Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Biociências
Pós Graduação em Psicobiologia
Caracterização de Subpopulações de Interneurônios
Imunorreativos Para Proteínas Ligantes de Cálcio no Córtex
Pré-Frontal do Sagui (Callithrix jacchus): Distribuição e
Morfologia.
Joanilson Guimarães Silva
Natal, Rio Grande do Norte
2011
Joanilson Guimarães Silva
Caracterização de Subpopulações de Interneurônios Imunorreativos Para
Proteínas Ligantes de Cálcio no Córtex Pré-Frontal do Sagui (Callithrix
jacchus): Distribuição e Morfologia.
Tese apresentada ao programa Pós-Graduação em
Psicobiologia do centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito
para o Titulo de doutor em Psicobiologia.
Área de concentração: Psicobiologia Fisiológica.
Orientador: Prof. Dr. Sidarta Tollendal Gomes Ribeiro.
Co-orientador: Dr. Marco Aurélio de Moura Freire
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Silva, Joanilson Guimarães. Caracterização de subpopulações de interneurônios imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no córtex pré-frontal do Sagui (Callithrix jacchus): distribuição e morfologia / Joanilson Guimarães Silva. – Natal, RN, 2011. 100 f. : Il.
Orientador: Prof. Dr. Sidarta Tollendal Gomes Ribeiro. Coorientador: Prof. Dr. Marco Aurélio de Moura Freire. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Callithrix jacchus – Tese 2. Córtex pré-frontal Sagui – Tese. 3. Interneurônios – Tese. I. Ribeiro, Sidarta Tollendal Gomes. II. Freire, Marco Aurélio de Moura. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 599.821
“Toda decisão acertada é proveniente de experiência. E toda experiência é proveniente
de uma decisão não acertada.”
Albert Einstein
Agradecimentos
Dedico esse trabalho a todos que diretamente ou indiretamente ajudaram na realização
do mesmo, em particular ao professor Sidarta Ribeiro, pela oportunidade de fazer parte
de sua equipe e pelo conhecimento repassado ao longo desses anos.
Agradeço aos meus pais Maria Selma e Manoel Norman, pelo carinho e apoio durante
todos esses longos anos.
Agradeço aos meus irmãos Roberto, Lely e Joci pela amizade e companheirismo.
Agradeço ao meu grande amigo Marco Aurélio pela amizade e confiança durante todos
esses anos de convivência.
Agradeço a todos os amigos e companheiros do IINN-ELS, pela amizade e pela
construção de um sonho para o nosso progresso cientifico.
Agradeço ao CNPq , FINEP e AASDAP, pelo apoio financeiro e científico.
Por ultimo agradeço a minha grande amiga, companheira, cúmplice e amante Lanna
Patrícia por toda a paciência, o amor e dedicação.
i
Sumário
Sumario
Lista de Figuras
i
iv
Lista de Tabelas v
Lista de Histogramas vi
Lista de Abreviaturas vii
Resumo viii
Abstract ix
1 Introdução 1
1.1 Neurônios excitatórios 1
1.2 Neurônios inibitórios 3
1.3 Proteínas ligantes de cálcio e sua função sistema nervoso central 4
1.4 Córtex pré-frontal 7
1.5 Razões para a escolha do sagui como animaleExperimental 10
2 Objetivos 13
2.1 Objetivo Geral 13
2.2 Objetivos Específicos 13
3 Material e Métodos 14
3.1 Espécime 14
3.2 Perfusão, craniotomia e microtomia 14
3.3 Coloração de Nissl 16
3.4 Imunohistoquímica para as proteínas ligantes de cálcio 16
3.5 Montagem das lâminas com os cortes histológicos 18
3.6 Sistema de microscopia automática e programas para análise morfométrica e estereológica
18
ii
3.7 Análise Qualitativa 19
3.8 Análise Quantitativa 19
3.8.1 Quantificação estereológica para a distribuição dos grupos de interneurônios 19
3.8.2 Ferramenta estereológica: O Fracionador Óptico 20
3.8.3 Análise estatística para estimativa do número de células através do Fracionador Óptico
23
3.9 Análise morfométrica dos interneurônios imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio
25
4 Resultados 26
4.1 Caracterização laminar das regiões do córtex pré-frontal do sagui 26
4.2 Distribuição laminar dos grupos imunorreativos para as Proteínas ligantes de cálcio
26
4.3 Distribuição laminar e características morfológicas dos neurônios imunorreativos para calbindina.
30
4.4 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos para calretinina.
34
4.5 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos para parvalbumina.
38
4.6 Perfis morfométricos dos grupos celulares imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio.
42
4.7 Análise quantitativa da estimativa celular entre os grupos CB, CR e PV no córtex pré-frontal do sagui.
45
4.8 Análise de variância (ANOVA) entre áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal em relação ao número estimados de células imunorreativas para CB, CR e PV.
55
5 Discussão 58
5.1 Considerações sobre a utilização de marcadores neuroquímicos no estudo da heterogeneidade das populações de interneurônios no córtex cerebral.
58
5.2 Imunorreatividade para as proteínas ligantes de cálcio entre os diferentes tipos morfológicos de interneurônios no córtex pré-frontal do sagui.
60
iii
5.3 Implicações funcionais das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio no processamento cortical
64
5.4 Contextualizando os diferentes padrões da arborização dendrítica. 67
5.5 Considerações sobre o emprego de ferramentas estereológicas na estimativa numérica dos grupos neuronais imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no córtex pré-frontal do Sagui.
70
5.6 Homogeneidade versus heterogeneidade da arquitetura inibitória cortical. 73
6 Conclusão 79
7 Referências Bibliográficas 80
iv
Lista de Figuras
Figura 1 - Sagui comum (Callithrix jacchus), espécie objeto de estudo do presente trabalho.
Figura 2 - Representação do método de contagem utilizado pelo fracionador óptico,
mostrando a distribuição de caixas de contagem através de grades com distâncias uniformes
que cobrem homogeneamente a área de interesse.
Figura 3 - Divisão citoarquitetônica e distribuição laminar das proteínas ligantes de cálcio
nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal.
Figura 4 - Células imunorreativas para CB no córtex pré-frontal do sagui.
Figura 5 - Reconstrução de células imunorreativas para CB.
Figura 6 - Células imunorreativas para CB com dendritos e axônios reconstruídos.
Figura 7 - Células imunorreativas para CR no córtex pré-frontal do sagui.
Figura 8 - Reconstruções a partir de células imunorreativas para CR.
Figura 9 - Reconstrução de células imunorreativas para CR.
Figura 10 - Células imunorreativas para PV.
Figura 11 - Células multipolares imunorreativas para PV, com árvores dendríticas
completamente reconstruídas localizadas na camada V.
Figura 12 - Terminais imunorreativos para PV.
v
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Distribuição laminar das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio
nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal.
Tabela 2 -Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos
para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal.
Tabela 3 –Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos
para proteínas ligantes de cálcio descrito no córtex pré-frontal.
Tabela 4 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV
(ΣQ), na região medial do córtex pré-frontal.
Tabela 5 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB, CR e PV (N) com
coeficiente de erro para a região medial do córtex pré-frontal.
Tabela 6 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB (ΣQ),
na região dorsolateral do córtex pré-frontal.
Tabela 7 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente
de erro para região dorsolateral do córtex pré-frontal.
Tabela 8 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV
(ΣQ), na região orbital do córtex pré-frontal.
Tabela 9 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente de
erro para região orbital do córtex pré-frontal.
vi
Lista de Histogramas
Histograma 1 - Distribuição laminar das proteínas ligantes de cálcio (CaBPs) nas regiões
dorsal, medial e orbital do córtex pré-frontal.
Histograma 2 - com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para
CB, CR PV na região medial do córtex pré-frontal.
Histograma 3 - Com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para
CB, CR PV na região dorsolateral do córtex pré-frontal.
Histograma 4 - com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para
CB, CR PV na região orbital do córtex pré-frontal.
Histograma 5 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas
para PV entre os as regiões do córtex pré-frontal.
Histograma 6 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas
para CB entre os as regiões do córtex pré-frontal.
Histograma 7 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas
para CR entre os as regiões do córtex pré-frontal
vii
Lista de Abreviaturas
Asf – (do inglês) area sampling fraction
CaBPS – proteínas ligantes de cálcio
CB - calbindina
CR – calretinina
CE - coeficiente de Scheaffer
CV- coeficiente de variação
CVB – coeficiente de variação biológica
DAB – diaminobenzidina
DP – desvio padrão
GABA - ácido -aminobutírico
PV- parvalbumina
SNC- sistema nervoso central
Ssf – (do inglês) section sampling fraction
TFS – tampão fosfato salina
Tsf – (do inglês) tissue sampling fraction
V2 – córtex visual secundário
viii
Resumo
Os interneurônios do córtex cerebral são caracterizados por suas diferentes propriedades
morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, atuando como moduladores da atividade
excitatória cortical dos neurônios piramidais, por exemplo. Vários estudos revelaram
diferenças na distribuição e densidade deste grupo celular ao longo de diferentes áreas
corticais em diversas espécies. Uma classe particular de interneurônios intimamente
relacionada à modulação cortical é revelada pela imunohistoquímica para as proteínas
ligantes de cálcio calbindina (CB), calretinina (CR) e parvalbumina (PV). Em que pese a
quantidade crescente de estudos focando nas proteínas ligantes de cálcio, o córtex pré-
frontal de primatas ainda permanece relativamente pouco explorado, especialmente no que
se refere a um melhor entendimento da organização do circuito inibitório ao longo de suas
subdivisões. No presente estudo caracterizamos a morfologia e a distribuição desse grupo
neuronal nas regiões medial, orbital e dorso-lateral do córtex pré-frontal do sagui
(Callithrix jacchus). Utilizando parâmetros morfométricos e técnicas estereológicas,
evidenciamos que os neurônios reativos a CR (especialmente células em duplo-buquê e
bipolares) possuem arborização dendrítica mais complexa quando comparados aos
neurônios reativos a CB (neurônios de tufos duplos e células em cesto) e PV (células em
candelabro). A densidade dos neurônios reativos a CB e CR é mais elevada nas camadas
supragranulares (II/III), enquanto os neurônios reativos a PV se concentram
predominantemente nas camadas infragranulares (V/VI). Os neurônios reativos a CR foram
o grupo predominante nas três regiões avaliadas, sendo mais prevalente na região
dorsolateral. Nossos achados apontam para diferenças cruciais no circuito inibitório ao
longo das diferentes áreas do córtex pré-frontal do sagui.
Palavras chave: Calbindina, calretinina, parvalbumina, córtex pré-frontal, interneurônios,
morfometria, estereologia.
ix
Abstract
Cortical interneurons are characterized by their distinct morphological, physiological and
biochemical properties, acting as modulators of the excitatory activity by pyramidal
neurons, for example. Various studies have revealed differences in both distribution and
density of this cell group throughout distinct cortical areas in several species. A particular
class of interneuron closely related to cortical modulation is revealed by the
immunohistochemistry for calcium binding proteins calbindin (CB), calretinina (CR) and
parvalbumin (PV). Despite the growing amount of studies focusing on calcium binding
proteins, the prefrontal cortex of primates remains relatively little explored, particularly in
what concerns a better understanding of the organization of the inhibitory circuitry across
its subdivisions. In the present study we characterized the morphology and distribution of
neurons rich in calcium-binding proteins in the medial, orbital and dorsolateral areas of the
prefrontal cortex of the marmoset (Callithrix jacchus). Using both morphometric and
stereological techniques, we found that CR-reactive neurons (mainly double bouquet and
bipolar cells) have a more complex dendritic arborization than CB-reactive (bitufted and
basket cells) and PV-reactive neurons (chandelier cells). The neuronal densities of CR- and
CB-reactive cells are higher in the supragranular layers (II/III) whilst PV-reactive neurons,
conversely, are more concentrated in the infragranular layers (V/VI). CR-reactive neurons
were the predominant group in the three regions evaluated, being most prevalent in
dorsomedial region. Our findings point out to fundamental differences in the inhibitory
circuitry of the different areas of the prefrontal cortex in marmoset.
Keywords: Calbindin, calretinin, parvalbumin, prefrontal cortex, interneurons,
morphometry, stereology.
1
1 - INTRODUÇÃO
Desde os estudos pioneiros do neuroanatomista espanhol Santiago Ramón y Cajal
no século XIX, sabe-se que existem dois tipos principais de neurônios no córtex cerebral
dos mamíferos são classificados de acordo com seu aspecto morfológico em piramidais e
não piramidais (DeFelipe & Jones, 1988). Os neurônios não piramidais, por sua vez, são
subdivididos em dois outros grupos: células espinhosas estelares e células lisas ou
parcialmente espinhosas – também denominadas de interneurônios. De acordo com suas
propriedades fisiológicas, os neurônios piramidais assim como os estelares são
classificados como ‘excitatórios’ ou de projeção, tendo o glutamato como seu
neurotransmissor principal, perfazendo cerca de 80% da totalidade dos neurônios
corticais. Já os interneurônios englobam os 20% restantes e são denominados de
neurônios ‘inibitórios’, por utilizarem o ácido γ-aminobutírico (GABA) como
neurotransmissor (DeFelipe, 2002a). Os neurônios inibitórios são conhecidos como
‘neurônios de circuito local’, uma vez que normalmente atuam como
inibidores/moduladores da atividade cerebral (veja Somogyi et al., 1998 para revisão).
Não obstante, cerca de 1% dos neurônios de projeção também são imunorreativos para
GABA (Gonchar et al., 1995).
1.1. Neurônios excitatórios
Dentre as células excitatórias, os neurônios piramidais constituem cerca de 80%
do total, formando a maioria das conexões corticais entre diferentes áreas (DeFelipe &
Fariñas, 1992). Constituem um grupo celular bastante particular, com corpo celular
grande e em formato triangular (piramidal), com arborização dendrítica que em geral se
2
estende perpendicularmente à base do corpo, alcançando distâncias variáveis. Possuem
também um dendrito apical proeminente que, na maioria dos casos, alcança a camada I
do córtex, onde se ramifica em diversos colaterais divergentes (Valverde, 2002). Uma
característica bastante interessante dos neurônios piramidais é a presença de pequenos
apêndices ao longo de seus prolongamentos denominadas espinhas dendríticas, as quais
aumentam consideravelmente a superfície receptora desses prolongamentos, sendo
formadas em sua maioria por um pequeno espessamento em formato esférico de 1 a 3 µm
de diâmetro unido por uma haste fina ao prolongamento celular (Valverde, 2002). A
‘cabeça’ da espinha dendrítica é a região que recebe a grande maioria das terminações
axonais, formando as sinapses (Valverde, 2002).
