FFI0776�FFI0776��� Modelagem�e�Modelagem�e�ggEngenharia�de�ProteínasEngenharia�de�Proteínas
Prof. Rafael V. C. GuidoProf. Rafael V. C. GuidoProf.�Rafael�V.�C.�GuidoProf.�Rafael�V.�C.�[email protected]@ifsc.usp.br
Aula�02Aula�02Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�Biomoleculares
Instituto�de�Física�de�São�Carlos�Instituto�de�Física�de�São�Carlos��� USPUSP
ObjetivosObjetivos
• Obtenção�e�determinação�estrutural�de�proteínas– Cristalografia�de�raios�X�(Xtal)g ( )– Ressonância�Magnética�Nuclear�(RMN)– Crio microscopia Eletrônica (Cryo EM)– Crio�microscopia�Eletrônica�(Cryo EM)
Ob ã d i ãOb ã d i ãObtenção�e�determinação�Obtenção�e�determinação�estrutural de proteínasestrutural de proteínasestrutural�de�proteínasestrutural�de�proteínas
Biologia�Molecular�Biologia�Molecular�–– Obtenção�de�proteínasObtenção�de�proteínas
A�Biologia�Molecular�é�o�estudo�da�Biologia�em�nível�molecular,�com�especial�foco�no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressãono�estudo�da�estrutura�e�função�do�material�genético�e�seus�produtos�de�expressão�(proteínas).
Estratégias:l– clonagem
– expressão
Purificação�de�proteínasPurificação�de�proteínasA�purificação�de�proteínas�é�uma�série�de�processos�que�têm�em�vista�o�isolamento�de�um único tipo de proteínas de uma mistura complexa A purificação de proteínas éum�único�tipo�de�proteínas�de�uma�mistura�complexa.�A�purificação�de�proteínas�é�vital�para�a�caracterização�da�função,�estrutura�e�interações�da�proteínas�de�interesse.�O�material�inicial�é�normalmente�um�tecido�biológico�ou�uma�cultura�microbiana�(nativa�ou�recombinante).�
Os passos de separação exploram as diferenças no Estratégias:�(pureza�>�97%)Os�passos�de�separação�exploram�as�diferenças�no�tamanho�da�proteína,�as�propriedades�físico�químicas�(hidrofobicidade,�estado�de�
g (p )– Ensaios�Enzimáticos;– Determinação�Estrutural
protonação)�e�afinidade�de�ligação.ç
Cinética�EnzimáticaCinética�Enzimática
A�cinética�enzimática�estuda�as�reações�químicas�catalisadas�pelas�enzimas,�em�ti l l id d d ã O t d d i éti d i itparticular,�a�velocidade�de�reação.�O�estudo�da�cinética�de�uma�enzima�permite�
elucidar�os�detalhes�do�mecanismo�catalítico,�função�no�metabolismo,�modulação�da�atividade�na�célula.�Além�disso,�fornece�as�bases�para�os�estudos�de�inibição�por��, p ç pmoléculas�bioativas�(e.g.,�fármacos�e�agroquímicos).
E�+�S� E•S E�+�P�
Exemplo�de�determinação�de�Exemplo�de�determinação�de�KKMM Estratégias�para�resolução�estruturalEstratégias�para�resolução�estrutural
Expressão�e�ifi ã d
Expressão�e�purificação�da proteína marcadapurificação�do�
produto�gênicoda�proteína�marcada�(e.g.,�C13,�N15)
Cristalização�e�difração�de�raios�X
Aquisição�de�dados�de RMNde�RMN
Cl dClonagem�do�gene
Determinação�estrutural�e�refinamento�do�modelo
refinamento�do�modelo�por�restrições�espaciais.
Cristalografia�de�ProteínasCristalografia�de�ProteínasCristalizaçãoCristalização
Experimentos�de�triagem�de�cristalização�empregam tipicamente uma buscaempregam�tipicamente�uma�busca�convencional�de�múltiplos�parâmetros�de�protocolos�nas�técnicas�de�gota�suspensa�(difusão�de�vapor),�com�otimização�via�utilização�de�aditivos�que�são�rotineiramente realizados em umarotineiramente�realizados�em�uma�câmara�termoestável��a�4�ou�18ºC
Estratégias:T i ( l ã f i l)– Triagem�(solução�fatorial)
– Otimização�da�condição
CristalCristalUm�cristal�é�um�sólido�no�qual�os�constituintes�(e.g.,�átomos,�moléculas�ou�íons) estão organizados num padrão tridimensional bem definido que se repete
Características
íons)�estão�organizados�num�padrão�tridimensional�bem�definido,�que�se�repete�no�espaço,�formando�uma�estrutura�com�uma�geometria�específica
• Estrutura�altamente�ordenada;• Alta�resolução;ç• Precisão�da�posição
dos�átomos;
Difração�da�luzDifração�da�luz
3° álbum�mais�vendido�de�todos�os�tempos�no�mundo�inteiro(~�40�milhões cópias)
Os�mais�vendidos�do�mundoOs�mais�vendidos�do�mundo
11°° 22°°11 22
~�108�milhões�cópias ~�65�milhões�cópias
http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_best�selling_albums_worldwide
Cristalografia�de�raios�XCristalografia�de�raios�X
A�cristalografia�é�o�ramo�da�ciência�que�estuda�as�propriedade�dos�cristais,�a�sua�
R t ã áti d dif ã
formação�e�interação�com�os�fatores�físicos,�químicos�e�ambientais.
