Assepsia e Estabelecimento in vitro
Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues
LPVLPV--ESALQESALQ
Assepsia
• Material Vegetal:
Campo X ViveiroCampo X Viveiro
??
Assepsia
• Campo...
Está em contato direto com esporos de fungos, insetos, pequenos animais e condição climática variável (umidade alta). Substrato ou solo rico em matéria orgânica e consequentemente de micro-organismos.
Assepsia
• Viveiro...
Está isolado do ambiente externo e com poucas variações climáticas. Normalmente utiliza-se substrato tratado.
Assepsia
• Seleção do explante (material vegetal)
Partes jovens da planta;
Material sadio (visualmente).
•• Teste para detecção de viroses e outras Teste para detecção de viroses e outras enfermidades.enfermidades.
•• PhaelenopsisPhaelenopsis Rio NegroRio Negro
Kits de
Diagnóstico...
Assepsia
• Extração e Toalete do explante
Tanto para extração como para o toalete, devemos utilizar instrumental apropriado e higienizado (pinças e facas esterilizaras e uso de hipoclorito entre uma planta e outra).
Na extração cuidado para não danificar o explante; no toalete, retirar excesso de solo e partes vegetais para facilitar a pré-lavagem.
Banana
Assepsia
• Pré-lavagem do material vegetal.
Lavar em água corrente, com esponja e detergente, a fim de retirar restos de solo, insetos fixados no tecido vegetal ou qualquer fonte de inóculo de fácil remoção.
Sujidade do tecido vegetal
Conceito de “sujidade”!
D-limoneno: adstringente natural que limpa superfície vegetal.
Assepsia
•• Agentes químicosAgentes químicos:
- Álcool 70%;
- Detergentes (Twin 20);
- Produtos a base de Cloro (Ca(ClO)2; NaClONaClO) com 2% de cloro ativo;
- Produtos a base de Mercúrio (HgCl);
- Óleos essenciais !!!!!
Assepsia
• Concentração das Soluções Assépticas (NaClO).
Depende do tipo de tecidos vegetal:
- Mais tenro (suave = 5 a 15% V/V)
-- Folhas, brotações jovens e tecidos tenros...Folhas, brotações jovens e tecidos tenros...
- Consistência média (padrão = 20 a 30% V/V)
-- Ápices caulinares e ramos herbáceos...Ápices caulinares e ramos herbáceos...
- Consistência dura (concentrado = 50% V/V)
-- Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...
Assepsia
• Tempo de assepsia:
-- 5 a 10 minutos;5 a 10 minutos;
- Material tenro
-- 10 a 20 minutos;10 a 20 minutos;
- Material consistência média
-- 20 a 30 minutos;20 a 30 minutos;
- Material consistência dura
Assepsia
• Concentração X Tempo
Resultados negativos!!!!!
Variar concentração e tempo!!!
Concentração Tempo (e vice-versa).
Assepsia
• Retirada da Solução e Lavagem dos explantes:
O processo com solução asséptica é realizado no interior do fluxo laminar. Após o tempo pré determinado, a solução asséptica é drenada e devem ocorrer as lavagem com água destilada esterilizada.
São realizadas 3 lavagens, ainda no interior do fluxo laminar.
Orquídeas!!
Quadro de amadurecimento da cápsula de sementes
GêneroGênero
MesesMeses
Bulbophylum
3
Calanthe
4
Cattleya
11
Coelogynes
13
Cymbidium
10
Cypripedum
3,5
Dendrobium
12
Epidendrum
3,5
Laelia
9
Masdevalia
3,5
Miltônia
9
Odontoglossum
7
Paphiopedilum
10
Phalaenopsis
6
Stanhopea
7
Wanda
20
Cápsula e sementes Orquídeas!
Protocolo de Assepsia (cápsula)
•• AssepsiaAssepsia: hipoclorito comercial 50/50 (v/v),
•• TempoTempo: 20 a 30 minutos,
• Lavagem 3 X com água autoclavada,
• Usar uma lâmina para abrir e outro instrumento
para retirar as sementes.
Germinação in vitro...
Assepsia das sementes
Protocolo de Assepsia (sementes)
•• AssepsiaAssepsia: hipoclorito comercial 30/70 (v/v),
•• TempoTempo: 20 a 30 minutos,
• Lavagem 3 X com água autoclavada,
• Usar seringa ou gase nas lavagens,
• Filtro de café...
Kit Básico!!!
Germinação in vitro...
Peculiaridades!!!
• Lavar em água corrente por 30 minutos ou “over night” (cultura com endofíticos ou de difícil desinfecção).
• Empregar o “sonicador” para fase do hipoclorito.
• Utilizar fogo após a lavagem (rizoma banana).
• Incubar no escuro inicialmente.
• Uso de antibióticos no viveiro (explante) e no meio de cultivo.
Por Meristema
• Feito em híbridos
• Espécies de alta qualidade
• Processo com custo maior
• Cuidados com a planta (número de frentes)
Cultivo in vitro Phaelenopsis
Haste Floral (nós)
Assepsia
Álcool 70 %
30 min. Solução de H2O2 (0,5 %)
15 min. Solução de H2O2 (3,0 %)
Lavar com água destilada estéril (3x)
OU
16.6 g/l dichloroisocyanuric acid Na2 (NaDCC) + Tween 20 (10 min)
Lavar com água destilada estéril (3x)
A
B
Oxidação
A: Sigma Comercial (P6793) B: MS + Vitaminas de TS + cit C: B5 (Gamborg) + BAP D: B5 (Gamborg) E: Arditti & Ernst F: Arditti & Ernst + micro + aux + cit
Cymbidium
Cattleya
INSTALAÇÕES
PLANTAS PARA VENDA
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