ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE
Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia
Adriana de Araujo Sacramento
Rio de Janeiro
2012
ADRIANA DE ARAUJO SACRAMENTO
Aluna do Curso de Ciências Biológicas Matricula 0823800162
ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERISTÁTICA DE
Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,
apresentado ao Curso de Graduação em
Ciências Biológicas do Centro Universitário
Estadual da Zona Oeste, UEZO, como parte
dos requisitos para obtenção do grau de
Biológo, sob orientação da Profª Drª Maria
Cristina de Assis.
Rio de Janeiro
2012
Sacramento, Adriana A, 2012
Atividade Bactericida de Shinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia /
Adriana de Araujo Sacramento,2012.
viii, 26 p.il;
Trabalho de conclusão de curso- Centro Universitário Estadual da Zona
Oeste- UEZO, 2012.
Orientador: Maria Cristina de Assis
Co-Orientador: Alaíde de Sá Barreto
1 Atividade Bactericida, 2 Burkholderia cenocepacia, 3 Crescimento
planctônico e séssil, 4 Schinus terebinthifolius
__Trabalho de Conclusão de Curso. I. Barreto, Alaíde de Sá, II.Assis, Maria
Cristina. II. Centro Universitário Estadual da Zona Oeste.III. Atividade Bactericida
de Shinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia.
ii
ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTEROSTÁTICA DE
Schinus terebinthifolius CONTRA Burkholderia cenocepacia
Elaborado por Adriana de Araujo Sacramento Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau......................................
Rio de Janeiro, 16 de julho de 2012.
Maria Cristina de Assis, Dra (Presidente da Banca e Orientadora)
Alaíde de Sá Barreto, Dra (Co- Orientadora)
Cristiane Pimentel Victório, Dra (examinador 01)
João Bosco de Salles, Dro (examinador 02)
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL
iii
DEDICATÓRIA
A Deus, por estar comigo, conduzindo meus passos, me
dando força e sabedoria. Aos meus pais e ao meu irmão que
me deram condições de estar aqui e acreditaram sempre nas
minhas conquistas, ao meu noivo pela compreensão e
dedicação e a minha orientadora Maria Cristina pelo carinho e
exemplo de profissionalismo.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus que me deu força e sabedoria para trilhar mais um caminho
em minha vida.
Aos meus pais pelo apoio e a confiança que depositaram em mim.
Ao meu irmão Adriano que esteve comigo em todos os momentos, me aconselhando,
dando força, e acreditando em mim.
Ao meu noivo Marlon pelo incentivo e compreensão em todos os momentos.
À minha orientadora, Doutora Maria Cristina, pela sua enorme disponibilidade,
atenção, conselhos e carinho. Obrigada!
A professora Cristiane Pereira (UFRJ) pela disponibilidade, grande ajuda e atenção!
A professora Alaíde pelo trabalho e alegria.
Agradeço as minhas amigas Karina Costa e Ana Paula Nogueira por estarem comigo
nos momentos em que pensei em desistir!
Agradeço as minhas irmãs científicas Juliana Chal e Ezaine Torquato pela alegria,
companheirismo, apoio e amizade.
Agradeço aos meus amigos de Laboratório Adriano Pereira, Verônica Torres e
Thiago Alves pela ajuda nos momentos necessários, pela alegria e amizade.
A todos os colegas de laboratório pelo amadurecimento e crescimento profissional.
A todos os professores pelos ensinamentos na vida acadêmica e profissional.
v
SUMÁRIO
Página
Resumo............................................................................................................................................ viii
Abstract...................................................................................................................... ..................... ix
1. Introdução.................................................................................................................................... 1
1.1 O complexo Burkholderia cepacia.............................................................................................. 1
1.2 Fatores de Virulência................................................................................................................... 3
1.2.1 Mecanismos de resistência de B. Cepacia.................................................................... 7
1.3 Fibrose Cística....................................................................................................................... 8
1.3.1 Fibrose Cística e B. cepacia....................................................................................... 11
1.4 Schinus terebinthifolius......................................................................................................... 12
2. Justificativa.............................................................................................................. .................... 14
3. Objetivos.................................................................................................................. .................... 15
3.1 Objetivo Geral..................................................................................................................... 15
3.2 Objetivos Específicos.................................................................................................................. 15
4. Materiais e Métodos.................................................................................................................... 15
4.1 Schinus terebinthifolius......................................................................................................... 15
4.2 Preparação dos Extratos....................................................................................................... 16
4.3 Caracterização Organoléptica............................................................................... .................... 16
vi
4.4 Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.......................................................... 16
4.5 Amostras Bacterianas......................................................................................... ............................ 17
4.6 Determinação da atividade antibacteriana in vitro do extrato aquoso Schinus terebinthifolius
contra B cenocepacia............................................................................................................................
17
4.7 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra B. Cenocepacia em Crescimento Planctônico.................................................
18
4.8 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. Cenocepacia em Crescimento Séssil..........
19
4.9 Avaliação do perfil químico de Schinus terebinthifolius por cromatografia em camada
delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).....................................................
20
4.10 Análise Estatística...................................................................................................................... 21
5. Resultados...................................................................................................................................... 21
5.1 Características organolépticas da espécie Schinus terebinthifolius................................................ 21
5.2 Atividade bactericida do extrato Schinus terebinthifolius contra a cepa ET-12 em crescimento
planctônico........................................................................................................................................
21
5.3 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 B. Cenocepacia em Crescimento
Planctônico...........................................................................................................................................
22
5.4 Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.......................................................... 23
5.5 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra isolados clínicos B. Cenocepacia em Crescimento Planctônico...................
24
5.6 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. Cenocepacia em Crescimento Séssil..........
25
5.7 Comparação da atividade bactericida de S. terebinthifolius contra B. cenocepacia em
crescimento planctônico e séssil..........................................................................................................
27
vii
5.8 Avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius por cromatografia em camada delgada
(CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)...............................................................
27
6. Discussão........................................................................................................................................ 29
7. Conclusões..................................................................................................................................... 32
8. Perspectivas................................................................................................................................... 32
9. Referências Bibliográficas............................................................................................................. 33
viii
RESUMO
Burkholderia cenocepacia é um patógeno oportunista que está frequentemente associada a
pacientes com fibrose cística (FC), estando relacionada a infecções graves em pacientes
fibrocísticos, quadros estes caracterizados por pneumonia necrosante com deterioração
pulmonar aguda levando à sepse, quadro clínico chamado de síndrome cepacia. A cepa
epidêmica ET-12 é virulenta em pacientes com FC, com alta resistência a antibióticos,
principalmente associada à formação em biofilme. Portanto, o objetivo deste trabalho é
determinar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus terethinfolius
frente à cepa ET-12 em crescimento planctônico e séssil. A atividade bactericida em
crescimento planctônico do extrato foi determinada por ensaio quantitativo que consistiu
na microdiluição em meio Luria Bertani do extrato em placas de 96 poços em
concentrações variadas. A determinação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL)
foi realizada por diluição e semeadura em meio Azul de Bromotimol (CLED). A inibição
do crescimento em estado séssil, foi realizado a partir de uma suspensão bacteriana com
DO680nm=0.2, que foi inoculada em placas de 96 poços e cobertas com tampas contendo
espículas. As espículas após 24 horas foram transferidas para nova placa contendo
diferentes concentrações do extrato e a determinação das UFC/mL foi realizada por
diluição e semeadura em CLED. Em crescimento planctônico podemos observar que houve
atividade bactericida nas concentrações de 20mg/mL e 10mg/mL e bacteriostática nas
concentrações de 5 mg/mL. Em crescimento séssil há um menor efeito da atividade
bactericida do extrato, mesmo na concentração de 20mg/mL, confirmando a alta
resistência bacteriana em biofilme. O perfil químico do extrato determinado por
cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência sugere como
componentes majoritários flavonóides e taninos. O extrato de S.terebinthifolius pode ser
uma alternativa no tratamento contra B. cenocepacia podendo contribuir com a qualidade
de vida dos indivíduos com fibrose cística.
Palavras Chaves: atividade bactericida, Burkholderia cenocepacia, crescimento
planctônico e séssil, Schinus terethinfolius.
ix
ABSTRACT
Burkholderia cenocepacia is an opportunistic pathogen that is often associated with
patients with cystic fibrosis (CF), being related to severe infections in CF patients, these
frames are characterized by necrotizing pneumonia with acute lung damage leading to
sepsis, the clinical syndrome called cepacia. The ET-12 epidemic strain is virulent in CF
patients, with high resistance to antibiotics, mainly associated with the formation of
biofilm. Therefore, the objective of this study is to determine the in vitro bactericidal
activity of aqueous extract of Schinus terethinfolius front of the ET-12 strain growing
planktonic and sessile. The bactericidal activity of the extract planktonic growth was
determined by quantitative assay which consisted of Luria Bertani broth microdilution in
the extract in 96 well plates at varying concentrations. Determination of Colony Forming
Units (CFU/mL) was performed by dilution and inoculation in Blue Bromothymol
(CLED). Growth inhibition state sessile was performed from a bacterial suspension
DO680nm = 0.2, was inoculated into 96 well plates and covered with lids containing
spikes. Spikes after 24 hours were transferred to new plate containing different
concentrations of the extract and the determination of CFU/mL was performed by dilution
and seeding on CLED. Planktonic growth can be observed that there was bactericidal
activity at concentrations of 20mg/ml and 10mg/mL and bacteriostatic at concentrations of
5 mg/mL. In sessile growth is less of an effect of the bactericidal activity of the extract,
even at a concentration of 20mg/ml, confirming the high resistance in bacterial biofilms.
