UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA
Faculdade de Medicina Veterinria
AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL
ANA CARINA FERNANDES FERREIRA
CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira
ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira
2008
LISBOA
UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA
Faculdade de Medicina Veterinria
AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL
ANA CARINA FERNANDES FERREIRA
DISSERTAO DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA
CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira
ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira
2008
LISBOA
iii
Dedicatria
A
todos aqueles que sempre acreditaram em mim...
iv
v
Agradecimentos Gostaria de agradecer minha orientadora, Professora Marlia Ferreira, todo o empenho, apoio, carinho e ateno que me deu ao longo deste projecto. Existem professores que marcam geraes, mas tambm existem aqueles que nos marcam para a vida! Ao Professor Antnio Barreto pelo seu contributo para a realizao deste estgio. Professora Maria Joo Fraqueza pelos seus ensinamentos. Lena, Zzinha e D. Maria pela forma carinhosa e familiar como me acolheram no laboratrio, por todo o que aprendi com elas, o meu muito obrigado! Na indstria, gostaria de agradecer o carinho com que fui acolhida bem como os ensinamentos transmitidos, ao Dr. Armindo Loureno, Dra. Rosrio Barata, Eng. Ftima Fernandes, ao Sr. Rui Oliveira, e ao Eng. Paulo Almeida, e de uma forma especial Eng. Paula Ferreira, pelo seu carinho e amizade. Gostaria igualmente de agradecer a todas as pessoas que trabalham na sala de fatiados, em especial D. Ermelinda, pela sua disponibilidade e ajuda na realizao deste projecto. Ao Azores Team, sinnimo do incio, meio e fim desta longa caminhada que foi o nosso curso, a vossa amizade permanecer para sempre, Ana Catarina Bastos, Joanna Franco, Mariana Messias e Patrcia Simes. Ao quase Aoriano Gonalo Antunes, obrigado pela enorme pacincia demonstrada, no fcil lidar com tanta Aoriana junta! A todos os meus colegas, de turma e de ano, que comigo se cruzaram ao longo destes seis anos, o meu muito obrigado. Com receio de me esquecer de algum no citarei nomes! A todos os meus amigos... sabe bem saber que esto sempre l! Aos meus pais, Lcia e Antnio, um muito obrigado ser muito pouco para lhes agradecer tudo o que fizeram por mim! Sem eles as etapas difceis no tinham sido ultrapassadas e esta longa caminhada no tinha chegado ao fim! Muito Obrigado! Ao meu irmo, Paulo, companheiro de todas as horas, um importante pilar da minha vida, e minha cunhada Ana, o meu agradecimento por estarem sempre presentes. Aos meus avs maternos, Felcia e Henrique, e a toda a minha famlia, peas muito importantes na minha vida, um obrigado muito especial. Ao meu namorado, Steven, obrigado pela pacincia, apoio, carinho, suporte e acima de tudo amizade. Apesar de longe nunca deixaste de estar presente... Muito Obrigado! Meno de apoio Este projecto foi totalmente financiado pela indstria de produtos alimentares onde decorreu.
vi
vii
Avaliao de uma metodologia de ATPmetria na monitorizao da higiene fabril
Resumo
Nas ltimas dcadas tem-se assistido a uma grande evoluo, quer nos mtodos de
produo dos alimentos, quer nos controlos necessrios para garantir a produo de
alimentos seguros.
Tornou-se necessrio aplicar mtodos mais rpidos do que os da microbiologia
clssica de forma a verificar a eficcia dos planos de higienizao das indstrias
alimentares, no momento exactamente anterior ao incio de fabrico, de forma a que as
superfcies que contactam directamente com os alimentos possam ser novamente
higienizadas, caso seja detectada uma situao no conforme.
De forma a implementar um mtodo expedito que permitisse avaliar a higienizao
efectuada em equipamentos de uma indstria alimentar, neste estudo compararam-se
mtodos clssicos de deteco de microrganismos (aerbios totais a 30 C e
Enterobacteriaceae), com mtodos ditos rpidos, designadamente deteco de ATP por
bioluminescncia e deteco de protena.
O estudo decorreu na sala de fatiados, na lmina e no tapete de duas das trs
mquinas presentes. As colheitas para os 3 testes foram realizadas em simultneo, aps
higienizao, sob as mesmas condies. Registou-se, igualmente, a observao visual das
superfcies onde se realizaram as colheitas.
Os resultados dos testes estatsticos McNemar e coeficiente Kappa revelaram
respectivamente os valores p= 0,022 e kappa= 0,410 para a comparao entre aerbios
totais e ATP por bioluminescncia; p= 0,146 e kappa= 0,428 para a comparao entre
aerbios totais e deteco de protena; p= 0,581 e kappa= 0,398 para a comparao entre
ATP por bioluminescncia e deteco de protena.
Tendo em ateno os resultados estatsticos obtidos, as caractersticas desta
indstria e os objectivos pretendidos, verificou-se que o teste de protena no trazia
nenhuma mais-valia, pelo que a escolha recaiu sobre o teste de leitura de ATP por
bioluminescncia, como o mais adequado na monitorizao da higiene.
Palavras-chave: planos de higienizao, microbiologia clssica, deteco ATP por bioluminescncia e deteco de protena
viii
ix
Evaluation of a methodology based on ATP bioluminescence for food industry hygiene monitoring
Abstract
In the last decades there were relevant improvements on the methods used in food
production, as well as on the necessary controls to make it more safe.
It has became necessary to apply more rapid tests then the ones in use in classical
microbiology, to allow the verification of the efficacy of the hygiene plans on food industries
just before the beginning of the production, and guarantee the hygiene conditions of surfaces
in contact with food, and consequently providing an answer almost at real time.
In the present work, in order to implement a more expedite method that could enable
the evaluation of hygiene conditions in food equipments, different classical methods of
detection of microorganisms (total viable counts and Enterobacteriaceae) and rapid
methods, such as ATP bioluminescence and protein detection assay, were compared. The study was developed in the slided room, on the conveyor belt and on the blades
of two slicer machines, using three different testes. The samples were collected
simultaneously, after hygiene procedures, under the same conditions. Data on visual
observations of the contact surfaces where samples were taken, were also registered.
The results of statistic tests, McNemar and Kappa coefficient showed respectively the
value p= 0,022 and kappa= 0,410 for comparation between total viable counts and ATP
bioluminescence; p= 0,146 and kappa= 0,428 for comparation total viable counts and protein
detection; p= 0,581 and kappa= 0,398 for comparation ATP bioluminescence and protein
detection.
Considering the results of the statistic tests, characteristics of the industry, and the
proposed aims, we concluded that the protein test assay doesnt show advantages,
becoming evident that the ATP bioluminescence is more suitable, for the purpose of hygiene
monitoring.
Key-words: hygiene procedures, classical microbiology, ATP bioluminescence and protein detection.
x
xi
ndice
Dedicatria ______________________________________________________________ iii Agradecimentos__________________________________________________________ v Meno de apoio _________________________________________________________ v Resumo________________________________________________________________ vii Abstract ________________________________________________________________ ix ndice __________________________________________________________________ xi ndice de figuras ________________________________________________________ xiii ndice de tabelas ________________________________________________________ xiv Lista de abreviaturas_____________________________________________________ xiv Introduo ______________________________________________________________ 1 1. Reviso Bibliogrfica ___________________________________________________ 3
1.1 Higienizao/Plano de higienizao ____________________________________________ 3 1.1.1 Programa de higienizao ___________________________________________________________5
1.1.1.1 Tipos de sujidade _______________________________________________________________________5 1.1.1.2 As superfcies __________________________________________________________________________6 1.1.1.3 A gua ________________________________________________________________________________7 1.1.1.4 Mtodos de higienizao __________________________________________________________________7 1.1.1.5 Detergentes e desinfectantes ______________________________________________________________8
1.1.2 Higiene Pessoal __________________________________________________________________11 1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza ________________________________________________12
1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos___________________________________________ 12 1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae _____________13
1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia ________________________________ 16
1.4 Mtodos de deteco de protena e de acares, fosfatos e hidratos de carbono _____ 21
2. Materiais e Mtodos ___________________________________________________ 25
2.1 Meios de Cultura___________________________________________________________ 28
2.2 Preparao da soluo de diluio____________________________________________ 28
2.3 Esterilizao ______________________________________________________________ 28
2.4 Anlises microbiolgicas____________________________________________________ 28 2.4.1 Colheita e preparao de amostras ___________________________________________________28 2.4.2 Contagem de microrganismos a 30 C ________________________________________________29 2.4.3 Contagem de Enterobacteriaceae ____________________________________________________29
2.5 Mtodos rpidos ___________________________________________________________ 29 2.5.1 Colheita de amostras ______________________________________________________________29 2.5.2 Material utilizado no teste de ATP ____________________________________________________29 2.5.3 Leitura do ATP por bioluminescncia__________________________________________________30 2.5.4 Material utilizado no teste de deteco de protena_______________________________________30 2.5.5 Leitura das zaragatoas de PRO-Clean ________________________________________________31
2.6 Anlise estatstica _________________________________________________________ 31
xii
3. Resultados____________________________________________________________ 33 3.1 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C____________________________ 33
3.2 Contagem de Enterobacteriaceae _____________________________________________ 35
3.3 Deteco de ATP por bioluminescncia________________________________________ 38
3.4 Visualizao da deteco de protena _________________________________________ 40
3.5 Registo da observao visual ________________________________________________ 42
4. Discusso ____________________________________________________________ 47 5. Concluses ___________________________________________________________ 57 Bibliografia _____________________________________________________________ 59 Anexos_________________________________________________________________ 63
xiii
ndice de figuras Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia.____________________________ 18 Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena. ________________________________ 22 Figura 3 Lmina de ao inoxidvel de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ____ 27 Figura 4 Tapete de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ___________________27 Figura 5 Lmina da fatiadora e placas de delimitao das superfcies de colheita de amostras.__ 27 Figura 6 Tapete transportador com placas, para delimitao das superfcies de colheita de amostras. ______________________________________________________________________ 27 Figura 7 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia e respectiva zaragatoa descartvel Ultrasnap. ____________________________________________________ 30 Figura 8 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia, preparado para efectuar medio. ________________________________________________________________ 30 Figura 9 Zaragatoa PRO-Clean. ___________________________________________________ 31 Figura 10 Zaragatoas PRO-Clean, aps colheita das amostras de superfcies com diferentes quantidades de protena. __________________________________________________________ 31 Figura 11 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 12 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 13 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ______________________________________________________________________ 35 Figura 14 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas._______________________________________________________________________ 35 Figura 15 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. _______ 36 Figura 16 Contagem de Enterobacteriaceae na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 17 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 18 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas.____ 38 Figura 19 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ____ 39 Figura 20 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ___ 39 Figura 21 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. ____ 40 Figura 22 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios na lmina da mquina 1. _____________________________________________________________ 40 Figura 23 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios no tapete da mquina 1. _____________________________________________________________ 41 Figura 24 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, na lmina da mquina 3. _____________________________________________________________ 41 Figura 25 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, no tapete da mquina 3. _____________________________________________________________ 42 Figura 26 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 42 Figura 27 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 28 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 29 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 44 Figura 30 Anlise de concordncia entre os vrios testes, assim como da observao visual. ___ 45
xiv
ndice de tabelas
Tabela 1 Contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo.................................................................................................................................... 33 Tabela 2 Contagens de Enterobacteriaceae, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo. ..... 36 Tabela 3 Valores de ATP medidos por bioluminescncia, nas amostras recolhidas, nas duas mquinas de fatiar e nos dois locais em estudo.. ................................................................................. 38 Tabela 4 Resumo dos resultados dos testes estatsticos de McNemar e do Coeficiente Kappa ..... 46 Tabela 5 Colheitas no concordantes entre si nos 3 testes .............................................................. 52
Lista de abreviaturas
AOAC International Association of Official Analytical Chemistry International
ATP Adenosina trifosfato
BCA cido bicinchoninico
BPH Boas Prticas de Higiene
CDM Contagem directa ao microscpio
DNA cido desoxirribonucleico
HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point
NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotdeo
ISO International Organization for Standardization NASA National Aeronautics and Space Administration
NP Norma Portuguesa
PCC Ponto Crtico de Controlo
PPM Partes por milho
RLU Relative Light Units / Unidades Relativas de Luz
UFC Unidade Formadora de Colnia
1
Introduo
O meu estgio curricular do Mestrado Integrado em Medicina Veterinria foi realizado
na rea cientfica de Segurana Alimentar e teve a durao aproximada de 5 meses, com
uma mdia de 8 horas dirias. Decorreu no Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais
da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Tcnica de Lisboa e numa indstria
de transformao de produtos crneos.
No Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais, acompanhei as diversas
actividades do laboratrio de microbiologia alimentar. De salientar a participao em
anlises microbiolgicas a zaragatoas, para controlo e monitorizao de higiene, a produtos
alimentares de origem animal (peixe, carne de bovino e suno, doces variados e molhos) e a
guas. As anlises eram efectuadas a solicitao do exterior, no regime de prestao de
servios.
Estas anlises, efectuadas segundo as tcnicas descritas nas Normas especficas
portuguesas ou europeias em vigor, incluram a pesquisa e/ou contagem de alguns
microrganismos, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C,
Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, esporos de Clostrdeos sulfito
redutores, Salmonella spp, Listeria monocytogenes, fungos (bolores e leveduras) e Vibrio
spp.
As anlises de gua, de acordo com o estipulado no Decreto-lei n. 306/2007,
constaram da pesquisa de Enterococos e Escherichia coli em 100 ml.
Concomitantemente a essas tarefas, estive integrada num estudo solicitado por uma
empresa de carnes, no qual se pretendia avaliar as alteraes microbiolgicas e qumicas
sofridas pela carne de bovino desde o corte e embalagem at ao consumo final, quando
armazenada em atmosfera protectora e colocada nas prateleiras de um supermercado, nas
condies usuais de venda aos consumidores.
Acompanhei a colheita desses produtos quer no local de corte e embalagem, quer
nos supermercados, de acordo com o desenho experimental do estudo. No laboratrio,
realizaram-se anlises microbiolgicas, nomeadamente a pesquisa de bactrias cido
lcticas (ISO 15214:1998), Brochothrix (ISO 13722:1996), microrganismos aerbios totais a
30 C (NP 4405:2002) e Pseudomonas spp (ISO 13720:2000).
Na indstria de transformao de produtos crneos, com trs linhas de produo
(fatiados, pastas e cozidos), fui integrada no Departamento da Qualidade, acompanhando e
participando como estagiria nas tarefas a desenvolvidas. Entre outras tarefas, acompanhei
processos de fabrico nas diferentes linhas, verifiquei menes de rotulagem em embalagens
e latas e procedi a colheitas de produtos para anlise microbiolgica. A amostragem era
2
aleatria e realizada sobre os produtos produzidos ao longo da semana (em mdia 6
produtos por semana).
As determinaes microbiolgicas, incluram contagens de microrganismos aerbios
a 30 C (NP 4405:2002), Enterobacteriaceae (NP 4137:1991), bactrias cido lcticas (ISO
15214:1998), Staphylococcus aureus (NP 2260:1986), Escherichia coli e coliformes
(utilizando o meio RAPID`E.coli 2 Agar da Bio-Rad Laboratrios, aprovado pela AOAC
international Association of Official Analytical Chemistry International), alm de pesquisa
de esporos de clostrdeos sulfito redutores (NP 2262:1986).
Efectuava-se, ainda, a todas as matrias-primas recebidas na fbrica, a pesquisa de
Staphylococcus aureus.
Participei na apreciao das provas de estabilidade (provas de estufa) das conservas
alimentares realizadas na indstria (salsichas, pasta de fgado e de carne). De cada ciclo de
esterilizao eram retiradas, no mnimo, 3 latas, das quais uma era mantida temperatura
ambiente, uma a 35 C e outra a 55 C, durante 7 dias.
Aps a incubao, eram escolhidas 20 latas aleatoriamente, das mantidas
temperatura ambiente, para realizao das determinaes ponderais (pesagem do produto e
do excipiente quando presente). O resultado das determinaes ponderais, de acordo com
padres pr-definidos, determina a aprovao ou reprovao de todo o lote. As restantes
latas eram abertas para se verificar a integridade do produto, suas caractersticas
macroscpicas (cor, textura, superfcie e contagem das unidades) e do excipiente, quando
presente.
Observei os grficos de cada esterilizao (com meno temperatura e presso),
tendo especial ateno para os diferentes tipos de grficos, correspondentes a um tipo de
conserva, uma vez que existem programas pr-definidos que tm que ser respeitados para
que a esterilizao possa ser considerada vlida.
Para alm disso, procedi a um estudo que tinha em vista a escolha de um mtodo
dito rpido para monitorizar e verificar a aplicao dos planos de higiene numa sala de
fatiagem de produtos prontos a serem consumidos, uma vez que esta etapa considerada
um PCC (Ponto Crtico de Controlo) no plano HACCP (Hazard Analysis and Critical Control
Point). Para o efeito, compararam-se dois mtodos expeditos ditos rpidos, a saber, a
pesquisa de ATP (Adenosina trifosfato) por bioluminescncia e a deteco de protena, com
mtodos de microbiologia clssica, onde se fez a avaliao da presena de alguns dos
principais indicadores de higiene, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C e
Enterobacteriaceae.
O objectivo deste trabalho foi, ento, nas condies em presena, escolher o mtodo
expedito que mais se adequa monitorizao do PCC considerado.
3
1. Reviso Bibliogrfica
1.1 Higienizao/Plano de higienizao
A palavra higiene teve a sua origem na Grcia Antiga. Na mitologia grega, aparece
Asclepius, filho de Apollo, referido como o Deus da medicina e da cura, e sua irm Hygeia
ficou conhecida como a Deusa da cura, estando esse poder directamente relacionado com a
limpeza (Lelieveld, Mostert & Holah, 2005).
Hipcrates, um dos mais famosos mdicos da Grcia Antiga, conseguiu restabelecer
a sade de alguns dos seus pacientes atravs de dieta apropriada e higiene conveniente
(Lelieveld et al., 2005).
Alguns antropologistas defendem que o homem tem uma tendncia natural para
viver com higiene e num ambiente ordenado, evitando o consumo de alimentos sujos. E em
meados do sculo XIX, na Europa, o mdico hngaro Ignc Flp Semmelweis (estabeleceu
relao entre o decrscimo da febre puerperal e a higienizao conveniente das mos
aquando dos cuidados mdicos) e o cirurgio Joseph Lister (introduziu a asspsia na
cirurgia), introduziram na sociedade moderna, os cuidados higinicos (Lelieveld et al., 2005).
Desde ento, inmeros investigadores concentraram-se no estudo da higiene, de
uma maneira geral e de uma forma especfica na higiene alimentar, uma vez que muitos
alimentos podem funcionar como veculos transportadores e causadores de doenas.
Assim, introduziram-se as Boas Prticas de Higiene (BPH) na manipulao de alimentos ao
longo de toda a cadeia alimentar, de forma a garantir a segurana alimentar.
As BPH esto previstas na legislao nacional e internacional, e so muito
frequentemente consideradas pr-requisitos num sistema de segurana alimentar baseado
nos princpios do HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point), conceito que foi
introduzido por Bauman, no ano de 1970, e alterou os conceitos de segurana alimentar at
ento em vigor (Hawronskyj & Holah, 1997; Metaxopoulos, Kritikos & Drosinos, 2003).
Prevenir a contaminao dos alimentos, a chave de um sistema de segurana
alimentar. A contaminao ocorre, muitas vezes, devido proliferao indesejvel de
microrganismos, deficiente separao dos produtos crus e processados, ao inadequado
controlo de temperatura durante o processo de fabrico ou armazenamento, inadequada
higienizao ou a contaminao cruzada, especialmente por microrganismos patognicos
ou suas toxinas, em refeies prontas a consumir (Easter, 2003; WHO/FAO, 2003; Legnani,
Leoni, Berveglieri, Mirolo & lvaro, 2004).
