Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em
Culturas de Células
Porto, 30 de Julho de 2008
13º Encontro das Ciências
13º Encontro das Ciências 22
Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células
Curso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do PortoAluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares
Orientador:João Manuel R. S. TavaresProfessor Auxiliar do Dep. de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP
Co-Orientador:Luís F. MetelloProfessor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear da ESTSP
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Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células
• Conteúdos da Apresentação:
– Culturas de Células;– Ciclo Celular;– Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas;– Apoptose ou Morte Celular Programada – Principais Vias para Início;
• Apoptose e Necrose;– Radiofármaco;
• Radiofármaco ideal para terapêutica com electrões de Auger– Citometria de Fluxo;– Procedimento de Irradiação;– Estudos de Influxo e Efluxo;– Análise da Apoptose Radioinduzida;– Conclusões Finais;– Perspectivas Futuras.
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Cultura de Células
• Cultura células – o que são?
– Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas quepermitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo deorigem.
– Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura,com concomitante separação das células vizinhas.
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Tipos de Cultura de Células
• Culturas Primárias
– Obtidas por recolha cirúrgica de pequenas peças de tecido;
– Culturas inicialmente heterogéneas, com o tempo tornam-se dominadas por fibroblastos;
– Tempo de sobrevivência in vitroreduzido;
– Propícia a desenvolvimento de contaminações.
• Linhas Celulares
– Crescimento rápido e contínuo;– Proliferação limitada (cerca de 30
divisões celulares) ou ilimitada (ex: células tumorais);
– Mais homogéneas, estáveis e reprodutíveis que culturas primárias;
– Elevada disponibilidade.
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Culturas de Células
Tipos cultura celular
Epiteliais – aderemao substrato e
apresentam formaachatada e poligonal
Linfoblásticas – nãoaderem ao substrato,
permanecem em suspensão comforma esférica
Fibroblásticas – aderem ao substrato, são
alongadas e bipolares
Culturas celulares podem apresentar-seem duas formas:
• Em suspensão;
• Em monocamada aderente.
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Vantagens e Desvantagens daCultura de Células• Vantagens:
– Controlo das condiçõesambientais;
– Análise de parâmetrosindependente;
– Número de testes elevado,num reduzido intervalo detempo;
– Redução dos ensaios comanimais menosdispendiosa.
• Desvantagens:
– Perda das característicasfenotípicas celulares;
– Sistema fora do ambientenatural.
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Ciclo Celular
• Definição: conjunto de transformações dinâmicas e contínuas quedecorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria,por divisão, origina duas células-filhas carácter cíclico, com períodos decrescimento e de divisão.
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Ciclo Celular
Ciclo Celular
Interfase Fase mitótica
Profase – Encurtamento cromossomas;Metafase – Formação fuso acromático;
Anafase – Clivagem dos centrómeros e ascensãocromossomas-fihos;
Telofase – Reorganização da membrana, célula com 2 núcleos;
Citocinese – divisão citoplasma;
Intervalo G1 – Período entre final da mitose e início fase S,
actividade biossintética;Fase S - Replicação do ADN;
Intervalo G2 – final da síntese de ADN e início divisão celular,
síntese de biomoléculas paradivisão celular;
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Ciclo Celular• Células de mamíferos
em cultura
• Fase G1 1 a 8 horas;• Fase S 6 a 8 horas;• Fase G2 2 a 4 horas; • Fase M < 1 hora.
• Total ≈ 10 a 20 horas A célula prepara-se para se dividir
Mitose
A célula divide-se
Início ciclo celular
A célula aumenta de tamanho, biossíntese
Célula retida
A célula decide se prossegue ou não no ciclo
celularA célula replica o seu ADN
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Possíveis Destinos Finais de CélulasIrradiadas
• Ausência de efeito;• Atraso na divisão;• Apoptose;• Falha reprodutiva;• Instabilidade genómica;• Mutação;• Transformação;• Efeito bystander;• Respostas adaptativas.