The chemical profile of the extract determined by thin layer chromatography and high
performance liquid chromatography suggested as major components of flavonoids and
tannins. The extract of S. terebinthifolius can be an alternative treatment against B.
cenocepacia may contribute to the quality of life of individuals with cystic fibrosis.
Keywords: bactericidal activity, Burkholderia cenocepacia, planktonic and sessile growth,
Schinus terethinfolius
1
1- Introdução
1.1 Complexo Burkholderia cepacia
Burkholderia cepacia (Figura 1), denominada inicialmente de Pseudomonas
cepacia, foi descrita em 1950 por Willian Burkholder como um patógeno de plantas
capaz de causar apodrecimento dos bulbos de cebolas (Burkholder, 1950), e capaz de
uma variedade de interações complexas, tais como a degradação de poluentes
aromáticos complexos (O’Sullivan &Mahenthiralingam, 2005), a proteção e promoção
de crescimento de plantas (Parke & Gurian-Sherman, 2001) e a infecção de seres
humanos e animais, além de causar doenças de plantas (Mahenthiralingam et al., 2005).
A taxonomia do gênero Burkholderia vem passando por várias revisões significativas ao
longo do tempo. Muitas espécies do gênero Burkholderia foram por muitos anos
incluídas dentro do gênero Pseudomonas por causa da extensa e indeterminada
descrição fenotípica. Análises de hibridização RNAr-DNA apresentaram diversidade
genética entre os membros desses dois gêneros (Yabuuchi et al., 1992). Em meados dos
anos de 1990, foi demonstrado pertencer ao conjunto, pelo menos cinco espécies
distintas, que foram classificadas como Complexo Burkholderia cepacia (CBC).
Figura1: Burkholderia cepacia
Fonte: eol.org
Análises taxonômicas revelaram que estes microganismos são genotipicamente
diferentes e fenotipicamente semelhantes. O CBC foi composto incialmente por nove
espécies distinguidas por técnicas moleculares em B. cepacia, B. multivorans, B.
cenocepacia, B. stabilis, B. vietnamiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina e B.
Pyrrocinia. Atualmente a posição taxônomica de clusters gênicos recA de isolados do
2
CBC foi determinada através de taxonomia polifásica propondo mais oito novas
espécies: B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B.
contaminans e B. lata (Vanlaere et al.,2009). Sendo assim, pertencem ao Complexo
Burkholderia cepacia, até o momento 17 espécies. Todas essas espécias foram isoladas
de escarro de pacientes com Fibrose Cística (FC), com exceção da Burkholderia
ubonensis, sendo predominante as espécies Burkholderia cenocepacia e Burkholderia
multivorans (Vanlaere et al., 2009).
Estas espécies são caracterizadas como bactérias Gram-negativas, aeróbias, não
formadoras de esporos, móveis, catalase e oxidase positiva, além da produção de
pigmentos fluorescentes e polihidroxialcanoatos como reserva de materiais, sendo sua
temperatura ótima de crescimento em torno de 30 °C e 35 °C (Palleroni & Genus,
1984).
Bactérias do Complexo B. cepacia são comumente encontradas no solo, água e
plantas. São fitopatógenos, podendo estar associadas à rizosfera de várias culturas,
como ervilha, milho, arroz e trigo. Podem ser usadas como agentes de biorremediação
por possuir a capacidade de metabolizar hidrocarbonetos clorados, que são encontrados
em pesticidas e herbicidas comerciais, incluindo o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético
(2,4,5-T), havendo a possibilidade de serem adicionadas em ambientes contaminados
por estas toxinas (Willians & Wilkins, 1989). Ainda podem ser usadas em controle
biológico, porque podem produzir antibióticos contra fungos patogênicos em plantas.
Contrastando com os fortes interesses econômicos, as bactérias do CBC
emergiram nas últimas duas décadas como patógenos oportunistas principalmente em
portadores de fibrose cística. No entanto, a sua patogenicidade não se limita à
população com FC, sendo um agente etiológico importante na granulomatose crônica,
imunossuprimidos, infecções em feridas, peritonites, artrites sépticas, afetando,
também, pessoas saudáveis. Portanto, são preocupantes os riscos de sua utilização como
um agente de controle biológico (Butler et al., 1995).
A espécie B. cenocepacia é a mais frequentemente isolada nos pacientes com
FC, e está associada a infecções graves nos mesmos, caracterizadas por pneumonia
necrosante com deterioração pulmonar aguda associada à sepse, quadro clínico este
chamado de síndrome cepacia (Isles, Maclusky & Corey,1984).
3
1.2 Fatores de Virulência de B. cepacia
As bactérias do Complexo B. cepacia possuem um DNA muito extenso, que é
dividido em dois ou mais replicons, oferecendo flexibilidade na aquisição, na perda e
expressão de genes (Mahenthiralingam; Baldwin & Dowson, 2008).
Os microrganismos que formam este complexo exibem vários fatores de
virulência, os quais incluem: pili (Sajjan et al., 1995), flagelo (Tomich et al., 2002),
produção de proteases, lipases, lipopolissacarídeo (LPS), formação de biofilme
(Courtney et al., 2004), sistema “quorum sensing” (Lewenza et al., 1999; Huber et al.,
2001) e sistema de secreção do tipo III (SSTT) (Tomich et al., 2003).
Existem alguns fatores que são determinantes para causar a infecção, como por
exemplo, a motilidade, a aderência, o dano tecidual e a formação de biofilme (Cunha et
al., 2004).
A adesão ao trato respiratório é um importante fator na colonização deste
patógeno. A expressão da adesina “cable pili”, tem sido demonstrado na linhagem
altamente transmissível ET-12 (eletrophoretic type 12) de B. cenocepacia, que carrega
um gene, denominado cblA, que é a adesina responsável pela aderência da bactéria na
célula epitelial (Davies & Rubin, 2007). O fato deste gene não estar presente em todos
os clones epidêmicos sugerem que outros fatores bacterianos podem estar envolvidos.
Outros fatores de virulência importantes são os sistemas de secreção de
proteínas bacterianas, que podem ser definidos como mecanismos capazes de exportar
produtos produzidos intracelularmente para o meio extracelular. Em bactérias Gram-
negativas, existem seis destes mecanismos de secreção (Winans et al.,1996).
O sistema tipo II de secreção tem sido identificado em B. cepacia e parece ser
responsável pela secreção de lipase, uma enzima importante na invasão de células
epiteliais pulmonares (Gotschlich et al., 2001). Além disso, parece ser importante na
secreção de metaloproteases de zinco, ZmpA e ZmpB, que são proteoliticamente ativas
contra proteínas da matriz extracelular, compreendendo o colágeno tipo IV e a
fibronectina (Kooi et al., 2006).
Outro fator de virulência que tem se demonstrado importante na invasão
intracelular, é a liberação da serina protease, HtrA (Pedersen et al, 2001;Wilson et al.,
2006). Esta serina protease também tem a capacidade de utilizar a ferritina como fonte
4
de ferro, e isso gera uma vantagem significativa para o CBC já que o pulmão de um
fibrocístico apresenta níveis mais elevados de ferritina (Whitby et al., 2006).
O sistema de secreção tipo III (SSTIII) é especializado em permitir que proteínas
efetoras transportem produtos bacterianos diretamente para o citoplasma da célula
hospedeira, sendo, portanto chamado de sistema secretor contato dependente (Cornelis
& Van Gijsegem, 2000). As proteínas translocadas para a célula hospedeira alteram as
funções celulares estabelecendo diversas relações como a patogênese para benefício
próprio (Mota et al., 2005). Tomich et al (2003) demonstraram que o SSTIII é
importante na sobrevivência de B. cenocepacia em infecções em murinos.
O sistema de secreção tipo IV recentemente descrito em B. cenocepacia, é
necessário para causar doença em cebolas e para a sobrevivência intracelular em células
epiteliais e macrófagos (Valvano & Loutet, 2010). O tipo VI (T6SS) também
identificado em B. cenocepacia, na qual sua expressão é regulada negativamente pelo
sensor do regulador de quinase-resposta ATSR . Experimentos in vitro demonstraram
que o T6SS também é necessário para proteção contra a predação pela ameba
Dictyostelium discoideum. Além disso, demonstraram que macrófagos infectados com
B. cenocepacia que superexpressam T6SS induziram a projeções celulares em
macrófagos favorecendo sua internalização em vacúolos (Valvano & Loutet, 2010).