Representação�esquemática�da�difração�de�raios�X
feixe�de�raio�X
Moléculas�no�cristalcristal
Padrão�de�difraçãoPadrão�de�difração
• raios�X difratados pela densidade eletrônica dosraios X�difratados�pela�densidade�eletrônica�dos�átomos�da�amostra.
Cristalografia�de�Proteínas�Cristalografia�de�Proteínas�–– EtapasEtapas
1 Análise dos Dados Experimentais1. Análise�dos�Dados�Experimentais– Verificar�a�qualidade�dos�dados�experimentais�
(e.g.,�grupo�espacial,�resolução,�I/�I,�Rfactor,�( g g p p ç factorredundância,�No.�de�reflexões,)
2. Determinação�das�Fases�Experimentais– Substituição�Isomórfica�
(átomos�pesados�� e.g.,�Se,�I,�Zn)– Substituição MolecularSubstituição�Molecular�
(e.g.,�proteínas�homólogas)3. Interpretação�do�Mapa�de�Densidade�e�Refinamento– Refinamento�no�Espaço�Real/Recíproco
4. Validação�da�Estrutura5. Depósito�no�Banco�de�Dados�de�Proteínas�(PDB)
Cristalografia�de�Proteínas�Cristalografia�de�Proteínas��� ExemploExemplo Mapa�de�densidade�eletrônicaMapa�de�densidade�eletrônica
Mapa�de�densidade�eletrônicaMapa�de�densidade�eletrônica ResoluçãoResolução dada EstruturaEstrutura
• Qualidade do cristal;• Qualidade do�cristal;• Certeza�da�localização�de�um�grupo�químico�no�espaço;
• Menor�o�valor�em�Å�maior�a�resolução�da�estrutura
Coleta�de�Dados�Coleta�de�Dados�–– “In�“In�househouse”” Laboratório�Nacional�de�Luz�Síncrotron�Laboratório�Nacional�de�Luz�Síncrotron��� LNLSLNLS
• A�única�fonte�de�luz�síncrotron�do�Hemisfério�Sul;• Brasil�é�um�dos�14�países�que�dominam�este�tipo�de�
tecnologia;g ;• Investimento�de�US$70�milhões�financiado�pelo�
CNPq�e�MCT;• Inaugurado em 2 de julho de 1997;• Inaugurado�em�2�de�julho�de�1997;
Campinas�� SP
No LNLS, cientistas fazem pesquisaspara ampliar o conhecimento sobre
á lé los átomos e as moléculas.
LNLS�LNLS�–– MX1�e�MX2MX1�e�MX2 Cristalografia�de�ProteínasCristalografia�de�Proteínas
RMN�de�ProteínasRMN�de�ProteínasRessonância��Magnética�Nuclear�(RMN)Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)
Ressonância�magnética�nuclear�é�uma�gtécnica�que�permite�determinar�propriedades�de�uma�substância�através�da�correlação�entre�a�energia�absorvida�contra�a�frequência,�na�faixa�d h t (MH )de�megahertz�(MHz)�
Características:Determinação de proteínas em– Determinação�de�proteínas�em�solução
– Indicação da dinâmica da proteínaIndicação�da�dinâmica�da�proteína�(e.g.,�mudanças�conformacionais,�enovelamento,�interações)
Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)Ressonância��Magnética�Nuclear�(RMN)
• Proteína marcada com isótopos• Proteína�marcada�com isótopos• Aumento da�sensibilidade�e�resolução
• Diminuição da�complexidade�ç pdo�espectro�de�RMN
• Isótopos estáveis mais utilizados:Isótopos estáveis�mais�utilizados:• 13C
15N• 15N�• 2H�(deutério)
RMN�RMN�–– EtapasEtapas
1. Produção da Proteína Marcada com Isótopos1. Produção�da�Proteína�Marcada�com�Isótopos2. Coleta�de�Dados�
Assinalamento dos valores de ressonância– Assinalamento�dos�valores�de�ressonância�(e.g.,�1H,�13C,�15N)Informação espacial sobre os átomos próximos (< 5 Å)– Informação�espacial�sobre�os�átomos�próximos�(<�5�Å)�(e.g.,�1H–1H�NOE;�1H–15N�HSQC,�TROSY)
– Assinalamento de sequências específicas– Assinalamento�de�sequências�específicas3. Refinamento�das�soluções
