________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Introdução
Câncer: conceitos básicos
Câncer é o nome dado para um grupo de mais de uma centena de
doenças caracterizadas pela perda do mecanismo de controle que governa a
proliferação celular e a diferenciação, podendo ocorrer em diferentes células do
corpo. No caso de tumores sólidos, a proliferação descontrolada das células
forma tumores locais que podem comprimir ou invadir tecidos vizinhos normais.
Uma pequena população de células dentro do tumor pode ser descrita como
células-tronco. Elas mantêm a sua habilidade de sofrer repetidos ciclos de
proliferação, como também migrar a distantes partes do corpo, colonizando
vários órgãos, em um processo conhecido como metástase (American Cancer
Society, 2009).
O processo pelo qual células normais transformam-se progressivamente
em células malignas requer a ocorrência de mutações sequenciais que surgem
como consequência de um dano no DNA. Este pode ser resultado de um
processo endógeno, tal como erros na replicação do DNA, instabilidade química
intrínseca de certas bases de DNA ou ataques por radicais livres gerados
durante o metabolismo. Danos no DNA podem também surgir como resultado de
interações com agentes exógenos, tal como radiação ionizante, radiação
ultravioleta, carcinogênicos químicos e biológicos. As células normalmente
reparam estes danos, mas, por várias razões, erros ocorrem e alterações
permanentes no genoma são introduzidas. Algumas mutações ocorrem em
genes responsáveis pela manutenção da integridade do genoma, facilitando,
assim, a ocorrência de mutações adicionais (American Cancer Society, 2009).
Existem três tratamentos disponíveis para o câncer: cirurgia, radioterapia
e quimioterapia., embora existam tratamentos alternativos, como por exemplo,
o transplante de medula em mieloma múltiplos. Metade dos pacientes de câncer
não pode utilizar cirurgia nem radioterapia como alternativas de tratamento
devido às próprias características do tumor, como o tamanho, a localização e a
resistência à radioterapia, restando apenas à quimioterapia como opção de
tratamento. Entretanto, mesmo a quimioterapia apresenta dificuldades e a
maior delas é a resistência do câncer aos quimioterápicos utilizados atualmente
(American Cancer Society, 2009; ULLAH, 2008).
98
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosResistência a múltiplas drogas (MDR)
A resistência aos quimioterápicos é o maior obstáculo no sucesso de uma
terapia antineoplásica. Alguns tumores são intrinsecamente resistentes ao
tratamento, enquanto outros adquirem progressivamente resistência múltipla a
uma grande variedade de fármacos estruturalmente e funcionalmente não
relacionados, tais como a antraciclinas, alcaloides da Vinca, epipodofilotoxinas,
taxanos e actinomicina D (ULLAH, 2008; TEODORI et al., 2006). Os problemas
relacionados a essa resistência e o modo de superá-los ou mesmo explorá-los,
constituem uma área de grande interesse dos oncologistas e profissionais de
áreas afins (MOLNÁR et al., 2006).
Os oncologistas foram os primeiros a observarem que cânceres tratados
com várias drogas antineoplásicas tendem a desenvolver uma resistência
cruzada para agentes citotóxicos, eliminando, com isso, a possibilidade de curar
esses tumores com quimioterapia. Esta observação sugere que a resistência a
múltiplas drogas (MDR) é, em muitos casos, resultante de mudanças
hereditárias nas células cancerosas, causando alterações nos níveis de proteínas
específicas, ou proteínas mutantes, que permitem às células cancerosas
sobreviverem na presença de vários agentes citotóxicos diferentes.
As alterações genéticas que conferem resistência aos agentes neoplásicos
podem afetar o ciclo celular, a susceptibilidade das células a apoptose, a
captação e efluxo de drogas, a armazenagem intracelular das drogas ou o
reparo de danos induzidos pelas drogas (normalmente no DNA).
O mecanismo melhor estudado de MDR envolve a superexpressão de uma
bomba de efluxo de muitas drogas dependente de energia, conhecida como
transportador de muitas drogas ou P-glicoproteína (P-gp), atualmente
denominada ABCB1. Esta proteína pertence à super família de transportadores
ABC (ATP Binding Cassete) que contêm uma sequencia altamente conservada,
que é ligadora de ATP. A P-gp (figura 29) é uma proteína da membrana
plasmática de 170 –180 kDa e é codificada pelo gene MDR1 (ULLAH, 2008).
Atualmente, sabe-se que outras proteínas de membrana participam deste
mecanismo de resistência, tais como a MRP (Multidrug Resistance-Associated
Protein) e a BCRP (Breaster Cancer Resistance Protein).
99
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Figura 29: Desenho esquemático da P-gp (SORRENTINO, 2002)
Produtos naturais como fonte de medicamentos
Os produtos naturais têm desempenhado um importante papel no
tratamento de enfermidades, desde os tempos mais remotos da história da
humanidade. No início do século XX, 80 % dos medicamentos eram de origem
natural (raízes, folhas e cascas) ou eram inspirados em substâncias presentes
nestas partes vegetais. Atualmente, os produtos naturais continuam sendo uma
importante fonte de fármacos e protótipos, responsável por 60% dos
antitumorais e 75% antimicrobianos, por exemplo, (HARVEY, 2008). A tabela 14
abaixo mostra diferentes fármacos de origem natural que estão em diferentes
estágios de desenvolvimento.