A primeira vez que o termo lipopolissacarídeo foi utilizado, foi para descrever
uma endotoxina, obtida através do método de extração fenólica da parede celular de
diversas cepas de bactérias Gram-negativas. Devido a sua função biológica, sua
estrutura é essencial para relação bactéria-hospedeiro (Westphal & Jann, 1965).
O CBC possui LPS diferente de outros microrganismos Gram-negativos, isso
por causa da diferença no núcleo de oligossacarídeos e também na porção do lípidio A
(Silipo et al., 2007). O LPS coopera para resistência à peptídeos antimicrobianos e
induz a uma resposta pró-inflamatória considerável (Bamford et al., 2007), além disso o
LPS de B. cenocepacia induziu a secreção de IL-8 em células epiteliais de vias aéreas,
mostrando ser mais potente que o LPS de outras espécies bacterianas (Reddi et al.,
2003).
Tem sido descrito que cepas do CBC crescem como biomassa nas secreções
pulmonares, possuindo a habilidade de formar biofilmes in vitro (Caraher et al., 2006).
Os biofilmes, definidos como complexos ecossistemas microbianos, podem ser
5
formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies,
podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta
maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de
seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou
abióticas (Rickard et al.,2002). Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme
ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos organismos denominados colonizadores
primários, que aderem a uma superfície. A sua composição pode conter proteínas ou
outros compostos orgânicos onde suas células aderidas passam a desenvolver-se,
originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS). Essas
matrizes EPS passam a atuar como substratos para a aderência de microrganismos
denominados colonizadores secundários, que podem se aderir diretamente aos primários
(Figura 2).
Figura 2- Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um
substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com
o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células
coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas
espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro. (Adaptado
de Rickard et al.,2002)
A natureza da estrutura do biofilme e os atributos fisiológicos dos organismos
6
promovem a persistência das infecções e uma resistência inerente aos antibióticos. Os
mecanismos responsáveis pela resistência podem ser: (i) retardo da penetração do
agente antimicrobiano através da matriz do biofilme, (ii) diminuição da taxa de
crescimento do biofilme (iii) mudanças ambientais que regulam o crescimento e a
composição do biofilme. O primeiro caso, a substância da matriz que são polímeros
extracelulares apresenta uma barreira para difusão das moléculas do antibiótico, assim
influenciando a taxa do transporte das moléculas para o interior do biofilme,
configurando assim uma barreira física. O segundo é a ineficiência da droga em
decorrência de taxas de crescimento muito lentas no interior do biofilme. Estudos que
determinaram a taxa de crescimento planctônico e da formação de biofilme, por
bactérias de Escherichia coli, observaram um crescimento mais lento do biofilme em
relação à formação planctônica, proporcionando maior resistência ao antibiótico
cetrimida (Evan, 1999). O terceiro caso é quando ocorre a participação de fatores
ambientais como pressão osmótica, deficiência de nutrientes, calor, danos oxidativos no
DNA, etc, na regulação do crescimento e a composição do biofilme. Em relação à fase
de maturação, trabalhos anteriores demonstraram que o “quorum sensing”, definido
como um mecanismo de comunicação através do qual bactérias regulam a expressão de
conjuntos de genes especializados em resposta à densidade celular e desempenham um
papel importante na maturação de biofilme (Huber et al., 2001).
Bactérias infecciosas que utilizam o sistema de “quorum sensing” são mais
virulentas por secretarem peptídeos que sinalizam a expressão de fatores de virulência
quando em alta densidade celular, evitando assim o reconhecimento precoce pelo
sistema imune. Burkholderia cepacia sintetiza N-acil homoserina lactona (AHL). As
AHL não controlam somente a expressão dos genes de virulência bacteriana, mas estão
também envolvidas em estimular a maturação de biofilmes resistentes a antibióticos
(Ward et al., 2003).
Importante consequência da formação de biofilme com profundas implicações
clínicas incluem o aumento da resistência a antibióticos, a desinfetantes e proteção
contra as defesas do hospedeiro (Caraher et al., 2006).
1.2.1 Mecanismos de Resistência a Antibióticos de Burkholderia cepacia
7
As bactérias do CBC possuem uma resistência intrínseca decorrente de vários
mecanismos: i) permeabilidade seletiva na parede celular, causada pela mudança no
envelope da célula bacteriana; ii) alterações na estrutura do lipopolissacarídeo; iii)
presença de várias bombas de efluxo multidroga, que expulsam o antibiótico da célula;
iv) além da formação de biofilme, que provoca a dificuldade de contato do antibiótico
com a superfície da célula bacteriana (Lacy et al, 1993).
O Complexo Burkholderia cepacia possui alta resistência à maioria dos
antibióticos. Este problema é agravado pelo desenvolvimento de resistência durante a
terapia (Wigfield et al., 2002). A terapia para pacientes com fibrose cística pode ser
destinada apenas a diminuir a carga bacteriana pulmonar e reduzir a resposta
inflamatória do hospedeiro, mas não à erradicação de B. cepacia (Davies & Rubin,
2007).
A resistência de Burkholderia cepacia à antibioticoterapia pode ser em
decorrência de um DNA muito extenso, medindo de 4,0 a 9,0 Mb, sendo capaz de sofrer
diversas mutações, adaptando-se a vários ambientes. É resistente aos aminoglicosídeos,
quinolonas, polimixinas, devido ao incomum componente LPS de suas membranas
celulares, e a β-lactâmicos devido à produção de betalactamases. O tratamento de
indivíduos com infecções por bactérias do CBC geralmente incluem a combinação com
dois ou três antibióticos com atividade sinérgica como o β-lactâmico (meropenem ou
ceftazidina), a ciprofloxacilina, a tobramicina, o cloranfenicol, a minociclina ou a
rifampicina. Contudo, estas combinações não levam a erradicação total do
microrganismo (Lacy et al., 1993)
Um estudo realizado por Peeters et al. (2009) para determinar a atividade in
vitro da ceftazidima, da ciprofloxacina, do meropenem, da minociclina, da tobramicina
e do trimetoprim contra as formas planctônicas e sésseis de Burkholderia cepacia
confirmou a resistência inata do B. cepacia a esses antibióticos usados em pacientes
fibrocísticos infectados por esses patógenos. Todos os antibióticos mostraram
semelhantes atividades bacteriostáticas contra B. cepacia em células planctônicas e
sésseis. Meropenem, minociclina e ceftazidima apresentaram a melhor Concentração
Mínima Inibitória (CIM) em concentrações clinicamente relevantes. Embora esses
microrganismos sejam tipicamente resistentes a aminoglicosídeos, altas doses de
8
tobramicina inibiu a maioria das cepas testadas. No entanto, o uso terapêutico de
concentrações mais elevadas de antibióticos não é recomendado por sua citotoxicidade.
Rodley et al.(1995) propuseram que em B. cepacia, a baixa permeabilidade da
membrana não parece ser suficiente para explicar os elevados níveis de resistência
exibidos. Segundo Rodley e colaboradores, foram identificados em B. cepacia genes
homólogos aos que constituem o operon mexA-mexB-oprM de P. aeruginosa, sendo que
neste microrganismo codificam três proteínas transportadoras MexA, MexB e OprM,
envolvidas na expulsão ativa de drogas. Este operon está envolvido na resistência a uma
ampla gama de antibióticos, incluindo a tetraciclina, o cloranfenicol, as
fluoroquinolonas, e alguns β-lactâmicos. No caso de P. aeruginosa, a proteína MexB
parece ser responsável pelo efluxo de substâncias através da membrana interna
enquanto que à proteína OprM é atribuído o efluxo através da membrana externa. A
proteína MexA, por sua vez, é considerada uma proteína de fusão membranar. A
presença simultânea das três parece ser necessária à multirresistência. Com base na
sequência de nucleotídeos publicada do gene opcM de B. cepacia (homólogo do gene
oprM de P. aeruginosa) e através da técnica de PCR, foi possível inferir sobre a
presença deste gene em alguns dos isolados, que eram exatamente os mais resistentes a
antibióticos, através da amplificação de um fragmento de aproximadamente 540 bp.
1.3- Fibrose Cística
A fibrose cística é comumente diagnosticada em descendentes europeus, com
uma frequência de um (1) doente para cada 3.200 nascidos vivos (Quinton, 2007). Em
negros essa doença é mais rara, acometendo (1) doente para cada 15.000 nascidos vivos,
para hispânicos essa incidência é de (1) doente para 9.200, e para asiáticos é de (1) para
10.000 (Boyle,2007). No mundo inteiro, mais de 50.000 indivíduos são afetados e muito
mais pessoas carregam o gene defeituoso que causa a fibrose cística (Govan & Deretic,
1996).