Tais estruturas foram inicialmente descritas e batizadas por Santiago Ramón y
Cajal em 1888, quando este trabalhava em Barcelona, ao avaliar o tecido nervoso
impregnado pela prata (coloração de Golgi) (DeFelipe, 2002b). Suas observações e as de
seus contemporâneos, Retzius (1891) e Schaffer (1892), levaram-no a propor que tais
estruturas desempenhariam um papel preponderante na fisiologia deste grupo celular. As
conclusões de Cajal foram amplamente aceitas e o estudo das espinhas dendríticas se
tornou um campo proeminente de pesquisa (Nimchinsky et al., 2002; Sabatin & Svoboda,
2000; Yasuda et al., 2003) uma vez que estas são estruturas altamente plásticas e também
o principal sítio de sinapses excitatórias no córtex cerebral (Valverde, 2002; veja também
DeFelipe, 2002b).
Recentemente vem sendo demonstrado que existem diferenças interessantes na
morfologia dos neurônios piramidais entre as distintas áreas corticais tanto dentro da
mesma espécie quanto entre espécies distintas (Jacobs et al., 2001; Elston & Rockland,
3
2002; Benavides-Piccione et al., 2002; Ballesteros-Yanez et al., 2006; veja Elston &
DeFelipe, 2002 para detalhes).
Em conjunto, as evidências sugerem a existência de relevantes especificidades
celulares nos circuitos corticais cerebrais. O estudo das diferenças celulares nos
diferentes córtices e entre áreas homólogas entre espécies distintas poderá contribuir
significativamente para um melhor entendimento dos processos que regem as diferentes
fisiologias. Por exemplo, em animais que utilizam mais uma modalidade sensorial que
outra, existem diferenças significativas na morfologia dendrítica que expliquem tais
diferenças? Esta é uma questão importante que pode e deve ser investigada em detalhes.
1.2. Neurônios inibitórios
Dentre os neurônios não piramidais, um grupo chama a atenção por possuir um
número bastante reduzido de espinhas dendríticas, chegando mesmo à completa ausência
dessas estruturas. Estas células são denominadas neurônios não piramidais lisos ou
parcialmente espinhosos, ou simplesmente ‘interneurônios’. Em geral os interneurônios
possuem axônios curtos distribuídos ao longo da camada celular ou em camadas acima
ou abaixo da localização de seu corpo celular (Lund & Lewis, 1993).
Para Santiago Ramón y Cajal, a ‘célula de axônio curto’ (interneurônio) seria um
“condensador ou acumulador de energia nervosa” (veja DeFelipe, 2002a para detalhes).
Ramón y Cajal intuiu que este grupo celular participaria ativamente na regulação do
fluxo de informação entre as diferentes regiões do sistema nervoso central (SNC). Ramón
y Cajal descreveu neurônios corticais camada a camada em diversas regiões do SNC,
especialmente no humano, gato e rato (DeFelipe & Jones, 1988), encontrando uma
4
grande variedade de tipos morfológicos distintos de interneurônios, especialmente no que
se refere ao padrão das arborizações axonais e dendríticas. Suas observações, juntamente
com suas acuradas ilustrações, representam a base dos estudos atuais de organização
cortical (DeFelipe & Jones, 1988; veja DeFelipe, 2002b e Freire, 2006 para revisão).
Um problema persistente no estudo de microcircuitos corticais é a dificuldade
para classificar interneurônios, em que pese os avanços recentes neste campo. Isto se
deve em grande parte à enorme gama de aspectos morfológicos, fisiológicos e
bioquímicos distintos encontrados. Além disso, grupos celulares com morfologias
distintas podem possuir o mesmo padrão de conectividade (Kisvárday, 1992) ou mesmo
padrões bioquímicos similares (DeFelipe, 1993; 1997). Mesmo com tais dificuldades,
certos interneurônios são facilmente caracterizados por suas características morfológicas
únicas, ou podem ser agrupados em grupos mais gerais com bom grau de acurácia tendo
como base seus padrões de arborização axonal ou características bioquímicas (DeFelipe,
1997).
Com o advento de técnicas imunohistoquímicas e histoquímicas, o método de
classificação químico tornou-se um dos mais utilizados, uma vez que se pode definir um
grupo celular pelo seu conteúdo de neurotransmissores ou enzimático, contribuindo para
um melhor entendimento dos circuitos corticais. Um dos avanços importantes na
caracterização química dos interneurônios é a demonstração da marcação
imunohistoquímica destes pelas chamadas ‘proteínas ligantes de cálcio’ (DeFelipe, 1993;
1997; Kubota et al., 1994; Meskenaite, 1997).
1.3 Proteínas ligantes de cálcio e seu papel funcional no sistema nervoso central
5
As proteínas ligantes de cálcio são aceptores do cálcio intracelular pertencente a
duas famílias distintas: as proteínas EF hand e as proteínas anexinas. As anexinas formam
uma família de proteínas do tipo não-EF hand que se ligam à membrana fosfolipídica na
presença de cálcio, enquanto que a família EF hand é formada por proteínas
caracterizadas por apresentar o domínio EF hand com uma alta afinidade a este íon
(Andressen et al., 1993).
Os sítios das proteínas EF hand se caracterizam por uma região continua de 29
aminoácidos (Kawasaki & Kretsinger, 1994), que contém duas α-hélices dispostas
perpendicularmente uma em relação à outra, flanqueando uma alça curta, em cujo interior
se localizam os resíduos dos aminoácidos aspartato e glutamato, ambos negativamente
carregados, responsáveis pela ligação dos íons cálcio carregados positivamente (Marsden
et al., 1990). As duas α-hélices têm a função de ancorar a alça de maneira correta e
comunicar as demais porções da molécula às mudanças de conformação geradas pela
ligação dos íons.
A organização espacial das α-hélices e da alça no sítio assemelha-se à disposição
de uma mão direita com o indicador estendido apontando para o alto, correspondendo à
primeira hélice (formada por 9 aminoácidos), o dedo médio dobrado, correspondendo à
alça (formada por 12 aminoácidos), e o polegar estendido, correspondendo à hélice de
saída (formada por 8 aminoácidos). Esta representação foi sugerida a partir da
caracterização da estrutura da parvalbumina, de onde se originou o termo ‘EF hand’
(Kretsinger & Nockolds, 1973).
A família EF hand apresenta em torno de 40 proteínas associadas à regulação dos
níveis de cálcio intracelular, muitas das quais são encontradas em terminações axonais e
6
estruturas pré e pós-sinápticas, sugerindo um papel chave dessas proteínas na transmissão
sináptica. A ação das proteínas EF hand pode estar associada como um fator chave
iniciando a cascata de reações dependentes de cálcio ou funcionando como tampões,
diminuindo a concentração citoplasmática desse íon (Hof et al., 1999). Um exemplo do
protótipo da proteína “disparadora” é a calmodulina, responsável por ativar mais de vinte
enzimas diferentes (Bainmbridge & Rogers, 1992). As proteínas “tampão”, como a
calbindina (CB), calretinina (CR) e a parvalbumina (PV), representam um sistema
passivo responsável pelo decréscimo da amplitude na sinalização do cálcio (Hof et al.,
1999).
A PV foi originalmente purificada de extratos de músculo de peixes e está
presente em altos níveis no SNC, onde pode ser encontrada em uma grande população de
neurônios (Celio, 1999). A CB foi extraída do duodeno de aves, onde facilita o transporte
do cálcio através da mucosa, sendo em seguida encontrada e mapeada no SNC (Hof et al.,
1999). A CR é a proteína ligante de cálcio descrita mais recentemente, sendo encontrada
exclusivamente no SNC e apresentando algumas sequências de aminoácidos homólogas a
CB (Jacobwitz & Winsky, 1991).
A revelação dessas proteínas ligantes de cálcio através de técnicas
imunohistoquímicas se tornou uma excelente ferramenta nos estudos evolutivos das
distintas vias funcionais que formam o SNC (DeFelipe et al., 1999; Hof et al., 1999;
Letinic & Kostovic, 1998). No córtex cerebral essas proteínas representam poderosos
marcadores para o estudo da grande heterogeneidade dos sistemas GABAérgicos, onde
cada um dos três ligantes é geralmente co-localizado com o GABA em subpopulações
distintas de interneurônios (Clemo et al., 2003; DeFelipe et al., 1999; DeFelipe, 2002;
Gonchar & Bukhalter, 1997; Zaitsev et al., 2005; Zaitsev et al., 2008).
7
Estudos têm revelado diferentes padrões morfológicos e de distribuição regional
nos neurônios corticais que expressam CB, CR e PV intra-espécies, mas em alguns casos
também a nível interespécies (DeFelipe, 1997; Hof et al., 1996). Essas diferenças
morfológicas e no padrão da distribuição podem representar traços consistentes que
podem ser interpretados através de um contexto filogenético (Hof et al., 1996).
Uma das características mais interessantes dos neurônios GABAérgicos que
expressam as proteínas ligantes de cálcio é o alto grau de co-expressão com outros
neuromoduladores tais como a somatostatina, o neuropeptídeo Y e o óxido nítrico
(Markram et al., 2004; Gonchar et al., 2008; Gonzalez-Albo et al., 2001). Alguns estudos
têm demonstrado que esses marcadores neuroquímicos exibem padrões na distribuição
laminar provavelmente relacionados às suas funções nos circuitos corticais (Clemo et al.,
2003; Gonchar et al., 2008).
As proteínas ligantes de cálcio CB, CR e PV apresentam um grande interesse do
ponto de vista neuroanatômico, pois elas podem ser observadas em subpopulações bem
definidas de neurônios ao longo de diferentes sistemas sensoriais em um grande número
de espécies, tais como roedores (Park et al., 2002; Cellerino et al., 1992; Lüth et al.,
1993; Lee et al., 2004), lagomorfos (Park et al., 2000), carnívoros (Hogan & Berman,
1994; Jeon and Park, 1997; Gao et al., 2000), primatas não humanos (Hendrickson et al.,
1991; DeFelipe et al., 1999; Elston & Gonzales-Albo, 2003) e humanos (Leuba et al.,
1998; Gonzalez-Albo et al., 2001).
1.4 Córtex Pré-frontal
Em primatas o córtex pré-frontal compreende entre 10% e 30% do volume do
lobo frontal (Fuster, 1997), apresentando uma organização altamente heterogênea e
8
definida como uma região de associação convencionalmente definida através de critérios
citoarquitetônicos e conectivos, caracterizada em todos os mamíferos por apresentar uma
camada granular bem desenvolvida e um padrão de conexões recíprocas com os núcleos
talâmicos (Petrides & Pandya, 1999; Fuster, 2002).
Enquanto a homologia do neocórtex em diferentes espécies de mamíferos é
indiscutível, o córtex pré-frontal em particular apresenta algumas controvérsias.
Evidências descritas através de estudos comparativos e a investigação de espécies já
extintas demonstram que, no curso da evolução, o córtex pré-frontal apresentou um
aumento desproporcional de seu volume em relação a outras áreas corticais (Fuster, 1997;
Fuster et al., 2000). De acordo com Brodmann (1909) o córtex pré-frontal ocupa cerca de
3,5% da totalidade da área cortical em felinos, 12,5% em caninos, 11,5% a 17% em
primatas não humanos e 29% em humanos (veja Fuster, 2002 para revisão). Esse
aumento no volume apresentado pelo córtex pré-frontal pode estar relacionado com a
evolução dos processos cognitivos observados especialmente nos primatas (Fuster, 2002).
O córtex pré-frontal é descrito como um recipiente de informações sensoriais,
recebendo aferências de diferentes áreas corticais visuais, auditivas, somestésicas,
gustativas, olfativas e motoras (Barbas & Pandya, 1987; Barbas & Pandya, 1989; Fuster,
1997). Baseando-se nesse contexto, o córtex pré-frontal é importante para funções
cognitivas e para a organização do comportamento (Miller, 2000), incluindo a função
mnemônica e no planejamento motor que são necessárias para a interação com o meio
(Ramnani & Owen, 2004). Investigações têm demonstrado que indivíduos com lesões no
córtex pré-frontal apresentam alterações na sua personalidade, com dificuldade para
manter a atenção, organizar tarefas e tomar decisões, muitas vezes agindo por impulso
sem levar em conta as consequências futuras (Miller et al., 2002).
9
A anatomia do córtex pré-frontal sugere que essa região pode ter um papel
‘executor’ no cérebro, sintetizando informações de diferentes áreas cerebrais e exercendo
forte influência no controle comportamental (Miller et al., 2002). O grupo de áreas que
compõem o córtex pré-frontal estabelece interconexões com áreas que processam
informações relacionadas ao meio externo (estruturas corticais e subcorticais que
compõem os sistemas sensoriais e motor), bem como informações internas (áreas do
mesencéfalo e sistema límbico envolvidas na memória e emoção) (Fuster, 1995; veja
Miller & Cohen, 2001 para revisão). De modo correspondente, os neurônios do córtex
pré-frontal apresentam um padrão altamente multimodal e codificam diferentes tipos de
informações nos diferentes estágios de percepção (Fuster, 1995; Barbas et al., 2005a).
Em particular, o córtex pré-frontal de primatas apresenta conexões com todas as
áreas corticais (Yeterian et al., 2011). As regiões lateral, medial e orbital são conectadas
reciprocamente com diferentes núcleos do tálamo, enquanto as regiões medial e orbital
são conectadas com o hipotálamo e com a formação hipocampal, sendo que algumas
dessas conexões são indiretas, passando antes pelo tálamo. A região lateral faz conexões
com os gânglios da base. Além disso, o córtex pré-frontal estabelece inúmeras conexões
com os córtices associativos das regiões occipital, temporal e parietal (Fuster, 1997;
Fuster, 2002; Barbas et al., 2005a; 2005b).
O papel das conexões do córtex pré-frontal não está totalmente esclarecido, mas
podemos inferir o papel funcional das estruturas que estão conectadas com esta região.
Em termos gerais, as conexões entre o córtex pré-frontal e o sistema límbico estão
envolvidas com o controle comportamental, enquanto que as conexões pré-frontal e
estriatal estão envolvidas com o controle motor (Fuster, 2002). As conexões recíprocas
10
entre o córtex pré-frontal lateral e o hipocampo com os córtices de associação também
podem estar relacionadas aos aspectos cognitivos do comportamento. No entanto o papel
dessas conexões nos processos cognitivos (por exemplo, a consolidação da memória)
ainda continua um tanto incompreendido (Fuster, 2002).