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Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Alterações Morfológicas
• Encurtamento celular devido a destruição dos filamentos de actina e lâminas docitoesqueleto;
• Quebra da cromatina no núcleo que conduz frequentemente a condensaçãonuclear e, muitas vezes, o núcleo celular toma uma aparência em “ferradura”;
• Contínuo encurtamento celular para permitir posterior remoção pelos macrófagos;
• Na fase final da apoptose surgem pequenas “esferas membranadas”, que formampequenas vesículas, denominadas corpos apoptóticos.
Apoptose de um trofoblasto
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Stress Celular (exemplo: radicais
livres e depleção factor crescimento)
Infecção vírus
Receptores de Morte Celular
Receptores de Morte Celular
Radiação ionizante
Célula T
Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Estímulos
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Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Vias para Início
Apoptose
Iniciada via receptores demorte
Iniciada por estímulos agentesexternos (ex: radiação)
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Apoptose e Necrose
Normal
Normal
Edema reversível Edema Irreversível Desintegração
Condensação Fragmentação Corpos Apoptóticos
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Radiofármaco
• Dois componentes:
– Radionuclídeo emissões energéticas corresponder aosobjectivos esperados e ao detector de radiação utilizado.
– Fármaco seleccionado, com base na sua localizaçãopreferencial num dado tecido ou órgão ou na participaçãofisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores.
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Electrões de AugerElectrões de
Auger
Captura electrónica
Conversãointerna
Conversão interna
• Fotões emitidos pelo núcleo durantedecaimento radioactivo colidem com oselectrões das orbitais mais internas;
• Colisão com electrões das orbitais maisinternas conduz à ejecção dos mesmos;
• Electrões ejectados com energia de keV– superior aos electrões de Auger, masinferior às partículas beta menos.
Captura electrónica:
• Cria-se uma lacuna numa orbital mais interna,devido a transferência de 1 electrão para o núcleo;
• Transição de electrões de orbitais mais externaspara preencher lacuna;
• Diferença de energias entre transições pode serlibertada sob a forma de fotão ou electrões deAuger – electrões de baixa energia.
Exemplos emissores de electrões de Auger: 201Tl, 111In, 99mTc, 67Ga…
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Electrões de Auger – Estado da Arte…
• Buchegger e colaboradores, 2006
– Alcance das partículas emitidas e sua relação com tamanho celular – efeito de crossfire;
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Electrões de Auger – Estado da Arte…
• Buchegger et al, 2006; Kassis et al, 2003;Boswell et al, 2005; Ginj et al, 2005; Chen etal, 2006; Mariani et al, 2000; O’Donnell et al,2006…
– Electrões de Auger no citoplasma – baixo LET
– Electrões de Auger no núcleo – alto LET
– Efeito by-stander.
99mTc – relação 94 vezes
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Electrões de Auger – Estado da Arte…
• Humm et al, 1994
Radionuclídeo C←C(Gy/Bq •s)
C←CS(Gy/Bq •s)
N←N(Gy/Bq •s)
N←Cy(Gy/Bq •s)
N←CS(Gy/Bq •s)
51Cr
67Ga
1.06×10-3
1.86×10-3
5.39×10-4
9.94×10-4
2.04×10-3
3.45×10-3
1.44×10-4
6.32×10-4
2.49×10-8
2.64×10-4
99mTc 8.16×10-4 4.23×10-4 1.55×10-3 8.68×10-5 4.76×10-5
111In
123I
125I
201Tl
203Pb
1.47×10-3
1.56×10-3
3.51×10-3
4.24×10-3
2.67×10-3
8.03×10-4
8.36×10-4
1.86×10-3
2.29×10-3
1.40×10-3
2.70×10-3
2.93×10-3
6.60×10-3
7.83×10-3
5.03×10-3
3.03×10-4
2.72×10-4
5.94×10-4
1.29×10-3
7.14×10-4
1.94×10-4
1.40×10-4
2.62×10-4
6.91×10-4
3.21×10-4
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Radiofármaco Ideal para Terapêuticacom Electrões de Auger
• Electrões emitidos pelos radionuclídeos com menos de 40 keV;
• Razão entre a emissão fotónica/electrão inferior a 2;
• Semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias;
• Nuclídeo-filho estável e com semi-vida física superior a 60 dias;
99mTc – electrões com energias entre 0.9 e 15.4 keV
99mTc – semi-vida física de ≈ 6 horas
99Tc – semi-vida física de ≈ 2.111×105 anos
13º Encontro das Ciências 25
Radiofármaco Ideal para Terapêuticacom Electrões de Auger
• Química adequada aos processos de radiomarcação;
• Radionuclídeo economicamente preparado com elevada actividade específica;
Mais de 80% dos estudos em Medicina Nuclear são realizados com agentes marcados com 99mTc
99mTc – amplamente disponível no serviço de Medicina Nuclear – Gerador 99Mo-99mTc
99mTc ??
