Polaridade das Ligações, Geometria Molecular e Força Molecular
y molecular de distrofias de - UAM
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Universidad Autónoma de Madrid Facultad de Ciencias Dpto. de Biología
Caracterización clínica y molecular de distrofias de retina (Enfermedad de Norrie) y formas maculares
(Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt).
TESIS DOCTORAL Rosa Riveiro Álvarez
Madrid, 2006
La Doctora Carmen Ayuso García, Jefa Asociada del Departamento de Genética de la Fundación
Jiménez Díaz,
CERTIFICA:
Que la presente Memoria titulada: Caracterización clínica y molecular de distrofias de retina
(Enfermedad de Norrie) y formas maculares (Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt), que presenta Dña.
Rosa Riveiro Álvarez para obtener el Grado de Doctor, ha sido realizada bajo mi dirección, autorizándola
para su presentación al Tribunal Calificador.
Madrid, a 20 de Julio de 2006.
V B
Fdo. Dra. Carmen Ayuso García Fdo. Prof. Dr. José Fernández Piqueras
Directora de la Tesis Doctoral Tutor de la Tesis Doctoral
AGRADECIMIENTOS
Después de casi ocho meses escribiendo, creo que ha llegado el momento en el que, por fin, os
puedo dedicar unas palabras. Quiero transmitiros que, sin vosotros, la realización de este trabajo hubiese
sido imposible para mí y por ello quiero daros las gracias a todos y cada uno de vosotros.
En primer lugar, quiero agradecer a las Doctoras Carmen Ayuso y Carmen Ramos que me
acogiesen en el laboratorio, hace algo más de cuatro años. No sólo tengo que darles las gracias por todo lo
que he aprendido, sino por su cercanía, su amabilidad y su apoyo.
De manera especial, quiero agradecer a la Doctora Carmen Ayuso la dirección incansable de este
trabajo, pero sobre todo, la paciencia y la capacidad de persuasión que ha tenido con su becaria incesante.
Quiero dar las gracias a la Doctora Isabel Valverde, por haberme orientado tan bien y porque
gracias a ella he tenido esta oportunidad. No me puedo olvidar de su preocupación y cariño todas las veces
que hemos intercambiado unas palabras en el pasillo.
Agradezco a todos mis compañeros de la red EsRetNet su apoyo a lo largo de estos años y que
hayan estado tan cerca siempre que les he necesitado.
De forma especial, quiero dar las gracias a los pacientes, ya que sin ellos no se hubiese podido
realizar este trabajo. Agradezco su paciencia y su colaboración, tanto en la recogida de muestras como en
la realización de los diversos estudios oftalmológicos.
Sobre todo, quiero dar las gracias a mis compañeros del Servicio de Genética de la FJD, ya que
vosotros habéis sido los auténticos compañeros de diario a lo largo de estos años y por eso, quiero daros
las gracias una y mil veces:
- a mi queridísima Aco, por haber compartido conmigo tu enorme conocimiento, por tu cariño y tu apoyo
constante. Porque siempre que he necesitado algo, has dado lo mejor de ti misma y con creces;
- a Chonny, no sólo por todo lo que me has enseñado desde el principio, sino por tu cariño, tu comprensión
y por esas largas horas de terapia, que tan bien nos han venido;
- a Elena, por estar siempre ahí detrás, espalda con espalda. Gracias por todo lo que hablas y aconsejas,
pero también por todo lo que escuchas y comprendes, por echarme siempre una mano y conseguir que no
fibrile;
- a Diego y a Fer, no sólo por vuestra inestimable ayuda a la hora de corregir textos varios en inglés y
solucionar problemas informáticos, respectivamente, sino por vuestra paciencia y confianza.
- a Anita y a Dan, por compartir vuestros conocimientos y vuestras bromas, por todos los buenos momentos
dentro y fuera del laboratorio;
- a Jesús, por enseñarme a hacer Southern y a conocer otros estilos musicales, pero sobre todo, por
echarme un cable a diario y por tu gran sentido del humor;
- a María G.H., por todo lo que me has enseñado, por transmitirme tu inquietud intelectual y tu tesón;
- a Jana, por ser una becaria pequeña estupenda y por confiar en mí, tanto en temas moleculares como en
otros más cotidianos;
- a Cristina y a Míguel, por vuestro trabajo y vuestro sentido del humor y, sobre todo, por conseguir que la
música no deje de sonar en el laboratorio;
- a María F., por ser una fuente inagotable de conocimiento, por tu cariño y tu preocupación, por haberme
echado una mano cuando te he necesitado;
- a Isa, por tus inteligentes preguntas y tus brillantes comentarios, por tu ayuda inestimable y por tu
constante preocupación de madre;
- a Marta, por tu cariño y por no dudar en ayudar cuando se pide un favor, por el ímpetu con el que
transmites tus conocimientos, sean sobre temas científicos o sobre cualquier otro;
- a Aurora y a Tere, por tantas horas de charlas y risas, por conseguir que esos pequeños descansos nos
desestresen a todos un poco;
- a Toñi, por ser tan cariñosa conmigo, dentro y fuera de la consulta;
- a nuestros últimos y estupendos fichajes, Carol, Nuria y Almu, por vuestro entusiasmo con cada cosa que
aprendéis, por vuestro enorme sentido del humor y por vuestro cariño;
También quiero dar las gracias a mis compañeros del Instituto Cajal, especialmente a la Doctora
Paola Bovolenta por haberme acogido durante cuatro meses en su laboratorio, y a Pilar, Jazz, Cristina e
Ivan, por todo lo que me han enseñado, por su enorme paciencia y sentido del humor.
Gracias a todos mis amigos, a los de Vigo y a los de Madrid, por ser como sois, especiales. Porque
aunque no nos veamos a diario, nada cambia entre nosotros y siempre estáis cerca cuando se os necesita.
Mil gracias por vuestra preocupación y apoyo a lo largo de estos últimos meses.
A mis padres, por su cariño, bondad y generosidad infinitos. Por su apoyarme en mis decisiones,
por comprenderme y ayudarme a diario. Porque gracias a vosotros cualquier cosa es posible.
De manera especial, quiero dar las gracias a Gonzalo, no sólo por ser un marido excepcional, sino
por ser un gran amigo y compañero. Por tus inteligentes consejos, por ser mi apoyo a diario y por no dejar
nunca de sorprenderme. Por contagiarte con mi alegría y, lo que es mejor, compartirla con los demás. Por
ayudarme a no preocuparme cuando las cosas no tienen solución, o cuando la tienen.
Mil gracias por estar siempre a mi lado.
If you wanna kiss the sky,
better learn how to kneel.
Misterious Ways
U2
A mis padres, a mis amigos,
a Gonzalo.
A vosotros os dedico esta Tesis.
Índice
Páginas
Prólogo 1
I‐ Introducción
1‐ El ojo humano 3
1.1- Anatomía del globo ocular 3
1.2- La retina 3
1.2.1- Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina 4
1.2.2- Histología de la retina 5
1.2.3- Fisiología: El proceso de fototransducción 10
2‐ Retinopatías hereditarias 12
2.1- Introducción 12
2.2- Diagnóstico oftalmológico 12
2.2.1- Antecedentes personales y familiares 12
2.2.2- Exploración oftalmológica 13
2.3- Características de las retinopatías hereditarias 14
2.3.1- Heterogeneidad en el patrón de herencia 14
2.3.2- Heterogeneidad genética 15
2.3.3- Heterogeneidad clínica 16
3‐ Enfermedades congénitas de la retina 16
4‐ Enfermedad de Norrie (ND) / Vitreorretinopatía Exudativa Familiar (VREF) 17
4.1- Rasgos clínicos 17
4.2- El gen: NDP 18
4.3- La proteína: Norrina 18
5‐ Retinopatías hereditarias centrales: Distrofias maculares 19
5.1- Aspectos clínicos 19
5.2- Aspectos genéticos 20
6‐ Retinosquisis Juvenil Ligada al Cromosoma X (XLRS) 20
6.1- Rasgos clínicos 20
6.2- El gen: RS1 21
6.3- La proteína: Retinosquisina 21
Índice
Páginas
7‐ Enfermedad de Stargardt (STGD) / Fundus Flavimaculatus (FFM) 24
7.1- Rasgos clínicos 24
7.2- El gen: ABCA4 25
7.3- Variantes alélicas de ABCA4 25
7.3.1- Variantes alélicas 25
7.3.2- Fenotipos asociados a defectos en ABCA4 26
7.4- La proteína: ABCA4/RmP 27
8‐ Perspectivas de futuro: tratamientos 29
8.1- Remodelación de la retina en el proceso degenerativo 29
8.2- Terapia génica 30
8.3- Retinas artificiales 31
8.4- Células madre 31
II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos 32
III‐ Pacientes y Métodos 34
1‐ Pacientes y familias estudiadas 35
1.1- Procedencia de los pacientes 35
1.2- Consulta y cuestionario inicial 35
1.3- Clasificación de las familias estudiadas 35
2‐ Metodología 51
2.1- Obtención de ADN genómico 51
2.1.1- Extracción de ADN genómico 51
2.1.1.1- Extracción de ADN por método salino 51
2.1.1.2- Extracción automática de ADN 52
2.1.2- Espectrofotometría de ADN: lectura de la concentración 52
2.1.3- Purificación de ADN genómico 53
2.2- Estudio genético directo 54
2.2.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR 55
2.2.1.1- Condiciones de la PCR 55
2.2.1.2- Cebadores 55
2.2.1.3- Detección del producto de PCR mediante electroforesis 57
2.2.2- Cribado de mutaciones mediante microarray de genotipado 58
Índice
Páginas
2.2.3- Secuenciación automática 59
2.2.3.1- Purificación del producto de PCR 59
2.2.3.2- Reacción de secuenciación 60
2.2.3.3- Purificación del producto secuenciado 61
2.2.4- Análisis con enzimas de restricción 62
2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay) 63
2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography) 64
2.3- Estudio genético indirecto 65
2.3.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR 65
2.3.1.1- Condiciones de la PCR 65
2.3.1.2- Cebadores 65
2.3.2- Análisis de haplotipos 68
2.3.3- Diseño de árboles genealógicos 68
2.4- Estudios de expresión 69
2.4.1- Vectores de expresión 69
2.4.2- Cultivos celulares y transfección 69
2.4.3- Inmunocitoquímica 72
2.4.4- Western Blot 72
IV‐ Resultados 76
1‐ Gen NDP 77
1.1- Estudio genético directo 77
1.1.1- Familias estudiadas 77
1.1.2- Caracterización de mutaciones 77
1.1.3- Caracterización de polimorfismos 78
1.2- Estudio genético indirecto 79
1.2.1- Familias estudiadas 79
1.2.2- Análisis de haplotipos 79
1.2.3- Haplotipos prevalentes 79
1.3- Correlación genotipo-fenotipo 81
1.4- Origen geográfico de las mutaciones 82
2‐ Gen RS1 84
2.1- Estudio genético directo 84
2.1.1- Familias estudiadas 84
2.1.2- Caracterización de mutaciones 84
Índice
2.1.3- Caracterización de polimorfismos 86
2.2- Estudio genético indirecto 86
2.2.1- Familias estudiadas 86
2.2.2- Análisis de haplotipos 86
2.2.3- Haplotipos prevalentes 87
2.3- Correlación genotipo-fenotipo 88
2.4- Origen geográfico de las mutaciones 91
2.5- Estudios de expresión 92
2.5.1- Localización subcelular de la Retinosquisina 92
2.5.2- Detección de la Retinosquisina mediante Western Blot 92
3‐ Gen ABCA4 94
3.1- Estudio genético directo 94
3.1.1- Familias estudiadas 94
3.1.2- Caracterización de mutaciones 94
3.1.3- Caracterización de polimorfismos 111
3.2- Estudio genético indirecto 113
3.2.1- Familias estudiadas 113
3.2.2- Análisis de haplotipos 113
3.3.2- Haplotipos prevalentes 120
3.3- Correlación genotipo-fenotipo 123
3.4- Origen geográfico de las mutaciones 126
3.5- Frecuencia de alelos mutantes de ABCA4 entre la población general 128
V‐ Discusión 130
1‐ Discusión general 131
2‐ Epidemiología de las distrofias de retina estudiadas 132
3‐ Gen NDP 133
3.1- Estudio genético directo 133
3.2- Estudio genético indirecto 134
3.3- Correlación genotipo-fenotipo 135
4‐ Gen RS1 136
4.1- Estudio genético directo 136
4.2- Estudio genético indirecto 137
4.3- Correlación genotipo-fenotipo 138
Índice
5‐ Gen ABCA4 138
5.1- Implicación en la Enfermedad de Stargardt 138
5.1.1- Estudio genético directo 138
5.1.2- Estudio genético indirecto 142
5.2- Implicación en la Distrofia de Conos y Bastones Autosómica Recesiva 144
5.2.1- Estudio genético directo 144
5.2.2- Estudio genético indirecto 145
5.3- Implicación en la Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva 145
5.3.1- Estudio genético directo 145
5.3.2- Estudio genético indirecto 145
5.4- Implicación en otras distrofias de retina 146
5.4.1- Implicación en la Distrofia Macular Autosómica Dominante 146
5.4.2- Implicación en familias con fenotipo diverso 146
5.5- Implicación en reorganizaciones cromosómicas 147
5.6- Correlación genotipo-fenotipo 150
5.7- Epidemiología de los alelos mutantes en ABCA4 153
6‐ Distribución geográfica de las mutaciones en los pacientes estudiados. 153
7‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia ligada al cromosoma X 155
8‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia autosómica recesiva 155
VI‐ Conclusiones 157
VII‐ Bibliografía 160
VIII‐ Bases de datos 174
IV‐ Publicaciones 176
1
PRÓLOGO
El ojo es un órgano complejo que nos permite apreciar el mundo que nos rodea, adquirir nuevos
conocimientos y comunicarnos con los demás. Todas las partes del globo ocular son importantes para
percibir correctamente una imagen, pero sin duda, la capa fundamental en el proceso de la visión es la
retina.
Conocer la organización de la retina ha sido una meta para muchos científicos durante los últimos
cien años. Las descripciones anatómicas de Santiago Ramón y Cajal (1892) de los distintos tipos celulares
que constituyen la retina de los vertebrados, el temprano conocimiento de los procesos fotoquímicos que
tienen lugar en ellos y los estudios de adaptación a la visión en color, hicieron posible que en los años
sesenta se tuviese un rudimentario conocimiento de cómo debía estar organizada la retina y cuál era su
funcionamiento.
En el campo de la Genética, también se han producido importantes avances a lo largo de estos
años. Sin duda, se han producido tres acontecimientos relevantes. El primero de ellos, ocurrido ya en el
siglo pasado, fue el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ácido desoxirribonucleico (ADN)
por James Watson y Francis Crick (1953), basado en los estudios previos de Rosalind Franklin, Maurice
Wilkins y Erwin Chargaff. De esta manera, se identificaba la molécula portadora de toda la información
genética de un organismo. Posteriormente, el científico español Severo Ochoa y el norteamericano Arthur
Kornberg volvían a revolucionar al mundo científico al conseguir descifrar el código genético, hecho que
permitía traducir la secuencia de bases del ADN en aminoácidos, los componentes esenciales de las
proteínas que constituyen nuestro organismo.
Han pasado cincuenta años desde el modelo de la doble hélice e incluso ha comenzado un nuevo siglo,
hasta que se ha podido obtener la secuencia completa del ADN a través del Proyecto Genoma Humano
(PGH; Abril 2003).
Hoy en día, la comunidad científica trata de aunar todos los conocimientos que nos han legado los
investigadores que nos han precedido, con el fin de comprender mejor cuáles son los mecanismos
moleculares subyacentes a cualquier proceso biológico. Asimismo, es preciso determinar qué sistema no
funciona correctamente en un determinado proceso de enfermedad, así como encontrar un tratamiento
eficaz, ya sea a través de fármacos, implantes o terapia génica.
A todos ellos que, con su gran esfuerzo, su valioso trabajo y su excepcional inteligencia, nos han
permitido tomar el relevo en este arduo camino, cada vez más avanzado,
Gracias.
Esquema de la retina de vertebrados mostrando los principales tipos celulares.
Dibujo original de Cajal, alrededor de 1890.
I- Introducción
2
I- Introducción
3
I- INTRODUCCIÓN
1- EL OJO HUMANO
1.1- ANATOMÍA DEL GLOBO OCULAR
En el ojo, se diferencian varias estructuras externas:
- una apertura negra, la pupila, que permite que la luz entre en el ojo;
- el iris, que es un músculo coloreado circular, responsable del color de los ojos. La contracción y relajación
del iris regula el tamaño de la pupila, permitiendo la entrada de mayor o menor cantidad de luz;
- una superficie externa transparente, la córnea, que recubre la pupila y el iris. Ésta es la primera lente y la
más potente del sistema óptico que, junto con el cristalino, permite la producción de una imagen definida a
nivel de los fotorreceptores;
- la esclera, que forma parte de la pared que sustenta el globo ocular. La esclera es contigua a la córnea.
En una sección sagital del ojo, se diferencian tres capas distintas:
1- La capa externa, formada por la esclera y la córnea.
2- La capa intermedia, dividida en dos partes:
- anterior: contiene el iris y el cuerpo ciliar; - posterior: contiene la coroides o capa vascular.
3- La capa interna o parte sensorial del ojo, la retina.
Existen tres cámaras rellenas de fluídos:
- cámara anterior: entre la córnea y el iris;
- cámara posterior: entre el iris, los ligamentos que sostienen al cristalino y el propio cristalino; ambas
cámaras están rellenas de humor acuoso.
- cámara vítrea: situada entre el cristalino y la retina; rellena de humor vítreo.
El cristalino, situado detrás del iris, está suspendido por unos ligamentos unidos a la porción
anterior del cuerpo ciliar. La contracción y relajación de estos ligamentos como consecuencia de las
acciones del cuerpo ciliar, producen cambios en la forma del cristalino en un proceso denominado
acomodación, que permite formar una imagen definida en la retina. Además, el ojo es rotado por los
músculos oculares. (Figura I.1)
1.2- LA RETINA La retina es la más interna de las tres túnicas de las que se componen los ojos de los vertebrados:
esclera, coroides y retina (Weisz & Keogh, 1987). Se diferencian dos regiones:
- retina anterior o ciega: reviste la cara posterior del cuerpo ciliar, los procesos ciliares y el iris;
- retina posterior o sensible: es la porción del ojo sensible a la luz, que desarrolla una función receptora e
integradora de las imágenes que recibe. En ella se observan dos elementos:
I- Introducción
- la papila del nervio óptico: corresponde al punto ciego de la retina por el que los axones de las
células ganglionares abandonan la retina para formar el nervio óptico;
- la mácula: es una región de la retina de aproximadamente 5 milímetros (mm) de diámetro. Es la
región encargada de la visión de mayor nitidez y definición.
Figura I.1: Anatomía externa e interna del globo ocular (www.eyedesignbook.com).
1.2.1- DESARROLLO EMBRINARIO DEL GLOBO OCULAR Y DE LA RETINA
Durante la gastrulación (proceso que sufre el embrión y que conduce a la formación de las tres
capas germinales: ectodermo, mesodermo y ectodermo), el ojo embrionario consiste en un surco óptico
localizado en el centro del encéfalo anterior (Figura I.2A).
Este surco óptico se separa en dos vesículas ópticas laterales, en torno al vigésimo octavo día de
gestación en humanos (Figura I.2B). A medida que se desarrollan estas vesículas, sus extremos distales se
expanden y se constriñen, formando los tallos ópticos.
A continuación, se produce un evento crucial en el desarrollo ocular, que es interacción de la
vesícula óptica con la placa del cristalino. Como resultado, la placa del cristalino se invagina y se
convierte en la fóvea del cristalino (Figura I.2C).
En este momento, en los tallos ópticos se desarrollan unos surcos denominados fisura óptica, de cuyo
mesénquima se forman los vasos sanguíneos hialoideos. A medida que se acercan y se fusionan los
bordes de la fisura, los vasos hialoideos quedan encerrados dentro del nervio óptico y darán lugar a la
arteria y a la vena central de la retina.
4
I- Introducción
Entre el trigésimo primer y el trigésimo quinto día de gestación, la fóvea del cristalino se cierra
formando las vesículas del cristalino. A su vez, estas vesículas se invaginan, dando lugar a la cúpula óptica, de doble capa (Figura I.2D).
La capa externa de la cúpula óptica originará el epitelio pigmentario de la retina (EPR) (sexta
semana de gestación) y la capa interna dará lugar a la retina neural (entre la cuarta y la quinta semana de
gestación) (Figura I.2E). Los primeros conos y bastones aparecen en embriones humanos entre la semana
diez y la semana quince, mientras que las capas de células horizontales, bipolares y ganglionares aparecen
a la mitad del desarrollo embrionario.
Figura I.2: Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina (Graw J, 2003).
1.2.2- HISTOLOGÍA DE LA RETINA
La sección vertical de la retina humana muestra una estructura estratificada compleja que incluye el
epitelio pigmentario de la retina, las capas neuronales y las membranas limitantes externa e interna, en las
que se producen las conexiones sinápticas. Las células implicadas en las distrofias de retina (DR) son los
fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario de la retina (Haw AW, 1970; Krstic RV, 1997).
Las primeras neuronas de la vía visual son los fotorreceptores, que se sitúan en la capa de conos y
bastones o capa nuclear externa. Los fotorreceptores traducen la señal luminosa y establecen sinapsis en
la capa plexiforme externa con la siguiente neurona: la célula bipolar, situada en la capa nuclear interna.
Esta neurona emite su axón a la capa plexiforme interna y conecta con la célula ganglionar, en la capa de las células ganglionares.
5
I- Introducción
Por último, los axones de las células ganglionares se dirigen hacia la papila del nervio óptico, formando la
capa de fibras del nervio óptico.
Figura I.3: Estructura de la retina.
EPITELIO PIGMENTARIO DE LA RETINA (EPR) Es la capa más externa de la retina. Está unida a la membrana de Bruch, que la separa de la
coroides o capa vascular. El EPR está formado por células columnares cargadas de melanina, contienen
microvellosidades en su polo apical y vainas cilíndricas en su membrana plasmática que envuelven los
segmentos externos de conos y bastones (Junqueira LC & Carneiro J, 1987).
Sus funciones, vitales para el proceso visual, son las siguientes:
1- Reciclaje de fotorreceptores: fagocitosis y digestión lisosómica de los discos del segmento externo de
conos y bastones.
2- Interviene en el ciclo de la vitamina A.
3- Síntesis de melanina: absorbe la luz no capturada por los fotorreceptores, impidiendo que se refleje
dentro del ojo.
4- Aporte de nutrientes para los fotorreceptores.
5- Síntesis de glicosaminoglicanos (componentes de la matriz extracelular de los fotorreceptores).
6- Barrera entre la circulación coloidal y las capas externas de la retina. Transporte iónico y de agua desde
el espacio subretinal.
6
I- Introducción
FOTORRECEPTORES
Los fotorreceptores son células alargadas sobre las que incide la luz siguiendo un eje longitudinal.
Su morfología está constituída por dos regiones diferenciadas: el segmento interno y el segmento externo.
En la región basal del segmento interno, se encuentran el núcleo y la región axónica. Esta región celular
también contiene abundantes mitocondrias, el retículo endoplasmático rugoso y el aparato de Golgi.
El segmento externo, unido al segmento interno por un estrecho cilio, posee un gran desarrollo de
membranas fotosensibles.
Figura I.4: Estructura del fotorreceptor.
Además de presentar diferencias morfológicas, los conos y los bastones difieren entre sí en su
función y distribución. Los conos son los responsables de la visión a elevados niveles de luz (fotópica), por
lo que perciben el color y una visión diurna muy rica en detalles. Contienen unos pigmentos visuales
denominados opsinas y, en función del fotopigmento que portan, los conos se subdividen en rojos, verdes
y azules. Existen unos seis millones de conos, la mayor densidad de ellos se encuentran en la mácula, la
región central de la retina. En el centro de la mácula se sitúa la fóvea, que es la región de mayor agudeza
visual.
Los bastones poseen un umbral de excitación más bajo y son los responsables de la visión
nocturna (escotópica) y en blanco y negro. En la retina humana hay alrededor de unos ciento cincuenta
millones de bastones, dispuestos de forma periférica. Por tanto, a medida que nos alejamos de la fóvea,
aumenta la densidad de bastones y disminuye la densidad de conos, disminuyendo la agudeza visual.
Segmento externo
Es el polo sensorial de la célula y está en íntimo contacto con el EPR. Es una prolongación celular
que diferencia morfológicamente a los conos (cortos y gruesos) de los bastones (largos), en la que tiene
lugar el proceso de fototransducción. Ultraestructuralmente, está constituido por microvesículas formando
unos mil discos apilados (Rawn JD, 1989). Éstos se encuentran rodeados por membrana plasmática,
formada a partir de invaginaciones de la membrana celular, que se separan de ésta en el caso de los
bastones y que permanecen como tales invaginaciones en el caso de los conos.
7
I- Introducción
8
Estas estructuras no son estáticas, sino que están sometidas a un proceso de reciclaje continuo:
- en los bastones, los discos migran hacia la porción apical del fotorreceptor progresivamente y son
fagocitados por el EPR. El proceso de migración dura entre nueve y doce días y el EPR fagocita alrededor
del 10% del segmento externo diariamente. Simultáneamente, se va añadiendo membrana nueva en el
lugar de la unión segmento externo-interno (Zinn KM & Marmor MF, 1979; Travis GH, 1997).
- En los conos, no se da la renovación de los discos ya que éstos son plegamientos de la propia membrana.
Se piensa que la estructura del disco se mantiene gracias a proteínas específicas del segmento
externo de conos y bastones, como la proteína RDS/periferina y la proteína ROM1, que contribuyen al
mantenimiento de la curvatura de los discos y de su anclaje al citoesqueleto del fotorreceptor (Connell GJ &
Molday RS, 1990).
Desde el punto de vista bioquímico, la membrana del segmento externo se caracteriza por una
elevada fluidez, debido a una composición baja en colesterol y extremadamente alta en ácidos grasos
esenciales (Deamen FJM, 1973). Otro componente que aparece en una composición inusualmente alta es
la vitamina E (α-tocoferol), que contribuye a la eliminación del producto generado por la fotooxidación de los
ácidos grasos del segmento externo.
Segmento interno
El segmento interno está separado del externo mediante una constricción denominada cilio de conexión, que interviene en el metabolismo celular sintetizando macromoléculas que liberan energía para
la fototransducción.
Esta porción del fotorreceptor presenta apilamiento de mitocondrias, contiene los orgánulos celulares y
acumula gran cantidad de glucógeno. El núcleo se localiza al comienzo del axón, el cual realiza sinapsis
con las células bipolares, lo que supone el primer relevo de la vía visual.
Opsinas o pigmentos visuales
Los segmentos externos de conos y bastones contienen sólo un tipo de pigmento visual por tipo
celular. El 11-cis-retinaldehído es el cromóforo para los cuatro pigmentos visuales. Se dispone
paralelamente al plano de la bicapa y perpendicularmente a las α-hélices, posición que le permite el
aumento en la captura de fotones. Las opsinas son proteínas que participan en la fotorrecepción: absorben
luz a distintas longitudes de onda, transformándola en impulsos nerviosos.
La rodopsina, opsina que se expresa en los bastones, se excita en condiciones de baja intensidad
lumínica y su máximo de absorción es de 493 nanómetros (nm) (Merbs SL & Nathans, 1992). Existen otros
tres pigmentos visuales que se localizan en los conos y absorben a distintas longitudes de onda (Stockman
A et al., 2000). El pigmento azul absorbe a 426 nm y su gen se encuentra localizado en 7q31. Las dos
últimas opsinas se encuentran en el cromosoma Xq28: el pigmento verde que absorbe a 530 nm y el
I- Introducción
pigmento rojo que absorbe a 552 o 557 nm, dependiendo de la presencia de un polimorfismo en el codon
180 que puede ser alanina o serina.
Figura I.5: Espectros de absorción de los pigmentos de los fotorreceptores.
OTROS TIPOS CELULARES
Células bipolares
Son las segundas neuronas del proceso visual. Establecen sinapsis mediante sus dendritas con el
fotorreceptor en la capa plexiforme externa y emiten su axón a la capa plexiforme interna, donde ocurre el
tercer relevo sináptico con las células amacrinas o las células ganglionares (Boycott BB et al., 1987). Su
función es crucial para detectar contrastes débiles o cambios en la intensidad de luz.
Células horizontales
Este tipo celular está ubicado entre la capa nuclear interna, donde se observan sus somas y en la
capa plexiforme externa, donde extiende sus dendritas y sus axones.
Sus terminaciones dendríticas forman sinapsis tripartitas o tríadas con los conos y las células bipolares de
los conos. Las terminaciones derivadas de sus axones inervan lateralmente las esférulas, que es como se
denomina a las conexiones que se establecen entre los bastones y la célula bipolar del bastón.
Se considera que desempeñan un papel esencial en el circuito de contraste simultáneo y la adaptación
neural a la luz.
Células amacrinas
Este término quiere decir “sin axón”. Establecen sinapsis con las células bipolares, con las células
ganglionares y con otras células amacrinas en la capa plexiforme interna.
Células ganglionares
Son las mediadoras del último relevo sináptico de la retina. Sus dendritas conectan con las células
amacrinas y bipolares en la capa plexiforme interna y sus cuerpos se localizan en la capa de células
ganglionares. Sus axones se organizan en la capa de axones del nervio óptico, que abandona la retina por
el punto ciego. Su función consiste en distinguir y seleccionar la información visual que se transmite al
cerebro (Lennie P et al., 1990).
9
I- Introducción
10
La glía. La célula de Müller Las células gliales son un componente esencial de la retina. Histológicamente, se diferencian
células tanto del tipo astroglía como microgliales pero, sobre todo, destaca la célula de Müller.
La célula de Müller está dispuesta verticalmente a todas las capas de la retina, abarcando todas ellas:
desde el soma, en la capa nuclear interna, irradian prolongaciones hacia las capas más internas de la
retina, rodeando vasos sanguíneos y en contacto con el humor vítreo. También emiten prolongaciones
hacia las capas de los fotorreceptores, rodeando a estas células. A su paso por las distintas capas, cubren
los cuerpos neuronales y las dendritas de los distintos tipos celulares.
Desempeñan funciones esenciales para la supervivencia de la retina: constituyen un tejido de
sostén para los diversos tipos celulares, intervienen en la nutrición retiniana mediante el acúmulo de
glucógeno y ejercen una función defensiva mediante fagocitosis.
1.2.3- FISIOLOGÍA: EL PROCESO DE FOTOTRANSDUCCIÓN
El proceso de fototransducción tiene lugar en los discos del segmento externo de los
fotorreceptores. El fotorreceptor es sensible a la luz y responde al estímulo luminoso variando su potencial
de membrana y, como consecuencia, varía su emisión del neurotransmisor glutamato al espacio sináptico
en la capa plexiforme externa.
En el bastón, adaptado a la oscuridad, el potencial de membrana está en torno a unos -40 milivoltios (mV).
Este potencial se mantiene en ausencia de luz debido a la existencia de una “corriente oscura” catiónica:
esta corriente se produce en reposo en el segmento externo del bastón por la actividad de un transportador
catiónico Na+/Ca2+ dependiente de GMP cíclico (GMPc) que, en oscuridad, permanece abierto.
Por tanto, se produce una liberación tónica de glutamato al espacio sináptico en ausencia de estímulos
visuales.
La molécula fotosensible de los discos de los bastones es la rodopsina, que consta de una parte
proteica, la opsina y un grupo prostético unido covalentemente, el 11-cis-retinal.
Fase luminosa
La cascada visual comienza con la captación de un fotón de luz, que provoca la activación de la
rodopsina por la isomerización del 11-cis-retinal a todo-trans-retinal, provocando un desplegamiento de la
proteína. Entonces, la rodopsina pasa en milisegundos por distintos estados energéticos derivados de los
cambios conformacionales y alcanza su forma activa y más estable: metarrodopsina II.
La rodopsina activada, a su vez, interactúa con la siguiente proteína de la cascada: la transducina,
que es una proteína heterotrimérica que consta de tres subunidades (α,β,γ). La rodopsina estimula la
subunidad α de la transducina, que se disocia y cataliza la conversión de GDP a GTP.
La transducina activada provoca un cambio conformacional en el complejo de la fosfodiesterasa
(PDE), una proteína G heterotetramérica: consta de dos tipos de subunidades activadoras (α,β) y dos
subunidades inhibitorias (γ). La disociación de estas dos últimas hace que la PDE hidrolice el GMPc a GMP.
I- Introducción
Esta situación provoca el cierre de los canales catiónicos de la membrana plasmática del bastón,
produciendo un aumento de polaridad en la membrana.
Esta hiperpolarización genera el potencial receptor, constituyendo la primera señal eléctrica de transmisión
de información neuronal (Yau KW, 1994).
Figura I.6: Esquema de las proteínas de la cascada visual.
Fase oscura
La finalización de la fotoexcitación se produce por inactivación de la metarrodopsina II por la
fosforilación de resíduos de serina y treonina de su extremo carboxilo terminal, mediante la enzima
rodopsina quinasa.
Posteriormente, la rodopsina fosforilada se une a la arrestina: la actuación de ambas enzimas evita la unión
de la rodopsina a la transducina, permitiendo que se paralice el proceso (Wilden U et al., 1996).
También es necesaria la inactivación de la transducina y la PDE, proceso en el que parecen estar
involucradas la concentración de Ca2+ intracelular y la recoverina: el descenso de las concentraciones de
Ca2+ provoca la activación de la recoverina, enzima que a su vez activa la guanilato ciclasa, que
reconstituye los niveles de GMPc. De esta forma, se reanuda la apertura de los canales dependientes de
GMPc.
El aumento del Ca2+ inhibe a su vez la actividad de la recoverina. La transducina GTPasa se
encarga de catalizar la separación de la transducina y la PDE, permitiendo su inactivación al unirse de
nuevo a sus subunidades inhibitorias.
Mientras, el todo-trans-retinal (el cromóforo) es reducido rápidamente a todo-trans-retinol, por la enzima
retinol deshidrogenasa y mediado por el paso de NADPH a NADP. Para que se produzca este último paso,
es necesario que el todo-trans-retinal sea transportado desde la membrana intradiscal al citoplasma del
fotorreceptor por la proteína RmP (Sun H et al., 2000), como se verá más adelante.
El proceso de fototransducción que se ha descrito en los bastones, ocurre de forma similar en los
conos. La diferencia radica en la longitud de onda a la que absorben las opsinas de los distintos conos.
De esta manera, cada tipo de cono se excita de forma espectralmente independiente, para un determinado
color.
11
I- Introducción
12
2- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS
2.1- INTRODUCCIÓN
Las distrofias hereditarias de la retina son un conjunto de enfermedades degenerativas y
generalmente progresivas, causadas por la afectación primaria de los fotorreceptores, que ocurren en una
de cada 3000 personas. Se caracterizan por ser transtornos hereditarios, por la evolución progresiva y por
no tener, por el momento, un tratamiento ni paliativo ni curativo, lo que conlleva a la pérdida total o parcial
de la visión (Rivolta C et al., 2002).
Histológicamente, la pérdida de los fotorreceptores es seguida generalmente por alteraciones en el
epitelio pigmentario y en la glía de la retina. Finalmente, los cambios degenerativos también afectan a las
neuronas de la retina profunda, a los vasos y a la cabeza del nervio óptico (Milam et al., 1998).
Las distrofias de retina (DR) se pueden clasificar, de manera general, en:
- formas periféricas, en las que los bastones son las células de la retina que se ven afectados inicialmente;
incluyen las formas típicas de Retinosis Pigmentaria (RP),
- formas centrales, con degeneración de los conos en su inicio, pudiendo afectarse de forma secundaria o
no los bastones; incluyen las distrofias maculares (DM), las distrofias de conos, las distrofias de conos y
bastones (DCB), etc.
