UNICAMP
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO
MESTRADO
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS QUÍMICOS
MODELAGEM E SIMULAÇÃO DE UM PROCESSO INOVA TIVO
PARA SÍNTESE ENZIMÁTICA DE DEXTRANA: VERIFICAÇÃO DA
APLICABILIDADE DO SISTEMA PARA PROCESSOS INDUSTRIAIS
Sueli Rodrigues
Setembro de 2000
Campinas -SP
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS QUÍMICOS
MODELAGEM E SIMULAÇÃO DE UM PROCESSO INOVATIVO PARA
SÍNTESE ENZIMÁTICA DE DEXTRANA: VERIFICAÇÃO DA
APLICABILIDADE DO SISTEMA PARA PROCESSOS INDUSTRIAIS
Autora: Sueli Rodrigues
Orientadora: Liliane Maria Ferrareso Lona
iii
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do titulo de Mestre em Processos Químicos.
Setembro de 2000
Campinas -SP
{!Wlt;,Ai•d~
TI:CA t:l:lli'111!M.
CM-00153431-7
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIDLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA - BAE - UNICAMP
R618m Rodrigues, Sueli
Modelagem e simulação de um processo inovativo para síntese enzimática de dex:trana: verificação da aplicablidade do sistema pra processos índustriais f Sueli Rodrigues.--Campinas, SP: [s.n.], 2000.
Orientadora: Liliane Maria Ferrareso Lona Dissertação (mestrado) -Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Modelos matemáticos. 2. Simulação (Computadores digitais). 3. Adsorção. 4. Bioreatores. I. Lona, Liliane Maria Ferrareso. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
Dedico esta tese aos meus pais que
sempre deram todo apoio e incentivo
à minha formação profissional.
1X
"Não desças os degraus do sonho para não
despertar os monstros. Não subas aos sótãos,
onde os deuses, por trás das suas máscaras,
ocultam o próprio enigma. Não desças, não
subas, fica. O mistério está é na tua vida! É
um sonho louco este nosso mundo ... "
Mário Quintana
XI
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos os que fazem ou fizeram parte de minha vida, os
quais direta ou indiretamente contribuíram para a realização desta tese.
À professora Liliane pela excelente orientação dada a este projeto, pela sua
dedicação, atenção e amizade.
À F APESP pela credibilidade e incentivo fmanceiro, o que viabilizou a realização
desta tese.
Ao assessor da FAPESP, e aos Professores César Santana e Francisco Maugeri,
pelas informações, análises, comentários e sugestões, que em muito contribuíram para a
elaboração da tese.
A todos os professores do Departamento de Processos Químicos pelo apoio
dispensado durante o curso de mestrado.
Aos colegas do laboratório Fabiano e Pauline pela amizade e momentos de lazer.
Aos funcionários da Faculdade de Engenharia Química, em especial a Eunir,
secretária do departamento pela atenção e ajudada dada no tocante a burocracia interna da
faculdade.
Ao meu pai pela força e incentivo ao meu desenvolvimento pessoal e profissional,
e aos demais colegas da pós-graduação pela amizade.
NOMENCLATURA
RESUMO
ABSTRACT
CAPÍTULO! INTRODUÇÃO
CAPÍTUL02 REVISÃO BffiLIOGRÁFICA
xiü SUMÁRIO
xvii
xxi
xxiii
1
2.1. Alguns Conceitos Biotecnológicos 4 2.1.1 Biopolimeros Extracelulares 4 2.1.2 Características Reológicas de Soluções de Polissacarídeos 5 2.1.3 Projeto de Reatores Microbiológicos 7 2.1.4 Recuperação de Polissacarídeos 1 O 2.1.5 Proteínas 12
2.2 Adsorção 17 2.2.1 Introdução 17 2.2.2 Influência da Temperatura 21 2.2.3 A Isoterma de Adsorção de Langmuir 22 2.2.4 O calor de Adsorção 27 2.2.5 Adsorção de Proteínas 28 2.2.6 Adsorção em Tanque Agitado 29
2.3. Cinética Enzimática 30 2.3 .1 Introdução 30 2.3.2 Cínética Enzimática 32
2.4. Síntese de Dextrana 36 2.4.1 Introdução 36 2.4.2 Produção de Dextrana 38 2.4.3 Síntese da Enzima 42 2.4.4 Síntese de Dextrana in vitro 45 2.4.5 Ação da Dextrana-sacarase Sobre a Sacarose em Condições Industriais 49 2.4.6 Purificação Enzimática e Imobilização 52
2.5. Redes Neurais 54 2.5 .1 Introdução 54 2.5.2 Utúdades de Processamento 55 2.5.3 Conexão entre as Utúdades 55 2.5.4 Ativação e Regras de Saída 56 2.5.5 Topologia 57 2.5.6 Treinamento da Rede 57 2.5.7 Modificação dos Padrões de Conectividade 58 2.5.8 Terminologia 58
2.5.9 Regra de Aprendizagem e Teorema de Convergência 2.5.IO Regra Delta 2.5.11 Backpropagation 2.5 .I2 Deficiências da Backpropagation
CAPÍTUL03 MODELO MATEMÁTICO
3 .I Introdução 3 .2 Modelagem do Reator Duplo Estágio 3.2 Modelagem do Reator Triplo Estágio 3.4 Resultados
CAPÍTUL04 MODELAGEM CONSIDERANDO AS RESISTÊNCIAS À
TRANSFERÊNCIA DE MASSA 4.I Introdução 4.2 Desenvolvimento do Modelo de Adsorção 4.3 Modelagem do Sistema Duplo estágio Incluindo a Resistência à
Transferência de Massa no Filme Líquido 4.4 Modelagem do Sistema Duplo estágio Incluindo a Resistência a
Transferência de Massa no Filme Líquido e Difusão nos poros 4.5 Resultados
CAPÍTULOS MODELAGEM CONSIDERANDO O TAMPÃO DE DESSORÇÃO
5 .I Introdução 5.2 Modelagem Matemática para o Reator Triplo Estágio
Considerando o balanço de NaCI 5.3 Resultados e Discussões
CAPÍTUL06 MODELO HÍBRIDO COM REDES NEURAIS
6 .I Introdução 6.2 Topologia da Rede 6.3 Modelagem Híbrida 6.4 Treinamento da Rede 6.5 Resultados e Discussões
CAPÍTUL07 VERIFICAÇÃO DA APLICABILIDADE DO SISTEMA PARA PROCESSOS INDUSTRIAIS
7 .I Introdução 7.2 Simulações 7. 3 Verificação da Aplicabilidade do Sistema para
Processos lndustrias 7. 4 Estimativa Econômica
xiv
59 60 6I 62
63 63 64 66 69
92 92 92
97
99 IOO
105 I05
I06 I08
115 115 116 117 118 119
123 I23 I25
130 134
XV
7. 5 Considerações finais 13 7
CAPÍTULOS CONCLUSÃO E TRABALHOS FUTUROS 138
8.1 Conclusão 138 8.2 Trabalhos Futuros 140
CAPÍTUL09 BffiLIOGRAFIA 142
APÊNDICE 1 MODELAGEM SIMPLIFICADA 147
APÊNDICE2 RESOLUÇÃO DO MODELO DE ADSORÇÃO DE HORTSMANN E CHASE 151
APÊNDICE3 ADSORÇÃO DA DEXTRANA-SACARASE EM DEAE-CELULOSE 155
APÊNDICE4 TREINAMENTO DA REDE 159
APÊNDICES CONSIDERAÇÕES SOBRE O ESTADO ESTACIONÁRIO 161
A,b,c = constantes empíricas
C subs = concentração de substrato (g/1)
C 1 = concentração de enzima livre no estágio 1 (g/1)
C2 = concentração de enzima livre no estágio 2 (g/1)
€ 3 = concentração de enzima livre no estágio 3 (g/1)
€0 = concentração de enzima livre no seio da solução (g/1)
€ru = concentração da enzima livre na superfície da resina (g/1)
€ru1= concentração de enzima no primeiro ponto de colocação ortogonal (ponto mrus
próximo à parede) (g/1)
€oiz = concentração de enzima no segundo ponto de colocação ortogonal (ponto mais
próximo ao centro) (g/1)
€cofatores= concentração de cofatores (g/1)
ei = concentração da enzima na fase líquida no interior dos poros
€mib = concentração de inibidores (g/1)
€o = concentração inicial de enzima no estágio de dessorção (g/1)
D =diâmetro da partícula (m)
DAB = difusividade de A em B ( m%)
Der= difusividade efetiva (m%)
E1 =concentração salina no tanque 1 de dessorção (mol/1)
E2 =concentração salina no tanque 2 (mol/1)
E3 =concentração salina no tanque 3 (mol/1)
Eo = concentração salina na corrente de alimentação do estágio de dessorção (mol/1)
Eo1= concentração inicial de sal no estágio de dessorção (mol/1)
F1 =vazão de alimentação do estágio 1 (l/h)
F2 =vazão de alimentação de tampão no estágio 2 (1/h)
F3 =vazão de alimentação de tampão no estágio 3 (1/h)
FR =vazão de reciclo (l/h)
g =constante gravitacional (rn!s2)
k 1 = constante cinética no sentido da adsorção (11 g h)
k2 =constante cinética no sentido de dessorção (h-1)
k3 = constante cinética do processo de dessorção (h"1)
lif= coeficiente de transferência de massa (rn!s)
Km = constante de Michaelis-Menten (g!I)
MA= peso molecualr da enzima (dàltons)
NNu= número de Nusselt
NPr = número de Prandtl
NRe = número de Reynolds
Nvi = viscosidade aparente/ viscosidade aparente à temperatura da parede
q1 = concentração de enzima adsorvida no estágio 1 (g!I res)
q2 = concentração de enzima adsorvida no estágio 2 (g!l res)
q3 = concentração de enzima adsorvida no estágio 3 (g!I res)
qi = concentração de enzima adsorvida (g/1 res )
qm =capacidade máxima de adsorção de enzima na resina (g!I res)
r= ponto interno de colocação em relação ao raio (m)
R= raio da partícula (m)
r reac = taxa da reação enzimática (g!I h)
S1 = concentração de substrato no estágio 1 (g!I)
S2 = concentração de substrato no estágio 2 (g!I)
xviii
S3 = concentração de substrato no estágio 3 (g/1)
So = concentração inicial de substrato no estágio de dessorção (g/1)
t e r = variáveis temporal e espacial
T =temperatura (" C)
t =tempo (rnin)
XIX
TQl = tanque perfeitamente agitado onde ocorre a dessorção da enzima (estágio de
dessorção)
TQ2 = tanque perfeitamente agitado onde ocorre a adsorção da enztma (estágio de
adsorção)
TQ3 = tanque perfeitamente agitado onde ocorre a adsorção da enztma (estágio de
adsorção)
V 1 = volume de líquido no estágio 1 (1)
V 2 = volume de líquido no estágio 2 (1)
V3 =volume de líquido no estágio 3 (1)
x = ponto de colocação admensional
Letras Gregas
p = densidade da solução (kg/m3)
s = fração líquida do sistema
1.1 = viscosidade da solução (kglm s)
v = volume de sólidos utilizado para adsorver a enzima (I)
L1p = diferença de densidade entre a partícula e a fase continua (kg/m3)
-c= tempo admensional
1: = tortuosidade
Ep= porosidade da partícula
RODRIGUES, Sueli. Modelagem e Simulação de um Processo Inovativo para Síntese Enzimátia de Dextrana: Verificação da aplicabilidade da sistema para processos industriais.
A dextrana é polissacrideo obtido a partir da sacarose, matéria prima barata e abundante no mercado Brasileiro. Sua aplicação depende fortemente de seu peso molecular, o qual pode variar de alguns milhares a milhões de daltons. A enzima utilizada para obtenção de dextrana é exógena e estável nas condições ótimas de síntese, o que torna a síntese enzimática viáveL Entretanto a dextrana é tradicionalmente obtida por fermentação devido ao alto custo da enzima.
O objetivo deste trabalho é o estudo da viabilidade da utilização de um sistema continuo para obtenção de dextrana através da síntese enzimática, em escala industrial. O sistema proposto é baseado no processo CARE onde ocorre adsorção e dessorção da enzima, sendo a mesma continuamente reciclada no processo e reutilizada. Essa prática permite o reaproveitamento da enzima e consequentemente a redução dos custos.
A adsorção e dessorção da enzima ocorre em tanques perfeitamente agitados, sendo que a reação enzimática ocorre com a enzima livre no estágio de dessorção. O processo CARE é constituído de dois tanques agitados e foi proposto para purificação de proteínas. A proteína é adsorvida no primeiro estágio, onde ocorre a separação dos produtos iodesejados, sendo posteriormente dessorvida no segundo estágio e recuperada.
O sistema proposto neste trabalho é constituído de três tanques agitados, sendo dois deles destinados a adsorção da enzima e um deles a dessorção e reação enzimática. Com a modelagem do sistema foram realizadas diversas simulações. Os resultados obtidos com o sistema triplo estágio, proposto neste trabalho, foram comparados com os obtidos com a utilização de um modelo duplo estágio. Um modelo mais realístíco que leva em conta as de resistências á transferência de massa na modelagem do sistema duplo estágio também foi desenvolvido. Foi também considerada a presença do tampão de dessorção na modelagem do sistema.
Foi realizado um estudo da viabilidade da utilização de redes neurais para determinação da taxa de reação enzimática. Para isso foi realizada uma modelagem l:n'brida do sistema duplo estágio. O estudo da viabilidade da aplicação do sistema em processos industriais foi baseado em dados experimentais de rendimentos em escala industriaL Esse procedimento aproxima os resultados obtidos por simulação das condições reais de síntese.
A síntese enzimática é uma alternativa interessante, pois apresenta uma maior facilidade de controle do processo além de um maior rendimento. Os resultados obtidos levam a conclusão da viabilidade de aplicação do sistema proposto em escala industrial, tendo sido inclusive realizada urna estimativa do possível faturamento com a comercialização dos produtos.
PALAVRAS CHAVE: Modelagem, Simulação, Síntese Enzimática, Dextrana, Adsorção de Proteínas
xxiii
RODRIGUES, Sueli. Modelagem e Simulação de um Processo Inovativo para Síntese Enzimátia de Dextrana: Verificação da aplicabilidade do sistema para processos industriais.
Dextran is a polysacharide obtained from sucrose, a common and cheap raw material in Brazil. Its application depends on its molecular weight, that presents a large range. There are dextrans of molecular weight from thousands to millions of daltons. The enzymatic synthesis of dextran is possible because the enzyme used to obtain dextran is stable under large conditions, although the tradition process for dextran production is the fermentative one.
The goal of this work is to study the viability of dextran enzymatic synthesis using a contínuos system. The proposed system is based on the CARE process where the adsorption and dessorption ofthe enzyme are carried out in stirred tanks and the enzyme is recycled. In this way, the enzyme can be recovered and the production costs are reduced.
The enzymatic reaction is carried out in the dessorption tank with the dessorbed enzyme. The CARE process was proposed protein purification. The system consists on two stirred tanks where the protein is adsorbed in the first tank and dessorbed and recoverd in the second tank.
In this work a system is proposed which consists on three stirred tanks. In two of them the enzyme is adsorbed and in the another one the enzyme is dessorbed and the enzymatic reation takes place. The results obtained throughout the simulations using the three tanks system, proposed in this work, was compared to the ones obtained with a two tanks. A more realistic model, that takes in account the mass transfer resistances related to enzyme was also developed. The buffers flow rates were also considered in the system modeling.
A hybrid model with neural networks was developed to predict the behavior of the two tanks system, in which the enzymatic reaction rate was obtained trough neural network. Based on experimental yields obtained under industrial conditions, the viability of the proposed system was verified for industrial applications.
KEY WORDS: Modeling, Simulation, Enzymatic Synthesis, Dextran ,Protein adsorption
1
A dextrana é um polissacarideo de glicose, cuja utilização está altamente relacionada
com seu peso molecular. Dextranas de alto peso molecular são empregadas na extração de
petróleo; as de médio peso molecular na indústria alimentícia como espessantes e
estabilizantes, enquanto que a dextrana de baixo peso molecular é utilizada na indústria
farmacêutica, como matéria prima para medicamentos, tendo sido utilizada como expansor
de plasma sanguíneo na segunda guerra mundial, sendo um produto potencial para a
fabricação de sangue artificial. Embora seja um produto de grande aplicabilidade, a
produção mundial de dextrana ainda é modesta, devido ao seu alto custo. No caso da
dextrana clínica, seu custo é ainda mais elevado, pois a mesma é obtida através da hidrólise
de dextrana de alto peso molecular. A dextrana consumida no Brasil é totalmente importada.
A carência em tecnologia para fabricação de bioprodutos é um problema que não se
restringe somente ao Brasil, mas à América Latina como um todo.
A dextrana é obtida a partir da sacarose, matéria prima abundante e de baixo custo
no Brasil. A enzima utilizada na síntese de dextrana é estável nas condições ótimas do
processo, o que viabiliza a obtenção de dextrana via reação enzimática.
Este trabalho visa a modelagem e simulação de um processo inovativo para síntese
enzimática de dextrana. O modelo do reator é baseado no processo CARE, proposto
inicialmente por Pungor et al. (1987) para a purificação de proteínas. O sistema CARE é
constituído de dois tanques agitados contendo em seu interior uma resina adsorvedora. No
primeiro estágio a proteína é adsorvida, sendo separada dos produtos indesejados. No
segundo estágio, ocorre a recuperação da enzima no sistema já purificada através da
dessorção da mesma.
O processo CARE têm sido bastante estudado ultimamente. Rodrigues et al. (1992)
modelaram e simularam o processo para purificação de proteínas. Uma modificação do
processo original para síntese enzimática de dextrana com reciclo de enzima, foi proposto
por Souza (1993), entretanto o sistema apresentou baixa produtividade e alta perda
enzimática. Com a finalidade de elevar a retenção enzimática e aumentar a produtividade,
2 este trabalho propõe uma configuração alternativa ao sistema CARE modificado proposto
por Souza (1993). O sistema proposto é constituído de três tanques agitados onde em dois
deles, a enzima é adsorvida usando um tampão apropriado e no outro, ocorre a dessorção da
enzima e a reação enzimática, conforme figura a seguir:
F1
Tampão dessorção -'-Substrato
Fr+Fl,Cl,ql,Sl
Tampão de adsorção
Fr, C3, q3.S3
Fr+Fl+F2 C2,q2,S2
Figura 1 - Reator triplo estágio para produção de dextrana.
F3
Tampão de adsorção
Produto
Como no processo CARE original, os tanques são considerados reator tanque
agitado de mistura perfeita. Na modelagem, vários parâmetros, tais como parâmetros
cinéticos e operacionais, são levados em consideração. A síntese enzimática de dextrana é
viável devido ao fato da enzima utilizada ( dextrana-sacarase) ser exógena e apresentar alta
estabilidade nas condições ótimas de síntese.
A modelagem inicial proposta para síntese de dextrana utilizando um reator duplo
estágio, proposta por Souza (1993), não leva em consideração as limitação à transferência
de massa e a difusão no interior da resina adsorvente. Entretanto estudos conduzidos por
(Hortsmann e Chase, 1989), evidenciam a influência destas resistências à transferência de
massa na cinética de adsorção. O desenvolvimento de métodos matemáticos para resolução
de equações diferenciais parciais, tais como colocação ortogonal (Yao e Tien, 1992),
permitem a inclusão destes fenômenos no modelo original.
3 Curralero et al. (1998), ainda estudanto o processo de síntese enzimática de
dextrana, utilizando o sistema proposto por Souza (1993), determinaram experimentalmente
a influência do tampão de dessorção no comportamento dos sistema. Segundo os autores, o
fator limitante para a otimização do processo proposto é o tempo de residência no estágio
de adsorção, o qual não pode ser elevado sem perda de produtividade. Sendo assim no
presente trabalho, é adicionado um estágio intermediário de adsorção no modelo original. A
inclusão desse estágio visa minimizar a perda enzimática, constatada por Souza (1993), sem
que haja uma queda significativa na produtividade, conforme reportado em Curralero et al.
(1998).
A utilização de redes neurais em Engenharia Química vem se destacando
ultimamente. Uma rede neural é nada mais que um algoritmo matemático baseado na
estrutura neurológica humana, e por isso é conhecida como uma técnica de inteligência
artificial. A rede tem a capacidade de, mediante treinamento adequado, encontrar valores
próximos àqueles utilizados para seu treinamento. Dessa forma, foi desenvolvido um modelo
híbrido, onde é utilizada uma rede neural para predição da taxa de reação enzimática no
estágio de dessorção. A rede utilizada tem caráter genérico, podendo ser utilizada para
outros processos mediante treinamento adequado.
A viabilidade da utilização do processo proposto em escala industrial, é determinada
através de simulações com o modelo do sistema. Não somente a rede neural tem caráter
genérico mas também o tem, o modelo determinístico, que poderá ser utilizado para
simulações de outras sínteses enzimáticas com base no processo CARE.
2.1- Alguns Conceitos Biotecnológicos
2.1.1 - Biopolímeros Extracelulares
Biopolímeros extracelulares têm encontrado grande aplicação em diversas áreas tais
como indústria alimentícia, onde são utilizados como estabilizantes, espessantes e
emulsificantes, e na indústria farmacêutica, onde são utilizados como veículos para drogas
e agentes complexantes para produção de medicamentos. Gomas xantânicas e dextranas,
são polissacarideos extracelulares, solúveis em água e bastante conhecidos, sendo também
de grande interesse comercial. Polissacarideos são polímeros de carboidratos, cujas
unidades são ligadas entre si pelo grupo hemicetal hidroxil do c] da molécula de
carboidrato, segundo reação genérica a seguir:
(G-0-X)+[(G-O)n -G] Enzima [(G-O)n+J-G]+X (2.1)
Onde:
G = unidade de carboidrato
X = produto não polimérico (pirofosfato ou oligossacarideo)
Enzima = transglicosidase
Os polissacarideos podem ser classificados em:
• extra-celulares
• intracelular
• componente estrutural da célula
Quanto a natureza química, os mesmos podem ser classificados em:
homopolissacarídeo: contém apenas um tipo de açúcar (único monômero)
heteropolissacarídeo: contém mais de um tipo de açúcar (mais de um monômenro)
5
Exopolissacarideos são polissacarídeos que podem ser sintetizados fora da célula.
A maioria é ainda pouco conhecida, sendo a estrutura e propriedades fisicas de muitos
ainda desconhecidas. Vale ressaltar também que a maioria dos polissacarideos são
sintetizados no interior da célula, sendo que a maioria dos exopolissacarideos são um
metabólito secundário obtido quando o microorganismo se encontra em um meio com
excesso de sua fonte de carbono. A atividade metabólica está relacionada com a taxa de
crescimento e meio de cultura, sendo temperatura, pH e concentração de substrato e
nutrientes fatores importantes. A dextrana é um dos poucos polissacarídeos exocelulares
que pode ser obtido via síntese enzimática sem alteraração de suas características.
Vários microorganismos podem sintetizar polissacarídeos, dentre eles podemos citar
bactérias, fungos e algas.
2.1.2- Características reológicas de soluções de polissacarídeos
Existe poucas informações sobre as características reológicas das soluções de
polissacarídeos. Sabe-se que as mesmas afetam a transferência de massa, homogeneidade
da mistura, potência de agitação requerida, separação e recuperação do produto final, além
do scale-up do processo. De urna forma geral, os meios de cultura para a produção de
polissacarídeos apresentam baixa viscosidade no início, sendo a mesma elevada
gradativamente durante a fermentação, atingido seu valor máximo no final do processo. Em
fermentações prolongadas, pode ocorrer decréscimo da viscosidade devido a autólise
(degradação parcial pela enzima). Estes meios são caracterizados, em sua maioria, como
6 fluidos Newtonianos no início, passando para não-Newtonianos, com comportamento
pseudo-plástico (n < I) e seguem a lei da potência a medida que o peso molecular é
elevado e, no caso da ocorrência de autólise, o comportamento apresentado no final da
fermentação é Newtoniana (Velijokovic e Lazié,l988). Uma solução de polissacarídeo
apresenta viscosidade com ordem de grandeza de 2 a 4 vezes maior que a da água. Os
principais fatores que determinam as características reológicas do meio de cultura são
morfologia e concentração da biomasssa, produção de material extracelular pelo
microorganismo sendo utilizado, e no caso da dextrana, deve-se levar em consideração a
concentração, estrutura, peso molecular e distrubuição do peso molecular do produto
(V elijokov e Lazié, 1988).
A viscosidade do meio depende, dentre outros fatores, da concentração de células,
sendo esta um parâmetro que pode ser utilizado para controlar o crescimento celular em
sistemas onde os demais efeitos são pequenos. No caso de fungos, seus micélios
contribuem bastante para o aumento da viscosidade do meio. Outro fator que pode alterar a
viscosidade do meio de cultura é a adição de sais, tais como KCl e borax, além do pH.
Algumas culturas, tais como cultura para produção de xantana, podem apresentar
comportamento tixotrópico devido a presença de forças viscoelásticas.
O conhecimento das propriedades reológicas do meio tem importância no projeto de
reatores no tocante a potência de agitação requerida, bem como obtenção de mistura
homogênea. Vale também relembrar que a presença de célula no meio de cultura trata-se de
um fator limitante para agitação. Encontrar uma boa relação mistura homogênea/ agitação é
tarefa árdua já que grandes densidades de potência podem levar o rompimento das células e
inutilização do meio de cultura.
A escassez de informações sobre o comportamento reológico de soluções de
polissacarídeos pode ser atribuída à dificuldade de medição das características reológicas
dos meios de cultura. Uma forma bastante utilizada para realização de tais medidas é
através do relacionamento entre o torque da turbina e velocidade rotacional. Devido às
próprias características do meio, a utilização de viscosimetros convencionais, tais como
viscosimetro de cilindros concêntricos, se toma impraticável, pois ocorre perda da
homogeneidade, devido à decantação das células, separação centrífuga devido à rotação do
cilindro e distorção das células ao passar pelo orifício.
7 2.1.3- Projeto de reatores microbiológicos
A maioria dos bioprodutos são atualmente produzidos via fermentação, sendo a
síntese enzimática limitada principalmente devido às características do produto de
interesse, dentre outros fatores, tais como: custo de produção e rendimento. O projeto de
biorreatores é voltado para uma máxima produtividade com menor custo operacional
possível. No caso de reações aeróbicas, a taxa de transferência e difusão de oxigênio é um
fator bastante importante, sendo a mesma praticamente constante em soluções de baixo
peso molecular. Em se tratando de um meio de cultura, a remoção de calor também tem um
papel essencial. Estes dois fatores são entretanto, fortemente influenciados pela agitação e
propriedades do meio (reologia). Embora não haja uma grande quantidade de material
publicado referente às características reológicas de soluções de polissacarídeos, muitas
informações a respeito de fluidos não-Newtonianos podem ser aproveitadas, segundo
Margaritis e Zajic (1978). Os principais tipos de agitação utilizados em bioreatores são:
mecânica, aeração, agitação a ar e filme líquido
Cálculos de scale-up reportados em Margaritis e Zajic (1978), assumindo o
mecanismo de transporte de massa como sendo de movimentação da massa reagente,
conduziram a diversos erros, pois a hipótese de mistura perfeita não é válída para meios de
cultura de alta viscosidade contendo células. Sendo assim, o scale-up deve ser realizado
levando-se em consideração a hipótese de similaridade dinâmica, mantendo-se o número de
Reynolds e a razão entre as dimensões do agitador e do fermentador constantes. Estudos
realizados em diferentes sistemas resultaram em padrões de mistura em vasos de diferentes
tamanhos, a seguir:
Re > I 5: o movimento bulk constitui o mecamsmo de transferência de massa
predominante
Re < 1.5 : a mistura é controlada pela difusão e o número de Schmidt deve ser levado em
consideração nos cálculos.
8 Irving e Saxton (1967), citado em Margaritis e Zajic (1978), efetuaram uma revisão
bibliográfica a respeito de tanques de mistura perfeita e apontaram as seguintes
características para sistemas de alta viscosidade:
• a densidade de potência deve ser alta
• a separação entre as paredes do vaso e o agitador deve ser pequena, pois quanto maior a
viscosidade, menor é o volume de fluido deslocado a cada rotação do agitador, sendo
esta mantida constante.
O tamanho do agitador tem uma forte influência na agitação obtida. Sabe-se que a
uma dada velocidade de agitação, quanto maior for o agitador melhor será a mistura e no
caso de tanques aerados, melhor será a distribuição de oxigênio. Agitadores pequenos
causam turbulência localizada. No caso de reatores aerados, uma alta densidade de potência
é necessária tanto para líquidos de baixa viscosidade como para líquidos de alta
viscosidade. No primeiro caso, as bolhas de Oz coalescem sendo necessária uma alta
densidade de potência para manter as bolhas pequenas, no segundo caso uma alta taxa de
cisalhamento é necessária para promover a formação de pequenas bolhas.
Steel e Maxon (1962), citado em Margaritis e Zajic (1978), propuseram um agitador
múltiplo de polias, o qual é utilizado industrialmente embora não existam muitos dados
sobre o mesmo. Apesar de várias características serem conhecidas, determinar o consumo
ideal de potência para fluidos não-Newtonianos é dificil já que a viscosidade aparente muda
com a velocidade de agitação. Margaritis e Zajic (1978) propuseram um método que
correlaciona o consumo de potência de fluidos não-Newtonianos com o de fluidos
Newtonianos através do número de potência e do número de Reynolds. A descrição do
método pode ser encontrada em Margaritis e Zajic (1978).
Quanto ao consumo de energia, a força inferida ao sistema influi na transferência de
calor e massa, bem como na homogeneidade do liquido. O aumento da pseudo plasticidade
do meio pode resultar em um decréscimo do coeficiente de transferência de massa, devido
ao decréscimo do coeficiente de arraste e do número de Sherwood. Culturas com baixa
agitação, a qual pode ser obtida através de aeração, seguem o regime de Taylor. Neste caso,
o tamanho e distribuição das bolhas são governados pelo balanço entre a turbulência do
9 líquido, forças interfaciais e forças de coalescência das bolhas. As principais conseqüências
do aumento da viscosidade do meio são:
• diminuição do número de Reynolds
• aumento da taxa de coalescência
• decréscimo da área interfacial gás e líquido
Outro fator importante no projeto de bioreatores é a transferência de calor. No caso
de vasos agitados, a viscosidade aparente é calculada em função da velocidade do impeller
e da tensão de cisalhamento média. Já no caso de vasos aerados, utiliza-se o número de
Reynolds modificado. Este dado é importante para o cálculo da taxa de transferência de
calor. Para vasos não aerados, mecanicamente agitados, contendo fluidos não-Newtonianos
as correlações propostas para a predição do coeficiente de transferência de calor apresentam
a seguinte forma típica:
No caso da síntese in vitro (síntese na ausência de microorganismo), a viscosidade
não é um dos maiores problemas. A ausência de células, e consequêntemente de produtos
metabólicos, além de um melhor controle do processo, influenciam na viscosidade do meio.
No caso de reatores do tipo tanque agitado, contendo sólidos em suspensão e etapas de
adsorção/dessorção, a otimização e scale-up de tais processos requer que as características
de transferência de massa e o equilíbrio sejam completamente compreendidos. A análise da
adsorção é complicada em tais sistemas porque o equilíbrio é descrito por uma isoterma
não-linear e as matrizes usadas na fabricação de adsorventes altamente seletivos são
frequentemente materiais porosos. Araújo (1996), utilizou um modelo considerando que a
adsorção de uma proteína da solução bulk na ínterface do adsorvente envolve um número
de passos discretos. Esses passos, todos contribuindo com uma resistência à transferência
de massa, incluem transferência do seio do líquido para a superfície externa da partícula
(resistência à difusão na película de filme líquido), movimento por difusão nos poros da
partícula (difusão nos poros ou resistência à difusão nas partículas) e a interação quimica
10 efetiva nos sítios de ligação (resistência à reação na superficie ). Modelos matemáticos de
adsorção bioespecífica em tanques agitados que incluem as contribuições de todos esses
termos têm sido recentemente apresentados em outros trabalhos. Tais modelos apresentam
necessariamente um número de parâmetros descrevendo as resistências à transferência de
massa, o que pode dificultar suas aplicações na análise da adsorção.