Pelo exposto acima, o córtex pré-frontal apresenta-se como uma região altamente
heterogênea, composta por uma serie de subáreas que variam de acordo com sua estrutura
e interconexões com diferentes áreas corticais e subcorticais (Rempel-Clower & Barbas,
2000). A variação entre as conexões apresentada pelo córtex pré-frontal pode explicar os
papéis funcionais distintos atribuídos a esta região (Barbas et al., 2005a).
1.5 Razões para a escolha do sagui como animal experimental
Atualmente, o Instituto do Cérebro da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (IC-UFRN) e o Instituto Internacional de Neurociências de Natal Edmond e Lily
Safra (IINN-ELS) têm como uma de suas linhas de investigação principais o estudo
comportamental de um pequeno primata do Novo Mundo, o sagui (Callithrix jacchus)
(Figura 1), especialmente no que se refere às suas vocalizações (Simões et al., 2010). Tal
animal foi escolhido como modelo por pelo menos quatro razões principais: 1. É uma
espécie abundante na região e de fácil reprodução; 2. É de pequeno porte (com peso entre
350 e 450 gramas no adulto), portanto de fácil manipulação; 3. Adapta-se facilmente ao
cativeiro e; 4. Possui o cérebro lisencefálico, livre de giros e circunvoluções que
dificultam o acesso às regiões de interesse. Tais características elegem o sagui como um
excelente modelo para estudos no SNC, além do fato de ser uma espécie evolutivamente
próxima à espécie humana, o que por si só já se constitui em um atrativo.
11
Figura 1 - Sagui comum (Callithrix jacchus), espécie objeto de estudo do presente trabalho
O sagui é uma espécie de primata bastante valiosa para a Neurociência. Seu
pequeno tamanho e sua boa adaptação a testes comportamentais laboratoriais são ideais
para investigações neuroquímicas, assim com caracterização citoarquitetônica das
estruturas corticais e subcorticais (Roberts et al., 2007). Essa espécie de primata também
é bastante utilizada em estudos que avaliam a modulação neuroquímica na emoção e
cognição, com o propósito de investigar novas drogas para futuras terapias utilizadas nos
transtornos psiquiátricos (Roberts et al., 2007).
Desde a criação do Centro de Primatologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN), coordenado pelo Departamento de Fisiologia, diversos
projetos de pesquisa envolvendo o sagui deram origem a uma gama importante de
publicações a respeito da base circadiana dos ritmos biológicos e do sistema visual desta
espécie (Costa & Brito, 1997; Costa et al., 1999; Cavalcante et al., 2002; Cavalcante et
al., 2005). Aspectos gerais de conectividade, organização topográfica e fisiologia de
12
alguns córtices sensoriais do sagui são alvos de estudo por grupos de pesquisa ao redor
do mundo (córtex auditivo: de la Mothe et al., 2006; Wang et al., 1995; Wang & Kadia
2001; córtex somestésico: Krubitzer & Kaas, 1990; Krubitzer et al., 1999; córtex visual:
McLoughlin & Schiessl, 2006; Zinke et al., 2006; Bourne et al., 2007).
Além das áreas corticais supracitadas, a organização morfofuncional do córtex
pré-frontal vem merecendo atenção especial. A citoarquitetura desta região no sagüi foi
originalmente descrita por Brodmann em 1909 e posteriormente por Pendin e Von Bonin
em 1947. Subsequentemente outros estudos têm examinado as conexões dessa área
(Brysch et al., 1990; Burman et al., 2006; Roberts et al., 2007). Apesar disso, a complexa
organização cortical ainda permanece relativamente pouco explorada (Roberts et al.,
2007).
13
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Caracterizar as subpopulações de interneurônios que expressam proteínas ligantes
de cálcio (CB, CR e PV) nos campos corticais pré-frontais do sagui, considerando seus
aspectos morfológicos, bem como seus padrões de distribuição e densidade, descrevendo
as semelhanças e diferenças intrínsecas dos sistemas inibitórios que compõem a área
supracitada.
2.2 Específicos
1). Descrever o padrão de expressão das proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e
PV) nas áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal do sagui;
2). Investigar o padrão de distribuição e densidade dos interneurônios
imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e PV);
3). Quantificar a morfologia celular dos neurônios que expressam as diferentes
proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e PV) revelados pela imunohistoquímica, utilizando
parâmetros morfométricos.
14
3. Materiais e Métodos
Saguis machos (Callithrix jacchus) (n=3) foram obtidos junto ao Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e de Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) (autorização
SISBIO-24231-1). Os espécimes foram submetidos a um período de quarentena no
Biotério do IINN-ELS localizado em Macaíba/RN, onde tratados antes de serem
disponibilizados para fins científicos.
Procurou-se realizar o trabalho com o mínimo de espécimes possível e todas as
providências necessárias foram tomadas de modo a evitar dor e sofrimento dos animais
durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas internacionais
estabelecidas pelo National Institutes of Health - NIH (Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals) e pelo comitê de ética e pesquisa em animais do IINN-ELS (licença
09-2010).
3.1 Perfusão, craniotomia e microtomia.
Os animais foram inicialmente submetidos à indução anestésica por via
respiratória através de uma mistura de oxigênio e isofluorano 5% (Cristália Produtos
Farmacêuticos Ltda., Brasil). A seguir os animais foram profundamente anestesiados por
via intramuscular com uma mistura de cloridrato de ketamina (86mg/kg) e cloridrato de
xilazina (13mg/kg). Os reflexos corneano e de aversão à dor pelo movimento de deflexão
da pata foram testados antes do início dos procedimentos experimentais, para a
averiguação do grau de anestesia. Após atingirem anestesia profunda os animais foram
posicionados em decúbito dorsal com os membros imobilizados. Foi feita uma incisão
15
longitudinal ao longo da linha média abdominal, seguida de duas incisões oblíquas
através das costelas, na direção da cabeça do úmero, de modo a expor completamente o
coração.
Após estes procedimentos os animais foram perfundidos através do ventrículo
esquerdo com solução salina heparinizada (0,9%) aquecida a 37ºC, seguida por
paraformaldeído a 4% (4ºC) em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2-7,4) por intermédio de
uma bomba peristáltica (Mity Flex 913, USA).
Após a perfusão, os cérebros foram cuidadosamente removidos da caixa craniana,
sendo em seguida acondicionados em uma cubeta de vidro contendo tampão fosfato 0,1
M (pH 7,2-7,4) por 12 horas. Após este procedimento os cérebros foram transferidos para
solução crioprotetora (sacarose a 30%) até submergirem por completo, sendo
posteriormente separados em três blocos distintos (anterior, médio e posterior).
Os blocos anteriores contendo o córtex pré-frontal foram embebidos em Tissue
Tek (Sakura Finetek Inc., USA), congelados em mistura de gelo seco e álcool absoluto e
fatiados em secções coronais seriadas de 40 µm de espessura obtidas com auxílio de um
micrótomo de congelamento (Carl Zeiss Micron HM 550, Germany), sendo
posteriormente submetidas à análise histológica e colocalização imunohistoquímica.
Todas as secções obtidas no criostato foram montadas diretamente em lâminas dotadas de
carga eletrica (SuperFrost Plus Microslides, VWR - USA) durante a microtomia. Após
este procedimento as lâminas foram armazenadas à temperatura de -80ºC em freezer
especial para este fim (Thermo Electron Corporation, USA), até serem utilizadas para os
procedimentos histológicos.
16
3.2 Coloração de Nissl
Algumas secções foram coradas através da técnica de Nissl de modo a definir
citoarquitetonicamente a localização das áreas de interesse.
As lâminas com o tecido histológico foram retiradas do freezer e mantidas à
temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida foram banhadas em uma solução de
água destilada/ácido acético (300 ml/50 µl) por 6 minutos, sendo em seguida imersas em
uma solução de cresil violeta à temperatura ambiente por 8 minutos, seguido por uma
bateria de álcool com um gradiente crescente de concentração (70%, 80%, 90% e 100%,
um minuto cada). Por fim, as lâminas foram imersas em xileno por 1 minuto. Ao final da
coloração as lâminas foram visualizadas ao microscópio óptico para exame do padrão de
coloração. Caso o mesmo fosse satisfatório, as secções eram montadas com o auxílio de
um meio de inclusão (Entellan, Merck).
3.3 Imunohistoquímica para ligantes de cálcio (CB, CR e PV)
a. As secções (40µm) foram retiradas do freezer e mantidas em temperatura
ambiente por 30 minutos, sendo em seguida imersas por 20 minutos em ácido bórico (pH
9.0) aquecido em banho maria a 55°C. A temperatura foi mantida constante neste
período. Em seguida permitiu-se que as secções resfriassem por 25 minutos imersas na
própria solução, tempo após o qual as secções foram submetidas ao protocolo para
imunohistoquímica.
b. Após o pré-tratamento as secções foram incubadas em peróxido de
hidrogênio/metanol (1 ml de H2O2/250 ml de metanol) por 30 minutos.
17
c. As secções foram lavadas em TFS/Tween 0,1% (Sigma Company, USA) por 3
vezes de 3 minutos.
d. Os epítopos inespecíficos foram bloqueados com soro normal do animal que
produziu o anticorpo secundário por 1 hora. No caso dos anticorpos para os ligantes de
cálcio CB, CR e PV, foi utilizado o soro normal de cavalo 10% (Chemicon, USA).
e. Após o bloqueio, o excesso do soro foi retirado e as secções foram incubadas
em anticorpo monoclonal de camundongo anti-CB (1:500) (Santa Cruz, USA), anti-CR
(1:500) (Santa Cruz, USA) e anti- PV (1:500) (Santa Cruz, USA) durante 24 horas a
18°C.
f. As secções foram lavadas em TFS/Tween por 3 vezes durante 3 minutos.
g. As secções foram incubadas no anticorpo secundário biotinilado cavalo anti-
camundongo (Vector, USA) por 2 horas.
h. As secções foram lavadas em TFS/Tween por 3 vezes durante 3 minutos.
i. As secções foram incubadas no complexo avidina-biotina-peroxidase (kit ABC,
Vector) por 45 minutos (uma gota da solução A + uma gota da solução B em 5 ml de
PBS por 30 minutos antes da incubação).
j. Por fim, as secções foram retiradas da solução de ABC, lavadas em TF por 5
minutos e reagidas em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,05% com 125µl de
H2O2 para revelação do cromógeno. A intensidade da reação foi monitorada com auxílio
de um microscópio até que o padrão de marcação se apresentasse satisfatório.
De modo a certificar a especificidade da marcação, o anticorpo primário foi
substituído pelo soro normal em algumas secções-teste, escolhidas aleatoriamente.
18
3.4 Desidratação e montagem dos cortes
Após serem submetidas aos processos imuhistoquímicos supracitados, as secções
foram desidratadas em cubetas de vidro em uma bateria de álcool etílico em diferentes
concentrações (50%, 70%, 80%, 90% e 100%); dois minutos cada, e imersas em xileno
por três minutos. Em seguida as lâminas foram cobertas com lamínula utilizando-se um
meio de inclusão (Entellan, Merck). A coleção de lâminas obtida foi limpa para a retirada
do excesso do meio de inclusão e submetida à inspeção microscópica para posterior
análise qualitativa e quantitativa.
3.5 Sistema de microscopia automática e programas para análise morfometrica e
estereológica
As análises microscópicas foram realizadas com auxílio de um sistema de
microscopia automática equipado com um microscópio binocular Nikon Eclipse 80i
acoplado a uma placa motorizada (MBF Bioscience Inc., USA) e um sistema de captura
de imagens digitais CX9000 (MBF Bioscience Inc., USA).
Para a reconstrução e análise morfométrica dos neurônios reativos para as
proteínas ligantes de cálcio foi utilizado o programa de morfometria automática
Neurolucida (MBF Bioscience Inc., USA). A distribuição e a densidade dos neurônios
imunorreativos para os diferentes marcadores nas áreas corticais de interesse foram
realizadas utilizando-se o pacote Stereo Investigator 8.0 (MBF Bioscience Inc., USA).
19
3.6 Análise qualitativa
A análise do padrão de marcação da neurópila reativa para as proteínas ligantes de
cálcio CB, CR e PV, assim como a distribuição dos diferentes grupos de interneurônios
ao longo das áreas corticais de interesse foi realizada utilizando-se objetivas de menor
aumento (4x). O contorno das regiões corticais e dos limites das camadas em geral foi
desenhado com o auxilio do programa Neurolucida (MBF Bioscience Inc., USA), sendo
assinalada a posição dos interneurônios para ilustrar sua localização ao longo dessas
regiões.
3.7 Análise quantitativa
3.7.1 Quantificação estereológica para a distribuição dos interneurônios
Para estimar a distribuição e a densidade dos grupos neuronais imunorreativos
para os diferentes marcadores foi utilizado o protocolo fracionador óptico do pacote
Stereo Investigator 8.0, o qual estima o número de células imunorreativas em uma área
previamente determinada. Para calcular essa área foi necessário levar em consideração o
número de secções e sua espessura. A distribuição e o número de células em cada um dos
grupos neuronais imunorreativos para os diferentes marcadores foram estimadas em 5
secções seriadas, com um intervalo de 12 secções com uma espessura de 40µm cada.
Comparações entre os diferentes grupos de valores foram feitas através da análise de
variância (ANOVA, teste Newman-Keuls a posteriori - nível de significância de 95%).
Os valores obtidos foram expressos como média ± desvio padrão.
20
3.7.2 Ferramenta estereológica: o fracionador óptico.
A contagem do número de células em uma determinada região é um problema de
difícil resolução pelo fato de não ser possível isolar fisicamente as células. Assim se faz
necessário fatiar o tecido em secções e estimar o número de células a partir dessas
secções. No entanto é preciso levar em consideração que, ao fatiar um determinado
volume de um tecido em secções, haverá inevitavelmente o corte das células que
compõem o tecido, de forma que uma mesma célula estará representada em secções
adjacentes. Segue-se que a contagem do número de células fragmentadas será maior que
o número real das células que compõem o tecido. Por essa razão, estimar o número de
células com base somente na contagem das células fragmentadas leva inexoravelmente a
um resultado errôneo.
A estereologia é um método que permite resolver esse problema, a partir de
amostras sistemáticas que fornecem um dado quantitativo sem viés. As técnicas
estereológicas tem o poder de estimar o número total dos objetos contidos em uma dada
região de interesse através de coleta de informação aleatória e sistemática, multiplicando-
se o número de elementos de interesse registrados pelos valores de probabilidade da
amostra (West, 2002). A estereologia é um ferramenta de contagem que elimina os vieses
amostrais ou seja utiliza sistemas de amostragens que são independentes das propriedades
do tecido, no qual as dimensões da sonda amostral e os parâmetros amostrais a ela
associados são definidos a priori, desprezando-se a coleta de dados acerca do tamanho,
forma e orientação espacial da área a ser investigada (Glaser and Glaser, 2000).
