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Biorreatores e
Processos Fermentativos
Aula 5 – Profa. Dra Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares
IFSC - USP
Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:
Processo “Upstream”
Biorreatores e biorreação
Processo “Downstream”
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Parte I
Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas
mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas ou
microrganismos, ou enzimas sobre condições controladas para a
biotransformação de matérias primas em produtos.
Produto – alimento, medicamento ou composto industrial
Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto
direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes
com ou sem subproduto ou derivados
Escala laboratorial Escala industrial
Estágios do processo produtivo
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Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos são os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores
Enzimas
Reatores enzimáticos ou
Bioquímicos
Células vivas
Biorreatores ou Reatores Biológicos
Biorreatores
Sistema não asséptico – onde não é absolutamente necessário
se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de
descarte de efluentes);
Sistema asséptico – onde as condições de assepsia são pré-
requisitos para a formação do produto com sucesso;
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Nem todo processo de fermentação precisa
ser livre de contaminações!!
Antigamente, a maceração das uvas era feita com os pés!!
Produção caseira dos vinhos
http://www.viagemesabor.com.br/noticias/roteiros/br/norte/para/marajo
Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de
contaminações!!
Queijo de leite de búfala
Tanque de maceração das uvas
Produção de vinhos
(Hoje: prensa hidráulica)
Quanto mais controle se tem sobre o processo de fermentação, maior é a
facilidade em se manter a qualidade e garantir a reprodução do processo.
Produção artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogurte e cerveja, muitas
vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condições
precárias de assepsia
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Chaim Weizmann e colaboradores, Inglaterra (1914-1918)
Início de FERMENTAÇÃO CONTROLADA
Processo submerso anaeróbio de produção de acetona-butanol
- grande escala com condições total de assepsia;
- condições estritas de anaerobiose (Clostridium
acetobutylicum);
Proteção contra aeróbios, mas não impedia a
contaminação por bacteriófagos!!
Dióxido de enxofre (conservante)
Hoje: prensa hidráulica
Maceração das uvas
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Biorreator ou fermentador
Biorreator ou fermentador
Variação em forma e tamanho dependendo da aplicação
O design do biorreator depende de um número de fatores que incluem:
-Tipo de células
-Tipo de reação metabólica
-Informação sobre a transferência de massa e calor
-Viscosidade e homogeneização
Tamanhos:
-Frascos agitados (erlenmeyers): 100 – 1.000 mL
-Fermentadores de bancada: 1 L – 30L
-Fermentadores piloto: 100 – 1.000 L
-Fermentadores industriais: 1.000 – 1.000.000 L
Também podem ser bandejas, garrafas (fermentação sólida), colunas
(imobilização células ou enzimas)
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Biorreator ou fermentador
1943 – EUA, Primeira planta industrial de fermentação para produção de
penicilina em fermentadores de aço-carbono de 54 m3
• Reatores em aço-carbono
• Sistemas de agitação e aeração
• Fundo e tampa torriesféricos esterilizáveis
• Entrada para a adição de inóculo
• Antiespumante
• Coleta de amostras
•Descarga e saída dos gases
formados durante a fermentação, etc.
Biorreator ou fermentador
Padrões de materiais usados nos fermentadores sofisticados:
Todos os materiais que estão em contato com as soluções ou com a
cultura do organismo devem ser resistentes à corrosão para prevenir a
contaminação do processo com traços de metais;
Não podem ser tóxicos pois se houver alguma dissolução do material
ou componente não haverá inibição do crescimento da cultura;
Materiais precisam suportar repetidas esterilizações por vapor em alta
pressão;
O sistema de agitação, portas de entrada e de saída devem ser rígidas
o suficiente para não deformar ou quebrar sob estresse mecânico;
Inspeção visual do meio e cultura é uma vantagem, por isso deve haver
materiais transparentes quando possível
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Biorreator ou fermentador
Sistema de agitação
Agitadores: turbinas
Sonda pH
Sonda oxigênio dissolvido
Camisa de resfriamento
Reator agitado
mecanicamente
(STR: stirred tank reactor)
• Tanque cilíndrico vertical;
• Agitado mecanicamente ou não;
• Provido de sistema de
aquecimento e resfriamento;
• Demais controles necessários
ao processo;
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Serpentinas
Estudo atual Aumento de escala 12 Kg 800 Kg
http://www.cetem.gov.br/publicacao/CTs/CT2005-084-00.pdf
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Capacidade dos biorreatores de escala
industrial
1- Pequena escala: 1 a 2 m3 de capacidade – cultivo de microrganismos
patogênicos, ou para crescimento de células animais ou vegetais. Em geral, seu
uso tem como objetivo produtos ligados à área de saúde
2 – Escala intermediária: dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 m3 –
especificamente empregado na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas.