A Fibrose Cística ainda é uma doença incurável, porém conhecimentos novos
sobre a etiologia e a fisiopatologia da doença, adquiridos nas últimas décadas, sugerem
novas formas de tratamento, auxiliando no aumento da sobrevida e gerando
possibilidades de cura da doença. Quando os primeiros diagnósticos de Fibrose Cística
foram identificados, quase todos os acometidos por essa doença morriam ainda no
9
primeiro ano de vida. Atualmente com o diagnóstico precoce e acesso ao tratamento
adequado, quase metade dos pacientes sobrevivem por mais tempo, e há ainda muitas
perspectivas de um futuro promissor (Ribeiro et al., 2002).
Essa doença é caracterizada por uma falha das glândulas de secreção exócrina do
organismo, como glândulas sudoríparas, bronquiais, do intestino, do pâncreas exócrino,
salivares e hepáticas. As mucosidades produzidas por essas glândulas são muito
espessas e dificultam a produção de enzimas do pâncreas e a expulsão das secreções
mucosas dos brônquios. Essas obstruções causam deficiências no aparelho digestivo e
nas vias respiratórias, gerando nos pulmões, o início da colonização por diversos
microrganismos de difícil erradicação (Kroll&Terra, 1999).
A Fibrose Cística, antigamente conhecida como mucoviscidose, é uma doença
autossômica recessiva, sistêmica e hereditária causada por um defeito no gene regulador
do canal de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR – cystic fibrosis
transmembrane regulator), localizado no braço longo do cromossomo 7, no lócus q31,
formado por 250kb de ácido desoxirribonucléico (DNA). Com 27 éxons, esse gene
origina um mRNA de 6,5kb, que transcreve a proteína CFTR, de aproximadamente
1480 aminoácidos (Rommens et al., 1989).
A CFTR (Figura 3) também denominada de “canal de cloro” sofre maturação em
organelas citoplasmáticas, sendo assim ela é encontrada na membrana apical das
células. Essa proteína define a formação de canais de cloreto em células epiteliais de
glândulas exócrinas, sendo de extrema importância para o transporte iônico através da
membrana celular, pois é responsável pela regulação do fluxo de cloro, sódio e água
(Boucher, 2004; Vankeerberghen et al., 2002).
Figura 3 – Estrutura da CFTR (canal de cloro)
Fonte: Tratado de Clinica Médica (2009)
10
Muitas mutações naturais já foram estabelecidas no gene da Fibrose Cística, mas
a que ocorre com maior frequência é a deleção de três pares de bases, a qual gera a
perda do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína CFTR, acarretando danos
na função da mesma. As mutações causadas pela presença de dois alelos provocam
danos como a ausência da atividade ou funcionamento parcial da CFTR, gerando
diminuição na excreção do cloro e aumentando a eletronegatividade intracelular. Esse
aumento resulta em um maior fluxo de sódio para preservar o equilíbrio eletroquímico,
e posteriormente o fluxo de água para dentro da célula por osmose. Mutações do tipo I,
II e III apresentam manifestações clínicas mais graves, enquanto as mutações do tipo IV
e V apresentam manifestações clínicas mais leves (Knowles,1986).
A Fibrose Cística é uma doença multissistêmica, quando acomete o trato
respiratório geram alterações no líquido de superfície com desidratação das secreções
mucosas, aumentando a viscosidade, propiciando a obstrução ductular, levando a reação
inflamatória e posteriormente ao processo de fibrose (Knowles,1986). As alterações no
líquido de superfície e alterações no clearance mucociliar fazem com que substâncias
quimiotáticas do hospedeiro como interleucina-8 (IL-8) favorecem a migração de
neutrófilos aos pulmões. A presença de neutrófilos em números elevados nas vias aéreas
geram liberação de elastase e grande quantidade de DNA no muco, favorecendo o
aparecimento de substâncias pró-inflamatórias como citocinas, fator de necrose tumoral
IL-1, IL-6 e IL-8. Na FC a inflamação ocorre precocemente e precede a infecção,
levando a colonização bacteriana e a infecção das vias aéreas, causando dano pulmonar
irreversível.
A colonização das vias aéreas por bactérias oportunistas causam dano tecidual, e
dentre esses microrganismos podemos citar: Staphylococcus aureus, Haemophilus
influenzae, Pseudomonas aeruginosa, e Burkholderia cepacia. Outros patógenos como
as micobactérias não tuberculosas, vírus e fungos, especialmente Aspergillus spp,
também têm sido isolados em doenças pulmonares de pacientes com fibrose cística
(Gilligan,1991; Saiman & Siegel, 2004).
11
1.3.1- Fibrose Cística e B. cepacia
B. cepacia é um dos microrganismos mais importantes na colonização bacteriana
em pacientes fibrocísticos. A primeira colonização pulmonar por B. cepacia foi
confirmada nos anos 70. Muitos pacientes acometidos pela Síndrome de B. cepacia, que
se caracteriza por pneumonia necrosante com deterioração pulmonar, febre, bacteremia,
elevação da média de sedimentação de eritrócitos e leucocitose, passam a uma rápida
evolução clínica geralmente fatal no período de um ano após a colonização por este
microrganismo (Govan & Deretic,1996).
As infecções por B. cepacia apresentam três características importantes:
Manifestações clínicas, de rápido e fatal declínio pulmonar;
Disseminação de cepas epidêmicas que podem acometer pacientes fibrocísticos
ou não;
A multirresistência a antibióticos de isolados de B. cepacia. (Govan et al., 1993)
Estudos epidemiológicos demonstraram que a transmissão do CBC ocorre por
contato social (Mahenthiralingam, Baldwin & Vandamme, 2002).
Foi demonstrado também que cepas virulentas de B. cenocepacia podem
substituir outras variantes genômicas durante a infecção, como a B. multivorans,
sugerindo a importância do isolamento dos pacientes infectados (Courtney et al., 2004).
Além disso, existe um risco de infecção cruzada nos centros de tratamento de fibrose
cística e um cuidado com a higiene deve ser priorizado para reduzir a contaminação
(Campana et al., 2005). Essas cepas podem também gerar uma epidemia de impacto
internacional, como o ocorrido com a cepa epidêmica ET-12, que se disseminou para
muitas pessoas com FC do Canadá, Reino Unido e outros países europeus, causando
uma alta taxa de mortalidade associado à sua capacidade de causar a síndrome cepacia
(Govan et al., 1996).
A predominância de espécies CBC varia geograficamente, sendo B. cenocepacia
a espécie predominante nos centros de FC na América do Norte, enquanto B.
multivorans é a espécie mais comum em pacientes FC dos países europeus. Contudo,
contaminações causadas por outras espécies podem ter ocorrido em todo o mundo, pois
B. cepacia é raramente erradicada do trato respiratório de pacientes de FC, mesmo com
terapia antimicrobiana, por possuírem elevada resistência intrínseca a múltiplos
antibióticos. O tratamento para erradicar esses microrganismos é praticamente
12
impossível, sendo realizada uma antibioticoterapia muito agressiva, com combinações
de duas ou mais drogas para o controle da infecção (Mahenthiralingam et al., 2008 ).O
que leva a diferentes centros de pesquisa a investir em drogas alternativas para o
controle destas infecções.
1.4- Schinus terebinthifolius
Desde o início das civilizações os vegetais têm sido utilizados, não só como
fonte de alimento, mas também como medicamento. O ramo da medicina alternativa
que utiliza plantas no tratamento de doenças é a fitoterapia, que oferece soluções
eficazes e de baixo custo. As plantas medicinais têm grande importância na manutenção
das condições de saúde da população, visto que, a fitoterapia representa a cultura de um
povo, como um saber difundido ao longo de gerações, além de suas ações terapêuticas
(Tomazzoni et al., 2006).
Desde as mais antigas civilizações que o uso de plantas tem sido utilizado como
recursos terapêuticos. Muitas experiências com ervas obtiveram sucesso através da cura,
porém outras fracassaram ocasionando mortes ou graves efeitos colaterais (Tomazzoni
et al., 2006).
Os fitofármacos são considerados de baixa toxicidade no que diz respeito aos
seus efeitos colaterais, sendo comprovado por vários estudos clínicos. Contudo, existem
comprovações de efeitos adversos, relevantes para o tratamento. Como por exemplo, o
extrato de Hypericum perforatum, que causa virada maníaca e fotossensibilidade
(Andreatini, 2000).