O controlo higinico eficaz fundamental para evitar as consequncias nefastas para
a sade humana e para a economia das doenas e leses causadas por alimentos e
4
deteriorao de alimentos (WHO/FAO, 2003). Blankenfeld-Enkvist & Brnnback (2002),
defendem mesmo que os contaminantes microbiolgicos nos alimentos so um dos mais
importantes problemas no que se refere a custos econmicos.
A infeco instala-se quando h ingesto de alimentos contaminados com bactrias
patognicas viveis, cuja quantidade tem de ser suficiente para ultrapassar a barreira cida
do estmago; passada esta barreira, os microrganismos sobreviventes chegam ao intestino
delgado, onde se multiplicam e provocam o aparecimento de sintomas (Soares, 2007).
Todos os intervenientes, incluindo agricultores e criadores, fabricantes e
processadores, manipuladores de alimentos e consumidores, tm a responsabilidade de
garantir que os alimentos so seguros e adequados ao consumo (WHO/FAO, 2003). Os
consumidores esperam dispor de alimentos de alta qualidade, isentos de microrganismos
patognicos e toxinas, pelo que a adequada higienizao indispensvel, no podendo ser
substituda por nenhuma outra aco (Wildbrett, 2000).
Para garantir a correcta aplicao dos planos de higienizao, todas as tarefas
devem estar registadas em documentos devidamente arquivados, permitindo posterior
consulta, especialmente os desvios e aces correctivas implementadas (Baptista, 2003).
Efectuar de forma adequada o plano de higienizao tem uma importncia
econmica elevada. Os custos tm que ver com o tempo despendido e a mo-de-obra,
equipamento e consumveis utilizados e se a higienizao no for realizada da forma mais
correcta e eficaz, o custo inerente a estas aces poder ser muito superior ao benefcio
que delas advm (Easter, 2003).
A matria orgnica remanescente, derivada de resduos de alimentos ou
incrustaes, pode funcionar como suplemento nutricional que favorece a sobrevivncia e a
proliferao dos microrganismos, diminuindo a eficcia dos detergentes e desinfectantes
(Patel, 1994).
Muitas vezes, na indstria, existem as condies ideais para o desenvolvimento de
biofilmes em qualquer superfcie. Estes, podem demorar dias ou semanas para iniciar o seu
desenvolvimento, que ocorre quando os microrganismos se agregam nas superfcies e
segregam uma matriz extracelular protectora, constituda por polissacridos e
glicoprotenas. Remover um biofilme, recorrendo a limpeza e desinfeco, pode revelar-se
tarefa impossvel, pelo que extremamente importante, impedir a adeso e reduzir a
incidncia de agregao de microrganismos, principalmente os patognicos, a estas
superfcies (Jessen & Lammmert, 2003; Lelieveld et al., 2005). O design higinico dos
equipamentos e o Layout da planta, tambm so aspectos importantes na preveno e
controlo dos biofilmes (Forsythe, 2002).
Um plano de higienizao deve especificar as reas, equipamentos e utenslios a
serem limpos, a responsabilidade por tarefas especficas, o mtodo e a frequncia da
limpeza e as medidas de monitorizao. De forma clara e directa deve responder a
5
perguntas como: o que limpo, como limpo, quando limpo e quem limpa (WHO/FAO,
2003).
A limpeza deve ser feita das reas menos contaminadas para as mais contaminadas,
e a eliminao da sujidade deve ser efectiva, assim como a destruio ou a reduo de
microrganismos, at nveis considerados aceitveis e que no coloquem em risco a sade
dos consumidores e a qualidade do produto, nomeadamente os potencialmente patognicos
e os que provocam deteriorao dos alimentos (Noronha, n.d.).
Idealmente, o plano de higiene dever ser pensado logo quando se inicia o desenho
e a construo do edifcio e a escolha dos equipamentos, uma vez que a sua configurao
deve permitir a correcta manuteno, limpeza e desinfeco. A contaminao pelo ar deve
ser prevenida ou minimizada e deve verificar-se a existncia de proteco efectiva contra a
entrada e permanncia de pragas. O projecto das instalaes deve privilegiar o fluxo de
produtos das zonas mais contaminadas para as menos contaminadas, prevenindo desta
forma as recontaminaes. Todos os documentos inerentes construo devem ser
criteriosamente catalogados, validados e armazenados (Noronha & Baptista 2003; Lelieveld
et al., 2005).
Os estabelecimentos fabris devem estar afastados de reas ambientalmente
poludas e de actividades industriais que constituam risco grave de contaminao, de reas
sujeitas a inundaes, salvo se forem tomadas precaues suficientes, de reas com
especial predisposio infestao por pragas e de reas em que os resduos, lquidos ou
slidos, no possam ser eficazmente removidos (WHO/FAO, 2003).
1.1.1 Programa de higienizao
Para se realizar um programa de higienizao com sucesso, essencial conhecer a
natureza da sujidade que vai ser removida, o tipo de superfcies que vo ser higienizadas, a
qualidade da gua, os mtodos de higienizao mais adequados e utilizar agentes de
limpeza e desinfeco compatveis com a indstria alimentar. igualmente importante
escolher o mtodo mais indicado para avaliar e monitorizar a eficcia do processo
implementado, o que permitir no s detectar precocemente um problema mas, acima de
tudo, evitar a sua perpetuao.
1.1.1.1 Tipos de sujidade
Definir o tipo de sujidade um dos elementos mais importantes quando se pretende
implementar um plano de higiene, pois est intimamente relacionado com o mtodo e
6
detergente mais indicado para a sua remoo (Noronha, n.d.). Assim, quanto origem, a
sujidade pode classificar-se em animal, vegetal e mineral; quanto sua composio
qumica, em inorgnica, proveniente de resduos metlicos, alcalinos ou de gua dura, e
orgnica, resultante sobretudo de resduos de alimentos (Baptista, 2003).
Numa indstria de carnes, a sujidade orgnica , sem dvida, a que maiores
problemas causa; os resduos de gordura, protenas e hidratos de carbono, resultantes da
laborao, necessitam ser correctamente higienizadas para que sejam cumpridos os pr-
requisitos estabelecidos no Cdigo de Boas Prticas (Noronha, n.d.).
A gordura, insolvel em gua e em solues alcalinas e cidas, facilmente
removida na presena de agentes tensioactivos e com ajuda de temperatura (40 C a 60C);
as protenas so pouco solveis em gua, ligeiramente solveis em soluo alcalina, mas a
sua remoo relativamente fcil; os hidratos de carbono, solveis em gua, permitem
igualmente uma remoo relativamente fcil (Noronha, n.d.).
1.1.1.2 As superfcies
A escolha dos materiais utilizados na indstria deve ser cuidada, devendo optar-se
pelos materiais durveis, no porosos, que no apresentem facilmente corroso, estveis
temperatura e aos produtos qumicos neles utilizados, passveis de manter e limpar
(Noronha & Baptista, 2003; WHO/FAO, 2003).
O melhor material utilizado , sem dvida, o ao inoxidvel, devido s suas
propriedades qumicas. o mais resistente corroso, tem superfcie suave e impermevel,
fcil de limpar e resistente a altas temperaturas. Contudo, no totalmente incuo, porque
na sua superfcie facilmente se forma uma camada de xido de crmio, que rapidamente
destruda pelo contacto com o ar. Inadequadamente utilizam-se materiais abrasivos para a
remover, danificando irremediavelmente a superfcie (Jullien, Bnzech, Carpentier, Lebret
& Faille, 2003).
As superfcies de metal enferrujam devido a detergentes cidos ou com cloro; os
galvanizados previnem esse enferrujamento. Nas superfcies de borracha, deve optar-se
pelas no porosas ou esponjosas, e por utilizar detergentes alcalinos que no afectam a sua
estrutura, ao contrrio do que acontece quando se utilizam solventes orgnicos e cidos
fortes (Noronha, n.d.).
Superfcies de beto podem ser danificadas e fragmentar devido ao contacto com
alimentos cidos e agentes de limpeza. O vidro, quando utilizado, deve ser suave e
impermevel e para proceder sua limpeza deve recorrer-se a detergentes alcalinos suaves
ou neutros, que no alteram a sua estrutura (Noronha, n.d.).
A madeira est contra-indicada na indstria alimentar, uma vez que no possvel
realizar uma higienizao conveniente, porque a sua superfcie rugosa facilita a fixao dos
7
microrganismos, para alm do que absorve facilmente humidade, gorduras e leos
(Noronha, n.d.).
1.1.1.3 A gua
Quando se pretende por em prtica um plano de higienizao, um dos factores
determinantes a ter em conta a qualidade na gua, que deve ser prpria para consumo
humano (ausncia de odor, sabor, cor e sedimentos estranhos, salubre, limpa,
desejavelmente equilibrada na sua composio, livre de microrganismos e no corrosiva),
(Noronha, n.d.; Decreto Lei n 306/2007).
De acordo com o Decreto-Lei n 306/2007, a gua destinada ao consumo humano
fornecida por redes de distribuio, por fontanrios no ligados rede de distribuio, por
pontos de entrega, por camies ou navios-cisterna, por reservatrios no ligados rede de
distribuio ou utilizada numa indstria alimentar, deve ser analisada quanto a parmetros
microbiolgicos, parmetros qumicos e parmetros indicadores. igualmente neste
Decreto-Lei que se encontram estabelecidas as frequncias mnimas de amostragem e de
anlise para a realizao do controlo de qualidade da gua.
O abastecimento, armazenamento e distribuio de gua potvel, assim como o
controlo de temperatura, deve estar disponvel, de forma a garantir a segurana e a
adequao aos alimentos. A utilizao de gua no potvel est prevista na indstria, desde
que se destine exclusivamente a controlo de incndios, produo de vapor, refrigerao ou
aco semelhante que no contacte com os alimentos. Os sistemas de gua no potvel,
devem estar identificados para que no haja refluxo para os sistemas de gua potvel
(WHO/FAO, 2003).