3- Grande escala: reatores com milhares de metros cúbicos de capacidade -
para processos que exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de
assepsia: fermentação alcoólica ou do tratamento biológico de resíduos
1- O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos
dias, trabalhar sem problemas por longos períodos e
satisfazer todas as exigências legislativas de contenção
ambiental;
2- As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto a
aeração e agitação, devem ser plenamente satisfeitas,
mantendo porém a integridade física dos mesmos;
Função primária de fermentação
• fornecer condições ambientais adequadas ao crescimento
dos microrganismos
Para tanto, 12 pontos devem ser observados:
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6- Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação
do conteúdo do fermentador deve ser parte integrante do
equipamento.
3- A potência absorvida deve ser a menor possível;
4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar
disponível;
5- Um sistema de controle de pH deve estar disponível;
Para tanto, 12 pontos devem ser observados:
7- Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo;
8- Eficiente sistema de controle dos gases e saída do
fermentador devem estar disponíveis;
10 – O reator deve preencher, sempre que possível, a
característica de multi-propósito, contudo, a regulamentação
de contenção ambiental e a possibilidade de contaminações
cruzadas podem ser fatores limitantes
9 - O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua
operação, limpeza e manutenção;
Para tanto, 12 pontos devem ser observados:
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11- O reator deve ter as superfícies internas polidas e todas as
suas conexões, na medida do possível, devem ser soldadas
e não rosqueadas;
12- Na medida do possível, o reator deve manter uma
geometria similar à dos reatores menores ou maiores, a fim
de facilitar a ampliação de escala do processo.
Para tanto, 12 pontos devem ser observados:
Biorreator de bancada
http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930
Escala laboratorial ~1L
Biorreator ou fermentador
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Biorreator ou fermentador
Composição: Reatores de bancada
1. Reatores de vidro com fundo arredondado ou chato e tampa
superior de inox ligada ao corpo por uma flange. Diâmetro
máximo = 60 cm.
vidro borossilicato esterilizado em autoclave;
2. Reatores com corpo cilíndrico de vidro, com tampas superior
e inferior em aço inoxidável. Esterilizado in situ (10-20L).
http://www.ars-fla.com/Mainpages/Bio-Reactor/bioreactor.html
Biorreator ou fermentador
Composição: Reatores Pilotos e industriais
Volumes: 50 L a 500 m3
Analisar materiais quanto:
- Capacidade de resistir às pressões de esterilização
- Resistência à corrosão
- Toxicidade dos produtos resultante de uma eventual corrosão;
- Custo do material
Aço inoxidável 316 – considerado adequado
não resolve todos os problemas: produção de ácido cítrico
pH 1 ou pH 2 corrosão
Inox 317 com 3-4% de molibdênio
Classes de aço inox no Brasil segue American Iron and Steel Institute (AISI)
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Tipo de
aço Carbono Cromo Níquel Titânio Molibdênio
304 0,08 18-20 8-11 - -
304L 0,03 18-20 8-11 - -
321 0,08 17-19 9-12 ≥ 5 xC -
316 0,08 16-18 10-14 - 2-3
316L 0,03 16-18 10-14 - 2-3
Tabela 1. Composição de alguns tipos de aços inoxidáveis AISI. Composição nominal (%).
Fermentação com células animais corrosão dos metais pesados insuspeitáveis problemas
Biorreator ou fermentador
Composição: Reatores Pilotos e industriais
Outros materiais:
Cobre (cervejarias – resistência pelas leveduras chega a 30 ppm)
Alumínio – raramente utilizado pois reagentes podem atacá-lo;
Níquel – elevada resistência à corrosão;
Titânio – alto custo;
Vidro borossilicato – instalação de visores;
Plásticos – resistentes à corrosão, mas alguns não resistem
muito a solventes (polietileno, polipropileno, PVC rígido...)
Aço carbono – Ferro + carbono: utilizado nos primeiros reatores
empregados na produção de penicilina. Não é mais utilizado
devido à dificuldade de limpeza e contaminação do produto
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Fermentação microbiana: um sistema de três fases
1. Fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos.
Pode também possuir substrato imiscível em água;
2. Fase sólida: consiste nas células, substratos ou produtos insolúveis;
3. Fase gasosa: oxigênio, CO2
1 - Oxigênio 2 - Temperatura 3 - pH
Fatores importantes:
Entrada de Inóculo
meios/nutrientes anti-espumante
Sistema de aeração
Sistema de colheita
de amostras
Sistema de agitação
Sondas para determinação de
pH pO2
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
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1- Oxigênio
Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois
estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de
antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas
recombinantes (hormônios, insulina), etc.
Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou
aneróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento
biológico de águas residuárias têm em comum o aspecto de exigirem
um adequado dimensionamento do sistema de transferência de
oxigênio (fase gasosa fase líquida)
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
1- Oxigênio
(Tortora, Funke & Case, 2000)
Último elemento a aceitar elétrons
Permite:
- Armazenamento de energia – ATP;
- Reoxidação das coenzimas que participam
das reações de desidrogenação.
NADH
NADH
NADH
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Diagrams:
Prokaryotic Mariana Ruiz
Binary Fission, JW Schmidt6
Participam das reações de síntese de
moléculas levando à sobrevivência
das células e ao surgimento de novas
células no processo de proliferação da
biomassa microbiana, para a qual a
energia é fundamental.
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1- Oxigênio C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O
Para a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de O2
Glicose é bastante solúvel, já O2 é pouco solúvel em água.
A concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem
de 7 mg O2/L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à pressão de 1 atm
e a 35oC.
Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo
sistema de transferência de oxigênio
http://www.pptechnologygroup.com/cfd_engineering.htm
- Transferência entre fases gasosa e aquosa;
- Oxigênio dissolvido deve chegar às células;
- Oxigênio deve penetrar nas células;
- Oxigênio deve ser consumido na reação
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
1- Oxigênio Em reatores não aerados, o oxigênio é
transferido do espaço livre acima do
líquido.
A agitação quebra continuamente a
superfície do líquido e aumenta a área de
transferência.
O efeito da velocidade de agitação na
entrada do gás em um biorreator de 2 L :
300 rpm 450 rpm 750 rpm
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
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1- Oxigênio Chicanas/Baffles Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Análise computacional de dinâmica de fluxos
1- Oxigênio Chicanas, quebra vórtice ou “baffles”
Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio
Normalmente:
4 chicanas equidistantes
Largura: 10% do diâmetro do reator
Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do
fermentador para evitar zonas de estagnação
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
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1- Oxigênio Chicanas afastadas da parede do biorreator Evita zonas de estagnação
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Co
Co 1
t0 t1
Co
Concentração de Oxigênio dissolvida aumenta com a agitação
Con
cen
tração d
e O
2
Tempo
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1- Oxigênio
Quando a velocidade de agitação é:
Devagar rápida
Injetar ar esterilizado
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
•Bolhas não serão quebradas tendendo a subir direto para a superfície. Acumulam no eixo do agitador, coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio.
pequena
•as bolhas pequenas irão circular por todo o reator e terão o seu tempo de residência aumentado.
grande
kLa diminui com o
aumento do volume do
líquido
kLa aumenta com a
área superficial do
líquido
kLa é maior quando as
pequenas chicanas estão
presentes
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
1- Oxigênio
Métodos para aumentar a taxa de transferência de
oxigênio (kLa) no sistema:
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Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (kLa)
no sistema:
-Aumento da pressão;
-Aumento da concentração de O2 no ar inserido no reator;
-Aumento da agitação;
-Aumento do fluxo de ar;
-Redução de espumas e remoção de bolhas de ar da superfície.
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
• Meio de fermentação: meios ricos em proteínas tendem a
formar mais espuma. Muitas células produzem moléculas
tipo detergente (ácidos nucléicos e proteínas excretadas
após lise das células ou compostos lipídicos produzidos
durante o crescimento);
• Taxa de aeração e velocidade do agitador (, formação
de espuma);
Fatores que favorecem a formação de espuma:
Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma
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Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma
Formação excessiva de espuma pode:
1. Bloquear os filtros de saída de ar;
2. Aumentar a pressão do biorreator
O controle é feito com a adição de agentes antiespumantes baseados em
silicone ou óleos vegetais que desestabilizam a espuma pela redução
da tensão superficial.
ON-OFF. Uma parte fica no meio e a
outra acima do nível do líquido.
Quando a espuma atinge a superfície
do sensor que está em cima, existe a
produção de uma corrente elétrica
que é detectada pelo controlador,
resultando na ativação da bomba.
Fatores que auxiliam na diminuição da formação da espuma:
• O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma é formada
facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de
espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma
colapsar por causa do seu próprio peso;
Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma
• Temperatura do condensador: em reatores de laboratório, uma temperatura mais
baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta
quando ela se move de uma região mais quente para a região fria do
condensador, causando o colapso da espuma;
• Quebradores mecânicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha é
puxada para o agitador e colapsa por ação de forças mecânicas. Em pequenos
reatores de laboratório são utilizados quebradores ultrassônicos, que geram
vibrações de alta frequência responsáveis por quebrar as bolhas da espuma
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Fatores que alteram a aeração de uma cultura microbiana
Geometria do biorreator
Wi
Li
Di C
HL
DT
WB
Geralmente cilíndricos. São construídos em dimensões padrão publicadas pela
International Standards Organisation e British Standards Institution.