Tabela14: Origem de fármacos baseados em produtos naturais em diferentes estágios de desenvolvimentoEstágio de desenvolvimento
Vegetal
Bacteriano
Fúngico
Animal Semi-sintético
Total
Pré-clínico 46 12 7 7 27 99Fase I 14 5 0 3 8 30Fase II 41 4 0 10 11 66Fase III 5 4 0 4 13 26Pré-registro 2 0 0 0 2 4Total 108 25 7 24 61 225
Sendo assim, pode-se concluir que os produtos naturais continuam
ocupando um relevante papel na descoberta de novos agentes terapêuticos.
Produtos naturais como fonte de agentes antitumorais
100
(HARVEY, 2008)
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosAs plantas têm sido uma importante fonte de agentes antitumorais para
uso clínico. Dentre estes, se podem citar a vimblastina, vincristina, camptotecina
e derivados, topotecano, irotecano, etoposideo e paclitaxel (figura 30) (CRAGG
et a.l, 2005).
Figuras 30 – Antitumorais de origem natural
101
VIMBLASTINA (R = CH3)VINCRISTINA (R = CHO)
TAXOL
IRINOTECANO CAMPTOTECINA
ETOPOSÍDEO TOPOTECANO
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosAtualmente, mais de 30 novas substâncias de origem natural
estão em diferentes fases de teste clínico no tratamento de diferentes
cânceres. Como exemplo, tem-se ixabepilona, romidepsina, ECO-4601 e
curcumina (figura 31) (GORDALIZA, 2007).
Figura 31- Novos antitumorais de origem natural
Desta forma, a busca de novos agentes antitumorais de origem natural
mostra-se viável e encorajadora, sendo este outro objetivo da presente
dissertação.
Flavonoides como agentes antitumorais
102
IXABEPILONA ROMIDEPSINA
ECO-4601 CURCUMINA
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Os flavonoides têm um largo espectro de atividades biológicas (Tabela
15). Um número significativo de flavonóides tem apresentado ação antitumoral
em vários modelos animais. Atualmente, existe um considerável interesse por
estas substâncias, devido aos seus efeitos benéficos nos diversos mecanismos
envolvidos na patogênese do câncer. As propriedades antioxidantes foram às
primeiras características estudadas nos flavonoides, em particular aquelas
relacionadas aos efeitos protetores contra doenças cardiovasculares (CAZAROLLI
et al., 2008).
Estas substâncias têm mostrado uma notável eficiência na eliminação de
radicais livres, que são agentes causadores de danos no DNA, os quais podem
acarretar a promoção de tumores. Vários flavonoides (quercetina e apigenina,
por exemplo) revelaram possuir ação antiinflamatória, atuando na inibição da
ciclooxigenase 2 (COX-2) e induzindo a óxido nítrico sintase. A inflamação
crônica desenvolve um importante papel na etiologia de diversos cânceres e
inibidores de COX-2 estão sendo estudados como agentes preventivos
(CAZAROLLI et al., 2008).
Outra característica que tem sido demonstrada para vários flavonoides é
a sua capacidade de inibir o crescimento de diversas linhagens de câncer
humano. Em tumores estrógenos-dependentes, este efeito inibitório tem sido
relacionado às propriedades antiestrogênicas de certos flavonoides
(isoflavonoides e quercetina, por exemplo). Em outros modelos in vitro, os
flavonoides têm também demonstrado afetar a sinalização celular e o ciclo
celular de progressão. Por exemplo, certos chás contendo flavonoides inibem o
sinal de transdução mediada pelo fator de crescimento epidermal e o fator de
crescimento plaquetário, favorecendo, assim, a inibição da angiogênese
(CAZAROLLI et al., 2008). Genisteína e quercetina inibem a tirosina quinase,
envolvida na proliferação celular. Finalmente, foi demonstrado que apigenina,
luteolina e quercetina causam apoptose por um mecanismo dependente de p-
53. Em síntese, múltiplos mecanismos antineoplásicos têm sido relacionados aos
flavonoides (CAZAROLLI et al., 2008).
Outro caso promissor é o flavopiridol (figura 4), uma flavona semi-
sintética análoga da rohitukina, uma substância antitumoral oriunda de uma
espécie vegetal indiana. Flavopiridol inibe quinases dependentes de ciclina
(CDKs), apresentando propriedade antitumoral inédita. É o primeiro inibidor de
CDKs a ser avaliado em testes clínicos em humanos pela Aventis Pharma e pelo
Instituto Nacional do Câncer (NCI) no tratamento de câncer. Testes iniciais com
103
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosinfusão de flavopiridol mostraram um efeito benéfico deste derivado em alguns
pacientes com linfoma non-Hodgkin’s, câncer de rins, de próstata, de cólon e
gástrico (REN et al, 2003).