Anacardiaceae é uma família botânica representada por 70 gêneros e cerca de
600 espécies de árvores ou arbustos, conhecidas por serem frutíferas e apresentarem
madeira de boa qualidade. Pertencem a esta família a Schinus terebinthifolius raddi,
popularmente conhecida como aroeira, corneíba ou cambuí. Esta planta é originária do
Peru e encontrada também na Europa, Ásia e outras regiões da América. No Brasil está
distribuída na vegetação litorânea, desde o Nordeste até o Sul do país. A árvore possui
porte grande, com casca fina e escamosa, suas folhas são compostas por folíolos
lanceolados e pontiagudos, possuem cutícula estriada, tricomas tectores unicelulares e
glandulares pluricelulares, drusas e prismas de oxalato de cálcio (Oliveira & Grotta,
1965), contém numerosas flores pequenas de cor branca ou amarelo esverdeado,
13
estando dispostas em pedículos. O fruto possui cor vermelha, é lustroso e contém um
odor característico semelhante à pimenta. A planta é catalogada em oito espécies
diferentes, sendo mais comum na América do Sul e do Norte (Coutinho et al., 2006; El-
Massry et al., 2009).
O uso medicinal da casca de Schinus terebinthifolius (Figura 4) foi descrito na
primeira edição da Farmacopéia Brasileira, em 1926 (Lucena et al., 2006).
Figura 4: Schinus terebinthifolius
Fonte: altervista.org
Alguns estudos têm demonstrado diferentes ações farmacológicas para S.
terebinthifolius como: atividade antiinflamatória (Gazzaneo et al., 2005),
antimicrobiana (Martínez et al., 1996; Melo-júnior et al., 2002; Schmourlo et al., 2005;
Lima et al., 2006), antioxidante (Velásquez et al., 2003) e antitumoral (Queires et al.,
2006).
Estudos fitoquímicos identificaram nesta espécie: fenóis, flavonóides, esteróides,
triterpenos, antraquinonas e saponinas (Lima et al., 2006). O schinol e o ácido
masticadienóico são responsáveis pela inibição competitiva específica da fosfolipase
A2. Os biflavonóides (amentoflavona, 2,3-dihidroamentoflavona e 2,3,2”,3”-
tetrahidroamentoflavona) são os principais metabólitos isolados de S. terebinthifolius, e
estão relacionados com sua ação antiinflamatória. O ácido hidroximasticadienóico, o
ácido terebinthifólico e o ácido ursólico, por sua vez, estão envolvidos na atividade
antimicrobiana, com demonstrações in vitro em algumas bactérias como Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e espécies de fungos, em especial
14
do gênero Aspergillus (Jain et al., 1995; Amorim & Santos, 2003; Varela-barca et al.,
2007).
As principais partes de S. terebinthifolius relatadas em estudos científicos são: a
casca, entrecasca e as folhas (El-Massry et al., 2009).
A atividade antimicrobiana in vitro da aroeira foi testada sobre microrganismos
da cavidade oral, observando que o extrato hidroalcoólico desta planta apresentou
atividade bactericida e bacteriostática sobre Streptococcus mitis, Streptococcus
sobrinus, e Streptococcus sanguis como também ação antifúngica sobre Cândida
albicans, Cândida tropicalis e Cândida Krusei (Alves, 2005). Além disso, foi
comprovado que os extratos alcoólicos e aquosos de S. terebinthifolius introduzidos em
géis apresentaram atividade antimicrobiana contra as cepas padrões de S. aureus
ATCC6538 e ATCC9144 (Leal et al., 1996).
Em estudo realizado por Guerra e colaboradores foi observado que o extrato
etanólico a 30% da aroeira apresentou atividade antibacteriana sobre as cepas de
Escherichia coli, Pseudomonas auruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis
(Guerra et al, 2000) demonstraram significativa atividade antibacteriana do extrato
etanólico a 80% desta planta sobre Candida albicans, comprovando a eficácia desta
planta como potente antimicrobiano (Martinez et al.,1996).
2- Justificativa
Burkholderia cenocepacia é um patógeno oportunista que frequentemente está
associado a infecções graves em pacientes com Fibrose Cística. Alguns estudos têm
demonstrado que B. cenocepacia é potencialmente virulenta, com alta resistência a
antibióticos, principalmente associada à formação de biofilme, o que dificulta o
tratamento de pacientes infectados por esta bactéria, mesmo com a combinação de dois
ou três antibióticos com atividade sinérgica e o uso de elevadas concentrações de
antibióticos (Peeters et al., 2009). Além disso, diversos estudos têm demonstrado os
diversos efeitos biológicos de Schinus terebinthifolius que poderiam contribuir para a
melhoria do quadro pulmonar, tais como: antioxidantes, antitumorais, cicatrizantes,
antiinflamatórios, antimicrobianos, febrífugos e analgésicos (Alves, 2005).
O que nos sugeriu investigar a atividade bactericida do extrato aquoso das folhas
15
de Schinus terebinthifolius contra Burkholderia cenocepacia.
3- Objetivos
3.1- Objetivo Geral
Avaliar a atividade bactericida e bacteriostática in vitro do extrato aquoso de S.
terebinthifolius frente a diferentes cepas de B. cenocepacia.
3.2- Objetivos Específicos
1- Avaliar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius frente ao clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em
crescimento planctônico e séssil;
2- Avaliar a atividade bactericida in vitro do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius frente a isolados clínicos de B. cenocepacia em crescimento
planctônico e séssil;
3- Verificar o perfil químico do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia em camada
delgada (CCD).
4- Materiais e Métodos
4.1- Material Vegetal
As folhas frescas de Schinus terebinthifolius foram coletadas na fazenda da
Secretaria do Meio Ambiente Agricultura e Pesca do Município de Itaguaí (SEMAAP -
Itaguaí / RJ), em um total de pelo menos 2832,69g. As folhas posteriormente foram
armazenadas no Laboratório de Tecnologia em Fármacos no Centro Universitário
Estadual da Zona Oeste - UEZO, após serem limpas e secas. Como etapa precedente à
preparação do extrato, as folhas foram congeladas por aproximadamente 16 horas a -
28ºC e trituradas em um moedor elétrico.
O registro da excicata do Schinus terebinthifolius é: RB 210.885.
4.2- Preparação dos Extratos
16
O extrato aquaso foi realizado a partir de folhas frescas de Schinus
terebinthifolius, sendo preparado por meio de infusão de acordo com a descrição da 1°
edição da Farmacopéia Brasileira, com algumas modificações. Para cada 800 g das
folhas de aroeira foram utilizados 2000 mL de água mineral. A água foi adicionada a
um béquer e fervida até 100ºC, entrando assim em processo de ebulição, com posterior
adição no béquer contendo as folhas frescas previamente trituradas. A solução foi
homogeneizada, havendo ajuste de temperatura até alcançar o ponto de 70ºC,
permanecendo em repouso durante 30 minutos com o recipiente fechado. Após esse
período, o infuso foi resfriado até atingir a temperatura ambiente e filtrado em funil de
porcelana contendo papel de filtro, com auxílio de uma bomba a vácuo e depositado em
kitazato. Finalmente, o extrato aquoso foi transferido para frascos âmbares,
devidamente identificados e mantidos congelados até o momento da liofilização. A
liofilização do extrato aquoso de aroeira foi realizado no Centro Universitário Estadual
da Zona Oeste no Liofilizador Liotop. Modelo: L202 – Liobras, com armazenamento do
material obtido a -20ºC.
4.3- Caracterização Organoléptica
Foram observadas características relacionadas à cor, sabor, textura e pH dos
extratos aquosos de folhas de Schinus terebinthifolius (Farmacopéia Brasileira, 1988).
4.4- Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius
Para avaliar o espectro de absorção do extrato aquoso preparado com as folhas
frescas da aroeira, realizamos uma varredura em espectrofotômetro para obter uma
curva absortiva. Utilizamos o extrato aquoso de S. terebinthifolius com pH 4,6 e com
pH próximo ao fisiológico (6,5 e 7,0) ajustando a solução aquosa do extrato com
bicarbonato de sódio 1.0 M. Para realizarmos a curva absortiva fizemos uma diluição
do extrato com os diferentes valores de pH (4,6; 6,5 e 7,0) de 1: 10 (200 µL do extrato +
1800 µL de PBS, pH= 7,2) e 1:20 (100 µL do extrato + 1900 µL de PBS, pH= 7,2),
sendo as amostras colocadas em cubetas de vidro e analisadas por varredura na faixa
de comprimento de onda de 200 a 500 nm, em espectrofotômetro UV-visível (Biothec,
modelo SP-2000 UV – Bel Photonics).
17
4.5- Amostras bacterianas
Em nossos experimentos foi utilizada a cepa ET-12 de B. cenocepacia (amostra
J2315, pertencente à genovariante IIIa), gentilmente cedida pelo Dr. Mustapha Si-Tahar
(Unité de Defense Inée et Inflamation, Instituto Pasteur, Paris - França) além de quatro
isolados clínicos de B. cenocepacia procedentes de pacientes com FC, atendidos no
Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e no Instituto Fernandes Figueira (IFF-
Fiocruz) com evolução clínica benigna diferente da síndrome cepacia, gentilmente
fornecidos pela Dr. Elizabeth de Andrade Marques (Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia da UERJ).