• Molécula transportadora deve apresentar umabiodistribuição selectiva para o tecido alvoagente deve associar-se com o complexo do ADNdurante um determinado período de tempoconsistente com a semi-vida física doradionuclídeo.
13º Encontro das Ciências 2626
Citometria de Fluxo
• Técnica utilizada para contar,examinar e classificar partículasmicroscópicas suspensas num meiolíquido em fluxo.
• Através de um aparelho de detecçãoóptico-eletrónico é possível analisarcaracterísticas físicas e/ou químicasde uma simples célula.
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Citometria de Fluxo
Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica
Microscopia Clássica Citometria de Fluxo
Detecção visual Detecção electrónica
Centenas de células analisadas Milhares e milhões de células analisadas
Análise qualitativa Análise quantitativa
Células imobilizadas na lâmina e contadas manualmente
Células em suspensão, passam individualmente em frente ao laser do citómetro de fluxo
13º Encontro das Ciências 28
Procedimento de Irradiação
Linhas de fibroblastos
grande resistência e sobrevivência em meio de cultura
interpretar os resultados obtidos como efeitos da irradiação
99mTc
Eluição gerador 99Mo-99mTc
99mTc-Pertecnetato de sódio adicionado aos meios de
cultura celular
13º Encontro das Ciências 2929
Procedimento de Irradiação
• Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml) de 99mTc;
• Concluído o processo de irradiação determinar quais as doses ideaisde irradiação;
• Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas,que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy.
13º Encontro das Ciências 3030
Estudos de Influxo e Efluxo
• Estudo de influxo
• Quantidade de 99mTc-Pertecnetato deSódio que penetrou a membranacelular.
• Estudo de efluxo
• Quantidade de 99mTc- Pertecnetatode Sódio que entrou na célula, masfoi de seguida expulso para o seuexterior.
Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membranacelular e sua consequente captação por parte da célula.
Centrifugação amostras cultura de células.
13º Encontro das Ciências 3131
Análise da Apoptose Radioinduzida
• Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio.
Reagente
Diagnóstico Celular Anexina V Iodeto de Propídio
Células Viáveis
Início de Apoptose
Final Apoptose e Necrose
13º Encontro das Ciências 3232
Conclusões Finais
• Linhas celulares grande disponibilidade e elevada capacidade dereprodutibilidade.
• Radiação apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis.
• Crescente interesse da comunidade científica relativamente aosradionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99mTc fazparte.
Pertinência e relevância da presente Dissertação
13º Encontro das Ciências 33
Conclusões Finais
• Citometria de Fluxo
– Iodeto de propídio e anexina V
• Determinar de forma rápida e correcta o número de células viáveis, onúmero de células em estádios inicias de apoptose e as células emestádios finais de apoptose ou em necrose presentes numa cultura decélulas.
• Espera-se que este seja o principal método a utilizar para a avaliação dosefeitos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas de célulasseleccionadas.
13º Encontro das Ciências 34Trabalhos Práticos 34
Perspectivas Futuras
1. Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado ecompleto sobre o tema da Dissertação;
2. Melhorar o conhecimento actual do papel do 99mTc enquanto agenteirradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitosradiobiológicos em culturas de células seleccionadas;
3. Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitosda radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose;
4. Estudo de efluxo e influxo do 99mTc-Pertecnetato de Sódio em culturasde células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agenteterapêutico com a sua dinâmica celular.
13º Encontro das Ciências 3535
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