2.2- DIAGNÓSTICO OFTALMOLÓGICO
2.2.1- ANTECEDENTES PERSONALES Y FAMILIARES
El diagnóstico temprano de las DR requiere una historia clínica completa, en la que se resaltan tres
aspectos fundamentales (www.retinosis.org):
a) Sintomatología y edad de comienzo: Generalmente el paciente se queja de pérdida de la agudeza
visual, reducción del campo visual, mala adaptación a la oscuridad (hemeralopia/ceguera nocturna) o
intolerancia a la luz (fotofobia), etc. El comienzo de los síntomas es muy variable, existiendo formas muy
tempranas (incluso congénitas), formas juveniles (entre la primera y la segunda década de vida) y formas
adultas.
b) Árbol genealógico: Dado el carácter hereditario de esta patología, es necesario reconstruir al menos
tres generaciones del enfermo. También es importante tener en cuenta la posible existencia de
consanguinidad en la familia, especialmente en aquellos casos que puedan presentar herencia recesiva de
la enfermedad.
c) Antecedentes personales: Resultan fundamentales, tanto en relación al proceso ocular (diagnóstico
diferencial de formas secundarias), como a cualquier alteración sistémica (diagnóstico diferencial e
identificación sindrómica).
I- Introducción
13
2.2.2- EXPLORACIÓN OFTALMOLÓGICA
La exploración oftalmológica incluye, entre otras, las siguientes pruebas (García-Sandoval B, 2001):
- Agudeza visual: Se utiliza, entre otras, el test de visión de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell, que
consiste en cuatro conjuntos de fichas de color removibles con un total de 85 fichas de referencia de color a
lo largo del espectro visible. Las anomalías en la visión de color son detectadas cuando el paciente es
incapaz de colocar las fichas en el orden correcto (Figura I.7a).
- Biomicroscopía del segmento anterior: Permite detectar cataratas subcapsulares posteriores, unos de
los hallazgos más frecuentes en los pacientes con RP.
- Campimetría: La técnica más empleada para valorar el campo visual es el campímetro de Goldman, que
proporciona información sobre la densidad del escotoma (zona sin visión) en valor absoluto y la representa
en escala de grises (Figura I.7b).
- Funduscopia: Examen del fondo de ojo utilizando un microscopio de rendija y unas lentes corneales de
contacto o simplemente una lente manual de 90 dioptrías (Figura I.7c).
- Electrooculograma (EOG): Es un examen que consiste en colocar pequeños electrodos cerca de los
músculos de los ojos para medir el movimiento de éstos.
- Electrorretinograma (ERG): Esta prueba consiste en el registro -mediante un electrodo encajado en una
lente de contacto- de los cambios del potencial eléctrico obtenido en la retina tras un estímulo luminoso.
Sirve para evaluar la integridad funcional de la retina y, más específicamente, de los bastones (ERG
escotópico), de los conos (ERG fotópico) o de ambos sistemas fotorreceptores (ERG mixto) (Figura I.7d).
- Angiofluoresceingrafía (AFG): Permite observar un efecto pantalla por los depósitos de pigmento que
impiden ver la fluorescencia coroidea (Figura I.7e).
- Tomografía de coherencia óptica (TCO): Representa los estratos de la retina en forma de una imagen
de sección transversal de alta resolución. Los colores calientes -rojo y blanco-, corresponden a zonas de
alta reflectividad. Los colores fríos -azul y negro-, cuentan con una reflectividad más débil y caracterizan
células ganglionares, fotorreceptores y la coroides (Figura I.7f).
I- Introducción
Figura I.7: a) Test de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell. b) Campimetría: las zonas oscuras representan las
regiones en las que se produce el escotoma. c) Fondo de ojo de un individuo sano. d) ERG con patrón bifásico típico de
un individuo normal. e) Imagen obtenida por AFG de un individuo sano, en el que se observa la fluorescencia de los
vasos sanguíneos de la coroides. f) Imagen obtenida por TCO, en la que se observan las distintas capas celulares.
2.3- CARACTERÍSTICAS DE LAS RETINOPATÍAS HEREDITARIAS
Unas de las características típicas de las DR es su elevada heterogeneidad, tanto a nivel genético
como a nivel clínico. De hecho, las manifestaciones de cada una de las diversas formas de DR varían en
función del patrón de herencia con el que se transmiten a las siguientes generaciones (Valverde D, 2001).
2.3.1- HETEROGENEIDAD EN EL PATRÓN DE HERENCIA
Herencia autosómica dominante (AD)
Se caracteriza porque en cada generación aparece al menos un afecto (transmisión vertical).
Varones y hembras se encuentran afectados por igual, ya que el gen alterado está situado en alguno de los
veintidós autosomas y presenta dos alelos, uno normal y otro mutado.
El riesgo de transmisión es del 50% en cada hijo de un afecto. La transmisión de varón a varón permite el
diagnóstico diferencial respecto a la herencia ligada al X.
Herencia autosómica recesiva (AR)
En este modelo de herencia aparecen varios miembros afectos dentro de una misma generación
(transmisión horizontal). Los progenitores son portadores sanos (presentan un alelo sano y otro mutado) y
la enfermedad se manifiesta cuando alguno de los hijos (varón o hembra) hereda ambos alelos mutados:
uno del padre y otro de la madre.
Por tanto, la enfermedad se hereda por ambas ramas familiares y la consanguinidad o la endogamia entre
las mismas suele ser un hecho frecuente. El riesgo de aparición de la enfermedad es de un 25% para cada
hijo. Todos los hijos de un afecto serán portadores.
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I- Introducción
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Herencia ligada al cromosoma X (XL)
En este tipo de patrón de herencia, las mujeres portadoras transmiten la enfermedad a sus
descendientes sin padecerla, con la probabilidad de un 50% de tener hijos varones afectos y un 50% de
tener hijas portadoras. No existe transmisión entre varones, puesto que el padre afecto únicamente aporta
el cromosoma Y a su hijo varón. Sin embargo, todas sus hijas serán portadoras del defecto genético.
Algunas portadoras pueden presentar síntomas de la enfermedad, debido a la inactivación al azar
del cromosoma X (MacDonald IM, 1997). En cualquier caso, las manifestaciones clínicas suelen ser más
leves y muy variables e incluso pueden existir asimetrías en la afectación de ambos ojos.
Herencia digénica y trialelismo
Es una condición génica causada por la interacción de dos mutaciones en dos genes diferentes no
ligados, donde sus productos proteicos están funcionalmente conectados.
En algunos casos, genes recesivos pueden verse afectados por un tercer alelo mutante que ejerce un
efecto modificador, suavizando o agravando el fenotipo. Un ejemplo de trialelismo se produce en la
Amaurosis Congénita de Leber y en el Síndrome de Bardet-Bield.
Herencia mitocondrial
Existen genes involucrados en patologías oftalmológicas que se encuentran en el genoma
mitocondrial. Son enfermedades de herencia materna, ya que las mitocondrias se transmiten a la siguiente
generación a través de los óvulos. Algunos ejemplos son la neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL),
el síndrome de Kearns-Seyre (KSS) y la neuropatía, ataxia y retinosis pigmentaria (NARP).
No hay evidencia de que las DR se manifiesten más tempranamente en las generaciones
sucesivas, es decir, no se produce el fenómeno de anticipación genética producido por mutaciones
dinámicas (alelos expandidos), excepto en el caso de la DR causada por mutaciones en el gen ATXN7
(antes SCA7, ataxia espinocerebelosa 7).
2.3.2- HETEROGENEIDAD GENÉTICA
Heterogeneidad alélica
Se produce cuando diferentes mutaciones a lo largo de la secuencia de un mismo gen
desencadenan el mismo proceso degenerativo.
Heterogeneidad no alélica
Se produce cuando distintos genes o loci son responsables de la misma enfermedad.
Prácticamente, en todos los cromosomas se encuentran genes involucrados en alguna patología retiniana.
Hasta el momento se han localizado un total de 163 loci, de los cuales 114 ya han sido clonados
(www.sph.uth.tmc.edu/Retnet).
I- Introducción
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2.3.3- HETEROGENEIDAD CLÍNICA
Formas no sindrómicas
Son aquellas DR en las que únicamente se manifiesta la patología ocular. Se presentan asociadas
a los modelos de herencia conocidos mendelianos.
Formas sindrómicas
Son aquellas DR que aparecen acompañadas de un cuadro clínico complejo, con manifestaciones
extraoculares. Suponen un 13-18% de todas las retinopatías hereditarias, se han descrito del orden de 77
síndromes distintos (www.retina-internacional.org). Pueden deberse a una herencia mitocondrial, herencia
dominante, herencia recesiva, trialelismo o reordenamientos cromosómicos.
Dentro de las formas sindrómicas, los más frecuentes son el Síndrome de Usher (recesivo) y el Síndrome
de Bardet-Bield (recesivo y trialélico).
Por lo tanto, a la hora de diagnosticar a un paciente, es importante determinar si se trata de una
degeneración exclusivamente ocular o bien si forma parte de un trastorno sistémico ya que algunas
retinopatías son un síntoma frecuente de distintos errores metabólicos congénitos, especialmente en
alteraciones del sistema peroxisomal, errores del metabolismo de los ácidos grasos y defectos de la cadena
respiratoria mitocondrial.
3- ENFERMEDADES CONGÉNITAS DE LA RETINA
Las enfermedades congénitas de la retina son relativamente frecuentes en la población: en todo el
mundo, entorno a 1,4 millones de niños menores de dieciséis años son ciegos (Johnson GJ et al., 2003).
Entre otros defectos oculares que se producen de forma temprana o incluso congénita, destacan los
siguientes:
- microftalmia: disminución del tamaño normal del globo ocular;
- anoftalmia: ausencia de los globos oculares, en cuyo caso pueden estar presentes los esbozos ópticos;
- persistencia de vítreo primitivo: se localiza centralmente como una masa retrolental que emite procesos
ciliares hacia la cápsula posterior del cristalino;
- retinopatía del prematuro / de la prematuridad: retinopatía bilateral del recién nacido que ocurre en
prematuros de bajo peso que han sido sometidos a concentraciones altas de oxígeno, lo que provoca
alteraciones vasculares en la retina e isquemia de la misma con posterior neovascularización, proliferación
vitreorretiniana y desprendimiento traccional de la retina.
- desprendimiento de retina: separación que se produce entre la retina y el EPR, acumulándose líquido en
el espacio virtual existente entre los dos.
- coloboma: se produce por un déficit en el cierre o soldadura de la fisura óptica y que puede afectar,
mayoritariamente, al desarrollo del iris o de la retina.
Algunos de estos defectos oculares hereditarios pueden deberse, entre otras causas, a alteraciones
en los genes NDP y RS1, como se verá a continuación
I- Introducción
4- ENFERMEDAD DE NORRIE (ND)/ VÍTREORRETINOPATÍA EXUDATIVA FAMILIAR (VREF)
4.1- RASGOS CLÍNICOS La Enfermedad de Norrie (ND; MIM +310600) es un trastorno recesivo ligado al X caracterizado por
una serie de cambios fibrosos y vasculares en la retina desde el nacimiento, que progresan durante la
infancia y la adolescencia causando pérdida de la agudeza visual de diferentes grados en varones.
Los cambios retinianos más severos son masas fibrovasculares de color amarillo-grisáceo,
llamados también “pseudogliomas” por su parecido a los tumores, que aparecen en los primeros meses de
vida y producen ceguera legal (agudeza visual < 20/200). Estas masas producen un aumento de la reacción
fibrótica en la retina, así como cambios vasculares, que habitualmente producen hemorragia del vítreo.
Desde el tercer mes de vida hasta los 8-10 años, se producen cambios progresivos en la retina: opacidad
del cristalino (cataratas), atrofia del iris con adhesión entre cristalino-iris (posterior synechiae) o adhesión
entre iris-córnea (anterior synechiae) y aumento de la presión intraocular, que puede resultar dolorosa. En
los estadios más avanzados de la enfermedad, los globos oculares se ven disminuidos y las córneas
presentan un aspecto blanquecino, de forma que los ojos parecen hundidos en las órbitas (microftalmia).
El 50% de los varones afectos presentan sordera neurosensorial que comienza en la infancia
temprana debido a defectos en la cóclea, así como retraso mental de diferentes grados (Warburg M, 1961;
Warburg M, 1975).
Un fenotipo más suave supone la aparición de una masa blanca desde el disco óptico hasta el
cristalino -persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV)- y anomalías vasculares periféricas, con o sin
cambios fibrosos -vitreorretinopatía exudativa familiar (FEVR; MIM #305390)-. Los varones afectos no
presentan sordera neurosensorial ni retraso mental (Fullwood P, 1993).
Figura I.8: A) Fondo de ojo de un paciente con vitreorretinopatía exudativa. Debido a cambios proliferativos en la
retina, se observan alteraciones en los vasos sanguíneos que aparecen alargados. Los exudados amarillos aparecen
cerca de la fóvea, debido a filtraciones de los vasos periféricos. B) La AFG (angiofluoresceingrafía) muestra
hiperfluorescencia de la región temporal del disco óptico y distorsión de los vasos sanguíneos a nivel macular.
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I- Introducción
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También se han identificado algunos casos de Enfermedad de Coats (MIM #300216) y retinopatía
de prematuridad (ROP; MIM #305390; descrita anteriormente) debido a mutaciones en el gen NDP (Black
GCM, 1999; Shastry BS, 1997).
La Enfermedad de Coats o teleangiectasia retiniana se caracteriza por un defecto en el desarrollo de la
vascularización de la retina que resulta en extravasación retiniana con exudados subretinianos y
desprendimiento de retina. Mediante AGF, se observan áreas con ausencia de perfusión, dilataciones y
aneurismas capilares. Al inicio, cuando sólo está afectado un sector de la retina, la visión está conservada.
Posteriormente, el desprendimiento de retina conduce a la pérdida de la visión.
4.2- EL GEN: NDP
El gen responsable de la Enfermedad de Norrie de denomina NDP (Norrie Disease Protein gene),
se localiza en Xp11.4 y consta de tres exones, pero sólo los exones 2 y 3 se traducen: el exón 1 está
situado dentro de la región 5´UTR (untranslated, no traducida) y se especula que desempeña una función
reguladora en la región promotora del gen, el exón 2 contiene los primeros 58 codones mientras que el
exón 3 es el de mayor tamaño y contiene los residuos 59-133 de la pauta abierta de lectura así como 917
pares de bases (pb) de la región 3´UTR.
Hasta el momento, se han identificado más de setenta mutaciones en el gen NDP (www.hgdm.org), la
mayoría provocan cambio de aminoácido (en inglés missense) y se producen en los exones 2 y 3.
4.3- LA PROTEÍNA: NORRINA
El gen NDP codifica una proteína secretable de 133 aminoácidos llamada “Norrina” cuyos residuos
de cisteína forman puentes disulfuro que sugieren un papel fundamental en la estructura y función de la
retina. La Norrina es un miembro de la familia de los factores de crecimiento tipo “cysteine-knot” y se
especula que interviene en la interacción neuroectodérmica célula-célula, que resulta crítica para el
desarrollo normal de la retina, del Sistema Nervioso Central (SNC) y de la cóclea.
Las alteraciones que ocurren en esta proteína, producen una vascularización incompleta de la
retina, tanto en pacientes con Enfermedad de Norrie como con vítreorretinopatía exudativa familiar. Sin
embargo, existe una forma de FEVR causada por defectos en el gen frizzled-4 (FZD4; MIM *604579) que
codifica un receptor de la vía Wnt. La vía de señalización de Wnt, que está conservada evolutivamente en
todos los organismos, regula un conjunto de procesos centrales para el desarrollo y las funciones celulares.
Estos procesos incluyen la proliferación celular, la diferenciación de células en tejidos especializados y el
establecimiento de regiones distintas dentro de la célula. Los cambios en la vía Wnt se han relacionado con
distintas enfermedades humanas, como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer, entre otras.
Recientemente, se ha determinado que la Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor
respectivamente, basándose en la similitud de los fenotipos vasculares causados por mutaciones en
Norrina y FZD4 tanto en humanos como en ratones: se ha observado que la Norrina se une con elevada
I- Introducción
especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5 (MIM *107770), para
provocar la activación de la vía Wnt (Xu et al., 2004).
Por tanto, estos datos consideran que el sistema Norrina-FZD4 desempeña un papel esencial en el
desarrollo vascular del ojo y del oído.
Figura I.9: Secciones histológicas de retinas de ratón silvestre y de ratón mutante fz4-/-, a nivel de la capa de fibras
nerviosas, plexiforme interna y plexiforme externa. En la retina fz4-/-, se desarrollan expansiones concretas a partir de
los vasos primarios, pero los vasos secundarios y terciarios están ausentes (Xu et al., 2004).
5- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS CENTRALES: DISTROFIAS MACULARES
5.1- ASPECTOS CLÍNICOS
La degeneración macular se caracteriza por alteraciones de la pigmentación, estrechamiento
arteriolar, cierto grado de atrofia óptica y deterioro progresivo de la función visual. La dispersión y
acumulación del pigmento retiniano da lugar a alteraciones visibles en el examen oftalmológico, que van
desde el aspecto moteado del pigmento hasta las acumulaciones típicas en forma de espículas óseas.
Estas maculopatías comparten unas características comunes: el material acumulado es de tipo lipofucsina,
se deposita en el epitelio pigmentario y las alteraciones afectan más severamente a la zona de la mácula.
La enfermedad comienza a manifestarse en la infancia con una disminución bilateral gradual y progresiva
de la visión central, aunque puede permanecer estacionaria durante muchos años. Este tipo de afectación
retiniana es más frecuente en individuos de raza blanca que en los de raza negra (Wright AF & Jay B,
1994).
19
I- Introducción
5.2- ASPECTOS GENÉTICOS
Las distrofias maculares suelen presentarse como casos esporádicos, autosómicos dominantes,
recesivos o ligados al cromosoma X. Dentro de las formas dominantes hay muchos tipos, que se distinguen
por sus manifestaciones clínicas, como la Enfermedad de Best, las distrofias en patrón, la distrofia macular
de Sorby y las drusas de herencia dominante. Entre las formas recesivas, destaca la Enfermedad de
Stargardt, que se considera la distrofia macular juvenil más común. En las formas ligadas al cromosoma X,
destaca la Retinosquisis juvenil. En general, las formas más frecuentes son las seniles, como la Distrofia
Macular Asociada a la Edad (DMAE).
6- RETINOSQUISIS JUVENIL LIGADA AL CROMOSOMA X (XLRS)
6.1- RASGOS CLÍNICOS
La Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X (XLRS; MIM +312700) es una de las causas más
comunes de degeneración macular juvenil en varones, con una prevalencia que oscila entre 1:5000 a
1:25000 (Mooy CM et al., 2002). La manifestación clínica más común es la pérdida de visión en la primera
década de vida, en algunos casos a los tres meses de edad, ocasionando una pérdida precoz de la
agudeza visual (20/60-20/120). El deterioro de la visión es leve hasta la quinta o sexta década de vida, a
partir de la cual la degeneración visual es progresiva y puede producirse ceguera legal en torno a los 70
años de edad.
El fondo de ojo se caracteriza por una degeneración macular microquística, que presenta una
distribución radial típica desde la fóvea hasta la periferia (patrón en “rueda de carro”). También se produce
degeneración vitreorretiniana y rotura de la capa de fibras nerviosas, que genera grandes hendiduras
(“schisis”). Estos desdoblamientos de las capas retinianas reciben el nombre de “velos vítreos” (Tantri A et
al., 2004). Este desgarro de las capas superficiales de la retina ocasiona degeneración de los
fotorreceptores, disminución de la capa ganglionar y alteraciones en el EPR. Posteriormente, surgen
lesiones en la retina periférica, alteraciones en el vítreo y reducción de la onda b en el ERG.
Figura I.10: A) Fondo de ojo de un paciente con RS; se observa atrofia macular y velos vítreos. B) Imagen obtenida por
TCO (Tomografía de Coherencia Óptica) que muestra las cavidades microquísticas en la fóvea.
20
I- Introducción
En estadios más tardíos, la hemorragia del vítreo constituye la fundamental complicación, ya que
agrava el déficit visual. En ocasiones se manifiesta por estrabismo (desviación de uno de los ojos de su
dirección normal, por lo que los ejes visuales no pueden dirigirse en un mismo tiempo al mismo punto), o
por nistagmus (espasmos de los músculos del ojo que produce movimientos oculares rápidos e
involuntarios) En un 40% de los casos, se produce desprendimiento de retina.
6.2- EL GEN: RS1
El gen asociado a esta enfermedad se denomina RS1 y fue identificado por clonación posicional.
Está situado en el brazo corto del cromosoma X (Xp22.2-p22.1), consta de 6 exones y codifica una proteína
de 224 aminoácidos denominada Retinosquisina (Sauer GC et al., 1997). Este gen contiene una región
altamente conservada en los exones 4-6, conocida como dominio discodín, como se verá más adelante.
RS1 se expresa principalmente en los fotorreceptores, en las células bipolares y en los axones más distales
de las células de Müller (Wu WW et al., 2005).
Hasta el momento se han identificado más de ciento treinta mutaciones en este gen
(www.hgmd.org; www.dmd.nl/rs), la mayoría de ellas en los exones 4-6 que codifican el dominio discoidín,
mientras que la mayor parte de las mutaciones que ocurren en la región de los exones 1-3 producen una
terminación prematura de la transcripción, originando una proteína truncada o ausencia de la proteína.
Figura I.11: Diagrama del gen RS1 y sus seis exones. Los exones 4-6 (sombreados) comprenden el dominio discoidín.
Las barras grises (encima) indican la frecuencia relativa de mutaciones dentro de cada exón (Tantri et al., 2004)
6.3- LA PROTEÍNA: RETINOSQUISINA
La Retinosquisina se expresa y se secreta a nivel de los fotorreceptores, en las células bipolares y
en los procesos distales de las células de Müller, en forma de un complejo proteico formado por varias
subunidades. La proteína secretada se asocia, por un lado, con la superficie de conos y bastones a nivel
del segmento interno, de la capa nuclear externa y de la capa plexiforme externa y, por otro lado, se une a
la superficie de las células bipolares dentro de la capa nuclear interna y de la capa plexiforme interna de la
retina (Reid SN et al., 2003).
21
I- Introducción
La característica estructural más destacada de la proteína es el dominio discoidín, formado por 157
aminoácidos (exones 4-6 de RS1), que suponen el 75% de la cadena polipeptídica procesada (Sauer GC et
al., 1997). Los dominios discoidín están presentes en una gran variedad de proteínas de membrana y
extracelulares, que intervienen en procesos de señalización y de adhesión celular (Factor V y Factor VIII
involucrados en la coagulación sanguínea; Neuropilinas 1 y 2, que intervienen en la regeneración y
degeneración del sistema nervioso, etc) (Baumgartner S et al., 1998; Vogel, 1999).
Las proteínas que contienen esta estructura contienen resíduos de cisteína al principio (Cys63) y al
final (Cys 219) del dominio. Ambos aminoácidos se sitúan próximos entre sí y son necesarios para el
correcto plegamiento de la proteína, ya que forman un puente disulfuro intramolecular (Wu WW & Molday
RS, 2003). Además, este dominio tiene tres resíduos de cisteína adicionales:
- Cys110 y Cys 142, que se supone que forman otro enlace disulfuro, estabilizando estas regiones de la
proteína para su inserción en la bicapa lipídica;
- Cys83: no aparece en el dominio discoidín de otras proteínas y aparece muy enterrado dentro de la
Retinosquisina, por lo que se especula que alteraciones en esta posición deben tener un bajo efecto en el
plegamiento, en la secreción o en el ensamblaje de la proteína.
Recientemente, se ha analizado la estructura oligomérica de la Retinosquisina para comprender las
funciones de esta proteína extracelular en la adhesión de las células retinianas y cómo las mutaciones en
RS1 producen Retinosquisis (Wu W et al., 2005). Este estudio ha permitido determinar que la estructura de
esta proteína es un octámero constituído por ocho subunidades idénticas, formado por la unión de cuatro
dímeros. Todas las uniones se establecen mediante puentes disulfuro, de la siguiente manera:
- puentes intermoleculares entre los resíduos Cys 59∼Cys223: mantienen la formación del octámero;
- puentes intermoleculares entre resíduos Cys40∼Cys40: forman dímeros entre dos subunidades
adyacentes o entre dos subunidades opuestas. (Figura I.12).
Figura I.12: A) Representación esquemática de la Retinosquisina procesada (sin el péptido señal de 23 aminoácidos).
La región RS1 (círculo) comprende los primeros 39 resíduos de la proteína y 5 resíduos del extremo C-terminal. El
dominio discoidín se representa en la elipse, las cisteínas involucradas en enlaces disulfuro intramoleculares (azules) e
intermoleculares (negras o grises) también se muestran.
B) Estructura del octámero: representados en gris, los enlaces disulfuro Cys40 forman dímeros entre subunidades
adyacentes (en este modelo, no se descarta que se puedan establecer entre subunidades opuestas); los enlaces
Cys59∼Cys223 que mantienen la formación del octámero se muestran en negro. (Wu et al., 2005).
22
I- Introducción
Asimismo, se ha especulado que el proceso de secreción de la Retinosquisina debe ser el
siguiente: la secuencia líder inicia la inserción y traslocación de la cadena peptídica naciente a través de la
membrana del retículo endoplasmático (RE). Una señal peptidasa en el lumen del RE corta la secuencia
líder en la Ser23, dando lugar al polipéptido procesado. El plegamiento del dominio discoidín ocurre con la
formación de los enlaces intramoleculares Cys63∼Cys219 y Cys110∼Cys142, mediante puentes disulfuro.
A continuación, se establecen los puentes disulfuro intermoleculares Cys40∼Cys40 y Cys59∼Cys223 entre
los segmentos 5´y 3´ flanqueantes al dominio discoidín, para formar el octámero (Figura I.12).
Figura I.13: Secreción de la Retinosquisina. En este esquema se representa la inserción de la proteína en el retículo
endoplasmático (RE), el ensamblaje de los monómeros mediante puentes disulfuro y su secreción (Wu et al., 2005).
También se han realizado estudios con modelos estructurales del dominio discodín, con el fin de
predecir cuál es el efecto de las mutaciones en el gen RS1 (Wang T et al., 2006). En este caso, los autores
concluyeron que existen tres mecanismos moleculares diferentes que producen XLRS: mutaciones que
interfieren en la secreción, mutaciones que interfieren en la oligomerización y mutaciones que permiten la
secreción y oligomerización, pero que interfieren en la función de la proteína.
En conclusión, se produce retención intracelular de la mayoría de las proteínas mutantes, lo que explicaría
porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la mutación responsable, es decir, no existe
correlación entre el genotipo y el fenotipo, como ya se había descrito con anterioridad (Wang T et al., 2002).
23
I- Introducción
7- ENFERMEDAD DE STARGARDT (STGD) / FUNDUS FLAVIMACULATUS (FFM)
La Enfermedad de Stargardt (STGD; MIM #248200) es una forma de degeneración macular juvenil,
con un patrón de herencia autosómico recesivo, descrita por primera vez por Karl Stargardt en 1909. Se
calcula que la prevalencia de la Enfermedad de Stargardt es de 1 entre 10.000, por lo que está considerada
como la distrofia macular hereditaria más común. De hecho, la frecuencia de portadores en la población se
ha estimado en torno a un 2% (Blacharski PA, 1988).
7.1- RASGOS CLÍNICOS
Esta distrofia macular se presenta entre la primera y la segunda década de vida, produciendo una
severa disminución de la agudeza visual central mientras que la visión periférica es normal. En la mayor
parte de los casos, los pacientes presentan una agudeza visual normal durante su infancia (Zhang K et al.,
1995; Allikmets R et al., 1997; Allikmets R, 1997b).
Desde un punto de vista histopatológico, el rasgo más característico es la aparición de acúmulos de
lipofucsina que se depositan en forma de motas amarillentas hacia el polo posterior del EPR. En los
estadíos más avanzados, se observa una gran zona atrófica en la mácula. Otros hallazgos oftalmológicos
muestran, mediante AFG, un fenómeno conocido como coroides oscura o silente: la circulación retiniana
destaca considerablemente sobre una coroides oscura, debido a que la fluorescencia de los capilares se ve
enmascarada por los acúmulos de pigmento que contienen las células del EPR. El electrorretinograma
(ERG) y el electroculograma (EOG) pueden ser normales en estadíos tempranos, pero se muestran
moderadamente alterados en las formas más avanzadas de la enfermedad (Aaberg TM, 1986).
Una variante de la STGD es el fundus flavimaculatus (FFM). Este término se utilizó por primera vez
para describir un fondo de ojo con motas blanco-amarillentas de forma irregular, que aparecían dispersas
por todas partes (Franceschetti A & Francois J, 1965). Por lo general, se considera que el paciente padece
STGD cuando los acúmulos de lipofucsina se disponen hacia el polo posterior del EPR y la pérdida de
visión comienza en primera o segunda década de vida. Sin embargo, el término FFM se emplea cuando
estos acúmulos están dispersos por todo el fondo de ojo, la enfermedad tiene un comienzo más tardío y
existe cierta preservación de la agudeza visual.
Figura I.14: A) Fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Stargardt (STGD); mácula atrófica y con acúmulos
amarillos de pigmento a su alrededor. B) AFG (angiofluoresceingrafía) que muestra la coroides oscura del paciente y la
fluorescencia de los acúmulos de lipofucsina; también se aprecia el patrón típico en “ojo de buey“.
24
I- Introducción
25
7.2- EL GEN: ABCA4
El primer locus genético para la Enfermedad de Stargardt se localizó en el brazo corto del
cromosoma 1 (1p21-p13) (Kaplan J et al.; 1993). Cuatro años más tarde se identificó el gen responsable de
enfermedad, ABCR (retina-specific ABC transporter), y alternativamente se denominó ABCA4 (ATP binding
cassette [ABC] transporter; Allikmets R et al., 1997a). Este gen consta de 50 exones que se traducen en su
totalidad. Tiene una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases que generan un polipéptido de 2.273
aminoácidos, denominado RmP (Rim protein; “proteína periférica”).
También se han descrito formas dominantes de la enfermedad (Stargardt-like disease), cuyos
genes responsables se encuentran en el cromosoma 6 (STGD3, ELOVL4; Elongation of Very Long Chain
Fatty Acids-like 4; Stone EM et al., 1994), en el cromosoma 13 (STGD2; Zhang K et al., 1994) y en el
cromosoma 4 (STGD4; Kniazeva M et al., 1999).
7.3- VARIANTES ALÉLICAS DE ABCA4
7.3.1- VARIANTES ALÉLICAS
Las mutaciones en ABCA4 se han visto asociadas a diferentes distrofias de retina, que incluyen:
- Enfermedad de Stargardt autosómica recesiva (arSTGD) / Fundus flavimaculatus (FFM) (Allikmets R et al.,
1997a)
- Retinosis Pigmentaria autosómica recesiva (arRP) (Martinez-Mir A et al., 1998)
- Distrofia de conos y bastones autosómica recesiva (arDCB) (Cremers FP et al., 1998)
- Degeneración macular asociada a la edad (DMAE) (Allikmets R et al., 1997).
Con el fin de explicar este espectro de fenotipos oftalmológicos, los investigadores propusieron un
modelo que explicaba la severidad de las enfermedades producidas por ABCA4 basándose en la actividad
residual de la proteína que generaban las mutaciones en este gen (Maugeri et al., 1999). Así, se
clasificaron los alelos mutantes de ABCA4 en “suaves”, “moderados” o “severos” y se estableció una
correlación entre diferentes combinaciones de alelos y diferentes fenotipos:
- Los pacientes con dos alelos “moderados” o la combinación de un alelo “suave” y otro “severo”,
conservan cierta actividad residual de la proteína y desarrollan STGD.
- Las DCB o la RP, son el resultado de un genotipo con dos alelos “severos” o la combinación de un alelo
“severo” y otro “moderado”. En estos fenotipos, la actividad de la proteína se ve muy reducida o es
inexistente.
- Por último, aquellos pacientes portadores de un solo alelo mutante y un alelo sano tienen un elevado
riesgo de desarrollar DMAE.
I- Introducción
Actividad residual de
ABC A4
Fenotipo Normal Normal DMAE STG STG arDCB RPARalelo 1 moderada severa moderada severa severa severa
alelo 2 moderada suave moderada severa
Figura I.15: En este gráfico se representa la relación inversamente proporcional que existe entre la severidad de la
mutación y la actividad residual de la proteína RmP (Maugeri et al., 1999).
Los estudios mutacionales de ABCA4 sugieren que quizá se trate del gen más polimórfico, hasta el
momento, implicado en distrofias de retina (Lewis RA et al., 1999; Rivera A et al., 2000). De hecho, en
ABCA4 se han identificado más de cuatrocientas alteraciones, desde mutaciones puntuales a deleciones de
varios exones (www.hgmd.org). La mayoría de los cambios reportados son mutaciones que provocan
cambio de aminoácido (Briggs CE et al., 2001; Gerth C et al., 2002; Yatsenko AN et al., 2001).
Los alelos causantes de enfermedad suponen entre el 66% y el 80% de los cromosomas asociados a
Stargardt estudiados (Yatsenko AN et al., 2001; Shroyer NF et al., 2001). Algunas de estas mutaciones se
han encontrado en elevada frecuencia en determinadas poblaciones de Europa y Estados Unidos,
sugiriendo un efecto fundador (Maugeri et al., 1999).
7.3.2- FENOTIPOS ASOCIADOS A DEFECTOS EN ABCA4
Distrofia de conos y bastones (DCB)
El diagnóstico de las DCB se realiza cuando el paciente presenta visión central disminuída o
borrosa, sin presentar ceguera nocturna. El fondo de ojo se caracteriza por presentar una mácula en “ojo de
buey” o con alteraciones granulares en el EPR, pudiendo existir o no cierta afectación de la retina periférica.
El campo visual presenta escotoma central, mientras que el campo periférico es normal o muestra una
constricción moderada. El trazado del ERG puede mostrar una respuesta de conos reducida o abolida, en
comparación con la respuesta menos alterada de los bastones, o puede reflejar una alteración por igual en
ambos sistemas de fotorreceptores.
Retinosis Pigmentaria (RP)
Aunque las características clínicas de la RP varían de unos pacientes a otros e incluso entre los
miembros afectados de una misma familia, la tríada clínica clásica consiste en afectación binocular con
ceguera nocturna (hemeralopia), reducción concéntrica del campo visual (“visión en túnel”, “visión en cañón
de escopeta”), pigmentación periférica del fondo del ojo con aspecto en espículas óseas u osteoclastos
(Birch DG et al., 1999; Klevering et al., 2004).
26
I- Introducción
Distrofia macular asociada a la edad (DMAE)
Es la primera causa de pérdida severa de visión entre la población de edad avanzada en el mundo
occidental (Allikmets et al., 1997). Es una enfermedad multifactorial, en la que interviene un componente
ambiental (tabaco, dieta, nivel de colesterol) y un componente genético (un alelo mutante en gen ABCA4,
polimorfismos en el gen del factor H del complemento; ambos en el cromosoma 1).
Por lo general, afecta a personas mayores de cincuenta años, aunque la incidencia aumenta
considerablemente a partir de los setenta años de edad. Se estima que un 30% de la población de esta
franja de edad padece alguna forma previa de la enfermedad, denominada MAE (Maculopatía asociada a la
edad), que produce alteraciones -percepción de manchas por la mañana, cuando el ojo se ha
acostumbrado a la oscuridad del sueño-, debido a la acumulación de drusas en la retina. Puede que el
proceso se detenga en esta fase o que evolucione hacia una de las dos formas de DMAE:
- forma húmeda: se produce de manera repentina, por la formación de neovasos;
- forma seca: se produce una evolución más lenta y progresiva, en la que las drusas se van fundiendo y
forman zonas de atrofia.
Figura I.16: Fondos de ojo correspondientes a los distintos fenotipos producidos por mutaciones en ABCA4, además de
la STGD: A) Distrofia de conos y bastones; B) Retinosis Pigmentaria; C) Distrofia Macular Asociada a la Edad.
7.4- LA PROTEÍNA: ABCA4/RmP
La proteína codificada por el gen ABCA4 también recibe el nombre de Rim Protein (RmP) porque
aparece en los bordes (en inglés rims) de los discos del segmento externo de los fotorreceptores. ABCA4
es un miembro de la superfamilia de los transportadores de tipo ABC (adenosin triphosphate-binding
cassette). Muchas de estas proteínas utilizan ATP para transportar sustratos -péptidos, lípidos o sustancias
hidrofóbicas- a través de las membranas celulares (Azarian Sm & Travis GH, 1997).
Otro miembro bien conocido de esta familia, es la proteína codificada por el gen de la fibrosis quística,
CFTR.
