Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose
Danielson Ramos
Introdução
Antes, os estudos da engenharia de DNA eram monitorados pela velocidade de sedimentação em gradiente de sacarose;
Hoje, se utiliza a técnica de eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida, pois são mais simples, rápidas e poder de resolução superior.
Princípio da eletroforese: Consiste na migração e separação de partículas em uma matriz, submetidas a uma diferença de potencial elétrico.
• A migração das partículas depende do tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas.
• Esquema 1: Eletroforese Sistema Horizotal
• Esquema 2: Eletroforese Sistema vertical
Parâmetros que afetam a migração do DNA de fita dupla em gel de agarose
• Tamanho da molécula de DNA, concentração de agarose e marcadores moleculares;
• Conformação do DNA e agentes intercalantes;
• Voltagem aplicada;
• Tampão de corrida
Protocolo Experimental
• Preparo do gel
• Eletroforese
• Anomalias de migração mais frequentes
- Efeito de extremidades;
- Efeito de sobrecarga da amostra;
- Contaminação do DNA por sais e proteínas.
Cuidados Importantes
• Brometo de etídeo: Usar luvas na manipulação e antes de serem descartados, devem ser descontaminados;
• Luz UV: Usar óculos e outros Eps;
• Agarose: Não agitar o erlenmeyer logo após a fusão (preparo);
• Reciclagem do Gel: Descontaminar, estocar em H2O destilada com trocas(15 dias), fundir em microondas, medir o volume e acrescentar o tampão decorrida, estocar a temperatura ambiente;
• Diferentes concentrações de géis na reciclagem, considerar 1%.
Finish
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