4.6- Determinação da atividade antibacteriana in vitro do extrato aquoso
Schinus terebinthifolius contra B. cenocepacia.
Inicialmente realizamos um ensaio qualitativo para determinar as concentrações
do extrato de S. terebinthifolius com atividade bactericida contra a cepa ET-12 de B.
cenocepacia. Para tal, foram utilizadas três alíquotas de 40 mg/mL do extrato de aroeira,
e em cada alíquota foram adicionados 10 mL de PBS estéril (pH 7,2), em seguida o pH
das amostras foi verificado. Visto que a solução aquosa do extrato possui um pH ácido
(pH 4,6), optamos por trabalhar com mais duas soluções, com pH próximo ao
fisiológico (pH 6,5 e 7,0). Portanto o pH de duas soluções foi ajustado com uma solução
de bicarbonato de sódio 1,0 M. Após esta etapa as soluções foram filtradas em uma
capela de fluxo laminar e 9 alíquotas de 1,0 mL de cada foram preparados de maneira
estéril e estocadas a -20ºC até a utilização.
Suspensões bacterianas foram preparadas em colorímetro (Biochrom, modelo
Libra S2) a partir de culturas de 18 horas da cepa ET-12 a 30ºC em meio Luria Bertanni
(LB) cultivadas em shaker orbital (Shaker orbital-Nova Ética) a 150rpm.
As culturas foram centrifugadas (centrífuga: Eppendorf, modelo - 5810R) a 2608
x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” formado foi
homogeneizado. Diluições em meio LB, a partir do “pellet” bacteriano foram realizadas
em colorímetro (Biochrom, modelo Libra S2) a 680nm, a fim de obter suspensões
bacterianas com DO680nm=0,2.
18
Em uma placa de 96 poços foram adicionados diluições seriadas de S.
terebinthifolius (20mg, 10mg, 5mg, 2,5mg, 1,25mg, 0,625mg) de forma a obtermos 100
µL como volume final, para os diferentes valores de pH. A cada poço foram
adicionados 100 µL da suspensão bacteriana com DO680nm = 0,2, que passou a DO680nm
=0,1 e as concentrações finais do extrato passaram a 20mg, 10mg, 5mg, 2,5mg, 1,25mg,
0,625mg, 0,325mg, respectivamente, para os diferentes valores de pH (4,6, 6,5 e 7,0).
Posteriormente a placa foi homogeneizada e incubada por 24horas a 37ºC. Após este
período, 10µL de cada diluição foram semeadas em “spots” em placas de Petri contendo
ágar azul de bromotimol (C.L.E.D). As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e
procedeu-se observação dos “spots” para selecionar as concentrações de S.
terebinthifolius a serem submetidas ao teste quantitativo.
4.7- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato
aquoso de Schinus terebinthifolius contra B. cenocepacia em Crescimento
Planctônico.
Foi determinada pela metodologia da microdiluição em caldo, segundo normas
da Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). Para o ensaio quantitativo
foram utilizadas as concentrações de 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/ mL selecionadas a
partir dos resultados obtidos no item 4.6. Para tal, foram utilizadas três alíquotas de 40
mg/mL do extrato de aroeira, e em cada alíquota foram adicionados 10 mL de PBS
estéril (pH 7,2) e duas alíquotas de solução aquosa de extrato foram ajustadas para pH
6,5 e 7,0, com uma solução de bicarbonato de sódio 1,0 M.
Suspensões bacterianas foram preparadas a partir de culturas de 18 horas da cepa
ET-12 e quatro isolados clínicos a 30 ºC em meio Luria Bertanni (LB) cultivadas em
shaker orbital (Shaker orbital-Nova Ética) a 150rpm.
As culturas foram centrifugadas a 2608 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi
descartado, e o “pellet” formado homogeneizado. Diluições em meio LB, a partir do
“pellet” bacteriano foram realizadas em colorímetro (Biochrom, modelo Libra S2) a
680nm, a fim de obter suspensões bacterianas com DO680nm=0,2.
Em uma placa de 96 poços foram adicionadas diluições seriadas em base 2 a
partir de uma solução S. terebinthifolius a 40mg/mL. A cada poço foram adicionados
19
100 µL da suspensão bacteriana com DO680nm = 0,2 onde a concentração final do extrato
passou a 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/mL para os diferentes valores de pH (4,6, 6,5 e
7,0) e a suspensão bacteriana passou a DO680nm= 0,1. Posteriormente a placa foi
incubada por 24hs à 37ºC. Em uma nova microplaca de 96 poços foram adicionados
180 µL de PBS estéril e 20 µL das culturas contendo diferentes concentrações do
extrato, que foram diluídas de 10-1
a 10-6
para a determinação das unidades formadoras
de colônias por mililitro (UFC/mL). De cada diluição, alíquotas de 10 µL foram
semeadas em triplicata em “spots” em placas de Petri contendo meio CLED. As placas
foram incubadas a 37ºC por 24 horas, quando foram realizadas as contagens das
colônias. Os resultados foram expressos em UFC/mL.
4.8- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato
aquoso de Schinus terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B.
cenocepacia em Crescimento Séssil.
A cepa ET-12 foi cultivada em caldo Luria Bertani (LB-Gibco) a 30 °C sob
agitação de 150 rpm (Shaker orbital-Nova Ética), por 16 a 18 horas. Após este período
as culturas foram diluídas até a obtenção de suspensões bacterianas com DO680nm=0.2.
Quando 200 µL desta suspensão foram inoculadas em microplacas de 96 poços, sendo
cobertas com uma tampa contendo espículas (Nunc-Immuno TSP) e incubadas a 37 °C
por 24 horas para a formação do biofilme. Após este período, as bactérias não aderidas
às espículas foram removidas após serem lavadas 3x com água destilada estéril. Em
seguida, a tampa contendo as espículas foi colocada em uma nova microplaca de 96
poços contendo as diluições seriadas do extrato aquoso do S. terebinthifolius (20mg/mL,
10mg/mL e 5mg/mL). Em seguida a placa foi incubada por 24 horas a 37 °C.
Posteriormente, as espículas foram lavadas 3x com água destilada estéril. Após esta
etapa, a tampa contendo as espículas lavadas foi colocada em contato com uma nova
placa de 96 poços que continham 200 µL de meio LB e incubada por 1 hora a 37 °C
para avaliar a atividade bactericida do extrato. Após este período, as espículas foram
retiradas, e a placa incubada por mais 6 horas a 37 °C. Em uma nova microplaca de 96
poços foram adicionados 180 µL de PBS estéril e alíquotas de 20 µL das culturas após
6h de incubação, posteriormente foram realizadas diluições de 10-1
a 10-4
. De cada
diluição, 10 µL foram semeados em triplicata em spots em placas de Petri, contendo
20
meio CLED. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas, quando foram realizadas
as contagens das colônias. Os resultados foram expressos em UFC/mL.
4.9-Avaliação do perfil químico de Schinus terebinthifolius por
cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE).
Para a avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius foram utilizados
solventes em padrão analítico (P.A), para cromatografia em camada delgada, e em grau
espectroscópico, para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As
misturas de solventes foram feitas sempre volume a volume (v/v).
Foram utilizadas placas de gel de sílica 60 G (para CCD) MERCK® e estas
foram reveladas com os seguintes reagentes cromogênicos: NP (2-
aminoetildifenilborato em etanol a 1,0 mg/mL) SPECTRUM® e PEG 4000
(polietilenoglicol a 5% em etanol) FLUKA® . A visualização das placas foi feita com a
utilização de câmara de UV contendo lâmpadas “Mineral light” nos comprimentos de
254 e 365nm. O sistema de solventes ideal para a corrida cromatográfica era composto
de acetato de etila: metanol: água: ácido acético (8: 1: 0.5: 0.1/ v/v).
A análise por CLAE acoplada ao detector de feixe de fotodiodos foi realizada
em aparelho SHIMADZU® CBM-10 A, equipado com bomba LC-10AD e detector
ultravioleta de feixe de fotodiodos SPD-M10A. A coluna utilizada foi a Lichrosorb-RP-
18 (25 cm de comprimento, 5 mm de diâmetro). Os solventes utilizados para a obtenção
do perfil em CLAE do extrato aquoso de Schinus terebentifolius foram: Solução A
(H2O: H3PO4 0.01%) e solução B (MeOH: H3PO4 0.01%). A eluição foi feita em modo
gradiente de 0% até 100% de B em 85 min, 1mL/ min. A detecção de UV foi
realizada com detector DAD e os canais observados foram de 254 e 365nm.
4.10- Análise Estatística
Os resultados foram expressos em médias ± erros padrões (SEM) dos valores
obtidos, além da análise de variância (ANOVA) seguida pelos testes de comparação de
Dunnett e o teste de significância de Bonferroni .
21
5-Resultados
5.1- Características organolépticas da espécie Schinus terebinthifolius.