Em alguns locais da indstria, dada a natureza das operaes a realizadas,
igualmente importante controlar a temperatura ambiente, de forma a garantir a segurana
dos alimentos. O inadequado controlo desta varivel uma das causas mais comuns das
doenas com origem nos alimentos.
1.1.1.4 Mtodos de higienizao
As prticas de higiene, devero ser realizadas de forma adequada, para garantir que
os microrganismos so removidos e inactivados durante a limpeza e desinfeco (Tompkin,
2004).
A limpeza pode recorrer utilizao combinada de mtodos fsicos, como o calor, a
frico, o fluxo turbulento, a limpeza a vcuo ou outros mtodos que evitem o uso de gua,
e mtodos qumicos utilizando detergentes e/ou desinfectantes (WHO/FAO, 2003).
8
Os mtodos e materiais de limpeza utilizados dependem da natureza da indstria
(processo de fabrico, tipo de produto, tipo de superfcies) e nvel de higiene requerido,
podendo ser efectuada apenas uma limpeza ou uma limpeza seguida de desinfeco.
Por vezes, por razes relacionadas com a economia de tempo e energia, h
interesse em limpar e desinfectar em simultneo (sanificao), todavia, em muitos casos,
esta operao conjunta levanta reservas, porque a sujidade que envolve os microrganismos
reduz a eficcia da desinfeco; para compensar a perda de eficcia provocada pela
sujidade, utilizam-se sempre quantidades mais elevadas de sanificador do que seria
necessrio para uma superfcie previamente limpa (Wildbrett, 2000).
O processo de higienizao inicia-se com o enxaguamento, para remoo de
partculas de sujidade e de alguns microrganismos pouco aderidos, seguindo-se lavagem
com a aplicao do detergente, que actua sobre as partculas de sujidade que se encontram
aderidas, diminuindo a sua ligao s superfcies; segue-se a fase de enxaguamento, para
remoo completa das partculas entretanto libertadas, do detergente aplicado e de alguns
microrganismos (Noronha, n.d.; Wildbrett, 2000; Cruz, Cenci & Maia, 2006).
Nos casos em que se realiza desinfeco, aplica-se ento o desinfectante que se
deixa actuar durante algum tempo; ocorre nesta fase uma reduo considervel do nmero
de microrganismos. Segue-se novo enxaguamento para remoo completa do
desinfectante, etapa dispensvel para alguns desinfectantes (Noronha, n.d.).
A desinfeco, no ser efectiva, sempre que algum dos passos anteriores do
processo de higienizao, no for eficazmente realizado (Lelieveld et al., 2005).
Por fim realiza-se a secagem, cuja principal finalidade a remoo de gua em
excesso, eliminando a humidade residual que poderia favorecer o crescimento de
microrganismos (Noronha, n.d.). Realiza-se recorrendo a ar seco ou qualquer outro material
disponvel como, por exemplo, papel descartvel, de forma a que a recontaminao seja
mnima (Lelieveld et al., 2005).
1.1.1.5 Detergentes e desinfectantes
Os detergentes utilizados nos processos de limpeza, devem obedecer a alguns
requisitos, como a dissoluo rpida e completa na gua, penetrao rpida na sujidade,
capacidade de condicionar ou neutralizar a dureza da gua, e de manter a sujidade em
suspenso, facilidade de enxaguar, biodegradvel e no txico. Agrupam-se em trs
classes, detergentes alcalinos, cidos e enzimticos (Noronha & Baptista, 2003).
Os detergentes alcalinos possuem pH entre 7 e 14; os altamente alcalinos, so
utilizados para a remoo de impurezas incrustadas ou queimadas, os moderadamente
alcalinos so eficientes na remoo de gorduras e os alcalinos suaves so vulgarmente
utilizados na limpeza manual de reas ligeiramente sujas.
9
Os detergentes cidos, removem os materiais que esto secos ou incrustados nas
superfcies e dissolvem os minerais. So especialmente eficazes na remoo de depsitos
formados pelos detergentes alcalinos.
Existem detergentes cidos orgnicos e inorgnicos. Os primeiros no corroem as
superfcies, so adequados para limpezas manuais e reduzem a dureza da gua. Os
inorgnicos so excelentes para remover e controlar depsitos minerais, mas bastante
corrosivos para as superfcies (Noronha, n.d.).
Os detergentes enzimticos constituem uma alternativa aceitvel, quando os
equipamentos no podem ser expostos a condies excessivamente cidas ou alcalinas,
uma vez que as enzimas actuam de forma especfica sobre a sujidade (Baptista, 2003).
Escolhido o detergente mais adequado, de acordo com as caractersticas da
indstria, fundamental seguir as recomendaes do fabricante sobre concentrao, tempo
e temperatura de utilizao; , tambm, importante a remoo prvia das sujidades, por
aco mecnica. A alterao de apenas um destes factores pode comprometer
irremediavelmente a eficcia do detergente (Langsrud, Sidhu, Heir & Holck, 2003).
A principal funo da desinfeco, reduzir o nmero de microrganismos viveis,
principalmente os patognicos, e prevenir o crescimento microbiano durante a produo;
especialmente importante em superfcies hmidas, onde as condies so mais favorveis
proliferao microbiana (Noronha, n.d.).
Actualmente o mercado disponibiliza trs tipos de desinfeco: por calor, por
radiao ou qumica.
A desinfeco por calor, um bom mtodo, actua sobre todos os microrganismos,
no corrosivo, contudo apresenta como principais limitaes a no aplicabilidade em
superfcies sensveis ao calor, bem como o seu elevado custo.
A desinfeco por radiao mais usada em hospitais e laboratrios; na indstria
alimentar os restos de alimentos e outras sujidades, absorvem a radiao e tm um efeito
protector dos microrganismos, o que, por si s, j uma grande desvantagem.
A desinfeco qumica , sem dvida a mais vulgarmente utilizada, contudo,
necessrio escolher o desinfectante mais apropriado de acordo com os microrganismos que
se pretendem eliminar; os mais utilizados so o cloro e compostos de cloro, compostos de
iodo e compostos de amnio quaternrio (Noronha, n.d.).
O cloro e compostos de cloro, so bons antibacterianos, contudo ineficientes na
presena de alguns produtos orgnicos; as solues muito concentradas podem ser
corrosivas para as ligas de alumnio. Dentro dos compostos de cloro, os mais utilizados so
os hipocloritos de clcio e sdio, cujo uso, nas concentraes adequadas, no alteram as
qualidades organolpticas dos produtos (Noronha, n.d.; Jessen & Lammmert, 2003).
Os compostos de iodo, podem combinar-se com agentes de limpeza cidos; as
solues preparadas devem ter concentraes entre 25-50 mg/l de iodo activo e pH inferior
10
a 4. O seu tempo de actuao bastante baixo, contudo este composto pode ser corrosivo,
o que implica a necessidade de enxaguamento abundante com gua limpa. Elimina um
largo espectro de bactrias, mas a presena de resduos alimentares e de sujidade inactiva-
o; apresenta cor amarela quando o iodo se mantm activo, e a alterao da cor significa a
inactividade do composto.
Os compostos de amnio quaternrio tm boa capacidade de higienizao, no so
txicos nem corrosivos, contudo tendem a permanecer nas superfcies, da a importncia de
enxaguar cuidadosamente com gua limpa. Devem ser usados em concentraes entre
200-1200 mg/l; se a gua de lavagem for dura, deve aumentar-se a concentrao, mas
nunca se pode misturar quaisquer detergentes ou agentes higienizantes aninicos
(Noronha, n.d.).
A escolha do desinfectante deve considerar o tempo de contacto, temperatura,
concentrao, pH, limpeza prvia e dureza da gua, os quais so factores importantes que
condicionam a sua eficcia (Cruz et al., 2006).
Ainda muito comum, na indstria, a realizao da limpeza manual, efectuada pelos
prprios manipuladores de alimentos. Devido grande heterogeneidade de resultados que
se podem obter, requerida uma cuidada monitorizao. Para auxiliar limpeza manual
pode recorrer-se a mangueiras com pistolas de gua, com tamanho adequado ao local a
higienizar, de forma a evitar quedas de presso ou disperso da sujidade, e a escovas,
preferencialmente de nylon, pois tm fibras resistentes, uniformes e no absorvem gua
(Noronha, n.d.).
O uso de raspadores est condicionado limpeza de zonas de dimenso reduzida e
os mecanismos abrasivos, vulgarmente conhecidos por palha-de-ao, esto restritos a
zonas que no contactem directamente com os alimentos.
Contudo, podem ainda utilizar-se outros mtodos, tais como imerso, alta presso
(recorrendo a bombas de gua de alta presso ou pistolas de vapor), espuma e gel (evita
aco mecnica e reduz custos de mo de obra), limpeza de equipamentos em circuitos
fechados (implica instalao de equipamentos especficos) e pulverizao, recorrendo a
nebulizantes e fumigantes ou a sistemas de asperso (Noronha, n.d.).
O equipamento utilizado na limpeza da rea de fabrico deve estar criteriosamente
identificado, para no ocorrer troca com o equipamento utilizado em reas de no produo;
deve ser manuseado com cuidado e de acordo com as instrues do fabricante, se for o
caso.
Aps higienizao, devem-se lavar, desinfectar e secar os utenslios e equipamentos
e armazen-los em lugar prprio. Os detergentes e desinfectantes devem ser colocados em
local fechado, longe dos gneros alimentcios, evitando o risco de contaminao (Noronha,
n.d.).
11
1.1.2 Higiene Pessoal
A roupa usada no exterior da fbrica, deve ser diferente da usada no interior da
mesma, principalmente nas zonas de processamento de alimentos. Idealmente cada
funcionrio deve possuir equipamento de proteco individual de cor clara, constitudo por
touca ou barrete, camisa, camisola ou bata, calas e calado apropriado. Eventualmente
avental, com bolsos abaixo do nvel da cintura, de forma que os objectos pessoais a
guardados que possam cair, vo directamente para o pavimento (Baptista & Saraiva, 2003).