27
I- Introducción
Los típicos transportadores ABC consisten en un polipéptido que contiene dos dominios
transmembrana y dos dominios de unión a nucleótidos (NBDs; Nucleotide-binding domains). Los NBDs son
hidrofílicos, constan de unos noventa-ciento diez aminoácidos y están altamente conservados,
compartiendo un 30-50% de homología entre los distintos transportadores. Cada NBD contiene dos
motivos, el motivo “Walker A” y el motivo “Walker B”, que son comunes dentro de la categoría de proteínas
de unión a nucleótidos. El rasgo distintivo entre los transportadores ABC es el motivo, que contiene la
secuencia consenso “LeuSerGlyGlyGln” (Stefkova J et al., 2004).
Figura I.17: Transportador ABC completo, con 2 dominios transmembranales y 2 NBDs (Stefkova J et al., 2004).
ABCA4 es un transportador de tipo flipasa (transmembranal), localizado en la membrana intradiscal
del segmento externo de los fotorreceptores. En condiciones normales, la proteína RmP transporta un
compuesto denominado todo-trans-retinal o N-RPE (N-retinilideno-fosfatidiletanolamina), desde la
membrana intradiscal al citoplasma del fotorreceptor, mediante la hidrólisis del enlace existente entre el
todo-trans-retinal y la fosfatidiletanolamina (Sun H et al., 2000). En el citosol, el todo-trans-retinal se reduce
a todo-trans-retinol, que atraviesa la membrana plasmática del segmento externo y es capturado por las
células del EPR, donde se reconvierte en 11-cis-retinal (cromóforo común a los cuatro tipos de
fotopigmentos). Por tanto, esta proteína transporta derivados de la vitamina A en los segmentos externos
de los fotorreceptores después de su exposición a la luz.
En ausencia de la proteína RmP, su sustrato comienza a acumularse en el espacio intradiscal y al
unirse una segunda molécula de N-RPE, se genera el compuesto A2PE (N-retinilideno-N-retinil-
fosfatidiletanolamina).
Por último el A2PE se hidroliza, originando un fluoróforo de lipofucsina denominado A2E (N-
retinilideno-N-retinil-etanolamina), cuya acumulación es tóxica para las células del EPR, que son las
encargadas de digerir los discos del segmento externo de los fotorreceptores (Eldred GE & Lasky MR,
1993). De forma secundaria al fallo de estas células, se produciría la muerte de los fotorreceptores.
28
I- Introducción
Figura I.18: Ciclo de los retinoides. Para el correcto funcionamiento de la vía visual, la molécula de todo-trans-retinal
debe salir del segmento externo del fotorreceptor transportada por la proteína RmP, codificada por el gen ABCA4.
8- PERSPECTIVAS DE FUTURO: TRATAMIENTOS
8.1- REMODELACIÓN DE LA RETINA EN EL PROCESO DEGENERATIVO
Estudios recientes en ratas con mutaciones en genes que se expresan tanto en fotorreceptores
(FR) como en células del epitelio pigmentario (EPR), han permitido observar que cuando comienza la
degeneración y muerte de los FR, el resto de las neuronas involucradas en la vía visual tratan de establecer
nuevas conexiones sinápticas con las células que no están dañadas (Cuenca N et al., 2004; Cuenca N et
al., 2005). Este hecho provoca una remodelación de la estructura de la retina, que es importante conocer
para poder aplicar los futuros tratamientos de forma eficaz. El proceso degenerativo estudiado se produce
en tres fases:
- Fase 1: los FR sufren un período de estrés, en el que se produce la desorganización de sus contactos
sinápticos;
- Fase 2: se produce la muerte gradual de los FR y puede iniciarse la muerte de alguna neurona retiniana;
- Fase 3: las células neuronales se mueren progresivamente, incluyendo las células ganglionares, y las
células de Müller rellenan los espacios dejados por éstas. A su vez, las células del EPR migran e invaden
las retina. La red vascular aparece totalmente modificada.
Según la fase de la enfermedad, se deberán utilizar estrategias terapéuticas distintas. Si la
enfermedad se encuentra en la fase 1 y 2, se podrán emplear estrategias para ralentizar la degeneración,
como son la inyección de factores neurotróficos, células encapsuladas o estrategias para curar la
29
I- Introducción
30
enfermedad, como son los transplantes retinianos y la terapia génica. Si la degeneración se encuentra en
fase 3, se podrán utilizar transplantes retinianos, incluyendo células y visión artificial.
8.2- TERAPIA GÉNICA
La terapia génica es una nueva forma de tratamiento de las enfermedades, que consiste en la
introducción en las células de material genético -genes completos y otro tipo de ácidos nucleicos- para
corregir un problema biológico. La base de la terapia génica es que se puede corregir la enfermedad
proporcionando a las células la información genética necesaria para que por sí mismas sinteticen la
proteína adecuada, en lugar de administrarla directamente, como sucede con los fármacos convencionales.
Esto permitiría en numerosos casos atacar la causa de la enfermedad, en lugar de limitarse a tratar sus
síntomas.
Las posibles aplicaciones de la terapia génica en el futuro tratamiento de las distrofias de retina
(DR), son las siguientes:
- deficiencias enzimáticas: en estos casos, el objetivo consistiría en implantar una copia normal del gen
defectuoso en un grupo pequeño de células retinianas, de tal forma que su producto proteico fuese
secretado por estas células a los fotorreceptores adyacentes.
- sustitución génica: en algunas DR, la terapia génica consistiría en reemplazar el gen defectuoso
directamente en los fotorreceptores. La transferencia del gen normal se realizaría por medio de un vector,
que reconociese de forma altamente específica al fotorreceptor, como célula huésped.
Hasta el momento, los vectores más eficaces son los de tipo viral. Para construir un vector viral de terapia
génica, se deben eliminar los genes del virus (fundamentales para que pueda multiplicarse) y sustituirlos
por el gen terapéutico. De esta forma, se aprovecha la eficacia del virus para entrar en las células y se
evitan los riesgos de su diseminación.
- factores neurotróficos: protegen a las neuronas de la muerte celular, aportando nutrientes e inhibiendo el
proceso de apoptosis que se origina en la retina. El problema que se plantea es que es necesaria una
administración continuada de estos factores, lo que puede ocasionar efectos secundarios adversos.
Además, resulta difícil atravesar la barrera sanguínea retinal. Con terapia génica, los factores neurotróficos
se podrían aplicar en dosis fisiológicas y se podrían evitar los efectos secundarios.
Hoy en día, se está experimentando con terapia de células encapsuladas, que consiste en implantar
en la retina bolitas de material sintético poroso que contienen células del epitelio pigmentario transformadas
genéticamente para producir cantidades masivas del factor neurotrófico.
I- Introducción
31
8.3- RETINAS ARTIFICIALES
Los investigadores Alan y Vincent Chow han inventado la llamada Retina Artificial de Silicio
(ASRTM), un microchip que mide menos de una décima de pulgada y que es menos grueso que un cabello
humano. El ASRTM contiene tres mil quinientas células solares microscópicas que convierten la luz en
impulsos eléctricos. El propósito de este chip es reemplazar los fotorreceptores dañados de la retina, ya
que intentan sustituir la estimulación que realizan los fotorreceptores sobre sus células diana, como son las
células horizontales y las bipolares.
La cirugía consiste en una minúscula incisión en la córnea, que permite situar el implante tras la
retina. Los primeros implantes de retinas artificiales, en pacientes con diversos grados de ceguera, ya se
han completado. De momento, únicamente se están evaluando la seguridad y la efectividad del chip,
colocando una versión reducida de éste en un lateral de la retina. Si los implantes son tolerados por el ojo,
se realizarán nuevas operaciones a mayor escala, que podrían devolver la visión incluso a pacientes en
estadíos muy avanzados de la enfermedad.
8.4- CÉLULAS MADRE
Son aquellas células dotadas simultáneamente de la capacidad de autorrenovación (es decir,
producir más células madre) y pluripotencia o totipotencia, es decir, de originar células hijas comprometidas
en determinadas rutas de desarrollo, que finalmente se diferenciarán en tipos celulares especializados. En
el contexto de la actual investigación, se pretende obtener células madre que se mantengan como tales en
cultivo en el laboratorio y que, bajo determinados estímulos, puedan conducir a poblaciones de células
diferenciadas.
Las células madre embrionarias de ratón (y quizá las humanas), son excelentes para manipulación
genética, y pueden realizar recombinación homóloga, por lo que se podría ensayar incluso terapia génica
sustitutiva, reemplazando genes anómalos por versiones correctas. Esta técnica consistiría en transferir un
núcleo somático a un óvulo y desarrollar el blastocisto artificial, a partir del cual se aislarían las células
madre y se manipularían por ingeniería genética para corregir el defecto.
También se puede intentar la manipulación genética de células madre no embrionarias: se ha visto
que células madre neuronales de fetos humanos fueron manipuladas genéticamente y demostraron su
capacidad de secretar productos terapéuticos, por lo que muestran un potencial para corregir defectos
metabólicos en neuronas y glía. En este sentido, se ha destacado la utilidad de las células madre de retina,
así como la aparición de una nueva metodología para emplear vectores no víricos en terapia génica a
través de los denominados inmunoliposomas.
Cristalografía de Rayos X del esqueleto azúcar-fosfato del ADN.
Rosalind Franklin, 1952.
II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos
32
II- Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos
II‐ JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
Las distrofias hereditarias de retina son un grupo muy heterogéneo, tanto genética como
clínicamente, de enfermedades oftalmológicas degenerativas. Hasta el momento, el tratamiento de estas
retinopatías aún no es posible. El estudio molecular de los genes responsables resulta fundamental, ya que
permitirá:
- establecer la confirmación molecular del diagnóstico clínico previamente establecido;
- determinar el patrón de herencia con el que se transmite la patología y ofrecer una prevención eficaz a
través de un asesoramiento genético adecuado y
- conocer el defecto genético causante de enfermedad, para poder aplicar el tratamiento preciso en el
futuro.
Los objetivos planteados en este trabajo han sido los siguientes:
1- Caracterizar, desde el punto de vista genético y molecular, a los pacientes clínicamente diagnosticados
de Enfermedad de Norrie, Retinosquisis, Enfermedad de Stargardt y formas asociadas.
2- Validar la técnica de genotipado empleada en el estudio del gen ABCA4 (microarray).
3- Determinar el origen parental de las mutaciones mediante el estudio genético familiar.
4- Establecer una correlación genotipo-fenotipo.
5- Facilitar al paciente un asesoramiento genético adecuado.
6- Contribuir a los estudios epidemiológicos de las distrofias de retina estudiadas.
33
“El Hombre de Vitruvio”
Leonardo da Vinci, alrededor de 1490.
III- Pacientes y Métodos
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III- Pacientes y Métodos
III- PACIENTES Y MÉTODOS
1- PACIENTES Y FAMILIAS ESTUDIADAS
1.1- PROCEDENCIA DE LOS PACIENTES
El reclutamiento de pacientes y familiares que han participado en este estudio se realizó a través de
la Red Española de Investigación en Distrofias de Retina (EsRetNet) -constituida por seis grupos
multidisciplinares de investigación: Fundación Jiménez Díaz (Madrid), Hospital San Pablo (Barcelona),
Hospital de Tarrasa (Tarrasa), Hospital La Fe (Valencia), Hospital Virgen del Rocío (Sevilla) y Universidad
de Vigo (Vigo)- y de otros hospitales externos.
Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes que participaron en el estudio, de
acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki (www.wma.net).
1.2- CONSULTA Y CUESTIONARIO INICIAL
El diagnóstico de los pacientes fue llevado a cabo por genetistas y oftalmólogos experimentados.
Habitualmente y con el fin de obtener la mayor cantidad de información posible, se entrega al paciente un
cuestionario que debe cumplimentar. En él se recogen los datos personales y familiares del afecto, así
como el registro de cuándo comenzó a padecer los primeros síntomas.
La información recogida en el cuestionario y en la consulta, así como los datos clínicos obtenidos en el
examen oftalmológico, serán de gran utilidad para elaborar una historia clínica completa y orientar el
estudio del gen responsable de su enfermedad.
1.3- CLASIFICACIÓN DE LAS FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio clínico y molecular se ha realizado en un total de 169 familias, que fueron clasificadas de
acuerdo con los siguientes criterios clínicos:
- Los pacientes con Enfermedad de Norrie o con vitreorretinopatía exudativa se diagnosticaron según los
criterios oftalmológicos establecidos por Warburg (Warburg M, 1975), la presencia o no de síntomas
sistémicos y su evolución. El diagnóstico diferencial incluye el “pseudoglioma” que puede ser debido a
diversas causas como inflamación, hemorragia, trauma, neoplasia u otra malformación congénita.
- El diagnóstico de pacientes afectos de Retinosquisis se fundamenta en signos oftalmoscópicos que
incluyen microquistes perifoveolares radiales (patrón en “rueda de carro”), opacidad de vasos retinianos,
lesiones en la retina periférica y alteraciones en el cuerpo vítreo (“velos vítreos”). El ERG muestra
disminución de la onda “b”. El diagnóstico diferencial incluye la RP típica y la enfermedad de Goldmann-
Favre (presencia de cuerpo vítreo licuificado con presencia de velos vítreos, edema macular, degeneración
pigmentaria de la retina con hemeralopia y ERG extinguido), los traumatismos y el desprendimiento de
retina antiguo.
35
III- Pacientes y Métodos
- Los pacientes con Enfermedad de Stargardt se seleccionan según los siguientes criterios oftalmológicos:
pérdida de la visión central, reducción de la agudeza visual a una edad temprana, pérdida del reflejo foveal,
apariencia granular de fóvea, estrías alrededor de la lesión macular, atrofia coroidal en el centro de la retina
y esclerosis de vasos coroidales, cambios en el epitelio pigmentario de la retina. Cuando los acúmulos de
pigmento se localizan hacia el polo posterior de la retina, se denomina Fundus flavimaculatus.
- El diagnóstico de la distrofia de conos y bastones se basa en los siguientes criterios: pérdida de la visión
central con historia de ceguera nocturna, severa reducción de la agudeza visual (20/100 que empeora con
la edad) y alteración de la visión de los colores. Los hallazgos funduscópicos muestran degeneración
macular, alteraciones en la retina periférica que incluyen acúmulos de pigmento o afinamiento del epitelio
pigmentario. La disminución de la respuesta del ERG se produce primero en los conos y posteriormente en
los bastones.
- La Retinosis Pigmentaria se diagnostica en pacientes que desarrollan ceguera nocturna a una edad
temprana con reducción progresiva y concéntrica del campo visual. El fondo de ojo presenta vasos
retinianos disminuidos, despigmentación del EPR, pigmento en forma de osteoclastos (espículas óseas) y
palidez papilar. La respuesta del ERG disminuye en los bastones y posteriormente en los conos, llegando a
estar abolida en la etapa final de la enfermedad. (Birch DG et al., 1999; Klevering BJ et al., 2004).
- Los pacientes con distrofia macular autosómica dominante presentan una herencia autosómica dominante
(a diferencia de la STGD, DCB y RP, que son autosómicas recesivas) y las siguientes características
oftalmológicas: pérdida de la agudeza visual central y anomalías maculares simétricas. La edad de
comienzo es variable, aunque generalmente se produce durantes las dos primeras décadas de vida.
Las familias presentadas en este trabajo, los genes implicados y los fenotipos asociados se
muestran en la siguiente tabla:
Gen estudiado Nº familias Nº familias vs. fenotipo Diagnóstico clínico
2 Enfermedad de Norrie NDP 11
9 Vitreorretinopatía exudativa
RS1 29 29 Retinosquisis
74 Enfermedad de Stargardt
28 Distrofia de conos y bastones
ABCA4 17 Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva 129
3 Fenotipo diverso
7 Distrofia macular autosómica dominante
Total 169
Tabla III.1: Clasificación de las familias estudiadas en este trabajo.
36
III- Pacientes y Métodos
a) Gen NDP (Retinopatías ligadas al cromosoma X):
- Enfermedad de Norrie (ND): ANF-7, ANF-8.
- Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF): XLDM-46, ND-1, ND-2, ND-4, ND-5, ND-6, ND-10, ND-12,
ND-14.
b) Gen RS1 (Distrofia Macular ligada al cromosoma X):
- Retinosquisis juvenil: XLRS-29, XLRS-30, XLRS-43, XLRS-44, XLRS-45, XLRS-53, XLRS-55, XLRS-56,
XLRS-70, ONCE-62, XLRS-93, XLRS-95, XLRS-97, XLRS-101, XLRS-102, XLRS-103, XLRS-104, XLRS-
107, XLRS-108, XLRS-112, XLRS-114, RP-130bis, RP-162bis, XLRS-124, XLRS-143, XLRS-144, XLRS-
145, XLRS-161, XLRS-185.
Gen ABCA4c) : (Distrofias Maculares Autosómicas Recesivas -STGD, DCB-, Retinosis Pigmentaria
Autosómica Recesiva y Distrofia Macular Autosómica Dominante):
- Enfermedad de Stargardt (STGD): ARDM-12, ARDM-14, ARDM-15, ARDM-16, ARDM-17, ARDM-22,
ARDM-31, ARDM-38, ARDM-39, ARDM-40, ARDM-47, ARDM-52, ARDM-57, ARDM-58, ARDM-60, ARDM-
61, ARDM-62, ARDM-63, ARDM-64, ARDM-65, ARDM-66, ARDM-67, ARDM-68, ARDM-69, ARDM-71,
ARDM-72, ARDM-75, ARDM-76, ARDM-77, ARDM-78, ARDM-81, ARDM-82, ARDM-83, ARDM-84, ARDM-
88, ARDM-90, ARDM-91, ARDM-96, ARDM-100, ARDM-110, ARDM-111, ARDM-116, ARDM-117, ARDM-
118, ARDM-119, ARDM-122, ARDM-123, ARDM-125, ARDM-128, ARDM-129, ARDM-130, ARDM-131,
ARDM-135, ARDM-137, ARDM-138, ARDM-139, ARDM-140, ARDM-142, ARDM-146, ARDM-148, ARDM-
151, ARDM-153, ARDM-155, ARDM-156, ARDM-158, ARDM-160, ARDM-162, ARDM-163, ARDM-164,
ARDM-165, ARDM-167, ARDM-168, ARDM-170, SRP-773.
- Distrofia de conos y bastones (DCB): ARDM-49, ARDM-79, ARDM-85, ARDM-86, ARDM-99, ARDM-126,
ARDM-133, ARDM-134, ARDM-159, ARDM-169, ARDM-174, ARDM-176, ARDM-192, ARDM-195, RP-55,
RP-267, RP-577, RP-586, RP-657, RP-719, RP-763, RP-827, RP-828, RP-959, RP-964, RP-965, RP-971,
RP-973.
- Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR): ARDM-54, ARDM-89, RP-82, RP-417, RP-578, RP-
586, RP-700, RP-716, RP-766, RP-775, RP-813, RP-818, RP-834, RP-854, RP-857, RP-927, RP-937.
- Fenotipo diverso (en la misma familia, existen casos de STGD, DCB o RPAR): RP-280, RP-315, RP-532.
- Distrofia macular autosómica dominante: ADDM-59, ADDM-74, ADDM-80, ADDM-92, ADDM-94, ADDM-
105, ADDM-106.
Los árboles genealógicos se muestran a continuación:
37
III- Pacientes y Métodos
Gen NDP: Familias con Retinopatías ligadas al cromosoma X -ND, VERF-
I:1 I:201/746
II:101/745
II:2SG-2651
V89fs
ANF-7
I:1 I:2
II:2SG-2658
II:3II:1
ANF-8
I:201/702
II:101/700
II:301/534
II:501/699
II:2
III:101/535
II:4
III:201/695
III:301/696
I:101/701
XLDM-46
I:101/753
II:101/752
II:301/751
II:2
I:201/754
ND-1
IV:5
V:603/133
V:403/141
III:1 III:203/130
IV:103/134
IV:403/139
IV:603/131
IV:2
V:1 V:2
IV:3
V:303/140
V:503/132
II:1 II:2
I:1 I:2
II:3 II:5II:4
III:4 III:5 III:6 III:8III:3
IV:703/599
IV:803/600
IV:1003/598
IV:11
III:7
IV:12 IV:15IV:9
V:7 V:8
IV:14IV:13
V:9 V:10 V:11
ND-2
38
III- Pacientes y Métodos
ND-10
I:1
II:201/1221
II:301/1223
II:6II:1
III:201/1222
II:4
III:3 III:4III:101/1220
I:2
II:503/553
I:1
05/820
I:2
05/848
II:2
05/817
II:3
05/849
II:1
05/821
III:1 III:2
ND-12
I:1 I:2
II:2
05/1148
II:3
05/1149
II:5
05/1146
II:1
III:1
05/930
III:2
II:4
III:3
05/1151
III:4
05/1150
ND-14
I:1 I:2
II:2
2762
II:3
2761
II:1
III:1
2763
III:2
2764
III:3
2765
III:5
2766
III:7
2768
III:9
2770
III:11
2771
III:13
2773
III:4
2767
IV:1
2775
IV:2
2776
IV:3
2777
III:6
2769
IV:4
2778
IV:5
2779
III:8
IV:6
2780
IV:7
2781
III:10
2772
IV:8
2782
III:12
2774
IV:9
2783
IV:10
2784
IV:11
2785
IV:12
2786
IV:13
2787
ND-5
I:1 I:2
II:1
04/33
ND-6
II:203/182
I:1 I:203/181
II:103/180
ND-4
39
III- Pacientes y Métodos
Gen RS1: Familias con Distrofia Macular ligada al cromosoma X -Retinosquisis-
XLRS-29
XLRS-43 XLRS-44
I:102/596
II:202/46
II:1
III:101/508
III:202/47
I:202/595
I:199/685
I:2
II:299/686
II:4II:199/687
III:1 III:399/688
II:3
III:4III:299/684
I:2
II:2 II:4II:1
III:696/526
III:896/524
III:296/765
III:397/61
III:196/548
IV:196/549
IV:296/550
IV:396/417
III:4
IV:497/60
IV:597/59
IV:697/81
IV:797/82
III:596/558
IV:896/523
IV:996/528
IV:1096/551
III:7
IV:1196/527
IV:1296/525
II:3
III:996/552
III:1296/553
III:10
IV:1396/709
IV:1496/708
III:11
IV:1696/555
IV:1796/556
I:1
IV:1596/554
XLRS-30
I:1 I:2
II:2 II:3
?II:5 II:6
III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:601/22
II:4
III:7 III:8 III:9 III:10 III:11
II:7
III:12 III:13 III:14 III:15
II:1
40
III- Pacientes y Métodos
I:103/943
I:203/942
II:103/986
II:203/974
II:403/940
II:303/941
XLRS-101
I:103/544
I:203/545
II:103/532
II:203/533
II:303/546
XLRS-93
I:1 I:203/746
II:103/745
II:203/748
II:303/747
XLRS-95
I:103/817
I:203/818
II:103/816
XLRS-97
I:1 I:2
II:2 II:4II:1
III:204/657
III:1
IV:1
II:3
III:304/708
III:404/707
XLRS-70
I:101/753
II:101/752
II:301/751
II:2
I:201/754
ONCE-62
I:2I:1
II:103/895
XLRS-103
I:101/1247
I:201/1249
II:101/1248
II:301/1250
II:201/1251
II:401/1252
XLRS-56
XLRS-102
I:2I:1
II:103/894
I:101/169
I:201/170
II:100/584
II:200/585
II:400/587
II:500/588
II:300/586
XLRS-55
I:1 I:201/674
II:200/718
II:1
III:200/720
III:3III:100/719
XLRS-45
I:1
II:201/1221
II:301/1223
II:6II:1
III:201/1222
II:4
III:3 III:4III:101/1220
I:2
II:503/553
XLRS-53
41
III- Pacientes y Métodos
XLRS-143
I:2I:1
II:104/804
I:2I:1
II:103/148
XLRS-112
I:1
II:104/56
II:204/704
II:304/705
I:204/706
XLRS-114
I:22043
I:12042
II:12044
II:22045
II:32046
RP-130bis
I:103/632
I:299/266
II:199/267
II:299/268
II:303/631
RP-162bis
II:1 II:204/315
III:204/1632
I:1 I:2
II:304/1631
II:404/1633
III:102/1050
XLRS-124
I:103/961
I:2
II:203/962
II:103/963
III:103/964
III:203/965
XLRS-107
II:103/970
II:203/969
I:103/971
I:203/972
XLRS-108
II:2 II:304/1280
III:203/986
I:1 I:2
II:504/1279
II:4
III:404/803
III:304/1277
II:6
III:5 III:604/1276
III:104/1278
II:104/1281
II:704/1275
XLRS-144
I:2I:1
II:104/805
XLRS-145
I:2I:1
II:104/806
XLRS-161 XLRS-185
I:2I:1
II:104/1522
?II:2
06/203
I:205/1220
I:105/1219
II:105/1221
XLRS-104
42
III- Pacientes y Métodos
Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Enfermedad de Stargardt-
I:198/308
II:298/309
II:398/331
II:11886
I:298/307
ARDM-12
I:198/333
I:298/334
II:398/336
II:298/335
II:104/1308
ARDM-14
I:199/1012
I:299/1013
II:1CG-1673
II:299/1014
ARDM-15
I:198/284
I:298/282
II:1CG-1728
II:298/283
ARDM-16
I:1 I:203/677
II:199/964
III:1
II:2
III:2
II:303/676
ARDM-31 ARDM-38
ARDM-39 ARDM-40 ARDM-47
I:202/281
I:102/282
II:197/451
ARDM-17
I:104/701
I:204/702
II:198/900
II:204/703
ARDM-22
I:102/815
I:202/814
II:200/573
II:102/813
I:102/145
I:202/146
II:102/147
II:200/1000
I:1
II:201/573
I:3
II:103/857
I:202/484
II:302/485
I:202/530
II:102/531
II:202/532
I:102/533
ARDM-60
II:2
III:102/723
II:102/721
II:302/722
I:102/724
II:402/725
I:202/726
ARDM-61
I:102/267
I:202/268
II:102/319
II:202/320
II:300/947
I:1 I:2
II:101/1170
II:2 II:3
ARDM-52
I:102/438
I:202/431
II:102/439
II:202/416
II:302/440
ARDM-57 ARDM-58
I:1 I:2
II:1 II:302/535
II:2
III:102/534
43
III- Pacientes y Métodos
I:202/759
II:1 II:302/599
II:5 II:6II:4
III:1
II:202/756
III:2
I:1
ARDM-62 ARDM-63 ARDM-64
I:102/1149
II:102/800
I:202/1150
ARDM-65
I:104/3
I:204/2
II:402/662
II:203/899
II:304/1
II:1
I:102/835
I:202/833
II:202/834
II:102/799
ARDM-71
I:102/644
I:202/643
II:202/642
II:102/645
ARDM-67
I:2I:1
II:102/429
ARDM-66 ARDM-69 ARDM-68
I:1 I:2
II:102/766
I:1 I:2
II:102/793
ARDM-72
I:1 I:2
II:102/853
ARDM-75
I:2I:1
II:102/855
ARDM-76
I:102/1090
II:502/806
II:103/126
II:303/127
I:202/1089
II:203/169
II:402/807
?III:1
05/50
I:1 I:2
II:102/857
ARDM-77
ARDM-78
II:202/888
II:302/889
II:402/891
I:1 I:202/890
II:102/887
ARDM-81
I:103/187
I:203/188
II:103/183
II:203/189
ARDM-82
I:103/338
I:2
II:103/337
II:203/339
ARDM-83
I:105/1366
I:205/1367
II:102/915
I:102/764
I:202/763
II:102/622
II:202/766
II:402/354
II:302/765
44
III- Pacientes y Métodos
I:103/344
I:203/341
II:103/340
II:203/342
II:303/343
ARDM-84 ARDM-88
ARDM-96
I:2
II:104/754
II:204/816
I:104/817
ARDM-100
I:1 I:2
II:203/378
II:103/910
I:1 I:204/609
II:104/608
II:203/749
ARDM-110
II:104/87
I:104/871
I:204/903
ARDM-90 ARDM-91
I:103/774
I:203/775
II:103/848
II:303/773
II:203/564
I:105/593
I:205/394
II:103/425
II:205/392
II:305/395
ARDM-111
I:104/577
II:303/1158
I:204/578
II:104/624
II:2
ARDM-116
I:2
II:104/142
I:1
II:204/143
II:3
I:1 I:2
II:104/144
ARDM-117 ARDM-118
I:104/561
I:204/560
II:404/183
II:104/559
II:204/616
II:304/558
I:105/1368
I:205/1369
II:304/184
II:105/1370
II:205/1371
ARDM-119
I:304/1590
I:404/1520
II:204/233
II:304/1521
II:104/1414
I:105/1256
I:205/1255
ARDM-122
I:1 I:2
II:104/264
ARDM-123
II:103/770
I:103/771
I:203/772
ARDM-125
I:1 I:205/87
II:305/86
II:105/88
II:204/387
ARDM-128
I:1 I:2
II:104/399
ARDM-129 ARDM-130
I:1 I:2
II:104/509
ARDM-131
I:104/491
I:204/492
II:104/458
II:204/493
45
III- Pacientes y Métodos
ARDM-135 ARDM-137 ARDM-138
I:1 I:2
II:104/542
I:104/840
II:104/839
I:204/841
I:103/1094
I:205/29
?II:1
05/30
I:104/734
II:204/674
II:104/735
I:204/733
I:104/769
II:104/771
II:204/772
II:304/768
I:204/770
ARDM-140
ARDM-142
I:104/492
I:204/943
II:904/920
II:1204/940
II:1004/941
II:1 II:2 II:4II:3 II:5 II:6 II:7 II:8 II:11 II:13
ARDM-153ARDM-146 ARDM-148 ARDM-151
I:204/849
II:104/847
I:104/848
I:1 I:2
II:104/985
I:1 I:2
II:104/1209
I:104/1331
I:204/1332
II:304/1333
II:204/1242
II:1
I:104/1361
I:204/1362
II:104/1364
II:204/1364
ARDM-155
ARDM-156
I:104/1395
I:204/1396
II:104/1394
II:204/1397
II:304/1398
ARDM-158 ARDM-160
I:1 I:2
II:104/1473
I:104/1512
I:204/1511
II:204/1509
II:104/1510
ARDM-162
I:105/15
I:205/24
II:105/123
II:205/16
II:304/1578
II:405/17
II:505/18
II:605/19
II:705/20
II:805/21
II:905/22
II:1005/23
II:1104/1610
II:1204/1609
46
III- Pacientes y Métodos
ARDM-163
I:104/1557
I:2
II:104/1558
II:204/1559
II:304/1560
II:404/1561
II:504/1562
II:605/77
ARDM-164 ARDM-165 ARDM-167 ARDM-168
I:1 I:2
II:105/2
I:1 I:2
II:105/3
I:1 I:2
II:105/108
I:1 I:205/189
II:1 II:205/196
II:305/279
ARDM-169
I:105/175
I:205/174
II:205/177
II:105/176
ARDM-139
I:105/406
I:205/398
II:205/396
II:105/397
I:2I:1
II:103/207
SRP-773
Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Distrofia de conos y bastones-
ARDM-49
I:102/285
I:202/287
II:201/896
II:102/286
I:104/1385
I:204/1384
II:204/1388
II:304/1386
II:404/1387
II:504/1389
II:604/1390
II:102/978
ARDM-79
I:2I:1
II:103/373
ARDM-85 ARDM-86
I:1 I:204/1337
II:103/372
II:204/1336
I:1 I:2
II:103/864
ARDM-99
I:104/411
I:204/412
II:104/357
II:204/744
II:304/460
II:504/431
II:404/518
ARDM-126 ARDM-133
I:204/644
II:104/645
II:304/631
I:3 I:4
II:204/633
II:404/632
I:104-469
?III:1
06/73
?III:2
06/74
II:104/536
I:204/568
II:204/537
II:304/538
I:1
ARDM-134 ARDM-159
I:1 I:204/1515
II:104/1504
47
III- Pacientes y Métodos
I:1 I:205/189
II:1 II:205/196
II:305/279
ARDM-169
I:1 I:205/490
II:105/486
II:205/487
II:301/213
II:405/488
II:505/489
II:605/573
II:705/504
ARDM-174
I:105/534
I:205/536
II:205/535
II:405/537
II:105/538
II:306/130
ARDM-176
I:1 I:2
II:105/1363
ARDM-192
I:1 I:2
II:11053
RP-55 ARDM-195
I:105/1328
I:205/1326
II:105/1299
II:205/1325
II:305/1327
RP-267
I:105/693
I:205/694
II:105/695
II:205/698
II:305/697
II:405/696
I:1 I:2
II:199/631
RP-577
RP-586
I:1 I:2
II:199/1217
RP-657
I:1 I:2
II:101/922
I:105/751
I:205/734
II:105/736
II:205/735
RP-719
I:103/671
I:203/673
II:103/672
II:203/98
RP-763
I:1 I:2
II:103/1123
RP-827 RP-828
I:1 I:2
II:103/1127
I:1 I:2
II:105/515
RP-964 RP-965RP-959 RP-973RP-971
I:1 I:2
II:105/612
I:1 I:2
II:105/548
I:1 I:2
II:105/753
I:1 I:204/1229
II:104/1226
II:304/1227
II:404/1228
II:204/1230
III:104/1231
III:204/1232
48
III- Pacientes y Métodos
Gen ABCA4: Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva
ARDM-54 ARDM-89 RP-82 RP-417
RP-586
I:103/252
I:203/251
II:103/231
II:203/232
I:1 I:2
II:197/884
I:1 I:2
II:11799
I:1 I:2
II:199/703
I:1 I:2
II:199/1217
I:101/1239
II:101/1238
II:201/1265
II:301/1199
I:201/1237
RP-578 RP-700 RP-716
RP-766 RP-775
I:101/1242
I:201/1244
II:101/1246
II:201/1245
II:301/1243
II:401/1240
II:601/1241
II:501/1200
I:1 I:2
II:102/464
I:1 I:2
II:103/235
I:1 I:2
II:103/385
I:1 I:2
II:103/944
RP-813 RP-818 RP-834
I:1 I:2
II:103/908
I:1 I:2
II:104/469
RP-854 RP-857 RP-927 RP-937
I:1 I:2
II:104/1505
I:104/1299
I:204/1298
II:104/368
II:204/1626
I:104/1553
I:204/1554
II:104/1552
II:204/1555
II:304/1556
I:1 I:2
II:105/225
49
III- Pacientes y Métodos
Gen ABCA4: Familias con Fenotipo diverso -STGD, DCB, RPAR-
RP-280 RP-315 RP-532
I:195/91
I:295/92
II:195/93
II:295/94
II:395/95
II:495/96
I:295/397
I:1
II:195/398
II:295/399
I:199/117
I:299/116
II:299/115
II:199/114
II:399/146
Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante
ADDM-59 ADDM-74 ADDM-80
I:202/468
I:1
II:102/479
II:203/871
I:1 I:2
II:102/837
I:1 I:2
II:102/920
ADDM-92 ADDM-94
II:1 II:203/446
I:1
III:203/398
III:1
IV:203/397
II:3
III:503/690
III:403/458
IV:1
V:106/183
III:603/631
III:3
IV:303/456
I:1 I:2
II:103/640
ADDM-105 ADDM-106
I:1 I:203/1192
II:103/1169
I:1 I:2
II:103/591
50
III- Pacientes y Métodos
2- METODOLOGÍA
2.1- OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO
El material de partida empleado en los estudios moleculares ha sido el ácido desoxirribonucleico o
ADN, obtenido a partir de muestras de 15 centímetros cúbicos (cc) de sangre periférica con el
anticoagulante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).
2.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO
La extracción de ADN se ha realizado utilizando dos métodos distintos:
2.1.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN POR EL MÉTODO SALINO
En un principio, el ADN se obtuvo por precipitación salina, que consiste en tratar la muestra con una
serie de disoluciones tampón (tampones) que rompen las membranas celulares de los eritrocitos y de los
leucocitos. Los leucocitos o glóbulos blancos son las células nucleadas de la sangre a partir de las cuales
se obtiene el ADN.
El protocolo empleado fue el siguiente:
Cuadro III.1A: Protocolo de extracción de ADN por el método salino.
1- Trasvasar las muestras de sangre a tubos Falcon 50 (50 ml) y enrasar con suero fisiológico (NaCl 0,09%).
Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.
2- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 30 min en hielo.
Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.
3- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 10 min en hielo.
Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.
4- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE y agitar.
Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.
5- Decantar el sobrenadante.
Añadir 3 ml de TLL, 200 μl SDS (dodecil sulfato de sodio) 10% y 500 μl solución proteinasa-k.
Dar un vórtex e incubar a 37ºC toda la noche.
6- Añadir 1ml NaCl 6M. Dar un vórtex. Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, a tpa.amb.