Tabela 15: Flavonoides com atividade antitumoral em diferentes linhagens
celulares de câncer
Câncer Célula Flavonoide
Cancer oral humano
HSC-2, HSG, SCC-25
Flavavonas, isoflavanas, EGC, chalconas, EGCG, curcumina, genisteína, ECG, quercetina, cisplatina
Cancer de mama humano
MCF-7Flavavonas, daidzeína,genisteína, quercetina, luteolina
Cancer de tireóide humano
ARO, NPA, WROGenisteína, apigenina, kaempferol, crisina, luteolina, biochanina A
Cancer de fígado humano
SK-LU1, SW900, H441, H661, haGo-K-1, A549
Flavona, quercetina
Cancer de próstata humano
LNCaP, PC3, DU145
Catequina, epicatequina, quercetina, kaempferol, luteolina, genisteína, apigenina, miricetina, silimarina
Cancer de colo humano
Caco-2, HT-29, IEC-6, HCT-15
Flavona, quercetina, genisteína, antocianina
Leucemia humano
HL-60, K562, Jurkat
Apigenina, quercetina, miricetina, chalconas
Parte Experimental I
104
Figura 32 – Estrutura do flavopiridol
(REN et al. 2006)
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
O presente estudo foi realizado sob a orientação da Profa. Dra. Márcia A.
M. Capella no laboratório de Fisiologia Renal (Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho).
Células e condições de cultura
Células utilizadas
Neste estudo foram utilizadas as seguintes linhagens celulares:
Melan-A – melanócito murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz
Monteiro, Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ.
B16F10: melanoma murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz Monteiro.
K-562: leucemia humana, que não expressa o fenótipo MDR, e é sensível
ao quimioterápico vincristina (VCR). Cedido pela Profa. Vivian Rumjanek,
Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
K-562 – Lucena-1: leucemia humana, que possui o fenótipo MDR,
resistente à vincristina, Cedido pela Prof.a Vivian Rumjanek.
Reagentes e equipamentos
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino foram
obtidos da Invitrogen do Brasil (São Paulo, Brasil).
Kit de dosagem de desidrogenase láctica (DHL) adquirido da Doles
(Goiânia, Brasil).
Soluções
105
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos O meio de cultura de células (DMEM, baixa glicose) foi preparado em
água ultra pura (miliQ), sendo posteriormente filtrado através de membranas de
0,2 μm. Soro fetal bovino foi adicionado em concentração final de 10% na hora
do uso.
A solução salina com tampão fosfato PBS (NaCl 137 mM; Na2PO4 8,1 mM;
KH2PO4 1,5 mM; KCl 2,7 mM) foi preparada em água MiliQ e esterilizada em
autoclave.
Cultura de Células
Melan-A e B16 F10
As linhagens celulares Melan-A e B16F10 foram cultivadas em DMEM
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SBF) a 37°C. À Melan A era
adicionado 1 μl de PMA (miristato-acetato de forbol) a 10-6 M, um agente
mitógeno
As passagens foram realizadas a cada dois ou três dias ou assim que as
células atingissem a confluência. Para os procedimentos de subcultivo, retirava-
se o meio de cultura, sendo as células lavadas duas vezes com 5 ml de PBS
estéril para retirada de proteínas e células mortas. Em seguida adicionava-se 1
ml de tripsina 0,5g/l (diluída em PBS). Posteriormente, as células eram então
incubadas em estufa por cerca de 10 minutos, tempo suficiente para que as
células se soltassem da garrafa. O processo era então interrompido com adição
de um volume equivalente de meio de cultura com soro. Após dissociação
mecânica de quaisquer grumos de células remanescentes, aproximadamente
4/5 da suspensão de células era transferida para um tubo do tipo Falcon,
enquanto o restante era usado na manutenção da garrafa de cultura. As células
eram, então, contadas em microscópio invertido, com o uso de uma câmara de
Neubauer para que a quantidade apropriada de células fosse destinada à cultura
em placas, de acordo com o experimento planejado. As placas eram incubadas
na estufa de cultura.
K-562 e K-562–Lucena-1
106
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos As linhagens celulares K-562 e K562-Lucena-1 cresceram em suspensão
em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino em
garrafas plásticas de 50 ml na estufa a 37°C por três dias. Sendo que a linhagem
K-562-Lucena-1 era mantida na presença de VCR 60 nM.
Para os procedimentos de subcultivo, retirava-se o meio de cultura com
as células, colocando-os em um tubo tipo Falcon e centrifugando em seguida
para retirada de proteínas e células mortas. Após a centrifugação, descartava-se
o meio e ressuspendia-se as células em 4 ml de meio com soro. Após esse
procedimento, 3/4 desse volume era colocado em um tubo Falcon, enquanto o
restante era usado na manutenção da garrafa de cultura. As células eram,
então, contadas em microscópio invertido, conforme procedimento mencionado
para as linhagens B16F10 e Melan A.
Medida da Viabilidade Celular – Dosagem de LDH (lactato desidrogenase)
Para a avaliação da viabilidade celular, utilizou-se um ensaio que se
baseia na redução de um sal de tetrazólio (fenanzina metossulfato) e
conseqüente formação de formazana no meio em suspensão. O teste de LDH é
um marcador de membrana integra. A enzima desidrogenase láctica está
presente em todo o citoplasma celular, e quando a membrana é danificada há
um contato com o meio externo. Este teste detecta a presença da LDH no meio
indiretamente devido à reação de redução do sal de tetrazólio (fenanzina
metossulfato) que depende do LDH para que a reação ocorra. Esta enzima pode
ser detectada pela ação catalítica e indireta de conversão do sal de tetrazólio
em outro corante solúvel em água. Sendo assim, o LDH permite analisar o
numero total de células viáveis, isto correlacionado com a proliferação das
mesmas.