É possível simplificar a solução matemática assumindo-se, quando possível, que
uma das resistências para transferência de massa é dominante podendo as demais serem
desprezadas. Dados experimentais sobre sistemas de adsorção de proteínas são raros, mas
indicam que a resistência dominante varia com o sistema de adsorção em questão. O
trabalho de Araújo (1996) inclui o desenvolvimento de um modelo que descreve a adsorção
de proteínas para adsorventes porosos em tanques agitados.
Deve-se ter em mente que a difusão ocorre devido ao movimento browniano das
partículas em solução, o qual ocorre devido ao movimento irregular das partículas
suspensas na dispersão pelas moléculas do liquido. Observa-se que quanto menor a
partícula, mais rápido é o seu movimento.
2.1.4- Recuperação de polissacarídeos:
Após a produção, o polissacarídeo deve ser isolado e purificado. Este procedimento
é realizado com base em processos de extração de produtos naturais. Como a seguir:
• extração ácida
• extração básica
• centrifugação
• ultrafiltração
• precipitação
• secagem
• eletrólise
11 • precipitação alcoólica
Outras etapas extras podem estar envolvidas no processo tais como:
• remoção das células
• destruição da enzima
• modificação química ou enzimática do polímero
Uma das técnicas de isolamento mais utilizada é a precipitação do produto de
interesse, a qual é geralmente obtida utilizando-se solventes orgânicos de alta volatilidade,
sendo fatores determinantes na escolha dos mesmo, a toxidade e a facilidade de purificação
do produto após a precipitação, fator que engloba, dentre outros, o custo do solvente e de
sua recuperação. Outro tipo de precipitação é a obtida por alteração do pH. Vale ressaltar
que o tipo de precipitação e as condições mecânicas da mesma podem afetar a natureza do
precipitado e que em alguns casos, a adição de íons metálicos pode colaborar no processo.
Dentre os solventes normalmente utilízados estão metano!, etano!, acetona e isopropanoL A
proporção de solvente utilizado depende do produto a ser precipitado. A remoção das
células normalmente é obtida por centrifugação e pode ser realizada antes ou após a
precitação.
A secagem dos polissacarídeos pode ser realizada em secadores batelada ou
contínuos, podendo ser realizada sob vácuo, com a utilízação de ar forçado ou até mesmo
gás inerte impregnado com solvente quando se fizer necessária. Durante a operação, as
seguintes características devem ser observadas:
• alteração da cor
• degradação do produto
• solubilização do produto
12 Estas características podem indicar algo de errado acontecendo no processo,
devendo este ser alterado. Sabe-se que a secagem rápida do biopolímero pode causar
endurecimento do mesmo, fazendo-se necessária uma etapa posterior de moagem, na qual o
calor promovido pelo atrito entre as peças do moinho e o produto pode causar
escurecimento e degradação do produto. Quanto a armazenagem do produto final, sabe-se
que polissacarídeos são produtos altamente higroscópicos, o que pode acelerar a
degradação dos mesmos durante a estocagem.
Além das etapas ordinárias já citadas, em alguns casos etapas adicionais visando a
melhoria ou modificação do produto final podem ser necessárias. Dentre os diversos
procedimentos existentes temos a remoção de material insolúvel, que visa a melhoria da
estética tomando o produto mais atrativo, além de em alguns casos melhorar sua
manipulação e a remoção de enzima e/ou células residuais, cuja presença pode levar a
degradação do polímero durante a estocagem. As principiais técnicas utilizadas nestas
etapas adicionais são diluição seguida de filtração, centrifugação ou floculação, e no caso
da remoção de células pode-se realizar a digestão alcalina das mesmas.
2.1.5 - Proteínas:
As proteinas são moléculas orgânicas constituídas a partir de aminoácidos. Podem
ser constituídas apenas de aminoácidos bem como possuir outros grupos em suas cadeias,
tais como fosfolipídios e carboidratos. As proteinas são classificadas de acordo com suas
funções biológicas. Dentre os diversos grupos de proteínas estão as enzimas, que nada mais
são que catalisadores biológicos, que fazem parte tanto de reações bioquímicas em
organismos vivos, como podem ser utilizadas para a sintese in vitro de produtos
biotécnológicos. Quanto a sua estrutura, enzimas são constituídas de proteinas, que são
compostos heteropoliméricos constituídos geralmente por no mínimo 20 aminoácidos. Para
que seja considerado proteina, um polímero de aminoácidos deve atingir um peso
molecular minimo arbitrário de 6.000 e ter um limite superior de 1.000.000 daltons (1
dalton = 1 unidade de massa atômica = 1,66 x I0-24 g), sendo que todo aminoácido
proteico é oticamente ativo.
13 Os aminoácidos são entidades químicas de baixo peso molecular (75 - 204 daltons)
que possuem pelo menos um grupamento amina e outro carboxila, são todos anfólitos, isto
é, íons de função iônica dupla e oposta. Uma manifestação dessa característica é o
comportamento das proteínas em solução, o qual pode ser tanto como cátions quanto como
ânions, sendo assim capazes de migrar tanto para um eletrodo negativo (cátodo) quanto
para um eletrodo positivo (ânodo), dependendo do pH da solução. Esta propriedade é
também utilizada em uma técnica de separação denominada eletroforese. Há ainda um
valor de pH (ponto isoelétrico) no qual não haverá migração, devido a igualdade entre as
cargas negativas e positivas existentes na solução.
Cada aminoácido é distinguido pela cadeia lateral característica que pode ser não
polar (hidrofóbica), polar carregada (hidroftlica) ou polar descarregada. As ligações
estabelecidas entre os aminoácidos são ligações arnídicas covalentes, também chamadas
peptidicas neste caso particular, pois os peptídeos são resultantes da condensação de dois
ou mais amínoácidos através do sistema a-amínocarboxila. Um polipeptídeo pode ser
chamado especificamente de di-, tri-, tetra-, ... n-peptídeo onde n é o número de
aminoácidos (também chamados de resíduos) e n-1 o número de ligações peptídicas. Desde
que os peptídeos são normalmente heteropolímeros abertos, cada um terá um grupamento a
-amina e um a-carboxila livres.
As proteínas são formadas a partir da ligação entre o grupo carboxila de um
aminoácido e o grupo amina de outro, com a liberação de uma molécula de água. Este tipo
de ligação é denomínado ligação peptídica, a qual é esquematizada a seguir:
Figura 2.1 -Esquema de uma ligação peptídica.
14 Em sistemas biológicos, as proteínas apresentam os seguintes tipos de interação:
Ligação cova/ente: ocorre entre os átomos de hidrogênio, oxigênio, carbono, fósforo e
exonfre.
Ligações eletrostáticas: grupos - COO · ; NH3+
Pontes de hidrogênio: ocorre entre átomos fortemente eletronegativos (oxigênio e enxofre)
e o hidrogênio ligado a outro átomo eletronegativo
Interações dipolo-dipolo: ocorre entre as cadeias laterais, geralmente no interior das
estruturas entre resíduos hidrofóbicos próximos
Interações de Van der Waals : ocorre entre todos os átomos e é resultado da distribuição
assimétrica de elétrons nos átomos
Interações hidrofóbicas : são resultantes da associação de cadeias de hidrocarbonetos em
meio aquoso
As propriedades fisico-químicas e químicas das proteínas começam com as
propriedades da ligação peptídica. As proteínas são estruturadas em diversos níveis. Sendo
o mais baixo denominado estrutura primária, a qual é caracterizada pela sequência
específica dos aminoácidos que compõem um determinado polipeptídeo. Sendo assim, o
simples conhecimento de quais e quantos aminoácidos integram um polipeptídeo, não é
informação suficiente para definir sua estrutura primária; é necessário ainda conhecer a
ordem na qual eles estão ligados covalentemente através das ligações peptidicas. A
estrutura primária é a mais estável de uma proteína. Temos ainda a estrutura secundária,
caracterizada pelo modo em que as cadeias se dispõem espacialmente, o qual pode formar
hélices, folhas ou esferóides compactos, com ligações de hidrogênio unindo cadeias
diferentes a diferentes partes da mesma cadeia. O que determina o tipo de estrutura
secundária a ser assumida por um polipeptídeo é sua própria estrutura primária, isto é, o
tipo, o número e a distribuição dos aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica.
A estrutura terciária das proteínas provém do enrolamento da cadeia polipeptídica
no espaço, o qual pode ser em torno de si mesma ou com outras cadeias semelhantes. Com
isso a proteína ganha estabilidade e reduz o volume ocupado no espaço. Dessa nova
15 conformação adquirida resultam as proteínas de forma esférica, chamadas globulares, e as
de forma cilíndrica, chamadas fibrosas. A estrutura terciária é predeterminada por uma série
de ligações e interações, tais como pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio, interações
dipolo-dipolo, interações de V an der Waals e interações eletrostáticas.
A conformação tridimensional adotada por uma macro molécula em solução obedece
tanto aos tipos de interação e ligações permissíveis entre seus diversos grupos, quanto ao
efeito que o solvente exerce sobre a proteína. Os resíduos, tanto os polares quanto os
apoiares, os quais em última instância ficam orientados em direção à superficie da estrutura
terciária, têm ainda a possibilidade de estabelecer posteriores interações de caráter
permanente ou transitório com outras proteínas. Essas novas interações dão origem à
estrutura quaternária, ou seja, a formação de dímeros, trirneros, tetrâmeros, etc, que
possuem especial importância no funcionamento de enzimas e proteínas transportadoras. A
natureza dessas interações é exatamente a mesma das que determinam a estrutura terciária.
A compreensão da estrutura das proteínas é de extrema importância, visto que a
mesma determina suas características fisico-químicas e, portanto, suas propriedades
funcionais. Denominam-se propriedades funcionais quaisquer funções que uma classe de
compostos possa desempenhar numa determinada aplicação tecnológica. Assim, as
proteínas podem ser usadas como emulsificantes, espessantes, espumantes, geleificantes,
etc. As proteínas funcionam também no metabolismo, na estocagem, no transporte, na
mobilidade, e na defesa de seres humanos e animais. As diferenças nas propriedades fisicas,
químicas e funcionais das proteínas provêm a base para sua separação bem como para sua
classificação.
As proteínas são altamente sensíveis a mudanças no meio. Desvios de condições
fisiológicas, ou do meio reacional, quando se fala em síntese in vitro, podem afetar a
conformação da proteína e causar sua desnaturação. Os principais fatores que podem alterar
a atividade de uma proteína são: pH, temperatura, força iônica, solventes orgânicos,
adsorção, dentre outros.
A desnaturação é um processo gradativo, que ocorre em vários estágios separados
por barreiras, dando-se primeiro as alterações fisico-químicas e depois as químicas. Devido
a associação íntima entre a proteína e seu solvente ou, genericamente falando, entre a
16 macromolécula e seu microambiente, não é possível restringir a ocorrência da desnaturação
à estrutura terciária unicamente.
Considerando-se que a estrutura terciària de uma proteína é o resultado de um
número relativamente grande de interações fisico-quimicas e, em alguns casos, de ligações
químicas, não seria possível definir de uma forma sintética e precisa qualquer alteração na
estrutura superior da macromolécula. Devido a este fato, emprega-se o termo desnaturação
para denotar qualquer alteração, ou alterações, nas estruturas quaternària, terciària ou
secundària das macromoléculas. A desnaturação pode ser causada por meios mecânicos,
físico-quimicos e químicos.
De forma geral, mecanicamente podem-se imprimir alterações na estrutura
quatemària e até na estrutura terciària, mas raramente atinge-se a estrutura secundària. A
proteína constituinte do fio de cabelo sofre desnaturação quando este é esticado. A
desnaturação da clara do ovo (albumina) é efetuada simplesmente pela agitação com um
garfo ou batedeira. As desnaturações mecânicas são na maioria das vezes irreversíveis.
Meios fisico-químicos de desnaturação são aqueles nos quais as ligações físico
químicas são perturbadas. Isso causa comprometimento das estruturas quatemària, terciària
e até secundària das proteínas. Este tipo de desnaturação pode ocorrer devido aos seguintes
fatores: calor, o tipo de solvente utilizado e pH fora do normal, sendo a desnaturação por
calor mais acentuada quanto maior o peso molecular da proteína. Além dos processos de
desnaturação por adição de calor, a subtração de calor até o congelamento também costuma
desnaturar irreversivelmente algumas proteínas.
Mudanças de solvente, de força iônica e o acréscimo de substâncias que quebram as
pontes de hidrogênio estruturais ou as interações de V an der Waals causam desnaturação
tanto reversível quanto irreversível, dependendo do tipo de proteína e da severidade do
tratamento.
Alterações do pH do meio, desde que não sejam extremas em torno do pH natural,
causam desnaturação reversível nas estruturas terciàrias da maioria das proteínas. Para
melhor entender a precipitação e a desnaturação ocasionadas pelas mudanças no pH, é
conveniente que se tenha antes uma visão global da solubilidade das proteínas em meio
aquoso em função do pH. O fenômeno da solubilidade de uma proteína deve ser
visualizado como a capacidade de um número substancial de grupos polares localizados na
17 superfície da mesma se solvatar na água através de pontes de hidrogênio. O número de
grupos polares inevitavelmente dependerá das estruturas primária, secundária, etc que em
última instância, determinarão também a densidade e a forma da macromolécula. A
capacidade de solvatação, porém, dependerá do pH e da força iônica do solvente.
A desnaturação ocasionada por meios químicos envolve quebra ou formação de
ligações covalentes e é geralmente irreversíveL A irreversibilidade não significa
necessariamente a deterioração das propriedades funcionais da proteína e sim apenas sua
modificação. A adsorção de proteínas em superfícies pode também afetar a atividade da
proteína. As proteínas adsorvem em praticamente todas as superfícies, incluindo metais,
plásticos e especialmente vidro. O próximo item aborda o processo de adsorção de forma
mais detalhada.
2 .2- Adsorção
2.2.1 - Introdução
A habilidade de sólidos porosos adsorverem reversivelmente grandes volumes de
vapor foi reconhecida no século 18, mas a aplicação prática desta propriedade em processos
industriais de separação e purificação é relativamente recente. O exemplo mais comum de
tal processo é o uso de uma coluna adsorvente empacotada com um adsorvente hidrofilico
para a remoção da umidade de fluxos de gás ou de líquidos. Tais processos são
convenientemente classificados como processos de purificação uma vez que os
componentes que são adsorvidos estão presentes em baixas concentrações, têm pouco ou
nenhum valor econômico, e frequentemente não são recuperados. Atualmente muitos
processos que fazem uso da adsorção visam a recuperação do adsorbato e até mesmo a
separação e transporte do mesmo para outro meio, onde este é então dessorvido. Esta última
aplicação é a base do projeto do sistema continuo duplo estágio (processo CARE) proposto
por Pungor et ai. (1987).0s primeiros processos de adsorção usavam carvão ativado ou
sílica gel como adsorvente, entretanto o potencial de adsorção de processos industriais tem
18
sido aumentado pelo desenvolvimento de peneiras moleculares adsorventes, especialmente
as zeólitas sintéticas.
A adsorção é um fenômeno no qual certos componentes de uma fase gasosa ou
líquida são seletivamente transferidos para a superficie de um sólido. Pode ser compreendida
como a concentração preferencial de uma determinada espécie na interface de duas fases. O
sólido é então denominado adsorvente e os componentes adsorvidos, adsorbato.
Termodinâmicamente, a adsorção pode ser vista como um caso em que o adsorbato
apresenta uma menor energia livre de Gibbs na superficie do adsorvente do que na solução.
Enquanto está buscando atingir o equilíbrio, o adsorbato desloca-se para a superficie do
adsorvente de forma a atingir um estado de energia menor (de acordo com a 2' lei da
termodinâmica). Ao se discutir os fundamentos da adsorção é útil distinguir entre adsorção
fisica, envolvendo forças de interações moleculares fracas, e quimiossorção, a qual envolve
essencialmente a formação de uma ligação química entre o adsorbato e a super:ficie do
adsorvente. Desta forma, o fenômeno de adsorção envolvendo superficies sólidas pode ser
classificado em duas categorias principais:
Adsorção física: é originária de forças intermoleculares, envolvendo, portanto, dipolos
permanentes, dipolos induzidos e interações quádruplas entre o adsorvente e a espécie
química a ser adsorvida (o adsorbato ); há também forças de atração e repulsão
eletrostáticas, a quais podem envolver forças de V an der Waals ou outras forças de valência
de caráter secundário.
Adsorção química (quimiossorção): envolve a interação química, com transferência
simultânea de elétrons, entre o adsorvente e o adsorbato; desta forma, as espécies
adsorvidas estão ligadas à superficie através de forças de valência, que são as mesmas
responsáveis por ligar os átomos em uma molécula. Na adsorção de eletrólitos, o mecanismo
importante é a atração eletrostática, a qual é muito dependente do pH e da força iônica;
portanto, a adsorção de ácidos e bases em adsorventes não polares (carvão ativado) pode
depender fortemente do pH.
19 A classificação do processo em adsorção química ou fisica depende da variação de
entalpia de adsorção (ou calor de adsorção). Adsorção fisica tem variação de entalpia bem
menor que o fenômeno de adsorção química (a variação de entalpia para adsorção fisica é da
ordem do calor de liquefação do adsorbato, enquanto que na adsorção química ela é
significativamente maior). Esta variação de entalpia é determinada experimentalmente.
Outro critério para a classificação do processo é a taxa de dessorção. Para adsorção fisica, a
dessorção é rápida (o processo de adsorção é altamente reversível), enquanto que para a
adsorção química isso geralmente não ocorre, sendo, na maioria das vezes, a dessorção uma
outra reação química, podendo inclusive em alguns casos não ocorrer dessorção sem
degeneração do adsorvente. A adsorção química pode ser ativada (apresenta energia de
ativação finita) ou não (apresenta energia de ativação proxima de zero).
Processos de adsorção têm a capacidade de promover separações que, para as quais
a utilização de outras técnicas de separação tais como: destilação, absorção e sistemas à
base de membranas, dentre outras, seriam inviáveis. Sua importância tem aumentado nos
processos de aplicação ambiental e na área bioquímica, estimulando avanços nas técnicas
utilizadas e em pesquisa de novos materiais. A seleção do adsorvente é de grande
importância para a eficiência do processo. O desenvolvimento de novos adsorventes, vem ao
encontro da crescente necessidade de implantação e otimização de processos que se utilizam
desta técnica. As principais características de um adsorvente são:
Capacidade: é a quantidade de adsorbato que é adsorvido por unidade de massa ou volume
de adsorvente. Esta é geralmente a característica mais importante e afeta fortemente os
custos, pois a quantidade de adsorvente requerido e a quantidade de adsorbato retido estão
diretamente relacionadas a sua capacidade. Para um dado adsorvente, a capacidade depende
da concentração da fase fluida, temperatura e condição inicial do adsorvente, além da área
disponível e características de afinidade. Os dados de capacidade de adsorção são
determinados a temperaturas fixas, através da construção de gráficos conhecidos como
isotermas. Uma isoterma é o gráfico que mostra a capacidade de um adsorvente em função
da concentração de adsorbato no meio, para uma dada temperatura. A capacidade também
pode ser expressa por índices tais como área superficial e porosidade dentre outros.
20 Seletividade: é a razão entre a capacidade de um adsorvente para um dado componente e
sua capacidade por outro, em uma dada concentração no fluido. Esta razão geralmente se
aproxima de um valor constante quando a variação de concentração tende a zero.
Seletividade em adsorção é algo semelhante à volatilidade relativa em destilação: quanto
menor o valor, maior o equipamento requerido, ou seja, maior a quantidade de adsorvente
necessària. Uma situação ideal é encontrada quando um dos componente, de uma
alimentação de dois componentes, não é muito adsorvido, o que indica boa seletividade.
Regenerabilidade: é essencial para processos cíclicos, onde o adsorvente precisa operar em
ciclos sequênciais com performace uniforme. Isto significa que cada componente do
adsorbato deve ser adsorvido de forma relativamente fraca, ou seja, ter mais afinidade fisica
do que química. O calor de adsorção provém da quantidade de energia requerida para a
regeneração. A regeneração pode ser otimizada alterando-se a temperatura ou a pressão, ou
promovendo alterações químicas, tais como eluição ou extração supercritica. Em certos
casos, a combinação dessas técnicas é empregada. Esta propriedade determina a fração da
capacidade que é recuperada durante a regeneração, muitas vezes chamada de capacidade de
trabalho. A regeneração de um adsorvente nada mais é que a dessorção do adsorbato, a qual
é realizada em condições favoráveis a este fenômeno.
Compatibilidade: esta propriedade está relacionada com os tipos de ataque, químico ou
fisico, que podem reduzir a vida útil do adsorvente. As partículas de adsorvente devem ser
inertes, tanto aos componentes quanto aos regenerantes presentes no meio ao qual o mesmo
está submetido. O meio associado às condições do processo, tais como vazões, temperatura,
pressão e vibração do equipamento, no caso de colunas empacotadas, não devem ser
favoráveis à desintegração das partículas de adsorvente.
Custo: trata-se de um fator altamente variável, dependendo não somente do fornecedor mas
também do período de compra. Este último fator é mais relevante quando se fala de
adsorventes naturais, tais como carvão de côco, pois este tipo de produto depende de
21 condições ambientais tais como safra; e carvão ativado, o qual é normalmente obtido na
decomposição térmica de materiais carbonáceos de origem animal (sangue, carne, ossos), ou
de origem vegetal (madeira, milho, arroz). O principal pré-requisito para o processo de
separação ser economicamente viável é a utilização de um adsorvente com seletividade,
capacidade e vida útil alta. Os preços podem variar numa faixa de $0.50 a $50 por lb. (fonte:
Chemical Engineering I November 1995)
No estudo e compreensão do fenômeno da adsorção, o conhecimento detalhado e
preciso das propriedades fisico-quimicas do material adsorvente é essencial. As propriedades
físicas do adsorvente relacionadas à sua eficiência dependem, dentre outros fatores, da
forma em que o mesmo está sendo utilizado, que pode ser pó (utilizado em geral para o
adsorbato na fase líquida) ou na forma granular (utilizado para o adsorbato na fase gasosa).
2.2.2 - Influência da temperatura
Na adsorção física, a quantidade adsorvida sempre decresce monotonicamente
quando a temperatura é aumentada; desta forma, muitos processos de adsorção física não
ocorrem a temperaturas muito superiores ao ponto de ebulição normal na pressão de
operação do sistema. Já os processos de quimiossorção frequentemente podem ser
desenvolvidos a temperaturas acima do ponto de ebulição, ou mesmo superiores a
temperatura crítica do material. É possível que as adsorções física e quimica ocorram
simultaneamente em uma dada superfície. Este fato dificulta uma generalização no que diz
respeito ao efeito da temperatura na quantidade de material adsorvido, sendo que diferentes
comportamentos podem ser constatados para distintos sistemas adsorvente-adsorbato.
A baixas temperaturas, a adsorção física é o processo dominante, sendo
insignificante a quimiossorção. Tem-se que a quantidade de material fisicamente adsorvido
decresce com a elevação da temperatura; já a quantidade de material adsorvido vm
quimiossorção aumenta a medida que se eleva a temperatura, até se tornar constante.
22 2.2.3 - A isoterma de adsorção de Langmuir
Sabe-se que a capacidade de um detemúnado adsorvente para um certo adsorbato é
controlada pelo equilíbrio de fases. Os gráficos da quantidade de material adsorvido por
unidade de volume, a uma temperatura constante, são chamados isotermas de adsorção.
Estas isotermas são uma expressão funcional para a variação da adsorção com a
concentração de adsorbato na solução, à temperatura constante.
Esses gráficos são divididos em cinco categorias principais de acordo com a figura
2.2:
.., m y .. n I)
k o 1/1 .., <{
~ õ
1/0 110 1.0 xo 1/0 PIP5
Figura 2.2 Classificação das isotermas segundo Braunauner (Ruthven, 1984).
As isotermas para adsorventes microporosos verdadeiros, nos quais o tamanho do
poro não é muito maior que o diâmetro molecular da molécula de adsorbato, é normalmente
do tipo I. Isto ocorre porque com tais adsorventes existe uma situação limite definida que
corresponde ao completo preenchimento dos microporos. Ocasionalmente, se os efeitos da
atração intermolecular forem grandes, uma isoterma do tipo V é observada. Uma isoterma
do tipo IV, sugere a formação de duas camadas superficiais: em uma superficie plana ou na
parede de um poro muito mais largo que o diâmetro do adsorbato. Isotermas dos tipos II e
III, são geralmente observadas apenas com adsorventes nos quais existe uma grande faixa de
tamanho de poros. Em tais sistemas existe uma contínua progressão da adsorção em
monocamada para a adsorção em multicarnada, e então para condensação capilar.
23 Virtualmente, todos os tratamentos teóricos do fenômeno de adsorção são baseados
ou podem ser rapidamente relacionados a análise desenvolvida por Langmuir. A isoterma de
Langmuir corresponde a um tipo de adsorção altamente idealizada. O modelo foi proposto
iniciamente para gases assumindo as seguintes hipóteses :
• Moléculas da fase gasosa são adsorvidas em pontos discretos de ataque na superficie do
adsorvente, ou seja, nos sítios de adsorção; cada sítio pode acomodar somente uma
molécula adsorvida. A energia de uma espécie adsorvida é a mesma em qualquer local, e
independe da presença ou ausência de moléculas adsorvidas nas proximidades. Esta
hipótese implica em que as forças entre moléculas adsorvidas adjacentes sejam tão
pequenas que possam ser negligenciadas, e que a probabilidade de adsorção em um sítio
vazio é independente do fato do sítio adjacente estar ocupado ou não. ·
• A quantidade máxima de adsorção possível é aquela correspondente a monocamada.
• A adsorção é localizada e ocorre pela colisão entre moléculas da fase gasosa com sítios
vazios.
• A taxa de dessorção depende somente da quantidade de material presente na superficie
do adsorvente.
Para o processo de adsorção fisica, a hipótese maís pobre é a terceira, enquanto que,
para a quimiossorção, é a segunda. Há uma significante quantidade de dados experimentaís
que contradizem estas hipóteses. A figura 2.3 apresenta alguns exemplos de isotermas de
Langmuir:
150
-125
f _. 1)0
} g 75
~ - 50 .!;
'"
1lO 200 P(Torr)
300
24
398K
323K
Figura 2.3 Isotennas de Langmuir para equilíbrio de propano em zeólita SA (Ruthven,l984)
A aproximação cinética para a derivação da equação de Langmuir assume que uma
taxa de adsorção na superficie é proporcional ao produto da pressão parcial do adsorbato
em fase gasosa e a fração da superficie vazia. Se a fração da superficie coberta pelo gás
adsorvido A é denominada BA, a fração da superficie vazia é dada por 1- BA, se nenhuma
outra espécie estiver adsorvida. Se a pressão parcial de A na fase gasosa for PA, a taxa de
adsorção é dada por :
(2.2)
onde k pode ser chamado de pseudo constante da taxa para o processo de adsorção. A taxa
de dessorção depende somente do número de moléculas que estão adsorvidas, portanto :
r desorção = k 'eA (2.3)
onde k' pode ser chamado de pseudo constante da taxa para o processo de dessorção. No
equilíbrio, as taxas de adsorção e de dessorção são iguais:
A fração de sítios ocupados pela espécie A é :
Dividindo ambos os termos por k' tem-se :
ondeK=k!k'
e - kPA A- k'+kPA
25 (2.4)
(2.5)
(2.6)
A fração de sítios ocupados é também igual a razão do volume de gás adsorvido, em
relação ao que seria adsorvido em uma monocamada.
(2.7)
Ambos os volumes são medidos em condições padrão ou a uma temperatura e uma
pressão de referência constantes. As duas últimas equações combinadas proporcionam a
seguinte expressão :
(2.8)
26 Construindo-se o gráfico de V x PA , obtém-se uma curva igual a isoterma de
adsorção do tipo I. A baixos valores de PA, o termo KPA é pequeno comparado com a
unidade e a quantia adsorvida será linear com a pressão. A altas pressões, esse termo será
grande comparado com a unidade, e a superficie estará praticamente repleta da substância
adsorvida. Nesse caso, V será próximo de Vm.
Linearizando a equação acima apresentada de modo a obter o valor de V m, obtem-se
a seguinte expressão:
(2.9)
Grafica-se, então, P AN x P A, proporcionando uma reta cujo coeficiente angular é
igual a IN m . Sabendo o volume correspondente a monocamada, pode-se determinar o
número de moles adsorvidos. Com o número de moles multiplicado pela área coberta pela
molécula adsorvida, obtém-se a área superficial total do catalisador.
A partir da expressão da isoterma de Langmuir:
(2.10)
é possível se obter uma forma linearizada com um simples rearranjo dos termos , resultando
em:
C * = _I_ C * + Kd q * qm qm
(2.11)
onde: q* representa a quantidade adsorvida por volume de adsorvente (mg/ml), qm é o valor
de saturação da monocamada, C* é a quantidade de enzima livre (mg/ml) e Kd é a constante
de equilíbrio (gll). Desta forma, dados de C*lq* versus C* para uma dada temperatura
resultam em uma reta.
27 2.2.4 - O calor de adsorção
De acordo com o modelo ideal de Langmuir, o calor de adsorção deveria ser
independente da superficie coberta pelo adsorbato, mas este requisito é raramente satisfeito
em sistemas reais, porque os efeitos da heterogeneidade da superficie e as interações
adsorvente - adsorbato são geralmente significantes. Sob estas condições, existe uma relação
simples entre a energia potencial média ( rfJ e o calor de adsorção, a qual deve ser descrita da
seguinte forma:
Energia interna para 1 mol de adsorbato na fase vapor = U g
Entalpia molar de adsorbato na fase vapor= U g + RT
Entalpia parcial molar da fase adsorvida = U, + ~
Calor isotérmico de adsorção = -Mfo = Ug- U, + RT- ~
Ug- U, é a diferença em energia cinética entre a molécula de adsorbato na fase gasosa
e no estado adsorvido e como tal depende da natureza da fase adsorvida.
Para um adsorvente não polar não existem contribuições de dipolo na energia de
adsorção. Se a pequena contribuição da energia de polarização for negligenciada, o
potencial, e portanto o calor de adsorção, podem ser calculados somando-se as
contribuições de dispersão e repulsão de cada átomo no adsorvente.
28 2.2.5 - Adsorção de Proteínas
O tratamento e entendimento da adsorção de proteínas requer uma grande
familiaridade com modernos conceitos sobre a estrutura e função das proteínas. Proteínas
são macromoléculas biológicas construídas para funções únicas e específicas, sendo
portanto, denominadas enzimas em reações bioquímicas. Enzimas nada mais são que
poliamidas de alto peso molecular produzidas pela co-polimerização específica de cerca de
20 aminoácidos diferentes. Para uma análise completa da adsorção, a sequência de
aminoácidos e as estruturas secundária, terciária e quaternária das proteínas devem ser
conhecidas. A solubilidade geral característica da proteína, íncluíndo seu comportamento em
diferentes meios de força iônica e pH, seu comportamento em soluções de uréia, em
soluções contendo pequenas quantidades de metano!, etano! ou glicerol e informações
relacionadas a soluções características são dados importantes na interpretação e predição
das interações nas ínterfaces.
Com base no fenômeno de adsorção, desenvolveram-se várias técnicas de separação
de proteínas, as quais são genericamente denominadas cromatografia. Cromatografia é um
exemplo de um método de separação altamente seletivo. Para isso, uma fase sólida que
adsorverá especificamente a proteína de ínteresse, é criada pela imobilização de um
componente conhecido para interagir com a proteína na matriz sólida. O líquido contendo o
componente a ser purificado, ou separado, é posto em contato com o adsorvente (uma
resína trocadora de íons, por exemplo), valendo-se do fato de que a adsorção é
suficientemente específica e somente a proteína de ínteresse será adsorvida. Todos os
componentes não-adsorvidos no líquido são removidos por um procedimento de lavagem.