O extrato aquoso das folhas de Schinus terebinthifolius, preparado por infusão
das folhas frescas da planta apresentou cor amarela, sabor amargo e adstringente e pH
ácido, na faixa de 4,6.
5.2- Atividade bactericida do extrato Schinus terebinthifolius contra a
cepa ET-12 em crescimento planctônico.
Inicialmente determinamos as concentrações do extrato de S. terebinthifolius a
serem utilizadas nos ensaios para determinação da concentração inibitória mínima do
crescimento da cepa ET-12 de B. cenocepacia. A tabela 1 apresenta as seis
concentrações utilizadas do extrato no pH 4,6, 6,5 e 7,0, e os resultados qualitativos da
inibição bacteriana. A tabela demonstra uma atividade de inibição do crescimento
bacteriano nas concentrações de 20mg/mL e uma redução de unidades formadoras de
colônias nos “spots” de 10µl quando utilizamos 10mg/mL de extrato. Nos “spots” das
demais concentrações utilizadas não foi possível contar as unidades formadoras de
colônias.
Tabela 1: Análise qualitativa da atividade bactericida do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius
Concentração do extrato aquoso Schinus terebinthifolius
pH 20mg/mL 10mg/mL 5mg/mL 2,5mg/mL 1,25mg/Ml 0,625mg/mL
4,6 NC RC IC IC IC IC
6,5 NC RC IC IC IC IC
7,0 NC RC IC IC IC IC
NC = não houve formação de Unidades Formadoras de Colônias
RC = redução do número de Unidades Formadoras de Colônias
IC = incontáveis números de Unidades Formadoras de Colônias
5.3- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato
aquoso de S. terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 B. cenocepacia em
Crescimento Planctônico.
Na figura 1A podemos observar uma significativa atividade bactericida do
extrato nas concentrações 20mg/mL e 10mg/mL (p<0.001) quando o número de
22
unidades formadoras de colônias das culturas tratadas com o extrato foram comparadas
com culturas que não foram tratadas (controle) para os diferentes valores de pH.
Quando foi utilizada a concentração de 5 mg/mL, observamos uma atividade
bacteriostática (Figura 1B) para pH 4,6 e 6,5. O extrato a 5 mg/mL com pH 7,0 não
apresentou diferenças significativas no número UFC/mL quando comparado ao
controle. Estes resultados podem ser melhor evidenciados na figura 1B que apresenta o
percentual de inibição do crescimento bacteriano quando as Unidades Formadoras de
Colônias obtidas em culturas da cepa ET-12 de B. cenocepacia não tratadas com S.
terebinthifolius foram tomadas com 100%. A concentração de 20mg/mL do extrato nos
diferentes valores de pH inibiu o crescimento bacteriano em culturas planctônicas em
100%, enquanto que em 10 mg/mL o extrato reduziu em 94,36%, 94,8% e 96,63% nos
pH 4,6, 6,5 e 7,0, respectivamente. Enquanto que na concentração de 5 mg/mL reduziu
em 57,74%, 44,74% e 45,85%, nas soluções de pH 4,6, 6,5 e 7,0 respectivamente,
demonstrando ser apenas bacteriostática ou seja reduz apenas taxa de crescimento.
Fig.1A- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em Crescimento Planctônico: Os
resultados representam médias erros padrões de 5 experimentos realizados em triplicata, onde * p<
0.05, **p<0.01 e ***p<0.001. Fig. 1B- Percentual de inibição do crescimento bacteriano do clone
epidêmico ET-12 de B.cenocepacia, em diferentes valores de pH ( 4,6, 6,5 e 7,0) do extrato aquoso
de Schinus terebinthifolius: Os resultados representam médias + erros padrões de 5 experimentos
realizados em triplicata
1A 1B
23
5.4-Curva absortiva do extrato aquoso Schinus terebinthifolius.
O fato de observarmos uma precipitação nos extratos de pH 6,5 e 7,0, e uma
menor significância na atividade bactericida quando foi utilizada a concentração de
5mg/mL nestes valores de pH, nos levou a fazer curva absortiva para verificarmos se
estava ocorrendo perda de constituintes. A Figura 2 mostra a sobreposição das curvas
de absorção de 200nm a 500nm do extrato aquoso S. terebinthifolius nos valores de pH
4,6, 6,5 e 7,0. As três amostras apresentaram um pico entre 200 e 300nm e outro em
300nm e 400nm. No entanto, foi observado que os extratos no pH 6,5 e 7,0
apresentaram uma diminuição das densidades óticas. O que nos levou a continuar os
experimentos com os extratos aquosos sem ajuste do pH, ou seja pH 4,6.
Fig. 2. Curva absortiva do extrato aquoso de S. terebinthifolius em diferentes valores de pH nos
intervalos de 200nm a 500nm
5.5- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de
Schinus terebinthifolius contra isolados clínicos B. cenocepacia em Crescimento
Planctônico.
Nesta etapa verificamos se o efeito bactericida do extrato aquoso observado com
a cepa ET-12 pode ser observado com outras cepas da mesma espécie (genovariante
IIIA), visto que existe uma grande variabilidade de resposta a substâncias
antimicrobianas dentro de uma mesma espécie. A Figura 3A representa o CIM do
extrato aquoso sobre quatro isolados clínicos de B. cenocepacia. Podemos observar
que, as concentrações de 20mg/mL, 10mg/mL e 5mg/mL inibiram significativamente o
crescimento bacteriano quando comparadas com as UFC/mL obtidas a partir de culturas
não tratadas com o extrato (controle) para as diferentes cepas testadas, exceto quando
24
foi utilizado 5mg/mL para a cepa 2627. Esses dados podem ser melhores
compreendidos na Figura 3B, que representa o percentual de inibição do crescimento
bacteriano do extrato quando as UFC/mL das culturas das diferentes cepas tratadas com
extrato foram comparadas com as UFC/mL obtidas em culturas controle, tomadas como
100%. Observamos uma atividade bactericida com percentual médio de 98% quando foi
utilizado 20 mg/mL para todas as cepas testadas. E quando foram utilizadas 10mg/mL e
5mg/mL houve uma inibição do crescimento bacteriano com um percentual médio de
88% e 48%, respectivamente, quando culturas das cepas 1664, 1634 e 1652 foram
tratadas com S. terebinthifolius. O tratamento das culturas da cepa 2627 com 5mg/mL
do extrato levou a uma inibição média em torno de 20%.
Fig. 3A- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra isolados clínicos B. cenocepacia em Crescimento Planctônico: Os resultados
expressos em UFC/mL representam médias + erros padrões de 3 experimentos realizados em triplicata, onde * p< 0.05, **p<0.01 e ***p<0.001; Fig. 3B- Percentual de Inibição do Crescimento Bacteriano:
Os resultados representam médias + erros padrões de 3 experimentos realizados em triplicata
3A 3B
25
5.6- Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de
Schinus terebinthifolius contra o clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia em
Crescimento Séssil.
O crescimento em biofilme melhor representa as características de crescimento
bacteriano de B. cenocepacia in vivo. Resultados anteriores de nosso grupo
demonstraram a formação de biofilme pela cepa ET-12 de B. cenocepacia em cultura de
24 horas (Carvalho et al., 2011). Estes fatos nos levaram a determinar o CIM do extrato
aquoso frente ao crescimento séssil. A Figura 4A representa espículas com a formação
de biofilme após 24 horas de contato com culturas da cepa ET-12. A Figura 4B mostra
o crescimento bacteriano após 6 horas de cultivo em contato com os biofilmes de 24
horas tratados com as diferentes concentrações do extrato aquoso de S. terebinthifolius.
Observamos um menor efeito bactericida do extrato em crescimento bacteriano séssil,
mesmo quando utilizada a concentração de 20mg/mL. Estes resultados são melhores
observados na Figura 4C que representa o percentual de inibição do crescimento
bacteriano das concentrações de S. terebinthifolius frente aos biofilmes formados por
ET-12 quando comparamos as UFC/mL obtidas em culturas tratadas com o extrato e os
valores obtidos em culturas não tratadas, tomadas como 100%. O percentual de inibição
de 20 mg/mL é de 82% 8,805, e em 10 mg/mL e 5mg /mL houve uma redução de
51% 13,58 e 35% 11,64, respectivamente.
4A 4B
26
Fig.4A-- Espícula com formação de biofilme após 24 horas de contato com as culturas da cepa ET-
12 de B. cenocepacia. Fig. 4B- A concentração mínima inibitória do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra a cepa ET-12 de B. cenocepacia em crescimento séssil: Os resultados
representam médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em quadruplicata, onde * p< 0.05,
**p<0.01 e ***p<0.001. Fig.4C- Percentual de inibição do crescimento séssil do clone epidêmico ET-
12 de B. cenocepacia, pelo extrato aquoso de Schinus terebinthifolius: Os resultados representam
médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em quadruplicata
5.7- Comparação da atividade bactericida de S. terebinthifolius contra B.
cenocepacia em crescimento planctônico e séssil.