7- Decantar el sobrenadante en un tubo Falcon 15 (15 ml). Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.
8- Decantar el sobrenadante en un tubo y centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.
9- Decantar el sobrenadante en un tubo y enrasar con etanol absoluto (100%).
Agitar; se observa la precipitación del ADN.
10- Lavar el ADN dos veces en etanol 70% a -20ºC.
11- Pasar el ADN a tubo limpio y centrifugar en vacío 15 min para eliminar los restos de etanol.
12- Pasar el ADN a un criovial y resuspender en 700 μl TRIS-EDTA 1mM / 0´1mM.
51
III- Pacientes y Métodos
Los reactivos utilizados se detallan a continuación:
tracción de ADN por el método salino.
Leyen
DN
La extracción automática del ADN se realizó mediante el BioRobot EZ1 (QIAGEN, Hilden,
er as
imultán angre periférica del paciente. El ADN eluido se obtiene a una
onc
.1.2 ONCENTRACIÓN
n las muestras extraídas por precipitación salina, ya que la
onc o era conocida, con el objetivo de preparar alícuotas del ADN original a
na con
Cuadro III.2: Lectura de concentración del ADN en el espectrofotómetro.
Reactivos:
TLE
Solución proteinasa-k: 10 ml proteinasa-k (10 mg/ml) + 5 ml SDS 10% + 400 μl EDTA 0´25M pH 8 + enrasar
TRI asar con H2Od hasta 100
ml.
(tampón de lisis de eritrocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 2´5 ml MgCl 1M + enrasar con H2 2Od hasta 500 ml.
TLL (tampón de lisis de leucocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 40 ml NaCl 5M + 4 ml EDTA 0´25M + enrasar con
H Od hasta 500 ml. 2
con H Od hasta 50 ml. 2
S/EDTA 1mM/0´1mM pH8: 50 μl TRIS 2M pH 8 + 40 μl EDTA 0´25M pH 8 + enr
Cuadro III.1B: Reactivos utilizados en la ex
da: ml, mililitros; rpm, revoluciones por minuto; min, minutos; μl, microlitros; M, molar (moles/litro); tpa.amb.,
temperatura ambiente; mM, milimolar = milimoles/litro; H2Od, agua destilada.
2.1.1.2- EXTRACCIÓN AUTOMÁTICA DEL A
G many), siguiendo las instrucciones del fabricante. El aparato permite la extracción de 1-6 muestr
eamente, a partir de 350 μl de ss
c entración óptima de aproximadamente 50 nanogramos por microlitro (ng/μl).
2 - ESPECTROFOTOMETRÍA DE ADN: LECTURA DE LA C
Esta técnica se realizó únicamente co
c entración del ADN obtenido n
u centración óptima de 50 ng/μl.
1- e cuantificaron las muestras de ADN en un espectrofotómetro Gene Quant pro (Amersham), siguiendo
;
3- Una vez obtenida la concentración del ADN original, preparar alícuotas a una concentración de 50 ng/μl.
S
las instrucciones del fabricante.
2- Registrar las medidas de las ABS obtenidas:
ABS 260nm: indica la concentración de ADN;
ABS 280nm: indica la concentración de proteínas;
ABS 230nm: indica la concentración de sales
Coeficiente ABS 260/ABS 280: indica la pureza:
- valores ∼1´6: indican contaminación por proteínas
- valores ∼2: indican contaminación por RNA
52
III- Pacientes y Métodos
2.1.3- PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO
Este proceso se realiza cuando las muestras de ADN -extraídas por precipitación salina- no
res alores óptimos de pureza.
ón del ADN genómico.
p entan los v
1- Añadir 5 μl RNAasa A (25mg) por cada 500 μl ADN. Incubar a 37ºC, 1h.
2- Añadir 75 μl SDS 10% por cada 1 ml ADN. Agitar.
n un volumen de fenol-cloroformo.
Si la muestra no está limpia, dar 2 pases. Recoger el sobrenadante.
5- Efectuar un pase en un volumen de cloroformo-isoamílico.
Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min.
Recoger
7- Añadir 2 vol
8- Conservar el ADN purificado en TRIS-EDTA 1mM/0´1mM pH8.
3- Añadir 20 μl proteinasa-k por cada 1 ml ADN. Agitar. Incubar a 56ºC, 1h.
4- Efectuar un pase e
Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min.
la fase acuosa.
6- Añadir 80 μl NaCl 5M por cada 1 ml ADN.
úmenes de etanol absoluto, para precipitar el ADN.
Cuadro III.3: Purificaci
53
III- Pacientes y Métodos
2.2- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
El protocolo para abordar el estudio directo de los tres genes de interés se realizó de la siguiente
manera:
enes NDP y RS1a) G :
1- a, del afecto y de sus familiares.
2- o, en el afecto.
4- s del afecto, mediante secuenciación del fragmento
entra la mutación.
ción, de mutaciones nuevas en población control.
Extracción de ADN a partir de sangre periféric
Amplificación mediante PCR de los exones de cada gen estudiad
3- Secuenciación automática de los exones de cada gen.
Ampliación del estudio directo a los familiare
concreto en el que encu
5- Confirmación, mediante ensayo de restric
b) Gen ABCA4
:
1- Extracción de ADN a partir de sangre periférica, del afecto y de sus familiares.
2- Cribado de mutaciones y polimorfismos mediante un microarray de genotipado, en el afecto.
3- Validación de resultados mediante secuenciación automática de los exones en los que se han
identificado las mutaciones responsables.
4- Ampliación del estudio directo a los familiares del afecto, mediante secuenciación de los fragmentos
concretos en los que se encuentran las mutaciones.
5- En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa
mediante secuenciación automática.
6- En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa
mediante MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay).
7- Confirmación, mediante ensayo de restricción, de mutaciones nuevas en población control.
8- Cribado de una mutación prevalente en población control mediante dHPLC (denaturing High
Performance Liquid Chromatography)
54
III- Pacientes y Métodos
2.2.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
NDICIONES DE LA PCR
A continuación, se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las distintas
uencias de los cebadores y las temperaturas de hibridación (Th) empleadas en la
mplificación de los diversos fragmentos se verán más adelante.
Reactivos y Concentraciones Ciclos (n=30)
2.2.1.1- CO
regiones exónicas. Las sec
a
Reactivo Concentración Temperatura Tiempo
ADN 50 ng/μl 95ºC 5 min
Tampón (Roche) 1´5 mM MgCl 2
Nuc M (de cada uno) 95ºC 20 s leótidos (Invitrogen) 1´25 m
Cebadores (Pacisa+Giralt) 10 μM (de cada uno) Th 30x 20 s 30x
DMSO -aditivo opcional- (Merck) 10% del volumen final 72ºC 40 s
GC-rich -aditivo opcional- (Roche) 20% del volumen final
Taq polimerasa (Roche) 2´5 unidades 72ºC 10 min
Agua estéril (Braun) csp 50 μl 4ºC ∞
Tabla III.2: Condiciones utilizadas para amplificar los diferentes exones de los genes NDP, RS1 y ABCA4.
Leyendas: DMSO, dimetilsulfóxido; csp, cantidad suficiente para; s, segundos.
El volumen final de la reacción fueron 50 μl. La reacción de PCR se realizó en un termociclador
en
.2.1.2- C
S-)
mplead enes NDP, RS1 y ABCA4, las temperaturas de
ibr C-
ch, que
en
cuando
E badores Tpa. (ºC)
Tam. (pb)
GC-rich
G eAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems).
2 EBADORES
A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores (sentido -S- y antisentido -A
os para amplificar las regiones exónicas de los ge
idación específicas y el tamaño de cada fragmento (pb). También se detalla la utilización o no de G
es un aditivo necesario:
h
ri
- la amplificación de regiones ricas en guaninas y/o citosinas, más difíciles de desnaturalizar;
la amplificación del fragmento no es específica.-
Tabla III.3: Gen NDP; los cebadores utilizados fueron descritos por Berger W et al., 1992.
xón Ce
ND1 S⇒ 5´ TCCCCGATAACGAGCGCCT 3´ AS⇒ 5´ CCTAGGCAAGCCGGCAGC 3´ 60 364 -
ND2a S⇒ 5´ GTTCCATTAGTGGTTCTGGG 3´ AS⇒ 5´ TTATCACCAGCAGGGAGAGC 3´ 58 322 +
ND2b S⇒ 5´ CCGATCCTGCCCTTTCCTT 3´ AS⇒ 5´ CTTGCCTGTTTCTGAGGGAA 3´ 58 337 -
ND3 S⇒ 5´ CCTGGCTAAGGTTGTGGCAT 3´ AS⇒ 5´ CCTGGGAGTAGCTTGTCCTT 3´ 58 349 -
55
III- Pacientes y Métodos
Tabla III.4: Gen RS1; los cebadores utilizados fueron descritos por Sauer GC et al. 1997.
Exón Cebadores Tpa. (ºC) Tam. (pb)
RS1 S⇒ 5´ CTCAGCCAAAGACCTAAGAAC 3´ AS⇒ 5´ GTATGCAATGAATGTCAATGG 3´ 54 216
RS S⇒ 5´ GTGATGCTGTTGGATTTCTC 3´ AS⇒ 5´ CAAGTGATAGTCCTCTATG 3´ 56 176 2
RS3 S⇒ 5´ CTGCCCTGCCTCTCTGGTTG 3´ AS⇒ 5´ GGTGTTCCCAATGACTGTTCC 3´ 60 178
RS4 S⇒ 5´ GGTGCTTGTTGAGTATTGAG 3´ AS⇒ 5´ AAAATCCCCGGGCCCTGC 3´ 54 219
RS5 S⇒ 5´ GAGAGCCAGCACCTGCGG 3´ AS⇒ 5´ GGGTGCGAGCTGAAGTTGG 3´ 65 311
RS6 S⇒ 5´ CCCG 5´ CTTTGTTCTGACTTTCTCTGGC 3´ 62 414 ATGTGATGGTGACAGG 3´ AS⇒
: Gen ABCA4; los cebadores on descritos por Rivera A et al. 200
Exón Ce Tpa. (ºC) Tam. (pb)
Tabla III.5 utilizados fuer 0.
badores
STG1 GTGTGGTC TTT 3´ 141 S⇒ 5´ AATCTGGTCTTC 3´ AS⇒ 5´ GTTTA GCTCCACACCTC 58
STG2 GAA CAGACC TCTC 3´ 197 S⇒ 5´ AATCTCTTAGCACCACT 58 C 3´ AS⇒ 5´ AGGCC AAAG
STG3 AC AAGGGGTG GCAAC 3´ 57 249 S⇒ 5´ CCTGCTTGGTCTCCATG 3´ AS⇒ 5´ ACGTG T
STG4 GGCTTTGTC 3´ GGTGAGGG ATGC 3´ 213 S⇒ 5´ CCTTATTAATGA 57 AS⇒ 5´ ATA AAATG
STG5 CCCTTCAACACCC 3´ TGCTTCCCTCC CCAG 3´ 220 S⇒ 5´ CCATTTC 58 AS⇒ 5´ G CCT
STG6 285 S⇒ 5´ CTACCACAGGGCAGTTTCTA 3´ AS⇒ 5´ CAGGAATCACCTTGCAATTG 3´ 58
STG7 S⇒ 5´GA 57 229 TCAGACTGTGCCTATGTG 3´ AS⇒ 5´ATAAGTGGGGTAAATGGTGG 3´
STG8 S⇒ 5´GAGCATTGGCCTCACAGCAG 3´ A 5´CCCCAGGTTTGGTTTCACC 3´ 54 400 S⇒
STG9 239 S⇒ 5´AGGTTACAAGCAATGGGGAG 3´ AS⇒ 5´TCTGGGAGGTCCAGGGTAC 3´ 58
S ⇒ 5´CCCCCCTTACTCTGATCAT 3´ 50 145 TG10 S⇒ 5´ATCTTTGTCTGGTTTTAGGC 3´ AS
S S⇒ 5´GAATTTCTAAGCAGAGCAGTG 3´ AS⇒ 5´AGCTCTGGCCCCACTCATG 3´ 54 303 TG11
S S⇒ 5´AGTTGAGTGTTTGCAGTTGG 3´ AS⇒ 5´CTGACTTTGGAGAAATGCAG 3´ 58 307 TG12
S GAGGTGTGAGTGAGC 3´ AS⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´ 58 277 TG13 S⇒ 5´TCGG
S 14 TG S⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´ AS⇒ 5´AATCCAGGCACATGAACAGG 3´ 57 362
STG15 S⇒ 5´AGGCTGGTGGGAGAGAGC 3´ AS⇒ 5´GGACTGCTACGGACCATTC 3´ 56 373
STG16 S⇒ 5´CTGTTGCATTGGATAAAAGGC 3´ AS⇒ 5´GATGAATGGAGAGGGCTGG 3´ 56 330
S GATAGGG 3´ AS⇒ 5´ CACACCGTTTACATAGAGGGC 3´ 58 231 TG17 S⇒ 5´ CTGCGGTAAGGTAG
S 209 TG18 S⇒ 5´CTCTCCCCTCCTTTCCTG 3´ AS⇒ 5´GCCTTTTCCTCGCCTCTG 3´ 56
S TGGGAAAGAGTAGACAGCCG 3´ 57 320 TG19 S⇒ 5´TGGGGCCATGTAATTAGGC 3´ AS⇒ 5´
S S⇒ 5´GCCCTCCTAAGGCATGTTG 3´ AS⇒ 5´TATCTCTGCCTGTGCCCAG 3´ 57 294 TG20
STG21 S⇒ 8 305 5´GTAAGATCAGCTGCTGGAAG 3´ AS⇒ 5´GAAGCTCTCCTGCTCCAAGC 3´ 5
STG22 S⇒ 5´AGGTACCCCCACAATG AS⇒ 5´AGCCCAGCCCAGGAGACT 3´ 56 260 CC 3´
STG23 3´ G 3 58 382 S⇒ 5´TTTTTGCAACTATATAGCCAGG AS⇒ 5´AGCCTGTGTGAGTAGCCAT ´
STG24 3 59 187 S⇒ 5´GCATCAGGGAGAGGCTGTC 3´ AS⇒ 5´CCAGACGGAACCCAAGTATG ´
STG25 3´ 3´ 56 379 S⇒ 5´GGTAACCTCACAGTCTTCC AS⇒ 5´GGGAACGATGGCTTTTTGC
STG26 ´ ´ 48 220 S⇒ 5´TCCCATTATGAAGCAATACC 3 AS⇒ 5´CCTTAGACTTTCGAGATGG 3
STG27 S⇒ 5´GAGATCCAGACCTTATAGGC 3´ AS⇒ 5´GTTATAACCCATGCCTGAAG 3´ 54 415
STG28 S⇒ 5´ACGTGTGACATCTCCATGCC 3´ AS⇒ 5´CCCTTCTAAGCAGCATGTGA 3´ 58 250
56
III- Pacientes y Métodos
Exón . (ºC) Tam. (pb) Cebadores Tpa
STG29 59 234 S⇒ 5´AGGCTCTGAGTTGCATGATG ⇒ 5´CTGCCATCTTGAACCCACC 3´ 3´ AS
S TG30 54 253 S⇒ 5´ACTTTGAGGCTGATTATGGAA 3´ AS⇒ 5´CCCCGTTGTTTGGAGGTC 3´
S TG31 56 198 S⇒ 5´TATAAGTCCTCAAGTTCCAAG 3´ AS⇒ 5´AATATCTTCTACAGGGAGCC 3´
S TG32 58 180 S⇒ 5´TAACGGCACTGCTGTACTTG 3´ AS⇒ 5´TCATGGCTGTGAGGTGTGC 3´
S A ´ TG33 58 228 S⇒ 5´TTCATGTTTCCCTACAAAACCC 3´ S⇒ 5´AAAATCCTACTCAAATCTCCAG 3
S TG34 56 269 S⇒ 5´GCTTAACTACCATGAATGAG 3´ AS⇒ 5´TCAGCAGGAGGAGGGATG 3´
S TG35 58 270 S⇒ 5´TAACTAGCTGTTAATGCAGCG 3´ AS⇒ 5´AAGAGTGGAGAAGGTGACAA 3´
S S⇒ 5´GTATCTTCTCCTCCTTCTGC 3´ AS⇒ 5´CACACAAGCTCCACCTTGG 3´ 58 303 TG36
S S⇒ 5´CAGGTCTGAGAGGTTAAGTG 3´ AS⇒ 5´CCACCAGGCTTCTCTTCAG 3´ 58 211 TG37
S S⇒ 5´GGAATGGAATGTGGAACTCC 3´ AS⇒ 5´ACACATACTCTACTATCCTAC 3´ 54 253 TG38
STG39 S⇒ 211 5´GGTTTGCCCCGTTTCCAAC 3´ AS⇒ 5´TCCCAGCTTTGGACCCAG 3´ 56
STG40 58 236 S⇒ 5´AGGTCTGTGGGGTGAGCTG 5´TCTGGATGCCCTGAGCTGC 3´ 3´ AS⇒
STG41 58 221 S A ⇒ 5´GAAAGGACAGTGCCAAGGAC 3´ S⇒ 5´TCTAACCAGCACCTCCAAAC 3´
STG42 57 149 S⇒ 5´CCGTCTCAGTTCTCAGTCC 3´ AS⇒ 5´AGAGCTGATGTTCGGAAGCC 3´
STG43 56 276 S⇒ 5´CTTACCCTGGGGCCTGAC 3´ AS⇒ 5´TCAGAGCCACCCTACTATAG 3´
STG44 54 287 S⇒ 5´GAAGCTTCTCCAGCCCTAGC 3´ AS⇒ 5´TGCACTCTCATGAAACAGGC 3´
STG45 51 208 S⇒ 5´CTTGTCTTCTCCAAATGGCA 3´ AS⇒ 5´TTTAAGCCCTTGGTGCGGC 3´
STG46 57 256 S⇒ 5´GAAGCAGTAATCAGAAGGGC 3´ AS⇒ 5´CCTCACATTCTTCCATGCTG 3´
STG47 57 219 S⇒ 5´CACATCCCACAGGCAAGAG 3´ AS⇒ 5´ATCCACAGAAGGCAAGC 3´
STG48 57 357 S⇒ 5´AGGCCCAACCACTAACAGAG 3´ AS⇒ 5´ACACTGGGTGTTCTGGACC 3´
STG49 54 178 S⇒ 5´GTGTAGGGTGCTGTTTTCC 3´ AS⇒ 5´CAAGCTGTGGACTGCATAAG 3´
STG50 57 66 S⇒ 5´AAACCAAGATGACGCGAGTC 3´ AS⇒ 5´GGAACGAGCGGTGTGAAAG 3´
2.2.1.3- D EDI
Lo resol de a osa a
ntr frag 25-6 P
in se ).
ro e ag o-ED V, volt
ETECCIÓN DEL PRODUCTO DE PCR M ANTE ELECROFORESIS
s exones amplificados por PCR se vieron mediante electroforesis en gel gar una
conce ación del 3%, que permite separar mentos de ADN en un rango de 1 00 pb. ara
determ ar el tamaño, se empleó un marcador de peso molecular de un rango de una kiloba (kb
Cuad III.4A- Protocolo de elaboración de geles d arosa. Leyenda: g, gramo; TBE, Tris-Borat TA; io.
1- P % d Bor DTA).
T lver la
U ro d
Ve gelifica
bromofe
azul d bromof
- marcador d )⇒ 1
En cubeta ucir el g V, 30 min.
V
e agarosa (Serva) en tampón TBE 1x. (Tris-reparar un gel a una concentración del 3 ato-E
apar y calentar en microondas hasta diso agarosa por completo.
e etidio (Roche). na vez disuelta, añadir un 18 % de bromu
2- rter en una carcasa con peines y dejar r.
3- Cargar las muestras, mezcladas con azul de
- muestras⇒ 20 μl producto de PCR + 2 μl
nol, en la siguiente proporción:
e enol 6x (10% del volumen de muestra)
e peso molecular 1 kb (Roche μl marcador + 9 μl azul de bromofenol 1x.
de electroforesis (Bio-Rad), introd4- el en el tampón (TBE 1x). Correr a 90
isualizar el gel bajo luz UV (Gelprinter® SuperII).5-
57
III- Pacientes y Métodos
Los reactivos utilizados en la preparación de los geles se detallan a continuación:
os
CRIB CROA
E izad tacio previo
4, de onales de crib
, S rphi Cadena Senc
, De esis, esnaturalizante) y
e la icas que represen
ión s en limorfismos de
nuc mor
El realiza a sarrol
os ndo rimer Extens
asp uero gre periférica
te.
Figura I ie de cristal (“chip
de A a polimerasa realiza la
ext ón i ntos de
or lavado. Se produce la detección de la señal emitida.
Reactiv
Taos:
1x: partir del tampón comercial Tmpón TBE BE 10x ( n 1x con 2Od.
zul de nol 100
zul e TB .
Pronadisa) y llevar a una concentració H
A bromofenol 6x: 0´25 g azul de bromofe + 40 g sacarosa + enrasar con H Od hasta ml. 2
A de bromofenol 1x: Añadir 5 volúmenes d E 1x por volumen de azul de bromofenol 6x
Cuadro III.4B: Reactivos utilizad en la electroforesis de fragmentos de ADN.
2.2.2- ADO DE MUTACIONES MEDIANTE MI RRAY DE GENOTIPADO
l microarray de genotipado se ha util o con el fin de realizar un análisis mu nal en
ABCA ya que presenta mayor sensibilidad de tección frente a las técnicas convenci ado
(SSCP ingle Strand Conformation Polymo sm, Polimorfismo Conformacional de illa;
DGGE naturing Gradient Gel Electrophor Electroforesis en Gel de Gradiente D
del gen ABCA4 en una sola reacción, permit identificación de 438 variantes genét ta la
detecc del 75% de las alteraciones descrita este gen, incluyendo mutaciones y po un
leótido (SNPs, Single Nucleotide Poly phisms) (Jaakson J et al., 2003). único
análisis previo del gen ABCA4 fue do por la empresa AsperBio Ltd., que h de lado
la tecnología APEX (Arrayed P ión) divers microarrays de genotipado utiliza
(www. erbio.com). El material de partida f n 50 μl ADN extraído a partir de san del
pacien
1 2 3 4
II.1: Método APEX. 1) Los 438 oligos sintéticos se inmovilizan por su extremo 5´ sobre una superfic
DN”). 2) Los fragmentos de la muestra amplificados por PCR se hibridan con los oligos. 3) L
ensi ncorporando nucleótidos. Los 4 terminadores están marcados con 4 fluorocromos distintos. 4) Los fragme
ADN y los nucleótidos no incorporados se eliminan p
58
III- Pacientes y Métodos
2.2.3- S
.2.3 ACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR
un
ma uestras.
espu or, se extrae el
agmento de ADN del gel con una cuchilla limpia y se introduce en un tubo eppendorf de 1´5 ml.
El protocolo de p tion Kit, Qiagen,
ilden, Germany), fue el siguiente:
Cuadro III.5- Protocolo para la purificación del producto de PCR a partir de geles de agarosa.
ndo el fragmento amplificado está constituído por una única banda, es decir, no a
as inespecíficas en el gel de agarosa, el producto de PCR se puede purificar directamente. Para ell
s ®
pro
ECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
2 .1- PURIFIC
Este proceso se utilizó para extraer y purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa, de
ta ño comprendido entre 100 pb y 10 kb, que resulta imprescindible antes de secuenciar las m
D és de la electroforesis del producto de PCR, se coloca el gel en un transiluminad
fr
urificación, realizado mediante un kit comercial (QIA-quick Gel Extrac
H
1- Pesar el gel cortado y añadir 3 volúmenes de buffer QG (μl) por volumen de gel (mg).
4-
3000 rpm, 1 min, tpa.amb.
8- irar el filtrado y centrifugar 1 min adicional.
9- Colocar la columna en un tubo eppendorf limpio de 1´5 ml.
10- Añadir 30 μl de tampón de elución (buffer EB) al centro de la columna, dejar reposar 1 min y centrifugar a
13000 rpm, 1 min, tpa.amb.
Incubar a 50ºC, 10 min o hasta que el gel se haya disuelto completamente.
Para que el gel se disuelva mejor, dar un vórtex al tubo cada 2-3 min durante la incubación.
2- Tras la completa disolución del gel, comprobar que el color de la mezcla es amarillo.
El buffer QG contiene un indicador de pH (amarillo si el pH < 7´5; naranja o violeta si pH > 7´5), ya que la
adsorción del ADN a la membrana QIAquick es eficaz sólo a pH < 7´5.
Si el color de la mezcla fuese naranja o violeta, añadir 10 μl de acetato de sodio 3 M pH 5´0 y agitar.
3- Añadir un volumen de isopropanol y mezclar con la pipeta.
Colocar la columna QIAquick en uno de los tubos de 2 ml proporcionados.
5- Para la adsorción del ADN, aplicar la muestra en la columna y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.
6- Tirar el filtrado y volver a colocar la columna en el mismo tubo.
7- Para lavar, añadir 750 μl tampón de lavado (buffer PE) a la columna, dejar en reposo 2-5 min y centrifugar
a 1
T
Cua parecen
o, band
e empleó un kit comercial (E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit, OMEGA) que utiliza como material de partida el
ducto de PCR, sin necesidad de separar previamente el fragmento amplificado por electroforesis.
59
III- Pacientes y Métodos
El protocolo utilizado fue el siguiente:
1- Determinar el volumen de partida del producto de PCR: añadir 4 volúmenes de tampón CP (μl) por
volumen de PCR.
2- Aplicar la solución a la columna HiBind® colocada en un tubo colector de 2 ml.
3- Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.
Tirar el líquido sobrante.
4- Lavar la columna 2 veces: añadir 750 μl de tampón de lavado (Wash Buffer) y centrifugar a 13000 rpm, 1
min, tpa.amb.
Tirar el líquido sobrante.
5- Centrifugar la columna vacía a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb., para secarla.
1mM pH8 y centrifugar a
6- Colocar la columna en tubo eppendorf de 1´5 ml.
O estéril (Braun) o TRIS/EDTA 1mM/0´Para eluir el ADN, añadir 30-50 μl H2
13000 rpm, 1 min, tpa.amb.
Cuadro III.6- Protocolo de purificación a partir de producto de PCR.
.2.3 R
cuenciación. En la reacción se
mp entes
ac
as con siguientes:
CICLOS (n=25)
2 .2- EACCIÓN DE SECUENCIACIÓN
Una vez purificado el producto de PCR, se realiza la reacción de se
leó un premix (dRhodamine DNA Sequencing Kit, Applied Biosystems) que incorpora los siguie
re tivos: tampón de la reacción, dNTPs (90%), ddNTPs (10%) y la enzima ADN polimerasa.
diciones utilizadas fueron lasL
Reactivos
Reactivo Volumen Temperatura Tiempo
AD 6 μl 94ºC 3 min N
Premix (Applied Biosystems) 4 μl 96ºC 10 s
Cebador [10mM] (Pacisa+Giralt) 1 μl 50ºC 25x 5 s 25x
DMSO (Merck) 1 μl 60ºC 4 min
Agua estéril (Braun) csp 20 μl 4ºC ∞
Tabla III.6: Condiciones de la reacción de secuenciación.
El producto de esta reacción se resuelve mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático
(ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) y la información obtenida se analiza mediante el
programa informático Sequencing Analysis Software v 5.1.1.
El volumen final de la reacción fueron 20 μl y la temperatura de hibridación (Th) fueron 50ºC. La
reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems).
60
III- Pacientes y Métodos
2.2.3.3- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO SECUENCIADO
Los productos de la reacción de secuenciación se purifican mediante unas columnas que contienen
n polímero denominado Sephadex G-501 (Princetown Separations), que permite eluir las moléculas de
ay as
olita q coge el ADN (producto
ecue ci es (dNTPs, ddNTPs, enzima, etc.) quedan retenidos en la
lum a
Una vez que se ha p el producto secuenciado, hay líquido sobrante y
resuspender el botó n agente d ralizant ras en el
secuenciador:
u
m or tamaño, mientras que las moléculas pequeñas quedan retenidas en el interior de cada una de l
b s ue conforman esta matriz. De esta forma, al centrifugar la columna se re
s n ado), mientras que los reactivos sobrant
co n .
1- Resuspender la columna de Sephadex con 800 μl H2O estéril (Braun).
tpa.amb.
ppendorf de 1´5 ml y añadir 20 μl reacción de secuenciación.
Centrifugar, una vez, a
Recoger el ADN eluíd
4- Lavar la columna con 750 μl H2Od y rehidratar durante 2-3 h.
5- Centrifugar 2 veces a 4000 rpm, 2 min, tpa.amb.
Tirar el líquido sobrante y conservar a 4ºC.
Dar un vórtex y rehidratar durante 2-3 h.
2- Centrifugar la columna 2 veces a 4000 rpm, 2 min,
Tirar el líquido sobrante.
3- Colocar la columna en tubo e
4000 rpm, 2 min, tpa.amb.
o y reservar.
Cuadro III.7- Protocolo de purificación de la reacción de secuenciación.
urificado
) con u
que evaporar el
cargan (pellet esnatu e, antes de r las muest
1 ´5 ml -con l cción de fi trador
rífuga de vacío (Concentrator , eppendorf). C r a tpa.am evaporar el
.
2- Resuspender el pelle
3- Dar vórtex y pulsada.
Desnaturalizar a 95ºC, 2 min. Mantener los tubos en hielo para evitar la renaturalización.
4- Cargar las muestras en el secuenciador automático (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied
- Colocar los tubos eppendorf de 1 a rea secuenciación puri cada- en un concen
5301de ADN / cent entrifu
Cuadro III.8- Desnaturalización de la reacción de secuenciación.
ga b. hasta
líquido por completo
t con 25 μl formamida, dejar actuar 15 min como mínimo.
Biosystems).
61
III- Pacientes y Métodos
2.2.4- ANÁLISIS CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Los ensayos de restricción se utilizaron para confirmar la presencia o ausencia de una mutación.
Una vez que se ha identificado el cambio, se introduce la secuencia en el programa informático Vector Nti
Suite v9. Este programa busca una endonucleasa de restricción (ER) que reconozca el cambio en la
secuencia, bien porque la mutación genere una nueva diana de restricción o bien porque destruya una
diana que existía previamente. Las ER utilizadas (New England BioLabs) y las condiciones de digestión de
los productos de PCR se recogen en las siguientes tablas:
Digestión
Enzimas y dianas
Enzima Diana Temperatura Tiempo
Aci I 5’…C↓CGC…3’ 37ºC 3 horas
Alu I 5’…AG↓CT…3’ 37ºC 3 horas
AGG…3’ 37ºC 3 horas
5’…C↓CGG…3’ 37ºC 3 horas
37ºC 3 horas
Eco NI 5’…CCTNN↓NNN
Msp I
Taq I 5’…T↓CGA…3’
Tabla III.7: Enzimas de restricción utilizadas, dianas que reconocen y condiciones de la digestión.
Reactivos
Reactivos Volúmenes
ADN (producto de PCR) 10 μl
Tampón 2 μl
Enzima de restricción (10 unidades/μl) 3 μl
Agua csp 20 μl
Tabla III.8: Reactivos de la digestión. El volumen final de la reacción fueron 20 μl.
l proto
Cuadro III.9- Ensayo de restricción.
E colo para realizar el ensayo de restricción fue el siguiente:
1- Amplificar por PCR el fragmento de interés.
2- Incubar el producto de PCR con la enzima de restricción a 37ºC, 3h (Ver condiones Tabla III.7).
3- Resolver mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% (Ver Cuadro III.4).
62
III- Pacientes y Métodos
2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay)
Esta técnica fue utilizada con la finalidad de detectar pérdidas (deleciones) o ganancias
(inserciones) de material genético. El análisis de las muestras se realizó mediante dos kits comerciales
(MRC-Holland B.V.: SALSA MLPA KIT P151 y 152 ABCA4), siguiendo el siguiente protocolo:
a) Desnaturalización del ADN:
· Partir de 5 μl ADN: desnaturalizar a 95ºC, 5 min. Enfriar a 25ºC.
b) Hibridación de las sondas
c) Reacción de ligaci
d) PCR: se realizó en mp PCR System 2700 (A Biosystems).
Reactivos CICLOS (n=35)
:
· Añadir 1´5 μl SALSA Probe-Mix y 1´5 μl MLPA buffer. Mezclar con cuidado.
Incubar a 95ºC, 1 continuación, inmin. A cubar a 60ºC, 16h.
ón
· Reducir la tpa. a 54ºC, añadir 32 μl de M r. La solució gase est por:
3 μl
Incubar a 54ºC, 15 min.
· Calentar a 98ºC, 5 min para inactivar la ligasa. Antes de la PCR, mantener el termociclador a 60ºC.
ix Ligase y mezcla n Mix Li á formada
Ligase 65-A + 3 μl Ligase 65-B + 1 μl Ligase 65 + 25 μl H O. 2
un termociclador GeneA pplied
Reactivo Volumen Te ratura Tiempo mpe
Reacción de ligación (ADN molde) 10 μl
SALSA PCR buffer 10x acción) 4 μl
SALSA PCR p
SALSA Enzyme dilution buffer (tampón enzima) 2 μl
SALSA Polymerase (enzima) 0´5 μl
72ºC
72ºC
4ºC
(pre-PCR)
30 s
30 s 35x
60 s
20 min
∞
60ºC
95ºC (tampón re
rimers (cebadores) 2 μl 60ºC 35x
Agua estéril (Braun) csp 50 μl
e) El r
Cuadro III.10- Protocolo del MLPA para el gen ABCA4.
ect oforesis capilar
· El producto de PCR obtenido se resuelve por electroforesis capilar (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer,
Applied Biosystems) mediante el programa informático GeneMapper Software v3.5.
Cargar las muestras en el secuenciador de la siguiente manera:
1 μl producto de PCR + 0´5 μl m Liz; Applied Biosystems) + 8´5 μl
formamida (Merck).
arcador de peso molecular (GS-500
63
III- Pacientes y Métodos
2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography)
ue
resentaron un patrón alterado o de heterodúplex, que se establece cuando está presente una mutación. La
lizó en el cromatógrafo WaveTM DNA Fragment Analysis System 4500
omic), siguiendo el siguiente protocolo:
nálisis de c ragmento depende composició s a lo
larg Por se realizó un análi temperatur a para
dete peratura óp obtenida por s .
La Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento -en condiciones desnaturalizantes- permitió realizar
un cribado previo de las muestras, con el fin de identificar una mutación prevalente entre los pacientes de
STGD, como se verá más adelante. A continuación, se secuenciaron sólo aquellas muestras q
p
detección de mutaciones se rea
(Transgen
1- Mezclar los productos de PCR (muestra control + muestra problema) en proporción 1:1, ya que el dHPLC
re una muestra homozigota normal y homozigota mutante.
2- Desnaturalizar los productos de PCR a 95ºC, 5 min en un termociclador (GeneAmp PCR System
eterodúplex.
3- Cargar 5 μl del producto de PCR mezclado en la columna (DnaSepTM column; Transgenomic).
odúplex y los homodúplex en un gradiente de acetonitrilo, formado por la combinación
de las soluciones A y B (WAVE OptimizedTM; Transgenomic). tware,
0´9 ml/min
- Duración de la carrera: 8 min, incluyendo lavado y equilibrado de la columna.
no puede diferenciar ent
2700; Applied Biosystems). Mantener a 54ºC, 1h para favorecer la formación de los h
4- Analizar los heter
TM5- Determinar los gradientes óptimos para eluir los amplificados mediante el programa Navigator Sof
bajo la aplicación Mutation Detection:
- Flujo del gradiente:
- Detección del ADN: luz UV (260nm)
Cuadro III.11- Protocolo de análisis de muestras en el dHPLC.
La temperatura óptima de a ada f de la n de base
o del mismo y, por tanto, es variable. ello, sis a a óptla im
ctar dicho alelo mutante. La tem tima, imulación en el aparato, fueron 63´2ºC
64
III- Pacientes y Métodos
2.3- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
2.3.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
2.3.1.1- CONDICIONES DE LA PCR
En la siguiente tabla se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las dis
regiones microsatélites. Las secuencias de los ce
tintas
badores empleados en la amplificación de los diversos
arcadores se verán más adelante.