Finalmente a proteína desejada é retirada do adsorvente, através do contato com uma fase
líquida, que diminui a força da interação entre adsorbato (proteína) e adsorvente (resina).
Tipicamente esses estágios são executados com adsorventes empacotados em um leito,
entretanto podem ser utilizados em processos envolvendo tanques agitados ou leitos
fluidizados.
No caso de adsorção em tanques agitados, o contato entre a resina e o adsorvente é
promovido de forma a se atíngir um estágio de equilíbrio (Araújo, !996). Este sistema de
29 adsorção, é tradicionalmente utilizado para obtenção de dados referentes a cinética de
adsorção, pois possibilita a realização de ensaios com monitoramento continuo da
concentração de adsorbato no seio do líquido.
Dentre os vários tipos de cromatografia utilizadas para separação de proteínas
podemos destacar a cromatografia por afinidade. Tal técnica é baseada nas interações de
proteínas e outros componentes da amostra da fase líquida (móvel) com um suporte sólido
estacionário de propriedades químicas definidas. Tais interações correspondem exatamente
ao processo de adsorção de superficies. Tais superficies (ou suportes) podem ser das mais
variadas, de acordo com o material das resina utilizada.
Outro tipo de cromatografia que também encontra grande aplicação na separação de
proteínas é a cromatografia de troca iônica, a qual trata-se de um método de separação
baseado nas diferenças de carga das moléculas sobre condições definidas de pH e força
iônica. Neste tipo de cromatografia, a proteína é adsorvida através de interações
eletrostáticas entre as cargas do adsorvente e da proteína.
O adsorvente deve ser ativado antes do uso. Isso significa balancear as cargas
através de contra íons, tais como cloretos, ou íons metálicos. Isso é feito através do
tratamento com soluções específicas para cada resina em questão. O processo de adsorção
se dá da seguinte forma: a proteína desloca o contra íon, tomando seu lugar na resina
trocadora. A região do adsorvente se toma eletricamente neutra, sendo o saldo de carga da
proteína de mesmo sinal que o contra íon. Deste fenômeno resulta o nome resina trocadora
de íons.
2.2.6 - Adsorção em tanque agitado
Araújo ( 1996), estudou a adsorção de albumina de soro bovino em tanques agitados.
Em seu trabalho foi proposto um modelo matemático para o balanço de massa, que
considera não somente os dados da cinética de adsorção, obtidos experimentalmente através
do modelo de Langmuir, mas também o transporte de massa no filme líquido e a difusão no
interior dos poros da resina. A resolução do modelo permite a obtenção de valores
30 otimizados do coeficiente de transferência de massa no filme líquido e da difusividade efetiva
no interior do sólido, os quais são função da concentração inicial de proteína. A comparação
entre as curvas obtidas pelo modelo e as experimentais demonstram boa concordância,
podendo o mesmo ser considerado adequado.
2.3 - Cinética Enzimática
2.3.1 - Introdução
Reações enzimáticas são aquelas onde a transformação do substrato (reagente) em
produtos é catalisada por uma enzima. Geralmente as enzimas são catalisadores altamente
específicos, ou seja catalisam uma só reação química ou conjunto de reações intimamente
relacionadas. As enzimas são classificadas de acordo com a especificidade, ou melhor, de
acordo com o tipo de reação que catalisam em:
Oxiredutases: reações onde ocorre a transferência de elétrons
Transferases: reações de transferência de grupos entre as moléculas diferentes do substrato
Hidrolases: reações de hidrólise Liases: reações onde ocorre a adição de grupos ás ligações
duplas ou o inverso
Isomerases: reações onde ocorre transferência de grupos dentro das moléculas, produzindo
formas isométricas
Ligase: reações de formação de ligações C- C, C-S, C-0 e C-N, por condensação
(acopladas a clivagem ATP)
Outra classificação é a classificação trivial, que nada mais é que um nome curto de
fácil memorização e utilização tal como: álcool desidrogenase. Há ainda a classificação
sistemática onde há a identificação do substrato, tipo de reação envolvida e o sufixo "ase",
31
tais como: álcool NAD+ oxidoredutase, e a classificação numérica que é a identificação
exata da enzima visando evitar ambiguidades, sendo portanto a mais indicada para
publicações e trabalhos científicos.
As reações enzimáticas são iniciadas pela ligação entre o substrato e o sítio ativo da
enzima. De acordo com a reação genérica a seguir:
(2.12)
As enz1mas são, entretanto, moléculas muito maiOres que o substrato, sendo
necessárias poucas moléculas de enzima para catalisar milhares de moléculas de substrato. A
ligação entre enzima e o substrato ocorre em uma pequena região da enzima denominada
sítio ativo.
O sítio ativo de uma proteína ocupa apenas uma pequena parte do volume total da
proteína, possui conformação tridimensional tratando-se de uma fenda na estrutura da
molécula. A especificidade da ligação depende do arranjo precisamente definido dos átomos
no sítio ativo. Com base na espeficidade da ligação enzima-substrato, os seguintes modelos
de arranjo foram propostos:
Modelo Chave-fechadura: o sítio ativo é sempre complementar ao substrato em tamanho,
forma e natureza química
Modelo de ajuste induzido: o sítio ativo tem forma complementar ao substrato somente após
a ligação
Hipótese dos três pontos de ligação: ocorre um direcionamento da ligação que ocorre em
pontos únicos e característicos da enzima
Mecanismo da distorção: a ligação com a enzima provoca a distorção de certas ligações do
substrato
32 As reações enzimáticas, ao contrário de reações químicas, ocorrem em condições
suaves de temperatura e pH. A especificidade enzimática pode ser dividida em quatro
grupos principais:
Absoluta: a enzima atua somente sobre um substrato
Grupal: a enzima atua sobre um determinado grupo funcional e portanto irá atuar em
qualquer substrato que o possua
Estereo-especitica: em se tratando de substratos com isomeria ótica, a enzima atua apenas
em um dos dois isômeros.
Estero-ewacial: a enzima atua em uma região específica da molécula
Devido a possibilidade de alteração em sua estrutura, de acordo com o meio em que
se encontra, a atividade enzimática é função, dentre outros fatores, do pH e temperatura do
meio reacional.
2.3.2- Cinética enzimática
Cinética enzimática é o ramo da enzimologia que estuda os fatores que afetam a
velocidade das reações enzimáticas tais como concentração enzimática, concentração de
ligantes (substrato, inibi dores, e ativadores ), pH, força iônica e temperatura. O estudo da
cinética enzimática de uma determinada reação envolve o estudo do mecanismo cinético da
reação, do modo pelo qual a enzima é regulada in vivo, da identidade dos sítios ativos da
enzima e de sua estrutura, do modelo de reação e sua validação a partir de dados
experimentais, além da inibição pelo substrato. A reação enzimática genérica é dada pela
equação (2.12), a qual pode ser simplificada assumindo que no início da reação, a
concentração de produtos é baixa e portanto, o produto não reverte para o substrato inicial,
ou seja EP, pode ser eliminado da reação que é dada pela equação a seguir:
33
S+EBES~k-=2~E+P (2.13)
Para se deduzir a equação da velocidade de uma reação enzimática, assume-se que o
equilíbrio entre E, S e ES é rápido quando comparado com a velocidade com que EP se
transforma em P. Sendo assim, a etapa de formação do complexo enzimático é rápida e a de
formação de produto lenta, sendo esta última a limitante do processo. Dessa forma, a
velocidade da reação será dada por:
d[P] dS V=--=k2[ES]=--
dt dt (2.14)
A quantidade de enzima total [Eo] é dividida entre enzima livre [E] e enzima ligada ao
substrato [ES]:
[Eo] = [E]+[ES] (2.15)
Dividindo a equação (2.14) por [Eo] tem-se :
k2[ES] --=
[E]+[ES]
v (2.16)
fEoJ
No equilíbrio temos Ks (constante de dissociação do complexo enzima-sustrato) dado por:
K _ [E][Sj k_J s- [ES] kJ
(2.17)
Substituindo a equação (2.17) na equação (2.16) e multiplicando por Jlk2 tem-se:
Onde:
[S]
__ v __ = Ks
[Eo]k2 l+[S] Ks
34
(2.18)
Vmax é a velocidade máxima atingida quando toda a enzima estiver na forma complexada
(ES). Substituindo na equação (2.18) e rearranjando tem-se:
[S] =-'--'---
Vmax
v
K 5 +[S] (2.19)
A equação (2.19) é denominada equação de Michaelis-Menten e é largamente
utilizada para descrever a cinética enzimática de diversas reações. Utilizando a hipótese do
pseudo estado estacionário, no qual a concentração inicial do substrato é muito maior que a
da enzima ([Sol >>>>>[Eo]), a etapa de formação de produto é irreversível (k:rO e
d[ES]Idt =O) após um breve tempo inicial. A velocidade da reação é dada por:
d[S] v=---= kj[ E][S] -k_j[ ES]
dt
d[ES] =kj[E][Sj-(k_J+k2)[ES] dt
(2.20)
(2.21)
35 As equações (2.20) e (2.21) são resolvidas numericamente. Se d[ES]Idt =O , a
equação (2.21) fica:
Definindo a constante de Michaelis-Menten :
e substituindo na equação (2.22) tem-se:
[ES]=[Sj[E] Km
Substituindo na equação da velocidade tem-se:
[S] --= --'---"---v
Km+[S]
Quando [S] = Km, temos que v = 0.5 V"""' .
(2.22)
(2.23)
(2.24)
(2.25)
A constante de Michaelis-Menten varia na faixa de 10-1 a 10-7 M, depende do
substrato, do pH , da força iônica e da temperatura do meio. Para o limite, onde k1 > > >k2,
Km = K,, que é a constante de dissociação do complexo ES. Neste caso, a dissocição do
complexo ES para E e S, é muito mais rápida que a formação de E e P. Os parâmetros Km e
Vma.x da equação de Michaelis-Menten são estimados graficamente utilizando-se de gráficos
36 de 1/v vs 1/S , e ajustando-se a curva obtida à equação linear de Michaelis-Menten, a
seguir:
1 Km 1 1 -=----+--v Vmax [Sj Vmax
(2.26)
Reações enzimáticas são essencialmente diferentes de reações químicas
convencionais, podendo ser afetadas pela presença de outras substâncias no meio reacional,
tais como inibidores e podendo ser ainda afetadas pela concentração do substrato, parâmetro
que pode ativar ou inibir uma dada reação. Sendo assim, pode-se dizer que reações
enzimáticas são altamente específicas.
2.4. Síntese de Dextrana
2.4.1 - Introdução
A dextrana, carboidrato de fórmula empiríca (C6H100 5) com rotação ótica positiva,
foi descoberta em I 87 4 por Scheibler como o agente causador do espessamento de xaropes
de cana e beterraba. Entretanto em 1864 Pasteur já havia descoberto que este espessamento
era causado por uma bactéria denominada Leuconostoc mesenteróides (Alsop,1983). Mais
tarde, foi verificado que a dextrana se tratava de uma substância com propriedades não
muito bem definidas. Isso se deve ao fato de existir uma ampla variedade de dextranas, as
quais podem ser pouco ou altamente rarnificadas. A faixa de peso molecular deste produto é
também bastante ampla, variando de 4000 daltons até dextranas com peso molecular
superior a 2 x 106 daltons. Atualmente denomina-se dextrana uma larga classe de
polissacarídeos, obtidos por fermentação ou síntese enzimática, cujo monômero é a-D
glucaconopiranosil com a maior parte das ligações do tipo a 1-6. Embora existam outras
37
bactérias capazes de sintetizar dextrana, tais como Acetobacter e Streptococcus, a maioria
dos estudos publicados se referem ao Leuconostoc mesenteróides ou Leuconostoc
dextranicum, sendo que o Leuconostoc mesenteróides NRRL B 512 F produz dextrana com
95 % de ligações a-1,6 e 5 % de ligações 1,3-a-D-glucanopirosídicas, sendo o mais
utilizado industrialmente para a produção de dextrana.
As aplicações da dextrana estão altamente relacionadas com seu peso molecular,
podendo ser utilizada como estabilizante e espessante de alimentos, expansor de plasma
sanguíneo, película protetora de sementes, defloculante, estruturas sirúrgicas, veículo para
medicamentos e peneiras moleculares, dentre outra aplicações. A dextrana de baixo peso
molecular, ou clínica (peso molecular na faixa de 40.000-70. 000), é largamente utilizada na
indústria farmacêutica como matéria prima de medicamentos e expansor de plasma
sanguíneo, tendo sido utilizada na segunda guerra mundial como substituto do plasma
sanguíneo. Comercialmente, a dextrana farmacêutica é denominada Dextrana 40 e Dextrana
70, sendo seus pesos moleculares rigorosamente controlados pelos órgãos de vigilância
sanitária. As principais características da dextrana clínica são sua alta resistência ao calor
(resistência à esterilização) e armazenagem, independência do sangue receptor, baixo índice
de efeitos colaterais e transmissão de doenças, além da propriedade química de se ligar a
íons metálicos (propriedade relacionada com as ligações a-1 ,3 ), proteínas e até mesmo à
hemoglobina, formando compostos de interesse medicinal tais como dextrano-sulfato
(anticoagulante semelhante a heparina) e ferro-dextrana (utilizada no tratamento de anemia
em animais e humanos). Outra aplicação medicinal relevante é o tratamento contra AIDS
(Busso e Resnick, 1990). Sendo assim, a dextrana clinica pode ser uma alternativa para a
obtenção de sangue artificial (Alsop, 1983), dentre outros usos ainda não identificados. A
Dextrana 40 provoca expansão sanguínea menor que a Dextrana 70, sendo esta última
utilizada para manter o volume de sangue e a pressão arterial em vítimas de queimaduras
graves. Já a dextrana de peso molecular médio (100.000-25.000.000 daltons) é utilizada na
indústria alimentícia como agente geleificante, espessante e estabilizante de alimentos e
indústria química, onde é empregada na obtenção de peneiras moleculares, tendo grande
aplicabilidade na obtenção de colunas cromatográficas (DEAE-SEPHADEX), na produção
de soda e de alumínio. Há ainda a dextrana de alto peso molecular (superior a 25 milhões de
daltons ), a qual é empregada na extração de petróleo com alta viscosidade, fazendo parte da
38 lama de perfuração sendo também empregada na recuperação secundária de petróleo.
Devido às suas particularidades, em muitos casos, a dextrana não pode ser substituída por
polissacarideos semelhantes, garantindo assim sua aplicabilidade industrial.
Apesar do grande número de artigos publicados sobre dextrana, a aplicação prática
deste polissacarideo ainda é limitada devido ao seu elevado custo de produção.
A dextrana produzida via Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F é solúvel em
água, meti! sulfóxido e etilenoglicol, apresentando atividade ótica positiva ( + 200°) em
solução aquosa na faixa de 3 a I O % e baixa viscosidade intrínseca. Soluções a
concentrações inferiores a 5% apresentam comportamento Newtoniana (Curralero ,1993).
2.4.2 - Produção de Dextrana
A produção de enzimática de polissacarideos é de grande interesse comercial, não
somente devido a obtenção de um produto final mais puro e homogêneo, mas também
devido a um melhor controle do processo para obtenção do produto desejado, além de não
depender de condições climáticas e outros fatores ambientais que interferem na síntese
natural destes produtos. Segundo DeBelder (1987), citado em Curralero (1993), a produção
mundial de dextrana gira em tomo de 500 toneladas por ano. Tradicionalmente a produção
industrial de dextrana é realizada via processo ferrnentativo. O tipo de dextrana obtida
depende do microorganismo empregado, sendo a bactéria Leuconostoc mesenterórides a
mais empregada atualmente. Utilizando sacarose como fonte de carbono, o microorganismo
primeiramente produz a enzima dextrana-sacarase, a qual é responsável pela conversão de
sacarose em dextrana. Além do processo ferrnentativo, pode-se obter dextrana via síntese
enzimática, utilizando a enzima livre ou imobilizada. A dextrana de interesse comercial pode
ser nativa (alto peso molecular) ou clínica (baixo peso molecular), sendo esta última
geralmente obtida a partir da hidrólise ácida da dextrana nativa utilizando-se HCI, H2S04 ou
dextranases, dentre outras técnicas tais como ultra-som (Curralero,!993). Seja qual for a
técnica de hidrólise empregada, trata-se de um processo de elevado custo.
A produção de dextrana por fermentação batelada, não requer um nível de controle
do processo muito elevado, sendo a temperatura a única variável controlada. O tempo total
39 do processo é variável, a viscosidade aumenta gradativamente devido ao aumento do peso
molecular da dextrana, e o pH final atinge valores entre 4.5 e 4. 8 devido a formação de
metabólitos ácidos pelo microorganismo. Segundo Jeanes, et a!. (1948), citados em
Curralero (1993), a aeração é desfavorável à síntese de dextrana. A síntese de dextrana via
processo ferrnentativo é constituída de três etapas básicas:
• crescimento celular
• produção enzimática
• produção de dextrana
As etapas posteriores à fermentação são:
• bidrólise, a qual pode ser ácida, enzimática ou ultrassônica
• fracionamento por solvente
• isolamento sólido (spray drier)
• preparação em dosagens farmacêuticas (no caso da dextrana clínica)
O crescimento celular é realizado em meio tamponado, sendo 7 o pH ótimo para esta
etapa. Já o pH ótimo para a produção enzimática se encontra na faixa de 6.0 a 6.9, enquanto
que o pH ótimo para reação enzimática (síntese de dextrana) é de 5.2. Durante a etapa de
crescimento celular, devem ser adicionados nutrientes (minerais) e o controle do processo
não é muito importante. O controle do pH durante a produção da enzima e reação
enzimática é fundamental para se obter o rendimento desejado e evitar a desnaturação da
enzima. O processo total dura em média 36 horas e a remoção da dextrana do caldo de
fermentação é realizada via precipitação. A figura a seguir mostra a alteração dos
parâmetros durante a fermentação:
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Figura 2.4 - Alterações dos parâmetros durante uma fermentação convencional para
produção de dextrana- (Aslop, 1983)
A figura 2.4 apresenta as alterações do pH, temperatura e taxa de conversão para
uma fermentação em escala industrial a 17 % de sacarose. Nota-se que durante o
crescimento celular há pouca produção da enzima, após este período a enzima é produzida e
atinge-se a taxa de conversão de 90 %, num período de 20 horas. A reação é exoténnica e
devido a produção de ácidos o pH cai_ Em termos de peso molecular, o rendimento pode ser
dividido em dextrana de alto peso molecular e baixo peso molecular. Aslop (1983), cita em
seu trabalho vários estudos de rendimento do processo, incluindo uma curva de custo. Da
análise dos resultados destes estudos, verifica-se que o melhor rendimento em termos de
quantidade de dextrana produzida é encontrado para uma concentração de 17.9 % de
sacarose, enquanto que o menor custo operacional é encontrado em uma concentração de
12,5 %, em se tratando de dextrana de alto peso molecular. Um dos fatores preponderantes
no custo de produção da dextrana é a etapa de precipitação, que consome uma alta
quantidade de solvente, o qual é posteriormente recuperado via destilação (operação de alto
custo). Já no caso da produção de dextrana de baixo peso molecular, há ainda a etapa de
hidrólise, para a qual é também atribuído um alto custo operacional. V árias melhorias para
produção de dextrana tem sido propostas desde que esta se tornou um produto de interesse
41 comercial, sendo uma das mais promissoras a síntese do polissascarídeo em um meio livre de
células (síntese in vitro ), já que a enzima pode ser isolada e armazenada sem perder a
estabilidade.
A obtenção de dextrana via síntese enzimática apresenta várias vantagens em relação
ao processo fermentativo, apesar de requerer um nível de controle do processo mais
elevado. Dentre essas vantagens estão a possibilidade de controle do peso molecular, etapa
de purificação mais simples, pois não há presença de células nem metabólitos secundários no
meio reacional, menor gradiente de viscosidade, mesmo para a produção de dextrana nativa,
além de maior rendimento. A síntese enzimática torna-se viável no caso da produção de
dextrana devido ao fato de a dextrana-sacarase ser uma enzima exógena e com alta
estabilidade nas condições de processo. Outros fatores relevantes são a possibilidade de
maximizar a obtenção da enzima (processo fermentativo ), já que há diferenças no tocante a
pH e temperatura ótimos para síntese da enzima e da dextrana, além da possibilidade de
obtenção de fruto se, que é um açúcar de alto valor comercial, como produto secundário.
A atividade enzimática é um fator importante para controlar a síntese. Várias
definíções de atividade enzimática têm sido propostas, sendo atualmente a mais aceita
industrialmente a dada por Jeanes (1965), citado em Alsop (1983), que é a unídade de
dextrana-sacarase (DSU) definida como a quantidade de enzima que converte 1 mg de
sacarose em dextrana em 1 hora (obtendo-se 0.52 mg de frutose), sob as condições de teste.
Segundo Kepsell (1952), citado em Alsop (1983), a adição de oligossacarídeos ou
mesmo de dextrana de baixo peso molecular na síntese enzimática de dextrana, promoveria a
formação de uma maior quantidade de dextrana de baixo peso molecular ( dextranda clíníca).
Alguns resultados experimentais utilizando maltose como aceptor para obtenção de dextrana
de baixo peso molecular para síntese de ferro-dextrana podem ser encontrados no trabalho
de Curralero (1993). Embora existam vários trabalhos publicados nesta área, há ainda
controvérsias sobre a forma de adição da enzima no meio reacional, sendo que atualmente
os processos de produção de dextrana são fermentativos (Alsop, 1983). Algumas
observações devem ser ressaltadas, como por exemplo: o aumento da quantidade de enzima
não está diretamente relacionado com o aumento na quantidade de dextrana produzida.
42 2.4.3 - Síntese da Enzima
A enz1ma dextrana-sacarase (1,6-a-D-glucan-6-a-glucanosil transferase, EC.
2.4.1.5) é obtida a partir do microorganismo Leuconostoc mesenteroides via processo
fermentativo. A dextrana-sacarase é uma enzima indutiva, cujo o único indutor conhecido é
a sacarose. O microorganismo utiliza sacarose como fonte de carbono, e embora possa
crescer em outros meios, tais como frutose e maltose, não há formação de dextrana-sacarase
nestas culturas. Fatores como pH e temperatura são muito importantes na síntese
enzimática. Um estudo realizado por Tuschiya (1952), citado em Alsop (1983), mostra que
a 23 o C os melhores rendimentos foram encontrados para pH = 6.7. É importante ressaltar
que mesmo em pH 6.7 ocorre rápida desnaturação da enzima para valores de temperatura
superiores a 25 o C. O ajuste de pH é realizado com solução de NaOH. Estudos utilizando
NH40H mostraram queda na produtividade. Um dos principais fatores de otimização do
processo é o controle da concentração de sacarose, o qual é monitorado por HPLC, para
evitar que uma queda no nível de sacarose, atingindo o valor zero, provoque uma queda
irreversível no rendimento. Com base nestes dados, foi proposta a síntese da enzima via
batelada alimentada, onde sacarose em solução de NaOH é adicionada ao meio, visando a
maximização da concentração da enzima e minimização da produção de dextrana. Conforme
Curralero (1993) a obtenção de dextrana-sacarase utilizando este processo, sendo a
separação das células do caldo de fermentação realizada através de centrifugação, resultou
em um caldo de fermentação com alta atividade enzimática, entretanto o mesmo apresentava
também elevada concentração de açúcares redutores e dextrana de baixo peso molecular, o
que inviabilizou sua utilização direta na síntese in vitro de dextrana. Devido a alta
instabilidade da enzima em pH 6.7, o procedimento adotado durante a fermentação é a
diminuição deste valor para pH 5.2 com ácido fosfórico após 8 horas, valor no qual a
enzima é estável, além de ser o valor ótimo para a atividade enzimática. Com este
procedimento, o açúcar residual é convertido em dextrana de baixo peso molecular, a qual
contribui para manter a estabilidade da enzima durante a estocagem.
Bazán (1993) realizou um estudo da síntese enzimática da dextrana clínica (peso
molecular de 40.000 daltons), no qual os parâmetros que influem na síntese, tais como
concentração de sacarose, temperatura, concentração enzimática e de aceptores, foram
43 estudados. A baixas concentrações de sacarose ( 1 O %) a maior parte da dextrana obtida é
dextrana nativa (alto peso molecular), e a altas concentrações obtém-se dextrana clínica e
uma grande quantidade de frutose, glicose e outros oligossacarídeos. A dextrana é removida
do meio por precipitação alcoólica utilizando-se etano!. A remoção da dextrana nativa por
precipitação é obtida com solução de etano! a 38 % (v/ v), já para dextrana clínica a
separação ocorre com etano! a 51 % (v/ v), sendo que os oligossacarídeos são precipitados
com etano! a 90 % (v/ v). Os rendimentos obtidos via síntese enzimática, tanto para dextrana
nativa como para dextrana clínica, são superiores aos obtidos via fermentação, porque não
há consumo de substrato para crescimento celular. No processo enzimático, o rendimento
teórico é de 100 %, em termos de sacarose total, entretanto na prática este valor não é
atingido.
O trabalho de Bazán (1993) engloba a síntese da enzima (dextrana-sacarase) via
processo fermentativo e a síntese de dextrana clínica. Para a obtenção de dextrana-sacarase
foram realizados vários ensaios, variando-se a concentração de substrato no meio. O
processo utilizado foi o de batelada alimentada, sendo a sacarose e o NaOH adicionados em
uma única solução, o que segundo Monsan e Lopez (1981) é mais adequado que a
alimentação dos mesmos em soluções separadas, já que a demanda de sacarose está
associada ao pH e ao crescimetno celular.
A enzima foi obtida em reator termostatizado. Devido a baixa estabilidade da mesma
no meio fermentativo, a alimentação de substrato foi cortada após sete horas de operação
para favorecer a produção da enzima e diminuir a concentração de açúcares residuais. Foi
notada uma queda da atividade enzimática no final do processo, o que era esperarado devido
a instabilidade da enzima. Os ensaios para obtenção da enzima foram realizados na faixa de
temperatura de 27-29 o C, pH = 6.7, sendo este reduzido com HCI para 5.2 no final do
processo, e concentrações de sacarose de 80, 160 e 200 g/1. Foram obtidas como condições
ótimas concentração de substrato igual a 160 g/1 e temperatura de 2 7• C. Nestas condições,
obteve-se atividade enzimática de 106 UDS/ml e concentração de açúcares residuais de 6.54
g/1. V ale ressaltar que a utilização de uma concentração elevada de substrato leva a
obtenção de um caldo de fermentação altamente viscoso, o que impede a separação da
enzima realizada por ultrafiltração. A dextransacarase é uma enzima que se agrega
facilmente, portanto a mesma não pode ser isolada do caldo de fermentação por precipitação
44 convencional sem comprometer a batelada. Outra forma de separação da enzima é por
cromatografia de permeação em gel.
Processos convencionais de produção enzimática não utilizam aeração, e embora
existam alguns trabalhos publicados sobre o assunto, este tópico será omitido por ser de
menor importância para o trabalho em questão. Em relação a fonte de carbono, é indicada a
utilização de uma baixa concentração de sacarose, visando obter maiores rendimentos
(Alsop, 1983). Como já mencionado, a produção de ácidos metabólicos pelo
microorganismo causa decréscimo no valor do pH, o qual deve ser controlado pela adição
de álcali. Sabe-se também que em qualquer processo envolvendo microorganismos, não
somente o substrato é um insumo importante, mas também os nutrientes. Como nutrientes é
adicionado nitrogênio, na forma de xarope de milho, ou levedura e fosfato (KH2P04), bem
como íons metálicos tais como magnésio, sódio e manganês. Segundo Kabolli ( 1980), citado
em Alsop ( 1983 ), a estabilidade da enzima purificada pode ser melhorada pela adição de
Ca+2, o que também aumenta a atividade enzimática. Segundo Lawford (1979), também
citado em Alsop (1983), a incubação na ausência de Ca+2 pode causar a desnaturação
irreversível. A adição de CaCh em concentrações na faixa de O. 001% a O .1 % podem dobrar
a produção da enzima, entretanto concentrações acima de 0.1% podem levar à morte do
microorganismo.
A enzima, como mencionado anteriormente, é bastante sensível ao pH e deve ser
estocada à baixa temperatura. Segundo Robyt e Walseth (1978), citado em Curralero
(1993), a enzima purificada em solução perde estabilidade quando estocada a 4 o C, sendo
assim, o uso de estabilizantes tais como dextrana de baixo peso molecular ou polietileno
glicol, metil-celulose e até mesmo detergentes neutros se faz necessário. Souza (1993) cita
em seu trabalho que a estocagem da enzima liofilizada a temperaturas inferiores a 5 o C,
mantém sua atividade por 5 anos. Tsumuraya (1976), citado em Bazàn (1993), realizou
estudos sob a influência de metais pesados na atividade enzimática. O resultado deste estudo
demonstra que a maioria dos metais testados, mesmo em baixas concentrações, leva a
desnaturação da enzima, a qual na maioria dos casos é irreversível. Quanto a estabilidade
térmica, estudos realizados por Kaboli e Reilly (1980), citado em Bazàn (1993),
demonstram que a enzima é fortemente degradada em temperaturas superiores a 30 o C, e
tem sua atividade máxima em pH=5.2, tanto para enzima livre como imobilizada.
45 2.4.4 - Síntese de dextran in vitro
Dentre as vantagens da sintese de dextrana in vitro estão a possibilidade de se
utilizar processo continuo e com maior facilidade de otimização. Além disso, a síntese in
vitro de dextrana não necessita de enzimas secundárias, como ocorre na maioria das reações
bioquímícas, bem como a enzima dextrana-sacarase não necessita de cofatores e
intermediários fosforilados, sendo a energia necessária para a condensação das unídades
glicosídicas proveníente da hidrólise da sacarose. A dextrana pode ser sintetizada na faixa de
3 a 37 o C, entretanto de acordo com Rodrigues (1989), a máxima atividade enzimática
ocorre a 30 o C e pH = 5.2. Já a energia de ativação não está ainda bem definída sendo
encontrados na literatura valores de 5 a 11 kcal/mol, na faixa de temperatura de 15 a 3 O o C
(Souza,1993). Mesmo assim, a sintese enzimática de dextrana é alvo de interesse comercial,
já que não seriam necessárias as etapas de crescimento celular e produção da enzima, o que
implica em aumento do tempo total do processo e do consumo de matéria prima (sacarose)
Além do mais, a possibilidade de recuperação da enzima , pode tornar a síntese in vitro uma
alternativa economícamente viável.