Após 24 horas de incubação com as frações a serem testadas, uma
alíquota de 50 µl de sobrenadante de cada poço foi retirada e colocada em outro
poço de outra placa de 96 poços. Em seguida, adicionava-se um volume de 100
µl em cada poço de uma solução de alumen férrico e substrato (lactato) na
proporção de 1:16, deixando, logo após, a placa na estufa a 37 °C por três
minutos. Posteriormente, adicionava-se aos poços um volume de 100 µl de uma
solução de fenanzina metosulfato (FMS) + NAD, na proporção de 1:20 em água,
e a seguir, colocava-se a placa na estufa de 37°C por nove minutos. Ao término
107
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosdeste tempo, procedia-se com a leitura da densidade ótica de cada poço em
leitor de ELISA (Benchmark, BioRad) no comprimento de onda de 510 nm.
Análise estatística
Excetuando os ensaios preliminares de citotoxicidade, os demais
experimentos foram analisados através do teste de análise de variância (one-
way ANOVA), usando intervalo de confiança de 95% e 99%. A magnitude das
diferenças foi verificada com os pós-testes de Dunnet.
Ensaios de CitotoxicidadeENSAIOS DE CITOTOXICIDADE
Determinação da faixa de concentração citotóxica
Objetivo
Com o objetivo de determinar a faixa de concentração em que as quatro
linhagens celulares apresentassem maior susceptibilidade às frações de acetato
de etila, KT1 e KT2, procedeu-se com o presente experimento, descrito abaixo.
Procedimento Experimental IA
As células foram cultivadas em placas de 96 poços (200µl/poço) em uma
concentração de 2x104 céls/poço e incubadas a 37ºC. Após 24 horas iniciaram-se
os experimentos.
As células foram tratadas inicialmente com as frações acetato de etila,
KT1 e KT2 nas concentrações de 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml. As frações KT1 e KT2,
como visto anteriormente, são oriundas da fração acetato de etila. Os
experimentos foram realizados com um n = 2, não sendo, por isso, realizados
testes estatísticos.
Resultados
108
AcOEt
KT1
KT2
Melan-A
AcOEt
KT1
KT2
B16F10
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Linhagens de melanoma e melanócito: B16F10 e Melan A
Neste experimento, as linhagens celulares utilizadas apresentaram
relevante sensibilidade frente às três frações testadas na concentração mais
elevada (0,1 mg/ml).
A fração de acetato de etila apresentou citotoxicidade praticamente
semelhante em ambas as linhagens (em torno de 40% de morte celular). Da
mesma forma, a fração KT1 apresentou citotoxicidade semelhante nas duas
linhagens (em torno de 45% de morte celular). Por último, a fração KT2
apresentou citotoxicidade ligeiramente maior na linhagem B16F10 (em torno de
40% de morte), mostrando-se mais susceptível que a Melan-A.
109
Figura 33: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre Melan-A. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.
AcOEt
KT1
KT2
AcOEt
KT1
KT2
K-562
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Linhagens leucêmicas: K-562 e Lucena
A análise dos experimentos referentes às linhagens leucêmicas K-562 e
Lucena permitiu averiguar que ambas apresentaram morte celular aparente
significativa na concentração mais elevada (0,1 mg/ml) em todas as frações
testadas.
A fração de acetato de etila foi mais tóxica para Lucena (em torno de
38% de morte celular). Já a fração KT1 apresentou alta toxicidade para K-562
(em torno de 60% de morte celular). Por fim, a fração KT2 foi mais tóxica para K-
562 (em torno de 40% de morte celular).
110
Figura 34: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre B16F10. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.
Figura 35: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre Lucena. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Conclusões parciais
Assim como nas linhagens estudadas anteriormente, os resultados
apresentados para estas linhagens favorecem a continuação dos ensaios, tendo
em vista a susceptibilidade das mesmas na concentração de 0,1 mg/ml. Uma
nova faixa de concentração mais ampla será estabelecida, devendo está
compreendida entre 0,01 a 0,1 mg/ml. Por meio desta será possível obter uma
curva de dose-resposta para cada linhagem, obtendo-se com isso, um perfil de
responsividade para cada fração testada, assim como um perfil de
susceptibilidade.
É importante ressaltar que a inexistência de um tratamento estatístico dos
dados obtidos nestes experimentos não invalida o perfil de susceptibilidade das
linhagens frente às frações testadas. Todavia, não serve para comparar os perfis
de susceptibilidade entre si, tendo em vista que em alguns casos os valores
ficaram próximos e podem sofrer desvios.
Curva de dose-resposta – Perfil de susceptibilidade
Objetivo
Com o objetivo de determinar a curva dose-resposta das frações KT1,
KT2 e do flavonóide KTA (corniculatusina 3-O-β-glucopiranosídeo), realizou-se o
experimento com as linhagens celulares utilizadas nas experimentações
anteriores, em uma faixa de concentração compreendida entre 0,01-0,1 mg/ml.