Cál l d E– Cálculo�das�Estruturas– Obtenção�de�Modelos�Múltiplos
4. Validação�da�Estrutura5. Depósito�no�Banco�de�Dados�p
de�Proteínas�(PDB)
RMN�RMN�–– Assinalamento�(1D)Assinalamento�(1D)
UbiquitinaUbiquitina (8,5�(8,5�KdaKda –– 76�resíduos)76�resíduos)qq ( ,( , ))
RMN�RMN�–– Assinalamento�(2D)Assinalamento�(2D)
Integração�de�RMN�e�Integração�de�RMN�e�XtalXtal
P t íP t í��Solubilidade
Proteína�(Solubilidade�>�1�mM)
Proteína�(Solubilidade�>�1�mM)
��Estabilidade
< 60 Kda< 60 Kda > 60 KDa> 60 KDa�60�KdaMarcação�15N�60�Kda
Marcação�15N>�60�KDa>�60�KDa
Det.�do�Estado�de�Agregação
Det.�do�Estado�de�Agregação
Det.�do�Estado�de�Enovelamento
Det.�do�Estado�de�Enovelamento XtalXtalAgregaçãoAgregação EnovelamentoEnovelamento
<�20KDaDupla��Marcação�(15N,�13C)
<�20KDaDupla��Marcação�(15N,�13C)
>�20�KDaTripla�Marcação�(15N,�13C,�1H)
>�20�KDaTripla�Marcação�(15N,�13C,�1H)
RMN�de�ProteínasRMN�de�Proteínas XtalXtal x�RMNx�RMN
Estrutura�da�Enzima�Tioredoxina Humana�resolvida�por�Xtal e�RMN
Xtal1ert.pdb
RMN3trx.pdb1ert.pdb 3trx.pdb
XtalXtal x�RMNx�RMN
Xtal RMN
Resolução atômica Boa razoávelRaramente FrequentementeHidrogênios Raramente
determinadosFrequentemente
determinadosTamanho da Molécula Sem restrição < 40 KDaç
Dinâmica Um estado conformacional
Múltiplos estadosconformacionais
Proteínas de Membrana Problemático Problemático
P di L LProcedimento Longo Longo
Banco�de�Dados�de�ProteínasBanco�de�Dados�de�Proteínas
Estruturas�de�proteínas�no�PDBEstruturas�de�proteínas�no�PDB08/2010
08/2011 8.28508/2011
08/2012 8.381
No.�Proteínas�e�Métodos�Experimentais�No.�Proteínas�e�Métodos�Experimentais�
í í íMétodo Experimental No. de Proteínas08/2010
No. de Proteínas08/2011
No. de Proteínas08/2012
Raio X 54 099 61 365 68 559Raio X 54.099 61.365 68.559RMN 7.412 7.882 8.347Microscopia Eletrônica 203 254 305Microscopia Eletrônica 203 254 305Hibrido 21 40 44Outros 125 133 141Outros 125 133 141Total 61.860 69.674 77.396
7.814 7.722
Estruturas�no�PDBEstruturas�no�PDB PerspectivaPerspectivaPerspectivaPerspectivaMicroscopia EletrônicaMicroscopia EletrônicaMicroscopia�EletrônicaMicroscopia�Eletrônica
Microscopia�EletrônicaMicroscopia�Eletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica
Criomicroscopia eletrônicaCriomicroscopia eletrônica• Visualização�de�complexo�
macromoleculares�( ã í í(e.g.,�interação�proteína�proteína,�prteína�DNA,�proteína�RNA,�síntese de prteína);síntese�de�prteína);
• Estruturas�cristalinas�são�úteis,�mas�não�necessárias;
• Não�existe�limite�de�tamanho�molecular�(e.g.,�ribossoma,�vírus);Q id d d• Quantidade�pequena�de�amostra�necessária�para�análise;
• Análise de moléculas em seu ambiente• Análise�de�moléculas�em�seu�ambiente�natural�(e.g.,�condições�fisiológicas);
• Baixa�resolução�(30–3�Å)
CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica
Amostra
Projeção�das�imagens�orientadasorientadas
Média�das�imagens�2D
Transformada�de�FourierFourier
Transformada deTransformada�de�Fourier�3D
Reconstrução�do�modelo 3Dmodelo�3D
CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica
PNAS,�2011,�108,�4817–4821
CriomicroscopiaCriomicroscopia EletrônicaEletrônica
NSMB, 2011, 18,���715�721
PNAS,�2007,�105,�1494–1498
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