Robyt (1979),citado em Alsop (1983), menciona que as propriedades da dextrana
sintetizada in vitro são as mesmas que a obtida via processo fermentativo. Vários
mecanísmos foram propostos para explicar a síntese de dextrana a partir de sacarose. Para se
propor um mecanísmo, deve-se levar em consideração o ciclo de crescimento da cadeia
(múltipla ou única), o processo de início da polimerização (com ou sem uso de iniciadores),
como ocorre o crescimento da cadeia (terrnínação reduzida ou não reduzida da molécula),
como ocorre a terrnínação da cadeia e como são formadas as rarníficações (ligações I, 3). A
reação geral da sintese de dextrana é dada pela equação a seguir:
nSacarose dextranasacarase
( D- Gli cose)n + nD- Frutose (2.27)
A reação é essencialmente irreversível e dentre os vários mecanísmos que têm sido
propostos para a mesma, o mais aceito é o de inserção proposto por Stay (1943), citado em
Alsop (1983), onde ocorre o crescimento em cadeia úníca conforme equações a seguir:
Onde:
S = sacarose
EP. =complexo enzima polímero
X= fi:utose
46
(2.28)
(2.29)
Neste mecanismo, a enzlilla permanece combinada à cadeia crescente, sendo o
mesmo concordante com medidas experimentais. Outro mecanismo proposto é o
crescimento em cadeia múltipla, no qual a cadeia se dissocia e há a formação de
oligossacarídeos e dextrana de baixo peso molecular. Entretanto este mecanismo não
encontra respaldo em medidas experimentais. Segundo o mecanismo de inserção, a
dextrana-sacarase age transferindo o grupo glicosil do doador ( sacarose) para o grupo
aceptor (cadeia polimérica de dextrana). Se houver falha na identificação do grupo aceptor
pela enzima, sendo identificada, por exemplo a água, ocorre hidrólise (invertase). Sendo
assim, a enzima teria dois tipos de atividade, hidrolítica e de glicosiltransferase. A primeira
etapa (atividade hidrolítica) seria a quebra da ligação glicose-fi:utose (constituintes da
sacarose), originando o grupo D-glicosil. A seguir, o grupo glicosil é transferido para cadeia
de polissacarideo (glicosiltransferase). A enzima teria também dois grupos ativos, um
doador e outro receptor. Duas moléculas de sacarose se ligam uma a cada um dos grupos
citados. O grupo glicosil da sacarose, ligada ao sítio doador, é então transferido para o
grupo receptor, liberando urna molécula de fi:utose. Dessa forma, ocorrem transferências
sucessivas de grupos D-glico-piranosil da sacarose para o final não redutor da cadeia ligada
ao sítio receptor. Esta transferência origina as ligações a.-1,6. A síntese é encerrada pela
dissociação ou inativação do complexo enzima-dextranosil, que se dá devido a atividade de
aceptores naturais, tais como glicose e fi:utose em concentrações suficientes para concorrer
47 com a sacarose pelo sítio ativo, liberando a dextrana. Segundo Alsop (1983) há teorias
quanto a utilização de iniciadores, que suportam o complexo enzima-sacarose como tal,
embora haja evidências de que os mesmos não sejam necessários.
Quanto a direção de crescimento da cadeia, o trabalho de Sidebotham (1974), citado
em Alsop (1983), menciona a existência de várias teorias a respeito do mesmo, que pode se
dar na extremidade não reduzida, reduzida ou em ambas, bem como há possibilidade de não
haver direção definida. Experimentos realizados por Robyt e Walseth (1978), utilizando
traçadores ( C14) e técnicas cromatográficas de análise, demonstram que o crescimento
ocorre na extremidade reduzida da cadeia. O mecanismo proposto por Robyt et al. (1974),
citados em Alsop (1983), consiste na formação de complexo enzimático covalente de glicose
e dextrana, sendo a glicose insertada entre a enzima a dextrana por ataque nucleofilico do
grupo C6-0H da glicose ao C1 da dextrana, formando uma ligação a-1, 6 -glicosídica. Desta
forma, há a formação de um grupo nucleofilico que ataca a sacarose formando um grupo
glicosil.
Quanto a terminação da cadeia, o mecanismo mais aceito é o mecanismo aceptor,
conforme citado anteriormente, no qual os açúcares de baixo peso molecular se ligam à
extremidade crescente da cadeia cessando a transferência dos grupos glicosídicos. Esta
técnica é também proposta para o controle do tamanho da cadeia, viabilizando a produção
de dextrana de baixo peso molecular através da adição de aceptores tais como maltose e
isomaltose dentre outros. Estes aceptores promovem a quebra entre a cadeia crescente e a
enzima segundo reação a seguir:
ESPn + S--+ SESPn --+ ES + SPn (2.30)
Este mecanismo pode também explicar porque com o aumento da concentração de
sacarose, o peso molecular da dextrana obtida é menor. Os aceptores podem ser
classificados em:
• fracos ( sacarose)
• moderadamente fortes ( a-metilglicosídeo)
48 • fortes (frutose e sorbitol)
O mesmo mecanismo pode explicar a diminuição da quantidade de dextrana de alto
peso molecular obtida por Curralero (1993) a altas concentrações de sacarose. Robyt e
Walstb (1978), investigaram a reação destes aceptores utilizando C14 como traçador dos
aceptores. Neste experimento, foram utilizados como aceptores glicose, frutose e maltose,
sendo obtidos produtos de alto e baixo peso molecular para reação. A redução e lúdrólise
ácida dos aceptores demostrou que todos os aceptores eram incorporados na extremidade
reduzida da cadeia. Isto demostra que o mecanismo de reação dos aceptores ocorre sem a
presença de sacarose. Nesta reação ocorre não somente a terminação da cadeia mas também
a produção de oligossacarídeos, conforme quadro a seguir:
Quadro 2.1 -Relação aceptor oligossacarídeo produzido- (Alsop,1983)
Glicose
Frutose
Maltose
Isomaltose
Leucrose
Panose
Quando a reação ocorre na presença de sacarose, há competição entre a reação de
polimerização da sacarose e dos aceptores, entretanto a estrutura dos produtos dos
aceptores e sua localização na cadeia é a mesma na presença ou ausência de sacarose. O
mecanismo proposto para incorporação do aceptor na cadeia da dextrana é o mesmo
proposto por Robyt e Walseth (1978), para o crescimento da mesma, ou seja ataque
nucleofilico do grupo glicosil e dextrangicosil do complexo enzimático formando
oligossacarideos e dextrana. Na presença de sacarose e do complexo
enzima!dextrana!glicosil, o estado dinâmico dos oligossacarídeos permite a formação de
outros complexos com a enzima, produzindo uma série de oligossarídeos e dextranas de
baixo peso molecular. A mistura de produtos obtidos depende da cinética das reações e da
força dos aceptores, bem como e suas concentrações.
49 As ramificações da cadeia de dextrana são constituídas de ligações 1,3. O estudo de
Bovey (1959) e Bailey (1957), citados em Alsop (1983), atribui as ramificações encontradas
na dextrana a uma enzima secundária denominada altemansacarase, a qual é termicamente
mais estável que dextrana-sacarase, entretanto só é obtida na presença de íons magnésio.
Até pouco tempo atrás não era possível separar a dextrana ramificada da não ramificada.
Um estudo utilizando Leuconostoc mesenteroides Bl355, mostrou ser possível a obtenção
de dextranas separáveis com caracteristicas fisicas diferentes denominadas ·L ·e · S, sendo a
dextrana 'L' um produto típico com 95 % das ligações 1, 6 e a dextrana 'S' um produto com
ligações alternadas 1,6 e 1,3, segundo Jeanes (1970), citado em Alsop (1983). O mecanismo
proposto para a formação de ramificações é análogo ao mecanismo de reação do aceptor,
proposto por Robyt e Walseth (1978), previamente apresentado. Neste caso, a dextrana
livre em solução se liga à cadeia em crescimento através do ataque nucleofilico de seu C3 ao
C1 na extremidade redutora da cadeia, liberando a dextrana do complexo. Este mecanismo
foi confirmado por experimentos laboratoriais, entretanto não foram realizados testes em
escala industrial.
2.4.5 - Ação da dextrana-sacarase sobre a sacarose em condições industriais
Testes de produção in vitro de dextrana em escala industrial foram efetuados a pH
5.2. A enzima utilizada foi obtida previamente por fermentação, segundo procedimento
descrito anteriormente, com adição de sacarose a um taxa de 20g/Vh. Notou-se o
aparecimento de uma pequena quantidade de frutose e leucrose no meio reacional,
entretanto o efeito destes carboidratos como aceptores foram ignorados no experimento em
questão (Alsop, 1983). O desenvolvimento de técnicas analíticas, tais como cromotografia
líquida dentre outras, permitiu o estudo do efeito de vários parâmetros na conversão de
sacarose em dextrana em escala industrial, tendo sido encontrado como parâmetro mais
importante de controle do rendimento e peso molecular a concentração de sacarose. A
tabela a seguir apresenta os rendimentos dos carboidratos envolvidos na sintese de dextrana
a várias concentrações de sacarose:
50 Tabela 2.1 - Rendimentos das frações de carboidratos obtidos na síntese in vitro de dextrana
variando-se a concentração de sacarose (g I 100 g de sacarose)-(Alsop,1983).
52.2 1.9 45.9 45.9 o 4 4.4 45.6 45.6 o 5 51.3 o lO 51.2 6.8 42.0 39 3.0
15 55 5 35.3 25.3
20 56.9 11.2 31 17 9 14.0
Analisando a tabela 2.1, observa-se que quanto maior a concentração de sacarose,
maior a quantidade de dextrana de baixo peso molecular obtida, sendo o maior rendimento
obtido para a concentração de 20 %. A concentração de leucrose (príncipal
monossacarideo) aumenta com o aumento da quantidade de dextrana de baixo peso
molecular produzida. A quantidade de dextrana de baixo peso molecular bem como de
oligossacarideos aumentam consideravelmente para concentrações de sacarose acima de
10%.
Bazán (1993) realizou uma série de ensaios em escala laboratorial para produção de
dextrana clínica via reação enzimática variando parâmetros como R ([aceptor]/[sacarose]),
concentração de sacarose, e temperatura. Ensaios preliminares foram realizados utilizando
se maltose como aceptor, sendo posteriormente realizados ensaios mais conclusivos
utilizando dextrana de baixo peso molecular (4676 daltons) como aceptor.
Através da análise dos efeitos dos parâmetros estudados por Bazán ( 1993 ), realizada
através do estudo de superficie de resposta, verificou-se que a concentração de sacarose é a
variável que mais influencia o processo, sendo que altas concentrações favorecem a
produção da dextrana clínica. Já a relação R, tem influência semelhante na concentração de
sacarose, porém em menor grau, sendo observado que o aumento de R favorece o
rendimento. A temperatura é a variável de menor influência, embora tenha sido notado que a
diminuição da mesma favorece a formação de dextrana clínica.
51 Zafar e Barker (1988) realizaram um estudo de síntese enzimática utilizando um
reator cromatográfico, no qual resultados obtidos experimentalmente foram comparados
com resultados obtidos em simulações do sistema proposto, tendo como objetivo prever o
comportamento do reator com base em parâmetros básicos, tais como constante de
Michaelis-Menten e coeficientes de distribuição. A idéia da utilização do reator
cromatográfico é baseada na diferença de afinidade entre os componentes da fase
estacionária e fase móvel, possibilitando assim a separação do produto, reduzindo com isto
os custos de purificação. O modelo proposto por Zafar e Barker (1988) considera a
dispersão axial infinita, sendo o reator aproximado a um tanque agitado. O sistema proposto
nada mais é que uma coluna preenchida com resina, onde dextrana-sacarase é alimentada
continuamente e pulsos de sacarose são ínjetados no sistema. A medida da eficiência do
reator revelou um consumo maior de enzima que o obtido em processos convencionais. Os
cromatogramas obtidos apresentam picos de sacarose e dextrana muito próximos, o que
compromete a aplicabilidade do processo. Entretanto estes fatos podem ser alterados pela
troca da resina. Quanto a simulação, a utilização de picos baixos de sacarose apresenta
resultados concordantes com os experimentais, entretanto desvios são observados para picos
elevados de sacarose. Neste caso, correções são feitas no modelo, que assume que a
sacarose é injetada no sistema em solução de dextrana-sacarase de mesma concentração que
a eluída continuamente pela coluna.
Souza ( 1993) propôs a síntese enzimática de dextrana utilizando o processo CARE,
tendo obtido experimentalmente as isoterrnas de adsorção da enzima em DEAE- Celulose e
os parâmetros da equação de Langmuir. A DEAE Celulose foi escolhida dentre três resinas
testadas, pois esta se mostrou a mais adequada para adsorção da enzima. Os resultados
obtidos em simulação com o modelo proposto mostraram grande perda de enzima, o que
foi atribuído ao fato do sistema não atingir o estado estacionário. O modelo de Souza
(1993) considera a reação de adsorção de 2' e a de dessorção de I' ordem, sendo a etapa de
adsorção muito mais lenta que a de dessorção. Um segundo estudo, do mesmo processo
realizado por Curralero (1998), engloba a análise das variáveis que mais afetam o processo,
além do efeito do tampão de desorção. Uma análise de superficie de resposta dos dados
obtidos envolvendo os parâmetros rendimento de dextrana, concentração dos constituintes
do tampão de dessorção, concentração de sacarose e quantidade de enzima retida, além de
52 produtividade levam a conclusão que o tempo de residência no reator de adsorção tem
influência significativa sobre todas as respostas, principalmente sobre a produtividade,
variável sobre a qual o aumento do tempo de residência no estágio de adsorção tem efeito
negativo. A retenção enzimática, entretanto, é favorecida pelo aumento do tempo de
residência no estágio de adsorção. Estes efeitos dificultam a otimização do processo, já que
a variável em questão tem efeito contrário entre estas duas respostas, as quais são de grande
interesse. Com as respostas analisadas foram obtidos modelos quadráticos para
produtividade, rendimento e retenção da enzima.
2.4.6- Purificação enzimática e Imobilização
A síntese enzimática pode ser realizada utilizando a enzima na forma livre e na forma
imobilizada. Monsan e Lopez ( 1981) realizaram um estudo comparativo entre estes dois
tipos de síntese, sob as mesmas condições. F oram notadas limitações difusionais durante a
reação enzimática, as quais são fortemente dependentes do suporte utilizado. Foi observada
também a tendência de formação de dextrana de alto peso molecular, devido a ligação de
unidades de glicose às cadeias pré-existentes. A síntese de dextrana clínica foi obtida
utilizando-se maltose como aceptor, sendo a distribuição do peso molecular obtida nesta
última, menos dispersa que a obtida quando a dextrana clínica é obtida via hidrólise de
dextrana nativa.
Segundo Monsan e Lopez (1981), quanto menor a superficie específica melhor é a
imobilização da enzima, devido a importância da difusão interna. V ale também ressaltar que
a síntese in vitro, utilizando-se enzima livre, segue a cinética de Michaelis-Menten, enquanto
que para a síntese com enzima imobilizada devem ser considerados os desvios deste modelo,
que ocorrem devido ao aumento da viscosidade durante a síntese. Esse fato também dificulta
a recuperação do suporte após a síntese. Entretanto, o aumento da viscosidade não é
observado na presença de aceptores, pois neste caso a dextrana sintetizada é de baixo peso
molecular. Sendo assim, a síntese de dextrana clínica com enzima imobilizada é uma
alternativa viável e interessante, embora existam poucos trabalhos publicados referentes a
este processo. As condições ótimas de síntese (temperatura e pH) não são influenciadas pela
53 imobilização. O maior problema encontrado é o aumento da viscosidade no interior dos
poros, o que favorece o crescimento da cadeia. A resistência difusional devida a esse
mecanismo é similar àquela apresentada em sínteses com inibição pelo produto. Quanto a
síntese de dextrana clínica, a utilização de enzima imobilizada, ou livre com acpetores
(maltose por exemplo) são similares no tocante às condições de síntese, entretanto a síntese
com enzima imobilizada permite a utilização de um processo contínuo, além de permitir a
produção simultânea de açúcares de alto poder adoçante e grande valor agregado tais como
fruto se.
Estudos realizados por Kaboli e Reilly (1980), citados em Bazàn (1993), levam a
conclusão de que a atividade enzimática é reduzida com a imobilização, sendo o melhor
suporte encontrado, a sílica. Quanto mais porosa a sílica, menor é fixação da enzima, sendo
a dextrana-sacarase uma enzima de dificil imobilização a qual é facilitada pela adição de
maltose. Alsop (1983) realizou testes em escala piloto obtendo consumo de 100 % do
substrato utilizado na produção de dextrana. Entretanto o autor não revela as condições de
teste ou mesmo o suporte utilizado. Quanto às propriedades da enzima, foram notadas
apenas pequenas variações quanto a estabilidade.
2.5 - Redes Neurais
2.5.1 - Introdução
Redes neurais são modelos comoutacionais com capacidade de aprender ou adaptar
se. São baseadas no sistema neurológico humano e sua operação é baseada em
processamento paralelo, derivado do modelo paralelo distribuído (PDP). Em uma rede
artificial, as unidades (neurônios) de processamento simples se comunicam entre si enviando
sinais através de um grande número de pesos (conexões). Para cada célula (neurônio) é
atribuída uma ativação (output). Para cada conexão é atribuído um peso, o qual determina o
efeito do sinal da unidade j (input) na unidade i ( output) através de um regra de
propagação. A figura a seguir apresenta a estrutura de uma rede neural:
Figura 2.5 -Estrutura de uma rede neural.
A rede apresentada na figura 2.5 é composta de três camadas de neurônios: input,
hidden e output. Quando estas camadas são conectadas na forma jeed-foward as
informações são passadas do input para a hidden e dai para o output. A rede apresentada na
55 figura 2.5 possui apenas uma camada hidden, entretanto pode-se trabalhar com redes com
duas ou mais camadas hidden.
2.5.2- Unidades de processamento:
Os neurônios ou unidades de processamento têm como função transformar o input
em output (calculado). Existem três tipos básicos de unidades de processamento:
camada input: recebe os dados externos
camada output: envia os dados para fora do sistema
camada intermediária (hidden): recebe e envia dados internos ao sistema
As várias unidades trabalham simultaneamente e durante a operação, as mesmas
podem ser atualizadas sincronicamente (atualização simultânea de todas as unidades) ou
anasincronicamente (cada unidade é atualizada a um dado tempo t ).
2.5.3 - Conexão entre as unidades:
Cada unidade fornece uma contribuição ao input da unidade a qual está conectada,
gerando um output. O input total é dado pela somatória dos outputs individuais mais um
termo externo denominado bias , conforme equação a seguir:
(2.31)
com
W;j > O ( excitação )
wij < O ( inibição )
56 Onde:
i, j = a unidade a que se refere (i,j)
i; = input de um conjunto de neurônios
a j = valores de ativação do elemento i da rede dado o vetor input
Wij = peso da conecção da unidade j para i
e,= input bias o(o.f( set) da unidade i
2.5.4 - Ativação e regras de saída
A função Fi fornece o efeito da ativação no input total da unidade, produzindo um
novo valor de ativação a, (t + I) para a unidade i dado por:
a, (t+ 1) = F;(a;(t),i;(t)) (2.32)
Freqüentemente a ativação é uma função não decrescente do input total da unidade
dado por:
(2.33)
Normalmente a função Fi é dada por uma função sigmoidal (forma de S ) como
apresentado a seguir:
F(i ) = 1 . =a,
' l+e-'' (2.34)
Em alguns casos o output pode ser uma função estatística. Neste caso a ativação é
determinada por uma função probabilística dada por:
1 p(a; *- 1) = 1 -UT +e ,
Onde:
T = parâmetro que determina a inclinação da função probabilidade
2.5.5 - Topologia
57
(2.35)
A topologia da rede determina o número de neurônios em cada uma das camadas
(input, hidden ou output). O número de neurônios na camada input está relacionado com os
dados de entrada da rede, ou seja informações fornecidas para a rede. O número de
neurônios na camada output está relacionado com a salda da rede, ou seja dados preditos
pela rede. Já o número de neurônios na camada hidden, bem como o número de camadas
hidden, é determinado durante o treinamento da rede.
2.5.6 - Treinamento da rede
O treinamento da rede consiste em configurar a rede para um dado conjunto de
dados de entrada com a finalidade de obter a salda (output) desejada. Para treinar a rede
podem ser utilizados conhecimentos prévios ou alguma regra de aprendizagem. A rede é
treinada através do ajuste de pesos das conexões entre as unidades de acordo com uma
regra de modificação. O treinamento, ou apredizagem da rede pode ser de dois tipos:
Supervisionado ou associativo: tanto o input quanto o output são fornecidos
Não supervisionado (auto-organizado): a unidade de output é treinada para responder aos
inputs, isto pode ser feito estatisticamente.
58 2.5. 7 - Modificação dos padrões de conectividade
O modelo básico de ajuste de pesos é o Modelo de Hebbian (Hebbin Leaming
Rule ), o qual utiliza duas unidades i e j simultaneamente ativas. Se i recebe o input de j
temos:
Llw. ="-'.a lJ 1 ..... 1 J (2.36)
Onde:
y = taxa de aprendizagem da rede (constante positiva )
Outra regra bastante utilizada que leva em conta a diferença entre a ativação real e a
desejada é a de Wrdrow -Hoff dada por:
(2.37)
Onde:
d; = ith elemento do output desejado para rede
2.5.8 - Terminologia
output vs ativação: output é igual a ativação (a saída de um neurônio é igual a ativação)
bias. o f! set . threshold: são termos constantes e independentes do conjunto de entrada da
rede, geralmente são implementados com pesos de valor unitário.
número de camadas: a rede pode ter duas ou mais camadas, para redes feed-jorward a
camada input não é computada
59 aprendizagem vs armazenagem: métodos de aprendizagem são baseados na minimização do
erro, enquanto métodos de armazenagem se referem a determinação dos parâmetros (pesos
da rede).
2.5.9 - Regra de aprendizagem e teorema de convergência
O treinamento da rede é realizado como descrito a seguir:
1) atribua pesos para as conexões randomicamente
2) selecione um vetor input ± dentre as amostras disponíveis para treinamento
3) se o output fornecido pela rede for diferente do desejado, o método fornecerá uma
resposta incorreta, e os pesos devem ser modificados de acordo com a regra Delta:
4) Volte para o passo 2
O procedimento é muito similar à regra de Hebb, a diferença é que quando a rede responde
corretamente não são feitas modificações nos pesos. Além das modificações nos pesos,
deve-se também modificar o limitante e, o qual é considerado uma conexão w0 entre
neurônio output e um neurônio nulo sempre em atividade: 1;0 = I.
Teorema da convergência: se existe um grupo de conexões de peso w*, o qual é capaz de
executar a transformação T, onde os dados de input são transformados corretamente em
output, a regra de aprendizagem da rede irá convergir para uma solução (a qual pode ser ou
não a mesma que w*) em um número finito de passos para quaisquer que sejam os pesos
iniciais.
60 2.5.10 - Regra delta
Trata-se de uma generalização do método de aprendizagem, utilizando-se o método
dos mínimos quadrados. A técnica pode ser estendida a inputs e outputs contínuos. A regra
tem sido aplicada principalmente para outputs puramente lineares. Para uma rede com um
output, o mesmo é dado por:
(2.38)
Onde:
Xj = padrão do vetor input
e = bias da unidade
A função erro (mínimos quadrados) é dada por:
(2.39) p p
Onde:
EP = erro do output da rede, dado o vetor input p
E = somatória dos erros
dP = output desejado dado o input p
aP = valores de ativação da rede dado o input p
O método encontra o valor dos pesos que mínimiza a função erro utilizando o
método do gradiente descendente. Este método realiza alterações nos pesos
proporcionalmente à negativa da derivada do erro no padrão corrente, para cada peso.
61 2.5.11 - Backpropagation
Os métodos que utilizam backpropagation consistem na generalização do erro. Os
erros da camada intermediária são determinados pela retroprogação dos erros da camada
output. Este método é utilizado para sistemas multicamadas de funções não lineares.
Trabalhando com backpropagation
I) apresentação do input e propagação do mesmo através da rede para cálculo do output
para cada unidade
2) passagem de volta através da rede (backpropagation) propagando o erro e ajustando os
valores dos pesos
O sinal de erro para a camada intermediária, é determinado recursivamente em termos do
sinal de erro das unidades diretamente conectadas, e o peso destas unidades.
O procedimento de aprendizagem requer que a alteração no peso seja proporcional a
óEP
ôw' sendo a taxa de aprendizagem a constante de proporcionalidade y. A taxa de
aprendizagem deve ser a maior possível. Para evitar oscilação e a alteração de peso, deve
se levar em consideração a alteração anterior de peso. Isto é feito pela adição de um termo
de momento.
A não utilização do método dos momentos faz com que o processo seJa maJs
demorado. Taxas muitas altas podem não convergir para o mínimo devido à oscilação na
rede. A ordem de apresentação do input para a rede é importante e pode ser utilizado o
método de permuta e transformações tais como séries de Fourrier.
62 2.5.12 -Deficiências e aplicações da backpropagation
Uma das principais deficiências do método é o fato de o treinamento ser lento e
demorado, o que em alguns casos pode ser atribuído a utilização de taxas de aprendizagem
e momentos inadequados. Muitos algoritimos possuem adaptações que permitem otimízar a
taxa de aprendizagem. As principais falhas oriundas do método são: encontro de um
mínimo local e paralisação da rede, definidas a seguir:
Paralisação da rede: pode ocorrer devido a ajustes de pesos com valores elevados . Isso
faz com que o input total para a camada intermediária (hidden), ou para a camada output
assuma valores muito altos (positivos ou negativos). Devido ao fato de a função de ativação
ser sigmoidal, a unidade terá uma ativação muito próxima de 1 ou de zero, sendo assim os
ajustes podem se tomar muito próximos de zero e o treinamento se toma virtual.
Mínimo Local: a superficie de erro de uma rede complexa é cheia de irregularidades (poços
e morros). Devido ao gradiente descendente, a informação pode ficar presa em mínimo local
quando há mínimos "mais profundos" nas vizinhanças. Métodos probabilísticos podem
evitar os mínimos locais, entretanto são mais lentos. Outra forma de contornar este
problema é o aumento do número de camadas intermediárias.
Aplicações da backpropagation
O método de backpropagation pode ser aplicado, a princípio a qualquer sistema
multicamada. Algumas aplicações específicas, tais como conversão da escrita em fala e
classificação de sinais sonoros, são citadas na literatura.
Na Engenharia Químíca, pode ser utilízada para predição do comportamento do de
qualquer sistema e ou unidade principalmente quando há dificuldades na modelagem
determínistica ou quando o tempo de processamento para a simulação do processo é
elevado.
3.1 Introdução
O processo CARE (Continuas Affinity Recicle-Extraction) foi proposto
originalmente por Pungor et ai. (1987) como um processo alternativo para separação e
purificação de proteínas. Desde então, o processo CARE tem sido objeto de estudo visando
várias aplicações, dentre elas destaca-se a síntese enzimática de bioprodutos.
Uma modelagem para este processo, é apresentada no trabalho de Rodrigues et ai.
(1992), para purificação de proteínas, apresentando o balanço de massa para a proteína livre
e adsorvida. As equações apresentadas por Rodrigues et ai. (1992) não apresentam termos
referentes a transferência de massa no filme líquido ou a difusão no interior dos poros da
resina adsorvente. Segundo os autores foi utilizado o modelo de adsorção proposto por
Chase (1984), no qual estes parâmetros estão englobados pela constante cinética de
dessorção. No caso de síntese de bioprodutos, além da cinética de adsorção deve ser levado
em conta a reação enzimática.
Posteriormente, Souza (1993) estudou o mesmo sistema para a síntese enzimática
de dextrana. A figura a seguir apresenta um esquema do processo CARE para síntese de
dextrana:
Fl
Tampão dessorção +Substrato
Fr,C2,q2,S2
Fr -c- Fl, Cl, ql,Sl
64 F2
Tampão de adsorção
Fl + FZ
Produto
Figura 3 .1 - Esquema de um reator duplo estágio para síntese de dextrana baseado no
processo CARE.
3.2 - Modelagem do o reator duplo estágio
No sistema proposto por Souza (1993), o primeiro estágio do sistema é o tanque de
dessorção. O estágio de dessorção recebe alimentação contínua de substrato e do tampão de
dessorção. Já o segundo estágio é o tanque de adsorção. Este estágio recebe alimentação do
tampão de adsorção e tem a função de manter a enzima no sistema. O processo opera
continuamente, sendo a enzima adsorvida no estágio 2 e dessorvida no estágio l, onde
ocorre a reação enzimática com a enzima livre em solução.
Uma corrente de refluxo promove o transporte de um tanque ao outro, sendo o
produto continuamente removido no estágio de adsorção e a enzima reciclada no sistema.
Souza (1993) apresenta um modelo matemático para o sistema apresentado na figura 3.1,
sendo o mesmo baseado no modelo proposto por Rodrigues et al. (1992). A modelagem
matemática proposta por Souza (1993) considera ambos os tanques reatores perfeitamente
agitados e de volume constante. Sendo assim, a vazão efluente do sistema será igual a soma
das vazões de alimentação do mesmo. Quanto a cinética enzimática para a síntese de
dextrana, a mesma segue o modelo de Michaelis-Menten. Já em relação a adsorção da
65 enzima, a mesma segue o modelo de Langmuir, sendo a adsorção uma reação de segunda
ordem e a dessorção uma reação de primeira ordem.
Como não há remoção de sólido no sistema, a fração líquida é constante. O
modelo proposto por Souza (1993) não considera as resistências à transferência de massa
no modelo de adsorção ou a influência dos tampões de adsorção e dessorção. Inicialmente
foi desenvolvido um modelo para o sistema duplo estágio, baseado no trabalho de Souza
(1993). A modelagem do reator duplo estágio é apresentada a seguir:
3.2.1- Balanço de massa para o tanque 1 (dessorção)
(3.1)
(3.2)
(3.3)
3.2.2- Balanço de massa para o tanque 2 (adsorção)
FRC2e + [k2q2 -kJC2(qm -q2)}(1 -e) ~ e
(3.4)
(3.5)
dSz =FRSJs +FJSJ _FRSzs (FJ+Fz}Sz KCzSz dt Vz Vz Vz v2 Km +Sz
Para as equações do modelo são válidas as seguintes relações:
66
(3.6)
volume de liquido s=
volume de solidos 1 - s volume de solidos
volume total 1-s= ---------
volume total s volume de liquido
3.3 - Modelagem do reator triplo estágio
Souza (1993) realizou diversas simulações utilizando o modelo apresentado no
item 3.2. De acordo com os resultados obtidos, um dos maiores problemas do processo
proposto é a alta taxa de perda enzimática, o que poderia ser minimizado pelo aumento do
tempo de residência no estágio de adsorção. Entretanto, o ajuste entre os tempos de
residência nos dois estágios é difícil, pois a obtenção de um alto consumo de substrato no
tanque de dessorção implica em baixo tempo de residência no estágio de adsorção, o que
prejudica a retenção enzimática (Curralero et a1.,1998).
Maugeri et ai. (1997), ainda para separação de bioprodutos, propuseram uma
alteração no processo CARE adicionando ao sistema um estágio de lavagem, ficando o
sistema então com três tanques agitados.
Visando o aumento do tempo de residência na etapa de adsorção, neste trabalho é
proposto um sistema onde um estágio intermediário de adsorção é adicionado ao modelo
duplo estágio proposto por Souza (1993). O sistema proposto pode ser visualizado na figura
a seguir:
Fl
Tampão dessorção + Substrato
Fr-'-Fl,Cl,ql,Sl
F2
T aro pão de adsorção
F r, C3, q3,S3
Fr..,-fh--F2 C2,q2,S2
Figura 3.2 -Esquema de um reator triplo estágio para síntese de dextrana
F3
Tampão de adsorção
Produto
A modelagem do sistema apresentado na figura 3.2 é apresentada a seguir:
3.3.1- Balanço de massa para o tanque 1 (dessorçiio)
dCJ FRC3s ---dt VJ
_dq_J = _F R,_,_q'-"3_s dt VJ
FJSJ _ KC1S1
v] Km+SJ
67
(3.7)
(3.8)
(3.9)
3.3.2- Balanço de massa para a o tanque 2 (adsorção)
dS2 _ FRSJ& , F1S1 FRS2s _ (FJ +F2JS2 -- -,----dt v2 v2 v 2 v2
3.3.3- Balanço de massa para o tanque 3 (adsorção)
_dC_3 = FrC2s +"-(F-"'J~+_F-=2'-'-)_C~2 (FJ +F2 +F3)C3
dt V3 V3 V3
FRS3s (FJ +F2 +F3)S3
V3 ~3
68
(3 .1 O)
(3 11)
(3.12)
(3 14)
(3 .15)
69 3.4- Resultados
Os modelos apresentados nos itens 3.2 e 3.3 foram resolvidos numericamente
utilizando-se o método de Runge Kutta de 4" ordem. Devido ao fato do sistema de equações
ser rígido foi necessário um ajuste do passo integração, tendo sido encontrado um valor
bastante pequeno ( I x 10- 5). Para a simulação dos reatores duplo e triplo estágio foram
utilizadas as seguintes constantes:
Tabela 3.1 -Constantes utilizadas para simulação dos reatores duplo e triplo estágio
qm = 519, 751 g r 1 kl = 7,1 1 g·l h-1 K = 186 98 h-1 ,
Kd = o,4975 g r 1 k2 = 3,54 h-1 T =25 o C
Km=5,12gr1 k3 = 1000 h-1 :pH= 5,2
As constantes acima foram extraídas do trabalho de Souza (1993), no qual os
valores das constantes cinéticas de adsorção foram obtidos a partir do ajuste do modelo de
adsorção (Langmuir) aos dados experimentais, e o valor da constante de dessorção (k3) foi
definido com base no trabalho de Rodrigues et al. (1992), sendo considerada dessorção
instantânea.