Utilizando essa metodologia, os números estimados a partir da amostragem podem ser
21
expressos em valores relativos ou absolutos indicando volume, número, distribuição
espacial assim como o tamanho das estruturas biológicas, sem ter conhecimento prévio
da geometria celular ou do tecido a ser investigado (West, 2002; Schmitz and Hof, 2005).
Entre as ferramentas utilizadas para se estimar o número total de células, o
fracionador óptico é um dos métodos estereológicos mais usados nas ciências
biomédicas. O fracionador óptico é um desenho baseado em métodos de amostragem
sistemática utilizado para estimar o número de células em uma região especifica de um
órgão, quando a população é demasiada grande para contar exaustivamente (Glaser &
Wilson, 1998), pois combina as propriedades da sonda tri-dimensional para contagem dos
elementos de interesse (disecador óptico) com o sistema de amostragem sistemática e
aleatória (fracionador), evitando vieses amostrais assim como pressuposições (West et
al., 1991).
Utilizando esse método pode-se estimar o número de objetos em qualquer volume
trimensional. As contagens são imparciais na medida em que não são influenciadas pelo
tamanho, forma, orientação espacial das células em estudo. O fracionador óptico utiliza
secções de pequena espessura e estima o número total de células a partir de uma
contagem de células em amostras aleatórias (systematic randomly sampled, SRS). Esse
método utiliza caixas de contagem virtuais, as quais são distribuídas de uma maneira
aleatória por toda a região de interesse, com uma distância uniforme entre as mesmas nas
direções dois eixos X, Y e Z (Figura 2). O fracionador óptico não requer medidas de
densidade para estimar o número de células, tornando esse método de fácil
implementação. Além disso, o método do fracionador óptico não é afetado pela retração
tecidual que ocorre durante o processamento histológico.
22
O princípio do fracionador óptico define que se tomarmos uma amostra aleatória
(x) de uma fração (f) conhecida da população, então a estimativa sem viés da população
(X) é o valor da amostra divido pela fração:
X = x/f
onde X representa o número de objetos de interesse, x é o valor medido ou estimado da
amostra e f é a fração amostral. É importante ressaltar que essa estimativa de X será sem
viés somente quando f for aleatória e sistemática. O valor de f é definido pelo
experimentador e depende de um equilíbrio entre a quantidade de trabalho que necessita
ser feito e a precisão da estimativa a ser obtida. Quando f for igual a 1, significa que toda
a população foi contada.
Figura 2 – Representação do método de contagem utilizado pelo fracionador óptico, mostrando a
distribuição de caixas de contagem através de grades com distâncias uniformes que cobrem
homogeneamente a área de interesse.
23
3.7.3 Análise estatística para estimativa do número de células através do
fracionador óptico
Para obter um número estimado de células utilizando o fracionador óptico,
multiplicamos o número de células contadas em todos os espaços de contagem pelos
valores recíprocos de probabilidade de cada amostra, o qual é determinado levando-se em
conta três variáveis:
1- Número de secções investigadas em relação ao número de secções da região
de interesse (ssf).
2- Área do espaço de contagem em relação à área matriz de contagem (asf)
3- Altura do espaço de contagem em relação à média da espessura da secção
levando em consideração a retração tecidual que ocorre durante o
processamento histológico (stf).
As três variáveis são integradas na fórmula:
N = ΣQ * 1/ssf * 1/asf * 1/tsf
N- número total de células.
ΣQ – número total de células contadas.
ssf - section sampling fraction – número de secções contadas/ número total de
secções.
asf – area sampling fraction – área do espaço de contagem/área da matriz de
contagem.
tsf – tissue sampling fraction – espessura do espaço de contagem/espessura da
secção.
Para estimar o coeficiente de erro em relação ao método empregado na
quantificação, aplicamos procedimento sistemático amostral de um estágio denominado
24
Coeficiente de Scheaffer (CE), previamente validado por Galser & Wilson, 1998 o qual
estabelece a precisão da metodologia aplicada. Em termos práticos a metodologia é
julgada apropriada para a coleta de dados quando CE ≤ 0.05 pois significa que a variância
introduzida pelo procedimento contribui pouco para a variância observada para cada
grupo de contagem. Aplicando o coeficiente de Scheaffer podemos determinar a área de
grade e as dimensões dos espaços de contagem a serem empregados para a quantificação
do número de células, A razão entre o coeficiente de erro intrínseco à metodologia (CE) e
o coeficiente de variação para as estimativas (CV) não deve ultrapassar 0.5 (Slomianka
and West, 2005). O coeficiente de variação biológica foi um segundo parâmetro estimado
sistematicamente usado na escolha do método de quantificação empregado, expresso em
valor percentual do coeficiente de variação o qual estabelece que a sua contribuição deve
ser sempre maior que 50% para que se minimize os erros intrínsecos do processo
amostral. O coeficiente de variação biológica é definido pela fórmula:
CVB2 = CV2 - CE2
CVB - variação biológica,
CV – coeficiente de variação,
CE – coeficiente de erro.
Para as comparações entre os números estimados das populações imunorreativas
para proteínas ligantes de cálcio nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-
frontal, aplicamos a análise de variância (ANOVA) com teste de Newman-Keuls a
posteriori com nível de significância de 95%.
25
3.7.3 Análise morfométrica dos interneurônios imunoreativos para as proteínas
ligantes de cálcio
A análise morfométrica foi realizada com o auxílio do programa Neurolucida
(MBF Bioscience Inc., USA). Dois critérios principais foram utilizados para a escolha
das células a serem reconstruídas: integridade da árvore dendrítica (células que
aparentaram ter dendritos artificialmente cortados não foram incluídas) e a posição
relativa do corpo celular – para uma célula ser considerada ‘supragranular’, o corpo
celular deveria estar totalmente localizado nas camadas supragranulares (definidas pela
coloração de Nissl), o mesmo se aplicando às células das camadas infragranulares.
Para avaliação morfométrica foram reconstruídas em média 60 células para cada
grupo imunorreativo. As células foram reconstruídas segundo os parâmetros descritos
acima em grades de 600µm x 600µm. Seis grades foram fixadas em cada região do córtex
pré-frontal (medial, dorsolateral e órbito-frontal), sendo três grades fixadas nas camadas
supragranulares e três grades nas camadas infragranulares. Para cada célula reconstruída
foram analisados os seguintes parâmetros morfométricos:
• Comprimento dendrítico
• Superfície de campo dendritico
• Volume dendrítico
• Área de corpo celular
• Número de dendritos
• Ordem dendrítica
• Número de terminações dendríticas
• Número de bifurcações dendríticas
26
4. RESULTADOS
4.1 Caracterização laminar das regiões do córtex pré-frontal do sagui
Para efeito de caracterização do córtex pré-frontal do sagui, o mesmo foi
parcelado em três regiões distintas considerando suas características citoarquitetônicas.
Cada região foi subdivida em grupos laminares e as camadas foram facilmente
distinguidas em todas as regiões. As camadas II/III foram incluídas em um único grupo,
assim como as camadas V/VI. A camada IV foi um ponto chave na caracterização das
regiões. A região medial foi caracterizada pela quase ausência da camada IV (Robert et
al., 2004), enquanto que as demais camadas apresentam uma expansão em seu padrão
laminar, levando à classificação da região medial como agranular. A região orbitofrontal
foi caracterizada como tendo uma estreita camada IV e foi classificada como região
disgranular, enquanto que a região dorsolateral foi caracterizada por apresentar todas as
seis camadas celulares distintas, sendo assim classificada como região eulaminar (Figura
3)
As células imunorreativas para CB, CR e PV apresentaram padrões distintos de
distribuição laminar nas três regiões do córtex pré-frontal do sagui examinadas (Figura3).
A imunohistoquímica para CB e CR revelou uma alta densidade celular nas camadas
II/III e uma redução expressiva nas V/VI, nas regiões medial, dorsolateral e orbital.
Enquanto que PV revelou uma alta densidade celular nas camadas V/VI quando
comparadas com os grupos CB e CR (Histograma 1, Tabela 1).
27
Figura 3 - Caracterização citoarquitetônica e distribuição laminar dos grupos celulares
imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio na região medial (A-D), dorsolateral (E-
H) e orbital (I-M) do córtex pré-frontal do sagui. Escala - 500µm.
Calbindina
28
Histograma 1 – Distribuição laminar das CaBPs, nas regiões dorsal, medial e orbital do córtex pré-frontal. Cada barra representa o número com média (± DP) para cada CaBPs. (Detalhes estatísticos na tabela 1).
PFC MEDIAL
0 50 100 150
V/VI CB
V/VI CR
V/VI PV
II/III CB
II/III CR
II/III PV
I CB
I CR
I PV
número de células
CaBPs
PFC DORSOLATERAL
0 50 100 150 200
V/VI CB
V/VI CR
V/VI PV
IV CB
IV CR
IV PV
II/III CB
II/III CR
II/III PV
I CB
I CR
I PV
número de células
CaBPs
PFC ORBITOFRONTAL
0 50 100 150
V/VICB
IV/VICR
V/VI PV
IV CB
IV CR
IV PV
II/IIICB
II/IIICR
II/III PV
I CB
I CR
I PV
número de células
CaBPs
29
Tabela 1. Distribuição laminar das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio
nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão
representados pela média ± desvio padrão. Valores que não apresentam a mesma letra ou
apresentam diferenças significativas com p<0.05 (Newman-Keuls).
Medial
Camada I II/III IV V/VI Significância
CB 1a 108 ± 15
b - 27 ± 2.5c F = 134.8
p<0.0001
CR 0a 132 ± 12b - 38 ± 5
c F = 258.9
p<0.0001
PV 0a 77 ± 11
b - 56 ± 6c F = 85.3
P<0.0001
Dorsolateral
CB 0a 101 ± 1.5
b 24 ± 5.1
c 34 ± 5.2
c F = 118.1
p<0.0001
CR 1a
147 ± 17b
38 ± 4c 47 ± 9
c F = 143.1
p<0.0001
PV 1a 91 ± 6.6b 55 ± 3.2c 62 ± 4.2c F = 51.7
p<0.0001
Orbitofrontal
CB 0a 86 ± 10
b 24 ± 3.6
c 22 ± 2.4c F =216.4
P<0.0001
CR 1a
124 ± 61b
33 ± 47c 38 ± 3.2
c F = 133.1
p<0.0001
PV 1a
85 ± 11b
47 ± 7.4c 55 ± 6.1
c F = 51.4
P<0.0001
30
4.3 Distribuição laminar e características morfológicas dos neurônios
imunorreativos para calbindina
A maioria das células imunorreativas para CB apresentou características
morfológicas típicas de interneurônios, com dendritos curtos e lisos e ausência de um
dendrito apical evidente. Essas células foram caracterizadas por corpos celulares com
formato ovalar, esférico ou fusiforme e dendritos curtos formando árvores dendríticas
com arranjos bipolares e multipolares (Figura 4). As células bipolares foram
caracterizadas por corpos fusiformes ou ovalares com alto padrão reativo e dendritos
curtos pouco reativos, orientados verticalmente apresentando bifurcações próximas ao
corpo celular. Essas células apresentaram arranjos axonais horizontais emergindo do
corpo celular ou de dendritos primários com colaterais verticais extensos os quais
atravessavam as camadas celulares vizinhas (Figura 6 e 7). Esse tipo celular foi
encontrado principalmente nas camadas supragranulares II/III e em menor número na
camada IV e camadas infragranulares V/VI. Nas camadas III e IV foram encontradas
células bipolares com longos dendritos que alcançavam as camadas vizinhas (Figura5).
Essas células foram caracterizadas por dendritos primários verticais que se bifurcavam
distante do corpo celular. As células multipolares reativas para CB foram caracterizadas
por corpos celulares com forte reatividade, apresentando em média três a quatro dendritos
primários curtos pouco reativos (Figura 3). Tal tipo morfológico apresentou uma maior
concentração nas camadas supragranulares.
31
Figura 4 - Células CB-ir no córtex pré-frontal do sagui, caracterizadas por corpos celulares
altamente reativos e dendritos finos com um padrão de reatividade mais acentuado. Barra de
escala: 30µm.
32
Figura 5 – Reconstrução de células CB-ir . Em A, reconstrução de uma célula bipolar com
axônio vertical descendente emergindo (seta) do corpo celular. Em B, célula bipolar com arranjos
dendriticos em duplo tufo e axônios verticais descendentes (seta) com inúmeros colaterais
emergindo de um dendrito primário. Escala 40 µm.
33
Figura 6 – Reconstrução total de células CB-ir. As células bipolares fomaram o grupo
morfológico predominante entre as células CB-ir, caracterizadas por dendritos bifurcados
formando arranjos em duplos tufos, com axônios horizontais (setas) caracterizados por inúmeros
colaterais (A e B) ou axônios descendentes (setas) (C e D) que emergiam do corpo celular
alcançando as camadas vizinhas.
A B
D C
34
4.4 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos
para calretinina
As células imunorreativas para calretinina (CR) foram descritas em todas as
camadas celulares do córtex pré-frontal, com uma maior concentração nas camadas
supragranulares II/III (histograma1, tabela1). As células apresentavam características
morfológicas típicas de interneurônios, com dendritos curtos e lisos, corpo celular
pequeno e ausência de dendrito apical. Em geral essas células apresentavam corpos
altamente reativos, e dendritos finos pouco reativos (figura7). A imunohistoquímica CR
revelou dois grupos morfológicos distintos. O primeiro agrupou células bipolares
verticais, caracterizadas por corpos celulares fusiformes ou ovalares, apresentando
dendritos primários que se bifurcavam próximo ao corpo e feixes axonais verticais que se
projetavam a partir do soma ou do dendrito primário, caracterizados por colaterais que se
ramificam próximo ao corpo (figura 8). A morfologia bipolar foi o tipo predominante
entre as células imunorreativas para CR, sendo encontradas em todas as camadas
celulares, com uma maior concentração nas camadas supragranulares II/III. .
Terminações axonais imunorreativas para CR foram descritas nas camadas
supragranulares III e IV. Essas terminações foram caracterizadas por processos verticais
com feixes estreitamente entrelaçados. (figura 7).