LOS (n=30)
m
Reactivos y Concentraciones CIC
Reactivo Concentración Temperatura Tiempo
ADN 50 ng/μl 95ºC 12 min
T p 95ºC 15 s am ón (Roche) 1´5 mM MgCl2N s 10xucleótidos (Invitrogen) 2´5 mM (de cada uno) 55ºC 10x 15
72ºC 30 s C
fluoroc 89ºC 15 s
ebador sentido marcado con
romo (Applied Biosystems) 5 μM
Ceb
(Pacis5 μM
72ºC 30 s
ador antisentido sin marcar 55ºC 20x 15 s 20x
a+Giralt)
Taq p 2´5 unidades 72ºC 30 min olimerasa (enzima)
Agua ∞ estéril (Braun) csp 15 μl 4ºC
Tabla III.9: Condiciones u flanqueantes a los genes
NDP, RS1 y ABCA4.
temperatura de hibridación (Th) fueron 55ºC. La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp
PCR System 2700 (Applied Biosystems).
Los productos de PCR correspondientes a los marcadores microsatélites se resolvieron mediante
electroforesis capilar, como se verá más adelante.
2.3.1.2- CEBADORES
A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores empleados para amplificar los
marcadores microsatélites flanqueantes a los genes NDP, RS1 y ABCA4, así como la localización en los
respectivos cromosomas. Como se indica en la tabla anterior, el cebador sentido está marcado con un
fluorocromo que permitirá su posterior detección mediante electroforesis capilar.
tilizadas para amplificar los diferentes marcadores microsatélites
Estas regiones se amplificaron mediante PCR múltiple (multiplex PCR), que permite la amplificación
simultánea de tres o cuatro marcadores microsatélites. El volumen final de la reacción fueron 15 μl y la
65
III- Pacientes y Métodos
Los datos para seleccionar los distintos marcadores se obtuvieron a partir de dos bases de datos
lectrónicas:
; 2, 3) National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview).
Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)
e
- (1) The GDB Human Genome Database (www.gdb.org)- (
Tabla III.10: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen NDP. Leyenda: Mb: megabase.
Marcadores Fluorocromo
DXS8090 NED S⇒ 5´GGGTGAAATTCCATCACAAA3´ ATGTACAAAAAATA3´ 41,08 Xp AS⇒ 5´ACAAATGCAG
DXS1068 PET S⇒ 5´CCTCTAAAGCATAS⇒ 5´CCCAT TG3´ 5 AGGGTCCA3´
CTGAGAACACGC 43,0 Xp
8012 HEX S⇒ 5´AGCTTAGCAAGCCCAAGTAA3´ AS⇒ 5´GGACA ACCATAAC3´ 45,5 Xp DXS TAAACATTCAG
S⇒ 5´CCA 3´ AS⇒ 5´AC GTG CCTCACTCCAGCCTGAG
TTTGACCTTATCAAACAGDXS7 6-FAM 3´ 47,6 Xp
MAOB NED SAS⇒⇒ 5´GAAGCATCG AGGAGT3´
5´ATTTGGCCT AGTTAG3´ - X AAGTTCATAG p
NDP
DXS8080 HEX S⇒ 5´GGCCAACAAGAGCAAAACT3´ AS⇒ 5´TCCTTAGACCCAAA CC3´ 48,4 Xp CTT
DXS1003 NED S⇒ 5´TTCACCCAT 3´ AS⇒ 5´CCATTCC AAG3´ 50,7 Xp AGAAGCCGT
TCACTGGC
Tabla III.11: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen RS1.
Marcadores Fluorocromo Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)
DXS8022 NED S⇒ 5´CTGTCACAGAAGTCCCATTTTA3´ AS⇒ 5´GGAAACTAATGCAGCATGTC3´ 18,05 Xp
DXS1053 PET S⇒ 5´TTAAGGAAGTATGAGGCTCCA3´ AS⇒ 5´TT 19,68 Xp GGTGCAAAAGTAATCACG3´
DXS8019 6-FAM S⇒ 5´TTCATTAAAAGCCGTCTTTG3´ AS⇒ 5´TGTTGAGTTTCCTCACAGC3´ 21,86 Xp
DXS9911 HEX TCTAAAACAGT3´ AS⇒ 5´GCTATATATCTGCTATGCAGTGG3´ - Xp S⇒ 5´CCCGATTTCC
RS1
DXS999 HEX S⇒ 5´GCTAACAACCTAGACTTCAACC3´ AS⇒ 5´CAGTTTCACAATCTCTGCC3´ 22,95 Xp
DXS1226 6-FAM S⇒ 5´ CTAAACCCATCTGNCCTC3´AS⇒ 5´TTTCCAGCAACTACCTTTCAT3´ 27,69 Xp
DXS989 6-FAM S⇒5´AGAAGATAGATATACCCACTCACC3´ AS⇒ 5´ACATAAGAAATAAAATGGCTGC3´ 27,30 Xp
66
III- Pacientes y Métodos
Tabla III.12: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen ABCA4.
Marcadores Fluorocromo Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)
D1S464 NED S⇒ 5´GCCTAAATTTCTTACACATCCTAAC3´ 73,98 1p AS⇒ 5´GTTTTAAACACCACAAATAAATGT3´
D1S167 6-FAM S⇒ 5´TAAATTCTCCTT TTGGGTC3´ AS⇒ 5´TGAGTCATCT CGTTTAAGA3´ 88,51 1p G
G
D1S43 S⇒ 5´GGCCACATGGGAATTTTCT3´ 1p 5 HEX AS⇒ 5´AGCAGTTCAAGGCCACAGT3´ 89,81
D1S2804 NED S⇒ 5´AAAGGATA G3´ C3´
TTTTGGCCCT 91,13 1p AS⇒ 5´CAACGAGTATATTAGCATGACC
D1S2868 PET C3´ 91,59 1p S⇒ 5´AGGTATAATCTGCAATAAAAAACTT3´ AS⇒ 5´AAAGTAAAACAATATGAAGCCA
ABCA4
D1S236 6 ´ -FAM S⇒ 5´AAACCACCTACCAATGTCTGTC3 93,06 1p AS⇒ 5´GAAGCTGTCGTTATGGGGT3´
D 1S2664 6-FAM S⇒ 5´CAGCCCACAGAATAACACTG3´ 94,20 1p AS⇒ 5´TTCATGCTATGATTTTCCGC3´
D GA3´ 95,35 1p 1S2793 VIC S⇒ 5´GCCCTTCAGTTCCCAGA3´ AS⇒ 5´TGTATTAGTCAAGTTTCACCAGA
de lo amplificaron v ueve ma ores
cionales, distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Estos marcadores se seleccionaron de
comercial: Linkage Mapping Sets v2.5 (Applied Biosystems).
Tabla III.13: Marcadores micr a: cM: centimorgan.
Marc Locus adores Distan (1) (2)
Además s marcadores flanqueantes al gen ABCA4, se eintin rcad
microsatélites adi
un kit
osatélites distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Leyend(1) (2)adores Distancia (cM) Marc cia (cM) Locus
D1S450 16,61 1p D1S196 169,4 1q
D1S2667 19,88 176,3 1q 1p D1S218
D1S234 44,49 188,55 1q 1p D1S238
D1S255 58,6 192,5 q 1p D1S408 1
D1S2797 68,9 1p D1S2757 19 q 3,41 1
D1S2890 80,9 194,98 1q 1p D1S413
D1S2829 94,99 194, q 1p D1S1660 98 1
D1S2803 96,23 207,07 1q 1p D1S249
D1S207 107,16 1p D1S425 215,07 1q
ABCA4 22 q D1S229 2,29 1
D1S206 122,64 S213 228,26 1q 1p D1
D1S2726 132,11 0 24 q 1p D1S280 5,24 1
D1S4 4 257,498 144,9 1q D1S2785 6 1q
D1S4 1 261,884 157,5 1q D1S2842 6 1q
D1S2878 165,78 1q D1S2836 271,84 1q
67
III- Pacientes y Métodos
2.3.2- ANÁLISIS DE HAP
tenidos se resu ctroforesis capila 1 tic
Analyze s) y ico GeneM er Softwar .
Cuadro III.12- Pre ABI PRISM 3100.
2.3.3- D E ÁRB EN
trucción de l s h oles genealógi realizó m e
el programa informático Cyrillic v
LOTIPOS ®r (ABI PRISM 3 00 GeneLos productos de PCR ob elven por ele
r, Applied Biosystem app e v3.5 se analizan mediante el programa informát
1 μl de la dilución 1:10 del producto de PCR + 0´5 μl marcador de peso molecular (GS-500 Liz; Applied
B ) + 12 μl midaiosystems (Merck). forma
®paración de las muestras para su análisis en el
ISEÑO D OLES G EALÓGICOS
La cons o aplotipos en los correspondientes árb cos se ediant
2.1.
68
III- Pacientes y Métodos
2.4- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN
roteína Retinosquisina, codificada por el gen RS1. Se utilizó esta proteína por dos motivos:
es una proteína de bajo peso molecular: 25 kilodalton (kDa)
es
a p se realizó en el Laboratorio de Neurobiología del Desarrollo del
stituto Cajal (CSIC, Madrid), por cortesía de la Dra. Paola Bovolenta.
.4.1- VECTORES DE EXPRESIÓN
Como vector de expresión, se utilizó un plásmido comercial que contiene la pauta abierta de lectura
c-His en posición carboxilo terminal (OmicsLink ORF
Express
Características del vector
A continuación se describen las técnicas empleadas en los estudios de expresión “in vitro” de la
p
-
- una proteína secretable por las células, que puede ser detectada en los medios de cultivo.
uesta a punto de esta metodología L
In
2
del gen RS1, marcado con los antígenos My
ion Clone, EX-Q0232-M10; RZPD; www.rzpd.de). En la siguiente figura se describe la construcción
utilizada:
Promotor CMV (Citomegalovirus) Célula hospedadora Mamíferos
Antibiótico de selección bacteriana Ampicilina Etiqueta (marcaje) C-Myc C-His
Figura III.2: Estructura y características del vector de expresión utilizado.
2.4.2- CULTIVOS CELULARES Y TRANSFECCIÓN
Se utilizaron dos líneas celulares, MDCK (procedentes de riñón canino) y HEK 293 (procedentes de
riñón embrionario humano). Las condiciones de cultivo fueron las siguientes:
Cuadro III.13- Condiciones de cultivo de las líneas celulares MDCK y HEK 293.
CCMMVV OORRFF
MMCC11 MMCC22
TT77 CC--MMyycc CC--HHiiss PPoolliiAA
1- Trabajar en campana de flujo laminar vertical (Cultek).
2- Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.
3- En placas Petri de 10 cm de diámetro (Falcon), añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ (Dulbecco´s
modified Eagle´s medium; GIBCO) + 10% suero bovino fetal (Sigma-Aldrich) + gentamicina 1:1000
(GIBCO).
4- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2 Heraeus, Hera Cell( ).
69
III- Pacientes y Métodos
Las líneas celulares se transfectan cuando se encuentran en crecimiento exponencial.
ormalmente, este crecimiento se produce cuando las células tienen una confluencia del 50-70%, obtenida
Se generaron líneas estables con ambos tipos celulares, e las que crecen
en la placa han incorporado el plásmido en su genoma y, p expresarán la
menor medida. Cada tipo celular se transfectó con tres plá
- RS1-Myc-His: proteína que se quiere estudiar
sfectadas con G418 (análogo
sintético de la neomi eucariotas estables
ue han sido transfectadas con vectores que contienen un gen de resistencia frente a la neomicina.
N
en cultivo 24 horas después de haberles dado un pase. La transfección se realizó con el reactivo FuGENE
(Roche), como se indica a continuación:
Cuadro III.14- Protocolo de transfección del reactivo FuGENE.
1- Atemperar el reactivo de lipotransfección FuGENE (Roche) a tpa. amb., 5 min. Trabajar en campana.
es del tubo.
4- Añadir 4 μl ADN plasmídico⇒ [ADN plasmídico]= 1 μg/μl. Incubar 45 min.
5- Añadir la solución anterior, gota a gota, sobre la placa de cultivo.
2- Añadir 100 μl medio D-MEM GlutaMAX™, sin suero bovino fetal, en tubos de vidrio.
3- Añadir 12 μl FuGENE directamente sobre el medio, sin tocar las pared
6- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2, 72 h.
s decir, que todas las célu
or tanto, proteína en mayor o
smidos diferentes:
- Flg-SFRP-Myc: proteína secretable; control positivo
- pcDNA: es un vector vacío; control negativo.
A las 72 horas de la transfección, se comenzó la selección de las células tran
cina; GIBCO), que permite mantener y seleccionar líneas celulares
q
1- Trabajar en campana de flujo laminar vertical.
2-
X™ + 10% suero bovino fetal
+ gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl (GIBCO).
4- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.
Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.
3- En placas Petri de 10 cm de diámetro, añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMA
Cuadro III.15- Selección de líneas celulares estables con G418.
70
III- Pacientes y Métodos
Una vez comenzada la selección, las células que no han incorporado el plásmido comienzan a
morir y únicamente sobreviven aquellas que han sido transfectadas. Al cabo de dos semanas, se aíslan
varios clones de cada una de las lineas celulares transfectadas con los diferentes plásmidos.
Cuadro III.16- Selección de clones a partir de líneas celulares estables.
1- Bajo el microscopio, marcar los clones por debajo de la placa de cultivo.
2- Trabajar en campana de flujo laminar vertical.
3- Absorber el medio de cultivo de la placa con pipeta Pasteur de vidrio.
4- Rodear los clones previamente marcados con un cilindro de plástico (punta amarilla cortada y
Anadir 3 ml PBS 1x a la placa, para preservar la viabilidad celular.
5- Introducir en cada ci μ
Incubar 2-5 min, en funci
6- Pasar las células a una placa multiwell-24 (Falcon) con medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino
fetal + gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl.
Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.
7-
fetal + gentamicina 1:1000 +
autoclavada), impregnado en vaselina.
lindro 100 l tripsina-EDTA 1x, para despegar las células.
on del tipo celular.
Una vez pasados los clones, retirar los cilindros de plástico con unas pinzas y absorber el PBS 1x con
pipeta Pasteur de vidrio.
8- Añadir a la placa 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino
G418 500 μg/μl.
Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.
Los reactivos utilizados se detallan a continuación:
Soluc
P
8
hasta
Trips rcial de Tripsina-EDTA 10x y llevar a una concentración 1x con
PBS 1x.
iones:
BS 1x (Phosphate Buffered Saline): Disolver en 800 ml H Od: 2
0 g NaCl + 2 g KCl + 26´8 g Na HPO + 2´4 g H PO + ajustar el pH a 7´4 con HCl 1M + enrasar con H2 4 2 4 2Od
1L.
ina-EDTA 1x: partir de la solución come
71
III- Pacientes y Métodos
Cada uno de los clones se siembra por duplicado en la placa multiwell-24 y en uno de ellos se
coloca un cristal tratado con polilisina (1 μg/μl). Una vez crecidos los clones, se aislarán:
- por un lado, los cristales tratados con polilisina, para realizar la técnica de inmunocitoquímica y comprobar
eficiencia de transfección;
por otro lado, los extractos celulares y los medios condicionados, para detectar la proteína por Western
lot.
.4.3-
E s células se realizo sigiendo el protocolo que se describe a
ontinuac
Cuadro III.17a- Protocolo de inmunocitoquímica.
lución PBS-T 1x.
.4.4- WESTERN BLOT La Retinosquisina se detectó mediante SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel
electrophoresis) y Western Blot, en extractos celulares y medios condicionados.
la
-
B
2 INMUNOCITOQUÍMICA
l marcaje inmunofluorescente de la
c ión:
1- Fijar las células con paraformaldehído 4% (diluido en PBS 1x), 15 min.
Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 veces. 2-
3- -T 1x + 5% suero bovino fetal + 1% seroalbúmina bovina, 1h.
5- n. Repetir 2 veces.
7- es.
8- PBS 1x), 5 min⇒ Tiñe núcleos celulares.
9- Lavar con H2O y secar. Montar con Mowiol (medio de montaje) sobre un portaobjetos.
10- Las células m
Bloquear con solución de bloqueo: PBS
4- Añadir el anticuerpo 1io diluido 1:2000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).
Lavar con PBS-T 1x, 5 mi
6- Añadir el anticuerpo 2io diluido 1:2000, incubar 45 min (Alexa 488; Molecular Probes).
Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 vec
Incubar con Hoechst 1:1000 (diluido en
arcadas se detectaron mediante microscopía de fluorescencia (Leica).
Solución:
PBS-T 1x Phosphate Buffered Saline Tween : Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x. ( )
Cuadro III.17b- Preparación de la so
2
72
III- Pacientes y Métodos
L s de SDS-poliacrilamida se prepararon bajo las siguientes condiciones:
os gele
Le nd
Cuadro III.19a- Preparación previa de las muestras para SDS-PAGE.
Cuadro III.19b- Reactivos empleados en el aislamiento previo de las muestras para SDS-PAGE.
1- Región separadora del gel:
- 5 ml H O 2
- 6 ml acrilamida/bis-acrilamida (30% acrilamide/bis-acrilamide solution, 29’2:0’8; Biorad) ⇒
12% poliacrilamida
- 3’8 ml Tris 1’5M pH 8’8
- 0’15 ml SDS 10%
- 0’15 ml APS 10%
- 6 μl TEMED
se prepara la región concentradora del gel (stack):
0’5 ml acrilamida/bis-acrilamida
- 0’38 ml Tris 1’5M pH 6’8
2- Una vez solidificada,
- 2’1 ml H2O
-
- 30 μl SDS 10%
- 30 μl APS 10%
Cuadro III.18-
dico; TEMED, N, N, N’, N’ tetrametiletilendiamina.
Protocolo de elaboración de geles de SDS-poliacrilamida.
ye a: SDS, dodecil sulfato sódico; APS, persulfato só
Los medios y las células se aislaron de la siguiente manera:
1- Medios condicionados:
- Recoger el medio y pasa pm, 5 min.
- Recoger el sobrenadante y mantenerlo en hielo⇒ este paso elimina posibles restos celulares.
2- Extractos celulares
r a un tubo eppendorf 1´5 ml, centrifugar a 1000 r
:
- Una vez recogido el medio, añadir solución de lisis de proteínas e inhibidores de proteasas.
ener en hielo 20 min, dando un vórtex cada 5 min.
- Recoger el sobrenada onentes celulares que no
han sido lisados.
- Mant
- Centrifugar a 13000 rpm, 5 min, 4ºC.
nte y mantenerlo en hielo ⇒ este paso elimina los comp
Solución de lisis de proteínas: 1´5 ml NaCl 5M + 5 ml Nonidet P40 10x + 2´5 ml Tris pH8 + enrasar con PBS
rotease Inhibitor Cocktail
Tablets, Roche), llevar a 1x con la solución de lisis de proteínas.
1x hasta 50 ml.
Inhibidores de proteasas: A partir de la solución comercial 20x (“Complete” P
73
III- Pacientes y Métodos
Una vez aislados los medios condicionados y los extractos celulares, las muestras se
esnaturalizaron de la siguiente manera:
alización y reducción previa de las muestras para SDS-PAGE.
adro III.20b- Preparación del tampón de Laemmly.
La electroforesis se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
a
tran ontar la transferencia, los papeles de filtro
hatmann y la membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences) deben ser previamente
humedecid
d
1- En tubo eppendorf 1´5 ml, cargar 15 μl muestra + 15 μl Laemmly buffer 2x con β-mercaptoetanol (agente
reductor).
2- Hervir las mu a 100ºC, 5 min.
3- Centrifugar a 1 er en hielo mientras se carga el gel.
estras en termobloque
eg. Manten3000 rpm, 10 s
Cuadro III.20a- Desnatur
Reactivo
Laemml Tris-HCl 0´0125M + 2% SDS + 5% β-mercaptoetanol + 20%
glicerol + H 6´8.
:
y buffer 2x con β-mercaptoetanol:
0´001% azul de bromofenol; p
Cu
1- Cargar en el gel las muestras y 7 μl marcador de peso molecular (Precision Plus Protein dual color; Bio-
2- Realizar la electroforesis a 180 V, aproximadamente 1 hora o hasta que se hayan resuelto todas las
Rad).
Running Bufferbandas del marcador. El tampón de electroforesis utilizado fue 1x.
Cuadro III.21a- Condiciones de la SDS-PAGE.
So
Ru buffer): 144g glicina + 36´3g Tris + 10g SDS + enrasar hasta 1L
con
Ru
luciones tampón:
nning Buffer 10x (Laemmli electrolyte
H2Od.
nning Buffer 1x: A artir del Running Buffer p 10x, llevar a 1x con H2Od.
Cuadro III.21b- Tampones de la SDS-PAGE.
Una vez finalizada la electroforesis de proteínas, se sumerge el gel en tampón de transferenci
sfer buffer), para eliminar el exceso de SDS. Antes de m(
W
os en este tampón.
74
III- Pacientes y Métodos
La transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa se realizó bajo las
siguientes condiciones:
Cuadro III.22a- Protocolo de transferencia. Leyenda: mA, miliamperio.
s lavados posteriores.
A
1- En un cassette (Bio-Rad), montar la transferencia en el siguiente orden:
cátodo→ e sponja→ 2 papeles Whatmann→ gel→ membrana de nitrocelulosa→ 2 papeles Whatmann→
La electroforesis se realizó en Transfer Buffer 1x.
esponja→ ánodo.
2- Transferir a 300 mA, 45 min.
Soluciones:
Transffer Buffer: Running Buffer 1x+ metanol 20x.
TBS 1x (Tris Buffered Sali
6´05 g Tris+ 8´76 g NaCl + ajustar el pH a 7´5 con HCl 1M + enrasar con H2Od hasta 1L.
TBS-T 1x (Tris Buffered Saline Tween): Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x.
ne): Disolver en 800 ml H Od: 2
Cuadro III.22b- Tampones empleados en la transferencia y en lo
continuación, se realizó el Western blot, bajo las siguientes condiciones:
Cuadro III.23- Protocolo de Western Blot utilizado.
Leyenda: HRP, horse radish peroxidase (peroxidasa de rábano); enzima que cataliza la oxidación del luminol en
presencia de peróxido de hidrógeno.
1- En un Falcon 50, bloquear la membrana con sol ción de bloqueo: TBS-T 1x + 5% leche desnatada en
polvo. Incubar a tpa.amb., 1h, en agitación orbital.
rpo 1io diluido 1:5000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).
el anticuerpo 2io diluido 1:100000, incubar 45 min (PO conjugated AffinityPure goat α-mouse IgG;
5- Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora. Realizar un último lavado con PBS 1x.
6- Lavar la membrana con H2
7- Revelar con ECL (Enhanced Chemiluminiscence) Advance Western Blotting Detection Kit (Amersham);
incubar 5 min en oscuridad. Secar la membrana.
u
2- Añadir el anticue
3- Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora.
4- Añadir
Jackson Inmunoresearch Laboratories).
O y secar.
75
Córtex visual primario
Tracto ópticoCuerpo
geniculado lateral
Radiaciones ópticas
Esquema de la vía visual.
IV- Resultados
76
IV-Resultados
IV- RESULTADOS
1- GEN NDP
1.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
1.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio molecular directo del gen NDP fue realizado en un total de once familias (ver pág.36).
1.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES
Se identificó la mutación responsable en siete de las once familias estudiadas (7/11):
- cuatro mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (4/7): p.Arg38Cys
(identificada en dos familias distintas), p.Arg121Gln y p.Lys104Asn;
- una mutación que produce un codon de parada prematuro (1/7), originando una proteína de menor
tamaño de lo normal: p.Tyr120X;
- una deleción “de novo” de cinco nucleótidos, que altera la pauta de lectura y genera un codon de parada
prematuro, dando lugar a una proteína truncada (1/7): p.Val89fsX101;
- una mutación que afecta al sitio donador del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los
intrones) del intrón 1 del gen NDP (1/7): IVS1+1 G>A.
Familia Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido Localización
ANF-7 c.654_658delTGTCG p.Val89fsX101 Exón 3
ANF-8 c.776C>A p.Tyr120X Exón 3
XLDM-46 c.778G>A p.Arg121Gln Exón 3
ND-2 c.529C>T p.Arg38Cys Exón 2
ND-5 c.529C>T p.Arg38Cys Exón 2
ND-12 IVS1+1G>A Intrón 1
ND-14 c.728G>T p.Lys104Asn Exón 3
Tabla IV.1: Mutaciones identificadas en el gen NDP.
77
IV-Resultados
De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, tres son mutaciones nuevas, es decir, no
descritas previamente: p.V89fsX101, p.Tyr120X y p.Lys104Asn.
A B
C AsnLys
Figura IV.1: Mutaciones nuevas identificadas en el gen NDP. A) p.Val89fsX101; B) p.Tyr120X; C) p.Lys104Asn.
El cambio p.Tyr120X se confirmó mediante un ensayo de restricción, ya que esta mutación elimina
una diana reconocida por la endonucleasa de restricción Msp I.
1.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.
78
IV-Resultados
1.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
1.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El análisis de haplotipos se realizó en nueve de las once familias (9/11), debido a que en dos familias
(2/11) únicamente se estudió el caso índice (ver págs. 38-39). En uno de estos dos varones se identificó la
mutación responsable de enfermedad.
1.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS
Este análisis realizado en las nueve familias permitió descartar el gen NDP como causante de
enfermedad en una de ellas (1/9), ya que los haplotipos no cosegregaban con la patología ocular. En las
ocho familias restantes (8/9), los haplotipos obtenidos del análisis de los marcadores microsatélites sí
mostraron cosegregación con la enfermedad. En dos de estas familias (2/8) no se han identificado
mutaciones en NDP, mientras que en las seis restantes (6/8) fue posible encontrar el defecto genético.
11 Familias
· Con estudio familiar: 9
· Sin estudio familiar: 2
· Cosegregan: 8
· No cosegregan: 1 ⇒ NNDD--44..
· Mutación identificada: 6⇒ AANNFF--77, XXLLDDMM--4466, NNDD--22, NNDD--55, NNDD--1122, NNDD--1144.. (Ver Tabla IV.1)
· Sin mutación identificada: 2 ⇒ NNDD--11, NNDD--1100..
· Mutación identificada: 1⇒ AANNFF--88.. (Ver Tabla IV.1)
· Sin mutación identificada: 1 ⇒ NNDD--66..
Figura IV.2: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Norrie o Vitreorretinopatía
exudativa familiar.
1.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES
En dos de las familias estudiadas (ND-2 y ND-5) se observó que compartían la misma mutación
[p.Arg38Cys (c.529C>T)] y que además compartían el mismo haplotipo, lo que hizo sospechar que en ambas
familias existiese identidad por descendencia. Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete
marcadores microsatélite flanqueantes al locus NDP. Este estudio molecular mostró que la región de ADN
común en las dos familias comprendía 5,35 Mb y estaba situada entre los marcadores DXS1068 y DXS8080
(Figura IV.3).
79
IV-Resultados
80
NNDD--22
III:4
? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?
III:3
???????
IV:7
162255178154183175182
IV:8
162255178154183175182
IV:11
162255178154183175184
IV:10
? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?
III:1
???????
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:1
164255178154183175182
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:6
166 162259 255182 178158 154187 183173 175186 182
IV:5
???????
V:3
162255178154183175182
V:4
162255178154183175182
IV:4
166 162259 255182 178158 154187 183173 175186 182
IV:3
???????
V:1
166259182158187173186
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
V:2
166259182158187173186
III:2
162 160255 253178 176154 152187 183173 175182 180
II:1 II:4II:2 II:3
NNDD--55
Figura IV.3:
IV:132787
162255178154183175168
II:22762
160 162253 255176 178152 154174 174171 183166 168
II:32761
162255178154183175168
II:1
168249170156191175164
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
III:32765
162255178154183175168
III:92770
168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168
III:132773
168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168
III:8
???????
IV:62780
168249170156191175164
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:72781
168249170156191175164
III:122774
164253180152187173166
IV:92783
168249170156191175164
IV:102784
164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168
IV:112785
164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168
III:12763
162255178154183175168
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:122786
164 168253 249180 170152 156187 191173 175166 164
183 175 168
IV:132787
162255178154183175168
II:22762
160 162253 255176 178152 154174 174171 183166 168
II:32761
162255178154183175168
II:1
168249170156191175164
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
III:32765
162255178154183175168
III:92770
168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168
III:132773
168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168
III:8
???????
IV:62780
168249170156191175164
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:72781
168249170156191175164
III:122774
164253180152187173166
IV:92783
168249170156191175164
IV:102784
164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168
IV:112785
164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168
III:12763
162255178154183175168
DXS8090DXS1068DXS8012
DXS7MAOB
DXS8080DXS1003
IV:122786
164 168253 249180 170152 156187 191173 175166 164
183 175 168
171 175 166
IV-Resultados
Figura IV.3: Árboles genealógicos simplificados de las familias ND-2 y ND-5, respectivamente. El análisis de haplotipos
realizado con siete marcadores microsatélites (Cen-DXS1003-DXS8080-NDP-MAOB-DXS7-DXS8012-DXS1068-
DXS8090-Tel) confirmó que ambas familias compartían el mismo haplotipo (barra negra). Existen marcadores en las
familias que se desvían de la segregación (Familia ND-2, individuo IV:1, marcador DXS8090; Familias ND-2 y ND-5,
marcador DXS1003). En este análisis se muestra la región común del cromosoma X que comparten (haplotipo negro) y
que los marcadores distales y proximales no están ligados.
1.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
En los pacientes estudiados, las mutaciones identificadas en el gen NDP se asociaron a tres
fenotipos distintos:
- Enfermedad de Norrie (ND) que produce ceguera desde el nacimiento y, en algunos varones, sordera
neurosensorial y retraso mental;
- Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF) que cursa con vascularización incompleta de la retina, pero sin
alteraciones sistémicas;
- Persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV), que consiste en la aparición de una masa blanca entre
el disco óptico y el cristalino.
Familia Mutación Características retinianas Manisfestaciones extraoculares Fenotipo
ANF-7 p.V89fsX101 Microftalmia unilateral, cataratas. Sordera neurosensorial, retraso mental. ND
ANF-8 p.Tyr120X Microftalmia, cataratas, phthisis bulbi, opacidad corneal.
Sordera, bajo coeficiente intelectual. ND
XLDM-46 p.Arg121Gln Ceguera congénita, phthisis bulbi. No VREF
IV:1⇒ Afectación oftalmológica. No VREF
V:3⇒ Ceguera desde los 5 años. No PHPV ND-2 p.Arg38Cys V:4⇒ Ceguera desde los 2 años, buena
visión en su ojo derecho. No VREF
ND-5 p.Arg38Cys Afectación oftalmológica;
existe un varón asintomático con mutación (III:1).
No VREF
ND-12 IVS1+1G>A Afectación oftalmológica. Retraso mental. ND
ND-14 p.Lys104Asn Afectación oftalmológica. No VREF
Tabla IV.2: Familias con mutación identificada en el gen NDP y fenotipos asociados. En la familia ND-2, se destacan tres
varones con la misma mutación y fenotipos diferentes.
81
IV-Resultados
En la tabla anterior se observa que las distintas mutaciones se asocian a fenotipos diversos e incluso
existe variabilidad intrafamiliar, como se observa en la familia ND-2. El caso más representativo de
heterogeneidad clínica aparece en la familia ND-5, en la que se identificó un varón de 60 años con la
mutación p.Arg38Cys y que no había desarrollado ningún síntoma (Figura IV.3, Familia ND-5, individuo III.1)
Para confirmar esta situación, se extrajo una segunda muestra de sangre del sujeto y se obtuvo el mismo
resultado.
A B DC
pseudogliomas exudados
Figura IV.4: Imágenes del fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Norrie (ANF-7). En ellas se aprecian
pseudogliomas (A, B) y alteraciones en los vasos sanguíneos, que originan exudados cerca de la fóvea (C, D).
1.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES
Los datos familiares recogidos en la consulta y en el cuestionario (ver pág. 35) permiten conocer la
procedencia geográfica del linaje materno de los pacientes, por lo que se puede representar el origen
geográfico de las mutaciones identificadas.
Familia ANF-7 ANF-8 XLDM-46 ND-2 ND-5 ND-12 ND-14
Procedencia Ciudad Real Cuenca Barcelona Madrid Guadalajara Barcelona Arteixo (La Coruña)
82
IV-Resultados
pp..AArrgg112211GGllnn IIVVSS11++11GG>>AA
pp..LLyyss110044AAssnn
pp..AArrgg3388CCyyss
pp..AArrgg3388CCyyss
pp..TTyyrr112200XX
pp..VV8899ffssXX110011
Figura IV.5: Mapa de España en el que se representa el origen geográfico de las mutaciones identificadas en el gen
NDP. La mayor parte proceden del centro de la península, mientras que dos surgen en Barcelona y una en Galicia.
83
IV-Resultados
2- GEN RS1
2.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
2.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio molecular directo del gen RS1 fue realizado en un total de veintinueve familias (ver
pág.36).
2.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES En este estudio molecular se identificaron mutaciones en el gen RS1 en veinte familias (20/29), de
las cuales diecinueve son españolas y una es portuguesa:
- dieciocho mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (18/20):
p.Glu72Lys (identificada en tres familias españolas -en una de ellas se produce “de novo”- y en una
portuguesa), p.Tyr89Cys, p.Leu137Pro, p.Arg141Cys, p.Gln154Arg (identificada en cinco familias
distintas), p.Arg197Cys, p.Arg209His, p.Arg213Gln, p.Glu215Gln, p.Glu215Val y p.Leu216Pro.
- una mutación “de novo” que produce un codon de parada prematuro (1/13): p.Gln80X.
- una inserción de un nucleótido (1/13), que altera la pauta de lectura y genera una proteína anómala de
sesenta y nueve aminoácidos más larga de lo normal: p.His194fsX263.
Familia Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido Localización
XLRS-43*, 93, 104, 185 c.214G>A p.Glu72Lys Exón 4
XLRS-108* c.238C>T p.Gln80X Exón 4
XLRS-44 c.266A>G p.Tyr89Cys Exón 4
XLRS-102 c.410T>C p.Leu137Pro Exón 5
XLRS-95 c.421C>T p.Arg141Cys Exón 5
XLRS-30, 70, 97, 143, 161 c.461A>G p.Gln154Arg Exón 5
XLRS-124 c.579_580insC p.His194fsX263 Exón 6
XLRS-145 c.589C>T p.Arg197Cys Exón 6
XLRS-112 c.626G>A p.Arg209His Exón 6
XLRS-45 c.638G>A p.Arg213Gln Exón 6
XLRS-29 c.643G>C p.Glu215Gln Exón 6
XLRS-101 c.644A>T p.Glu215Val Exón 6
XLRS-107 c.647T>C p.Leu216Pro Exón 6
Tabla IV.3: Mutaciones identificadas en el gen RS1. Se identificaron un total de trece cambios diferentes en hemizigosis
en la región codificante del gen. *: Indica que la mutación se produce “de novo”.
84
IV-Resultados
De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, cuatro son mutaciones nuevas: p.Gln80X,
p.Leu137Pro, p.Gln154Arg y p.Glu215Val.
A B
DC
Q154R (A461G)
Figura IV.6: Mutaciones nuevas identificadas en el gen RS1. A) p.Gln80X; B) p.Leu137Pro; C) p.Gln154Arg;
D) p.Glu215Val.
La alteración más frecuente en nuestras familias fue el cambio p.Gln154Arg, que se identificó en
cinco de ellas (5/20). (Figura IV.5C). Para determinar que se trataba de un cambio patogénico y no de un
polimorfismo, se estudiaron setenta y seis cromosomas en individuos control mediante ensayo de restricción,
ya que la mutación genera una diana de restricción para la enzima Aci I. El análisis mostró que la mutación
no aparecía en ninguno de los controles. Asimismo, el análisis de haplotipos demostró que la mutación
segregaba en todos los individuos afectos pertenecientes a estas cinco familias, como se verá más adelante.
Mediante el estudio directo, se identificaron otras dos mutaciones nuevas que provocan cambio de
aminoácido, p.Leu137Pro y p.Glu215Val, localizadas en los exones 5 y 6 del gen RS1 respectivamente
(Figuras IV.5 B y D). Estas nuevas variantes alélicas no se encontraron en setenta y seis cromosomas
control analizados, ya que ambas alteraciones eliminan las dianas de restricción para las endonucleasas Eco
NI y Alu I, respectivamente.
El cambio p.Glu215Val se identificó en un varón afecto y también en su madre, por lo que se descarta que
este evento mutacional se haya producido “de novo” (Familia XLRS-101, ver pág. 41). Sin embargo, no se
pudo establecer el origen de la mutación p.Leu137Pro, ya que únicamente se estudió el caso índice (Familia
XLRS-102, ver pág. 41).