Reatores do tipo STR, em geral:
-Tanque cilíndrico
-Relação de altura:diâmetro (H:D)
2:1 ou 3:1
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Wi
Li
Di C
HL
DT
WB
Di = Diâmetro do impelidor (m) DT = Diâmetro do tanque (m)
HL = altura da coluna do líquido (m) C = distância do impelidor ao fundo do reator (m) Wi = altura da pá da turbina (m) WB = altura da chicana (m)
Esquema de tanque agitado por turbinas de pás planas, com indicação de dimensões importantes
na transmissão de potência ao líquido
Máxima potência com mais de um impelidor:
Di < Hi < 2Di
Hi = distância entre impelidores
Número de impelidores para uma máxima transferência de potência
> N˚Impelidores >
HL – Di
Di
HL – 2Di
Di
Geometria do biorreator
Razão Valores
Típicos OBS
Altura do líquido do reator e altura do reator Ht/Hl ~ 0,7 - 0,8 Depende do nível de espuma
produzido durante a fermentação
Altura do reator e diâmetro do tanque Ht/Dt ~ 1 - 2
Reatores europeus tendem a ser
mais altos que os projetados nos
EUA
Diâmetro do impelidor e diâmetro do tanque Da/Dt 1/3 – 1/2
Reatores com turb. Rushton são
geralmente 1/3 do diâmetro do
tanque. Os de fluxo axial são
maiores
Largura das chicanas e diâmetro do tanque Lb/Dt ~0,08 – 0,1 Geralmente 10% do diâmetro do
reator
Altura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor W/Da 0,2
Largura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor L/Da 0,25
Distância média entre o impelidor e a saída de gás e
altura da pá E/W 1
Geometria do biorreator
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Geometria do biorreator
Fluxos: Axial e Radial
Geometria do biorreator
Fluxo axial: o líquido é dirigido para
a base do reator, isto é, paralelo ao
eixo do agitador. São deficientes em
gerar turbulência e quebra das
bolhas de ar, o que os tornam
indesejáveis para cultivos aerados.
Algumas marcas comerciais: Impelidor Lightnin 320, Impelidor KPC – KROMA, Impelidor Pitched
Impelidor Lightnin
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Geometria do biorreator
No fluxo radial, o líquido é inicialmente
dirigido a parede do reator, isto é, ao
longo do raio do tanque. Não é tão
eficiente quanto o fluxo axial. Maior
quantidade de energia é necessária
para gerar o mesmo fluxo que o axial;
Algumas marcas comerciais: tipo
Arrowhead, de pás curvas, de pás retas
verticais, Impelidor Rushton, Impelidor
Smith.
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2- Temperatura
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Reação no Biorreator
Exotérmica
Endotérmica
Equipamentos devem ter
sistema de transferência
de temperatura.
podem aquecer o sistema e também podem
ser úteis para esterilização do biorreator
antes do início do processo da fermentação;
Sistema de circulação
de vapor e água quente
2- Temperatura
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Para o resfriamento de culturas, por
onde pode passar água, por exemplo,
com temperaturas menores
Camisa (Jacket) ou
serpentina de resfriamento
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2- Temperatura
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
Camisas são cada vez menos utilizadas – reduzida eficiência na
transferência de calor pela circulação irregular do vapor ou da
água de refrigeração;
Serpentinas internas permitem boa troca térmica e eficiente
circulação do fluido em alta velocidade
Inconvenientes:
a) Reduzem significativamente o volume útil do fermentador;
b) Dificultam a limpeza interna;
c) Dificultam a mistura eficiente do meio em fermentadores
agitados mecanicamente;
d) Podem ser um foco adicional de contaminação por defeito nas
soldas difíceis de detectar.
Serpentinas
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3- pH
No biorreator deve haver um sistema de determinação de pH
assim como uma entrada para balancear a reação com
ácido/base que não ofereça nenhum risco de contaminação
para o sistema.
Temperatura e pH também ficam mais homogêneos com a agitação
Fatores físico-químicos que devem ser
considerados em uma fermentação industrial
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Importância da agitação e mistura
Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases: 1- Dispersão do ar no meio de cultivo 2- Homogeneização para igualar a temperatura, pH e concentração de nutrientes 3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos 4- Dispersão de líquidos imiscíveis
Importância da agitação e mistura
Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento?
CUIDADO!!
Agitação excessiva pode romper as células e
aumentar a temperatura o que ocasiona uma
redução na viabilidade celular!!
Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade
de mistura do meio evitando-se o dano celular.
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1. Sistema de agitação;
2. Sistema de distribuição de O2;
3. Sistema de controle de espuma;
4. Sistema de controle de temperatura;
Características básicas de biorreatores
5. Sistema de controle de pH;
6. Portas de amostragem;
7. Sistema de limpeza e esterilização;
8. Linhas para esvaziar o biorreator.
Bibliografia
Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8 e 20 Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, 2004. Cap. 4
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