As células multipolares formaram o segundo grupo celular, em geral
caracterizadas por corpos celulares esféricos ou ovalares com um forte padrão de
reatividade. Essas células apresentaram em média de três a quatro dendritos primários
que se bifurcavam próximo ao corpo celular formando árvores dendríticas complexas,
geralmente apresentando um axônio ascendente que se projetava para as camadas
35
adjacentes (figura 8). Tal tipo morfológico foi descrito principalmente nas camadas
supragranulares II/III e IV.
Figura 7 – Células CR-ir no córtex pré-frontal do sagui. A imunohistoquímica para CR
revelou grandes células bipolares caracterizadas por apresentarem uma orientação vertical
(figuras A,B e E), células multipolares (C e D). Escala 30µm.
36
Figura 8 – Reconstruções a partir de células imunorreativas para CR. Célula bipolar em A
caracterizadqa por um axônio delgado descendente (seta) emergindo do corpo celular com
inúmeros colaterais. Célula multipolar em B com axônio delgado vertical ascendente (seta)
emergindo de um dendrito primário. As cabeças de seta indicam longos arranjos axônais verticais
imunorreativos formando espécies de colunas. Escala 40µm.
37
Figura 9 – Reconstrução total de células CR-ir. A morfologia predominante para CR foi
caracterizada por células bipolares verticais, que apresentavam geralmente dendritos que se
bifurcavam próximo ao corpo celular formando tufos em polos opostos do corpo celular. Essas
células foram caracterizadas por axônios verticais descendentes ou ascendentes que emergiam do
corpo celular ou de um dos dendritos primários (setas em A e C), ou axônios horizontais que
emergiam do corpo celular formando colaterais com arranjos ascendentes e descendentes (setas
em B e D).
A B
D C
38
4.5 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos
para parvalbumina.
As células imunorreativas para parvalbumina (PV) apresentaram morfologia típica
de interneurônios, com dendritos curtos e lisos e ausência do dendrito apical, sendo
caracterizadas por corpo celular arredondado ou ovalar. O grupo PV-ir apresentou uma
distribuição mais homogênea quando comparadas com a CB e CR, com uma grande
densidade de células na camada média IV e nas camadas V/VI.
Dois grupos celulares com morfologias distintas foram descritos para PV. O
primeiro grupo foi caracterizado por células bipolares verticais, descritas principalmente
nas camadas supragranulares II/III e V. Nessas camadas foram descritas grandes células
bipolares fusiformes com orientação vertical, apresentando dendritos primários finos que
se bifurcavam longe do corpo celular e se estendiam ao longo de toda a camada na qual o
corpo celular estava localizado (Figuras 10 e 11). Na camada V foram descritas células
bipolares com corpo celular arredondado e dendritos longos que alcançavam a camada
VI. Células multipolares foram descritas nas camadas infragranulares, as quais
apresentavam um alto padrão reativo, com corpos arredondados e dendritos primários que
se ramificavam formando árvores dendríticas complexas (Figuras 10 e 11). A PV também
revelou pequenos terminais axonais verticais próximos ao corpo celular, (Figura 12), no
entanto não conseguimos identificar seus segmentos iniciais.
39
Figura 10 – Grandes células multipolares (A, B e C), foram reveladas para PV, caracterizadas por
corpos celulares altamente reativos e dendritos longos pouco reativos formando grandes árvores
dendríticas horizontais. Grandes células bipolares verticais (D) imunorreativas para PV foram
localizadas nas camadas supragranulares. Escala 30µm
40
Figura 11 – Células multipolares imunorreativas para PV, com árvores dendríticas completamente
reconstruídas localizadas na camada V. Essas células foram caracterizadas por corpos celulares
esféricos ou ovalares e arranjos dendriticos horizontais. Os números romanos indicam a camada
onde a célula estava localizada. Escala 40µm.
41
Figura 12 – Terminais axonais PV-ir, indicados pelas setas. Geralmente esses terminais se
localizavam próximo ao corpo celular apresentando orientação vertical (setas). Escala 100 µm em
A e 30 µm em B.
42
4.6 Perfis morfométricos dos grupos celulares imunorreativos para proteínas
ligantes de cálcio.
Com intuito de caracterizarmos a heterogeneidade morfológica entre os grupos
celulares imunorreativos para CB, CR, e PV, quantificamos a morfologia a partir de
medidas morfométricas relacionadas a árvore dendrítica assim como ao corpo celular. As
células foram agrupadas em duas classes, considerando a disposição e o número de
dendritos: células bipolares e células multipolares.
Entre os três grupos imunorreativos caracterizados, as células bipolares CR-ir
apresentaram árvores dendríticas com maior grau de complexidade quando classificamos
o segmento dendritico por ordem (Tabela 2). As árvores dendriticas associadas as células
CR apresentaram maior número de bifurcações assim como o número de terminações
(Tabela 2). Em relação ao comprimento e superfície da árvore dendrítica, o grupo CR
apresentou as maiores medidas topológicas em relação aos grupos CB e PV (Tabela 2),
no entanto as árvores dendríticas não apresentaram diferenças de volume entre os grupos.
Em relação ao corpo celular, as células imunorreativas para CB apresentaram uma maior
área quando comparadas aos grupos imunorreativos para CR e PV (tabela 2).
43
Tabela 2. Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão representados pela média (±DP). Valores que não apresentam a mesma letra subscrita apresentam diferenças significativas p<0.05 (Anova-Newman Keuls)
Entre as células multipolares, o grupo imunorreativo para CR apresentou o maior
número de segmento dendritico por ordem (Tabela 3), assim como os maiores números
de bifurcações e terminações quando comparadas aos grupos imunorreativos para CB e
PV (Tabela 3). As células CR apresentaram maiores superfícies dendríticas quando
comparadas com os grupos CB e PV, no entanto os grupos não apresentaram diferenças
em relação ao comprimento dendritico (Tabela 3). Quando consideramos o volume
dendritico, as células PV apresentaram maiores parâmetros em relação aos grupos CR e
Bipolares
CB CR PV Significância
Bifurcações 4 ± 2a 7 ± 3b 3 ± 1c F = 16.8 p<0.0001
Terminações 4 ±2a 6 ± 3b 5 ± 1c F = 7.4 p<0.001
2 ordem 4 ± 2a 4 ± 2a 4 ± 1a F = 0.5p>0.05
3 ordem 3 ± 2a 6 ± 2b 3 ± 1a F = 21.3 p<0.0001
4 ordem 2 ± 1a 5 ± 2b 2 ± 1a F = 30.6 p<0.0001
5 ordem 2 ± 1a 3 ± 1b 2 ± 1a F= 8.3 p<0.01
Superfície 272 ± 11µm3a 398 ± 18 µm3b 317 ± 30 µm3c F = 6.7 p<0.001
Comprimento 177 ± 23 µma 206 ± 53 µmb 140 ± 34 µmc F = 3.8 p<0.05
Volume 73 ± 38a 110 ± 57a 83 ± 52a F = 2.8 p>0.05
Área do soma 102 ± 18 µm2b 79 ± 18 µm2a 79 ± 23 µm2a F = 11.6 p<0.001
44
CB (Tabela 3). As células CR apresentaram a menor área de corpo celular entre os grupos
analisados.
Tabela 3. Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão representados pela média (±DP). Valores que não apresentam a mesma letra subscrita apresentam diferenças significativas p<0.05 (Anova-Newman Keuls)
Multipolares
CB CR PV
Bifurcações 5 ± 1a 6 ± 2b 4 ± 1a F = 9.0 p<0.001
Terminações 8 ± 2a 10 ± 3b 7 ± 1a F = 14.5 p<0.0001
1 ordem 4 ± 2a 5 ± 1b 4 ± 1a F = 34.3 p<0.0001
2 ordem 6 ± 2a 8 ± 3b 8 ± 2b F = 10.5 p<0.0001
3 ordem 3 ± 1a 6 ± 2b 4 ± 1a F = 35.6 p<0.0001
4 ordem 3 ± 1a 4 ± 2b 2 ± 1c F = 28.5 p<0.0001
5 ordem 2 ± 1a 3 ± 1b 2 ± 1a F = 5.2 p<0.01
Superfície 220 ± 78 µm3a 285 ± 10 µm3b 89± 30 µm3c F= 39.7 p<0.0001
Comprimento 130 ±31µma 129 ± 29µm a 136 ± 28µma F = 1.3 p>0.05
Volume 57 ± 21µm3a 65 ± 30 µm3a 81 ± 32 µm3b F = 6.5 p<0.002
Área do soma 102 ± 24 µm2a 77 ± 17 µm2b 102 ± 27 µm2a F = 10.0 p<0.001
45
4.7 Análise quantitativa da estimativa celular entre os grupos CB, CR e PV no
córtex pré-frontal do sagui.
Para fins de contagem celular, o córtex pré-frontal foi parcelado em três grandes
regiões: medial, dorsolateral e orbital. Esse parcelamento segue o mesmo estabelecido
por Burman e colaboradores (2006) e Robert e colaboradores (2007).
Os grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir não apresentaram uma homogeneidade numérica
quando comparamos a densidade celular através de pareamentos entre os grupos, onde foi
encontrado diferenças nas regiões do córtex pré-frontal caracterizadas
citoarquitetonicamente. Contudo essas relativas diferenças na densidade dos grupos CB-
ir, CR-ir e PV-ir nas regiões do córtex pre-frontal variaram de acordo a reatividade das
proteínas ligantes de cálcio assim o padrão citoarquitetônico de cada região analisada
como demostrado a seguir.
Na região dorsalateral, caracterizada por apresentar as cinco camadas celulares
bem definadas também denominada de região eulaminada, o grupo CR-ir apresentou uma
densidade celular ((123.646 ± 5.293 células/mm3) duas vezes maior quando comparada a
densidade celular do grupo PV-ir (59.425 ± 5.192 células/ mm3) ou quando comparada a
densidade celular do grupo CB-ir (79.781 ± 11.010 células/ mm3) (Anova F = 27,18
p<0.001). No entanto não foi encontrada diferenças estatísticas significativas quando os
grupos CB-ir e PV-ir foram pareados (p>0.05). Dados compilados no histograma 2.
As tabelas 4 e 5 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a
contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na
região dorso-lateral do córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de
variação biológica para cada grupo celular.
46
Tabela 4. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB (ΣQ), na região dorsolateral do córtex pré-frontal do sagui.
Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções
Animais a (caixa) (µm)2
A (X, Y) (µm)2
asf tsf ssf N de caixas
N de secções
ΣQ
Animal1
CB
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 226 5 83345
Animal2
CB
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 203 5 88570
Animal3
CB
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 215 5 76897
Animal1
CR
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 231 5 127310
Animal2
CR
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 203 5 135584
Animal3
CR
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 215 5 107905
Animal1
PV
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 195 5 54588
Animal 2
PV
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 210 5 65146
Animal3
PV
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 203 5 69543
47
Tabela 5. Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente de erro para região dorsolateral do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e estimativa individual (Média, N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e médios (CE).
CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.
Calbindina
Espessura N CE
Animais
1 32 83345 0,06
2 31,8 88570 0,05
3 31,5 67430 0,06
Média 31,7 79781 0,06
D.P 11011
CV2=(D.P/Média)
2 0,0190
CE2
0,0361
CE2/CV
2 0,1889
CVB2
0,0154
CVB2(% de CV
2) 81,1%
Calretina
Espessura N CE
Animais
1 32 127390 0,06
2 31 135584 0,05
3 31,6 107655 0,06
Média 31,5 123646 0,06
D.P 14185
CV2=(D.P./Média)
2 0,0131
CE2 0,0036
CE2/CV2 0,2735
CVB2 0,0095
CVB2(% de CV2) 63,6%
Parvalbumina
Espessura N CE
ANIMAIS
1 31,7 54588 0,06
2 32 65146 0,06
3 31,6 59425 0,06
Média 31,7 59425 0,06
D.P 15534
CV2=(D.P/Média)
2 0,0080
CE2
0,0036
CE2/CV
2 0,4468
CVB2
0,0044
CVB2(% de CV
2) 55,3%
48
Histograma 2 - Na região dorsolateral do córtex pré-frontal, o grupo CR-ir apresentou
uma maior densidade celular quando comparado ao grupo PV-ir (ANOVA –Newman Keuls
p<0.001) ou ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.01). Por outro lado a densidade
celular entre os grupos PV-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas significativas
quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05)
Na região orbital também caracterizada como uma região disgranular por
apresentar a camada celular IV rudimentar, assim como caracterizado na região
dorsolateral, o grupo CR-ir apresentou uma alta densidade celular (91.200 ± 4.663
células/mm3) quando comparada a densidade celular do grupo CB-ir (55.850 ± 5.142
células/mm3) ou em relação a densidade celular do grupo PV-ir (44.840 ± 8.168
cells/mm3) (Anova F = 45.88 p<0.001). Por outro lado a densidade celular entre os
grupos CB-ir e PV-ir não apresentaram diferenças estatísticas significativas (Anova
p>0.05). Resultados compilados no histograma 3.
As tabelas 6 e 7 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a
contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na
PFC DORSOLATERAL
CB CR PV
0
50000
100000
150000
número de celulas/mm
3
49
região dorso-lateral do córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de
variação biológica para cada grupo celular.
Tabela 6. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV
(ΣQ), na região medial do córtex pré-frontal do sagui.
Animais a (caixa) (µm)2
A (X, Y) (µm)2
asf tsf ssf N de caixas
N de secções
ΣQ
Animal1
CB
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 133 5 76126
Animal2
CB
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 141 5 57034
Animal3
CB
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 136 5 63456
Animal1
CR
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 138 5 76217
Animal2
CR
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 120 5 85774
Animal3
CR
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 130 5 69675
Animal1
PV
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 145 5 52376
Animal 2
PV
500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 132 5 37736
Animal3
PV
500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 142 5 42567
Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções
50
Tabela 7. Estimativa do número de células imunorreativas para CB, CR e PV (N) com
coeficiente de erro para a região medial do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e
estimativa individual (Média,N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e
médios (CE).
Calbindina
Espessura N CE
Animais
1 32,1 76217 0,06
2 32 85774 0,06
3 30,5 69675 0,06
Média 31,87 72225 0,06
D.P 8094
CV2=(D.P/Média)
2 0,0109
CE2
0,0036
CE2/CV
2 0,3274
CVB2
0,0073
CVB2(% de CV
2) 67,25%
Calretina
Espessura N CE
Animais
1 32,2 76120 0,06
2 32,1 57034 0,05
3 31,5 63456 0,06
Média 31,8 65538 0,06
D.P 9714 CV
2=(D.P./Média)
2 0,0219 CE
2 0,0036
CE2/CV
2 0,1638
CVB2
0,0183
CVB2(% de CV
2) 83,6%
Parvalbumina
Espessura N CE
ANIMAIS
1 32,1 52376 0,05
2 31,9 37736 0,07
3 32 42567 0,06
Média 32 44226 0,06
D.P 7459
CV2=(D.P/Média)2 0,0284
CE2 0,0036
CE2/CV2 0,1265
CVB2 0,0248
CVB2(% de CV2) 87,3%
CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.