A temperatura e o pH são considerados constantes na síntese enzimática de
dextrana, visto ser o reator isotérmico, além de apresentar um pH e temperatura ótimos do
ponto de vista cinético (reação enzimática). Os valores de pH e temperatura apresentados
na tabela 3.1 são os valores ótimos para a reação em estudo.
3.4.1 - Sistema duplo estágio
Primeiramente, foi realizado um estudo paramétrico com o modelo duplo estágio,
a fim de verificar a influência de cada uma das vazões e da fração líquida sobre o sistema.
Com este estudo foi notado que as simulações reportadas por Souza (1993) e Curralero
(1998) foram realizadas utilizando-se o modelo simplificado (apêndice 1). Com este
70 modelo, ou seja considerando a adimensionalidade das vazões, as vazões de alimentação
nos dois tanques são necessariamente iguais. O estudo paramétrico realizado com o modelo
não simplificado mostrou que a utilização de vazões de alimentação diferentes, nos estágios
de dessorção e adsorção para o sistema duplo estágio, leva a uma maior retenção
enzimática, com aumento significativo do consumo de substrato em relação ao obtido
quando se utilizam vazões iguais.
Outra variável que em muito influencia a retenção enzimática é a vazão de refluxo.
Observou-se que quanto maior a vazão de refluxo, maior é a quantidade de enzima retida
no sistema. Além das variáveis já mencionadas, há ainda a fração líquida do sistema.
Verificou-se que quanto menor a fração líquida, ou s~a, quanto maior a quantidade de
resina no sistema, maior é a quantidade de enzima retida. Entretanto, a fração líquida não
pode ser muito baixa, pois o modelo proposto baseia-se na hipótese de os tanques serem
perfeitamente agitados. Com valores muito baixos de fração líquida, não se pode assegurar
a validade desta hipótese. Para ilustrar as observações resultantes do estudo paramétrico
efetuado com o modelo duplo estágio, foram realizadas as simulações apresentadas na
tabela 3 .2.
Tabela 3.2- Condições operacionais para o reator duplo estágio
100 100 50
100 100 100
70 250
70 250
100 70 250
Diversas simulações forma feitas para se chegar na faixa de vazões apresentada na
tabela 3.3. Sendo assim, os dados apresentados na tabela 3.2 constituem algumas das
condições operacionais utilizadas para simular o reator duplo estágio. Nestas simulações, o
volume de ambos os tanques foi considerado igual e sendo o volume total (volume de
sólido + volume de líquido) de cada um dos tanques de 1000 litros. A utilização de um
volume de 1000 litros para cada um dos tanques visa aproximar o sistema às condições
operacionais industriais do processo, visto que uma das propostas deste trabalho é o estudo
da viabilidade técnica da produção industrial de dextrana. As concentrações iniciais de
71 enzima adsorvida são nulas para ambos os tanques. A concentração inicial de enzima livre
no tanque de dessorção é dada pela variável Co (tabela 3 .2) e é nula no tanque de adsorção.
A concentração inicial de substrato, no tanque 1, é igual a concentração de substrato na
corrente de alimentação, e é nula no tanque de adsorção. O valor da concentração inicial de
substrato é de 25 g/1 (tanque 1) e a fração líquida do sistema é constante.
Com os resultados obtidos por simulação, foram confeccionados gráficos
comparativos entre as diversas condições de operação. Estes gráficos são apresentados nas
figuras 3.3; 34 e 3.5:
''"' [ o.m~
' g '-'" ~l
o,9a5 I ~ Sim1
0,980 lf _:_:;=-=;;:::.~=;~1--::-~:';:---C:-~----~·-~ m ~ w ~ tM
Tempo(h}
Figura 3.3 - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema
(reator duplo estágio).
0,35
o 0,30 ~
i " o •
"'
''
02
Tempo{h)
~Sim'!
i --Sim2 Sim3
so ao
Figura 3.4 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção (reator duplo estágio).
~ \ ''~ ~ ~ • " ! :g <11
~; 0,20
• o \; :i' :r 11~"
0,15 v [>·
r '· 'N g I t.D ~ o.1o 1 . 2 I ~
• 0,05 I E § w
0,00
o
I
\ · . ·--·~-
20 40 60
Tempo (h)
' ! - Sim1 (Ads) ] ·~ Sim1 (Uwe) ' Sim2 (Ads) !
··Sim2{livre) I , Sim3 {Ads) i j -Sim3 {Livre) i
80 100
Figura 3. 5 - Concentração de enzima total adsorvida no sistema e concentração de enzima
livre no tanque de dessorção.
72 De acordo com os gráficos apresentados nas figuras 3 .3 e 3.4 pode-se notar que a
diminuição da vazão da alimentação no tanque 2, associada ao aumento da vazão de
reciclo, favorecem não só a retenção enzimática no sistema mas também o consumo de
substrato A figura 3.5 apresenta os perfis de enzima livre e adsorvida em cada um dos
tanques.
Observando o perfil de concentração de enzima livre no tanque de dessorção e de
enz1ma adsorvida no sistema (figura 3.5), tendo em vista a hipótese de dessorção
instantânea, pode-se considerar que toda a enzima contida no tanque de dessorção está livre
(não adsorvida). Observa-se, como já era esperado, uma diminuição gradual de enzima
livre no tanque de dessorção, bem como um aumento gradual de enzima adsorvida no
tanque de adsorção. A condição operacional ótima do sistema visa alto rendimento, fator
diretamente associado a uma elevada concentração de enzima livre no tanque de dessorção
e uma alta retenção enzimática, o que implica em uma menor concentração de enzima
adsorvida no tanque de adsorção, devido a concentração mais elevada no tanque de
dessorção.
A comparação entre os gráficos 3 .3, 3.4 e 3. 5 permite verificar que a melhor
condição operacional, dentre as três primeiras simulações com as condições operacionais
apresentadas na tabela 3 .2, é aquela referente a simulação de número 3. Com as condições
operacionais da simulação de número 3, obtemos uma alta retenção enzimática e alto
consumo de substrato. Voltando a análise do gráfico 3.5, observamos que as curvas
referentes a concentração de enzima livre no tanque de dessorção e de enzima adsorvida no
tanque de adsorção apresentam valores mais próximos entre si nas simulações 3 e 2, que o
obtido com simulação 1. Dessa forma, em uma primeira análise pode-se dizer que quanto
mais próximas estiverem as concentrações de enzima livre, no tanque de dessorção, e de
enzima adsorvida, no tanque de adsorção, melhor será o desempenho do sistema em estudo.
As simulações de número 4 e 5 visam a verificação da influência da fração líquida do
sistema nos perfis de concentração do mesmo. As figuras 3.6 e 3.7 apresentam os mesmos
gráficos comparativos apresentados nas figuras 3.3 e 3.4, incluindo a variação da fração
líquida do sistema.
A análise dos gráficos apresentados nas figuras 3.6 e 3.7leva a conclusão de que o
aumento da fração líquida do sistema provoca um aumento na perda enzimática, devido ao
aumento da quantidade de enzima livre nos tanques. Dessa forma, o consumo de substrato
73 no tanque de dessorção aumenta. Entretanto o aumento da perda enzimática pode
in viabilizar economicamente o uso do sistema, devido ao alto custo da mesma.
1,005..------------,
1,000
0.990
~ :::: 0.975
-Sim3
Sim4 i Sim5 i
o.9ss L-":===:;;:'--...--;;;~--;;~-;;;~-;;~ w • w 00 100
Tempo{h)
Figura 3.6 - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema
(reator duplo estágio).
3.4.2 Sistema triplo estágio
Tempo (h)
Figura 3. 7 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção (reator duplo estágio).
De forma semelhante ao estudo paramétrica realizado para o modelo duplo
estágio, foi realizado também um estudo paramétrica para o modelo triplo estágio. O
volume total de cada um dos tanques é novamente de 1000 litros. As condições iniciais para
o tanque de dessorção são as mesmas que as utilizadas no modelo duplo estágio. As
condições operacionais utilizadas para simular o modelo triplo estágio são apresentadas na
tabela 3.3.
Tabela 3.3- Condições Operacionais para o reator triplo estágio
I I ! Sim s FI (l/h) F2 (l/h) F3 (1/h) FR (1/h) Co(g/1) I
Sim6 0,5 80 100 o !50 0,3 ! !
Sim7 I 0,5 100 50 50 150 0,3
Sim8 I 0,5 I 100 100 o 180 0,3
Sim9 0,5 100 80 o 150 I 0,3
Sim10 0,5 I 100 80 o 250 ! 0,3
Sim li 0,5 I
100 70 o 250 I 0,3
Sim12 0,6 100 70 o 250 0,3 ----------·M·
74 Através de simulações com o modelo de reator triplo estágio, utilizando os dados
operacionais da tabela 3.3, foi possível determinar a influência de cada uma das vazões na
performance do mesmo, bem como comparar a performance do reator triplo estágio com o
modelo duplo estágio. Na simulação de número 7, a vazão de alimentação do segundo
estágio foi dividida entre os tanques 2 e 3 _ Os resultados das simulações efetuadas para o
modelo triplo estágio são apresentados nas figuras a seguir:
1.002;--------------,
1,(HI(l
0,99S
0,996
g 0,994
0.990
"'~ L'c~=~--:::----:';:--;';:--"-c::-l 60 80 100
Tempo (h)
Figura 3 _ 8 - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema
(reator triplo estágio).
,. r "·' .J t.r "'~ f "·"
~--------
Tempo (h)
-Sim61 Sim7 S1m8
""
Figura 3.9 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção (reator triplo estágio).
A análise dos gráficos apresentados nas figuras 3.8 e 3.9 permite a verificação da
influência das vazões de alimentação e refluxo, na performance do reator triplo estágio.
Quanto maior a vazão de alimentação do tanque 1, maior é a perda enzimática. Através das
curvas obtidas com simulações de números 7 e 8 verifica-se que o comportamento do
sistema triplo estágio é muito semelhante ao obtido com o sistema duplo estágio. Nota-se
pelo gráfico da figura 3.8 que a diminuição da vazão de alimentação do tanque 1 beneficia
a retenção enzimática do sistema, bem como a divisão da corrente de alimentação para os
tanques de adsorção (F2 e F3) em pouco influencia a performance do reator. Dessa forma,
em termos operacionais é mais interessante utilizar um valor nulo para a alimentação do
segundo estágio de adsorção, visto que esse procedimento implica em uma maior facilidade
de controle do processo além de representar economia em termos de bombas e tubulações.
Quanto menor a vazão de alimentação no estágio de dessorção, menor será a capacidade da
planta, visto ser menor a quantidade de substrato alimentada no sistema.
75 As simulações de números 9 e I O visam o estudo da influência da vazão de refluxo
e da concentração de substrato na performance do sistema. Para a simulação 9 foi utilizada
uma concentração de substrato 4 vezes maior que a utilizada na simulação 1 O, tendo sido
mantida a concentração inicial de enzima no sistema. O resultado das simulações 9 e 1 O são
apresentados nas figuras a seguir:
o
' t.ooo r
0.999
0.996
o 0.994
ti
0,$90
""' t ' -Sim9
Sim10 i
'"
'
'" '" .. '"" Tempo (h)
Figura 3.1 O - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema
(reator triplo estágio).
"" '" '" '""
Tempo (h)
Figura 3.11 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção (reator triplo estágio).
Verifica-se, através das curvas apresentadas na figura 3.11, que o consumo de
substrato na simulação de número 9 foi menor que o obtido na simulação 10. Já em relação
a vazão de refluxo, o gráfico da figura 3.1 O mostra que o aumento da mesma provoca uma
pequena elevação na quantidade de enzima retida no sistema. Comparando-se os gráficos
das figuras 3.3 e 3.10 nota-se que o sistema triplo estágio é menos sensível à vazão de
refluxo que o sistema duplo estágio.
As simulações de números 11 e 12 visam verificar a influência da fração líquida do sistema
no comportamento do reator triplo estágio.
1.000
0.99B
8 :::f ~ t ü :::t : -_:~~~:--s;~1~1~-:
Sim12! 0.986 t 0.986 '--~-,~, --.~, --.. ~~ .. c--"~,,,--l
Tempo (h)
Figura 3.12 - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema
(reator triplo estágio).
40 60
Tempo (h)
~~~,~----,1 '-Stm11i
Sim12
ao 100
76
Figura 3.13 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção (reator triplo estágio).
Novamente, verifica-se através dos gráficos das figuras 3.12 e 3.13 que o aumento
da porosidade do sistema (diminuição da quantidade de resina no sistema), eleva a perda
enzimática, entretanto em pouco afeta o consumo de substrato no tanque de dessorção.
3.4.3 Comparação entre os sistemas duplo e triplo estágio
Com a finalidade de se verificar a influência do volume dos tanques no
desempenho do sistema, as seguintes simulações foram realizadas:
Tabela 3.4- Condições operacionais para o sistema duplo estágio
i I I I i Sim i E F1(1/h) Fz(l/h) FR (1/h) Co (g/1) v1 (I) Vz(l)
Sim13 I I I
I 0,5 100 70 250 0,3 500 500
Sim141 0,5 100 70 250 0,3 500 1000 I I
Tabela 3.5- Condições operacionais para os sistema triplo estágio
Sim E F1(1/h) Fz(l/h) F3(1/h) FR(I/h) Co (g/1) VI (I) Vz(l) VJ(l) ! !
Sim15 · 0,5 100 70 I o ' 250 0,3 500 500 500 ! I
Sim16 0,5 100 70 o 250 I 0,3 500 500 1000
77 Os resultados obtidos com as simulações de 13 a 16, bem como a comparação entre
os modelos duplo e triplo estágio são apresentados nos gráficos a seguir:
1.000
V.9S5
'-Sim13
-Sim15
Tempo (h}
Figura 3.14 -Gráfico comparativo entre o
modelo duplo e triplo estágio (enzima
retida no sistema).
"''r--------------,
Tempo (h)
Figura 3.15 - Gráfico comparativo entre o
modelo duplo e triplo estágio (enzima
total adsorvida no sistema),
Através dos gráficos das figuras 3.14 e 3.15, verifica-se que a quantidade total de
enz1ma adsorvida no sistema triplo estágio é menor que a quantidade total de enzima
adsorvida no sistema duplo estágio. Já a quantidade de enzima retida no sistema para os
dois modelos são praticamente idênticas .. V ale ainda lembrar que a quantidade de enzima
retida no sistema engloba não somente a enzima adsorvida, mas também a enzima livre no
sistema. Entretanto, analisar somente a quantidade de enzima retida no sistema não é o
suficiente para atestar a superioridade do sistema triplo estágio em relação ao duplo estágio,
visto que o rendimento trata-se também de um fator importante do processo. Os gráficos a
seguir apresentam os perfis de concentração de enzima livre e de consumo de substrato no
tanque de dessorção para os sistemas duplo e triplo estágio:
o,;; r----------;===:::;'1 i-sim131 l-slm15
0,30
020
~ 0,15
0,10
0,05
O,OOL==========c.J m " m ~ 100
Tempo(h)
Figura 3, 16 -Perfil de concentração de
enzima livre no tanque de dessorção
(sistema duplo e triplo estágio).
~ 1./) 0.4
02
0,0
40 iill
Tempo {h)
i-Sim131 Sím15 !
'""
78
Figura 3.17- Perfil de consumo de
substrato no tanque de dessorção (sistema
duplo e triplo estágio).
Os gráficos apresentados na figuras 3 _ 16 e 3 _ 17 mostram que, apesar de apresentar
menor quantidade de enzima adsorvida, o sistema triplo estágio apresenta maior quantidade
de enzima livre no tanque de dessorção, o que acarreta maior consumo de substrato. Dessa,
forma, pode-se afirmar que o sistema triplo estágio é superior ao duplo estágio, não em
termos de retenção enzimática no sistema, mas em termos de consumo de substrato. O
sistema triplo estágio, referente a simulação 15, apresenta o dobro do volume destinado a
adsorção que o sistema duplo estágio referente a simulação 13 _ Dessa forma, poderia se
esperar que, dobrando o volume do tanque de adsorção no sistema duplo estágio fosse
obtido, para este último, o mesmo desempenho do obtido com sistema triplo estágio. Os
gráficos apresentados nas figuras 3, 18 e 3 _ 19 contradizem esta expectativa.
De acordo com os gráficos apresentados nas figuras 3, 18 e 3 _ 19, nota-se que a
quantidade de enzima retida no sistema diminui para o sistema duplo estágio, quando se
utiliza o mesmo volume para o estágio de adsorção do sistema triplo estágio. O mesmo
acontece com a quantidade de enzima adsorvida.
Figura 3.18
Tempo (h)
Sim141 ~Sím15 i
Gráfico comparativo
sistema duplo e triplo estágio (retenção
enzimática).
02•,----------
~ :;:rf =I .., 0.16
·~ Q,14
j i~1t " r ro- o.o4 r E f ~Sim14 ~ o.o:2 ~ Sim15
w 0.00 l-'-~-:::----c:-~".:-~:.;:::=~::J ..-..02 8 ~ ~ • 100
Tempo (h)
79
Figura 3.19- Gráfico comparativo sistema
duplo e triplo estágio (enzima total
adsorvida)
Os gráficos apresentados nas figuras 3.18 e 3.19 evidenciam que a quantidade de
enzima retida no sistema, bem como a quantidade de enzima adsorvida no sistema não
estão relacionadas apenas ao volume total do estágio de adsorção, mas também a
configuração do sistema. Os gráficos a seguir apresentam o perfil de enzima livre e o
consumo de substrato no estágio de dessorção:
0,35 r------------;::====;1 '-'"~' 'I ~s;mi4]
~~Sim1.:J
020
~ :::! 0,10
0,05
: """rL=;::===;==;::==.==:o-J
W • H W 1U
Tempo(h)
Figura 3 .20 - Perfil de concentração de
enzima livre no estágio de dessorção
(sistema duplo e triplo estágio).
f
., Tempo (h)
,~Sim14: i ---Sim15j
'""
Figura 3.21 - Perfil do consumo de
substrato (sistema duplo e triplo estágio).
Conforme pode ser visto nos gráficos das figuras 3.20 e 3.21, a quantidade de
enzima livre no sistema duplo estágio é bem menor que a quantidade de enzima livre no
80 sistema triplo estágio, chegando a níveis muito próximos de zero. Consequentemente o
consumo de substrato diminui. Os gráficos apresentados nas figuras de 3.18 a 3.21 mostram
que a adição de um estágio extra de adsorção no sistema aumenta o consumo de substrato,
ou seja aumenta o rendimento do processo. A simulação de número 16 visa a análise da
performance do sistema triplo estágio quando se aumenta o volume do segundo estágio de
adsorção. Os resultados são apresentados a seguir:
1.000
0,995
o ü 0.990
E 0,955
0.980
i-Sim15i f--Sim16 i
Tempo (h) '"'
Figura 3.22 - Gráfico comparativo do
sistema triplo estágio com volumes
diferentes para os estágios de adsorção.
0.25,--------------,
,-f ' '
Sím15; -Sim1ô
Tempo{h)
Figura 3.23 - Gráfico comparativo do
sistema triplo estágio com volumes
diferente para os estágios de adsorção.
Conforme os gráficos das figuras 3.22 e 3.23 o aumento de volume do segundo
estágio de adsorção diminui a quantidade de enzima retida no sistema. Os gráficos a seguir
apresentam o perfil de concentração de enzima livre e o consumo de substrato no estágio de
dessorção:
0.35[---------====l .. ~~~f I 0.30
~,. I
":I,.~··-~~~~ -~-~-~ w w s w 100
Tempo (h]
Figura 3.24 - Perfil de enzima livre no
estágio de dessorção para o reator triplo
estágio, com volumes diferentes para os
estágios de adsorção.
81
Sim16
"'
"' Qi líi 0.4
00 100
Tempo(h)
Figura 3.25 - Consumo de substrato no
estágio de dessorção para reator triplo
estágio, com volumes diferentes para o
estágio de adsorção.
Como pode ser visto na figura 3.24 o perfil de enztma livre no estágio de
dessorção é ligeiramente maior quando se utiliza um volume maior para o segundo estágio
de adsorção. Consequentemente, o consumo de substrato será também ligeiramente maior,
visto que a reação enzimática ocorre no estágio de dessorção.
3.4.4 - Estudo da influência das concentrações de substrato na corrente de
alimentação e da concentração inicial de enzima no tanque de dessorção utilizando o
modelo duplo estágio
A partir da simulação de número três (tabela 3 .2), a que apresentou os melhores
resultados para o sistema duplo estágio, foram estudadas a influência da concentração de
substrato na corrente de alimentação e a concentração inicial de enzima no tanque de
dessorção. As vazões de alimentação, fração líquida e volume do sistema permanecem
inalterados em relação a simulação de número 3. Os valores de concentração inicial de
sacarose no tanque de dessorção permanecem idênticos às concentrações da corrente de
alimentação. A tabela 3.6 apresenta os valores de concentração inicial de enzima e subtrato
para o sistema duplo estágio.
82 Tabela 3.6- Concentrações iniciais (modelo duplo estágio)
Sim I So (gj!) Co (gj!)
Siml7 I 10 0,3 '
Sim18 I 50 0,3
Sim19 75 0,3
Sim20 25 I 0,10
Sim21 I 25 I 0,25
Sim22 25 0,50
Sim23 I 25 0,75
O gráfico da retenção enzimática obtido com as simulações de 17 a 19 corresponde
àquele apresentado na figura 3 .3, mais precisamente à curva obtida com a simulação de
número 3. Este gráfico não é apresentado, pois as curvas obtidas para as simulações de 17 a
19 são coincidentes à curva obtida para a simulação 3, já que não foram alteradas as vazões
e a concentração inicial de enzima. Os resultados obtidos com as simulações de 17 a 23 são
apresentados a seguir:
0.0
0.0
~ "f 0.2 r
~~---Sim17
Sim18 i
Sim19 1
-' --------'
o.oLt ~~·~~~··-==~~··~···--::::_-=~ m ~ oo oo 100
Tempo (h)
Figura 3 .26- Gráfico comparativo do
consumo de substrato (reator duplo
estágio).
Tempo(h)
~=----Sim20 j
' Sim21
Sim22
Sim23
Figura 3.27 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato (reator duplo
estágio).
!.002
LOOO
0.998
0.996
0.994
o 0.992 ü ;o 0.900 ü
0.989 --Sim20 0.986 --Sim21
0.964 Sim22
0.982 --Sim23
0.900
'" " " Tempo (h)
Figura 3.28 - Gráfico comparativo da
quantidade total de enzima retida no
sistema.
0.000 ' 0.0004
--Sim20
0.000 ' ---Sim21
Sim22
Sím23
0.000 ' r / r f 0.0000
'"' Tempo {h)
Figura 3.30 - Gráfico comparativo da
concentração de enzima livre no tanque
de adsorção.
0.0
,_,
Tempo (h)
-Sim20
--Sim2i
Sim22 Sim23
83
Figura 3.29 - Perfil da concentração de
enzima livre no tanque de dessorção
(reator duplo estágio).
''" ~ -------···
~ 0,45
~ OAO F j ~Sim20 l
-I -~----Sim2i i o c 0,00 Sim22: • " 020 i -- Sim23l
~ ~
020 .. 0.15
2 0.10 l
~ 0.05'
'ª 0,00 w -0,05
'"' Tempo(h)
Figura 3.31 - Gráfico comparativo da
quantidade total de enzima adsorvida no
sistema.
"'""" t
~ :::::f ifMOOJ
~Simzo
·-Sim21 Sim22 Sim23!
.... ~f ~~---------~ 0.00000 r
L-7---~,~.~~ .. ~~~.,----.~.~~,~.~ Tempo (h)
Figura 3.32- Gráfico comparativo da
quantidade de enzima adsorvida no
tanque de dessorção.
uf 10
i ~Sim20 1
i~Sim21l I Sim22! ! ----- Sim23 I
1'~----------
~~-----
Tempo (h)
Figura 3.34 - Gráfico comparativo da
concentração de substrato no tanque de
adsorção.
0.50
0,45
0.40
0,:15
0,30 -;;; :!! 0.25
0.10
0,05
0,00
Figura ~ ~~
J . .).J
quantidade
"
de
" ôO
Tempo (h)
Gráfico
enzima
tanque de adsorção.
~Sim20
Sim21
Sím22 Sim23
'" '"
comparativo
adsorvida
r\ i \ i \'--~~~--====:;-
'"" Tempo (h)
84
da
no
Figura 3.35 - Gráfico comparativo da
concentração de substrato no tanque de
adsorção.
Conforme pode ser observado pela figura 3.26, o aumento da concentração de
substrato, na corrente de alimentação, diminui levemente o consumo de substrato. Já o
aumento da concentração de enzima, para uma mesma concentração de substrato na
corrente de alimentação, aumenta o consumo de substrato e diminui a perda de substrato
não convertido, conforme pode ser observado nos gráficos das figura 3.27 e 3.35. Este
comportamento é atribuído a uma maior quantidade de enzima livre no tanque de
dessorção, como pode ser visto na figura 3.29. Já a figura 3.30 mostra que a quantidade de
85 enzima livre no tanque de adsorção também aumenta. Entretanto não se pode concluir que
esse aumento implique em uma perda enzimática significativa, visto que para as curvas
apresentadas no gráfico 3.28 são coincidentes e a quantidade de enzima livre no tanque de
adsorção é muito pequena, conforme pode ser observado na figura 3 .30.
Observa-se ainda a ocorrência de um ligeiro aumento na quantidade de enzima
adsorvida no tanque de dessorção (figura 3.32). Já o aumento na quantidade de enzima
adsorvida no estágio de adsorção é bem mais significativo (figura 3.33), o que evidência
que o aumento da concentração inicial de enzima não afeta muito a perda enzimática.
De acordo com os resultados apresentados nas figuras de 3.26 a 3.35, o aumento da
quantidade de substrato na corrente de alimentação deve ser realizado paralelamente com o
aumento da concentração inicial de enzima livre, para que não haja perda de matéria prima
não consumida. Já o aumento da concentração de enzima livre aumenta o consumo de
substrato. Os resultados apresentados nas figuras 3.29 e 3.35 mostram claramente que, para
uma dada condição operacional ótima em termos de vazões de alimentação, existe uma
concentração ótima de substrato na corrente de alimentação e uma concentração inicial
ótima de enzima livre no sistema, para que seja obtido um alto consumo de substrato. A
otimização do sistema, baseada na quantidade de dextrana produzida desejada, leva a
determinação destes valores.
3.4.5 - Estudo da influência da concentrações de substrato na corrente de
alimentação e da concentração inicial de enzima no tanque de dessorção
utilizando o modelo triplo estágio:
Analogamente ao estudo realizado para o modelo duplo estágio, foi realizado um
estudo para verificar a influência da concentração inicial de sacarose e enzima livre no
comportamento do modelo triplo estágio. Neste estudo, as vazões de alimentação, fração
líquida do sistema e volume dos tanques são idênticas às utilizadas na simulação de número
11, a que apresentou melhor desempenho para o modelo triplo estágio. Novamente, a
concentração inicial de substrato é idêntica à concentração da corrente de alimentação. Os
86 valores das concentrações iniciais de enzima (Co) e de substrato (So) são apresentados na
tabela 3.7:
Tabela 3.7- Concentrações iniciais (modelo triplo estágio)
. Sim
I Sim24 ',
I Sim25 I Sim26 I I
I Sim27
Sim28
I ' Sim29
Sim30
'·'
~ U) 0,4
'·' 0.0
40 60
Tempo (h)
I
---- Sim24
Sim25 Sim26
Figura 3.36 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato (modelo triplo
estágio).
.. :c-So (g/1) Co (g/1)
10
50
75
25
25
25
25
1,000
0,995
o ~ ~
0,990
o,sas
I
I I
------- Sim27
Sim28 Sim29 Sim30
0,3
0,3
0,3
O, 10
0,25
0,50
0,75
" ~ Tempo(h)
'"'
Figura 3.37 - Gráfico comparativo da
quantidade total de enzima retida no
sistema (modelo triplo estágio).
I I
O,Oc----------------,
'-Sim27!
I' -Sim28 i
Sim29; i Sím30 :
Figura 3 3 8 - Perfil da quantidade total de
enzima adsorvida no sistema (modelo
triplo estágio),
O.Ol.lOJOL--------r:===::;-i 1"=-sim27'
0,00()25
0,00020
~ oooo" f o 0.00010
0,00005
O,OOOOl.l
! --~Sim28 i Sim29 i Sim30
11
í ~~----~----~--------
r--~~-~-
Tempo (h}
Figura 3 AO - Perfil da concentração de
enzima livre no primeiro tanque de
adsorção (modelo triplo estágio),
Tempo (h)
-Sim27 -Sim28
Sim29 ---·Sim30
87
Figura 3,39 - Perfil da concentração de
enzima livre no tanque de dessorção
(modelo triplo estágio),
0,00040,--------------,
::::::: I'
0,00025
0,00010
0.00005
0.00000
-Sim27; --Sím28'
í,, _ Sim29 j ---- Sim30 1 ~ :::::1
-n.oooos '---~---::,,---~~~-~:':6~--:':.,~-,:':00-----J Tempo (h)
Figura 3 A 1 - Perfil da concentração de
enzima livre no segundo tanque de
adsorção (modelo triplo estágio),
:~~;:I 0,00008
0,00007
0,000~
~ 0,00005 f-
0,00002
0,00001
0,00000
--Sim27 -~sim28
Sim29 ----- Sim30
~ :::: ~~
-o.cXloo1 L-:-~-:,:;:"~-~'"-~-;.,;-~-;,:;;-"~-,;;;.,;--" Tempo (h)
Figura 3.42 - Perfil da concentração de
enzima adsorvida no tanque de dessorção
(modelo triplo estágio)
0.3$
0,30
020
~ 0,20 l
~ 0.15~ cf' iUOt
0,05
0,00
! --Sim27! i --Sim281 ' . ' i Sim29 j
i ------- Sim30 I
-----~··--
Tempo (h)
Figura 3.44 - Perfil de enzima adsorvida
no segundo tanque de adsorção (modelo
triplo estágio).
:::::r-0,00007 f ' 0.00000
~ 0.00005
~ o.ooow
r§ 0,00003
0.000(12
i -·Sim27 i ; -Sim28 i : Sím291
- ------Sim30
0.00001 ;_~·---~-------
0.00000
Tempo (h)
88
Figura 3.43 - Gráfico comparativo da
concentração. de enzima adsorvida no
primeiro tanque de adsorção (modelo
triplo estágio).
:9 uf 10
i
' ' ~--Sim27 i
I
--Sim28 I Sim29!
-- Sim30 f
:v--···-·--------~
"" Tempo (h)
Figura 3.45 - Perfil da concentração de
substrato no estágio de dessorção (modelo
triplo estágio).
-Sim27 -Sim28
Sim29 ----Sim30
Figura 3 .46 - Perfil da concentração de
substrato no primeiro estágio de adsorção
(modelo triplo estágio).
89
-Sim27 --Sim28
Sim29
r 1--- ------------~--~---- ------------'
Tempo (h}
Figura 3 .4 7 - Perfil da concentração de
substrato no segundo estágio de adsorção
(modelo triplo estágio).