As pessoas que entram em contacto directo ou indirecto com os alimentos, devem
manter um nvel adequado de limpeza pessoal, e comportamentos e modos de operao
adequados de forma a no contaminarem os alimentos por contaminao cruzada, quer
devido a infeces bacterianas, quer virais. Os operadores envolvidos no processo de
limpeza, devem receber formao em higiene pessoal e alimentar, para que sejam
prevenidas as contaminaes cruzadas dos alimentos, resultantes da disseminao da sua
flora corporal, principalmente as que resultam dos microrganismos com uma dose infectante
baixa, como seja a Escherichia coli O157 (WHO/FAO, 2003; Lelieveld et al., 2005).
As contaminaes cruzadas podem ocorrer de forma directa, quando o alimento
directamente contaminado a partir de outro alimento ou superfcie com que contacte e ainda
atravs do ar (Legnani et al., 2004). A contaminao indirecta envolve um processo bem
mais complexo, em que a contaminao ocorreu em um ou mais locais ao longo da cadeia
alimentar, tendo permanecido resduos nos tecidos (Lelieveld et al., 2005).
As reas de processamento devem ter acesso restrito ou controlado, podendo ser
necessrio lavar as mos ou desinfect-las antes da entrada nestas reas. O equipamento
de uso pessoal dever ser o mais apropriado e a sua utilizao exclusiva do local de
trabalho; dever apresentar-se limpo e ser trocado com frequncia, de forma a reduzir a
potencial de contaminao durante o processo laboral.
Os lavatrios para lavagem das mos devem estar equipados com gua quente e
fria. As mos devem ser higienizadas com sabo especfico, e a desinfeco realizada com
produtos adequados; devem ser secas com toalhas descartveis. O Staphilococus aureus,
constituinte comum da flora cutnea habitual pode continuar presente, mesmo tendo os
cuidados citados, pelo que pode ser aconselhvel o uso de luvas descartveis quando se
manipulam alimentos (WHO/FAO, 2003).
A lavagem das mos e da zona dos antebraos exposta, dever ocorrer
obrigatoriamente no incio da laborao, aps ida casa de banho, aps as refeies,
sempre que se manusear alimentos crus ou material contaminado, antes de se colocar ou
12
mudar de luvas e depois de se contactar com detergentes ou desinfectantes (Baptista &
Saraiva, 2003).
1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza
Optimizar e monitorizar, o programa de limpeza, reduz custos em material e tempo,
minimiza a contaminao ambiental, diminui as perdas por avarias e aumenta o tempo de
vida til dos produtos alimentares. Normalmente, a monitorizao avalia a presena de
resduos, recorrendo a inspeco visual e faz a avaliao microbiolgica, atravs do recurso
a tcnicas de microbiologia clssica ou a mtodos mais expeditos, como as placas de
contacto.
Por outro lado, pode recorrer-se utilizao de mtodos rpidos para monitorizao
do plano de limpeza, nomeadamente ATPmetria, que mede a quantidade de ATP presente
numa determinada superfcie, ou zaragatoas especficas que permitem detectar protena
(importante na indstria de carnes) ou lactose (indstrias de lacticnios).
De acordo com Baptista (2003), uma elevada percentagem de intoxicaes e
infeces alimentares, resulta da contaminao dos equipamentos, o que refora a noo
da importncia fundamental da higienizao, na indstria alimentar.
1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos
De acordo com Prescott, Harley, & Klein (2005), a microbiologia pode ser definida
como o estudo de organismos e agentes demasiado pequenos para serem claramente
vistos a olho nu.
Mesmo antes de os microrganismos poderem ser visualizados, alguns autores
suspeitavam da sua existncia e responsabilizavam-nos por doenas. Entre estes encontra-
se o filsofo romano Lucretius (98-55 A.C.) e o fsico Girolamo Fracastoro (1478-1553), que
sugeriram, cada um a seu tempo, que as doenas eram causadas por criaturas vivas
invisveis (Prescott et al., 2005).
Antony van Leeuwenhoek, um microscopista amador, foi o primeiro a observar e
descrever microrganismos, publicando os resultados das suas primeiras observaes de
bactrias e protozorios em 1677 (Ferreira & Sousa, 2000; Prescott et al., 2005).
Contudo, s no sculo XIX (1857), Louis Pasteur, demonstrou que a fermentao
cido lctica era produzida por microrganismos, iniciando desta forma a era moderna da
microbiologia alimentar (Prescott et al., 2005).
13
A anlise microbiolgica, designada clssica, tradicional ou convencional, remonta
aos anos de 1920-1930, contudo nessa poca no existia metodologia especfica.
Anteriormente a esta data, a nica forma de verificar se um local estava ou no
correctamente higienizado, seria recorrer inspeco visual, alis um mtodo ainda
bastante utilizado na indstria alimentar. Isoladamente no um bom mtodo, porque
apenas detecta os detritos maiores (Baptista, 2003), todavia associado com outros pode-se
revelar bastante til, por exemplo, quando combinado com luz ultravioleta, pode detectar
detritos de p ou de leo em stios pouco acessveis.
Actualmente, as tcnicas de anlise microbiolgica baseiam-se na colheita de
amostras e respectivo processamento em laboratrio, de acordo com mtodos descritos em
Normas Portuguesas (NP) ou Internacionais (EN, ISO, entre outros).
As amostras podem ser slidas, lquidas, de ar ou amostras de superfcies, e os
mtodos, solutos, meios de cultura e diluies utilizados dependem do tipo de material
colhido, da estrutura da superfcie e da expectativa do tipo e nvel de contaminao.
At aos anos 80, o controlo da eficcia dos planos de higienizao numa indstria
alimentar era feito com recurso microbiologia dita clssica (Easter, 2003), recolhendo
amostras com zaragatoas estreis, determinando para o efeito contagens de
microrganismos a 30 C e de Enterobacteriaceae, cujas diluies eram semeadas em meios
de cultura especficos ou no, conforme os microrganismos avaliados. Geralmente,
procuravam-se microrganismos aerbios mesfilos e microrganismos indicadores de
higiene, nomeadamente os de origem fecal.
A metodologia microbiolgica clssica , ainda hoje, considerada o Gold Standard,
quando as monitorizaes so requeridas em regulamentos nacionais e internacionais,
constituindo os mtodos oficiais de controlo (Blankenfeld-Enkvist & Brnnback, 2002).
1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae
Atravs da contagem os microrganismos a 30 C, percebe-se da contaminao
presente, na amostra, uma vez que engloba a grande maioria dos microrganismos com
importncia na indstria, inclusive os potencialmente patognicos de maior interesse.
Por outro lado, as Enterobacteriaceae, incluem um vasto leque de microrganismos,
constitudo por bacilos Gram negativos, aerbios-anaerbios facultativos, fermentadores da
glucose, catalase positivos e citrocromo-oxidase negativos. Os principais gneros desta
famlia so: Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Eschericia, Salmonella, Proteus, Shigella,
Yersinia e Klebsiella (Prescott et al., 2005).
14
A presena de Enterobacteriaceae em alimentos processados fornece uma boa
indicao de um tratamento inadequado ou de recontaminao aps o processamento. A
presena de Enterobacteriaceae nas superfcies, equipamentos e mos dos manipuladores
pode aumentar o nmero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) nos alimentos, se
durante o armazenamento, transporte ou distribuio ocorrer um aumento de temperatura
(Crowley et al., 2005).
Crowley et al. (2005) referem que as Enterobacteriaceae e outros microrganismos
indicadores de higiene avaliam a qualidade dos alimentos e as condies de higiene durante
o processamento. No entanto, os autores ressalvam que no seguro associar estes
microrganismos indicadores a microrganismos patognicos contaminantes dos alimentos.
De acordo com Tebbutt (2007), a contagem de Enterobacteriaceae e de
microrganismos aerbios totais a 30 C, providenciam adequada informao para verificar o
sistema HACCP.
As tcnicas clssicas de colheita e processamento de amostras so amplamente
usadas na indstria. Tm a grande vantagem de permitir detectar e quantificar
microrganismos especficos, mas apresentam desvantagens, como sejam no detectarem
resduos de produtos resultantes de uma m higienizao, ou por outro lado o tempo que
medeia entre a realizao da anlise e a obteno de resultados, alm da necessidade de
mo-de-obra especializada para as realizar (Lelieveld et al., 2005). O custo inerente a este
mtodo tambm constitui um factor limitante, tendo em conta que o mesmo se encontra
associado ao nmero de amostras processadas, isto , ao custo da realizao da colheita,
transporte para o laboratrio, bem como do processamento de anlise propriamente dita em
laboratrio (Tompkin, 2004). Constituem, no obstante, uma ferramenta importante, quando
em presena de uma toxinfeco, ou quando se pretende implementar um programa de
pesquisa e controlo de um microrganismo potencialmente patognico especfico, por
exemplo, Listeria em superfcies.
A maioria dos protocolos de colheita de amostras em superfcies baseiam-se na
tcnica de Manheiner & Yheunez descrita em 1917. Esta tcnica utiliza zaragatoas
esterilizadas, com uma haste mais ou menos flexvel e uma substncia fibrosa na
extremidade, mergulhada num soluto diluidor isotnico. A colheita da amostra faz-se por
esfregao na superfcie a testar. Os microrganismos transferidos para a zaragatoa podem
ser semeados, num meio de cultura adequado, directamente ou aps diluies em soluto
apropriado (Lelieveld et al., 2005).
O registo da data de colheita, do processamento, bem como do operador que a
realizou, assim como a temperatura a que a amostra entregue no laboratrio, so dados
extremamente importantes, principalmente na presena de resultados incomuns ou
significativamente diferentes, pois podem auxiliar na interpretao dos mesmos.