51
Histograma 3 - Na região orbito-frontal do córtex pré-frontal, o grupo CR-ir apresentou
uma maior densidade celular quando comparado ao grupo PV-ir (ANOVA –Newman Keuls
p<0.001) ou ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.001). Por outro lado a
densidade celular entre os grupos PV-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas
significativas quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05).
A região medial caracterizada pela ausência da camada IV denominada como
região agranular, difere das outras duas regiões que formam o córtex pré-frontal, quando
analisamos a densidade celular entre os grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir. O grupo PV-ir
apresentou apresentou a menor densidade celular (44.230 ± 7.460 celulas/mm3) quando
comparado a densidade celular do grupo CB-ir (65.540 ± 9.715 células/mm3) ou
comparada a densidade celular do grupo CR-ir (77.200 ± 8.096 células/mm3) (Anova F =
11.69 p<0.01), no entanto a densidade celular entre os grupos CB-ir e CR-ir não
demonstraram diferença estatística significativa (p>0.05). Resultados compilados no
histogtograma 4
As tabelas 8 e 9 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a
contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na
PFC ORBITOFRONTAL
CB CR PV
0
20000
40000
60000
80000
100000
número de celulas/mm
3
52
regiãomedialdo córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de
variação biológica para cada grupo celular.
Histograma 4 - Na região medial do córtex pré-frontal, o grupo PV-ir apresentou uma
menor densidade celular quando comparado ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls
p<0.05) ou ao grupo CR-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.01). Por outro lado a densidade
celular entre os grupos CR-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas significativas
quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05).
PFC MEDIAL
CB CR PV
0
20000
40000
60000
80000
100000
número de celulas/mm
3
53
Tabela 8. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV
(ΣQ), na região orbital do córtex pré-frontal do sagui.
Animais a (caixa) (µm)2
A (X, Y) (µm)2
asf tsf ssf N de caixas
N de secções
ΣQ
Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 141 5 56793
Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 125 5 60455
Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 155 5 50302
Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 142 5 87983
Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 124 5 96551
Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 145 5 89076
Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 147 5 58000
Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 123 5 38217
Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 132 5 42457
Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções.
54
Tabela 9. Estimativa do número de células imunorreativas (N) para CB, CR e PV com
coeficiente de erro para região orbital do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e
estimativa individual (Média, N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e
médios (CE).
.
Calbindina
Espessura N CE
Animais
1 32,1 54105 0,06
2 31,7 36080 0,06
3 30,5 42457 0,06
Média 31,4 44213 0,06
D.P 9139
CV2=(D.P/Média)
2 0,0427
CE2
0,0036
CE2/CV
2 0,0842
CVB2
0,0391
CVB2(% de CV
2) 91,6%
Calretina
Espessura N CE
Animais
1 32,2 54103 0,06
2 31,9 36080 0,06
3 31,5 42457 0,06
Média 31,9 44213 0,06
D.P 8284
CV2=(D.P./Média)
2 0,0088
CE2 0,0032
CE2/CV
2 0,3637
CVB2
0,0056
CVB2(% de CV
2) 63,6%
Parvalbumina
Espessura N CE
Animais
1 32,1 56793 0,06
2 31,9 60455 0,06
3 32 50302 0,06
Média 32 55850 0,06
D.P 5141
CV2=(D.P/Média)
2 0,0084
CE2
0,0036
CE2/CV
2 0,4247
CVB2
0,0048
CVB2(% de CV
2) 57,5%
CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.
55
4.8 Análise de variância (ANOVA) entre áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal
em relação ao número estimados de células imunorreativas para CB, CR e PV
Após observamos que o número estimado dos grupos celulares pode variar em
uma determinada região, passamos a investigar se o número estimado dos diferentes
grupos celulares poderiam apresentar diferenças entre as diferentes áreas investigadas.
Dessa maneira pareamos as três regiões do córtex pré-frontal considerando a média do
número estimado para cada grupo imunorreativo.
Quando comparamos a densidade celular dos grupos imunorreativos, entre as
diferentes regiões do córtex pré-frontal caracterizadas citoarquitetonicamente
encontramos diferenças para o grupo CR-ir (F= 17,69 p<0.01), assim como para o grupo
CB (F= 5,38 p<0.05), que podem traçadas com diferenças significativas entre as região
eulaminada e a região agranular para o grupo CR-ir, (p<0.01) assim como entre a região
eulaminada e a região disgranular (p<0.01), no entanto a densidade celular do grupo CR-
ir não apresentou diferença significativa entre a região agranular e a região disgranular
(p>0.05). Resultados compilados no histograma 5
Histograma 5 – O grupo CR-ir demonstrou variação na sua densidade entre a região
dorsolateral e a região medial (p<0.01), assim quando comaparada com a região
orbitofrontal (p<0.01), no entanto a densidade celular não apresentou diferenças estatísticas
significativas entre as regiões medial e orbitofrontal (p>0.05)
PFC CR
MED. DORSLAT. ORBITOFRONT.
0
50000
100000
150000
número de celulas/mm
3
56
A região agranular assim como a região disgranular apresentram uma baixa
densidade celular para o grupo CB-ir quando comparadas com densidade celular da
região eulaminada (F = 5.38 p<0.05), enquanto que a densidade celular para o grupo CB-
ir entre as regiões disgranular e agrnular não apresentaram diferenças estatísticas
significativas (p>0.05). Dados compilados no histograma 6.
Histograma 6 – A densidade celular para o grupo CB-ir apresentou diferença significativa
apenas entre as regiões dorslateral e orbitofrontal (p<0.05), enquanto que as outros
possíveis pareamentos entre as regiões não apresentaram diferenças estatísticas
significativas (p>0.05)
Em contraste aos grupos CB-ir e CR-ir, o grupo PV-ir apresentou uma relativa
uniformidade na sua densidade celular através das diferentes regiões do córtex pré-frontal
PFC CB
MED. DORSLAT. ORBITOFRONT
0
20000
40000
60000
80000
100000
número de celulas/mm
3
57
Histograma 7- O grupo PV-ir apresentou uma densidade celular relativamente homogênea
entre as diferentes regiões do córtex pré-frontal em relação aos outros grupos celulares
analisados (p>0.05)
PFC PV
MED. DORSLAT. ORBITOFRONT.
0
20000
40000
60000
80000
número de celulas/mm
3
58
5 Discussão
5.1 Considerações sobre a utilização de marcadores neuroquímicos no estudo da
heterogeneidade das populações de interneurônios no córtex cerebral.
Muitos estudos têm descrito a grande diversidade dos neurônios GABAérgicos,
considerando suas características neuroquímicas, eletrofisiológicas e morfológicas
(DeFelipe, 2002; Druga, 2009; Markram et al 2004). Essa população neuronal altamente
heterogênea está relacionada a diferentes funções que incluem sincronização das
atividades oscilatórias corticais e plasticidade sináptica (Druga, 2009; Markram et al.,
2004). Além disso, estudos recentes têm demonstrado que grupos de neurônios
GABAérgicos distintos coordenam a atividade das grandes populações de neurônios
piramidais (Markram et al., 2004). A caracterização dos diferentes subtipos de neurônios
GABAérgicos é particularmente importante para o entendimento das funções cerebrais.
Um dos grandes problemas no estudo dos neurônios GABAérgicos, se dá pela
falta de uma classificação padronizada no que tange a grande diversidade dessa
população. Atualmente o emprego da classificação neuroquímica é utilizada
principalmente no estudo da grande heterogeneidade GABAérgica. No entanto um
determinado marcador neuroquímico pode ser expresso em diferentes grupos
morfológicos, assim como um determinado grupo morfológico pode expressar diferentes
marcadores. Além disso, diferentes marcadores neuroquímicos podem ser co-expressos
em neurônios individuais. Mesmo apresentando limitações, a análise baseada na
caracterização neuroquímica tem méritos inegáveis.
A introdução da imunohistoquímica nos anos 1970 e 1980 representou uma das
maiores inovações para o entendimento dos circuitos corticais. A utilização dessa
ferramenta possibilitou a investigação dos padrões sinápticos entre diferentes grupos
59
celulares, permitindo inferir aspectos gerais dos circuitos corticais. Um importante
avanço na caracterização dos interneurônios e nos estudos de novos aspectos dos
circuitos corticais foi a demonstração de que certos grupos de interneurônios
morfologicamente identificados podem expressar proteínas ligantes de cálcio (Condé et
al., 1999; DeFelipe, 1993;1997; 2002; Gabbot & Bacon, 1996).
A vantagem da marcação imunohistoquímica em relação a outras técnicas como a
coloração de Golgi e a marcação por injeção intracelular de corantes é que, ao contrário
dessas técnicas, a marcação através da imunohistoquímica é mais replicável e
homogênea, revelando consistentemente detalhes finos da distribuição dos grupos
celulares (DeFelipe, 1997; 1999; 2002). A imunohistoquímica permite a investigação da
densidade e distribuição dos terminais axonais de diferentes grupos celulares, bem como
a análise das conexões sinápticas entre os grupos celulares (DeFelipe, 1997; 1999; 2002;
Gabbot & Bacon, 1996)
Outra grande vantagem no emprego dos marcadores neuroquímicos é a
compatibilidade com a análise quantitativa. Uma vez que a imunomarcação pode revelar
uma grande massa de neurônios GABAérgicos, o emprego dessa metodologia permite
uma estimativa precisa do número e/ou densidade desses subtipos neuronais em regiões
específicas do cérebro (Jino & Kosaka, 2006). Os marcadores neuroquímicos são
bastante úteis não apenas na investigação da organização anatômica, mas também podem
estimar mudanças patológicas associadas a algumas doenças e desordens como a
epilepsia e a isquemia (Arabadzisz & Freund, 1999; Arellano et al., 2004; Cobos et al.,
2005).
60
5.2 Imunorreatividade para as proteínas ligantes de cálcio entre os diferentes tipos
morfológicos de interneurônios no córtex pré-frontal do sagui.
Os interneurônios perfazem cerca de 20% da população neuronal cortical, com
cerca de doze variedades morfológicas distintas encontradas em quase todas as espécies
de mamíferos (Douglas & Martin, 2004, 2009). No entanto a proporção desses grupos
celulares pode variar entre as áreas corticais de uma determinada espécie ou até mesmo
entre espécies (DeFelipe, 2003; Douglas & Martin, 2009; Hof, 1999; Lund & Wu, 1997;
Kawaguchi & Kubota, 1997).
Apesar de constituírem numericamente o menor grupo entre os neurônios
neocorticais, os interneurônios desempenham importantes funções modulatórias nos
circuitos corticais, respondendo a alterações dinâmicas nas atividades excitatórias,
exercendo controle sobre uma vasta gama de aferências que chegam ao córtex cerebral,
desempenhando atividade sincronizadora e exercendo uma influência direta na escala de
tempo de disparo dos neurônios piramidais (Markram et al., 2004). As funções exercidas
pelos interneurônios são determinadas pelo perfil morfológico, neuroquímico e molecular
característico de cada grupo. Uma classificação mais abrangente levando em
consideração diferentes aspectos morfofisiológicos para a grande diversidade dos
interneurônios é um passo crucial no entendimento da organização dos circuitos corticais.
A pesquisa dos interneurônios corticais foi primeiramente orientada através de
suas características somatodendriticas e axonal, através do emprego de técnicas
modificadas da “reazione nera” de Golgi. Mais tarde com a introdução da microscopia
eletrônica foi possível demonstrar características ultraestruturais e sinápticas desses
elementos. Mais recentemente com o emprego marcadores moleculares e investigações
eletrofisiológicos, dados valiosos tem sido gerados indicando uma grande diversidade
61
fenotípica associada aos interneurônios corticais. Tradicionalmente, as classificações da
heterogeneidade dos interneurônios foram baseadas em descrições apoiadas em critérios
qualitativos não padronizados. Portanto as classificações aplicadas à grande diversidade
morfológica e eletrofisiológica desses grupos muitas vezes diferem entre si (DeFelipe,
1997; Markram et al., 2004), e não estabelecem claramente os padrões mais relevantes
para o que se determina ser uma classe específica de interneurônios. A heterogeneidade
estrutural dos interneurônios reflete diferenças funcionais, mas seu significado permanece
não totalmente esclarecido.
No presente trabalho, caracterizamos os diferentes grupos imunorreativos para
CB, CR e PV no córtex pré-frontal do sagui, considerando os parâmetros morfométricos
somatodendriticos associados à caracterização de suas projeções axonais e os padrões de
distribuição laminar e regional. Parâmetros morfométricos somatodendriticos têm sido
usado exaustivamente na caracterização das grandes populações de neurônios piramidais
em diferentes áreas corticais de primatas e roedores (Elston et al., 1997, 2002, 2006a,
2006b, Benevides-Piccione et al., 2002, 2006) No entanto o perfil somatodendritico tem
sido pouco utilizado na caracterização dos grupos de interneurônios Freire et al., 2010).
Acreditamos que esse tipo de análise, em conjunto com a caracterização das projeções
axonais, fornece um bom arcabouço na classificação de grupos neuronais GABAérgicos.
Diversos estudos têm utilizado amplamente as proteínas ligantes de cálcio
(calbindina, calretinina e parvalbunia) para subdividir os células GABAérgicos em
grupos neuronais distintos, considerando perfis axonais, eletrofisiológios e moleculares
expressos por diferentes grupos. A imunohistoquímica para proteínas ligantes de cálcio
tem revelado padrões axonais característicos para as diferentes classes de interneurônios,
permitindo a identificação e classificação dessas células em grupos neuronais distintos.
62
No entanto muitos autores têm negligenciado a morfologia dendrítica, caracterizando-a
superficialmente, enfocando quase sempre padrões axonais já consagrados na
identificação dos diferentes grupos que compõem a população dos neurônios
GABAérgicos.
No presente estudo observamos diferenças entre os perfis somatodendríticos entre
os grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio. A CR agrupou células as
quais apresentaram os perfis somatodendrícos com os maiores graus de complexidade.