As figuras de 3.36 a 3.47 apresentam os resultados das simulações da tabela 3.7. O
gráfico apresentado na figura 3.36 apresenta comportamento semelhante ao apresentado na
figura 3.26 para o modelo duplo estágio. Novamente, a elevação da concentração de
substrato, mantendo-se a concentração enzimática, resulta em uma diminuição do consumo
de substrato no sistema. Em relação ao estudo da concentração de enzima, observa-se
novamente concordância com o modelo duplo estágio, visto as curvas que descrevem o
perfil da quantidade de enzima retida no sistema serem coincidentes (figura 3.37) também
para o modelo triplo estágio.
Observa-se através do gráfico apresentado nas figuras 3.38 e 3.39, que quanto maior
a quantidade inicial de enzima no sistema, maior é a quantidade de enzima adsorvida e livre
no sistema. Novamente, pode-se dizer que a elevação da concentração de enzima livre nos
tanques de dessorção não influenciam, de forma significativa, a perda enzimática do
sistema, devido ao fato de haver resina em quantidade suficiente para adsorver a enzima.
O consumo de substrato é maior com o aumento da concentração inicial de
enzima, como pode ser visto nos gráficos de 3.45 a 3.47. De acordo com os resultados
apresentados nas figuras de 3.38 a 3.47, a elevação da concentração de substrato não
acompanhada de uma elevação da concentração inicial de enzima, aumenta a quantidade de
substrato não consumido no processo.
90 Apesar de apresentar perfis semelhantes, nota-se através dos gráficos obtidos com
o modelo duplo e triplo estágios, que há uma pequena diferença nos valores obtidos para
cada um dos sistemas, embora tenham sido utilizadas as mesmas condições operacionais
para ambas as simulações_ A fim de verificar a amplitude dessa diferença, os resultados
obtidos com cada um dos modelos são comparados a seguir:
1.002~------------~
1.000
0.998
o,9S6
0,994
8 0,992
~ u 0.990
c o.ssa r
c o.sae
0,984
'~Sim23! i -·-- Sím30 i
Tempo (h)
Figura 3A8 - Gráfico comparativo da
retenção enzimática no sistema (modelos
duplo e triplo estágio)_
,_,
~ ::tl
(f} 0,4
r 0,2 ~
; -Sim23 i ' . ' i ~-~ Sim30 i
'-'L[ ~---~-~-~~~-~~__,__] 40 eo so 100
Tempo (h)
Figura 3_50 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato (modelos duplo e
triplo estágio)
M
'-' ro E
~ ,_,
g ,_, I ro ~
< ~ 0.2 ' ' ' o ' E '' ~ w
M
~-
I
" " "' Tempo (h)
-Sim23' -Sim30
Figura 3 A9 - Gráfico comparativo da
quantidade total de enzima retida no
sistema (modelo duplo e triplo estágio)
'-" ,_,
f
'-Sim23]
l_~ .. r ' ' ' ' '2 0,5
\ "' ü-M l
\ ,_, \
,_, ao 1oo
Tempo (h)
Figura 3 51 - Gráfico comparativo da
concentração de enzima livre (modelos
duplo e triplo estágio),
De acordo com os resultados apresentados na figura 3_50, o desempenho dos
sistemas estudados, em termos de consumo de substrato são praticamente idênticos para
91 ambos os sistemas. As figuras 3.48 e 3.49 evidenciam a superioridade do modelo triplo,
estágio no tocante a retenção enzimática. Embora a quantidade de enzima livre no estágio
de dessorção seja menor para o modelo triplo estágio (figura 3.51), isso não prejudica o
consumo de substrato.
92
4.1- Introdução
Além do processo CARE, a adsorção de macromoléculas em leitos fluidizados e
tanques agitados também tem sido alvo de estudos para o desenvolvimento de novos
processos de purificação e separação de bioprodutos. Hortsmann e Chase (1989)
apresentam um modelo para cinética de adsorção de proteínas, englobando a resistência a
transferência de massa no filme líquido e a difusão no interior dos poros. O modelo
apresentado é altamente concordante com resultados experimentais. Araújo (1996) aplicou
este modelo para adsorção de albumina de soro bovino em resinas de troca iônica, em leito
fluidizado e em tanque agitado, tendo sido obtidos bons resultados.
A modelagem proposta por Souza (1993) não considera as resistências à
transferência de massa e a difusão no interior do sólido. Entretanto estas resistências podem
influenciar bastante o comportamento do sistema. Com base nos estudos de Hortsmann e
Chase (1989) e de Araújo (1996), foram propostos dois outros modelos envolvendo em
primeira instância a resistência de transferência de massa no filme líquido, sendo
posteriormente inserida a difusão no interior dos poros.
4.2 - Desenvolvimento do Modelo de Adsorção
O modelo de adsorção considerando a resistência à transferência de massa no filme
líquido e a difusão no interior do sólido proposto por Horstmann e Chase (1989) é baseado
nas seguintes suposições:
• O adsorvente é feito de material poroso, onde o soluto deve se difundir no interior dos
poros, com base na Difusividade Efetiva (Der), a qual é considerada independente da
concentração.
93 • A transferência de massa para a superficie do adsorvente é limitada pela resistência a
transferência de massa no filme líquido, a qual é caracterizada pela resistência de
película (kr)
• A reação de adsorção na superficie do adsorvente é descrita por uma reação irreversível
de segunda ordem, sendo a mesma isotérmica e com equilíbrio representado pelo
modelo de Langmuir
• As partículas de adsorvente são esféricas e de tamanho uniforme
Conforme estas hipóteses, é apresentado o balanço de massa proposto por Hortsmann e
Chase (1989):
4.2.1 -Balanço de massa sobre a partícula sólida
Difusão do soluto no interior dos poros do adsorvente
(4.1)
As condições iniciais são:
t=O; C,=O
As condições de contorno são:
a::'. r= O; - 1 =O (no centro da partícula ) (4.2) a-
94
(4.3)
De acordo com a equação (4.3), a transferência de massa no filme líquido depende
não somente da concentração de enzima livre na fase líquida (Cb), mas também da
concentração de enzima no interior dos poros do adsorvente, sendo esta dada por c,J r-R
4.2.2- Cinética de adsorção sobre a superfície do adsorvente
(4.4)
Considerando o equilíbrio entre a enzima livre e adsorvida no interior dos poros, e sendo a
cinética de adsorção representada pelo modelo de Langmuir tem-se:
Equação de Langmuir:
Onde:
&j· Podemos expressar - 1 como:
éJt
Kd=k2 kj
(4.5)
(46)
(4.7)
95
Onde:
(4 8)
Substituindo na equação (4.7) temos:
t3qi qmKd t"X:i -= ôt (Kd+Cii ôt
(4.9)
Substituindo a equação (4.9) na equação (4.1) temos:
(4.10)
A equação (4.10) pode ser rescrita da seguinte forma:
(4.11)
Onde:
(4.12)
Adimensionalizando as variáveis te r na equação (4.11), temos:
Onde:
r ex=-
R
Adimensionalizando-se também as variáveis t e r na condição inicial temos:
r=O;C,=O
Onde:
éC· x=0·-1 =0
'&
4. 2.3 - Balanço de massa na fase líquida para tanque agitado
A condição inicial para a equação ( 4 .15) é:
t =o; Cb =Co
96
(4.13)
(4.14)
(4.15)
97 Adimensionalizando-se as variáveis r e t na equação ( 4.15), tem-se
(4.16)
As condições iniciais para equação (4.16) são:
r= O; Cb =Co
A difusão no interior dos poros de um sólido poroso, seja uma resina ou catalisador,
depende de vários fatores dentre eles, o tamanho da enzima e o diâmetro médio dos poros.
Sendo assim para o sistema em estudo será considerada primeiramente a resistência à
transferência de massa no filme liquido, sendo posteriormente adicionada ao modelo a
difusão no interior dos poros, como já mencionado anteriormente. A resina utilizada no
sistema em estudo é a DEAE-Celulose. Trata-se de uma resina de troca iônica de
porosidade mediana.
4.3 - Modelagem do Sistema Duplo Estágio, incluindo a resistência à
transferência de massa no filme liquido.
Não sendo considerada a difusão no interior dos poros, a força motriz na equação
(4.15), representada pelo termo (Cb-CíJir=R, foi substituída pelo termo
Cb- 1 , visto que pela equação de Langmuir temos: Cí = 1
. Souza (
q-Kd J q-Kd ( qm- qí) ( qm- q;)
(1993) determinou experimentalmente a isoterma de adsorção da dextranasacarase em
DEAE-Celulose. Em seu trabalho a dessorção da enzima foi considerada instantânea.
Sendo assim, a resistência à transferência de massa na fase líquida foi considerada somente
no estágio de adsorção.
98 4.3.1- Balanço de massa para o tanque I (dessorção)
dCJ FRC2s ---dt VJ
(4.17)
(4.18)
dSJ = F1So + FRS2s FRSJs FJSJ _ KCJSJ
dt VJ VJ VJ VJ Km +SJ (4 19)
4.3.2- Balanço de massa para o tanque 2 (adsorção)
(4.20)
(4.21)
dS2 = FRSJs + FJSJ _ FRS2s (FJ +F2JS2 KC2S2
dt V2 V2 v2 V2 Km +S2 (4.22)
99 4.4 - Modelagem do Sistema Duplo Estágio, incluindo a resistência à
transferência de massa no filme líquido e difusão nos poros.
Nesta modelagem, a equação (4.15) é mantida como apresentada, pois estamos
considerando a difusão no interior do sólido. Sendo assim, além da equação (4.15) foi
inserida no modelo a equação ( 4.1 0), que representa a variação de C i no tempo para todos
os raios. Novamente, devido ao fato da reação de dessorção ser instantânea, a resistência à
transferência de massa na fase líquida bem como a difusão no interior da resina foram
consideradas somente no estágio de adsorção.
4.4.1- Balanço de massa para o tanque 1 (dessorção)
(4.23)
_dq_I = _F R!.-'..q"-"2:._8
dt VJ (4.24)
(4.25)
4.4.2- Balanço de massa para o tanque 2 (adsorção)
(4.26)
100
(4.27)
(4.28)
(429)
4.5 - Resultados
O modelo apresentado no item 4.3 foi resolvido numericamente através do método
de Runge Kutta 4• ordem. Já o modelo apresentado no item 4.4 foi resolvido utilizando o
método de colocação ortogonal para a equação 4.28 e o método de Runge Kutta 4• ordem
para as equações diferenciais ordinárias.
O método de colocação ortogonal é um método de resíduos ponderados, onde um
polinômio interpolador é utilizado para representar a função em pontos discretos (pontos de
colocação). Neste trabalho o polinômio foi utilizado o polinômio de Lagrange e dois pontos
internos de colocação, quantidade que se mostrou suficientemente precisa.
Os valores de temperatura e pH são àqueles apresentados na tabela 3.3. Já os valores
das constantes kfe Def foram obtidos através do ajuste do perftl experimental obtido por
Souza (1993) ao modelo de adsorção proposto por Hortmann e Chase (1989). Estes valores
são 3, 14 x 10-2 m/ h e 1, 88 x 10-5 m2 I h respectivamente. Para este ajuste, apresentado no
apêndice 2, foram consideradas as propriedades da água para representar a solução tampão,
pois não foram encontrados, em nenhuma referência, os valores de viscosidade e densidade
da solução utilizada por Souza (1993) para obter a curva de adsorção da dextrana-sacarase
em DEAE-Celulose.
Outro parâmetro não encontrado foi a porosidade da resina, que normalmente é
determinada experimentalmente. Neste caso, a única informação disponível era a
101 classificação da resina como sendo de porosidade mediana, segundo o fabricante (Sigma).
Dessa forma, foi utilizado o valor de 0.75 para porosidade da resina. Já o raio da partícula
(R = 1.25x 10-4 m) foi encontrado no trabalho de Souza (1993), o qual apresenta uma
análise granulométrica da resina. Apesar destas aproximações, os resultados obtidos através
de simulações com os modelos que incluem a resistência à transferência de massa e difusão
intraparticular permitem verificar, qualitativamente, o comportamento do sistema.
A simulação de número 3 para o modelo duplo estágio (Capítulo 3) foi novamente
realizada, utilizando agora o modelo apresentado no item 4. 3, onde somente a resistência à
transferência de massa na fase líquida é considerada. Os gráficos a seguir apresentam os
resultados obtidos:
I LOOO'
o o ;:: 0.9SO o
0.9S5
Tempo (h)
Figura 4.1 - Quantidade de enzima retida
no sistema (reator duplo estágio
considerando a transferência de massa na
fase líquida no estágio de adsorção ).
I t.O r 00 ~
f o Q_SI IJl r
''
i -Sím3m i ' ~----~- Sim3
ii ,_,I'
00
L-~~~w~~~~~~oo~~~oo~~,~,~
Tempo (h)
Figura 4.2 - Consumo de substrato no
estágio de dessorção (reator duplo estágio
considerando a resistência à transferência
de massa no estágio de adsorção ).
O índice m na legenda dos gráficos indica que o modelo utilizado considera a
resistência à transferência de massa no filme líquido. Conforme pode ser observado nas
figuras 4.1 e 4.2, quando a resistência à transferência de massa é levada em consideração a
perda enzimática é ligeiramente superior à obtida quando esta transferência não é levada
em consideração. Isso se deve a uma menor quantidade de enzima adsorvida, devido à
difusão da mesma ser dificultada pela resistência de película no filme líquido. Quanto ao
consumo de substrato, não se verifica nenhuma alteração, pois a quantidade de enzima livre
no sistema é suficiente para consumir o substrato alimentado. V ale ressaltar que a curva
!02 obtida para ambos os modelos não apresenta alterações, em ambos os casos a perda
enzimática é linear no intervalo de tempo estudado.
Figura 4.3
sistema
Tempo {h)
Enzima total retida no
(reator duplo estágio
considerando a resistência à transferência
de massa na fase liquida e difusão no
interior da resina).
-Sim3'
,_,
\00
Tempo (h)
Figura 4.4 - Consumo de substrato no
estágio de dessorção (reator duplo estágio
considerando a resistência à transferência
de massa na fase líquida e difusão no
interior da resina).
Utilizando o modelo apresentado no ítem 4.4, onde são levadas em consideração
tanto a resistência à transferência de massa na fase líquida como a difusão no interior da
partícula, a simulação de número 3 para o reator duplo estágio foi novamente repetida. Os
resultados são apresentados nas figuras 4.3 e 4.4.
Conforme pode ser observado na figura 4.3, a curva obtida utilizando-se o modelo
de adsorção proposto por Hortsmann e Chase (1989) é bastante diferente da obtida através
do modelo original para o reator duplo estágio proposto por Souza (1993). Nota-se, através
do gráfico apresentado na figura 4.3, que a queda da quantidade total de enzima retida no
sistema é menor no início, tornando-se mais acentuada com o passar do tempo. O valor
final obtido também é menor que o obtido para o modelo original (figura 3 3) sob as
mesmas condições operacionais Já para o consumo de substrato, o perfil se mantém igual
ao obtido para o modelo original.
A diferença entre os perfis obtidos para a perda enzimática no sistema quando as
resistências à transferencia de massa são levadas ou não em consideração, se deve a
!03 alteração da cinética de adsorção, que pode inclusive ter o tempo de necessário para se
atingir o equilíbrio alterado em função dos parãmetros kre Der(apêndice 2).
A seguir é apresentado o gráfico com os perfis de enzima livre no estágio de
dessorção e enzima total adsorvida no sistema para a simulação de número 3 utilizando o
modelo apresentado no item 4.4:
~~~ o_so ~L----------=======1 " l -- Sim3 (Ads)
:§ ~ o.zs ~·--~ Sim3 (Livre) .9 • . "' ~ ~ 0.20 o o 1/J ·a. ~ 1!:1 0.15 . ~ E • .N g 0.10
tD (l! :f;
• 0.05
·~ o_oo UJ
o 20 40 60 80 100
Tempo (h)
Figura 4.5- Concentração total de enzima adsorvida e enzima livre no tanque de dessorção.
Modelo duplo estágio considerando a resistência à transferência de massa e difusão da
enzima no interior da resina.
Observa-se que o gráfico da figura 4.5 é semelhante àquele apresentado na figura
3.5 (as curvas representadas em ambos os gráficos possuem o mesmo tipo de perfil).
Entretanto, os valores obtidos quando são consideradas as resistências á transferência são
diferentes daqueles obtidos para o modelo originaL Nota-se também que as curvas
referentes a enzima total adsorvida no sistema e enzima livre se encontram mais próximas
no gráfico da figura 4. 5.
Apesar das constantes utilizadas nos modelos apresentados nos itens 4.3 e 4.4 serem
aproximações, a utilização destes modelos permite estimar o comportamento do sistema
quando se leva em consideração a resistência à transferência de massa no filme líquido e a
difusão da enzima no interior da resina adsorvente.
Os gráficos apresentados nas figuras de 4.1 a 4.4 mostram que a inclusão de
resistências à transferência de massa na modelagem do sistema altera não só os valores
104 relativos a retenção enzimática, mas também o perfil da quantidade de enzima retida no
sistema.
Sendo o reciclo de enzima um fator econômico limitante para a viabilidade do
processo, faz-se necessário um estudo experimental da adsorção da enzima que leve em
consideração não somente as resistências à transferencia de massa, mas também a presença
de dextrana no meio. Esta consideração é importante devido ao fato de a dextrana ser um
polissacarídeo, cujos efeitos da viscosidade de suas soluções podem interferir nos
fenômenos de transferência de massa.
105
5.1 - Introdução
Os modelos apresentados no Capítulo 3 não consideram a influência dos tampões de
adsorção e dessorção no comportamento do sistema. O reator estudado considera a
adsorção e dessorção da enzima mediante a alimentação de tampões apropriados nos
respectivos estágios de adsorção e dessorção.
Segundo Curralero et al. (1998), a dessorção da enzima é promovida mediante a
adição de tampão de NaC1 no estágio de dessorção. A adsorção seria promovida mediante a
diminuição da concentração de NaCI no estágio de adsorção, através da diluição com água
pura (tampão de adsorção).
O estudo de Curralero et al. ( 1998) implica na determinação experimental das
isotermas de adsorção da dextrana-sacarase em DEAE-Celulose variando-se as
concentrações salina do meio de O M a 0,50 M. Foi verificada que a presença de NaCl
pouco interfere na constante k1 mas tem grande influência nos valores de qm e kz
(constantes da equação de Langrnuir), sendo válidas as seguintes equações para o cálculo
de qm e kz em função da concentração salina:
qm = 18,7 exp( -JJ,78[NaCl 1 2 +3,30[ NaCl 1 +5,02) (5.1)
k =2,52+ 6,18[NaCl1 (5.2) 2 0,122+[NaCl1
Em seu trabalho, Souza (1993) apresenta dados experimentais para a adsorção de
dextrana-sacarase em DEAE-Celulose utilizando como tampão uma solução de acetado
0,2mM. Já o trabalho de Curralero et al. (1998) considera a adsorção da enzima na resina
106 na presença de NaCl. Sendo assim, existem duas condições experimentais diferentes, o que
leva a obtenção de valores diferentes para as constantes da equação de Langmuir, conforme
pode ser visto na tabela 5.1:
Tabela 5.1 - Constantes da equação de Langmuir
Souza (1993) 7,11 3,54 519,751
Curralero et a!. ( 1998) 2,22 3,84 2830
ausência de
Curralero et al. (1998) 2,22 5,00 3570
OM
Curralero et al. (1998) 2,22 7,55 3090
= M
Curralero et al.(l998) 2,22 8,33 810 I M
5.2 - Modelagem matemática para o reator triplo estágio considerando
balanço de NaCI
As mesmas hipóteses consideradas para o modelo descrito no Capítulo 3 são aqui
consideradas, exceto que os valores de k2 e qm são dados em função da concentração de
NaCl em cada um dos tanques (equações 5.1 e 5.2). A dessorção é novamente considerada
instantânea (k3 = 1000 h"1). A alimentação de NaCl (tampão de dessorção) é realizada
através da corrente de alimentação do primeiro estágio (F t). Dada a superioridade do reator
triplo estágio, o balanço de sal foi considerado somente para este sistema. As equações do
modelo são apresentadas a seguir:
5.2.1- Balanço de massa para o tanque 1 (dessorção)
dCJ
dt
dqJ = FRq3e FMJ8 FJql -k3
q1
dt VJ VJ VJ
5.2.2- Balanço de massa para a o tanque 2 (adsorção)
107
(5.3)
(5.4)
(5.5)
(5.6)
FRC2e +(I-e) [k2q2 -kJC2(qm -q2)] v2 e
(5.7)
dS2 =FRSJe+FJSJ_FRS2e (FJ+F2)S2 KC2S2 (5.9) dt v2 v2 v2 V2 Km +S2
108
(5.10)
5.2.3- Balanço de massa para o tanque 3 (adsorção)
(5.12)
(FJ+F2 +F3)S3 KC3S3
V3 Km +S3 (5.13)
(5.14)
5.3 - Resultados e Discussões
De acordo com as equações 5.1 e 5.2, os valores de qm e k2 não variam muito para
concentrações acima de 0,50 M. Foi realizado um estudo preliminar do desempenho do
sistema triplo estágio considerando os valores de qm e kz constantes e correspondentes aos
valores referentes á concentração salina de 0,50 M. Neste estudo, foi repetida a simulação
de número11, apresentada no Capítulo 3, sendo utilizados os valores para os parâmetros k~,
k2 e qm obtidos por Curralero et al. (1998) (apresentados na tabela 5.1 para a [NaCl] = 0,5
M). Para este estudo foi utilizado o modelo sem o balanço de sal apresentado no Capítulo 3.
109 Os resultados foram então comparados com os resultados obtidos para o sistema que usa os
dados experimentais de Souza (1993). As condições operacionais são apresentadas na
tabela 5.2 :
Tabela 5.2 - Condições operacionais para o sistema triplo estágio considerando os dados
experimentais de Souza (1993) e Curralero et a1.(1998).
Sim .
•• . FI (1/h) F2 (1/h) F3 (llh) '.· FR(IIh) So (g/1) Co (g/1) .· s
Sim31 * 0,5 100 70 o 250 25 0,3
Sim32** 0,5 100 70 o 250 25 0,3 '
*Dados experimentais de Souza (1993)
**Dados e'qxrimentais de Curralero et ai. (1998)
Os resultados obtidos com as simulações da tabela 5.3 são apresentados a seguir:
1.00
0.98
0.97
Tempo (h)
Figura 5.1 - Gráfico comparativo da
retenção enzimática.
0.0
'"" Tempo (h)
Figura 5.2 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no estágio de
dessorção.
De acordo com os gráficos apresentados nas figuras 5.1 e 5.2, a presença de sal no
sistema prejudica a retenção enzimática, mas não influencia o consumo de substrato. Os
resultados apresentados nos gráficos das figuras 5.1 e 5.2 correspondem a condições
drásticas onde a concentração salina seria constante de igual a 0,5M, nos três tanques.
Para promover a dessorção da enzima é necessária uma concentração mínima de sal
em tomo de 0,50 M. Entretanto a enzima sofre desativação na presença de NaCI, sendo que
quanto maior a concentração salina maior é a desativação da enzima (Souza, 1993). Dessa
forma, é necessário um ajuste de vazões com a finalidade de se obter baixas concentrações
110 salinas nos tanques de adsorção, bem como evitar concentrações muito superiores a 0,5 M
no tanque de dessorção. Com isso, pode-se aumentar a quantidade de enzima adsorvida nos
estágios de adsorção, melhorando assim o desempenho do sistema, quando se utilizam os
dados experimentais de Curralero et al. (1998).
F oi então realizado um ajuste da vazões de alimentação em cada um dos tanques
para obtenção dos perfis salinos desejados. Novamente, o volume total (sólidos+ líquido)
dos tanques foi considerado constante, assumindo o valor de I 000 litros. A fração líquida
do sistema foi considerada constante e igual a 0.5, visto ser o valor que apresentou melhor
desempenho para o sistema. A tabela 5.3 apresenta as condições operacionais utilizadas
para o ajuste de vazões do sistema triplo estágio, considerado a presença de solução salina
no sistema:
Tabela 5.3 - Condições operacionais para determinação do perfil de NaCI (sistema triplo
estágio)
I
Sim F1 (1/h) Fz (1/h) F3 (1/h) FR(llh) E1o(moll) Eo (moi/!)
Sal! 100 70 o 250 I 0,50 0,50 '
Sal2 100 100 o 250 I 0,50 0,50
Sal3 100 I
100 I 100 250 0,50 0,50
I Sal4 100 100 100 100 0,50 I 0,50
SaiS 100 100 o 250 I 0,50 0,75
i Sal6 100 I 150 o 250 0,50 0,75
*para todas as simulações da tabelas= 0,5
As figuras de 5. 3 a 5. 6 mostram os perfis salinos em cada um dos tanques obtidos
com as simulações da tabela 5 .3:
I
~ 02 w
Tempo {h)
-E2 E3
s•1
Figura 5.3 -Perfil da concentração salina
nos tanques.
Q50~ ' 1 :Sal3
~ ~~~~- '-------õ V25
~ )20
w :::1~ ; -E1 i
~-·~EE231 005
000 l-~~~~~· ~~~-r---'---~ 20 ~c M 30 1QO
Tempo (h)
Figura 5.5- Perfil da concentração salina
nos tanques
111
"' ,
o~
, ~ o E --
Tempo (h)
Figura 5.4 - Perfil da concentração salina
nos tanques
o E
Tempo {h)
Figura 5.6- Perfil da concentração salina
nos tanques
Observa-se que o aumento da vazão de alimentação do segundo estágio (F2) diminui
a concentração salina nos estágios de adsorção, sem interferir na concentração salina do
estágio de dessorção. Já o aumento da vazão de alimentação do terceiro estágio (tampão de
adsorção) causa a diminuição da concentração salina no estágio de dessorção, o que não é
interessante para o processo. Já a diminuição da vazão de reciclo, causa elevação da
concentração salina em todos os tanques, como pode ser observado comparando-se as
figuras 5.5 e 5.6. Sendo assim, é interessante aumentar a vazão do segundo estágio.
Observa-se também que, com as condições operacionais utilizadas nas simulações
apresentadas nas figuras de 5.3 a 5.6, não foi atingida a concentração mínima de sal
necessária para a dessorção da enzima no primeiro estágio. Dessa forma, deve-se aumentar
112 a concentração salina na alimentação e realizar um ajuste adequado de F2, para obtenção de
baixas concentrações nos estágios de adsorção.
"~~~~~--------,
G5
'J
Tempo {h}
Sal5 '
-E1 : ~-E2[ ! E3
Figura 5. 7 - Perfil da concentração salina
nos tanques
H;-------~------
\/
J1
_:li; -E2
E3
)0-l
~~~--~---~--,----10 00
Tempo {h)
Figura 5. 8 - Perfil da concentração salina
nos tanques.
Observa-se nos gráficos apresentados nas figuras 5.7 e 5.8 que aumentando ainda
mms a vazão de alimentação do segundo estágio ( adsorção) ocorre a diminuição da
concentração salina nos estágios de adsorção, mas também há influencia na concentração
salina do estágio de dessorção a qual diminui. Com o aumento da concentração salina na
alimentação do estágio de dessorção foi possível chegar na concentração mínima de sal
necessária para a dessorção. Pode ser também observada uma diminuição da concentração
salina no estágio de dessorção no início do processo. Isso pode afetar o rendimento neste
período e ocorre devido ao fluxo de sal para os demais tanques.
Não é interessante o aumento da vazão de alimentação no estágio de dessorção, pois
isto causaria queda no consumo de substrato, devido a diminuição do tempo de residência
no estágio de dessorção. Sendo assim, o melhor ajuste de vazões, tendo sido atingida a
concentração mínima de sal requerida no estágio de dessorção, é o correspondente à
simulação Sal6. Sendo assim foi verificado o comportamento do sistema para as condições
operacionais relativas à simulação Sal6, utilizando o modelo apresentado na seção 5 .2,
onde as constantes k2 e qm são calculadas em função da concentração salina, através das
equações 5.1 e 5 .2.
Os resultados obtidos com os dados experimentais de Curralero et al. (1998) são
novamente comparados aos obtidos utilizando-se os dados experimentais de Souza (1993),
113 para a condição operacional relativa a simulação Sal6 (tabela 5 .2). As condições
operacionais do sistema são apresentadas na tabela 5. 4:
Tabela 5.4 - Condições operacionais para o modelo com balanço de sal utilizando-se os
dados experimentais de Souza (1993) e Curralero et ai (1998) .
Sim · .. ·. .. · .... ·.·. 'c d. - )P\ · · on tçoes o eracmnats
Sim33 * Sal6
1 Sim34** I Sal6
*Dados experimentais de Souza (1993)
**Dados experimentais de Curra!ero et al (1998)
Sim34!
}()
Tempo (h)
Figura 5.9 - Gráfico comparativo da
retenção enzimática.
. ·· .. ·.· .•.. ·. l ... .·. Co (g/1) : . . · 1 So (gll) .
0,3 25
0,3 I 25
06
00
10(
Tempo [h)
Figura 5 .I O - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no estágio de
dessorção.
Conforme resultados apresentados nos gráficos 5.9 e 5.10, o ajuste de vazão
permite uma condição operacional que minimiza a perda enzimática do sistema, quando se
utilizam os dados experimentais de Curralero et al. (1998). Entretanto, observa-se valores
de retenção enzimática ligeiramente inferiores àqueles obtidos quando são utilizados os
dados experimentais de Souza (1993).
De acordo com os resultados apresentados, é possível um ajuste onde se obtenha
alta retenção enzimática, mesmo considerando a presença de sal no sistema. O ajuste de
114 vazões permite a obtenção de uma retenção satisfatória de enzima, apesar de a presença de
sal no sistema de influenciar a adsorção da enzima, conforme pode ser visto no apêndice 3.
Os dados experimentais de Curralero et ai. (1998) são mais realísticos que os de
Souza (1998), pois incluem a presença do tampão de dessorção. Embora o tampão de
dessorção (NaCI) provoque uma diminuição na quantidade de enzima adsorvida, é possível
um ajuste de vazões onde a retenção enzimática seja satisfatória, sem prejuízo do consumo
de substrato.
115
6.1 -Introdução
O emprego de redes neurais, na predição de parâmetros envolvidos em processos
de síntese, tem se desenvolvido recentemente. A determinação de parâmetros através de
redes neurais é de grande valia, pois permite a partir de um dado conjunto de dados
experimentais obter a predição de valores, mediante treinamento da rede. A obtenção de
taxas de reações enzimáticas envolve um número maior de parâmetros do que a
determinação de taxas de reações químicas, pois além dos parâmetros usualmente utilizados
para determinação de taxas de reações químicas outros fatores influenciam na referida taxa.
Redes neurais são métodos matemáticos baseados na estrutura neurológica do
cérebro. Trata-se portanto de uma técnica de inteligência artificial, cuja característica é
"aprender'' a lógica existente em um determinado conjunto de dados e com isso predizer
valores diferentes daqueles utilizados para o treinamento da rede.
A utilização de redes neurais em modelos híbridos para processos químicos é
prática bastante comum em Engenharia Química. Modelos híbridos são constituídos de um
modelo determinístico e uma rede neural, cuja função é fornecer parâmetros importantes do
processo utilizados no modelo determinístico. No caso de reações enzimáticas, muitos
parâmetros podem influenciar a taxa de reação, tais como a inibição. Usualmente, a taxa de
reação enzimática é obtida a partir do ajuste de dados experimentais a modelos conhecidos,
tais como o modelo de Michaelis-Mentem.
Por ser baseada em um conjunto de dados de treinamento específico, uma rede
neural só tem validade para condições nas mesmas faixas de operação utilizadas para a
obtenção dos dados experimentais. Visto que a maioria dos processos químicos possuem
condições operacionais bem determinadas, esse fato não inviabiliza a utilização de redes
neurais em modelos híbridos. O treinamento da rede é a parte mais trabalhosa, pois tanto a
topologia da rede como também o ajuste de seus pesos, através do treinamento, são fatores
fortemente dependentes do conjunto de dados utilizados. Entretanto, uma vez treinada uma
116 rede para uma determinada aplicação, a mesma pode ser acoplada a controladores ou
instalada em uma calculadora (do tipo HP) possibilitando a tomada de decisão através de
medidas diretas na linha de produção.