15
Aps incubao, a contagem das colnias desenvolvidas nos meios, fornece uma
indicao sobre a abundncia ou no de contaminao na superfcie testada.
A recolha feita de forma assptica, recorrendo a um maarico ou lamparina de
lcool. As superfcies testadas podem ter diferentes reas, e so geralmente delimitadas por
placas metlicas ou de outro material esterilizvel, com janelas quadrangulares.
Regra geral, a zaragatoa consegue remover os microrganismos da rea em estudo,
todavia, a sua remoo pode ser dificultada quando se est em presena de detritos
incrustados e, particularmente de biofilmes. Nestas situaes, as contagens podem ficar
diminudas e os resultados eventualmente falseados.
Geralmente, as zaragatoas para colheita das amostras encontram-se mergulhadas
em solues, neutralizantes, isotnicas e redutoras do stress fisiolgico, cujo principal
objectivo manter a viabilidade dos microrganismos recolhidos das superfcies. O soluto
neutralizante tem a funo de neutralizar a presena de resduos de detergentes ou
desinfectantes que permaneam remanescentes na superfcie, mesmo aps o
enxaguamento. Sem o soluto neutralizante, os resduos de detergente e de desinfectante
poderiam inactivar os microrganismos, fazendo com que artificialmente o seu nmero fosse
reduzido.
Algumas empresas adicionam substncias surfactantes s solues contidas nos
tubos das zaragatoas, com o objectivo de reduzir a tenso superficial e melhorar a captao
de microrganismos, aquando da realizao da recolha da amostra. Em alguns casos, a
presena de surfactante provoca um aumento do nmero de colnias, por desagregao de
grupos de organismos, aumentando deste modo, falsamente, o nmero de UFC (Lelieveld et
al., 2005).
Idealmente, as zaragatoas devero ser processadas logo aps a recolha da amostra,
contudo essa situao nem sempre possvel, especialmente se a colheita realizada
longe do laboratrio. Ento, as zaragatoas tm que ser transportadas a temperaturas
inferiores a 5 C, mas sem permitir a sua congelao. Esta condio faz com que as
diferenas microbiolgicas sejam mnimas, quando comparadas com zaragatoas que so
processadas logo aps a colheita (Lelieveld et al., 2005).
Em qualquer indstria alimentar, fundamental a resposta rpida das anlises
efectuadas a determinado produto, equipamento ou superfcie, uma vez que a presena de
contaminao microbiolgica pode implicar a perda de produto ou mesmo um problema de
sade pblica, com todos os custos que isso implica.
J quando se trata de indstria onde existem planos de HACCP implementados, a
questo agudiza-se, porque na monitorizao de Pontos Crticos de Controlo, de um
fluxograma, so muitas vezes necessrios resultados quase imediatos, para que possam
ser reproduzidas aces correctivas em tempo til.
16
As desvantagens apontadas anteriormente anlise microbiolgica clssica,
particularmente no que se refere ao tempo de resposta so factores muito importantes
nestes casos, o que ter a na base, entre outros factores, da procura de um mtodo
microbiolgico de resultados mais expeditos.
Os principais objectivos dos mtodos rpidos so contribuir para aumentar a
eficincia dos laboratrios, simplificar o trabalho, aumentar a capacidade analtica e reduzir
os custos (Hygiena, n.d.; Easter, 2003), o que permitiu o crescimento acelerado do mercado
dos mtodos rpidos.
Entre os vrios testes propostos, referem-se o teste de deteco de ATP por
bioluminescncia e o teste de deteco de protena.
1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia
O ATP, importante fonte de energia intracelular, est presente em todos os seres
vivos; sendo usado em diversas funes celulares, desempenha um papel importante na
troca de energia nos sistemas biolgicos, servindo como dador de energia.
Resduos de produtos alimentares, contm elevada quantidade de ATP; as clulas
microbianas tambm contm ATP; aps higienizao de equipamentos e superfcies de
contacto com produtos alimentares, a quantidade de ATP dever ser reduzida.
A descrio bioqumica da reaco de bioluminescncia foi feita em 1940, e a
determinao de ATP usando o sistema luciferina/luciferase foi descrito em 1949
(Hawronskyj & Holah, 1997; Patel, 1994). Contudo, o desenvolvimento e aplicao de
mtodos baseados na deteco de ATP, teve incio nos anos 80, com a empresa Lumac
(Easter, 2003); nessa altura, a medio de ATP por bioluminescncia, destinava-se
deteco de microrganismos nos alimentos e monitorizao da higiene, um indicador rpido
do nvel de material biolgico presente em superfcies e em lquidos, principalmente nos
sistemas aeroespaciais da NASA (National Aeronautics and Space Administration).
Estes testes dispensam a sementeira e cultura em meios apropriados e os resultados
surgem em segundos ou minutos, contrariamente a horas ou dias como acontece com as
metodologias clssicas. Pode considerar-se que representam a verdadeira inspeco ao
processo de higienizao, porque para alm dos microrganismos detectam tambm
resduos de alimentos, resultantes de uma higienizao deficiente.
Estes resduos, podem potenciar o desenvolvimento de microrganismos presentes se
as condies ambientais forem propcias, em termos de tempo e temperatura, alm de
17
poderem ser origem de contaminao cruzada de outros alimentos e nalguns casos,
alergias alimentares (Patel, 1994; Lelieveld et al., 2005).
A ATPmetria um mtodo que detecta baixos nveis de contaminao (Redsven et
al., 2007), e por isso pode ser utilizada, em todos os locais onde se processam alimentos,
sejam hospitais, restaurantes, supermercados ou indstrias diversas, locais onde a rpida
avaliao de contaminao e do nvel higinico das superfcies e gua tem elevado
interesse, uma vez que contribui para a produo de alimentos seguros, de qualidade e
reduz os custos inerentes deteriorao de alimentos.
uma tcnica amplamente utilizada, todavia a interpretao do que se avalia nem
sempre simples. Simm, Andrade, Mendona, Passos & Chaves (2006) realizaram um
estudo de ATPmetria, com substncias orgnicas vulgarmente detectadas em indstrias
alimentares, em superfcies de ao inoxidvel, nomeadamente -casena (3,5; 7,0 e 11,0 mg/ml) representando protenas, sacarose (0,6; 1,2 e 11,0 mg/ml) representando os
acares e banha de porco (7,0; 14,0 e 21,0 mg/ml) representando as gorduras. Estas
concentraes foram determinadas em ensaios prticos, e representam os valores destes
compostos, determinados nas referidas superfcies aps finalizada a higienizao. O mesmo
estudo, incluiu tambm concentraes de Staphilococus carnosus (5,4 x 109 e 5,4 x 104
CDM/ml) e Bacillus subtilis (2,9 x 107 e 2,9 x 103 CDM/ml), bactrias obtidas por contagem
directa ao microscpio (CDM).
O estudo mostrou que as solues contendo substncias orgnicas isoladas ou
associadas entre si ou com esporos de Bacillus subtilis forneciam resultados considerados
satisfatrios, ainda que ressalvando a importncia dos resultados falso negativos, porque a
concentrao de ATP do esporo bacteriano 10000 vezes menor que a prpria bactria.
Suspenses de Staphilococus carnosus associados s substncias orgnicas ou
isoladamente, forneceram resultados insatisfatrios. Os seus autores concluem que esta
tcnica pode ser usada para monitorizao da higiene, desde que associada com outros
mtodos como a contagem microbiana.
A bioluminescncia um fenmeno amplamente observado na natureza, ocorrendo
nas profundezas dos oceanos, em alguns insectos, bactria, fungos e numa variedade de
outros organismos (Patel, 1994; Liu, Vico & Lindh, 2008).
A bioluminescncia, (do grego bios vivo e do latim lumen luz) a luz produzida
num sistema biolgico, com uma taxa de eficincia de 96% (Rocha, 2007).
O fenmeno de luminescncia ocorre (Fig. 1) quando uma molcula excitada pela
absoro de energia, proveniente de uma reaco qumica, retoma ao seu estado inicial
com emisso luminosa. Nestas reaces os substratos so de origem biolgica, as enzimas
luciferases (oxigenases), utilizam o oxignio molecular para oxidar o substrato (luciferina),
traduzindo-se esta reaco pela emisso de um foto por cada molcula de ATP (Liu et al.,
2008).
18
Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia (Adaptado de: Liu, Vico & Lindh,
2008).
A medio do ATP por bioluminescncia requer usualmente a amostragem de uma
rea com, aproximadamente, 100 cm2 (Moore & Griffith, 2002b Hygiena, n.d.).
A luz emitida tem caractersticas muito precisas em termos de cor, intensidade e
polarizao e a sua quantidade proporcional ao valor total de ATP na superfcie e, por
conseguinte, sua limpeza (Rocha, 2007). A quantidade de ATP no interior das clulas
varia com o tipo de clula, e com a fase da curva de crescimento em que se encontra
(clulas em stress ou na fase estacionria de crescimento contm menor quantidade de
ATP).
O complexo luciferina-luciferase (a luciferase pode ser obtida do pirilampo
Americano, Photinus pyralis), converte a energia qumica associada ao ATP em luz, numa
reaco em que h proporo molar, ou seja, um foto de luz produzido pela hidrlise de
uma molcula de ATP. Os reagentes esto formulados de forma que haja emisso de uma
luz verde amarelada. A luz emitida medida em relative light units (RLU) (Hawronskyj &
Holah, 1997; Aycicek, Oguz & Karci, 2006).
As leituras obtidas devero ser comparadas com as leituras padro, determinando se
uma superfcie se encontra limpa ou no. Em poucos minutos, esta tcnica permite afirmar
se a superfcie em estudo se encontra ou no apta para entrar em contacto com alimentos.
A formulao qumica dos reagentes varia com a marca do aparelho, contudo, todos
contm o complexo luciferina-luciferase, ies de magnsio, soluo tampo e extractores
(para remover o ATP das clulas vivas). Variam quanto ao prazo de validade, uma vez que
o mesmo est relacionado com a sua composio assim como com a temperatura de
armazenamento (Lelieveld et al., 2005).