111
Figura 36: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre K-562. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em e triplicata.
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosOutro objetivo do ensaio foi determinar o perfil de susceptibilidade das linhagens
e compará-las entre si, ou seja, Lucena versus K-562 e B16F10 versus Melan A.
Procedimento Experimental IB
Baseando-se nos resultados obtidos previamente, trabalhou-se com as
seguintes concentrações: 0,01; 0,025; 0,05; 0,075 e 0,1 mg/ml.
As células foram cultivadas em placas de 96 poços (200 µl/poço) em uma
concentração de 2x104 células/poço e incubadas a 37ºC na estufa. Após 24
horas iniciaram-se os experimentos.
Estes experimentos foram realizados com um n representativo de 3 para
a Melan-A, K-562, Lucena e um n de 2 para a B16F10, devido a problemas de
ordem técnica, devendo ser complementado posteriormente. Sendo assim,
somente nos experimentos com a linhagem B16F10 não foram realizados os
testes estatísticos.
Resultados e Discussão
Os resultados obtidos a partir das diferentes frações testadas serão
apresentados a seguir, seguido de suas respectivas discussões.discussões.
112
Melan A – KT1
B16F10 – KT1
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosEnsaios realizados com a fração KT1
Linhagens de melanoma e melanócitos: B16F10 e Melan A
Resultados em Melan-A
Neste experimento constatou-se uma relação dose-resposta para a fração
KT1 na faixa de 0,01-0,1 mg/ml. Observaram-se crescentes taxas de morte
celular em concentrações crescentes. Na concentração mais elevada (0,1mg/ml)
obteve-se uma taxa de morte de aproximadamente 40%. Esta linhagem de
melanócitos murino, neste ensaio, atua como grupo controle de células sadias e
normais.
Resultados em melanoma B16F10
Com a linhagem B16F10 (melanoma murino), observou-se para a fração
KT1 uma resposta semelhante à observada no experimento com a Melan A. As
crescentes concentrações foram acompanhadas de crescentes taxas de morte
célula, sendo a maior observada em 0,1 mg/ml, em torno de 40%.
113
Figura 37 efeito da fração, KT1 sobre Melan A. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%.
K-562 – fração KT1
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Linhagens Leucêmicas: K-562 e Lucena
Resultados em linhagem leucêmica K-562
Neste experimento, a K-562 respondeu às crescentes concentrações de
KT1, alcançando na concentração de 0,1mg/ml uma taxa de morte de
aproximadamente 45%. Por meio deste ensaio averiguou-se a susceptibilidade
desta linhagem frente à fração testada.
.
Resultados em linhagem leucêmica Lucena
114
Figura 38: efeito da fração, KT1 sobre B16F10. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média.
Figura 39: efeito de KT1 sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
Lucena –fração KT1
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos O presente resultado confirma os resultados prévios obtidos com a
Lucena utilizando esta fração. Observa-se também neste ensaio um crescente
aumento da susceptibilidade celular em maiores concentrações de KT1,
chegando a um percentual de morte de aproximadamente 48% em 0,1 mg/ml.
Os bufadienolidos são esteróides cardioativos, conhecidos desde os
tempos mais remotos. Podem ser oriundos de fontes animais, tais como sapos
do gênero dos Bufonidae, como em plantas. No reino vegetal foram encontrados
em 6 familías: Crassulaceae, Hyacinthaceae, Iridaceae, Melianthaceae,
Ranunculaceae e Santalaceae (KRENN e KOPP, 1997).
Na famíla Crassulaceae estão presentes em diferentes espécies (STEYNE
et al., 2006). Até o momento, existem alguns estudos sobre as atividades
antitumorais de bufadienolidos. Na espécie Kalanchoe hybrida foram descritos
os bufadienolidos acetato de 3-bersaldegenina, acetato de 3-daigredorinenina,
assim como as kalanhibrinas A, B e C. Todos estes apresentaram atividade
citotóxica para as linhagens tumorais MCF-7, NCI-H460 e SF-268 (KUO et al.,
2008). Outros relatos mostram a ação citotóxica de kalanchosidos A, B e C,
oriundos de Kalanchoe gracilis para as linhagens celulares: KB (carcinoma
humano epidermóide), A-549 (câncer de pulmão), 1A9 (câncer de ovário), PC-3
(câncer de próstata) (WU et al., 2006).
Em relação aos bufadienolidos presentes em K. tubiflora, existem relatos
na literatura de citotoxicidade da briofilina A, também denominada briotoxina C
115
Figura 40: efeito da subfração, KT1 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
B16F10 – KT2
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos(YAMAGISHI et al., 1988) frente às linhagens de células tumorais KB, A-549
(adenocarcinoma humano de pulmão), HCT-8 (carcinoma de cólon humano), P-
388 (leucemia linfocítica de murinos) e L-1210 (leucemia de ratos) e com
briofilina B (YAMAGISHI et al., 1989) frente à linhagem KB.