Nas camadas supragranulares a CR revelou células multipolares com quatro a cinco
dendritos as quais apresentavam grandes números de bifurcações formando dendritos
altamente ramificados de grandes comprimentos e superfícies. Geralmente essas células
apresentavam um axônio ascendente que se projetava para a camada I. As características
morfológicas desse grupo revelaram semelhanças com as características morfológicas das
células de Martinotti, descritas em outras espécies de primatas e roedores (MacGarry et
al., 2010). Geralmente as células de Martinotti são descritas nas camadas II e V,
caracterizadas por árvores dendríticas elaboradas quando comparadas outros tipos de
interneurônios (Markram et al, 2004), Esse tipo celular geralmente apresenta axônios
com plexos ascendentes os quais estabelecem sinapses com dendritos distais localizados
na camada I (DeFelipe, 2001, MacGarry et al., 2010).
O segundo grupo imunorreativo para CR apresentou células caracterizadas por
dendritos orientados verticalmente. Podemos dividir esse grupo em dois subgrupos. O
primeiro subgrupo apresentou longos dendritos primários que emergiam em cada um dos
polos do corpo celular e se ramificavam em dendritos de segunda ordem. O segundo
subgrupo exibia dendritos primários que emergiam em cada um dos polos do corpo
bifurcando-se e dando origem a um grande número de ramificações. Cada árvore
63
dendrítica formava arranjos proeminentes semelhantes a tufos. Esse segundo tipo celular
foi preferencialmente localizado nas camadas I/III e camada V. Essas células
apresentavam feixes axonais verticais que se projetavam a partir do soma ou de um
dendrito primário. Normalmente os axônios apresentavam colaterais que se ramificam
junto ao corpo celular. Com base nessas características, essas células parecem ser células
duplo buquê descritas no córtex pré-frontal de outras espécies de primatas (Condé et al.,
1994; Lund & Lewis, 1993, Zaitsev et al., 2005). A identificação das células CR como
células duplo buquê é apoiada pelas observações de terminações axonais imunorreativas
para CR. Essas terminações foram caracterizadas por processos verticais com feixes
estreitamente entrelaçados. Normalmente esses feixes apresentaram numerosas dilatações
em forma de botões e um número variável de curtas ramificações. Os terminais axonais
descritos aqui têm sido encontrados no neocórtex tanto de humanos como de macacos
(DeFelipe, 2002; DeFelipe et al, 1990; 1999; DeFelipe & Jones, 1992, Elston &
Gonzalez-Albo, 2003). DeFelipe e colaboradores (1999) demostraram que células duplo
buquê podem apresentar uma distribuição heterogênea em distintas áreas corticais,
apresentando uma alta densidade no córtex temporal inferior, e uma baixa densidade em
no córtex visual secundário (V2).
A CB revelou principalmente grupos de células bipolares com tufos duplos,
caracterizadas por axônios verticais que emergiam do corpo celular, e se projetavam
verticalmente através das camadas celulares. Células bipolares caracterizadas por
axônios verticais descendentes ou ascendentes também foram reveladas com a
imunohistoquímica para CB. No que tange a classificação morfológica esses tipos
celulares constituem grupos distintos.
64
O grupo PV-ir foi caracterizado células multipolares, apresentando de 3 a 4
dendritos de primeira ordem que se bifurcavam próximo ao soma, formando árvores
dendríticas com um grande número de ramificações de segunda ordem.
Frequentemente tem sido descrito que a PV pode ser expressa nas células em
candelabros encontradas em diferentes regiões do córtex de primatas (DeFelipe, 1997;
2003; DeFelipe et al., 1985; 1989; 1999; del Rio et al., 1994). As células em candelabro
são caracterizadas por dendritos multipolares e axônios verticais altamente ramificados
em torno do corpo celular com alta densidade de botões. Os terminais axonais são
caracterizados por fileiras de botões que lembram candelabros. Essas células estabelecem
sinapses com regiões proximais dos axônios das células piramidais (Markram et al.,
2004). No córtex pré-frontal do sagui conseguimos visualizar terminais axonais verticais
semelhantes aos descritos por DeFelipe e colaboradores (1999) nas áreas visuais de
primatas, entretanto, não conseguimos identificar se essas terminações emergiam das
células imunorreativas para parvalbumina. A PV também revelou feixes axonais
horizontais esparsos e com poucos botões que formavam uma trama complexa de
terminações; no entanto também não fomos capazes de identificar suas origens.
5.3 Implicações funcionais das células imunorreativas para proteínas ligantes de
cálcio no processamento cortical
A CB, CR e PV tem sido co-localizadas com GABA em diferentes regiões
corticais em distintas espécies de primatas (Condé et al., 1994; Hendry et al., 1989;
Defelipe, 1997; 1999; Gonzales Albo et al., 2001, Pouget et al, 2009; Zaitsev et al.,
2009). A identificação no presente estudo dessas proteínas em classes específicas de
interneurônios no córtex pré-frontal do sagui pode levar a uma maior compreensão sobre
65
a organização dos circuitos intrínsecos do córtex pré-frontal dos primatas. Nossos
resultados corroboram observações prévias de que, em uma dada área cortical,
populações específicas de interneurônios podem modular diferentes populações de
neurônios piramidais (DeFelipe et al, 1999). Por exemplo, diferentes subpopulações de
neurônios piramidais são implicadas em projeções ascendentes, descendentes e calosas, e
a distribuição laminar dessas subpopulações de neurônios varia de acordo com o tipo de
projeção. Portanto é provável que a diferença na distribuição laminar dos interneurônios
imunorreativos para CB, CR e PV reflita diferenças na circuitaria cortical, por sua vez
relacionada a diferentes formas de processamento cortical descrito nas áreas pré-frontais.
O perfil funcional das subpopulações neuronais é determinado em parte pela
microanatomia e pela organização da microcircuitaria local, dentro de cada área. Assim é
altamente compreensível que existam diferenças substanciais na capacidade de cada
grupo neuronal em integrar aferências.
Inúmeros estudos têm mostrado que os interneurônios imunorreativos para PV no
córtex pré-frontal dos primatas formam grupos fisiológicos homogêneos, os quais
compartilham propriedades similares com as células PV imunorreativas descritas no
córtex frontal de ratos. Os interneurônios PV estabelecem conexões inibitórias com o
segmento inicial dos axônios das células piramidais (DeFelipe, 1997, Somogyi, 1998,
Zaitsev et al., 2005). Essas aferências inibitórias proximais promovem potenciais
inibitórios pós-sinápticos (IPSPs), com cinéticas rápidas de grande amplitude, quando
comparados com aferências distais (Beirlein et al, 2003; Markram et al., 2004; Zaitsev et
al., 2009). Essas propriedades fornecem uma alta fidelidade temporal assim como um
poderoso controle inibitório sobre os potenciais de ação, que tipicamente ocorre nos
compartimentos proximais dos axônios das células piramidais (Beierlein et al., 2003;
66
Druga, 2009 Markran et al., 2004; Zaitsev et al., 2005; 2009). Esse tipo de integração
sináptica estabelecida entre os neurônios piramidais e os interneurônios está envolvido na
geração de oscilações neuronais sincrônicas, mecanismo através do qual regiões cerebrais
específicas estabelecem redes funcionais transitórias para percepção, cognição e ação
(Freund, 2003; Freund & Ketona, 2007; Makram et al., 2004; Tarczy-Homoch et al.,
1998; Zaitsev et al., 2005; Varela et al., 2001).
Funcionalmente, as células imunorreativas para CB e CR apresentam
propriedades fisiológicas similares, mas diferem nos seus padrões conectivos com
elementos pré e pós-sinápticos (DeFelipe, 2002; DeFelipe et al., 1999; Druga, 2009).
Numerosas células imunorreativas para CB e CR apresentam um padrão dendritico e
axonal com orientação vertical, provavelmente estabelecendo um sistema inibitório
colunar (DeFelipe, 2002). Não obstante, interneurônios imunorreativos para CB
frequentemente estabelecem sinapses com terminações distais de células piramidais na
camada I. Esse fato sugere que, em uma coluna cortical, os interneurônios imunorreativos
para CB estabelecem contatos sinápticos com processos dendriticos distais, modulando o
processamento dendrítico e a integração das aferências sinápticas das células piramidais,
afetando fortemente a relação dos neurônios piramidais com aferências sinápticas
oriundas das camadas supra e infragranulares. (DeFelipe, 1997; 2002; del Rio &
DeFelipe, 1997; Markram et al., 2004). Assim os interneurônios imunorreativos para CB
são muito bem posicionados para modular seletivamente as interações entre as aferências
oriundas das diferentes camadas corticais.
Células imunorreativas para CR estabelecem conexões sinápticas
preferencialmente com dendritos de outros neurônios GABAérgicos. Em um estudo
realizado por Melchitzky e Lewis (2001) no córtex pré-frontal dorsolateral de macacos,
67
foi demonstrado que neurônios imunorreativos para CR recebem uma menor densidade
de sinapses excitatórias, em comparação com dendritos imunorreativos para PV.
Tomadas em conjunto, essas evidências sugerem que os interneurônios imunorreativos
para CR constituem um sistema cuja atividade pode mediar uma rede global de
desinibição (Zeitsev et al., 2005).
5.4 Contextualizando os diferentes padrões da arborização dendrítica.
A arborização dendrítica dos neurônios recebe milhares de sinapses, com efeitos
excitatórios ou inibitórios, rápidos ou lentos, ionotrópicos ou metabotrópicos. Os
dendritos formam uma unidade integrativa funcional e estruturalmente complexa. Os
padrões de ativação das entradas sinápticas determinam se um neurônio disparará um
potencial de ação e como ele responderá a outras ativações sinápticas no futuro (Yuste &
Tank 1996).
A eferência da maioria dos neurônios é expressa como frequência de disparos de
potencias de ação e depende do valor da corrente que alcança o soma. Por outro lado, tal
corrente depende da somação das correntes de eventos sinápticos individuais e de
diversos fatores que influenciam nessa somação: se o dendrito é passivo ou ativo, se as
sinapses são proximais ou distais.
Uma importante questão é de que forma centenas de milhares de sinapses
interagem na arborização dendrítica, afetando sua saída. Alguns aspectos dependem da
estrutura dos neurônios. A influência de uma única entrada sináptica é particularmente
dependente dos dendritos, enquanto que a saída é dependente das distribuições setoriais
do axônio.
68
Recentes avanços em métodos de aquisição da morfologia neuronal digitalizada
em 3D têm permitido medidas quantitativas precisas da complexidade dendrítica. A
disponibilidade desses dados tem levado a uma renovação do interesse por identificar
parâmetros morfológicos capazes de elucidar de que forma a complexidade dendrítica
influencia nas funções neuronais (Rothine et al., 2005) .
Diferenças no tamanho e no grau de complexidade das árvores dendríticas podem
influenciar a capacidade computacional dos neurônios a nível celular e subcelular (Elston
2003; Jacobs and Scheibel, 2002; Spruston, 2008), assim como o número de ramificações
influencia diretamente na capacidade de compartimentalização do processamento
dendrítico (Elston, 2003; Jelinek et al., 2005; Mel, 1999; Rall et al., 1992; Segev, 1998;
Spruston et al., 1999; Stuart et al., 1997).
As diferenças estruturais entre as camadas corticais podem refletir diferenças no
processamento da informação que chega ao córtex (Elston, 2003). Por exemplo,
neurônios corticais caracterizados por pequenas árvores dendríticas têm a capacidade de
integrar aferências em menores áreas, quando comparados às grandes células. Além
disso, a integração das aferências leva à compartimentalização do processamento nas
árvores dendríticas. Como resultado, distintos padrões de ramificações podem mediar
diferentes formas de processamento na árvore dendrítica antes que o sinal chegue ao
corpo celular. Portanto há maior potencial para compartimentalização em camadas que
apresentam células com alta complexidade dendrítica, em comparação com camadas que
apresentam células com menor grau de complexidade ( Benavides et al., 2005; Eslton,
2003)
Diferenças nos parâmetros morfológicos como comprimento dendrítico, volume e
número de ramificações estão intimamente relacionadas com as propriedades
69
eletrofisiológicas dos neurônios (Rothnie et al., 2006). Além disso, diferenças na
distribuição e configuração espacial das aferências na árvore dendrítica podem
influenciar tanto a capacidade funcional dos neurônios como o armazenamento de
memorias dos circuitos corticais (Elston et al., 2003; Stepanyants et al., 2002).
Estudos recentes têm relacionado o potencial de retro-propagação com o
fenômeno da plasticidade sináptica, o qual age como um mecanismo de detecção de
coincidência temporal entre a atividade pré-sináptica e os potenciais de ação pós-
sinápticos (Rothine et al., 2006). A coincidência temporal das aferências sinápticas com o
potencial de ação pós-sináptico pode disparar uma mudança na eficácia sináptica análoga
a lei de Hebb ( Yuste & Denk, 1996).
Estudos de modelagem têm demonstrado diferenças na eficácia da retro-
propagação em diferentes tipos neuronais que podem ser atribuídas a variações da
morfologia dendrítica (Segev & London, 2000; Vetter et al., 2001). Em particular, a
presença de bifurcações e a complexidade das ramificações podem influenciar da
extensão da retro-propagação através das árvores dendríticas (Vetter et al., 2001). Células
com grandes diâmetros dendríticos que apresentem um número reduzido de ramificações
podem apresentar retro–propagação rápida resultando potencias de ação em série
(Krichmar et al., 2002).
As respostas eletrofisiológicas neuronais em resposta a uma despolarização são
correlacionadas com a complexidade da árvore dendrítica, assim células com pequenos
campos dendriticos necessitaria uma menor corrente de despolarização para sair do seu
estado de repouso (Krichmar et al., 2002). A morfologia dendrítica também pode
influenciar no padrão de disparo apresentado pela célula (Krichmar et al, 2002), assim
como na transição entre padrões de disparos (Krichmar et al., 2002).
70
Em conjunto, esses estudos têm demonstrado o papel crucial da distribuição da
massa dendrítica e da complexidade da arborização dendrítica na integração neuronal,
plasticidade sináptica e padrão de disparos que definem a função neuronal.
5.5 Considerações sobre o emprego de ferramentas estereológicas na estimativa
numérica dos grupos neuronais imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no
córtex pré-frontal do sagui.
No presente trabalho estimamos o número de células imunorreativas para
calbindina, calretina e parvalbumina nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex
pré-frontal do sagui, através de métodos estereológicos. A maioria dos métodos de
contagem utilizando a microscopia de luz se baseia em princípios geométrico-estáticos.