A reaco catalisada pela enzima luciferase, a qual utiliza a energia contida numa
molcula de ATP (rica em energia), conduzindo descarboxilao oxidativa da luciferina,
cujo resultado a produo de luz, com um pico de ocorrncia aos 0,3 segundos (Patel,
1994).
A actuao ptima das enzimas luciferases est condicionada a certas condies:
pH 7,75 e temperatura entre 20-22 C (Hawronskyj & Holah, 1997; Niza Ribeiro, Cerqueira,
Santos & Louz, 2002). Alteraes de pH, temperatura, presena de ies metlicos (Zn2+,
Cd2+ e Hg2+), podem reduzir a luz emitida ou detectada (Patel, 1994).
19
Algumas indstrias reclamam um teste que se mantenha estvel temperatura
ambiente, contudo essa varia consideravelmente em funo do clima, o que obrigaria as
indstrias produtoras destes aparelhos e das zaragatoas a produzirem diferentes produtos
de acordo com a amplitude trmica do pas (Lelieveld et al., 2005).
O valor de ATP varia consideravelmente de acordo com o gnero alimentcio em
presena. Alguns alimentos frescos, como tomate, apresentam valores elevados, enquanto
outros alimentos, especialmente os muito processados, ricos em gordura, leo ou acar,
mostram valores de ATP muito baixos (Lelieveld et al., 2005).
Na produo de leite em p, ou na mistura de farinhas e de acares, os
procedimentos de limpeza no removem todos os detritos, pelo que, nestes casos, no
possvel utilizar a tcnica de deteco de ATP por bioluminescncia.
Os detergentes usados na limpeza, podem provocar uma diminuio ou aumento dos
indcios de ATP. Por este motivo, desejvel, para haver consistncia nos resultados,
garantir que os agentes de limpeza, so removidos por enxaguamento, antes de o teste ser
executado. Contudo, para reduzir ao mximo essa interferncia, muitos kits comerciais
contm na sua constituio substncias neutralizantes como a lecitina, tween 80 ou a
ciclodextrina (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005).
De acordo com Costa, Andrade, Brando, Passos & Soares (2006), o hidrxido de
sdio, utilizado na higienizao da indstria de lacticnios no interfere com a deteco de
ATP por bioluminescncia. Esta opinio contrria de outros autores que comprovaram a
aco inibitria dos sais de sdio sobre a luciferina (Rodionova & Petushkov, 2006).
A repetibilidade e confiana dos instrumentos e dos seus testes podem variar
consideravelmente de acordo com os fabricantes, mas regra geral so superiores aos testes
realizados recorrendo microbiologia clssica com recurso ao uso de zaragatoas (Lelieveld
et al., 2005).
A sensibilidade dos instrumentos disponveis, bem como dos seus testes varivel,
e tem sido discutido qual o limite de sensibilidade adequado aos testes. A resposta a essa
questo prende-se com o facto de cada teste, numa indstria, ter a capacidade de distinguir
entre uma superfcie eficientemente limpa de uma ineficientemente limpa.
Os testes altamente sensveis so mais adequados quando, por exemplo, se
pesquisam microrganismos potencialmente patognicos, ou em situaes em que difcil
distinguir se uma superfcie est efectivamente limpa ou no.
Contudo, alguns estudos referem que a tcnica de deteco de ATP por
bioluminescncia apenas detecta microrganismos quando a sua contagem for superior a 103
ou 104 UFC/cm2, enquanto que outros se referem a 100 cm2 ou zaragatoa, o que mostra
que no h unanimidade de opinies de autores, e parece ser uma limitao do mtodo,
quando comparado com os mtodos tradicionais que conseguem detectar
20
A ATPmetria pode ainda ser adaptada num teste para determinao de resduos de
substncias alergnicas, sendo para tal necessrio que detecte entre 0,1 e 5 ppm (partes
por milho) de alergnios em resduos de alimentos (Lelieveld et al., 2005).
A dimenso dos primeiros luminmetros condicionava-os ao uso exclusivo em
laboratrio; os seus reagentes eram fornecidos sob a forma de p liofilizado, em frascos
contendo 25 ou 50 testes e aps re-hidratao duravam apenas 1 a 2 dias, o que os tornava
muito dispendiosos. O seu manuseamento apenas podia ser realizado por um analista
especializado (Easter, 2003).
Actualmente, os luminmetros possuem um tamanho reduzido, o que possibilita o
seu transporte, facilitando desta forma a sua utilizao quer em laboratrio quer fora deste,
por exemplo na prpria rea de produo. Adquiriram desta forma uma dupla vantagem
por um lado as amostras podem ser imediatamente lidas, minimizando a possibilidade de
alterao dos resultados, por outro lado, os responsveis pela higienizao da fbrica
verificam se esta foi realizada de forma eficaz ou no (Easter, 2003).
Alguns luminmetros, mais recentes, podem ser ligados a um computador ou
directamente a uma impressora. Os valores das leituras so transferidos para um programa
de software apropriado, permitindo a percepo dos locais onde a higienizao est a ser
bem ou mal realizada (Lelieveld et al., 2005).
Os programas informticos associados a este tipo de instrumentos, facilitam a
identificao das amostras e armazenam informao para posterior anlise. Futuramente,
pretendem-se luminmetros verdadeiramente portteis (do tamanha da palma da mo), sem
que isso implique uma diminuio da capacidade de realizao (performance) dos testes, ou
aumento do custo do aparelho (Lelieveld et al., 2005).
Os dispositivos de amostragem e respectivos reagentes, bem como as embalagens
tm igualmente evoludo; os reagentes encontram-se em compartimentos separados nas
zaragatoas de colheita, facilitando a realizao da tcnica e diminuindo os custos. Para
activar os reagentes segura-se com firmeza o tubo contendo a zaragatoa e usa-se o polegar
e o indicador para quebrar a vlvula. Agita-se levemente durante 5 a 10 segundos e o
dispositivo est pronto para ser colocado no luminmetro e realizada a leitura, at 1 minuto
aps a sua activao.
A extremidade da zaragatoa de colheita encontra-se acima do nvel de leitura, para
eliminar interferncias, aquando da leitura no luminmetro.
A empresa fornecedora dos luminmetros e respectivas zaragatoas faculta valores
recomendados em RLU para cada superfcie, determinados com base em mtodos
clssicos de microbiologia, relacionando-os com as leituras de ATP. Contudo, quem realiza
os testes tambm pode estabelecer os seus limites com base na mdia e desvio padro dos
resultados da sua amostragem. Assim, um resultado est inserido na categoria conforme,
quando o seu valor menor ou igual mdia dos resultados; na categoria cautela, quando
21
superior mdia mas inferior ou igual mdia adicionada ao desvio padro; na categoria
no conforme quando o valor superior mdia adicionada ao desvio padro (Hygiena,
n.d.). Quando se estabelecerem limites utilizando estas ferramentas, fundamental analisar
os resultados e, se necessrio, recalcular os limites, pelo menos uma vez por ano, ou
sempre que o programa de higiene ou alguns dos seus procedimentos seja alterado, de
forma a optimizar os resultados e obter uma melhoria contnua dos padres.
Os dispositivos de amostragem, quando armazenados refrigerados entre 2 C e 8 C
tm uma validade de cerca de 12 meses, mas se estiverem armazenados entre 8 C e 25 C
duram apenas 6 semanas. Os dispositivos de amostragem devem manter-se temperatura
ambiente durante 2-5 minutos antes da utilizao (Easter, 2003; Hygiena, n.d.).
As principais vantagens de ATPmetria so a rapidez, o baixo nvel de deteco,
incluso de todos os tipos de microrganismos activos, fcil interpretao dos resultados,
automatizao e anlise local; a principal desvantagem a no indicao da presena de
microrganismos potencialmente patognicos nas superfcies (Hawronskyj & Holah, 1997;
Rocha, 2007).
O teste ideal deveria detectar microrganismos e resduos alimentares com
sensibilidade suficiente, a sua eficcia deveria ser semelhante quando realizado sobre
superfcies secas ou hmidas, deveria ter boa repetibilidade e reprodutibilidade, deveria ser
fcil de manusear, pouco dispendioso, rpido, resistente e deveria possibilitar o
armazenamento dos dados (Lelieveld et al., 2005).
Larson et al. (2003) estabeleceram uma correlao significativa entre contagem de
microrganismos aerbios totais a 30 C e os valores provenientes das leituras de ATP, em
superfcies de diversos locais existentes em casas particulares.
Os testes alternativos ditos rpidos, devero ser encarados como um complemento
microbiologia clssica, num sistema integrado de controlo da qualidade, especialmente
quando se pretende estabelecer a relao entre a contaminao microbiana e risco de
doena infectante (Larson et al., 2003; Aycicek et al., 2006).
1.4 Mtodos de deteco de protena, fosfatos e hidratos de carbono
Alm do desenvolvimento e aplicao do teste de deteco de ATP por
bioluminescncia, como meio de monitorizar a limpeza, foram desenvolvidos outros testes
para detectar componentes de resduos alimentares e avaliar a eficcia da higiene.
Com o teste de deteco de protena pretendia-se desenvolver um teste
independente de instrumentos, cromognio, barato, simples e funcional, extensvel a
22
resduos qumicos, incluindo protenas, aucares redutores, NAD+ (nicotinamida adenina
dinucletdo) e fosfatos, individualmente ou combinados.
De acordo com os seus fabricantes, so apropriados para grandes e pequenas
indstrias de gneros alimentcios, assim como restaurantes e mercados, entre outros
(Easter, 2003).
Os testes conduzem, usualmente, produo de uma cor nica ou de uma
sequncia de cores. Aps um tempo determinado, entre 1 a 10 minutos, a alterao visual
da cor pode ser avaliada qualitativamente. A subjectividade do teste aumenta
consideravelmente quando utilizado em superfcies moderadamente sujas; a
subjectividade diminui em superfcies muito limpas ou muito sujas (Lelieveld et al., 2005).