Os resultados apresentados no presente trabalho evidenciam a
citotoxicidade da fração KT1 (rica em bufadienolidos) para todas as linhagens
testadas, inclusive em células sadias como Melan-A. Até o presente momento
não existem relatos de estudos destes bufadienolidos com estas linhagens
celulares na literatura.
Estudos de estrutura-atividade demonstram a importância do grupo orto-
acetato na atividade antitumoral contra a linhagem leucêmica P-388 e propõe
que os bufadienolidos exercem sua ação modulando reguladores do ciclo celular,
tais como a proteína cinase C (LIAL et al., 2009).
Por fim, frente ao exposto, os resultados obtidos são de grande
importância, para o conhecimento desta espécie e na bioprospecção de agentes
antitumorais.
As evidências de citotoxicidade destas substâncias frente estas linhagens
celulares, encorajam a continuação dos estudos, visando o isolamento dos
bufadienolidos e avaliação do seus respectivos perfis de citotoxicidade.
Ensaios realizados com a fração KT2
Linhagens de melanoma e melanócito: B16F10 e Melan-A
Resultados em melanoma B16F10
Neste ensaio pode-se observar uma gradual susceptibilidade da
linhagem frente a crescentes concentrações da fração KT2, chegando a uma
taxa de morte de aproximadamente 42 % na concentração de 0,1mg/ml.
116
Melan A – KT2
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Resultados em linhagem Melan-A
Os resultados obtidos neste estudo apontam para uma resposta linear de
Melan A frente a crescentes concentrações de KT2. Esta fração apresenta um
perfil de toxicidade nesta linhagem, alcançando um percentual de morte de 40%
na concentração mais elevada (0,1 mg/ml).
Linhagens leucêmicas: K-562 e Lucena
Resultados em linhagem leucêmica K-562
117
Figura 41: efeito da fração, KT2 sobre B16F10. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média.
Figura 42: efeito da fração, KT2 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
K-562 – KT2
Lucena – KT2
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos Neste ensaio pode-se observar uma responsividade linear em crescentes
concentrações de KT2. Na maior concentração (0,1mg/ml), observou-se uma
taxa de morte de aproximadamente 35%.
Resultados em linhagem leucêmica Lucena
Neste ensaio pode-se observar uma responsividade a KT2 aparentemente
maior que a observada para K-562. Observou-se também um comportamento
linear frente a crescentes concentrações de KT2, alcançando uma taxa de morte
de aproximadamente 42% na concentração mais alta (0,1mg/ml).
118
Figura 43: efeito da fração, KT2 sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
Em todos os resultados obtidos com as quatro linhagens, observou-se
ação citotóxica da fração KT2. No capítulo II, a análise de CLAE evidenciou a
presença de pelo menos 6 flavonóides nesta fração. Acredita-se que a ação
citotóxica observada pode está ocorrendo ou pela ação de um único flavonóoide
presente na mistura ou pela ação conjunta de dois ou mais flavonóides
(sinergismo).
Nos ensaios com as linhagens B16F10 e Melan A, a ação citotóxica foi
observada para ambas as linhagens. A Melan A foi utilizada como referencial de
células normais e sadias. Aparentemente, os resultados obtidos não são
promissores, visto a toxicidade observada. Entretanto, como KT2 é constituída
de uma mistura de flavonóoides, tornam-se necessários estudos posteriores com
os flavonóides isolados, a fim de descobrir a ação de cada um ou daqueles que
são majoritários. Desta forma, ainda são prematuros e inconclusivos os
resultados obtidos até aqui.
Na literatura são encontradas algumas citações de efeitos citotóxicos de
flavonóoides para a linhagem B16F10, como por exemplo: tangeretina, rutina
(um derivado diglicosilado do flavonol quercetina), e diosmina (CONESA et al.,
2005), luteolina, baicaleina e quercetina (YÁÑEZ et al., 2004), entre outros. Para
Melan-A existem menos relatos. Dentre os existentes, cita-se a ação dos
flavonóides
miricetina e baicaleina. O ácido fenólico – ácido gálico – também revelou
atividade citostática (MARTINEZ et al., 2006).
Os resultados obtidos com as linhagens leucêmicas são promissores,
pois para ambas as linhagens foram observadas susceptibilidade a KT2.
Constatou-se ainda, uma maior susceptibilidade da linhagem resistente a
múltiplas drogas (Lucena) quando comparada à linhagem não resistente (K-562).
119
Figura 44: efeito da fração KT2 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
K-562 – Flavonide KTA
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosOs resultados atuais encorajam o estudo e isolamento de flavonóoides desta
fração. Uma discussão mais aprofundada dos resultados com flavonóides será
feita mais adiante, ao final dos ensaios com o flavonóoide KTA.
Ensaios realizados com o flavonóoide KTA (Corniculatusina 3-O-β-glucopiranose)
Resultados e discussões
Linhagens leucêmicas K-562 e Lucena
Resultados em linhagem K-562
Neste ensaio observou-se o efeito citotóxico do flavonóoide KTA
(corniculatusina 3-O-β-glucopiranosídeol) sobre a linhagem K-562. Verificou-se a
responsividade desta linhagem a concentrações crescentes de KTA, mostrando-
se susceptível. Uma taxa de morte 37% é observada na concentração de 200
µM.