Por último, se identificó una mutación nueva que produce un codon de parada prematuro, originando
una proteína truncada: p.Gln80X (Figura IV.5A). Este cambio aparece en el varón pero no en su madre, lo
que sugiere que la alteración se haya producido “de novo”. (Familia XLRS-108, ver pág. 42).
85
IV-Resultados
2.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS
En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.
2.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
2.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio familiar se realizó en diecinueve de las veintinueve familias (19/29), debido a que en diez
familias (10/29) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 40, 41, 42). En seis de estos varones
estudiados (6/10) se identificó la mutación en RS1.
2.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS
En las diecinueve familias en las que se realizó el estudio familiar, fue posible descartar el gen RS1
como responsable en dos de ellas (2/19) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la
enfermedad. En las diecisiete familias restantes que mostraban cosegregación, se identificó el defecto
genético en catorce de ellas (14/17).
· Con estudio familiar: 19
· Sin estudio familiar: 10
· Cosegregan: 17
· No cosegregan: 2 ⇒ XXLLRRSS--5566, XXLLRRSS--111144.
· Mutación identificada: 14⇒ XXLLRRSS--2299, XXLLRRSS--3300, XXLLRRSS--4433, XXLLRRSS--4455, XXLLRRSS--7700, XXLLRRSS--9933, XXLLRRSS--9955, XXLLRRSS--9977, XXLLRRSS--110011, XXLLRRSS--110044, XXLLRRSS--110077, XXLLRRSS--110088, XXLLRRSS--112244, XXLLRRSS--118855. (Ver Tabla IV.3)
· Sin mutación identificada: 3 ⇒ OONNCCEE--6622, RRPP--113300bbiiss, RRPP--116622bbiiss.
· Mutación identificada: 6⇒ XXLLRRSS--4444, XXLLRRSS--110022, XXLLRRSS--111122, XXLLRRSS--114433, XXLLRRSS--114455, XXLLRRSS--116611. (Ver Tabla IV.3)
· Sin mutación identificada: 4 ⇒ XXLLRRSS--5533, XXLLRRSS--5555, XXLLRRSS--110033, XXLLRRSS--114444.
29 Familias
Figura IV.7: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Retinosquisis juvenil.
86
IV-Resultados
2.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES
En este estudio molecular, se han identificado dos mutaciones prevalentes: p.Gln154Arg y
p.Glu72Lys. El cambio más frecuente fue la nueva mutación p.Gln154Arg, que se identificó en cinco familias
(ver Tabla IV.3). Una vez realizado el estudio familiar, se observó que los pacientes pertenecientes a estas
familias compartían un haplotipo idéntico, sugiriendo identidad por descendencia.
Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete marcadores microsatélites a lo largo del
cromosoma X, flanqueantes al gen RS1. Este análisis permitió determinar que los pacientes compartían un
fragmento común de ADN de 3,27 Mb, localizado entre los marcadores DXS1053 y DXS999.
I:1 I:2
II:1
I:1 I:2
II 1
I:1 I:2
II:1
I:1 I:2
II:1
I:1 I:2
II:1
XXLLRRSS--116611 XXLLRRSS--114433 XXLLRRSS--3300 XXLLRRSS--9977 XXLLRRSS--7700
DXS8022 DXS1053 DXS8019 DXS9911 RS1 DXS999 DXS1226 DXS989
164 202 155 176 RS1 265 294 176
174 202 155 176 RS1 265 292 176
172 202 155 176 RS1 265 294 176
174 202 155 176 RS1 265 290 176
172 202 155 178 RS1 265 298 192
170 202 155 176 RS1 265 298 178
TEL
CEN
99/684
04/657
03/816 04/804 04/1522
Figura IV.8: Árboles genealógicos simplificados de las familias XLRS-30, XLRS-70, XLRS-97, XLRS-143 Y XLRS-161,
portadoras de la mutación p.Gln154Arg (c.461A>G) y análisis de haplotipos realizado con 7 marcadores microsatélites
(Tel-DXS8022-DXS1053-DXS8019-DXS9911-RS1-DXS999-DXS1226-DXS989-Cen). El estudio molecular confirmó que
los individuos portadores de la mutación p.Gln154Arg compartían una región común en el cromosoma X, localizada entre
los marcadores DXS1053 y DXS999.
La segunda mutación más frecuente fue el cambio p.Glu72Lys, que se identificó en cuatro familias
(ver Tabla IV.3). Sin embargo, estas familias no parecen estar relacionadas entre si, ya que presentaban
haplotipos diferentes (Figura IV.8).
87
IV-Resultados
88
Los datos oftalmológicos obtenidos de cada paciente, así como las mutaciones identificadas, se
recogen en la siguiente tabla (Tabla IV.4):
En los pacientes estudiados, se observaron manifestaciones clínicas similares, independientemente
del tipo de mutación identificada en el gen RS1. En general, presentan pérdida de la agudeza visual central,
amplitud reducida de la onda b en el ERG y fondo de ojo en el que se observan desgarros (en inglés schisis)
maculares y presencia de velos vítreos. Los pacientes de mayor edad (XLRS-44, XLRS-95) presentan
afectación macular más severa y atrofia del EPR (George ND et al., 1996).
2.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
Figura IV.9: Árboles genealógicos simplificados de las familias portadoras de la mutación p.Glu72Lys, construidos con 3
marcadores microsatélites (Tel- DXS9911-RS1-DXS999- DXS989-Cen). En este caso, se descarta un posible efecto
fundador, ya que los varones afectos presentan haplotipos distintos entre si.
II:202/46
178 178272 274180 182
II:1
???
III:101/508
178274182
III:202/47
178274182
I:102/596
?
I:202/595? ?
XXLLRRSS--4433
XXLLRRSS--110044
II:2
???
II:304/1280
182 178256 272186 176
III:203/986
182256186
I:1
???
I:2
? ?? ?? ?
II:504/1279
182 178256 272186 176
II:4
???
III:404/803
182256186
III:304/1277
176 178264 272176 176
II:6
???
III:5
???
III:604/1276
178 182256 256192 186
III:104/1278
178 178272 272168 176
II:104/1281
182 178256 272186 176
II:704/1275
182 178256 272186 176
XXLLRRSS--118855
I:105/1219
176259186
I:205/1220
182 180273 273176 184
II:105/1221
182273176
XXLLRRSS--9933
I:103/544
176272176
I:203/545
176 178256 264178 176
II:103/532
176 178272 264176 176
II:203/533
176 176272 256176 178
II:303/546
176256178
89
Mutación Familia Edad de inicio
Edad actual Fondo de ojo Apariencia del
vítreo ERG Complicaciones
p.Glu72Lys XLRS-43 4 meses 8 años Desprendimiento de retina, microquistes periféricos. Normal Reducido Estrabismo congénito,
leves anomalías vasculares.
p.Glu72Lys XLRS-93 12 años 34 años Microquistes maculares, squisis periférica. Velos vítreos Estrabismo y ambliopía, AV: 20/100.
p.Glu72Lys XLRS-104 8 años 17 años Squisis macular y periférica, quistes maculares. Velos vítreos ↓ amplitud onda b AV: 10-20/100
p.Gln80X XLRS-108 7 años No disponible.
p.Tyr89Cys XLRS-44 10 años 52 años Atrofia macular del EPR, papilas pálidas. Velos vítreos Onda b no registrable Cataratas, AV: 10/100, escotomas absolutos.
p.Leu137Pro
XLRS-102 6 años 22 años Squisis macular y periférica, quistes
maculares. Normal Onda b no registrable Hemorragias del vítreo, AV: 20-32/100.
p.Arg141Cys XLRS-95 4-5 años 40 años Atrofia macular del EPR, atrofia coriorretiniana.
Degeneración vitreorretiniana tipo Goldmann-Favre
Sin respuesta Catarata incipiente, no perfusión de los capilares), AV: 10/100.
p.Gln154Arg XLRS-30 18 meses 22 años Desprendimiento de retina, mácula con grandes agujeros. Normal Hemorragia del vítreo
p.Gln154Arg XLRS-70 1 año 3 años Desdoblamiento de las capas retinianas,
degeneración macular microquística. Velos vítreos ↓ amplitud onda b Endotropía e hipermetropía.
p.Gln154Arg XLRS-97 6 meses 4 años Desprendimiento de retina, squisis macular. Normal ↓ amplitud onda b Hemorragia vitreorretiniana, estrabismo.
p.Gln154Arg XLRS-143 2 años 7 años Squisis macular y periférica. Normal ↓ amplitud onda b AV: 20-30/100
p.Gln154Arg XLRS-161 1 año 3 años Squisis macular Normal ↓ amplitud onda b
p.His194fsX263 XLRS-124 7-8 años 15 años Squisis macular Normal Alterado Pérdida de visión, fotofobia y discromatopsia.
p.Arg197Cys XLRS-145 3 años 25 años Squisis macular. Normal ↓ amplitud onda b AV: 40-50/100
p.Arg209His XLRS-112 Congénito 34 años RS desde la infancia. Persistencia de vítreo primitivo. Cataratas congénitas, AV: 2-5/100.
p.Arg213Gln XLRS-45 7 años 18 años Squisis macular y periférica. Normal ↓ amplitud onda b Nictalopia, AV: 10/100.
p.Glu215Gln XLRS-29 5 años 21 años Microquistes en máculas. Normal Onda b no registrable Nictalopia, fotofobia, escotomas relativos, hemorragia del vítreo,
AV: 10-20/100.
p.Glu215Val XLRS-101 2 años 23 años Lesión macular bilateral. Normal Abolido Estrabismo nictalopia, fotofobia, ambliopía, AV: 30-40/100.
p.Leu216Pro XLRS-107 13 años 26 años Squisis macular. Velos vítreos ↓ amplitud onda b AV: 20-30/100.
IV-Resultados
En la tabla anterior, se observa que los pacientes presentan alteraciones semejantes en el fondo de
ojo, con complicaciones clínicas que difieren entre si. La edad de comienzo de la enfermedad es variable,
aunque suele producirse en la infancia temprana o incluso ser congénita.
Figura IV.10: A) Fondo de ojo de paciente con RS (XLRS-45), de 17 años, en la que se observan grandes velos vítreos
(flechas negras). B) TCO del paciente de la familia XLRS-104, de 16 años, en la que se aprecian quistes a nivel macular
(flechas blancas). C) Fondo de ojo y D) AGF del paciente de la familia XLRS-95, de 40 años de edad. En estadíos más
avanzados de enfermedad, se produce atrofia del EPR (flecha negra) y acúmulo de gran cantidad de pigmento (flecha
blanca).
Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer afecta, portadora de la mutación
p.Glu215Gln: presentaba ERG abolido, tanto el escotópico como el fotópico, y escotoma absoluto. Otras dos
mujeres de la misma familia mostraban el ERG reducido, pero eran asintomáticas.
Figura IV.11: Árbol genealógico de la familia XLRS-29. La flecha roja muestra a la mujer portadora de la mutación
p.Glu215Gln, que es afecta. Las mujeres señaladas con flechas azules, también portadoras de mutación, presentan
alterado el ERG pero mantienen una buena visión.
I:2
? ?? ?? ?
II:2
? ?? ?? ?
II:4
? ?? ?? ?
II:1
???
III:696/526
177 179275 273173 179
III:896/524
177 179275 273173 179
III:296/765
177 179275 273173 169
III:397/61
177 179275 258173 179
III:196/548
179273179
IV:196/549
179 179273 273179 169
IV:296/550
179 177273 275179 173
IV:396/417
179273169
III:4
(177)(262)(179)
IV:497/60
177275173
IV:597/59
177275173
IV:697/81
179258179
IV:797/82
177 179262 258179 179
III:596/558
181258193
IV:896/523
181 179258 273193 179
IV:996/528
181 179258 273193 179
IV:1096/551
177275173
III:7
???
IV:1196/527
177275173
IV:1296/525
177275173
II:3
???
III:996/552
179273169
III:1296/553
179 181258 272179 181
III:10
? ?? ?? ?
IV:1396/709
179 177273 258169 177
IV:1496/708
???
III:11
???
IV:1696/555
179258179
IV:1796/556
181272181
I:1
???
IV:1596/554
179258179
AA CCBB DD
90
IV-Resultados
2.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES
En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de las madres de los pacientes, por lo
que se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.
Familia XLRS-29 XLRS-30 XLRS-43 XLRS-44 XLRS-45 XLRS-70 XLRS-93
Procedencia Toledo Oviedo Madrid Málaga Córdoba Ayamonte (Huelva) Madrid
Familia XLRS-95 XLRS-97 XLRS-101 XLRS-102 XLRS-104 XLRS-107 XLRS-108
Procedencia Valencia Bilbao Murcia Barcelona Segades (Valladolid) Zaragoza Barcelona
Familia XLRS-112 XLRS-124 XLRS-143 XLRS-145 XLRS-161 XLRS-185
Procedencia Cuenca Madrid Sta. Cruz Tenerife
Sta. Cruz Tenerife Sevilla Lisboa
(Portugal)
pp..GGlluu221155GGllnn
pp..GGllnn115544AArrgg
pp..GGlluu7722LLyyss ((22))
pp..TTyyrr8899CCyyss
pp..AArrgg221133GGllnn
pp..AArrgg114411CCyyss
pp..GGllnn115544AArrgg
pp..GGlluu221155VVaall
pp..LLeeuu113377PPrroo pp..GGlluu7722LLyyss
pp..LLeeuu221166PPrroo pp..GGllnn8800XX
pp..AArrgg220099HHiiss
pp..HHiiss119944ffssXX226633
pp..GGllnn115544AArrgg pp..AArrgg119977CCyyss
pp..GGllnn115544AArrgg
pp..GGlluu7722LLyyss
pp..GGllnn115544AArrgg
Figura IV.12: Mapa de la Península Ibérica en el que se representa el origen geográfico de las alteraciones identificadas
en el gen RS1. La distribución de las mutaciones es homogénea, con cierta agregación en el centro y en el sur de
España, así como en el archipiélago canario.
91
IV-Resultados
2.5- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN
2.5.1- LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LA RETINOSQUISINA
Una vez realizada la técnica de inmunocitoquímica, la proteína se detectó en las células mediante
microscopía de fluorescencia confocal:
AA BB CC
Figura IV.13: Imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, en células HEK 293 transfectadas con el plásmido
RS1-c-Myc-c-His. A) Imagen de una región de la preparación a 60x.
B) Imagen de dos células de la preparación anterior, obtenida con el objetivo 60x y ampliada con zoom.
C) Imagen de otra región de la preparación en la que se muestran los núcleos contrateñidos con Hoechst (azules).
Las imágenes anteriores muestran que la Retinosquisina se localiza en el citoplasma celular. Sin
embargo, no se detecta en el medio de la preparación, cuando se trata de una proteína secretable. Este
hecho sugiere que la proteína se secreta en muy baja proporción y mediante una transfección transitoria (se
realiza la técnica de inmunohistoquímica a las 72 horas de la transfección) no se detecta. Por ello, se
seleccionaron líneas celulares estables que expresan esta proteína en mayor proporción (ver pág.70).
2.5.2- DETECCIÓN DE LA RETINOSQUISINA MEDIANTE WESTERN BLOT A continuación se muestran las imágenes obtenidas por autorradiografía de los geles SDS-PAGE,
tanto en transfecciones transitorias como en líneas celulares estables:
92
IV-Resultados
Figura IV.14: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP
(control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo). La línea celular utilizada fue HEK 293.
Leyenda: M, marcador de peso molecular.
En la autorradografía del gel, se observa que la Retinosquisina aparece en los extractos celulares, al
igual que en la inmunocitoquímica, pero no se secreta al medio cuando se obtiene mediante transfección
transitoria. Sin embargo, la proteína secretable codificada por el gen SFRP se detectó en los medios
condicionados (Figura IV.14; carril MC SFRP, tamaño 37 kDa).
Al seleccionar líneas estables, fue posible detectar la proteína codifica por RS1 (tamaño 25 kDa), tanto en los
EC como en los MC. Se observan diferencias en la secreción entre los distintos clones:
Figura IV.15: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP
(control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo) líneas MDCK estables.
93
IV-Resultados
3- GEN ABCA4
3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
3.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio molecular directo del gen ABCA4 fue realizado en un total de ciento veintinueve familias
(ver pág.36).
3.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES El estudio molecular del gen ABCA4 realizado con el microarray de genotipado, permitió identificar
pacientes con dos alelos mutantes, con un alelo mutante y sin alelos mutantes. Debido al elevado número de
familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.
a) Enfermedad de Stargardt (STGD)
Se estudiaron un total de setenta y cuatro familias con STGD, entre las cuales se identificaron:
- veintinueve familias con dos alelos mutantes,
- veintitrés familias con un alelo mutante,
- veintidós familias en las que no se identificaron mutaciones.
0
5
10
15
20
25
30
2 alelosmutantes
1 alelo mutante 0 alelosmutantes
Familias con Enfermedad de Stargardt
Nº familias
Figura IV.16: Familias STGD clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.
Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes
tablas:
94
IV-Resultados
Familias con dos alelos mutantes
Alelo 1 Alelo 2 Familia
Exón Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
5 c.455G>A p.Arg152Gln 5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-141
46 c.6320G>A p.Arg2107His 46 c.6320G>A p.Arg2107His 17 c.2588G>C p.Gly863Ala
ARDM-151
21 c.3163C>T p.Arg1055Trp 19 c.2888 del G p.Gly963fs
5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-17 46 c.6320G>A p.Arg2107His
46 c.6320G>C p.Arg2107Pro
ARDM-22 19 c.2888 del G p.Gly963fs 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg ARDM-31 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 35 c.4926C>G p.Ser1642Arg ARDM-47 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-57 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-60 13 c.1804C>T p.Arg602Trp 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-61 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-62 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-64 6 c.634C>T p.Arg212Cys 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-66 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 41 c.5819T>C p.Leu1940Pro ARDM-72 5 c.466A>G p.Ile156Val 13 c.1804C>T p.Arg602Trp
ARDM-76 6 c.768G>T p.= o altera el procesamiento (*) 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu
ARDM-82 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3364G>A p.Glu1122Lys ARDM-88 28 c.4139C>T p.Pro1380Leu - IVS40+5 G>A
28 c.4222T>C p.Trp1408Arg ARDM-96 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu
35 c.4918C>T p.Arg1640Trp 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys
ARDM-110 46 c.6320G>A p.Arg2107His
42 c.5882G>A p.Gly1961Glu
ARDM-111 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys
ARDM-116 46 c.6320G>A p.Arg2107His
30 c.4469G>A p.Cys1490Tyr
ARDM-119 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-128 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu
5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-137 46 c.6320G>A p.Arg2107His
- IVS40+5 G>A
17 c.2588G>C p.Gly863Ala ARDM-138
19 c.2828G>A p.Arg943Gln 30 c.4537insC p.Gln1513fs
5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-139 46 c.6320G>A p.Arg2107His
23 c.3386G>T p.Arg1129Leu
95
IV-Resultados
Alelo 1 Alelo 2 Familia
Exón Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
ARDM-153 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs 42 c.5881G>A p.Gly1961Arg ARDM-155 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 13 c.1804C>T p.Arg602Trp ARDM-168 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg ARDM-170 9 c.122C>T p.Arg408X 30 c.4457C>T p.Pro1486Leu
Tabla IV.5: Familias STGD en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4. 1: Indica que estas familias se analizaron previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).
Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (*) p.Val256Val).
Familias con un alelo mutante
Alelo 1 Alelo 2 Familia
Exón Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
25 c.3758C>T p.Thr1253Met ARDM-121
42 c.5882G>A p.Gly1961Glu
ARDM-161 38 c.5395A>G p.Asn1799Asp ARDM-38 13 c.1804C>T p.Arg602Trp ARDM-39 - IVS40+5 G>A ARDM-40 21 c.3056C>T p.Thr1019Met ARDM-63 18 c.2690C>T p.Thr897Ile ARDM-65 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-75 48 c.6721C>G p.Leu2241Val ARDM-78 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-81 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-90 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-91 19 c.2791G>A p.Val931Met
ARDM-125 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-131 18 c.2701A>G p.Thr901Ala ARDM-135 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-146 21 c.3056C>T p.Thr1019Met ARDM-158 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-162 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-163 30 c.4457C>T p.Pro1486Leu ARDM-164 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-165 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-167 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs SRP-773 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu
Tabla IV.6: Familias STGD en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).
96
IV-Resultados
Todas las mutaciones identificadas por el microarray se comprobaron mediante secuenciación
automática. Únicamente se identificaron dos posibles fallos de detección:
- un falso positivo en la familia ARDM-153, debido a que el cambio de nucleótido se producía en la posición
c.5881 G>A (p.Gly1961Arg) en lugar de la posición c.5882 G>A (p.Gly1961Glu) detectada por el chip, es
decir, el el nucleótido anterior (ver Tabla IV.5).
BA B C
Figura IV.17: Secuencias del exón 42 del gen ABCA4. A) Secuencia silvestre;
B) Secuencia con la mutación p.Gly1961Arg; C) Secuencia con la mutación p.Gly1961Glu.
- un falso negativo en la familia ARDM-81, en la que no se detectó la mutación c.4297G>A (p.Val1433Ile),
como se verá más adelante.
A partir de los resultados obtenidos de nuestras familias, calculamos la frecuencia de detección del
microarray en nuestros pacientes STGD, para compararla con los porcentajes de detección obtenidos
habitualmente en otras poblaciones europeas y americanas:
(29 familias x 2 alelos mutantes) + (23 familias x 1 alelo mutante)
x 100 = 54,7%.
148 alelos totales
97
IV-Resultados
Con el fin de testar la eficiencia del microarray en nuestros pacientes STGD, se seleccionaron nueve
pacientes en los que sólo se había identificado uno de los alelos mutantes y se secuenciaron los cincuenta
exones del gen ABCA4. Se identificó el segundo alelo mutante en seis de ellos y se identificaron cinco
mutaciones nuevas:
- una mutación “de novo” en la que se produce un cambio de aminoácido en la proteína: p.Val1433Ile;
esta mutación está descrita y se encuentra incluida entre las cuatrocientas treinta y ocho variantes
alélicas detectadas por el microarray. El hecho de que no se hubiese detectado puede deberse a un
falso negativo del chip.
- tres mutaciones en las que se produce un codon de parada prematuro: p.Gln1315X (identificada en dos
familias, en una de ellas se produce “de novo”): p.Gln2187X.
- una inserción de un nucleótido, que altera la pauta de lectura, genera un codon de parada prematuro y,
en consecuencia, una proteína truncada: c.4739 del T.
- una mutación que afecta al sitio aceptor del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los
intrones) del intrón 22 del gen ABCA4: IVS22-2 A>T.
Alelo 1 Alelo 2 Familia
Exón Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
25 c.3758C>T p.Thr1253Met ARDM-121
42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 27 c.3943C>T p.Gln1315X
ARDM-38 13 c.1804C>T p.Arg602Trp 33 c.4739 del T Leu1580fs ARDM-39 - IVS40+5 G>A No detectado ARDM-40 21 c.3056C>T p.Thr1019Met 27 c.3943C>T p.Gln1315X * ARDM-63 18 c.2690C>T p.Thr897Ile No detectado
No detectado ARDM-65 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-78 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 48 c.6559C>T p.Gln2187X ARDM-81 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 29 c.4297G>A p.Val1433Ile * ARDM-90 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser - IVS22 -2A>T
Tabla IV.7: Mutaciones identificadas en el gen ABCA4 por secuenciación automática.
*: Indica que la mutación se produce “de novo”. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).
98
IV-Resultados
A B
Figura IV.18: Mutaciones nuevas detectadas en el gen ABCA4. A) p.Gln1315X (c.3943C>T); B) Leu1580fs (4739 del T);
C) Q2187X (c.6559C>T); D) IVS22-2 A>T.
Los tres pacientes anteriores en los que no se identificó el segundo alelo responsable de
enfermedad, se analizaron con la técnica MLPA, para detectar posibles pérdidas o ganancias de material
genético que incluyesen regiones exónicas completas, en las que pudiesen existir mutaciones que no serían
detectadas por secuenciación automática. Mediante este estudio, se observó que los pacientes no
presentaban deleciones ni inserciones de ninguna de las cuarenta y ocho sondas que hibridan
específicamente con cuarenta y ocho exones del gen ABCA4.
Por tanto, la tasa de detección total (microarray+secuenciación+MLPA) de alelos mutantes es la siguiente:
(35 familias x 2 alelos mutantes) + (17 familias x 1 alelo mutante)
x 100 = 58,8%.
148 alelos totales
Asimismo, se amplió el estudio mutacional a los familiares del paciente mediante secuenciación de
las regiones del gen ABCA4 en las que previamente se han identificado mutaciones mediante el microarray
de genotipado.
C DExón 23
99
IV-Resultados
En la familia ARDM-61 (ver pág. 43), se identificó en la paciente la mutación p.Arg1129Leu en
homozigosis (ver Tabla IV.5). No se identificaron otras alteraciones patogénicas, a excepción de dos
polimorfismos en homozigosis (p.His423Arg, IVS33+48 C>T). Al ampliar el estudio familiar, se observó que
únicamente su padre era portador de un alelo mutante mientras que su madre presentaba alelos silvestres
en ambas copias del gen (Figura IV.19 A, B). Con el fin de determinar si esta segregación se había producido
por disomía uniparental paterna o por microdeleción del cromosoma 1 materno, se realizó la técnica MLPA
que permite detectar pérdidas (o ganancias) de material genético. El resultado de este análisis molecular
permitió establecer que la paciente presentaba ambas copias del gen ABCA4, descartando una posible
deleción del alelo materno (Figura IV.19 C). Estudios posteriores demostraron que esta segregación era
debida a una isodisomía parcial paterna, como se verá más adelante.
02/724 02/726 02/725
LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee ↓↓ LLeeuu
CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC ↓↓ TT
LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee
CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC
LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee ↓↓ LLeeuu
CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC ↓↓ TT
B
C
02/725
Control
A
II:2
III:102/723
II:102/721
II:302/722
I:102/724
II:402/725
I:202/726
Figura IV.19: A) Árbol genealógico de la familia ARDM-61. B) Secuencias de la paciente (mutación p.Arg1129Leu en
homozigosis), de su padre (portador del cambio p.Arg1129Leu) y de su madre (no portadora), respectivamente. C)
Electroferogramas del MLPA realizado en la paciente y en un control sano (los picos sombreados representan las sondas
que hibridan con los exones de ABCA4, los picos normales son sondas sintéticas). Cada sonda presenta un patrón de
amplificación normal, que sugiere que existe una dosis normal en ambas copias del gen ABCA4. Por tanto, se descarta la
posibilidad de microdeleción materna.
100
IV-Resultados
b) Distrofia de conos y bastones (DCB)
Se estudiaron un total de veintiocho familias con DCB, entre las cuales se identificaron:
- seis familias con dos alelos mutantes,
- cuatro familias con un alelo mutante,
- dieciocho familias en las que no se identificaron mutaciones.
0
5
10
15
20
25
30
2 alelosmutantes
1 alelomutante
0 alelosmutantes
Familias con Distrofia de Conos y Bastones
Nº familias
Figura IV.20: Familias DCB clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.
Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes
tablas:
Familias con dos alelos mutantes
Alelo 1 Alelo 2 Familia Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Exón
ARDM-79 19 c.2888delG p.Gly963fs 19 c.2888delG p.Gly963fs ARDM-86 19 c.2888delG p.Gly963fs 19 c.2888delG p.Gly963fs
ARDM-126 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-133 1 c.32T>C p.Leu11Pro 19 c.2888 del G p.Gly963fs ARDM-176 19 c.2888delG p.Gly963fs 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg
RP-267 36 c.5041_5055del p.Val1681_Cys1685del 36 c.5041_5055del p.Val1681_Cys1685del
Tabla IV.8: Familias DCB en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4.
101
IV-Resultados
Familias con un alelo mutante
Alelo 1 Alelo 2 Familia Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Exón
ARDM-99 29 c.4297G>A p.Val1433Ile ARDM-174 35 c.4918C>T p.Arg1640Trp
RP-577 9 c.1140T>A p.Asn380Lys RP-959 5 c.466A>G p.Ile156Val
Tabla IV.9: Familias DCB en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.
El cambio c.2888delG fue el alelo mutante más frecuente entre los pacientes DCB. Se identificaron
dos pacientes con esta alteración en homozigosis (ARDM-79 y ARDM-86) y otros dos pacientes en los que la
mutación forma un heterozigoto compuesto (ver Tabla IV.8). En la paciente de la familia ARDM-79, el
diagnóstico clínico cambió de STGD (a los 10 años de edad) a DCB (a los 26 años), durante la realización de
este estudio. Esta mujer presentó inicialmente hallazgos oftalmológicos compatibles con STGD (palidez
papilar, maculopatía inespecífica con puntos de pigmento que confieren un aspecto grisáceo, campo visual
con escotoma paracentral, vasos retinianos ligeramente atenuados y discromatopsia). En una segunda
exploración realizada a los veintiséis años de edad, la paciente mostró ERG abolido (fotópico y escotópico),
reducción del campo visual periférico (prácticamente escotoma absoluto), afinamiento de los vasos retinianos
y pigmento en forma de espículas óseas, consistente con un diagnóstico de DCB.
Las mutaciones identificadas por el microarray se confirmaron mediante secuenciación automática,
siendo correctas en todos los casos. Asimismo, en el paciente perteneciente a la familia ARDM-99, en el que
únicamente se había identificado un alelo responsable de enfermedad, se analizaron los cincuenta exones
del gen ABCA4 mediante secuenciación. En este caso, no se detectó el segundo alelo mutante.
Este paciente también se analizó mediante MLPA, sin que se identificasen alteraciones en las sondas que
pudiesen sugerir pérdidas o ganancias de material genético.
102
IV-Resultados
c) Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR)
Se estudiaron un total de diecisiete familias con RPAR, entre las cuales se identificaron:
- cuatro familias con un alelo mutante,
- trece familias en las que no se identificaron mutaciones,
- no se identificó ninguna familia que fuese portadora de mutaciones en ambos alelos de ABCA4.
0
5
10
15
20
25
30
2 alelosmutantes
1 alelomutante
0 alelosmutantes
Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva
Nº familias
Figura IV.21: Familias RPAR clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.
Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla:
Alelo 1 Alelo 2 Familia Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Exón
ARRP-700 42 c.5843CA>TG p.Pro1948Leu SRP-766 15 c.2300T>A p.Val767Asp SRP-775 5 c.466A>G p.Ile156Val SRP-834 - IVS40+5 G>A
Tabla IV.10: Familias RPAR en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.
Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con
los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.
103
IV-Resultados
d) Fenotipo diverso
Se estudiaron un total de tres familias en las que aparecen afectos con distintas distrofias de retina,
entre las cuales se identificaron:
- una familia en la que se identificó un afecto de STGD con dos alelos mutantes,
- dos familias en las que se identificaron sendos afectos con un único alelo mutante.
0
5
10
15
20
25
30
2 alelosmutantes
1 alelomutante
0 alelosmutantes
Familias con fenotipo diverso
Nº familias
Figura IV.22: Familias con afectos que presentan distintos fenotipos clasificadas en función de los alelos mutantes
identificados.
Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias, así como el fenotipo exhibido,
se recogen en las siguientes tablas:
Familias con dos alelos mutantes
Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Fenotipo Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Exón
RP-2801 ⇒ 95/93 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp STGD
RP-280 ⇒ 95/96 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp RP precoz
Tabla IV.11: Familia con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en las que se han identificado ambos
alelos mutantes en ABCA4. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).
104
IV-Resultados
p.Asn1805Asp
I:195/91
I:295/92
II:195/93
II:295/94
II:395/95
II:495/96
p.Asn1805Asp P,Asn1805Asp
p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp
SSTTGGDD RRPP pprreeccoozz
Figura IV.23: Árbol genealógico de la familia RP-280 en la que muestra la segregación de los alelos mutantes en ABCA4
y los respectivos fenotipos.
En una mujer afecta de esta familia (II:4), portadora de un único alelo mutante en ABCA4, se
identificó un alelo mutante en el gen CRB1 (Human Crumbs Homologue 1), implicado en la Amaurosis
Congénita de Leber (LCA) y RP precoz (E.Vallespin et al., 2005). Esta mujer presenta un fondo de ojo típico
de RP con preservación del epitelio paraarteriolar, mientras que su hermano afecto, portador de la mutación
p.Asn1805Asp en homozigosis, manifiesta un fenotipo típico de Enfermedad de Stargardt.
Como se observa en la Figura IV.20, los alelos mutantes identificados en ABCA4 cosegregan con la
enfermedad en el probandus (II:1), pero no en su hermana. El análisis de haplotipos confirmó esta
segregación, como se verá más adelante.
Familias con un alelo mutante
Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Fenotipo Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido Exón Exón
RP-315 ⇒ 95/397 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu DCB
RP-315 ⇒ 95/398 DM Best
RP-315 ⇒ 95/399 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu FFM
RP-532 ⇒ 99/115 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu STGD
RP-532 ⇒ 99/114 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB
RP-532 ⇒ 99/146 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB
Tabla IV.12: Familias con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en los que se ha identificado un alelo
mutante en ABCA4. Leyenda: DM: Distrofia macular de Best; FFM: Fundus flavimaculatus.
105
IV-Resultados
B
I:295/397
I:1
II:195/398
II:295/399
p.Gly1961Glu
p.Gly1961Glu
FFFFMM
DDCCBB
DDMM BBeesstt
A
I:199/117
I:299/116
315. B) Familia RP-532.
lelos mutantes en ABCA4 y los respectivos fenotipos.
madre afecta (I:2) presenta un fenotipo de DCB, mientras
24), que es una manifestación menos severa que
fondo de ojo que concuerda con distrofia macular de
cada por mutaciones en el gen VMD2 -Vitelliform
En la familia RP-532 isma segregación del alelo
ermano (II:2) muestra un fenotipo STGD.
Figura IV.24: A) Familia RP-
En ambos árboles genealógicos se muestra la segregación de los a
En la familia RP-315, se observa que la
que su hijo afecto (II:2) muestra un fenotipo FFM (ver pág.
la STGD. Como caso peculiar, la hija (II:1) presenta un
Best (distrofia macular juvenil, autosómica dominante, provo
Macula Dystrophy Gene 2-).
, los tres hermanos afectos presentan la m
p.Arg1129Leu. Sin embargo, ambas hermanas (II:1, II:3) presentan un fenotipo DCB mientras que el
h
Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con
los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.
II:299/115
II:199/114
II:399/146
P,Arg1129Leu
DDCCBB
SSTTGGDD p.Arg1129Leu
DDCCBB
p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu
106
IV-Resultados
e) Distr
, entre las cuales se identificaron:
dos familias con un alelo mutante; en una de ellas (ADDM-92) se identificó una paciente afecta de distrofia
acular, compatible con STGD, en la que se detectaron ambos alelos mutantes en ABCA4.
- cinco familias en las que no se identificaron mutaciones,
ofia Macular Autosómica Dominante (ADDM)
Se estudiaron un total de siete familias con ADDM
-
m
0
5
10
15
20
25
30
2 alelosmutantes
1 alelomutante
0 alelosmutantes
Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante
Nº familias
Figura IV.25: Familias ADDM clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.
Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla:
Familias con un alelo mutante
Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido Exón Cambio de
nucleótido Cambio de aminoácido
Fenotipo
ADDM-59⇒ 02/468 42 c.5582G>A p.Gly1961Glu DM
ADDM-92 ⇒ 03/397 5 c.466A>G p.Ile156Val DM
ADDM-92 ⇒
03/456 5 c.514G>A p.Gly172Ser 45 c.6148G>T p.Val2050Leu STGD
ADDM-92 ⇒ 03/691 18 c.2690C>T p.Thr897Ile
Tabla IV.13: Familias ADDM en las que se han identificado alelos mutantes en ABCA4.
Leyenda: DM: Distrofia macular.
107
IV-Resultados
En la familia ADDM-92 se realizó un estudio con el microarray en individuos afectos (III:5, IV:2, IV:3)
y en alg los mutantes en
a afecta
ojo de esta paciente es compatible con STGD.