Alguns testes tm o formato de zaragatoas, outros apresentam-se sob a forma de
tiras de plstico ou almofadas de material absorvente impregnado com os reagentes
apropriados.
De acordo com Griffith, Cooper, Gilmore, Davies & Lewis (2000), testes
independentes do uso de instrumentos e economicamente acessveis podem ser utilizados
em estabelecimentos de produo de alimentos, muitas vezes criticados pela baixa
sensibilidade para a monitorizao de higiene.
Em ensaios alternativos ao uso do ATP, os mtodos que detectam protena possuem
grande potencial, quando se trata de resduos de alimentos resultantes, por exemplo, de
carne de aves, bovinos ou sunos ou de produtos lcteos, devido ao seu elevado contedo
em protena. De notar, no entanto que, em testes realizados a alguns alimentos no
proteicos, se verificou a reduo dos componentes da reaco do biureto, e consequente
mudana de cor, o que representa afinal, tambm, ausncia de limpeza (Lelieveld et al.,
2005).
A maior parte dos testes que se baseiam na deteco de protena, utilizam a reaco
do Biureto (Fig. 2).
Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena (Adaptado de: Forsythe, 2002 ).
Assim, sob condies alcalinas, as ligaes peptdicas das protenas formam um
complexo com o Cobre II (Cu2+) do reagente biureto.
Esta reaco, adicionada de cido bicinchoninico (bicinchoninic acid BCA), produz
uma intensa cor roxa. Neste teste, a palavra de ordem usada dever ser if its green its
23
clean se est verde, est limpo. A cor verde significa limpo, os resultados mais
pretendidos; cor cinzenta indica resultado medocre, deve voltar-se a enxaguar ou a
higienizar ou a repetir o teste; cor roxa sinnimo de resultado negativo, tem que se voltar a
higienizar (Lelieveld et al., 2005).
Desinfectantes em concentraes normais no causam interferncia ou falsos
positivos; em alguns casos elevadas concentraes de produtos alcalinos podem originar
resultados falso-negativos, enquanto que desinfectantes base de perxidos podem causar
uma reaco de mudana de cor com resultado falso positivo (Hygiena, n.d.).
boa prtica aguardar um perodo de tempo adequado aps a limpeza, antes de se
realizar a anlise superfcie. importante, em qualquer programa de colheita de amostras,
estabelecer um procedimento de amostragem consistente e fcil de reproduzir.
Para assegurar melhores resultados, a colheita dever ser feita aps a limpeza com
o detergente ou aps enxaguamento, mas antes da desinfeco final. A presena de
resduos na superfcie aps a limpeza com detergente reduz a eficcia do desinfectante, por
este motivo a realizao do teste nesta fase previne desperdcios de tempo e de produtos
qumicos.
O teste no foi concebido como ferramenta de deteco microbiolgica, mas se
existirem mais de 107 UFC a colorao do teste altera-se como quando na presena de
protena (Hygiena, n.d.).
O armazenamento a temperatura entre 2 e 25 C permite uma validade de 12 meses.
Entre 26 e 35 C, a sua validade significativamente reduzida para 2 semanas. Em situao
alguma se deve congelar os testes (Hygiena, n.d.).
As zaragatoas devem ser mantidas temperatura ambiente uns minutos antes da
sua utilizao, o que aumenta a rapidez da reaco e aumenta a sensibilidade. A ttulo de
exemplo, quando as zaragatoas esto temperatura ambiente (15 25 C) tm capacidade
de detectar 500 g/100 l, enquanto as mantidas a temperaturas superiores (37 C), nas mesmas condies, apenas conseguem detectar 100 g/100 l (Hygiena, n.d.). Sendo um teste semi-quantitativo, d uma ideia aproximada da concentrao de
protena presente. Quando a cor obtida verde, a concentrao varia entre 0-30 g/100 l de protena; cinzento corresponde a uma concentrao de protena entre 50-80 g/100 l e roxo corresponde a uma concentrao superior a 100 g/100 l protena (Hygiena, n.d.). Trata-se de uma tcnica mais rpida do que as de microbiologia tradicional, mais
barata que a bioluminescncia por ATP, mas, dependendo do tipo de alimento analisado, ao
mesmo tempo, menos sensvel do que esta (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005).
A intensidade da cor e a rapidez da sua produo funcionam como indicadores do
nvel de sujidade, se bem que os resultados so usualmente fornecidos em termos de limpo
ou no limpo.
24
Curiosamente, a tcnica de deteco de protenas serviu de base, segundo
Lipscomb, Pinchin, Collin, Harris & Keevil (2006), para o desenvolvimento de uma nova
tcnica de epifluorescncia utilizando um corante fluorescente, designada comercialmente
por SYPRO Ruby. Detecta protenas e pries, especialmente em instrumentos cirrgicos, os
quais, segundo os mesmos autores, so muitas vezes responsveis por infeces
nosocomiais, muitas das quais com desfecho fatal.
O NAD+ e compostos semelhantes so resduos qumicos, extensamente distribudos
no material biolgico, incluindo nos alimentos e nos microrganismos. Desta forma, o nvel de
NAD+ em superfcies, fornece informao relativa sujidade orgnica. detectado numa
reaco qumica que conduz uma reaco visvel, com cores que alteram gradualmente de
amarelo a roxo numa escala de 0 6, em 5 minutos (Lelieveld et al., 2005).
Nos kits de deteco de resduos qumicos, a ausncia de reaco positiva no
implica, necessariamente, ausncia de microrganismos. Estes testes podem ser mais ou
menos sensveis, e importante test-los e ter em conta o tipo de alimento produzido.
Outros testes baseados em zaragatoas, podem ser usados para detectar glucose ou
glucose e lactose, este ltimo com efeito prtico na indstria dos lacticnios. Os resultados
so obtidos em 60 segundos. Devido colorao resultante da reaco, os resultados
devem ser lidos, if it turns green it isnt clean se se torna verde no est limpo, o que
pode causar alguma confuso com os resultados dos testes da protena.
Na maior parte dos casos, um teste menos sensvel do que o teste do ATP, mas
considerado para alguns resduos de alimentos como razovel, e rpido para um teste no
baseado em instrumentos (Lelieveld et al., 2005).
Outra opo um teste de fitas, contendo enzimas que detectam fosfatos e hidratos
de carbono. Por aco da capilaridade as fitas absorvem resduos de alimentos de
superfcies molhadas com os reagentes do teste. Quando as tiras do teste j esto
suficientemente molhadas adquirem tom cinzento-escuro; em presena de resduos de
alimentos, a sua cor altera-se para roxo em 120 segundos. As vantagens deste teste,
quando comparado com testes recorrendo a zaragatoas, prende-se com a sua simplicidade,
baixo custo de produo e transporte. Pode tambm ser utilizado para monitorizao da
higiene das mos (Lelieveld et al., 2005).
Estes testes so menos sensveis do que o de leitura ATP por bioluminescncia, mas
facultam um teste simples e semi-quantitativo, para avaliao de higiene fabril.
Estes mtodos no tm necessariamente que substituir os tradicionais, utilizando
meios de cultura. Tm, antes, que ser vistos como uma informao adicional ao programa
de segurana alimentar, adquirida num curto espao de tempo, facilitando desta forma uma
aco correctiva imediata, optimizando o processo e reduzindo os custos associados a
alimentos alterados.
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2. Materiais e Mtodos
O objectivo deste estudo foi tentar obter algum tipo de relao entre os resultados
obtidos pelas contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae
e os resultados obtidos atravs de deteco de ATP por bioluminescncia e de deteco de
protena, tendo em vista, adoptar um dos mtodos ditos rpidos, na verificao da eficcia
do plano de higienizao implementado.
O estudo foi realizado numa sala de acesso restrito, mantida a 12 C, onde se fatiam
produtos transformados base de carne, prontos a consumir, acondicionados em atmosfera
protectora, nomeadamente presunto, fiambre, toucinho fumado, paio, mortadela e fiambre
de frango.
Utilizaram-se no estudo duas das trs fatiadoras existentes na sala. Na fatiadora
nmero 1, fatiam-se, maioritariamente, produtos de marca prpria, pelo que durante o dia se
verifica pouca alternncia de produtos. Na fatiadora nmero 3, fatiam-se produtos de
diferentes marcas, logo, ao longo do dia, fatiam-se uma grande heterogeneidade de
produtos.
Foram efectuadas 48 recolhas para cada tipo de anlise, divididas entre as 2
mquinas de fatiar; em cada mquina colhiam-se amostras na lmina (local 1) e no tapete -
tela transportadora (local 2). Desta forma, na mquina 1 colheram-se 11 amostras de cada
local e na mquina 3, 13 amostras, igualmente de cada local.
Em cada mquina trabalha um grupo de 4 a 5 pessoas, constante, salvo raras
excepes, responsvel pelas operaes de fabrico e limpeza. Cada funcionrio usa
equipamento de proteco individual, constitudo por calas e tnica brancas, botas de
borracha branca, touca, luvas, mscaras, aventais e manguitos descartveis, colocados
apenas no momento de entrada na sala de fatiados. O acesso a esta sala est condicionado
por uma desinfeco das mos, por meio de um sensor automtico, que ao mesmo tempo
abre automaticamente a porta.
Os ensaios realizados nas mquinas 1 e 3, ocorreram durante a higienizao
intermdia, ou seja, entre o fim de fatiagem de um produto e o incio da de outro, excepto
um caso, em ambas as mquinas que ocorreu no incio da laborao, ou seja, a
higienizao foi realizada no dia anterior.
Na mquina 1, 5 ensaios aps terminar a fatiagem do presunto e antes de iniciada a
do fiambre; 2 quando terminou a fatiagem do fiambre e se iniciou a da mortadela; outros 2
na passagem de toucinho fumado a fiambre; 1 de paio para fiambre e 1 no incio da
laborao, ou seja, a higienizao tinha sido realizada no dia anterior.
Na mquina 3, 3 a
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