Resultados em linhagem Lucena
Neste ensaio pode-se observar linearidade na taxa de morte de Lucena ao
aumento da concentração do flavonóoide KTA, evidenciando a susceptibilidade
da mesma. Significativa taxa de morte celular (42%) foi observado na
120
Figura 45: efeito de KTA sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
Lucena – Flavonoide KTA
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosconcentração de 200 µM. Pode-se constatar também uma maior sensibilidade de
Lucena a KTA que K-562, igualmente observado para a fração KT2.
Resultados e discussões
Sobre o gênero Kalanchoe existem alguns estudos realizados com
enfoque em bioprospecção de agentes imunomoduladores. Os flavonóoides
testados apresentam em sua maioria ação inibitória sobre linfócitos, justificando
a ação imunossupressora observada em diferentes extratos de Kalanchoe
(COSTA et al., 2008).
Com relação às linhagens tumorais em estudo, existem alguns relatos na
literatura referente à ação citotóxica de diferentes flavonóides. Sobre as
linhagens leucêmicas existem alguns relatos da ação citotóxica. Os flavonóides
gossipina (BABU et al., 2003), tilirosídeo (SOUZA et al., 2002), genisteína
(CONSTANTINOU E HUBERMN, 1995). vitexicarpina (WANG et al., 2005),
apigenina, quercetina, miricetina, e chalconas (REN at al., 2003) mostraram
citotoxicidade frente à linhagem K-562.
Efeitos citotóxicos de flavonóoides frente à linhagem K-562-Lucena-1 não
foram relatados até o presente momento na literatura, segundo o levantamento
121
Figura 46: efeito de KTA sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. b – representa um intervalo de confiança de 95%.
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosbibliográfico realizado nas bases de dados disponíveis. Desta forma, o presente
trabalho é o primeiro com este enfoque.
Os resultados com KTA apresentados mostram que a linhagem resistente
a muitas drogas (Lucena) foi mais susceptível a linhagem K-562 - não possui
fenótipo de resistência - o que ressalta a importância desses resultados, tendo
em vista que a maioria das celulares tumorais desenvolve ou já demonstra
resistência a muitas drogas.
Fica evidente também que a citotoxicidade de KT2 (mistura de
flavonóides) e a de KTA estão muito próximas. Tal fato permite sugerir que
outros flavonóides presentes em KT2, além de KTA, atuam sinergicamente em
sua ação citotóxica.
Conforme foi dito no capítulo I, este é o primeiro relato do flavonóide KTA
para o gênero Kalanchoe e, até o momento, nenhuma atividade biológica foi
relatada na literatura. Em vista disso, os resultados apresentados são inéditos e
promissores, justificando estudos posteriores.
Futuramente, o flavonóide KTA será testado nas linhagens Melan-A e
B16F10, visto que estas linhagens se mostraram susceptíveis à fração KT2, da
qual se isolou KTA. Adicionalmente, experimentos complementares devem ser
realizados, para averiguar a toxicidade de KTA em células sadias, como
leucócitos, por exemplo,
Conclusão final
Os resultados apresentados confirmam a ação citotóxica da subfração
KT1 para as quatro linhagens estudadas, sendo o seu efeito justificado pela
presença de bufadienolidos - conhecidamente tóxicos (LEE, et al. 1989) -
discutida no capítulo I. Futuramente, esta fração será purificada, objetivando a
obtenção de bufadienolidos puros para que possam ser testados nas linhagens
tumorais utilizadas neste estudo e em outras também.
Os ensaios realizados com KT2 evidenciaram a sua ação citotóxica nas
quatro linhagens estudadas. Sabendo-se que diferentes constituintes
flavonoídicos estão presentes nesta subfração, acredita-se que a ação
observada seja resultado de um sinergismo dos flavonóides presentes na
mistura.
Os ensaios com o flavonóide KTA (corniculatusina 3-O-β-
glucopiranosídeo)l, oriundo de KT2, revelaram considerável citotoxicidade, o que
indica a sua participação na ação citotóxica observada para KT2.
122
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosEstudos posteriores devem ser realizados com linfócito humanos para
averiguar a sua toxicidade em células sadias. Ensaios com as linhagens Melan-A
e B16F10 serão realizados baseando-se nos resultados promissores obtidos com
KT2.
Por fim, é importante ressaltar a importância dos resultados inéditos
obtidos neste trabalho, os quais contribuem para uma melhor compreensão da
espécie Kalanchoe tubiflora, assim como para a bioprospecção de agentes
antitumorais.
Bibliografia
American Cancer Society, 2009.
123
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicoshttp://www.cancer.org/docroot/CRI/content/CRI_2_4_1x_What_Is_Cancer.asp?
sitearea. (09/02/09).
BABU, B. H.; JAYRAM, H. N.; NAIR, M. G.; AJAKUMAR, K. B.; PADIKKALA, J. Free
radical scavenging, antitumor and anticarcinogenic activity of gossypin. J.
Exp. Clin. Cancer Res. V. 22. 581-9. 2003.
CONSTANTINOU, A.; HUBERMAN. E. Genistein as na inducer of tumor cell
differentiation: possible mechanism of action. Proc. Soc. Exp. Biol Med.