Figu ealóg a ADDM-9 la que se muestra la segregación de los alelos mutantes en
AB ectivo notip
Las mutaciones identificadas en n por secuenciación, coincidiendo con
los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.
unos miembros sanos (II:2, III:4, III:6), mediante el cual se identificaron diversos ale
ABCA4, como se indica en la Figura IV:23 (en la Tabla IV.13 únicamente se recogen los familiares que
presentan diferentes alelos entre sí). La ampliación del estudio familiar permitió identificar a una prim
(IV:3) con mutaciones en ambos alelos del gen. El fondo de
ra IV.26: Árbol gen ico de la famili 2 en
CA4 y los resp s fe os.
estas familias se comprobaro
II:1 II:203/446
I:1
III:203/398
III:1
II:3
IV:203/397
III:503/690
III:403/455
IV:1
V:1/18306
III:603/691
III:3
IV:303/456
p.Ile156Val
DDMM
DDMM
p.Ile156Val
p.Ile156Val
p.Val2050Leu p.Thr897Ile
SSTTGGDD
p.Val2050Leu p.Ile156Val p.Gly172Ser
108
IV-Resultados
109
En la siguiente gráfica se comparan los alelos mutantes identificados en los distintos fenotipos, en la
que se aprecia que la patología en la que se detecta un mayor número de alelos mutantes es en la STGD.
En las restantes retinopatías, el mayor porcentaje lo representa la no detección de mutaciones.
0STGD DCB RPAR Otr
5
10
15
20
25
30
35
40
os
2 alelos mutantes1 alelo mutante0 alelos mutantes
Figura IV.27 pos asociados a mutaciones en el gen ABCA4 y
os en cada uno de ellos.
Leye 15, RP-532, ADDM-59 y ADDM-92.
con dos alelos mutantes.
En la mue tinueve pacientes, se identificaron un total de
nco alelos mutantes diferentes:
treinta y nueve alelos sencillos (39/45),
-
- un alelo triple mutante (1/45).
ncia al tipo de mutaciones, se observó que:
la mayor parte de las mutaciones producen un cambio de aminoácido en la proteína (35/45),
cinco producen cambios en la pauta de lectura (5/45),
- tres
miento de los intrones (2/45).
generan un codon de parada prematuro y, por tanto, una proteína truncada (3/45),
- dos alteran los sitios donadores/aceptores del procesa
-
-
En refere
-
cuarenta y ci
cinco alelos dobles mutantes (5/45),
: Histograma en el que se representan los distintos fenoti
porcentaje de alelos mutantes identificad
nda: En la columna Otros se incluyen las familias RP-3
La familia RP-280 se clasifica como STGD
stra que conforman nuestros ciento vein
cuencias.
110
Figura IV.28: gráfi e representan el total lelos mutantes di entificados en el gen ABCA4, así como sus respectivas freEn esta ca s de a ferentes (45) id
0
5
10
15
20
25
R1129LG1961E
2888 del G
R152Q + R2107H + R1108CG1977S
3211 ins GT R602W
IVS40 +5 G>AI156V
L2060RQ1315XT1019MV1433I
R1108C + R2107HP1486L
5041 del VVAIC
N1805D
T1253M + G1961E
G863A + R1055WN1799DR2017PS1642R
4739 del TT897IR212CL1940PL2
V25241V
6V o alt.proc.
Q2187XE1122KP1380L
IVS22 -2 A>T
V931M
W1480R + R1640WC1490Y
T901AG863A + R943Q
4537 ins CG1961R
R408XL11P
R1640WN380P
K1948LV767D
%00´́9933%11´́8877%%%
88´́441
2222´́44
1%%
33%%
´́447777 %% 44´́6677%% 33´́7744%%
22´́8800%
IV-Resultados
3.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS El microarray de genotipado ha permitido detectar mutaciones bios a nivel de ADN que resultan
patológicos para el individuo) y polimorfismos (cambios a nivel de ADN a nivel de proteína no patológicos
para el individuo) en el gen ABCA4. En este gen se ha identificado dos e polimorfismos:
- cambios en la secuencia de ADN que no alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína: mutaciones
sinónimas o polimorfismos;
- cambios de nucleótido que producen un cambio de aminoácido en la proteína, pero que se han
identificado en homozigosis en población control sin que produzca ectación retiniana en el individuo:
polimorfismos proteicos.
En la siguiente tabla se indican las frecuencias de los cambios identifica :
Polimorfismo
(cam
o
tipos d
n af
dos
Exón Cambio de nucleótido
Cambio de aminoácido
Frecuencia
6 c.635G>A p.Arg212His 3´3% 10 c.1268A>G p.His423Arg 28´3% 10 c.1269C>T p.= (1) 3´3% - IVS10+5 del G 21´7%
19 c.2828G>A p.Arg943Gln 6´1% 28 c.4203C>A p.= (2) 2´9% - IVS33+48 C>T 57´0%
40 c.5603A>T N1868I 10´2% 40 c.5682G>C p.= (3) 27´4% 41 c.5814A>G p.= (4) 16´8% 42 c.5843CA>TG P1948L 3´3% 42 c.5844A>G p.= (5) 12´7% 44 c.6069C>T p.= (6) 9´0% 45 c.6249C>T p.= (7) 8´2% 46 c.6285T>C p.= (8) 16´4% - IVS48+21 C>T 2´4%
49 c.6764G>T p.Ser2255Ile 6´5%
Tabla IV.14: Polimorfismos, proteicos y no proteicos, iden dos en ABCA4.
Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (1) p.His423His; p p.Pro1401Pro; p.= (3) p.Leu1894Leu;
p.= (4) p.Leu1938Leu; p.= (5) p.Pro1948Pro; p.= (6) p.Ile2023Ile; p.= (7) p 083Ile; p.= (8) p.Asp2095Asp.
tifica
.= (2)
.Ile2
111
IV-Resultados
Se identificaron un total de diecisiete polimorfismos diferentes, de los cuales:
och
Figura IV. ados en el CA4 y sus resp ecuencias.
- o son mutaciones sinónimas (8/17),
- seis son variantes que provocan un cambio de aminoácido en la proteína (6/17),
- tres cambios se producen en zona intrónica (3/17).
29: Polimorfismos identific gen AB ectivas fr
020406080
100120140160
R212H
H42 423H
10+5
del G
86
8I
L189
4L19
3 948L19
48PI20
23I
I2083
I
D
IV
>T
S2255
I3R
H
IVSR94
P14 48 C>N1
3Q 01P T
IVS33+ L P
8L
P1 2095
D
21 C
S48+
33´́33%%
2288´́33%%
33´́33%%
2211
2
´́77%%
66´́11%% 2´́99%%
5577´́00%%
1100
60
45
30
15
0
´́22%%
2277´́44%%
1166´́88%%
33´́33%%
1122´́77%%99´́00%% 88´́22%%
1166´́44%%
22´́44%% 66´́55%%
112
IV-Resultados
3.2- ES
de las ciento veintinueve familias (79/129), como se
erá a continuación.
.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS
Debido al elevado número de familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.
a) Enfermedad de Stargardt (STGD)
El análisis de haplotipos se realizó en cincuenta y tres de las setenta y cuatro familias con STGD
(53/74), ya que en veintiuna de las familias (21/74) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 43-
47). En las familias estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en cuatro de ellas
(4/53) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las cuarenta y
nueve familias restantes que mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en cuarenta y dos
de ellas (42/49).
Figura IV.30: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Stargardt.
· Con estudio familiar: 53
· Sin estudio familiar: 21
· Cosegregan: 49
· No cosegregan: 4⇒ AARRDDMM--7711,, AARRDDMM--111188,, AARRDDMM--114400,, AARRDDMM--115566.
· Con alelos mutantes: 42⇒ AARRDDMM--1122, AARRDDMM--1144,, AARRDDMM--1155,, AARRDDMM--1166,, AARRDDMM--1177,, AARRDDMM--2222,, AARRDDMM--3311,, AARRDDMM--3388,, AARRDDMM--3399,, AARRDDMM--4400,, AARRDDMM--4477,, AARRDDMM--5577,, AARRDDMM--6600,, AARRDDMM--6611,, AARRDDMM--6622,, AARRDDMM--6633,, AARRDDMM--6644,, AARRDDMM--6655,, AARRDDMM--7722,, AARRDDMM--7788,, AARRDDMM--8811,, AARRDDMM--8822,, AARRDDMM--9900,, AARRDDMM--9911,, AARRDDMM--9966,, AARRDDMM--111100,, AARRDDMM--111111,, AA
TUDIO GENÉTICO INDIRECTO
3.2.1- FAMILIAS ESTUDIADAS
El estudio familiar se realizó en setenta y nueve
v
3
RRDDMM--111166,, AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--112255,, AARRDDMM--112288,, AARRDDMM--113311,, AARRDDMM--113377,, AARRDDMM--113388,, AARRDDMM--113399,, AARRDDMM--114466,, AARRDDMM--115533,, AARRDDMM--115555,, AARRDDMM--116622,, AARRDDMM--116633,, AARRDDMM--116688,, AARRDDMM--117700. (Ver Tablas IV.5 y IV.6)
· Sin alelos mutantes: 7⇒ AARRDDMM--6677,, AARRDDMM--8833,, AARRDDMM--112222,, AARRDDMM--8844,, AARRDDMM--110000,, AARRDDMM--114422,, AARRDDMM--116600.
· Con alelos mutantes: 10⇒ AARRDDMM--6666,, AARRDDMM--7755,, AARRDDMM--7766,, AARRDDMM--8888,, AARRDDMM--113355,, AARRDDMM--115588,, AARRDDMM--116644,, AARRDDMM--116655,, AARRDDMM--116677,, SSRRPP--777733. (Ver Tablas IV.5 y IV.6) · Sin alelos mutantes: 11⇒ AARRDDMM--5522,, AARRDDMM--5588,, AARRDDMM--6688,, AARRDDMM--6699,, AARRDDMM--7777,, AARRDDMM--111177,, AARRDDMM--112233,, AARRDDMM--112299,, AARRDDMM--113300,, AARRDDMM--114488,, AARRDDMM--115511.
74 Familias STGD
113
IV-Resultados
Como se ha visto anteriormente (ver pág. 100), en la familia ARDM-61 se identificó que la paciente
resentaba la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis debido a una isodisomía parcial paterna, ya que
ador del alelo mutante. La posibilidad de que esta segregación fuese debida a
una una
D1S435-D1S2804-D1S2868-ABCA4-D1S236-D1S2664. En esta región del brazo corto
el cromosoma 1, se observó que la paciente era homozigota para todos los marcadores y que éstos eran
énticos a uno de los dos alelos paternos (Figura IV.31, barra negra). La región homozigota (isodisómica)
e 4´4 Mb, incluyendo el locus de ABCA4.
Figura IV.31: Árbol genealógico de la familia ARDM-61 en el que se muestran treinta y dos marcadores genéticos
distribuidos a lo largo del cromosoma 1, en la paciente y en sus padres.
p
únicamente su padre era port
microdeleción del alelo materno se descartó mediante el análisis de cinco marcadores microsatélites
flanqueantes al gen:
d
id
comprendía una distancia física d
D1S206
D1S167 D1S435 D1S2804 D1S2868 D1S236 D1S2664
D1S464
D1S2793
D1S450 D1S2667
D1S234
D1S207
D1S255
D1S2797
D1S2890
D1S2829 D1S2803
D1S1660 D1S249 D1S425
D1S218
D1S2726
D1S498
D1S484 D1S2878 D1S196
D1S238 D1S408 D1S2757 D1S413
D1S229 D1S213 D1S2800 D1S2785 D1S2842
D1S2836
AABBCCAA44
02/7242 33 21 11 11 21 12 11 32 22 41 21 32 12 1? ?2 12 32 21 23 23 21 12 11 23 22 22 22 31 22 12 31 21 31 22 12 11 22 1
02/7252 13 11 21 11 21 12 31 22 12 11 21 12 22 2? ?2 22 22 21 13 23 31 22 21 23 12 12 12 11 12 32 11 11 21 32 32 31 12 1
02/7261 31 22 11 12 31 23 22 11 21 32 22 32 11 3? ?1 31 32 11 22 13 12 12 22 11 31 21 21 21 13 21 21 12 13 13 23 21 21 1
+ + - + - -
114
IV-Resultados
Como se muestra en la figura anterior, se analizaron veintisiete microsatélites adicionales,
localizados a lo largo del cromosoma 1. Se observó que la paciente presentaba marcadores heterozigotos
biparentales cerca del centrómero (D1S2726), así como en la región distal del brazo corto (D1S450,
D1S2667) y del brazo largo (D1S2842). En los restantes marcadores, se observaron regiones no
informativas en las cuales no se puede diferenciar entre una segregación biparental normal o heterodisomía
uniparental maternal.
El análisis de haplotipos permitió determinar que esta segregación era producida por una isodisomía
parcial paterna, con los puntos de rotura localizados entre 1p22.3 (D1S167-D1S435) y 1p22.1 (D1S2664-
res D1S2793 y D1S206 (brazo corto) también podrían estar involucrados en la
isodisomía, pero no son informativos.
Asimismo, la paternidad se confirmó mediante el análisis de marcadores microsatélites localizados
en los cromosomas 13, 18, 21, X e Y (datos no presentados en este trabajo).
b) Distrofia de conos y bastones (DCB)
El análisis de haplotipos se realizó en catorce de las veintiocho familias con DCB (14/28), ya que en
catorce de las familias (14/28) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 47, 48). En las familias
estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en dos de ellas (2/14) en las que se
observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las doce familias restantes que
mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en ocho de ellas (8/12).
Figura IV.32: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con distrofia de conos y ba
· Con estudio familiar: 14
· Sin estudio familiar: 14
· Cosegregan: 12
· No cosegregan: 2⇒ AARRDDMM--113344,, AARRRRPP--771199.
· Con alelos mutantes: 8⇒ AARRDDMM--7799, AARRDDMM--8866,, AARRDDMM--112266,, AARRDDMM--113333,, AARRDDMM--117744,, AARRDDMM--117766,, RRPP--226677,, RRPP--995599. (Ver Tablas IV.8 y IV.9)
· Sin alelos mutantes: 4⇒ AARRDDMM--4499,, AARRDDMM--116699,, SSRRPP--776633,,
D1S2793). Los marcado
stones.
AARRDDMM--119955.
· Con alelos mutantes: 2⇒ AARRDDMM--9999,, RRPP--557777. (Ver Tablas IV.8 y IV.9)
28 Familias DCB
· Sin alelos mutantes: 12⇒ AARRDDMM--8855,, AARRDDMM--115599,, AARRDDMM--119922,, AARRRRPP--5555,, RRPP--558866,, RRPP--665577,, SSRRPP--882277,, SSRRPP--882288,, SSRRPP--996644,, RRPP--996655,, RRPP--997711,, RRPP--997733.
115
IV-Resultados
c) Retin
n la familia ARRP-700, el análisis de haplotipos permitió descartar el gen ABCA4 como responsable
de enfermedad, ya que ambos hermanos afectos (II:1, II:5) mostraban haplotipos diferentes. En el hermano
afecto (II:1) se identificó un alelo mutante, como se indica en la siguiente figura:
Figu lelo
mutante p.Pro1489Leu.
· Con alelos mutantes: 3⇒ SSRRPP--776666
osis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR)
El análisis de haplotipos se realizó en cinco de las diecisiete familias con RPAR (5/17), (ver pág. 49).
En dos de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (2/5) y en una
de ellas se identificó un alelo mutante (1/2). En las tres familias que mostraban cosegregación, no se
identificaron alelos mutantes.
· Con estudio familiar: 5
· Cosegregan: 3
Figura IV.33: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con RPAR.
E
ra IV.34: Árbol genealógico de la familia ARRP-700, en el que se muestra los haplotipos y la segregación del a
17 Familias RPAR
· No cosegregan: 2
· Sin estudio familiar: 12 ,, SSRRPP--777755,, SSRRPP--883344 (Ver Tabla IV.10).
n alelos mutantes: 9 ⇒ AARRRRPP--8822,, RRPP--441177,, RRPP--557788,, RRPP--558866,, SSRRPP--771166,, · SiSSRRPP--881133,, SSRRPP--881188,, RRPP--885544,, RRPP--993377.
I:101/1242
158 154191 183188 188
I:201/1244
154 170177 179188 184
II:101/1246
158 154191 177188 188
II:201/1245
154 154183 177188 188
II:301/1243
154 170183 179188 184
II:401/1240
154 154183 177188 188
II:601/1241
154 154183 177188 188
II:501/1200
158 170191 179188 184
p.Pro1948Leu
p.Pro1948Leu
· Sin alelos mutantes: 3⇒ AARRDDMM--8899,, SSRRPP--885577,, RRPP--992277
· Con alelos mutantes: 1⇒ AARRRRPP--770000 (Ver Tabla IV.10).
AARRDDMM--5544.
.
· Sin alelos mutantes: 1⇒
116
IV-Resultados
d) Fenotipo diverso
Figura IV.35: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con fenotipo diverso.
Como se ha mostrado anteriormente (ver pág. 104), en la familia RP-280 se identificó la mutación
p.Asn1805Asp en homozigosis en el probandus con STGD (II:1), mientras que su hermana (II:4) es
heterozigota pa gación de los
aplotipos confirmó la distribución de los alelos mutantes.
Figura IV.36: Árbol genealógico de la familia RP-280, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo
mutante p.Asn1805Asp.
3 Familias Fenotipo diverso
· Con estudio familiar: 3 · Cosegregan: 3
El análisis de haplotipos se realizó en las tres familias que presentaron distintos fenotipos asociados
a mutaciones en el gen ABCA4. En las tres familias, los haplotipos cosegregaban con la enfermedad y se
identificaron alelos mutantes.
ra dicho cambio y presenta un fenotipo compatible con RP precoz. La segre
h
· Con alelos mutantes: 3⇒ RRPP--228800,, RRPP--331155,, RRPP--553322 (Ver Tablas IV.11 y IV.12)
.
I:195/91
154 158177 177189 185
I:295/92
154 154177 185189 207
II:195/93
154 154177 177189 189
II:295/94
154 154177 185189 207
II:395/95
158 154177 185185 207
II:495/96
158 154177 177185 189
p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp
p.Asn1805Asp
p.Asn1805Asp
SSTTDDGG RRPP pprreeccoozz
p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp
117
IV-Resultados
En la familia RP-315 el alelo mutante p.Gly1961Glu aparece en la madre y en el hijo, como se ha
En la familia RP-532, los haplotipos cosegregan con la enfermedad. Los tres hermanos comparten
los mismos haplotipos y el alelo mutante p.Arg1129Leu.
Figura IV.38: Árbol genealógico de la familia RP-532, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo
mutante p.Arg1129Leu.
visto anteriormente (ver pág. 106). El análisis de haplotipos mostró que ambos hermanos comparten uno de
los dos cromosomas paternos (rojo), pero cada uno ha heredado un cromosoma materno diferente.
DDCCBB
Figura IV.37: Árbol genealógico de la familia RP-315, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo
mutante p.Gly1961Glu.
I:295/397
170 158183 191206 188
I:1
? ?? ?? ?
II:195/398
154 158179 191206 188
II:295/399
154 170179 183206 206
p.Gly1961Glu
p.Gly1961Glu DDMM BBeesstt FFFFMM
I:199/117
170 154185 183206 206
I:299/116
158 168183 191206 188
II:299/115
170 158185 183206 206
II:199/114
206 2
170 168185 183
06
II:399/146
06
170 158185 183206 2 p.Arg1129Leu
DDCCBB
SSTTGGDD
p.Arg1129Leu
p.Ar
DDCCBB
p.Arg1129Leu g1129Leu
118
IV-Resultados
e ofia Macular Autosómica Dominante (ADDM)
El análisis de haplotipos se realizó en dos de las siete familias con ADDM (2/7), (ver pág. 50). En una
de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (1/2), aunq
) Distr
ue se
entificó un alelo mutante. En la familia que mostró cosegregación (1/2), también se identificó un alelo
utante. En las familias restantes, no se detectaron mutaciones.
Figura IV lias con ADDM.
En la familia ADDM ABCA4, como se ha visto
an
descartar el gen ABCA4 como responsable
Figura IV.40: Árbol genealógico de la familia ADDM-92; haplotipos y segregación de los alelos mutantes.
· Con estudio familiar: 2
· Sin estudio familiar: 5
· Cosegregan: 1
· No cosegregan: 1 · Con alelos mutantes: 1⇒
id
m
.39: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las fami
-92 se identificaron diversos alelos mutantes en
teriormente (ver pág. 107). El análisis de haplotipos que se muestra en la siguiente figura no puede
de enfermedad.
AADDDDMM--5599 (Ver Tabla IV.13).
· Sin alelos mutantes: 5 ⇒ AADDDDMM--7744,, AADDDDMM--8800,, AADDDDMM--9944,, AADDDDMM--110055,, AADDDDMM--110066.
· Con alelos mutantes: 1⇒ AADDDDMM--9922 (Ver Tabla IV.13).
7 Familias ADDM
II:1
? ?? ?? ?
II:203/446
154185
168183
208 188
III:203/398
154 154189 185206 208
III:1
? ?? ?? ?
IV:203/397
154 154183 185208 208
II:3
? ?? ?? ?
III:503/690
154 168191 183188 188
III:403/455
154 168177 183206 188
IV:1
? ?? ?? ?
V:106/183
158 154177 185208 208
I:1
? ?? ?? ?
III:603/691
168 168179 183204 188
III:3
? ?? ?? ?
IV:303/456
154 154189 177184 206
p.Ile156Val
DDMM
p.Ile156Val
p.Gly172Ser p.Val2050Leu
p.Thr897Ile SSTTGGDD
p.Ile156V
DDMM
p.Ile156Val
p.Val2050Leu
119
IV-Resultados
3.3.2- HAPLOTIPOS PREVALENTES Mediante el estudio genético directo realizado en nuestras familias, se ha identificado un alelo
mutante prevalente (ver pág. 110, Figura IV.28). En el gráfico anterior se puede observar que la mutación
más frecuente en nuestra población es el cambio p.Arg1129Leu, que aparece en dieciocho pacientes y en
cinco de ellos se produce en homozigosis.
El análisis de haplotipos realizado con marcadores extragénicos (microsatélites) e intragénicos (SNPs o
polimorfismos de único nucleótido, detectados mediante el microarray) permitió identificar que algunos de
los pacientes portadores de dicha mutación comparten un haplotipo similar, como se muestra en la siguiente
ta
Familias
bla:
Marcadores ARDM-31 ARDM-47 ARDM-57 ARDM-611 ARDM-62 ARDM-78 ARDM-82
D1S435 168 154 168/154 158 154/154 154 164 DIS2804 182 182/182 182 182/182 182 192 182 D1S2868 146 146/146 146 146/146 144 146 146
p(c
.His423Arg .1268A>G) A//G A//G A//G G A//G A G
p.Arg1129Leu (c.3386G>T) T T/T T T T T T
IVS33 + 48C>T T T/T T T C//T T T
D1S236 188 202/206 206 206/206 206 210 206
Familias
Marcadores ARDM-96 ARDM-111 ARDM-119 ARDM-128 ARDM-139 ARDM-155 ARDM-162
D1S435 168 154/154 168/154 168/168 154 154 170 DIS2804 190 188/182 172/182 172/172 182 182 182 D1S2868 142 142/146 146/146 146/146 146 146 146
p.His4(c.1268
23Arg A>G) A//G G G G A//G A//G A//G
p.Arg11(c.3386
29Leu G>T) T T T T T T T
IVS33 + 48C>T T T T T T T T
D1S236 206 206/184 206/206 206/206 206 206 188 Tabla
p.Arg1129
símbolo”//” ind
p.Arg1129
IV.15: marcadores extragénicos e intragénicos al gen ABCA4, identificados en familias con la mutación
Leu. En los marcadores intragénicos, los alelos salvajes se muestran en azul y los mutantes en rojo. El
ica que no se ha podido establecer la fase del alelo. Las familias subrayadas indican que el cambio
Leu se produce en homozigosis; por tanto, se muestran ambos alelos, paterno y materno, respectivamente. 1: En esta paciente la homozigosidad se ha producido por isodisomía parcial (ver pág. 100).
120
IV-Resultados
En la tabla anterior no se incluyen las familias ARDM-66, ARDM-76, ARDM-164 y SRP-773, ya que
en ellas
observa que el cambio IVS33+48C>T está presente siempre que
fismo aunque éste aparece en heterozigosis. En la familia ARDM-78, el cambio p.His423Arg no se
roduce, mientras que IVS33+48C>T aparece asociado a la mutación p.Arg1129Leu.
de los ma dore satélites identi r la
ARDM-47 ) -61 os al debido diso ía parcial -11
materno), ARDM-139 y ARDM-155. Si no se cons el marcador D1S el más ABCA4, ver
pág. 67 rva que amilia -57 y ARDM-82 ten un haplotipo ar con atro
anterio V.41A)
El se po más prevalente arte s familia -11 (alelo pa R -128
(amb ura IV.41B). Por úl ilias ARDM-31 y ARDM-162 comparten un haplotipo
idéntico, que r distal
Figura IV.41: Haplotipos compartidos por las diferentes familias con la mutación R1129L.
116688118822114466GG TT TT
220066
únicamente se ha estudiado el caso índice y no se puede establecer la fase de los marcadores
microsatélites y polimorfismos.
Según los resultados anteriores, se
aparece la mutación p.Arg1129Leu, aunque en la familia ARDM-62 no se ha podido establecer la fase.
En las familias en las p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el cambio p.His423Arg aparece asociado a
dicha mutación en todas excepto en la familia ARDM-47, en la que no se pudo determinar la fase del
polimor
p
El análisis rca s micro ficó un haplotipo compartido po s familias
(alelo materno , ARDM (en amb elos, a la iso m ), ARDM 9 (alelo
idera 435 ( distal de
), se obse las f s ARDM compar simil las cu
res (Figura I .
gundo haploti
s alelos) (Fi
lo comp n la s ARDM 9 terno) y A DM
o g timo, las fam
únicamente difiere en el marcado D1S435 (Figura IV.41C).
AA AARRDDMM--4477,,
115544 118822 114466 GG TT TT
220066
115544 118822 114466 AA////GG
TT TT
220066
AARRDDMM--6611,, AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--113399,, AARRDDMM--115555
115544 118822 114466 GG TTTT
2200
66
11554411
8822
11
4466AA
////GG TTTT
220066
115544 118822 114466 AA////GG
TTTT
220066
AARRDDMM--5577,, AARRDDMM--8822
1155881188
22
1144
66AA////
GG
TTTT
2200
66
116688 117722 114466 GG
1
TTTT
118888
T
15544 118822 114466 AA////GG
TTT
118888
AARRDDMM--3311,, AARRDDMM--116622
117700 118822 114466 AA////GG
TTTT
118888
AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--112288 BB CC
116688 117722 114466 GG TTTT
118888
121
IV-Resultados
122
El segundo alelo más frecuente en la muestra de pacientes STGD fue el cambio p.Gly1961Glu (ver
pág. 110, Figura IV.28). El haplotipo establecido con las mutaciones detectadas por el microarray mostró que
p.Gly1961Glu siempre aparece asociado a cuatro polimorfismos de único nucleótido. Sin embargo, el
aplotipo formado con los marcadores microsatélites extragénicos difiere entre los distintos pacientes.
l se representan los polimorfismos proteicos y en rojo la mutación.
s el alelo complejo
[p.Arg152 uce en
homoz nte
[p.Arg110 5). Los
haplotip s. El
anális
Figura IV.43: Haplotip 08Cys+p.Arg2107His] y
[p.Arg1108Cys+p.Arg210 . Los marcadores u ados fueron los siguientes: TEL- D1S435-
DIS2804-D1S2868- c.455G>A (p.Arg152Gln) - c.3322C>T (p.Arg1108Cys) - c.6320G>A (p.Arg2107His) -D1S236-CEN.
Las mutaciones se representan en rojo.
h
Figura IV.42: Haplotipos de las familias con la mutación p.Gly1961Glu; los marcadores utilizados fueron los siguientes:
TEL- D1S435- DIS2804- c.5682G>C (p.Leu1864Leu) - c.5814A>G (p.Leu1938Leu) - c.5843CA>TG (p.Pro1948Leu) –
c.5844A>G (p.Pro1948Pro) - c.5882G>A (p-Gly1961Glu) - D1S236-CEN.
En azu
18
Otra mutación frecuente en nuestros pacientes e
Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], que aparece en cuatro familias, en una de ellas se prod
igosis (ARDM-14). En otras dos familias (ARDM-110 y ARDM-116), se detectó el alelo doble muta
8Cys+p.Arg2107His], que difiere del anterior en la mutación p.Arg152Gln (ver pág. 9
os construidos con los marcadores microsatélites son similares entre los diferentes paciente
is de haplotipos se muestra en la siguiente figura:
os de las familias con los alelos complejos [p.Arg152Gln+p.Arg11
7His], respectivamente tiliz
115588 118888 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA 1
800
AARRDDMM--1122
115544 119911 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA
1
220088 1
15544 118833 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA
1
18899 1
15588 117777 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA
1
18855 2
16688 118877 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA
1
21144 1
15544 118855 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GGcc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GG cc..55888822GG>>AA
18833
AARRDDMM--5577 AARRDDMM--6600 AARRDDMM--6655 AARRDDMM--116688 AARRDDMM--8811
115544 119900 114444 cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888
AARRDDMM--1144 AARRDDMM--1177 AARRDDMM--113377 AARRDDMM--113399 AARRDDMM--111166 AARRDDMM--111100
115544 119900 114444 cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888
115544 119900 114444 cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888
115544 119900 114444 cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 220066
115544 119900 114444 -- cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888
115588 119988 114444 -- cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888
115544 118822 114488
cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA
220066
IV-Resultados
3.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
Con el fin de determinar la severidad de las mutaciones identificadas en el gen ABCA4, se han
agrupado los pacientes en función de la combinación de alelos mutantes que presentan, el fenotipo exhibido
y en la edad de comienzo de la enfermedad. Los datos utilizados en el análisis se recogen en las siguientes
blas: ta
1- En primer lugar, se clasifican los pacientes con el alelo prevalente p.Arg1129Leu en homozigosis. Los
síntomas comienzan en la segunda década de vida y el fenotipo resultante es STGD: presentan escotoma
central, discromatopsia (no percepción de los colores), fotosensibilidad y agudeza visual disminuida (entre
0´1-0´5). Algunos casos presentan estrabismo y alteración de la onda b en el ERG.
Familia Alelo 1 Alelo 2 Edad de inicio (años) Fenotipo
ARDM-61 p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu 12 STGD ARDM-111 p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu 18 STGD ARDM-119 p.Arg11 STGD29Leu p.Arg1129Leu 19 ARDM-128 p.Arg11 STGD 29Leu p.Arg1129Leu 19 ARDM-47 p.Arg11 STGD 29Leu p.Arg1129Leu 21
N= 5; Media de edades ⇒ x = 17´8 años; Desviación estándar ⇒ σ = 3´42
Edad de inicio (años) Fenotipo
2- A continuación, se muestran los pacientes heterozigotos compuestos con el alelo p.Arg1129Leu.
Asimismo, el fenotipo asociado a esta combinación de alelos es siempre STDG y la edad de comienzo oscila
desde la primera década de vida hasta la cuarta.
Familia Alelo 1 Alelo 2
29Leu p.= o altera el procesamiento 9 STGD ARDM-76 p.Arg11
ARDM-78 p.Arg1129Leu p.Gln2187X 10 STGD ARDM-155 p.Arg1129Leu p.Arg602Trp 11 STGD ARDM-57 p.Arg1129Leu p.Gly1961Glu 15 STGD ARDM-82 p.Arg1129Leu p.Glu1122Lys 15 STGD ARDM-66 rg1129Leu p.Leu1940Pro 17 GD p.A ST
A p.A Trp STRDM-96 rg1129Leu p.Trp1408Arg p.Arg1640 17 GD
ARDM-139 p.Arg152Gln
p.Arg1108Cys p.Arg2107His
p.Arg1129Leu 20 STGD
ARDM-62 p.Arg1129Leu p.Gly1977Ser 39 STGD
ARDM-31 p.Arg1129Leu p.Ser1642Arg 40 STGD N= 10; Media de edades⇒ x = 19´3 años; Desviación estándar= σ = 10´6
123
IV-Resultados
3- En la siguiente tabla se recogen los pacientes con STGD que portan, al menos, un alelo complejo. Al igual
que en el grupo anterior, la edad de comienzo es muy variable.
Familia Alelo 1 Alelo 2 Edad de inicio (años) Fenotipo
ARDM-14 p.Arg152Gln
p.Arg1108Cys p.Arg2107His
p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His
5 STGD
ARDM-17 p.Arg152Gln
p.Arg1108Cys p.Arg2107His
p.Arg2107Pro 8 STGD
ARDM-110 p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Gly1961Glu 8 STGD
ARDM-15 p.Gly863Ala c.2888delG 11 p.Arg1055Trp STGD
ARDM-116 p.Arg1108Cys p.A is p.Cys1490Tyr 11 STGD rg2107Hp.Arg152Gln
STGD ARDM-137 p.Arg1108Cys IVS40+5 G>A 13 p.Arg2107His p.Gly863Ala p.Arg943Glu STGD ARDM-138 c.4537ins C 19
p.Thr1253Met ARDM-12 p.Gln1315X 38 STGD p.Gly1961Glu
N= 8; Media de edades= 14´1 años; Desviación estándar= σ = 9´8
4- A continuación se recogen los pacientes que portan alelos sencillos, a excepción del alelo mutante
p.Arg1129Leu. Presentan STGD y la edad de comienzo se sitúa entre la primera y la segunda década de
vida.
Familia Alelo 1 Alelo 2 Edad de inicio (años) Fenotipo
STGD ARDM-38 p.Arg602Trp c.4739 del T 8 STGD ARDM-40 p.Thr1019Met p.Gln1315X 8 STGD ARDM-90 p.Gly1977Ser IVS22 -2A>T 8 STGD ARDM-72 p.Ile156Val p.Arg602Trp 12 STGD ARDM-22 c.2888delG p.Leu2060Arg 12 STGD ARDM-170 p.Arg408X p.Pro1486Leu 14 STGD ARDM-64 p.Arg212Cys p.Gly1977Ser 15 STGD ARDM-168 p.Gly1961Glu p.Leu2060Arg 15
ARDM-88 IVS40+5 G>A 16 STGD p.Pro1380Leu STGD ARDM-60 p.Arg602Trp p.Gly1961Glu 17 STGD ARDM-81 p.Gly1961Glu p.Val1433Ile 18 STGD ARDM-153 c.3211insGT p.Gly1961Arg 24
N= 12; Media de edades= 13´9 años; Desviación estándar= σ = 4´5
124
IV-Resultados
5- Por último, se muestran las familias que presentan un fenotipo DCB, caracterizado por pérdida de la visión
central, ceguera nocturna y alteraciones en el ERG que se manifiestan primero en conos y posteriormente en
astones. El comienzo de la enfermedad es muy temprano, ya que se produce en la primera década de vida.
Familia A Edad de inicio (años) Fenotipo
b
lelo 1 Alelo 2
RP-267 p.Val168 p.Va el 6 DCB 1_Cys1685del l1681_Cys1685dARDM c.2 8 -79 888delG c.2888delG DCB ARDM c.2 8 -86 888delG c.2888delG DCB
ARDM p.L -133 eu11Pro c.2888delG 8 DCBARDM-176 c.2 p.Leu2060Arg 10 DCB 888delG ARDM p.Gl p 0 -126 y1977Ser .Gly1977Ser 1 DCB
N edade esviación est ar= σ = 1´4
= 6; Media de s= 8´3 años; D ánd
125
IV-Resultados
3.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES
En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de los padres de los pacientes, por lo que
se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.