A figura 5 mostra uma melhor atividade inibitória do crescimento bacteriano
pelo extrato de S. terebinthifolius em culturas planctônicas, embora ao compararmos as
UFC/mL das culturas planctônicas e sésseis os resultados não apresentaram diferenças
significativas.
Fig. 5- Comparação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius contra a cepa ET-12 B. cenocepacia em Crescimento Planctônico e Séssil: Os resultados expressos em UFC/mL representam médias + erros padrões de 2 experimentos realizados em
quadriplicata
4C
27
5.8-Avaliação do perfil químico de S. terebinthifolius por cromatografia em
camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Inicialmente realizamos a detecção dos derivados fenólicos de S.
terebinthifolius por CCD (Figura 6A) com utilização do reagente NP/PEG. As placas
foram observadas sob luz UV a 254 nm antes da revelação e a 365 nm após a revelação.
A presença de flavonóides foi evidenciada pela coloração alaranjada observada na placa
de CCD após a utilização do NP/PEG. Quando o extrato foi submetido a análise por
CLAE, o perfil cromatográfico (Figura 6B) nos sugeriu a presença de flavonóides e
taninos. Eestes resultados podem ser melhores evidenciados nas Figuras 6C e 6D,
respectivamente (Simões et al. 1999).
Fig. 6A- Sistema Cromatográfico do extrato aquoso de S. terebinthifolius: Gel de sílica GF 254,
acetato de etila: metanol: água: ácido acético (8: 1: 0.5: 0.1/ v/v). Corante NP/PEG
Fig. 6B- Cromatograma do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em 365 nm, corrido em 85
minutos
6A
6B
BB
28
Fig. 6C- Espectro de absorção característico de flavonóide no tempo 64.23 minutos. Fig. 6D-
Espectro de absorção característico de tanino no tempo 55.05 minutos
6-Discussão
As bactérias do Complexo B. cepacia emergiram nas últimas duas décadas como
agentes de infecções oportunistas principalmente associadas a infecções respiratórias
em pacientes com fibrose cística (FC). A colonização pulmonar com Burkholderia
cenocepacia está associada com acelerado declínio clínico e morbidade da infecção.
Há evidências de que cepas de B.cepacia crescem como biomassa no muco
pulmonar (Burns et al., 1999) e formam biofilme (Schwab et al., 2002). A formação
de biofilme leva a severas implicações clínicas como aumento da resistência a
antibióticos e desinfetantes, além de proteção contra a resposta imune do hospedeiro.
Estudos realizados por Garcia & Hickey (2002) mostraram que biofilmes geram
uma maior resistência a antibióticos, sendo necessário utilizar altas concentrações de
antibióticos, o que pode ser tóxico para o organismo. Outro estudo realizado por Peeters
e colaboradores (2009) confirma a alta resistência das cepas do CBC a uma ampla gama
de antibióticos. O estudo mostra também que altas doses de tobramicina foram
necessárias para inibir a maioria das cepas testadas, tanto para culturas planctônicas,
como para biofilmes.
Tobramicina é utilizada como uma solução inalatória como coadjuvante no
tratamento das infecções broncopulmonares. A inalação de 300mg leva a uma
concentração média de 1.237µg/g (variando de 0,35 a 7.414 µg/g) no escarro. A
toxicidade deste antibiótico pode levar perda de audição, danos aos rins, ao feto, entre
outros.
6D
BB
6C
BB
29
Por existir essa resistência intrínseca e uma grande dificuldade no tratamento de
infecções respiratórias causadas por bactérias do CBC, é que atualmente muitos
pesquisadores buscam alternativas de tratamento para inibir estas infecções
(Mahenthiralingam et al., 2008). E o presente trabalho teve como objetivo buscar uma
nova alternativa de tratamento através do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius. A
maioria dos casos de síndrome cepacia foi relacionada com infecção por cepas de B.
cenocepacia, particularmente pela cepa ET-12 (Govan & Deretic, 1996;
Mahenthralingam et al., 2005). Em nosso estudo utilizamos o clone epidêmico ET-12
de B. cenocepacia, cepa amplamente estudada e que apresenta resistência a múltiplos
antibióticos. No complexo Burkholderia cepacia existe uma grande variabilidade nos
fatores de virulência de diferentes cepas em uma mesma espécie, resolvemos testar a
atividade bactericida do extrato aquoso sobre quatro cepas clínicas, isoladas de
pacientes fibrocísticos.
Nossos estudos foram realizados de modo a comparar a atividade bactericida do
extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em crescimento séssil e planctônico, visto
que diversos estudos demonstram que a formação em biofilme confere maior resistência
aos antimicrobianos do que o crescimento planctônico.
Estudos realizados por Peeters et al. (2009) indicam que as concentrações
inibitórias utilizadas para crescimento planctônico e crescimento séssil são semelhantes.
Para a maioria das cepas testadas, o tratamento com ceftazidima, ciprofloxacina,
meropenem, minociclina ou trimetoprim / sulfametoxazol gerou reduções similares no
número de células planctônicas e sésseis.
Já em nossos resultados encontramos uma atividade bactericida significativa do
extrato aquoso de Schinus terebinthifolius em concentrações de 20mg/mL e 10mg/mL
em crescimento planctônico, enquanto que houve uma menor atividade bactericida
contra crescimento séssil. Na concentração de 5mg/mL observamos uma atividade
bacteriostática tanto em crescimento planctônico como séssil. Estes resultados estão em
acordo com os encontrado por Callaghan et al (2006) que avaliou a suscetibilidade de
diferentes antimicrobianos em crescimento planctônico e séssil, e observaram que em
biofilme as cepas eram mais resistentes.
A avaliação química preliminar do extrato aquoso de S. terebenthifolius nos
permite sugerir a presença de flavonóides e taninos. Os flavonóides mais conhecidos
30
desta espécie correspondem às biflavonas (amenthoflavona e dihidroamentoflavona)
(Jain et al., 1995), provavelmente devido a extração realizada, com solventes de maior
polaridade, não foi possível observar a presença destes metabólitos. O flavonóide
observado no extrato aquoso foi do tipo flavonol, pois apresentava máximos de
absorção no UV nas regiões de 355nm para banda I e 268nm para a banda II (Simões et
al, 1999). A presença de taninos nesta espécie já foi descrita por Queiroz et al. (2002).
Os taninos hidrolisáveis e condensados são responsáveis pela propriedade adstringente
em plantas (Monteiro et al, 2005), característica organoléptica esta que foi observada no
extrato da aroeira utilizado, além disso, esta classe de metabólitos é bastante conhecida
também em função da sua atividade antibacteriana (Machado et al, 2002).
Nossos resultados são estimulantes e nos permitem sugerir que o extrato aquoso de
S. terebenthifolius pode ser uma alternativa na inibição da infecção por B. cenocepacia
podendo contribuir com a qualidade de vida dos indivíduos com fibrose cística. Pois,
além da atividade antimicrobiana, possui segundo a literatura, atividades
antiinflamatórias e antioxidativas, que desempenham papel importante na regeneração
do tecido pulmonar do fibrocístico.
7-Conclusões
As concentrações de extrato de Schinus terebinthifolius a 20 mg/mL e 10 mg/mL
tiveram efeito bactericida enquanto que as concentrações de 5 mg/mL tiveram
efeito bacteriostático contra o clone epidêmico ET-12 em crescimento
planctônico.
O extrato mostrou ter atividade bactericida quando utilizado contra as quatro
cepas clínicas em crescimento planctônico na concentração de 20 mg/mL.
Quando foram utilizadas as concentrações de 10mg/mL e 5mg/mL houve uma
inibição do crescimento bacteriano, mostrando ser apenas bacteriostático.
Em crescimento séssil o extrato possui menor atividade bactericida, mesmo
quando utilizada a concentração de 20 mg/ mL, visto que em crescimento
plactônico teve melhor efeito bactericida, confirmando estudos realizados por
diversos autores, que demonstraram que em biofilme há uma resistência
intrínseca.
31
O perfil cromatográfico sugere como componentes majoritários a presença de
taninos e flavonóides no extrato aquoso de S. terebinthifolius.
8-Perspectivas
Isolar os metabólitos de aroeira por meio de técnicas cromatográficas (CLAE
semi-preparativo ou cromatografia em coluna aberta).
Identificar os metabólitos puros por meio de técnicas espectroscópicas (RMN H1
e C13
) e espectrométricas (espectrometria de massas).
Avaliar a resposta inflamatória do Schinus terebinthifolius, visto que na fibrose
cística, a inflamação ocorre precocemente e precede a infecção, mesmo em
condições clínicas estáveis;
Verificar a citotoxicidade de culturas de células epiteliais alveolares (A549)
frente às concentrações do extrato aquoso determinadas pelos ensaios
bactericidas.
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