6.2 - Topologia da Rede
Reações enzimáticas são, em geral, mais complexas que reações químicas, pois
sofrem influência não somente de fatores tais como pH, temperatura, concentração de
reagentes e catalisador e demais fatores considerados para cinética de reações quimicas,
mas também da presença de cofatores e inibidores. No caso de inibidores, uma reação
enzimática pode ser inibida tanto pelo substrato quanto pelo produto. Dessa forma, uma
rede neural para obtenção de uma taxa de reação enzimática genérica, deve englobar estes
fatores em sua topologia. A figura 1 apresenta a topologia de uma rede com a finalidade
descrita acíma:
Taxa de
Figura 6.1 - Topologia de uma rede neural genérica para determinação da taxa de reação
enzimática.
A rede apresentada na figura 6.1 é constituída de sete neurônios na camada de
entrada, dois na camada oculta e 1 na camada de saida, que é a taxa de reação enzímática a
ser obtida através da rede. O número de neurônios na camada oculta pode ser alterado, pois
constitui um dos fatores a serem otimizados na topologia da rede. No caso da síntese
enzimática de dextrana, a reação ocorre sem a necessidade de cofatores e portanto o
neurônio referente a esta variável foi suprimido da rede, assim como os neurônios
referentes a concentração de inibidores, ao pH, à força iônica e à temperatura, que são
117 constantes na condição ótima de síntese, sendo estes parâmetros fixos e bem definidos.
Sendo assim, a rede utilizada neste trabalho tem a seguínte topologia:
Figura 6.2. Topologia da rede utilizada par predição da taxa de reação enzimática para
síntese de dextrana.
6.3 - Modelagem Híbrida
A modelagem híbrida foi realizada com o íntuito de estudar a viabilidade da
utilização de redes neurais para determínação da taxa de reação enzimática. Sendo assim a
modelagem híbrida foi aplicada ao sistema duplo estágio.
No modelo híbrido, a taxa de reação enzimática é determínada via rede neuraL A
rede é utilizada somente para detenninação da taxa de reação no estágio de dessorção visto
que a reação enzimática é praticamente desprezível no estágio de adsorção, devido á baixa
concentração de enzima livre neste estágio.
6.3.1 -Balanço de massa para o tanque 1 (dessorção)
FJCJ k (1-e) --+ Jqj VJ &
(6.1)
118
dq I = _Fc!.:Rc:.q.::..2 _e dt VJ
(6.2)
_dS_J = _F1_s_0 +-'F R'-'-S-"'2_e dt VJ VJ
Yreac (6.3)
6.3.2- Balanço de massa para a o tanque 2 ( adsorção)
_dC_2 = FrC JEi + _FJ_C_J _ '--( F...!cJ~+_F...=2~)_C,_2 dt v2 v2 v2
FRC2e + fk2q2 -kJC2(qm -q2)]'-(J_-_e-'-) ~ 8
(6.4)
(6.5)
( 6.6)
6.4 - Treinamento da rede
O treinamento da rede consiste em apresentar à mesma os pares de treinamento
(inputloutput), tendo sido determinado um erro máximo admitido, já que o funcionamento
de uma rede neural é baseado na minimização do erro através de um método de otimização,
que na rede utilizada é o método do gradiente descendente. Durante o treinamento, ocorre a
seleção dos pesos (conexões) que minimizam a soma dos quadrados dos erros entre a
predição da rede e o output desejado, especificado pelos pares de treinamento. O
treinamento da rede é iniciado com atribuição randômica de pesos de valores baixos. Deve
se evitar a inicialização da rede com pesos iguais, pois este procedimento pode resultar em
não convergência no caso de redes que requerem pesos desiguais (Rumelhart e
119 McClelland 1989). Com o treinamento, o vetor contendo os dados de entrada (input) se
propaga através da rede para gerar a saída predita pela rede ( output). Durante o
treinamento, é arbitrada uma taxa de aprendizagem da rede, que é equivalente ao tamanho
do passo, podendo também ser utilizado um termo de momento para acelerar a
convergência da rede.
A velocidade de aprendizagem, bem como a qualidade do treinamento dependem
não só da topologia da rede, mas também do erro máximo admitido e do conjunto de dados
de treinamento apresentado à mesma. O conjunto de dados de treinamento da rede devem
ser sempre normalizados entre O e 1, tanto os de input quanto os de output. A seguir é
apresentado o algoritmo de treinamento da rede e o esquema de treinamento:
6. 4.1 - Algoritmo de treinamento da rede:
1) Cálculo das saídas da camada hidden
2) Cálculo das saídas da camada input
3) Cálculo de õ ( sinal de erro ) e atualização de e ( erro ) na camada output
4) Atualização das conexões (pesos) entre as camadas output e hidden
5) Cálculo de õ ( sinal de erro ) e atualização de e ( erro ) na camada hidden
6) Atualização das conexões ( pesos ) entre as camadas input e hidden
7) Realização do teste de convergência ( Erro < Erro máximo admitido )
6.5 - Resultados e Discussões
F oi utilizada para a determinação da taxa de reação enzimática uma rede
backpropagation. Os dados utilizados para treinamento da rede foram obtidos via
simulação. O ideal seria a utilização de dados experimentais. Entretanto o treinamento de
uma rede neural requer um conjunto muito grande de pares de treinamento, no caso da
120 reação enzimátia em estudo (síntese de dextrana) estes dados senam a taxa de reação
(neurônio de saída) e a concentração de enzima e susbtrato (neurônios de entrada).
Só um estudo de viabilidade entretanto, não necessita de dados experimentais. Não
temos dados experimentais em quantidade suficiente para o treinamento da rede. Para a
síntese enzimática de dextrana, os únicos dados experimentais encontrados para a taxa de
reação enzimática foram a constante de Michalis-Menthen (Km) e a constante cinética de
reação (K). Dessa forma, o treinamento da rede só foi possível utilizando-se os dados
obtidos a partir da equação de Michaelis-Menthen.
Para o treinamento da rede foi utilizado um conjunto de 225 pares. O treinamento
da rede engloba, dentre outros fatores, a detenninação do número de neurônios na camada
intermediária. Outro fator importante para a utilização de uma rede neural em um modelo
híbrido é o treinamento da mesma dentro da faixa de validade para o sistema em estudo.
A topologia da rede utilizada no modelo apresentado no item 6.3 é aquela
apresentada na figura 6.2. Após o treinamento, a rede foi testada utilizando-se um conjunto
de 12 pares de teste, diferentes dos utilizados para o treinamento. Os gráficos a seguir
apresentam os resultados obtidos com o teste da rede:
Taxa de reação enzimàtica
"'r;::=:;==:~--~ Output esperado ~
"" i ao
o "
'"
x Outputda rede
• ' •
•
•
Par de treinamento
• '
•
Figura 6.3 - Gráfico comparativo entre a
saída esperada e a fornecida pela pela
rede para taxa de reação enzimática.
Taxa de reação enzimática
"' '" ' . Taxa de reação enzimática I
"' • ~
" • " ~ " o ., ..
" " '" " " '"' '"' "" Output esperado
Figura 6.4 - Gráfico de dispersão entre a
saída esperada e a fornecida pela rede
para taxa de reação enzimática
Pelos gráficos apresentados nas figuras 6.3 e 6.2, observa-se que a resposta da rede
é satisfatória, podendo ser utilizada no modelo híbrido. Dessa forma, as simulações de
121 número 3 e 4, apresentadas no Capítulo 3, foram repetidas utilizando o modelo híbrido para
o reator duplo estágio. A simulação de número 3 foi escolhida por ser a que apresentou o
melhor desempenho do sistema. Já simulação de número 4 foi escolhida para verificar a
validade da rede alterando-se uma das condições do sitema, no caso a fração líquida. Com
relação á cinética de adsorção, foram utilizados os dados experimentais obtidos por Souza
(1993). A tabela 6.1 apresenta as condições operacionais para o modelo híbrido:
Tabela 6.1 - Con 1ções operacwnms para o mo e o í n o d 1 h b .d
'
Sim s F1 (l/h) Fz(l/h) FR(l/h) .
Co (g/1) I Hib3 0.5 100 70 250 0.3 I
I
Hib4 0.6 100 70 250 0.3 I
As figuras de 6.5 a 6.8 apresentam os resultados obtidos com o modelo híbrido
comparados com o modelo determinístico.
o ~ ib
Tempo (h)
Figura 6. 7 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no estágio de
dessorção (modelo determinístico e
modelo híbrido ).
·c
I Sim4
"' Hib4 I
OD o ~ Oi :.t
~ 2
Tempo (h)
Figura 6.8 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no estágio de
dessorção (modelo determinístico e
modelo híbrido ).
De acordo com os gráficos das figuras 6.7 e 6.8, os resultados obtidos com a
utilização do modelo híbrido são próximos aos resultados obtidos com o modelo
122 determinístico. Pode-se dizer que a utilização de uma rede neural para obtenção da taxa de
reação enzimática é viável.
O principal problema encontrado para a utilização do modelo híbrido, neste caso
específico, é o necessidade de um número muito grande de pares de treinamento. No caso
de reações enzimáticas de cinética conhecida como a síntese de dextrana, existem poucos
dados experimentais, e os mesmos são reportados em termos das constantes da equação do
modelo (no caso da dextrana Michaelis-Menten).
Em relação a cinética de adsorção da enz1ma, esta não foi considerada na
modelagem híbrida. Sendo assim, os perfis de enzima livre e adsorvida são determinados
através de equações e não da rede, tal qual é realizado no modelo determinístico, sendo
portanto obtidos perfis idênticos.
7.1- Introdução
Apesar das inúmeras vantagens da síntese enzimática de dextrana, quase a
totalidade da dextrana produzida atualmente é obtida por fermentação, tendo sido
encontrado apenas um produto obtido através de síntese enzimática (Dextrana 1500 -
Sigma-Aldrich). A principal restrição à utilização da síntese enzimática é o alto custo da
enzima. Dessa forma, sistemas onde a recuperação da enzima seja possível são alternativas
interessantes. Entretanto, quando se pensa em processos industriais, além da recuperação da
enzima, deve-se levar em consideração a alta produtividade e o rendimento do processo.
Os estudos realizados com o reator triplo estágio evidenciam a superioridade do
mesmo em relação ao reator duplo estágio proposto por Souza (1993). Foi observado que
quanto maior a quantidade de enzima presente no sistema, maior é quantidade de substrato
consumido no estágio de dessorção (Capítulo 3). Entretanto, quando se trata de uma reação
enzimática, o aumento da quantidade de enzima não está diretamente relacionado a um
aumento na quantidade de dextrana produzida. Em condições industriais deve-se garantir
uma atividade enzimática suficiente para a conversão desejada de substrato.
Diversos estudos experimentais evidenciam que o aumento da concentração de
substrato, bem como o uso de aceptores favorecem a formação de dextrana de baixo peso
molecular. Dessa forma, a otimização de qualquer processo de síntese de dextrana não está
relacionada somente com a quantidade de dextrana produzida, mas também com o peso
molecular desejado.
A maior parte da dextrana obtida por fermentação é dextrana de alto peso molecular
(nativa). Quanto a dextrana de baixo peso molecular (clínica), esta é tradicionalmente
obtida através da hidrólise da dextrana nativa, o que eleva seu custo de produção. Sendo
assim, a síntese enzimática constitui uma alternativa à síntese de dextrana clínica, devido a
facilidade de controle do sistema.
124 Testes de produção in vitro de dextrana em escala industrial foram efetuados a pH
5.2 em solução de dextrana-sacarase de 10 U.D.S/ m1 (Alsop,1993). Os rendimentos desses
testes em termos de dextrana total clínica e nativa, além de produtos secundários (mono e
di-sacarideos) são apresentados na tabela a seguir:
Tabela 7.1 -Rendimentos das frações de carboidratos (g I 100 g de sacarose) obtidos na síntese in vitro de dextrana variando-se a concentração de sacarose (Alsop,1983).
A tabela 7.1 apresenta os rendimentos experimentais obtidos para a conversão total
do substrato, ou seja toda a sacarose é convertida em algum produto (segundo a tabela 7.1).
O que garante a conversão total do substrato é atividade enzimática, a qual é determinada
experimentalmente e depende não somente da concentração da enzima utilizada, mas
também de suas condições de armazenagem e do meio em que a mesma está sendo
utilizada tais como: concentração salina, presença de determinados íons e pH, dentre outros
fatores. Embora não se saiba qual o sistema utilizado, para a obtenção dos rendimentos
apresentados na tabela 7.1, seu uso como base de cálculo permite aproximar as estimativas
realizadas neste capítulo das condições reais de síntese em escala industrial.
O processo estudado neste trabalho é uma síntese enzimática, a qual apresenta
algumas características peculiares, tais como quantidade de dextrana produzida e peso
molecular dependente das condições de síntese e não somente da cinética enzimática
(equação de Michaelis-Menten). Dessa forma, o estudo da viabilidade da aplicação do
sistema proposto em escala industrial, através de simulações do processo, deve ser
embasado em dados experimentais, tais como os apresentados na tabela 7 .1.
Sob o ponto de vista econômico, a síntese enzimática de dextrana é mats
interessante para a obtenção de dextrana clínica, visto que há a possibilidade da eliminação
da etapa de hidrólise. Sendo assim, foi considerada, para fins de verificação da
125 aplicabilidade do processo em escala industrial, as condições apresentas na tabela 7.1 para
uma concentração de 20 % de substrato na corrente de alimentação, visto ser a que
apresenta maiores rendimentos em termos de dextrana clínica.
7.2 - Simulações
Para verificar a aplicabilidade da utilização do processo CARE modificado para
síntese enzimática de dextrana, foi considerado o reator triplo estágio dada sua
superioridade em relação ao modelo duplo estágio. O volume dos tanques e fração líquida
do sistema são constantes, sendo a fração líquida do sistema igual a 0,5 e o volume total
(volume de sólidos + líquido) de cada um dos tanques igual a 1000 litros. Os dados
experimentais relativos a adsorção da enzima utilizados foram os obtidos por Curralero et
al. (1998), por serem mais completos que os apresentados por Souza (1993), visto que
consideram a presença do tampão de dessorção.
Considerando a concentração de 20 % de sacarose (tabela 7.1) e o modelo
matemático apresentado no Capítulo 5, serão consideradas, num primeiro momento, as
seguintes condições operacionais para o sistema:
Tabela 7.2 Condições operaciOnais para o sistema triplo estágio utilizando os dados
experimentais de Curralero et al. (1998)
As condições operac10na1s apresentadas na tabela 7.2 referem-se àquelas
necessárias para se garantir a concentração mínima de 0,5 M de NaCl no estágio de
dessorção, com baixas concentrações de sal nos estágios de adsorção, conforme
apresentado no Capítulo 5. Entretanto, devido ao aumento significativo da concentração de
substrato na alimentação serem utilizadas em valores bem superiores as utilizadas até agora
nos capítulos anteriores, são utilizadas concentrações mais elevadas de enzima, com a
126 finalidade de se verificar a quantidade de enzima necessária para a obtenção de um alto
consumo de substrato.
Os resultados obtidos com as simulações da tabela 7.2 são apresentados a seguir:
< ~001
1
"'"I ""'1 ª JêSS
~ ers 0 """j' -c9n
~~---,~,--~,--~õJ----,~,--~.~~
Tempo (hj
Figura - 7.1 - Gráfico comparativo da
quantidade de enzima retida no sistema.
''l "I
' ]~i
Lj ~ 21 JQ
iG
Tempo (h)
Figura 7.2 - Gráfico comparativo do
consumo de substrato no tanque de
dessorção.
As vazões de alimentação utilizadas nas simulações da tabela 7.2 são idênticas á
simulação Sal6 (CapítuloS), sendo estas as que apresentaram melhor desempenho para o
processo. Dessa forma, pode-se assegurar que as concentrações de sal em cada um dos
tanques estão dentro das faixas desejadas. As curvas coincidentes obtidas no gráfico
apresentado na figura 7 .I se devem ao fato da vazões serem serem iguais para as três
simulações consideradas (a retenção enzimática em termos percentuais é fortemente
dependente das vazões de alimentação). Observa-se que apesar do aumento da quantidade
inicial de enzima no sistema, não há muita diferença no consumo de substrato no tanque de
dessorção. Uma análise dos perfis da concentração de substrato em cada um dos tanques,
conduz a melhores conclusões.
i --Sim35 -sim36
Sim37
Tempo (h]
Figura 7.3 -Perfil de substrato no tanque
de dessorção.
'" i\ -Sím35 -Sim36
,, 1.1
Sim37
3 •o /i "' I
f
Tempo{h)
Figura 7.5 - Perfil de substrato no
segundo estágio de adsorção.
127
Tempo (h]
Figura 7.4 - Perfil de substrato no
primeiro estágio de adsorção.
~ODO
50DG i\
~ i\
.1000 i\ $ f\ " 0000 In " (\ ~
" I ~ 2000
~ I ~
·ooo
100
Tempo (h)
Figura 7.6 - Perfil da perda de substrato
pelo sistema.
Observa-se através dos gráficos das figuras de 7.3 a 7.5 que a quantidade de
substrato no tanque 1 diminui rapidamente, enquanto que há um pico na concentração de
substrato nos demais tanques. A ocorrência disso se deve ao fato de que, no início da
operação, o substrato não consumido no tanque de dessorção é transferido para os estágios
de adsorção. Essa transferência causa uma elevação brusca na concentração de substrato
nos estágios de adsorção, a qual se estabiliza com o passar do tempo, pois o sistema tende a
um estado estacionário.
A figura 7.6 apresenta o perfil da perda de substrato não consumido, obtida pelo
produto da vazão efluente do sistema (F1+F2+F3) e a concentração de substrato no último
estágio (S3). Observa-se que, quanto menor a concentração inicial de enzima, maior é a
.l;"". >W:<)
~~~----·
128 perda de substrato não consumido. Os gráficos a seguir apresentam os perfis de enztma
livre e adsorvida em cada um dos estágios, bem como o perfil da perda enzimática:
Tempo (h)
~sim35
~-Sim35
Sim37
Figura 7. 7 - Perfil de enztma livre no
estágio de dessorção.
'o~w·..r-12<10'
1 !<10~
90<1ü"'
80<1D'
:§; ::~~ rj" 5C<!ü"
10
I
l I
Tempo{h)
--Sim35 i ~Slm36 i
Sim37
Figura 7.9 - Perfil de enztma livre no
segundo estágio de adsorção.
Tempo (h)
Figura 7.8 - Perfil de enz1ma livre
primeiro estágio de adsorção.
"" ''" "' 020
~ ~~ ~ ~~~ ~ ~ ;~ ~ J 12
'JW
il "' ~ 000
·~ J02 •1G0
~m
~~~~~~~-~,
20
Tempo (h}
i -~~Sim35 i
I
~Sim36 !1
Slm37;
Figura 7.10- Perfil da perda enzimática no
sistema.
Observa-se, na figura 7. 7, uma queda brusca da concentração de enzima livre no
tanque de dessorção. Entretanto, o pico presente nos perfis de enzima livre é menor que o
obtido para o substrato no primeiro estágio de adsorção, e não aparece no segundo estágio
de adsorção. Isto se deve ao fato de a enzima não somente estar sendo transferida do
estágio de dessorção para os estágios de adsorção, mas também sendo adsorvida nos
tanques de adsorção.
129 A concentração de enzima livre nos estágios de adsorção é muito pequena se
comparada a concentração de enzima livre no estágio de dessorção. Observa-se também
que quanto maior a quantidade inicial de enzima no sistema, maior é a concentração de
enzima livre no sistema e maior a perda enzimática, dada pelo produto da vazão efluente do
sistema (F 1+Fz+F3) e a concentração de enzima livre no último estágio de adsorção (C3).
De acordo com os resultados obtidos, quanto maior a concentração inicial de
enzima livre maior é consumo de substrato e maior será também a perda enzimática do
sistema. Entretanto, é dificil estabelecer uma concentração de enzima suficiente para a
conversão total do substrato, tal qual apresentada na tabela 7.1, visto que essa conversão
depende da atividade enzimática, a qual é uma medida experimental e deve ser realizada
para cada lote de enzima utilizado na síntese, a fim de verificar a concentração necessária
para se atingir uma dada atividade enzimática.
Os rendimentos apresentados na tabela 7.1 foram obtidos para uma atividade
enzimática de 10 UDS/ ml. Souza (1993) apresenta urna tabela da atividade enzimática da
dextrana-sacarase em função da concentração de enzima (medidas experimentais). Embora
as condições de síntese não sejam a mesma utilizada nas medições de Souza (1993), a
mesma pode ser utilizada para estimar a concentração de enzima necessária para a obtenção
dos rendimentos apresentados na tabela 7. L A tabela 7.3 apresenta os dados obtidos por
Souza (1993) para a determinação da isoterma de adsorção da dextrana-sacarase em DEAE
Celulose.
Tabela 7.3 -Atividade enzimática da enzima dextrana-sacarase (Souza, 1993)
Observa-se através da tabela 7.3, que não há uma linearidade entre a concentração
de enzima e a atividade enzimática e evidenciando ainda mais a dificuldade em se
determinar uma concentração em unidades clássicas de concentração, tais como razão
massa/volume), para se obter os rendimentos apresentados na tabela 7. L Usando a tabela
130 7' c,~.,,., g'..!i~_ observa-se que a concentração enzimática para uma atividade de 10 UDS/
ml obtida por Souza (1993), está em torno de 0,5 g/1. Embora essa concentração deva
necessariamente ser determinada experimentalmente, o valor de 0,5 g/1 será considerado
como a concentração mínima de enzima livre necessária para a obtenção dos rendimentos
apresentados na tabela 7.1.
7.3- Verificação da aplicabilidade do sistema para processos industriais
O sistema em estudo é de difícil otimização devido ao elevado número de variáveis
envolvidas_ A otimização do sistema visa a obtenção de alto rendimento, alta produtividade
e alta retenção enzimática. Todos esses fatores dependem fortemente das vazões de
alimentação de cada um dos tanques. Dessa forma, dada uma condição inicial em termos de
fração líquida do sistema, concentração inicial de substrato e concentração inicial de
enzima, a otimização do mesmo pode ser realizada através do ajuste das vazões de
alimentação.
Neste trabalho, uma otimização heurística foi realizada. As condições operacionais
apresentadas na tabela 7 .2, foram escolhidas dentre várias simulações, sendo que as
mesmas apresentaram resultados satisfatórios em termos de consumo de substrato e
retenção enzimática. O rendimento do processo, não é diretamente relacionado ao consumo
de substrato, visto que de acordo com a tabela 7.1, nem todo substrato consumido é
convertido em dextrana. Já em relação a produtividade, por se tratar de um processo
contínuo, este fator depende da quantidade substrato convertido em dextrana, além da
vazão efluente do sistema.
Por ser um sistema contínuo e sem alimentação de enzima, o estado estacionário é
difícil de ser atingido, visto que há sempre uma perda enzimática e com o passar do tempo,
um acúmulo de substrato_ Pode-se dizer ainda que o sistema entra em estado pseudo
estacionário, visto que nas condições utilizados para as simulações, essas variações são
quase imperceptíveis após um certo tempo, o qual pode ser convenientemente denominado
start up do processo_ De acordo com os resultados apresentados nas figuras 7.6 e 7.1 O, após
20 horas de operação, não são notadas mais variações bruscas na perda de substrato não
convertido e na perda enzimática do sistema. A essas 20 horas iniciais será atribuída a
131 qualidade de start up do processo. Para fins de cálculo da taxa da perda enzimática e de
substrato, será considerada o valor médio obtido no intervalo de tempo considerado nas
simulações (100 h). Para as simulações da tabela 7.2, de acordo com os rendimentos da
tabela 7.1 temos:
Tabela 7.4 - Rendimentos obtidos com reator triplo estágio com base nos dados
experimentais apresentados na tabela 7. 1
De acordo com a tabela 7.1, nem todo o substrato consumido é convertido em
dextrana. A tabela 7.4 apresenta os rendimentos em termos de dextrana total produzida
com o sistema triplo estágio, proporcionais aos rendimentos experimentais reportados na
tabela 7.1, considerando alimentação de substrato a 20 %. Observa-se que apesar da
concentração inicial de enzima dobrar da simulação 35 para a 37, a diferença entre as
respectivas taxas de produção de dextrana não é tão grande. Entretanto, deve-se considerar
a atividade enzimática e não somente a concentração mássica de enzima livre.
A concentração mínima de 0,5 g/1 de enzima livre no tanque de dessorção só é
obtida com as condições operacionais da simulação de número 37. Dessa forma, esta
simulação será considerada como base para a estimativa econômica do sistema, apresentada
posteriormente. Entretanto, nesta seção, para fins de estudo comparativo da viabilidade
técnica em termos de perda enzimática e de substrato não consumido, serão consideradas as
simulações de número 35 a 37.
Todos os cálculos apresentados nesta seção foram realizados proporcionalmente
aos rendimentos apresentados na tabela 7.1 (dados em g/ 1 OOg de substrato consumido).
O substrato consumido, produz além da dextrana, monossacarideos (basicamente
frutose) e dissacarideos (maltose e isomaltose). Além disso, a dextrana produzida pode ser
dividida em dextrana de alto peso molecular (nativa) e de baixo peso molecular (clínica). A
132 tabela 7.5 apresenta as quantidades de monossacarideos, dissacarideos, dextrana nativa e
clínica, bem como taxa de perda enzimática para as simulações da tabela 7.2:
Tabela 7.5 - Rendimentos obtidos com reator triplo estágio com base nos dados
experimentais apresentados na tabela 7 .1.
De acordo com as tabelas 7.4 e 7.5 há pouca diferença em termos das taxas obtidas
para a produção de dextrana e produtos secundários (mono e di-sacarídeos). Entretanto, em
um processo continuo isso pode fazer diferença. Para calcular a produção anual de
dextrana, serão considerados os dados das tabelas 7.4 e 7.5 considerando operação anual de
300 dias (7200 h). Mesmo em se tratando de um processo contínuo, deve haver paradas
para limpeza e manutenção do sistema. O período de operação continua foi estimado em
sete dias, considerando este um intervalo suficiente para limpeza e esterilização dos
equipamentos. Uma estimativa da produção anual de dextrana, consumo e perda de
substrato, bem como a perda de enzima é apresentada na tabela 7.6:
Tabela 7.6- Estimativa dos rendimentos anuais da síntese enzimática de dextrana com o
reator triplo estágio.
* dextnma total considerando dextrnna de alto e baixo peso molecular
De acordo com os resultados apresentados na tabela 7.5, a perda enzimática e de
substrato estimadas não são muito significativas, frente a quantidade dextrana produzida.
133 Esta perda gira em torno de 5% do substrato alimentado. Entretanto os dados da tabela 7.6
só consideram as perdas inerentes a operação do sistema não sendo considerados o
consumo de enzima e substrato na carga do reator quando ocorre uma parada do processo,
seja para manutenção ou limpeza. Os resultados apresentados na tabela 7.6 são resultados
da operação da planta em uma condição otimizada obtida através das simulações do
processo. Na prática, espera-se a ocorrência de perdas maiores, visto que alguns fatores tais
como problemas com o transporte hidráulico de entre os tanques e perdas decorrentes deste
transporte não são previstas pelo modelo.
Considerando que a limpeza do sistema seja semanal (52 paradas por ano), a tabela
7.7 apresenta o consumo de substrato e enzima para carga do reator considerando uma
concentração inicial de enzima de 2 g/1 (sim37) e a possibilidade de recuperação de 80 %
da enzima presente no sistema em cada parada.
Tabela 7.7. -Consumo anual de enzima e substrato para carga do reator, considerando o
volume de líquido nos tanques de 500 I.
Comparando a tabela 7.7 com a 7.6 observa-se que o maior consumo de enzima se
dá durante a carga do reator, enquanto que a perda anual de substrato no processo é igual ou
superior à necessária para carregar o reator.
A produção mundial de dextrana gira em torno de 500 toneladas/ano (Curralero,
1993). A estimativa de dextrana obtida através da simulação do sistema triplo estágio é de
100 toneladas/ano, isso representa 20% da produção mundial de dextrana. Sendo assim, o
reator triplo estágio é viável para síntese enzimática de dextrana em escala industrial, nas
condições estudadas. Na prática a quantidade de dextrana obtida pode ser inferior ao
estimado (20%) devido ao fato de o modelo não prever os todos os problemas operacionais
do processo tais como: problemas com o transporte hidráulico. Ainda assim a capacidade
da planta seria alta o viabiliza o processo.
As estimativas apresentadas podem variar também em função do intervalo de tempo
entre uma parada e outra, e outros fatores não abordados no presente trabalho, tais como
134 concentração de enzima (g/1) necessária para a obtenção da atividade enzimática necessária
para obtenção dos rendimentos apresentados na tabela 7.1, os quais foram utilizados como
base de cálculo (medida esperimental).
Um cálculo preciso para o consumo de substrato e perda enzimática é dificil visto, o
mesmo ser fortemente dependente de dados experimentais não disponíveis tais como
intervalo de tempo considerado para regeneração da resina, desativação da enzima devido a
presença de tampões ( dessorção, adsorção e tampões para o ajuste de pH), possibilidade
real de recuperação da enzima em cada parada do sistema, além outros problemas
decorrentes da operação do sistema tais como transporte hidráulico. Dadas essas
considerações, os consumos de enzima e substrato, bem como a quantidade de dextrana
produzida sofreriam variações, cujo cálculo preciso é impossível com as informações
disponíveis em literatura aberta.
Em termos de consumo enzimático, pode-se dizer que o processo consome em tomo
de 13 kg/ ano, enquanto que o consumo de substrato (sacarose) é algo em tomo de 365
ton!ano (quantidades estimadas com base nas tabelas 7.6 e 7.7). Entretanto, além da
dextrana há a produção de monossacarideos e dissacarideos, sendo a frutose o principal
monossacarideo obtido. A frutose é um açúcar de alto valor adoçante e de grande aceitação
no mercado, sendo portanto um subproduto interessante. De acordo com a tabela 7.4, a
quantidade de frutose obtida juntamente com a síntese de dextrana é algo em tomo de 190
ton!ano. Sob esse ponto de vista, aproximadamente 80% da sacarose alimentada no sistema
é convertida em produto comercial ( dextrana e frutose ), segundo os rendimentos
apresentados na tabela 7.2.
7.4- Estimativa Econômica
A estimativa econômica visa comparar o gasto com matéria prima e o possível
faturamento com os produtos finais ( dextrana e frutose ). Não foram considerados nesta
análise as etapas de purificação e separação dos produtos, bem como custos operacionais,
ativação e reposição da resina, bem como custos referentes as soluções tampão e a enzima,
(esta última não é comercializada para aplicações industriais).
135 As aplicações da dextrana são fortemente dependente de seu peso molecular. O
preço do produto final também varia de acordo com o peso molecular do produto. Para fins
de cálculo, foi considerado um valor médio dentre 3 produtos comerciais, cuja faixa de
peso molecular varia de 60.000 a 500.000, sendo estes produtos obtidos via fermentação.
Foi considerada a produção estimada de 100 ton/ ano de dextrana total, conforme
apresentado na seção anterior, sendo a mesma dividida em 57 tonl ano de dextrana nativa e
43 ton/ano de dextrana clínica (considerando a proporção apresentada na tabela 7.1 para
alimentação de substrato a 20 %).
Já em relação a enzima, a mesma é comercializada em termos de atividade
enzimática em quantidades ínfimas destinadas a outras finalidades, que não o uso industrial.