V.208, p. 109-115. 1995.
CONESA, M.; ORTEGA, C.; GASCON, Y.; BAÑOS, A.; JORDANA, C.; GARCIA-
BENAVENTE, O. Treatment of metastatic melanoma B16F10 by the
flavonoids tangeretin, rutin, and diosmin. J Agric Food Chem. v.53, p.
6791-7. 2005.
CAZAROLLI, L. H.; ZANATTA, L.; ALBERTON, E. H.; FIGUEIREDO, M. S. R. B.;
FOLADOR, P.; DAMAZIO, R. G.; PIZZOLATTI, M. G.; SILVA, F. R. M. B.
Flavonoids: Prospective Drug Candidates. Mini-Reviews in Medicinal
Chemistry ,V. 8, 2008.
CRAGG, G. M.; NEWMAN. D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of
Ethnopharmacology, v. 100, p. 72–79, 2005.
GORDALIZA, M. Natural products as leads to anticancer drugs. Clin Transl Oncol,
v. 9, p. 767-776, 2007.
HARVEY, A. L. Natural product in drug discovery. Drug Discovery today, v.13, p.
19/20, 2008.
LEE, K. H.; CHANG, J. J.; YAN, X. Z.; HARUMA, M.; YAMAGISHI, T.Bryophyllin B, A
novel potent cytotoxic bufadienolide from Bryophyllum pinnatum. Journal
of Natural Products, v. 52. p. 1071-1079, 1989.
LIAO, S-G.; CHEN, H-D,; YEU, J-M. Plant Orthoesters. Chemical Revies. v. 109, p.
1092-1140. 2009.
124
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicos
MCKENZIE, R. A.; FRANKIE, F. P.; DUNSTER, P. J. The toxicy to cattle and
bufadienolide content of six Bryophyllum species. Australian Veterinary
Journal, v .64, p. 298-301, 1987.
MOLNAR, J.; GYÉMÁNT, N.; TANAKA, M.; HOHMANN, J.; BERGMANN-LEITNER, E.;
MOLNÁR, P.; DELI, J.; DIDIZIAPETRIS, R.; UMBELINO FERREIRA, M. J.
Inhibition of multidrug resistance of cancer cells by natural diterpenes,
triterpenes and carotenoids. Current Pharmaceutical Design, v. 12, p. 287-
311, 2006.
REN, W.; QIAO, Z.; WANG, H.; ZHU, L.; ZHANG, L. Flavonoids: Promising
Anticancer Agents. Medicinal Research Reviews, v. 23, p. 519-534, 2006.
SORRENTINO, B. P. Gene therapy to protect haematopoietic cells from cytotoxic
cancer drugs. Nature Reviews Cancer, v. 2, p. 431-441, 2002.
TEODORI, E.; DEI, S.; MARTELLI, C.; SCAPECCHI, S.; GUALTIERI, F. The functions
and structure of ABC transporters: implications for the design of new
inhibitors of Pgp and MRP1 to control multidrug resistance (MDR). Curr
Drug Targets, v. 7, p. 893-909, 2006.
ULLAH, M. F. Cancer Multidrug Resistance (MDR): A Major Impediment to
Effective Chemotherapy. Asian Pacific J Cancer Prev, v. 9: p. 1-6, 2008.
KREEN, L.; KOPP, B. Bufadienolides from animal and plant sources.
Phytochemistry.
v. 48, p. 1-29. 1998.
KUO. P-C.; KUO, T-H.; SU, C-R.; LIOU, M-J.; WU, T-S. Cytotoxic principles and α-
pyrone ring opening derivatives of bufadienolides from Kalanchoe hybrida.
Tetrahedron. v. 64, p. 3392-3396.
STEYN, P.; VAN HEERDEN, F. R. Bufadienolides of plant and animal origin. Natural
Product Reports, 1998.
125
________________________________________________________________ __Capítulo III
Ensaios biológicosWU, P-L.; HSU, Y-L.; WU, T-S.; BASTON, K. F.; LEE, KH. Organic Letters, v. 8, p.
5207-5210.
YAMAGISHI, T.; YAN, X-Z.; WU, R-Y, MCPHAIL, D.R.; MCPAHIL, A.T.; LEE K.H..
Structure and stereochemistry of bryophyllin-A, a novel potent cytotoxic
bufadienolide orthoacetate from Bryophyllum pinnatum. Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 36, 1615-1617. 1988.
YAMAGISHI, T.; HARUMA, M.; YAN, X-Z, CHANG J-J, LEE K-H.. Antitumor Agents,
110. 1,2 Bryophyllin B, a novel potent cytotoxic bufadienolide from
Bryophyllum pinnatum. Journal of Natural Products, v. 52, p.1071-1079.
1989.
YÁÑEZ, J.; VICENTE, V.; ALCARAZ, M.; CASTILLO, J.; BENAVENTE-GARCIA, O.;
CATEREAS, M.; TERUEL, J.A. Cytotoxicity and antiproliferative activities of
several phenolic compounds against three melanocyre cell lines:
relationship between structure and activity. Nutr. Cancer. v . 49, p. 191-9.
2004
126