Desse modo, para a obtenção de resultados consistentes é necessário um grande número
de determinações, com um grande consumo de tempo. Em tecidos biológicos como o do
cérebro, geralmente os grupos celulares são extensos e esparsos, fazendo-se necessário o
fracionamento da região em secções seriadas, de modo a obter um mapeamento completo
da região de interesse. Através de contagem celular nessas secções podemos estimar o
tamanho real da população. No entanto, estimar o número dessas grandes populações
através de contagens extensivas se torna pouco prático. Nesses casos, uma abordagem
amplamente aceita para estimar o tamanho de uma determinada população celular se faz
pelo uso de técnicas estatísticas estereológicas.
A estereologia é um método que utiliza amostras sistemáticas para fornecer um
número estimado sem viés. Através de abordagens estereológicas podemos obter um
número fidedigno de células não subestimado, o que poderia ocorrer se utilizássemos
71
métodos convencionais (Mandarin Lacerda, 2003). A aplicação de contagens sistemáticas
diminui a necessidade de contagens exaustivas, reduzindo o número total de células
contadas necessárias para se fazer uma estimativa precissa do tamanho de uma
determinada população celular (Glaser & Wilson, 1998). Em outras palavras, aplicando
amostragens sistemáticas, podemos estimar de uma maneira robusta o número real de
uma população celular em uma determinada área de interesse, a partir do número total de
células contadas em determinados espaços de contagem, e da probabilidade amostral
(Schmitz & Hof, 2005).
Os métodos estereológicos desenvolvidos nas ultimas décadas têm revolucionado
as estimativas quantitativas das grandes populações celulares no cérebro, fazendo com
que sua utilização seja aplicada sempre que dados tridimensionais precisem ser extraídos
a partir de medições em secções (Jelsing et al, 2006). O fracionamento óptico é um
método estereológico sem viés, o qual tem seu principio em amostragens uniformes,
sistemáticas e aleatórias que permitem inferir de maneira robusta, a partir do número total
de partículas contadas, o número de células de uma população (Gundersen, 1986;
Gurdesen et al., 1988). A estimativa fornecida pelo emprego do fracionamento óptico
apresenta vantagens do ponto de vista estatístico e de esforço empreendido em relação a
outras metodologias estereológicas (Schmitz & Hof, 2005).
Na estereologia a precisão do tamanho estimado de uma população celular
baseada no fracionamento óptico é aferida pela estimativa do coeficiente de erro (CE).
Um estudo realizado por Glaser e Wilson (1998) através de simulações computacionais
revelou que o coeficiente de Scheaffer relacionado a uma estimativa populacional através
do fracionamento óptico é o que mais se aproxima de um coeficiente de erro real. O
coeficiente de Scheaffer representa o grau de incerteza relacionado com potenciais erros
72
metodológicos, sendo esperado que esse coeficiente contribua menos que 50% para a
variação total (CE2/CV2 <0.5). Na metodologia aplicada no presente trabalho, o
coeficiente de erro para todas as estimativas foi menor 0.5, evidenciando que os
potenciais erros metodológicos empregados nas contagens foram mínimos.
O coeficiente de variação biológica foi outro parâmetro utilizado para avaliar a
metodologia aplicada na estimativa dos grupos celulares. A variação biológica consiste
na variação natural, de ocorrência fisiológica, independente de variáveis pré-analíticas.
Esse coeficiente é dado pela formula matemática (CVB2 = CV2 – CE2). Para considerar a
metodologia aplicada adequada, é preciso que a variação biológica contribua com mais
de 50% para o coeficiente de variação global. Desse modo o coeficiente de erro é
adequado sempre que esse contribuir menos que a variação biológica para o coeficiente
de variação global.
Quando comparamos o número estimado de células imunorreativas para as três
proteínas ligantes de cálcio por região entre os indivíduos de cada grupo, observamos
uma diferença de 21% na região medial, 15% na região dorsolateral e de 12% na região
orbitofrontal para CB. Para CR, observamos uma diferença de 15% na região medial,
14% na região dorsolateral e de 8% na região orbitofrontal entre os indivíduos do grupo.
No caso da PV, a diferença entre os indivíduos para a região medial foi de 23%, 12%
para a região dorsolateral e de 30% para a região orbitofrontal. Essas diferenças podem
ser explicadas pela variação biológica entre os indivíduos, assim como por variações
relacionadas ao processamento do material biológico. Entre as variáveis mais comuns
podemos exemplificar a fixação do tecido durante o processo de perfusão ou as etapas de
criproteção às quais o tecido foram submetidos. Essas variáveis podem influenciar
diretamente o processo imunohistoquímico. Pequenas variações na espessura das secções
73
teciduais podem acarretar diferenças na penetração dos anticorpos, constituindo outra
variável que se deve levar em consideração para explicar a diferença do número de
células imunorreativas entre os animais. Desse modo, se houver uma baixa penetração do
anticorpo no tecido, consequentemente haverá um baixo padrão de reatividade revelada
pelo cromógeno, no nosso caso o DAB. Assim muitas vezes a célula reativa ficará
mascarada pelo padrão reativo da neuropila, fazendo com a mesma não seja identificada
durante a contagem. Devemos considerar também a diferença de idade entre os
indivíduos. No nosso caso os animais foram cedidos pelo IBAMA como animais adultos
jovens, mas sem uma estimativa exata da faixa etária.
5.6 Homogeneidade versus heterogeneidade da arquitetura inibitória cortical.
A imunohistoquímica para as proteínas ligantes de cálcio tem sido usada para
parcelamento de áreas corticais (Bourne et al., 2007; Ding et al., 2009; Ongur et al.,
2003; Nimchinsky et al., 1997). Entretanto, existem poucos estudos quantitativos que
examinem a distribuição dos interneurônios GABAérgicos no córtex pré-frontal de
primatas (Condé et al., 1999; DeFelipe et al., 1999; Dombrowski et al., 2001; Elston &
Gonzales-Albo, 2003; Sherwood et al., 2010).
No presente trabalho, observamos que os grupos imunorreativos para as diferentes
proteínas ligantes de cálcio podem apresentar diferenças em relação a densidade celular
de acordo com as características citoarquitetonicas de cada região investigada. Desse
modo as regiões que compõe o córtex pré-frontal apresentam distintos perfis de
densidade celular e citoarquitetura, os quais podem ser descritos de uma maneira
quantitativa. Considerando esses distintos perfis, identificamos a região dorsolateral
como uma região granular caracterizada pela presença das seis camadas celulares bem
74
definidas. Essa região apresentou uma alta densidade celular para o grupo CR-ir quando
comparada a densidade celular apresentada pelo grupo na região orbital a qual foi
caracterizada como uma região disgranular assim como a região medial caracterizada
como região agranular caracterizada pela ausência da camada celular IV. Por outro lado a
densidade celular dos grupos CB-ir e PV-ir se mantiveram homogênea através das três
regiões analisadas.
Quando comparmos a densidade celular entre os grupos imunorreativos, grupo
CR-ir monstrou uma densidade celular duas vezes maior quando comparado a densidade
do grupo CB-ir assim como do grupo PV-ir. Essas diferenças foram mais evidentes
quando comparamos a densidade celular entre os grupos nas região dorsolateral granular
e na região orbito-frontal disgranular. Entretanto a região medial agranular foi
caracterizada por uma certa homogeneadade para a densidade celular entre os grupos.
Considerando a análise estereológicas para os grupos celulares imunorreativos para as
proteínas ligantes de cálcio, o córtex pré-frontal pode ser fracionado em três regiões
distintas levando em consideração o perfil citoarquitetônico característico de cada região,
assim como a densidade celular dos grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir em cada uma das regiões
analisadas.
Diferenças regionais para a densidade celular dos grupos neuronais
imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio têm sido descritas em diferentes
espécies primatas (DeFelipe et al., 1999, Dombrowski et al., 2001; Elston e Albo, 2003;
Kritzer et al., 1992). Quando comparamos os resultados descritos em diferentes trabalhos
aos nossos achados, encontramos algumas diferenças dignas de nota entre as espécies no
que tange à distribuição dos grupos neuronais imunorreativos para CB, CR e PV.
75
Resultados descritos por Elston e Gonzalez-Albo (2003) foram caracterizados por
diferenças na densidade celular dos grupos imunorreativo para CB entre a região
dorsolateral granular e a região orbital disgranular no córtex pré-frontal do macaco da
noite (Aotus trivirgatus). Por outro lado os grupos PV-ir e CR-ir, não apresentam
diferenças significativas, sendo o grupo CB-ir apresentou uma maior densidade celular
entre os grupos analisados.
Dombrowski e colaboradores (2001) demonstraram que as áreas dorsolaterais
granulares do córtex pré-frontal do Rhesus apresentam uma alta densidade celular para
PV, quando comparada as regiões medias agranulares e as regiões orbitais disgranulares.
Enquanto o grupo CB-ir apresentou uma maior densidade na região órbito-frontal,
quando comparada as regiões dorsais e orbitais. Por outro lado, o grupo CR-ir apresentou
uma distribuição homogênea entre as áreas analisadas. Múltiplas comparações entre as
áreas demonstraram que grupo PV-ir apresentou uma densidade celular duas vezes maior
em relação a densidade celular do grupo CB-ir e ao grupo CR-ir em todas as regiões do
córtex pré-frontal analisadas.
O estudo realizado por Condé e colaboradores (1999) no córtex pré-frontal do
macaco cynomolgus (Macaca fascicularis) demonstrou uma distribuição homogênea
entre grupos imunorreativos para as proteínas ligantes cálcio nas diferentes regiões
corticais. No refererido estudo, análises quantitativas demonstraram que grupos CR-ir,
CB-ir e PV-ir não se diferenciam em relação as suas densidades celulares entre as
regiões granulares e regiões agranulares analisadas. No entanto a análise de variância
revelou diferenças sutis na densidade celular entre os grupos analisados. As análises,
demonstraram que o grupo CR-ir, apresentou uma densidade celular aproximadamente
76
duas vezes maior, quando comparado aos grupos CB-ir e PV-ir em todas as áreas
analisadas.
Comparações entre áreas de diferentes modalidades corticais tem demonstrado
uma densidade de interneurônios imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio
aproximadamente duas vezes maior nas áreas do córtex pré-frontal quando comparadas
com as outras áreas corticais, refletindo especializações regionais na circuitaria dos
interneurônios (Eslton e Gonzalez-Albo, 2003). Por outro lado, as diferenças regionais
da densidade celular entre os grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio
pode variar de acordo com o antígeno. Por exemplo, a CR apresentou uma diminuição
progressiva nas regiões órbito-frontal e medial, enquanto que os grupos CB e PV
apresentaram diminuições sutis entre as regiões.
Como mencionado acima, a variação quantitativa nos diferentes estudos pode ser
atribuída a diferentes fatores, como espécies utilizadas como modelo, fatores que
interferem nas técnicas aplicadas como retração tecidual, penetração do anticorpo, assim
como a diferenças metodológicas aplicadas na estimativa do número de células. Além
dos fatores descritos, alguns dos estudos mapearam a distribuição dos grupos de celulares
exclusivamente em regiões disgranulares ( Elston & Gonzalez Albo,2003) ou em regiões
eulaminadas (Condé et al., 1999; Elston & Gonzalez-Albo, 2003).
De que forma surgem as características celulares e moleculares específicas nas
diferentes regiões do córtex pré-frontal? Os padrões de proliferação celular, duração do
ciclo celular, migração e eliminação neuronal apresentam papeis fundamentais na
formação do córtex cerebral (para revisão Caviness et al., 1995; McConnell, 1991),
podendo ser responsáveis pelos distintos perfis das diferentes áreas que formam o córtex
pré-frontal. De acordo com as estimativas de Canviness e colaboradores (1995), durante a
77
fase inicial do desenvolvimento cortical, a duração do ciclo celular é mais longa sendo
que poucas células migram para o córtex, sugerindo que as áreas do córtex pré-frontal
medial agranular que apresentam uma menor densidade celular completam seu
desenvolvimento em um período mais curto que áreas eulaminadas. Nossos dados
demonstram que a densidade celular foi aproximadamente equivalente nas camadas
profundas em todas as regiões do córtex pré-frontal, enquanto que as camadas superiores
apresentaram diferenças sutis entre as regiões, de sorte que a região medial agranular
apresentou um número menor de células em relação as áreas dorsolaterais eulaminadas.
Essa evidencia é consistente com a fase inicial uniforme do desenvolvimento cortical
descrito por Rakic (1988), sugerindo que o período de desenvolvimento pode ser
prolongado nas regiões eulaminadas. A alta densidade celular na região dorsolateral pode
ser explicada pela alta densidade nas camadas II/III, que são formadas após as camadas
mais profundas de acordo com o padrão de desenvolvimento “inside-out” apresentado
pelo córtex (Rakic, 2009).
Nossos dados demonstram que os números de neurônios imunorreativos para CB
e PV não diferem nas distintas áreas do córtex pré-frontal, revelando certas características
comuns na organização neurobiológica do córtex dos primatas. No entanto algumas
características regionais da população dos neurônios GABAérgicos pode ser relacionada
com o perfil específico do processamento cortical de cada área. Em particular a inibição
intracolunar por neurônios GABAérgicos tem sido implicada aos padrões temporais de
atividade das assembleias neuronais (Markram et al., 2004), dessa forma, especializações
dos circuitos inibitórios podem contribuir para as diferenças no processamento entre as
modalidades sensórias. Similarmente nossos resultados sugerem que certos processos
78
computacionais das áreas do córtex pré-frontal do sagui são preferencialmente
relacionados a padrões citoarquitetônicos específicos.
79
6 Conclusão
A imunohistoquímica para CB, CR e PV revelou detalhes da morfologia
somatodendritica e axonal de subpopulações neuronais, permitindo estudo
morfofuncional detalhado. A maioria das células imunorreativas apresentaram
características de interneurônios, caracterizados por diferentes padrões dendríticos e
axonais. No entanto fomos capazes de classificar cada grupo celular através de
características morfológicas. Juntamente com a caracterização axonal, a caracterização
através de parâmetros morfométricos das árvores dendríticas nos fornece um ótimo
arcabouço para a classificação morfofuncional dos diferentes grupos de interneurônios.
A aplicação das técnicas de imunohistoquímica juntamente com a aplicação de
ferramentas estereológicas nos permitiu caracterizar a distribuição dos grupos celulares
de acordo com o perfil citoarquitetonico cada região analisada no córtex pré-frontal do
sagui. Dessa maneira fomos capazes de fracionar o córtex pré-frontal em três regiões
distintas apoiadas na densidade e distribuição celular de cada cada grupo imunorreativo
associada ao perfil citoarquitetônico de cada uma, revelando semelhanças e as diferenças
intrínsecas na organização dos circuitos inibitórios.
80
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