Dessa forma, é dificil incluir o custo da enzima nos cálculos de forma direta. Sendo assim
em uma primeira análise o custo da enzima não será considerando, sendo posteriormente
estimado um valor máximo para este custo. Quanto a sacarose, foi considerado açúcar
comercial. Foi também considerado o custo da dextrana obtida via síntese enzimática, de
peso molecular 1.500. A tabela 7.8 apresenta as respectivas cotações. Para fins de cálculo,
será considera dextrana clínica aquela obtida via síntese enzimática e nativa a obtida via
processo fermentativo.
Tabela 7.8 -Custo de matérias prima e produtos (fonte: Sigma-Aldrich)
via síntese
*fonte: Indicadores econômicos do Jornal Folha de São Paulo (27/0712000) .
De acordo com a tabela acima, um faturamento anual com a venda dos produtos
obtidos com o reator triplo estágio pode ser estimado em tomo de 60 milhões de dólares,
com a média do preço de mercado da dextrana obtida por fermentação. Já com o preço da
dextrana obtida via síntese enzimática, é da ordem de três vezes a média utilizada para a
136 dextrana obtida via fermentação. O faturamento anual possível, somente com este produto é
da ordem de 180 milhões de dólares.
Quando comparado com o faturamento anual obtido com a venda dos produtos,
pode-se dizer que o custo com substrato é desprezível. Embora não tenham sido
considerados nesta análise o custo com tampões e resinas bem como custos operacionais e
de manutenção, estes tendem a ser razoável frente ao faturamento possível com a
comercialização de dextrana e fiutose. O fator limitante na síntese enzimática de dextrana
são os custos com a enzima
Foi encontrado para a dextrana-sacarase o custo de US$ 6. 701 UDS. Segundo o
fabricante (Sigma-Aidrich) a enzima é comercializada na forma liofilizada, com atividade
mínima de I 00 UDS/mg. Considerando um faturamento com a comercialização de dextrana
e fiutose entre 200 e 300 milhões de dólares/ ano, um lucro líquido em torno de I 00
milhões de dólares/ ano seria possível desde que o gasto com enzima, operação da planta e
tampões naõ ultrapassse 150 milhões de dólares/ano. Fazendo uma projeção, com os custos
citados temos:
Tabela 7.9- Projeção considerando as estimativas do custo com enzima e demais custos
não computados na tabela 7.8 .
. Faturamento com Dextrana de alto peso m<lle<:ul::~r (base de calculo dextrana obtida por fermetação tabela 7 Faturamento com peso molecular (base de calculo dextrna obtida via síntese enzímática tabela Faturamento com Frutose
185,
5.62
0.085
1 Custo com enzima operação da planta e tampões 150.0 I
Os dados considerados nesta análise são fortemente dependentes do custo com a
enzima e do produto final obtido, para os quais não foram encontrados dados suficientes
137 para uma análise mais precisa. Outro fator que afeta o custo é o grau de pureza das matérias
primas empregadas e etapas de purificação, não consideradas na análise.
7.5- Considerações fmais
A estimativa econômica do processo estudado é difícil. A não existência de
informações reais do processo, tais como especificação dos reagentes utilizados, dificulta o
cálculo dos custos, que varia muito em função do reagente utilizado. Dessa forma, os
cálculos apresentados neste Capítulo são estimativas, com base em dados de produção
obtidos através de simulação. Outro fator importante é o fato de ter sido considerada a
operação do sistema durante todo o ano. Os cálculos apresentados na seção anterior se
referem a uma projeção possível de produção. Entretanto, o tempo de operação do sistema
pode ser reduzido para alguns meses, semanas ou dias, de acordo com a produção desejada.
Dados industriais, ou até mesmo em escala piloto referentes ao sistema estudado,
são fundamentais para a obtenção de um panorama mais realista e menos especulativo.
Entretanto, levando-se em consideração a obtenção de um possível lucro anual em torno de
I O milhões de dólares ( I O % do apresentado nos cálculos ), já tornaria o processo viável,
principalmente em se tratando da obtenção de dextrana clínica.
Embora a fatia do mercado considerada para cálculos anuais seja relativamente alta
(20 % da produção mundial), acredita-se que a produção de dextrana esteja concentrada em
poucas empresas, visto só terem sido encontrados dados de uma única empresa (Sigma -
Aldrich). Considerando a produção mundial de 500 ton!ano em termos de dextrana obtida
via fermentação ( US$ 1.11 /g, segundo tabela 7 .8), tem-se um faturamento anual de 550
milhões de dólares/ano, o que torna a produção de dextrana clínica um investimento
promissor, visto o mercado para este polissacarideo ser modesto devido ao seu alto custo.
8.1 - Conclusão
Neste trabalho foi proposta adição de um reator triplo estágio contínuo com reciclo
de enzima para síntese enzimática de dextrana. O sistem é baseado no reator duplo estágio
proposto por Souza (1993) e a adição de um estágio extra de adsorção visa aumentar a
retenção enzimática. No reator triplo estágio estudado dois dos tanques são destinados a
adsorção da enzima, enquanto o outro é destinado a dessorção e reação enzimática. Foi
realizada a modelagem do sistema duplo e triplo estágio.
Diversas simulações foram realizadas com ambos os sistemas, tendo sido
apresentadas somente aquelas que apresentaram melhores resultados. Um estudo
paramétrico (não apresentado) utilizando uma ampla faixa de vazões de alimentação e de
reciclo foi realizado para determinação das melhor faixa de vazão a ser utilizada para os
sistemas em estudo.
Os resultados obtidos com as simualções do sistema duplo e triplo estágio foram
então comparados entre si. Foi constatada a superioridade do sistema triplo estágio em
relação ao sistema duplo estágio. Essa superioridade é evidenciada através do consumo de
substrato. A quantidade de enzima adsorvida no sistema triplo estágio é ligeiramente
superior à obtida com o sistema duplo estágio, entretanto, devido a consideração de
dessorção instantânea, a quantidade de enzima livre no estágio de dessorção é maior para o
sistema triplo estágio frente ao sistema duplo estágio, visto que a taxa de dessorção
depende somente da quantidade de material adsorvido na superfície do adsorvente (hipótese
do modelo de Langmuir).
Um outro modelo de adsorção, onde as resistências à transferência de massa são
consideradas, foi utilizado na modelagem do reator duplo estágio. Essa consideração foi
realizada com a finalidade de verificar o quanto a inclusão dessas resistências poderiam
influir na performance do sistema. Foi então verificada queda na quantidade de enzima
retida no sistema, quando somente à resistência á transferência de massa no filme líquido é
considerada. Já quando não somente a resistência à transferência de massa no filme líquido
139 é considerada, mas também a difusão no interior da partícula, verificou-se queda na
quantidade de enzima retida no sistema e alteração do perfil da quantidade total de enzima
adsorvida no sistema.
Apesar de se tratar de uma estimativa qualitativa, visto não haver disponíveis
dados experimentais importantes para o modelo de adsorção proposto e a resina utilizada
não ser esférica, as alterações observadas no comportamento do sistema indicam a
importância em se considerar essas resistências. Devido ao fato de o produto sintetizado ser
um polissacarídeo, cuja viscosidade de suas soluções podem assumir valores de 2 a 4 vezes
o valor da água, e dada as limitações difusionais impostas pelo aumento da viscosidade do
meio, a consideração das resistências à transferência de massa podem assumir papel
primordial no desempenho do sistema estudado. Entretanto, este tópico precisa ser melhor
estudado.
A área de biotecnologia tem se desenvolvido recentemente, tendo sido descobertas
novas enzimas e, até mesmo outras aplicações para enzimas já conhecidas. Sob esse ponto
de vista, a utilização de redes neurais para determinação da taxa de reação enzimática pode
encontrar aplicação prática, em reações cuja cinética não se ajuste a modelos conhecidos.
Sendo assim, ainda para o reator duplo estágio foi utilizado um modelo híbrido, onde a taxa
de reação enzimática é obtida através de uma rede neural. Foi constatada a viabilidade da
utilização de uma rede neural para esta finalidade.
Devido a superioridade do modelo triplo estágio, este foi utilizado para o estudo da
viabilidade do processo em escala industrial. Desde o início do trabalho, as simulações
foram realizadas utilizando reatores de volume compatível com reatores industriais para
síntese de bioprodutos. Esse procedimento reduziu significativamente o número de
simulações realizadas. O estudo da viabilidade da utilização do sistema em escala industrial
foi embasado em dados experimentais de rendimento, visto que nem todo substrato
consumido é convertido em dextrana. De acordo com os resultados obtidos, pode-se
considerar que o reator triplo estágio é uma opção viável para a síntese enzimática de
dextrana em escala industrial, com a possibilidade de obtenção de fiutose (produto
secundário de grande aceitação comercial). Foi verificada a conversão de 80 % da sacarose
alimentada no processo em produtos comerciais ( dextrana e fiutose ). A comercialização de
dextrana de baixo peso molecular obtida via síntese enzimática (Sigma -Aldrich) evidencia
140 a viabilidade da síntese enzimática em escala industrial, embora não seja conhecido o
sistema ou condições operacionais para esta síntese.
8.2 - Trabalhos Futuros
O sistema estudado depende fortemente da cinética de adsorção. Devido a
inexistência de dados relativos a dessorção da enzima, a mesma foi considerada instantânea
neste trabalho. Entretanto Curralero et al. (1998) consideram a taxa de dessorção como o
inverso da taxa de adsorção. Dessa forma, faz-se necessária a determinação da isoterma de
dessorção da enzima. Outra consideração quanto a cinética de adsorção é o fato de os dados
experimentais disponíveis não considerarem a presença de dextrana. Dado o aumento da
viscosidade, a presença de dextrana pode influenciar bastante a adsorção e dessorção da
enzima.
Ainda em relação a cinética de adsorção, seria interessante considerar também a
presença do tampão utilizado para o ajuste de pH, visto que a reação ocorre em pH 5.2 e o
tampão utilizado para dessorção é um sal neutro (NaCI). Essa consideração inclusive pode
refletir não somente na cinética de adsorção da enzima, mas também na estabilidade da
mesma, pois sabe-se que a enzima é pouco estável para valores de pH superiores a 6. 7.
Em relação a cinética enzimática, é importante considerar, para a mesma, a
presença do tampão de dessorção no meio, pois sendo a dextrana tradicionalmente
produzida por fermentação, os dados cinéticos disponíveis em literatura aberta são
referentes às condições encontradas no caldo de fermentação.
A utilização de outras soluções tampão, seja para adsorção e dessorção ou para o
ajuste de pH, bem como a utilização de outras resinas poderiam levar a outras condições de
síntese, como por exemplo o uso de uma menor quantidade de resina, o que melhoraria o
transporte hidráulico do sistema.
Para obtenção experimental das isotermas de adsorção da enzima, a resina utilizada
(DEAE-Celulose) é previamente tratada. O sistema estudado envolve o reciclo da enzima
através de seus estágios de adsorção e dessorção, dessa forma a determinação da
regeneralibidade da resina, bem como o tempo que esta pode ser utilizada antes que seja
141 necessária uma reativação da mesma, são dados experimentais relevantes. A montagem do
sistema em escala de bancada traria informações úteis a respeito das limitações relativas ao
transporte hidráulico de sólidos.
De um modo geral, para trabalhos futuros, a obtenção de dados experimentais
importantes, permitiriam a obtenção de resultados mais precisos a respeito do
comportamento do sistema, suas limitações e aplicações práticas.
142
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147
Modelar processos e sistemas químicos consiste em encontrar as equações
matemáticas que descrevem o sistema em estudo e a simulação permite a previsão do
comportamento do sistema. Muitas vezes, as equações do modelo são complexas e
envolvem um grande número de parâmetros e variáveis. Dessa forma, a adimensionalização
ou a simplificação de modelos matemáticos é prática bastante comum, pois permite a
redução do número de variáveis envolvidas simplificando, dessa forma, a solução
matemática das mesmas. Em casos extremos, a solução do sistema de equações só é
possível através da adimensionalização de variáveis.
Os modelos apresentados no Capítulo 3 poderiam ser simplificados através da
adimensionalização das vazões. Entretanto para que o número de variáveis seja realmente
reduzido as vazões de alimentação de cada um dos tanques deveriam ser iguais, como pode
ser visto mais adiante. O estudo paramétrica evidência o fato dos sistemas em estudo
(reator duplo e triplo estágio) serem muito sensíveis às vazões de alimentação, tendo sido
obtido um melhor desempenho, tanto para o reator duplo como para o reator triplo estágio,
quando se utiliza vazões de alimentação desiguais. A simplificação do modelo, com
adimensionalização das vazões, reduz o número de variáveis e simplifica a otimização do
sistema, entretanto esta prática pode implicar em algumas restrições. Sendo assim, as
simulações apresentadas neste trabalho foram realizadas utilizando o modelo original sem
simplificações.
Modelo Original]
Como apresentado na seção 3.2 o modelo original é aqui reescrito.
Balanço de massa para o estágio de dessorção:
(1)
148
dqJ FRq2e ---dt VJ
(2)
dS1 F;S0 FRS,e FRS1& F;S1 KC1S1 -=--+---------dt v;. v;. v;. v;. Km + SI
(3)
Balanço de massa para o estágio de adssorção
(4)
(5)
(6)
Modelo Simplificado
Souza (1993) simplificou o sistema de equações que constituem a modelagem do
reator duplo estágio. Esta simplificação é realizada em termos da adimensionalização das
vazões, através das variáveis lj/ e r, sendo utilizado para simplificar ainda mais o modelo a
razão entre volume e vazão de alimentação através da variável r (tempo de residência),
sendo válidas portanto as seguintes relações:
F; = vazão de alimentação do estágio i
Uf = FR r Fi
149 Balanço de massa para o estágio de dessorção:
dCJ = lf/&(C2 -CJ) dt Tj
(7)
dqJ = lf/8( q2- qJ) qJ - ksqJ dt TJ TJ
(8)
dSJ =(SJ-S2)+lf/e(S2-SJ) KC1S1
dt TJ TJ Km+Sj (9)
Balanço de massa para o estágio de adsorção:
(10)
(11)
dS2 = (S 1 -s2 ) + lf&(S1 -s2 ) S2 KC2S2
dt '2 '2 Y'2 Km +S2 (12)
Restrições do modelo simplificado.
Comparando-se as equações representativas do modelo simplificado e do modelo
original, fica evidente que o modelo simplificado só tem validade quando a variável
admensional !f for igual para os dois tanques. Sendo assim, as vazões de alimentação em
!50 cada um dos estágios devem ser iguais e à variável adimensional y deve ser atribuído valor
unitário. Essa restrição torna a utilização do modelo simplificado limitado, pois a utilização
de vazões de alimentação desiguais melhora o desempenho do sistema, conforme
demonstrado no Capítulo 3. As mesmas observações são válidas para o sistema triplo
estágio.
151
A adsorção da dextrana-sacarse em DEAE-Celulose segue o modelo de Langmuir.
Com o intuito de estimar a influência dessas resistências no comportamento do sistema,
foram utilizados dois modelos adicionais, um dos quais leva em consideração somente a
resistência à transferência de massa no filme líquido, enquanto o outro considera também a
difusão no interior da resina.
Foi utilizado o modelo de adsorção proposto por Hortsmann e Chase (1989). Foram
utilizados, para a estimativa da difusividade efetiva (Dei) e do coeficiente de película (kJ),
as propriedades da água. Esse procedimento se deve a inexistência de dados experimentais
importantes para a utilização do modelo, tais como viscosidade e densidade da solução
tampão, utilizada para obtenção das isotermas de adsorção. Para a estimativa dos
parâmetros mencionados, foram utilizadas as seguintes correlações, apresentadas no
trabalho de Hortsmann e Chase (1989):
Co"elação de Polson (1950) para difusividade
D AB = 9,4xJo-5 T J.l(M A)
(1)
c~elação Geankopolis (1983) para estimativa do coeficiente de transferência de massa
21 3( JJ/3 kJ = 2DAB +0.3{ f.l J- Apf.lg
d pDAB P2
Onde:
Ap = densidade diferencial entre a partícula e a fase líquida
d = diâmetro médio da partícula
(2)
152
g = constante gravitacional Com a estimativa de D AB e a porosidade da resina é possível
s estimar Der através da relação Def = 2..DAB ( Froment e Bischoff, 1990). Estimados os
'"C
valores de Def e Kr, os valores corretos destes parâmetros são determinados através da
solução do modelo de adsorção proposto por Hortsmann e Chase (1989), apresentado no
Capítulo 6. O valor correto para estes parâmetros é determinado através do ajuste da
solução do modelo à curva experimental de adsorção da enzima na resina, tendo sido
utilizado para isso os dados experimentais da adsorção de dextrana-sacarase em DEAE
Celulose obtidas por Souza (1993).
A resolução do modelo foi realizada utilizando-se o método de colocação ortogonal,
tendo sido utilizados dois pontos internos de colocação. O ajuste à curva de adsorção foi
realizado através do método de tentativa e erro utilizando como valores iniciais as
estimativas de Der e Kf
Os demais dados necessários, tais como diâmetro médio da resina e densidade
foram da mesma forma extraídos do trabalho de Souza (1993). Já o peso molecular da
enzima foi obtido junto ao fabricante (Sigma). A DEAE-Celulose utilizada é classificada
como sendo de porosidade mediana (Souza, 1993), dessa forma foi utilizado o valor de O. 75
para a porosidade da resina (sp). Quanto a tortuosidade ('t ) foi utilizado o valor típico de
3.0 (Forment e Bischoff, 1990). A tabela 1 apresenta os dados utilizados para resolver o
modelo de adsorção proposto:
b 1 1 D d til. d Ta e a - a os u IZa os para o ajuste d d 1 d d orno e o e a sorção. Presma = 614 (kg/ m3l !l = 1.1 x 10·3 (kg/ ms) Págua = I 000 (kg/ m 3) MA= 65.000 daltons t.p =386 (kg/ m3 T=298K
I qm = 519,751 (g/1 res) R=2 x 104 m Kd = 0,4795 (g/1)
Com os parêmetros Dej e Kr estimados, foi realizado o ajuste do modelo de
adsorção aos dados experimentais de Souza (1993). Dessa forma, através do método de
tentativa e erro foram obtidos os valores de Def e Kr que mais aproximam o modelo de
adosrção à curva experimental. O gráfico de ajuste bem como o perfil da concentração de
enzima no interior do sólido são apresentados nas figuras I e 2.
--Experimental -Simulação
··. . .
Tempo (min)
Figura 1. Cinética de adsorção da
dextrana-sacarase em DEAE-Ce1ulose:
comparação entre a curva obtida por
simulação e os dados experimentais.
153
"r-------------------------,
~ o.s
• c 02
g 8 OI
Tempo (min)
Í ------- Cbi2 Cbi1
------Cbi
-Cb
Figura 2. Perfis de concentração (g/1)
obtidos através da simulação da cinética
de adsorção de dextrana-sacarase em
DEAE-Celulose.
Conforme o gráfico apresentado na figura 1, os resultados obtidos via simulação são
bastante concordantes àqueles obtidos experimentalmente. Um ajuste melbor poderia ser
obtido se estivessem disponíveis uma maior quantidade de dados experimentais. Os valores
de kfe Derutilizados para obtenção dos dados acima são 8.74 x 10"6 m/s e 5.22 x 10"9 m2/s
respectivamente. A figura 2 evidencia a ocorrência de difusão no interior da partícula.
F oram ainda realizadas simulações com valores diferentes de D,r e Kf, com a
finalidade de se verificar a influência destes parâmetros na cinética de adsorção da
dextrana-sacarase em DEAE-Celulose. As figuras de 3 a 6 apresentam estes resultados.
P,-------------------------,
~os
~ 02
g
,. .. --"" ... --,l:i;:· I ::.·.~ ~::; I
"L,:i. .. :_/_-:,:-, --;;,.---;,;;-, -~~;.-,=-=c•:_:;,~o\J 8 01
Tempo(min)
Figura 3 - Perfis de concentração (g/1)
obtidos através da simulação da cinética
de adsorção de dextrana-sacarase em
DEAE-Celulose utilizando um valor de
Der 20% inferior ao utilizado para ajuste
dos dados experimentais.
".---------------------,
1-····CbO I
I, · · CM i' ------Cbi
,-Cb
Tempo (min)
Figura 5 - Perfis de concentração (g/1)
obtidos através da simulação da cinética
de adsorção de dextrana-sacarase em
DEAE-Celulose utilizando um valor de
Der 20% superior ao utilizado para ajuste
dos dados experimentais.
!54
P,------------------------,
~ 03
~ 0.2
li 8 0.1
_,/""', •. ···'"-~--,_.,·
;;:>7"
20 30
Tempo (min)
Figura 4 - Perfis de concentração (g/1)
obtidos através da simulação da cinética
de adsorção de dextrana-sacarase em
DEAE-Celulose utilizando um valor de kf 20% inferior ao utilizado para ajuste dos
dados experimentais.
",-------------------------, ,_,
20 so Tempo (min)
! -------- Cbi2 1
1 .... c•;, 1 I .. c•; I ~
Figura 6 - Perfis de concentração (g/1)
obtidos através da simulação da cinética
de adsorção de dextrana-sacarase em
DEAE-Celulose utilizando um valor de kf 20% superior ao utilizado para ajuste dos
dados experimentais.
De acordo com os gráficos apresentados nas figuras de 3 a 6, a alteração de Kf e Der
influi significativamente no tempo necessário para se atingir o equilíbrio de adsorção, tendo
sido notada pouca alteração nos valores obtidos para as concentrações de enzima.
155
Um dos pontos vitais da síntese enzimática de dextrana utilizando o processo CARE
modificado é a adsorção da enzima. Souza (1993) realizou estudos sobre a adsorção da
enzima em três tipos de resina (DEAE-Sephadex A-50; DEAE-Sephadex A-25 e DEAE -
Celulose). Das três resinas estudadas, foi escolhída para determinação experimental das
isotermas de adsorção da dextrana-sacarase, a resina DEAE-Celulose, por possibilitar a
dessorção da enzima na presença de NaCI em concentração mínima de 0.50 M.
Souza (1993) determinou experimentalmente as isotermas de adsorção, bem como
determinou os parâmetros da equação de Langmuir (qm, k1 e kz). Para promover a adsorção
da enzima, Souza (1993) reporta a utilização de uma solução tampão de acetato à
concentração de 0,2 m M. Equação de Langmuir:
dq -=kJC(qm-q)-k2 q dt
(1)
Curralero et ai. (1998) estudaram a influência da presença de NaCI na faixa de
concentrações de O a 0.5M. Neste trabalho, foi verificada que a presença de NaCI em pouco
afeta a contante k1. Entretanto, as constantes qm e k2 são fortemente dependentes da
concentração de NaCI, sendo válidas as seguintes equações:
qm = 18,7 exp( -11,78[NaCl 1 2 +3,30{ NaCl 1 +5,02) (2)
k = 2,52 + 6,18[NaCl1 2
0,122+[NaCl1 (3)
Sendo assim, existem duas determinações experimentais diferentes para a cinética
de adsorção da dextrana-sacarase em DEAE - Celulose. Simulando a adsorção através da
equação de Langmuir, podemos comparar o perfil de concentração da enzima livre
156 utilizando as constantes obtidas por Souza (1993) e por Curralero et al. (1998). Para a
simulação, foi utilizada a equação de Langmuir, dada pela equação (1 ). Foram utilizados
cinco tampões diferentes, que resultam em valores diferentes para as constantes k1; k2 e qm.
A tabela 1 apresenta as condições das simulações:
Tabela 1- Constantes da equação de Langmuir utilizadas na simulação da adsorção
de dextrana-sacarase em DEAE-Celulose (Souza, 1993) e Curralero et al. (1998).
A Souza (1993) 7,11 3,54 519,75!
Tampão de Acetato 0.2 mM
B Curralero et al. ( 1998) 2,22 3,84 2830
ausência de NaCI
c Curralero et a1.(1998) 2,22 5,00 3570
[NaCl J= 0,10 M
D ' Curralero et a1.(1998) 2,22 7,55 3090
[NaCl] = 0,25 M
E Curralero et al.(l998) 2,22 8,33 810
[NaCIJ = 0,50 M
E Curralero et al. (1998) 2,22 7,17 1922
[NaCl] = 0,37 M
E Curralero et al.(l998) 2,22 7,10 2312
I [NaCI] = 0,35 M
E I Curralero et a1 ( 1998) 2,22 7,26 1614 I [NaCl] = 0,40 M
O gráfico comparativo do perfil de concentração de enzima livre obtido com a
simulação da adsorção da dextrana-sacarase e DEAE-Celulose, utilizando os tampões da
tabela 1, é apresentado na figura I.
157
1.05,------------------, 1.00
095
0.90
0.85
o 10 15 20 30
Tempo (min)
Figura 1 - Gráfico comparativo da adsorção de dextrana-sacarase em DEAE-Celulose, segundo tabela 1.
Analisando-se o gráfico apresentado na figura 1, observa-se que somente para a
concentração salina de 0,50 M a quantidade de enzima adsorvida é menor que a obtida
quando se utiliza os dados experimentais se Souza (1993). Dessa forma, pode-se dizer que
existe uma faixa de concentração salina onde os resultados obtidos com a utilização das
constantes obtidas por Souza (1993) e por Curralero et ai. (1998) são bastante próximos.
Esta faixa ocorre para concentrações salinas entre 0,35 M e 0,40 M, tendo sido obtidos
resultados bastante próximos para a concentração salina de 0,37 M, como pode ser
observado na figura 6.2:
1.05,----------------..., 1.00
0.95
0.90
8 0.85
õ 0.80
0.75
0.70
Tempo (mín}
M , 0.35M I ·~-·0.40M
.
Figura 6.2 -Gráfico comparativo da adsorção de dextrana-sacarase em DEAE-Celulose.
158 De acordo com os perfis de enzima adsorvida, pode-se dizer que a presença de sal
até uma concentração salina de 0,30 M no tanque de adsorção não prejudicaria a adsorção
da enzima. Entretanto, foi observada alta adsorção enzimática em concentrações salinas
baixas, evidenciando a necessidade de manter a concentração salina elevada no tanque de
dessorção. Esse comportamento muito provavelmente se deve ao balanço iônico do
sistema, visto ser a DEAE-Celulose uma resina trocadora de íons.
Quanto a dessorção da enzima, não foi encontrado nenhum dado experimental. A
única informação disponivel é a concentração salina mínima em tomo de 0.50 M para que
haja dessorção. Entretanto nada se sabe sobre a cinética de dessorção. Dessa forma, a
dessorção foi considerada instantãnea nos sistemas estudados. De acordo com as hipóteses
de Langmuir, a dessorção depende somente da quantidade de enzima adsorvida, dessa
forma foi utilizado para a taxa de dessorção a seguinte equação:
(4)
159
O sucesso da utilização de uma rede neural está na escolha dos dados utilizados para
o treinamento da rede. Neste trabalho, os dados para treinamento da rede foram obtidos a
partir de constantes e equações de modelos, visto serem escassos os dados experimentais
disponíveis. Para conferir aplicabilidade à rede proposta, os dados experimentais não
devem ser ajustados a modelos conhecidos, pois não haveria sentido em se treinar uma rede
neural quando os modelos e suas respectivas constantes são conhecidos e fornecem bons
resultados. A obtenção de dados experimentais para treinamento da rede para predição da
taxa de reação enzimática pode ser realizada através da determinação do perfil de consumo
de substrato para várias concentrações de enzima e substrato. O número de dados irá
depender da disponibilidade em realizar os ensaios, comportamento da reação e aplicação
desejada para a rede.
Para utilização do modelo híbrido apresentado no Capítulo 6, foi utilizada uma rede
backpropagation. A rede foi treinada com um conjunto de 225 pares de entrada/saída, que
por motivos práticos não são apresentados. Os dados de entrada são a concentração de
substrato e enzima livre no tanque de dessorção.
Para o treinamento da rede, os pesos e biases foram inicializados randomicamente,
tendo sido utilizados a= 0.8 e TI= 0.3. Foi arbitrado um erro máximo de 1.5 x 10-5 Os
seguintes dados foram obtidos com o treinamento da rede:
Pesos da camada input para hidden W(1,1) -0.14350229 W(1,2) -6.169227 45 W(2,1) -3.02410651 W(2,2) 1.57652121
Tetas
TETI (1) 1.081825
TETI (2) -1.32933
TEH (1) 2.648885
160 Após o treinamento da rede, a mesma deve ser testada com o objetivo de verificar
se a rede está respondendo corretamente. Dessa forma, o conjunto de pares utilizados para o
teste da rede deve ser diferente daqueles utilizados para o treinamento da mesma. Para
testar a rede, foi utilizado o seguinte conjunto de pares de treinamento apresentado na
tabela 1.
Tabela 1. Dados utilizados para testar a rede
para predição da taxa de reação
4
5
6
7
8
9
o I
12
161
O sistema proposto não recebe alimentação de enzima. Dessa forma, a remoção
continua de enzima impede que o estado estacionário seja atingido. Entretanto, para o
tempo de processo utilizado nas simulações, as variações são quase imperceptíveis.
O tempo de operação do reator irá depender de alguns fatores não abordados neste
trabalho tais como, o tempo necessário para reativação da resina, cronograma para limpeza
e esterilização do sistema, e eventuais reposições enzimáticas. Dessa forma, foram
realizadas simulações para o sistema triplo estágio, com a finalidade de se determinar o
intervalo de tempo em que é possível operar o sistema sem a necessidade de reposição
enzimática, bem como a influência das vazões de alimentação na determinação desse
tempo. As condições operacionais para a estas simulações são apresentadas na tabela 1. Os
dados experimentais relativos a cinética de adsorção da enzima utilizados nesta simulação
são os obtidos por Curralero et a!. (1998).
Tabela 1 - Condições operacionais para o reator triplo estágio para um intervalo de tempo
de 10.000 horas.
100 150 o 250 75 1.0 200
100 70 o 250 75 1.5 200
* fração líquida= 0,5
Os resultados obtidos com as simulações da tabela 1, são apresentados nas figuras
de 1 a 4 . Observa-se que para um intervalo de tempo muito grande, ocorre a perda total da
enzima e consequentemente um acúmulo de substrato. Estes resultados sugerem que seja
realizada a alimentação de enzima no sistema. Entretanto, o sistema não pode operar
continuamente por um intervalo de tempo muito grande.
Devido ao fato da reação ser enzimática, há a necessidade de paradas para limpeza
ou reativação da enzima. No estudo de viabilidade, foram consideradas paradas semanais,
ou seja 168 horas de operação contínua.
'!2
Tempo (h)
Figura 1 - Quantidade total de enztma
retida no sistema .
Tempo (h)
Ap1 j
~Ap2!
162
Figura 2 - Consumo de substrato no
estágio de dessorção.
Os gráficos apresentados na figuras 3 e 4 apresentam o intervalo de tempo de 180
horas de operação contínua.
U VG4 '"' g lj
on
""'+--.~~~~~~~~~~~~ ' ·10 50 so 100 120
Tempo {h)
Figura 3 - Quantidade total de enzrma
retida no sistema .
\L_
<~Ap1i I~Ap2!
====== SO 100 :20 ''0 100 'SO
Tempo(h)
Figura 4 - Consumo de substrato no
estágio de dessorção.
De acordo com os gráficos das figuras 3 e 4 é possível a operação do sistema num
intervalo de tempo de 180 horas, sem que a perda enzimática seja superior a 80% (valor
considerado na estimativa econômica} Devido a alta quantidade de enzima retida no
sistema, não há acúmulo de substrato.
163
Os gráficos apresentados nas figuras evidenciam que apesar do sistema não entrar
em estado estacionário, há a possibilidade de operação contínua, em um determinado
intervalo de tempo. Este intervalo de tempo é definido em função da quantidade de enzima
retida no sistema e vazões de operação, visto que os resultados evidenciam que as vazões
de operação afetam a retenção enzimática e consequentemente o consumo de substrato.
Uma possibilidade para prolongar o intervalo de operação, sem paradas, seria a
alimentação de enzima, por pulso. Entretanto, primeiramente é necessário determinar o
ótimo tempo de operação contínua, que não é só função da retenção enzimática, mas
também da necessidade de limpeza e reativação e ou reposição da resina.
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