Procedencia ocedenPr cia
F el ilia elo paterno Alelo materno amilia Alelo paterno Al o materno Fam Al
A (Sevilla) ARDM-90 Segovia RDM-12 Peñaflor ARDM-14 Madrid Ciudad R ARDM-91 Guadalajara eal
ARDM-15 Ciud Guadalaj ARDM-96 Burgos C( a)
idamón ad Real ara La Rioj
ARDM-16 T ARDM-110 ano udad Real) d Puerto Ll
(Cioledo Madri
ARDM-17 a (Vizcaya) Madrid ARDM-111 Barrik
ARDM-22 Toledo ARDM-116 Castro Caldelas (Orense)
ARDM-31 Salamanca ARDM-119 San Sebastián (Guipúzcoa)
Echarri Aranaz (Navarra)
ARDM-38 Cáceres ARDM-125 -
ARDM-39 Valladolid ARDM-128 Galdako (Vizcaya)
Horga (Vizcaya)
ARDM-40 Segovia ARDM-131* Yunclillos (Toledo)
Ines (Soria)
ARDM-47 Madrid ARDM-135 -
ARDM-57 Madrid ARDM-137 Ciudad Real Fuentes de León (Badajoz)
ARDM-60 Huelva Ciudad Real ARDM-138 (1) Lucerna (Suíza) Ginebra (Suíza)
ARDM-61 Burgos ARDM-139 Prádanos de Bureba (Burgos) Madrid
ARDM-62 Almadén (Ciudad Real) ARDM-146 Oviedo
ARDM-63 Toledo ARDM-153 Alora (Málaga)
Osuna (Sevilla)
ARDM-64 Madrid Zaragoza ARDM-155 Vélez-Rubio (Almería) ARDM-65 Madrid ARDM-158* Las Palmas Cuenca ARDM-66 Nuñomoral (Cáceres) ARDM-162 Papatrigo (Ávila) ARDM-72 Pontevedra ARDM-163 Ingenio (Las Palmas) ARDM-75 Cuenca ARDM-164 San Sebastián (Guipúzcoa)
ARDM-76 Barcelona ARDM-165 Monforte de Lemos (Lugo)
Puebla de Brollón (Lugo)
ARDM-78 Ciudad Real ARDM-167* Torre de Juan Abad (C. Real)
Úbeda (Jaén)
ARDM-81 Madrid ARDM-168 Oviedo ARDM-82 Ávila Madrid ARDM-170 Madrid ARDM-88 Tenerife SRP-773 Madrid
Tabla IV.16: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias STGD.
126
IV-Resultados
127
Procedencia Procedencia
Familia Alelo paterno Alelo materno Familia Alelo paterno Alelo materno
ARDM-79 Toledo ARRP-700 Madrid ARDM-86 SRP-766 La goza) Asturias Almunia (ZaraARDM-99 ula (M 5 sesM urcia) SRP-77 Avile (Murcia)
ARDM-126 * (Salaman Valladolid Toledo SRP-834 Cantalpino ca)
ARDM-133 Na de la Mata (Cáceres)
o valmoral Aldea Rodrig(Salamanca) RP-280 -
ARDM-174 dosera ( CácereLa Co Badajoz) RP-315 s
ARDM-176 Sta. Mª del Páramo )
S. Martín del Camino (León) (León RP-532 Sevilla
RP-267 San Ginés (Orense) ADDM-59 Madrid RP-959 León Cas Burgos) ADDM-92 trillo de la Reina (
Tabla IV.17: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias DCB, ( de de Su presentan los alelos : Indica de esta se.
Figura IV.44: Origen geográfico de las alteraciones identificadas en el gen ABCA4.
RPAR, fenotipo diverso y ADDM. 1): El paciente proce iza, no se re en el mapa. * que no se pue blecer la fa
VV225566VV RR11112299LL
II115566VV RR660022WW
VV993311MM GG886633AA++RR110055
55WW
NN11779999DD2288
8888 ddeellGG ((33))LL22006600RR TT889977II
GG11997777SS ((22))
TT11225533MM++GG11996611EE QQ11331155XX
33221111iinnssGGTTR
R11112299LL
MadridMadrid::RR11112299LL ((55)) //// GG11996611EE ((55))
RR115522QQ++RR11110088CC++RR22110077HH ((33)) RR22110077PP //// RR221122CC VV11443333II //// RR440088XX
PP11448866LL
//// PP11994488LL
Ciudad RealCiudad Real::RR115522QQ++RR11110088CC++RR22110077HH ((22)) //// RR11112299LL ((22))
RR11110088CC++RR22110077HH //// 22888888 ddeellGG GG11996611EE //// GG11997777SS
QQ22118877XX
RR11112299LL SS11664422RR
LL
1111PP
RR6600
22WW 44773399 ddeellTT RR11112299LL LL11994400PP
22888888 ddeellGG GG11996611EE
II
VVSS4400++55GG>>AA TT11001199MM QQ11331155XX GG11997777SS
IIVVSS2222--22AA>>TT
RR660022WW
RR11112299LL
((33))
GG11997777SS VV776677DD
LL22224411VV
EE11112222KK RR11112299LL
PP11338800LL IIVVSS4400++55GG>>AA
RR11112299LL ((44))
RR11110088CC++RR22110077HH CC11440099YY
5500
4411 ddeell1155ppbb ((22))
RR11112299LL
RR11112299
LL ((22))
IIVVSS
4400++55GG>>AA RR11664400WW
TT11001199MM
GG11996611EE LL22006600RR
22
888888 ddeellGG ((22))
GG11996611RR
RR660022WW RR11112299LL
PP11448866
33221111iinnssGG
VV11443333II II115566VV
22888888 ddeellGG
LL22006600RR II115566VV
IV-Resultados
3.5- FRECUENCIA DE ALELOS MUTANTES DE ABCA4 ENTRE LA POBLACIÓN GENERAL
Con el fin de deter uencia de portadores (sanos) de alelos mu CA4, se
est muta eu el alel lente e ente
(fre 4/107= 22´4%), en un to atrocientos cro
- osomas se ana ediante ensayo de r , con la ER ción
la diana de res a endonucleasa.
- s cromosomas se mediante dHPLC
Mediante ayo portadore ón p.Arg1129L rgo, el
análi er rom ida de alto en los restantes cromo as,
permitió ectar un odúplex en os control ). A
con , se secuenciaron l muestras que presen atrón alte s
el al
- g. 101)
tantes en ABminar la frec
udió la ción p.Arg1129L , ya que es o preva ntre los paci s analizados
cuencia=2 tal de cu mosomas:
Aci I, ya que la mutacien crom lizaron m estricción
destruye tricción de est
tresciento analizaron .
ens de restricción, no se identificaron s de la mutaci eu. Sin emba
sis post ior realizado por c
patró
atografía líqu
o o en heter
rendimiento som
det n alterad dos individu (Figura IV.41
tinuación as dos taron un p rado y se identificó en amba
elo p.Arg1129Leu.
Figura IV.41: Patrón cromatográfico de un individuo control y de un individuo portador del alelo p.Arg1129Leu.
Los cálculos realizados se indican a continuación:
El alelo p.Arg1129Leu representa el 22´4% de los alelos mutantes identificados en ABCA4 (ver pá
y la tasa de detección del microarray es del 54´7% en pacientes STGD (ver pág. 88):
Por tanto: p.Arg1129Leu ⇒ 0´224 x 0´547 = 0´122⇒ 12´2% de los alelos posibles muta
STGD, es decir, el 12´2% de la frecuencia alélica mutante (q) para ABCA4.
ntes en
BBllaannccoo
CCoonnttrrooll ssaannoo
MMuuttaannttee
128
IV-Resultados
- La frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en la población general es 2/400 = 0´005, por tanto:
res de alelos
mutantes en dad de
1:588.
- Para calcular las frecuencias genotípicas a partir de las frecuencias alélicas, se utilizó la fórmula del
equilibrio de Hardy-Weinberg:
A partir de la ecuación anterior, se obtiene que la frecuencia (estimada) de portado
ABCA4 en nuestra población sea del 7´87% y la prevalencia (estimada) de la enferme
Frecuencia absoluta mutante
Frecuencia alelo R1129L 12´2 =
100 ⇒ qq =
0´005 x 100 = 0´041
12´2
EEqquuiilliibbrriioo ddee HHaarrddyy--WWeeiinnbbeerrgg⇒⇒ pp22 ++ 22ppqq ++ qq22 == 11
Homozigotos sanos= p2 = 0´9197 Heterozigotos sanos = 2pq = 0´0786 Homozigotos mutantes= q2 = 0´0017
129
Representación de la retina realizada por Ramón y Cajal (1852-1934).
V‐ Discusión
130
V- Discusión
V‐ DISCUSIÓN
1‐ DISCUSIÓN GENERAL
“Durante el año 1896 […] ataqué con nuevos bríos la retina, el más antiguo y pertinaz de mis
amores de Laboratorio…”, eran las palabras de Santiago Ramón y Cajal recogidas en su obra Historia de
mi labor científica. Sus descripciones anatómicas y fisiológicas de los diversos tipos celulares
revolucionaron las investigaciones neurológicas de la época, más aún, cuando los medios ópticos de los
que disponía para observar las retinas de los diferentes vertebrados eran, cuando menos, rudimentarios.
Hoy en día, la estructura de la retina se conoce en profundidad y su análisis ha permitido determinar que la
mayoría de las conexiones neuronales establecidas por Cajal eran correctas.
El avance de la Ciencia ha permitido que la Biología Molecular llegue a “ver” incluso dentro de los
fotorreceptores. De hecho, se han identificado un total de ciento sesenta y seis loci (localizaciones
genéticas), de los cuales se han clonado un total de ciento dieciséis (www.sph.uth.tmc.edu/Retnet). Las
proteínas codificadas por estos genes intervienen en el desarrollo celular de la retina, en la integridad
estructural, en el transporte de metabolitos, en la cascada de fototransducción, en el control y el
mantenimiento de la cascada, etc., y consiguen que esta estructura, elegantemente organizada, confiera
uno de los sentidos más importantes: la visión.
El conocimiento de la secuencia de estos genes, de las mutaciones que se producen y de la repercusión
fenotípica que puedan tener en el paciente resulta imprescindible para comprender las interacciones que se
generan entre las diferentes proteínas existentes en las células retinianas.
Como se ha observado a lo largo de este trabajo, es necesario un enfoque multidisciplinar, en el
que la correcta clasificación clínica de la patología y el abordaje molecular preciso resultan esenciales. El
resultado de esta investigación conjunta permite, por un lado, conocer la prevalencia y la distribución
geográfica de las distrofias de retina estudiadas y, por otro lado, facilitar al paciente un asesoramiento
genético adecuado. En un futuro cada vez más próximo, el conocimiento de la causa genética de la
enfermedad permitirá aplicar al paciente el tratamiento adecuado, sustituyendo el gen dañado (terapia
génica).
La caracterización genotípica y fenotípica resultan esenciales para el diagnóstico de estas
enfermedades, no obstante, es necesaria una aproximación funcional que permita determinar cuál es el
papel de cada una de las proteínas codificadas por estos genes, así como las interacciones que puedan
existir entre ellas y la interacción que existe entre los genes y el ambiente. Conocer los productos proteicos
permitirá identificar posibles dianas terapéuticas con herramientas genómicas, que harán más efectivos
dichos tratamientos.
131
V- Discusión
PPaacciieennttee
EEssttuuddiioo ggeennééttiiccoo
IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddeell ggeenn rreessppoonnssaabbllee
NNoo iiddeennttiiffiiccaacciióónn ddeell ggeenn rreessppoonnssaabbllee
EEssttuuddiioo ggeennóómmiiccoo
IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee SSNNPPss
BBúússqquueeddaa ggeennóómmiiccaa
IInnffoorrmmee yy ccoonnsseejjoo ggeennééttiiccoo
TTrraattaammiieennttoo:: tteerraappiiaa ggéénniiccaa
BBúússqquueeddaa ddee oottrrooss ggeenneess CCoonnoocciiddooss
DDeessccoonnoocciiddooss
EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall
IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee ddiiaannaass tteerraappééuuttiiccaass
DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa ffuunncciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa
pprrooggnnoossiiss ddeell ppaacciieennttee
TTrraattaammiieennttoo
IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee nnuueevvooss ggeenneess
Figura V.1- Esquema de los diferentes estudios moleculares aplicables a las distrofias de retina hereditarias.
2‐ EPIDEMIOLOGÍA DE LAS DISTROFIAS DE RETINA ESTUDIADAS
El estudio epidemiológico sobre distrofias de retina realizado en pacientes españoles ha permitido
conocer la prevalencia de estas enfermedades en España. Hasta el momento, se han estudiado un total de
tres mil novecientos treinta y seis casos (3936) correspondientes dos mil ciento sesenta y seis familias no
emparentadas (2166) (Ayuso C et al., Memoria Red EsRetNet 2005; comunicación personal). En el
siguiente gráfico se muestran las frecuencias de los fenotipos observados: la ND y la XLRS presentan una
frecuencia muy baja (0´5% y 1´2%, respectivamente). La STGD es algo más frecuente (3´8%), siendo la
RPAR uno de los fenotipos más prevalentes en población española. Sin embargo, mientras que la mayoría
de los casos de STGD están asociados a mutaciones en ABCA4, únicamente una pequeña fracción de
casos con RPAR (0´43%) y algo más con DCB (0´71%) están causados por mutaciones en este gen,
existiendo una gran heterogeneidad genética.
132
V- Discusión
Otras DR
ND
XLRS
STGD
DCB
RPAR
RPAR-ABCA4
Otras RP (RPAD, XLRP)
Otros
DDRR⇒⇒1100%%
11´́22%% 00´́55%% 33´́88%%
00´́7711%% 1166%%
RRPP⇒⇒7744%%
3377%% 3377%%
00´́4433%%
Figura V.2- Porcentajes de las distrofias de retina presentadas en este trabajo con respecto al total de casos españoles
estudiados hasta el momento (3936 casos; Ayuso C et al., Memoria final EsRetNet 2005).
3‐ GEN NDP
3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
En las familias presentadas en este trabajo, se identificaron seis mutaciones diferentes en el gen
NDP asociadas a dos fenotipos diferentes, Enfermedad de Norrie (ND) y vitreorretinopatía exudativa
familiar (VREF). La Enfermedad de Norrie es una displasia retiniana congénita que, en la mayoría de los
casos, produce ceguera desde el nacimiento. La vitreorretinopatía exudativa familiar ligada al cromosoma X
es un defecto del desarrollo caracterizado por vascularización incompleta de la retina periférica. Las formas
de VREF ligadas al cromosoma X se asocian a mutaciones en el gen NDP, aunque también se han descrito
formas autosómicas recesivas y autosómicas dominantes (Clevers H, 2004). De hecho, en el cromosoma
11q13-23 se han identificado dos loci implicados en FEVR autosómica dominante, que corresponden a los
genes Fzd4 (frizzled-4 gene) y LRP5 (Robitaille J et al., 2002; Toomes C et al., 2004). Recientemente se ha
observado que las proteínas Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor: la Norrina se une con
elevada especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5, para provocar
la activación de la vía Wnt. Este sistema de señalización desempeña un papel esencial en el desarrollo
vascular del ojo, del oído interno y del cerebelo (Xu Q et al., 2004).
Mediante el estudio molecular realizado en el gen NDP se identificaron dos nuevas mutaciones que
producen un codon de parada prematuro: p.Val89fsX101 que se produce “de novo” y p.Tyr120X (ver pág.
77). La consecuencia de estas alteraciones es una proteína truncada, que se asocia con un fenotipo más
severo de la enfermedad, en el que, además de problemas visuales, se presentan sordera neurosensorial y
133
V- Discusión
retraso mental de diferentes grados. De hecho, este tipo de mutaciones siempre se asocian a un fenotipo
ND (Wong F et al., 1993; Chynn E et al., 1996). Sin embargo, existen diversos ejemplos de alteraciones que
generan un cambio de aminoácido en la proteína y que también producen ND (www.hgmd.org).
En una de nuestras familias (ND-12) se identificó una mutación que afecta al sitio donador del
procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los intrones) del intrón 1 del gen NDP: IVS1+1G>A.
Este cambio se había descrito con anterioridad (Fuchs S et al., 1996), asociado a ND. Asimismo, nuestro
paciente presenta pérdida severa de visión y retraso mental.
Las mutaciones identificadas que provocan un cambio de aminoácido, únicamente causan pérdida
de visión en nuestros pacientes y se asocian con una forma menos severa de la enfermedad. Existen
algunos ejemplos de VREF ligada al cromosoma X debido a mutaciones en el gen NDP y, en todos los
casos, se deben a cambios que no generan una proteína truncada (Chen ZY et al., 1993; Fuchs S et al.,
1996; Johnson K et al., 1996; Torrente I et al., 1997; Shastry BS et al., 1997).
La mutación p.Arg121Gln identificada en la familia XLDM-46 se había descrito previamente, incluso
en otra familia española (Fuentes JJ et al., 1993). Ambas comparten haplotipos, lo que sugiere que
nuestros pacientes probablemente pertenezcan a otra rama de esta familia.
El cambio p.Lys104Asn, identificado en una familia gallega (ND-14), únicamente se ha descrito en este
trabajo y está asociado a VERF. La alteración p.Arg38Cys, detectada en dos de nuestras familias (ND-2,
ND-5), se había reportado previamente (Royer et al., 2003).
3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
En las dos familias portadoras de la mutación p.Arg38Cys, el análisis de los marcadores
microsatélites flanqueantes al gen NDP permitió identificar que compartían el mismo haplotipo, por lo que
se puede sospechar identidad por descendencia. En la figura IV.3 (ver pág. 80), se observa que el individuo
IV.1 perteneciente a la familia ND-2 difiere en el marcador DXS8090 (164) con respecto a los restantes
varones afectos y las mujeres portadoras de ambas familias (162). Observando el haplotipo de su madre
para ese marcador (III:2; 162 pb), se aprecia que se producido una repetición más del dinucleótido CA (164
pb), mostrando la inestabilidad de estas regiones genómicas (Jones MH & Nakamura Y, 1992).
Este cambio (p.Arg38Cys), descrito por primera vez por Royer G et al., se identificó en un varón
afecto de una familia francesa, pero no se encontró en el análisis realizado en población control en un total
de setenta y cinco cromosomas. La detección de esta mutación en una familia francesa y en nuestras dos
familias españolas sugiere la posibilidad de un efecto fundador en población del sur de Europa.
134
V- Discusión
3.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
Las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, a excepción del cambio IVS1+1G>A localizado
en el intrón 1, se producen en el dominio “cysteine-knot”, localizado entre los aminoácidos 32 y 133. Se
considera que esta región de la proteína desempeña un papel fundamental en las interacciones
neurológicas.
Exones 1 y 2 no traducidos Dominio “cysteine-knot”
Codon de parada prematuro
Altera la pauta de lectura
Cambio de aminoácido
Figura V.3- Representación esquemática de la estructura del gen NDP y de las mutaciones identificadas en nuestros
pacientes.
La mayor parte de las alteraciones descritas en el gen NDP se producen en este dominio, como las
mutaciones en el codon 121 [p.Arg121Trp (777C>T)] y [p.Arg121Gly (777C>G)], asociadas a VREF y ND,
respectivamente (Fuchs S et al., 1996; Zhu D & Maumanee H, 1994). Se han reportado diversas
mutaciones en este aminoácido, por lo que se puede asumir que debe desarrollar una función importante
en esta estructura de la proteína. La severidad de los fenotipos asociados a mutaciones en el codon 121
puede depender del tipo de alteración que se produzca.
Asimismo, se produce expresividad variable entre los pacientes de las familias en las que se
identificó el cambio p.Arg38Cys. En la familia ND-2, uno de los varones afectos presenta persistencia de
vítreo primitivo hiperplásico y se quedó ciego a los cinco años, mientras que su hermano padece
vitreorretinopatía exudativa y conserva buena visión en su ojo derecho. Este es un ejemplo de que una
mutación puede producir dos fenotipos diferentes, incluso dentro de la misma familia. La variabilidad
intrafamiliar se ha descrito en diversas enfermedades hereditarias, incluyendo retinopatías (Weleber RG et
al., 1993; Kondo H et al., 2003; Dharmaraj N et al., 2003).
De hecho, esta mutación produce un fenotipo ND en la familia francesa en la que se describió esta
alteración por primera vez (Royer et al., 2003). Sin embargo, este cambio se identificó en un varón
asintomático de la familia ND-5. En este paciente, se podría sospechar una situación de penetrancia
incompleta, no descrita con anterioridad en la literatura.
La variabilidad de expresión en varones afectos, en relación con las funciones cognitiva y auditiva,
así como en la edad de comienzo de los síntomas, sugieren que genes modificadores u otros factores
relacionados deben desempeñar un papel esencial, no bien definido todavía, en la modulación del fenotipo
de la enfermedad (Fuentes JJ et al., 1993).
135
V- Discusión
Una vez que se conoce que el binomio Norrina-Fzd4 interviene en la vía Wnt del desarrollo,
podemos sospechar que existen mutaciones más agresivas (como las que producen un codon de parada
prematuro) que alteran considerablemente la estructura de la proteína, especialmente si se producen en el
dominio “cysteine-knot”. En consecuencia, la unión ligando-receptor desaparece y la vía Wnt se interrumpe,
produciendo un defecto más severo en la vascularización retiniana.
4‐ GEN RS1
4.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
El estudio molecular del gen RS1, realizado en veintinueve familias, permitió identificar el defecto
genético responsable de enfermedad en veinte de ellas. Se detectaron un total de trece mutaciones
diferentes, cuatro de las cuales no se habían reportado previamente (p.Gln80X, p.Leu137Pro, p.Gln154Arg
y p.Glu215Val). La caracterización molecular de RS1 permitió determinar que las alteraciones no se
producen al azar, si no que se localizan en los exones 4, 5 y 6 del gen que codifican el dominio discoidín de
la proteína.
Codon de parada prematuro
Altera la pauta de lectura
Cambio de aminoácido
Péptido señal Dominio discoidín Dinucleótidos CG
Figura V.4- Representación esquemática de la estructura del gen RS1 y de las mutaciones identificadas en nuestros
pacientes.
Entre los trece cambios identificados, se ha observado que ocho de ellos (8/13; 61´5%) se
producen en dinucleótidos CG, que son secuencias consideradas como puntos calientes de mutación en el
genoma (Lutsenko E & Bhagwat AS, 1999). En RS1 existen veintiséis dinucleótidos CG, que representan
aproximadamente un 7´7% de la secuencia codificante del gen. Se analizaron todas las alteraciones
puntuales identificadas hasta ahora en RS1 (www.hgmd.org) y se observó que el 18´5% de ellas se
producen en estos dinucleótidos.
136
V- Discusión
El cambio p.Gln80X (XLRS-108), ocurre en un dinucleótido CG y se produce “de novo”, generando
una proteína truncada que carece de dominio discoidín. Asimismo, la mutación p.Glu72Lys se produce “de
novo” en la familia XLRS-43. De hecho, esta alteración se ha descrito en repetidas ocasiones en
poblaciones diferentes. Otro punto caliente de la secuencia codificante se sitúa en un tracto de seis
citosinas (posiciones nucleotídicas 574_579), en el que se produce la inserción de una citosina que
desplaza la pauta de lectura y genera una proteína anómala de sesenta y nueve aminoácidos más larga de
lo normal (p.His194fsX263). Esta inserción se ha descrito previamente en tres familias no relacionadas de
Austria, Reino Unido y Estados Unidos (The Retinoschisis Consortium, 1998).
Las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en pacientes
procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de novo” en el
gen RS1, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia. Esta situación
pone de manifiesto que se producen múltiples orígenes de la XLRS.
La sustitución más frecuente en nuestros pacientes con Retinosquisis, p.Gln154Arg, se identificó en
cinco familias no relacionadas entre sí (ver pág. 87). Esta mutación se describe por primera vez en este
trabajo y, a diferencia de los cambios anteriores, no se produce en un dinucleótido CG.
4.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
El análisis de los marcadores microsatélites realizado en las familias portadoras de la mutación
p.Gln154Arg permitió identificar que comparten un haplotipo común, por lo que se puede sospechar
identidad por descendencia. Teniendo en cuenta que únicamente se ha descrito otro cambio en este codon
(p.Gln154X; The Retinoschisis Consortium, 1998) y que esta alteración no se produce en un dinucleótido
CG, se puede sospechar que esta mutación se ha transmitido a partir de un ancestro común.
El cambio p.Glu72Lys se identificó en tres familias españolas y en una familia portuguesa. Esta
mutación tiene un efecto fundador en población finlandesa, en la que uno de cada tres pacientes con XLRS
presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). Sin embargo, en nuestras familias se trata de una
mutación recurrente, quizá porque se produce en un dinucleótido CG, pero no fundadora, ya que los
pacientes presentan haplotipos diferentes entre sí. De hecho, en la familia XLRS-43 esta mutación se
produce “de novo” en una mujer portadora que tiene dos gemelos afectos (ver pág. 88).
137
V- Discusión
4.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
Independientemente de la heterogeneidad de las mutaciones, los pacientes presentan
manifestaciones clínicas similares, con cierta variabilidad intrafamiliar en la edad de comienzo y en la
progresión. Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer con síntomas clínicos (ver
pág. 90). Aunque se trata de situaciones excepcionales, en la literatura se han descrito casos de mujeres
con Retinosquisis producida por consanguinidad (Forsius H et al., 1973; Francois P et al., 1989; Mendoza-
Londono R et al., 1999). En el estudio molecular de RS1 realizado por Mendoza-Londono R et al., se
describe una mutación en homozigosis en las mujeres afectas como causa de la enfermedad. En nuestra
familia, los padres de la paciente no están emparentados entre sí, por lo que su fenotipo se podría explicar
por una inactivación sesgada del cromosoma X o por una alteración en otro gen responsable.
El estudio molecular del gen RS1 permite establecer que el espectro de mutaciones es amplio y las
manifestaciones oftalmológicas son variables. Se ha observado la agudeza visual de los pacientes
disminuye con la edad y que la maculopatía empeora a partir de los treinta años, pero no existe correlación
entre el tipo de mutación y la severidad de la enfermedad. De hecho, se aprecia variación en las
manifestaciones clínicas entre varones afectos de la misma familia.
Estudios recientes con modelos estructurales del dominio discodín, permitieron determinar que las
mutaciones en RS1 pueden inhibir la secreción de la proteína, alterar su oligomerización o interferir en su
función (Wang T et al., 2006). Los autores concluyeron que se produce retención intracelular de la mayoría
de las proteínas mutantes, lo que explicaría porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la
mutación responsable, es decir, no existe correlación entre el genotipo y el fenotipo.
Por tanto, la identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el
diagnóstico clínico y facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite
predecir la evolución (prognosis) del paciente.
5‐ GEN ABCA4
5.1- IMPLICACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE STARGARDT
5.1.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO Las diversas mutaciones en el gen ABCA4 se han asociado con diferentes distrofias de retina,
aunque en la etiología de la STGD es donde desarrollan un papel decisivo. ABCA4 consta de cincuenta
exones, con una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases, por lo que la detección de mutaciones
en este gen supone un reto. Para el cribado mutacional previo de nuestros pacientes, se utilizó el
microarray de genotipado ABCR400 diseñado por Asperbio (Jaakson K et al., 2003) y las mutaciones
detectadas se confirmaron mediante secuenciación automática.
138
V- Discusión
Para evaluar la eficiencia del microarray, se estudiaron un total de setenta y cuatro familias
diagnosticadas de STGD. En nuestra muestra, se identificaron ochenta y un alelos potencialmente
asociados a enfermedad, lo que supone una tasa de detección de 54´7% (ver pág. 97). Se identificaron
ambos alelos mutantes en el 39´2% (29/74) de los pacientes, un alelo mutante en el 31´1% (23/74) y no se
identificaron mutaciones en 29´7% (22/74) restante de los casos.
Estos porcentajes son simililares a los identificados por Jaakson K et al., ya que en sus series de
pacientes el microarray detecta entre el 54-56% de los alelos asociados a enfermedad, en pacientes con
Stargardt elegidos al azar y que no han sido analizados previamente, dependiendo de la composición étnica
de la muestra y del grado de caracterización clínica y molecular de la misma. En su estudio incluyen
pacientes europeos procedentes de Italia (Nápoles), Países Bajos (Nijmegen) y Eslovenia (Ljubljana) y
pacientes norteamericanos reclutados en dos centros (Harkness Eye Institute, Universidad de Columbia,
Nueva York; National Eye Institute, NIH, Bethesda, MD). La distribución de los alelos mutantes en estas
poblaciones, así como en población española, se muestra en la siguiente tabla:
Pacientes STGD Cromosomas analizados
Alelos asociados a
enfermedad (%)
Alelos complejos Alelos más frecuentes Distribución
de los alelos Valores medios
Univ. Columbia Nueva York 120 68 (56´7%) 10
p.Gly1961Glu 10% p.Gly863Ala 4´2% IVS38-10T>C 4´2%
2- 38´3% 1- 36´7% 0- 25´0%
NEI/NIH 40 24 (60%) 5 IVS38-10T>C 14´3% p.Gly1961Glu 7´1%
2-45´0% 1- 30´0% 0- 25´0%
2- 41´6% 1- 33´4% 0- 25´0%
Italia (Nápoles) 62 34 (54´8%) 0 p.Gly1961Glu 12´9% IVS35+2T>C 9´7%
2- 32´2% 1- 45´2% 0- 22´6%
Países Bajos (Nijmegen) 36 20 (55´6%) 4
p.Gly1961Glu 11% p.Gly863Ala 8´3% p.Val256Val 8´3%
2- 38´9% 1- 33´3% 0- 27´8%
Eslovenia (Ljubljana) 28 15 (53´6%) 0
p.Gly1961Glu 21´4% p.Arg681X 7´1% p.Gln1412X 7´1%
2- 28´6% 1- 50´0% 0- 21´4%
2- 33´3% 1- 42´8% 0- 23´9%
España 148 81 (54´7%) 6 p.Arg1129Leu 22´4% p.Gly1961Glu 8´4% c.2888delG 7´4%
2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%
2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%
Tabla V.1: Eficiencia de detección de mutaciones del microarray ABCR400 en población europea y norteamericana
(Jaakson K et al., 2003) y en población española.
Según estos datos, se detectaron ambos alelos mutantes en un porcentaje más elevado de
pacientes españoles que en la media de pacientes europeos reportados por Jaakson K et al. Sin embargo,
el porcentaje de pacientes en los que no se han identificado alelos mutantes también fue más elevado
(29´7% en España frente al 23´9% europeo y el 25´0% norteamericano), indicando la inclusión de
fenocopias que no se pueden evitar por completo debido a los medios de selección, ya que los pacientes
son remitidos por diversos oftalmólogos entre los cuales no se establece un protocolo común de diagnóstico
para STGD. Se ha observado que en aquellos pacientes que se han caracterizado clínicamente en detalle,
se identifican ambos alelos mutantes.
139
V- Discusión
Además de la eficiencia obtenida, el microarray es altamente sensible y específico, ya que en un
total de doscientos cincuenta y ocho alelos analizados (=129 pacientes ABCA4) únicamente se identificaron
un falso positivo (no específico) y un falso negativo (no sensible), que determinan una
especificidad/sensibilidad del 99´6% (ver pág. 97).
La secuenciación automática del gen ABCA4 realizada en nueve pacientes STGD en los que se
había detectado previamente un alelo mutante, permitió identificación del segundo alelo asociado a
enfermedad en seis de ellos (6/9), que supone una tasa de detección total (microarray+secuenciación) de
58´8% (ver pág. 99). En consecuencia, la distribución de los alelos es la siguiente:
Pacientes STGD Cromosomas analizados
Alelos asociados a enfermedad (%)
Distribución de los alelos ABCR400
Distribución de los alelos ABCR400 + secuenciación
España 148 81 (54´7%) 2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%
2- 47´3% 1- 23´0% 0- 29´7%
Tabla V.2: Eficiencia de detección de mutaciones mediante el microarray ABCR400 y mediante la combinación de
métodos ABCR400+secuenciación automática, en población española.
El análisis realizado con MLPA en los tres pacientes STGD restantes, no detectó ninguna alteración
que implicase deleción o duplicación de material genético que pudiese representar el segundo alelo
responsable de enfermedad. Por tanto, únicamente la secuenciación automática de todas las posiciones
nucleotídicas del gen ABCA4 permite una mayor tasa de detección de mutaciones frente al microarray de
genotipado.
Además de la diferencia en la tasa de detección de mutaciones entre las poblaciones estudiadas,
las frecuencias de los alelos mutantes también son distintas. La mutación más frecuente en población
europea es el cambio p.Gly1961Glu. En los pacientes españoles aparece con una frecuencia del 8´41%,
que la sitúa en el rango observado en otras poblaciones europeas, a excepción de Eslovenia, en la que
este cambio aparece con mayor frecuencia (21´4%). Fumagalli A et al. analizaron los polimorfismos del
exón 42 de ABCA4 y definieron un haplotipo común, en el que p.Gly1961Glu se asocia con tres
polimorfismos de único nucleótido (c.5836-43A>C, c.5836-11A>G y c.5844A>G), sugiriendo un origen
común a partir de un mismo cromosoma ancestral.
En nuestros pacientes STGD, el alelo p.Gly1961Glu E siempre aparece asociado al haplotipo c.5682G>C,
c.5814A>G, c.5843CA>TG y c.5844A>G, que así mismo puede sugerir la hipótesis de un origen ancestral
común.
140
V- Discusión
Sin embargo, el alelo mutante más frecuente en nuestra muestra de pacientes STGD es el cambio
p.Arg1129Leu, que representa el 22´4% de los alelos asociados a enfermedad. La prevalencia de esta
mutación en pacientes norteamericanos es del 1% (Webster AR et al., 2001). Este alelo siempre aparece
asociado a un polimorfismo localizado en el intrón 33 del gen (IVS33+48C>T), por lo que se puede
sospechar un origen común en población española. En un 35´7% de las familias, esta mutación también
aparece asociada al polimorfismo p.His423Arg (c.1268A>G), aunque en un 57´1% no se ha podido
establecer la fase. Considerando que p.Arg1129Leu y IVS33+48C>T aparecen en desequilibrio de
ligamiento y pueden indicar un posible origen común, el cambio p.His423Arg ha debido producirse
posteriormente como un evento mutacional recurrente, ya que en las familias en las que la que la mutación
p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el polimorfismo IVS33+48C>T también aparece en homozigosis,
pero el cambio p.His423Arg se identifica en heterozigosis. El hecho de que en la familia ARDM-78 el
cambio p.His423Arg no aparece, pero si el alelo complejo p.Arg1129Leu + IVS33+48C>T, refuerza esta
hipótesis (ver pág. 120).
Alelo mutante Población STGD Frecuencia alélica Referencia
Eslovenia 21´4% Jaakson K et al., 2003
Italia 12´9% Jaakson K et al., 2003
Italia 10% Fumagalli A et al., 2001
Alemania 12% Rivera A et al., 2000
Países Bajos 11% Jaakson K et al., 2003
p.Gly1961Glu
España 8´4% Este trabajo Países Bajos /
Alemania 15% Maugeri A et al., 1999
Reino Unido 3´6% Papaioannou M et al., 2000
Francia 2´8% Maugeri A et al., 2002
España 1´87%* Este trabajo
España 3% Paloma E et al., 2001
p.Gly863Ala
Italia 0% Simonelli F et al., 2000
p.Arg1129Leu España 22´4% Este trabajo
Tabla V.3: Frecuencia alélicas de las mutaciones más prevalentes en ABCA4 en pacientes STGD europeos.
*: Este cambio forma dos alelos dobles mutantes, [p.Gly863Ala +p.Arg1055Trp] y [p.Gly863Ala + p.Arg 943GlnQ]; cada
uno de ellos aparece con una frecuencia del 0´93%.
En el gen ABCA4 se producen dos o más alteraciones en cis, denominadas “alelos complejos”,
reportadas por primera vez por Shroyer NF et al., 2000. En nuestros pacientes, se identificaron seis alelos
complejos, cinco dobles mutantes y uno triple mutante (ver pág. 109). Cabe destacar que las mutaciones
p.Arg1108Cys y p.Arg2107His únicamente aparecen combinadas como un alelo doble mutante en dos
familias (ver pág. 95). En otras cuatro familias, estas alteraciones se asocian a un tercer cambio (R152Q) y
en una de ellas este alelo triple mutante se produce en homozigosis (ver pág. 95).
141
V- Discusión
El alelo [p.Arg152Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His] puede haber evolucionado a partir del alelo
[p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], por evento mutacional recurrente. De hecho, son los dos alelos complejos
más prevalentes entre nuestros pacientes. El análisis de los marcadores microsatélites muestra que los
pacientes comparten un haplotipo similar, incluso el paciente de la familia ARDM-110 (doble mutante) tiene
un haplotipo idéntico al que muestran las familias ARDM-14 (alelo materno), ARDM-17 y ARDM-137 (triples
mutantes). Este hecho sugiere que la mutación p.Arg152Gln se ha producido recientemente, ya que los
cambios/polimorfismos de único nucleótido tienen una tasa de mutación mucho menor que los
microsatélites, que son más inestables (Morral N et al., 1994).
La mayoría de las mutaciones que se producen en el gen ABCA4 son puntuales, cambia un
nucleótido determinado que origina diversos tipos de cambios a nivel de la proteína. El cambio más
frecuente son las mutaciones que provocan cambio de aminoácido, seguidas de los cambios que alteran la
pauta de lectura. Esto puede ser debido a que al copiar un gen de tamaño considerable como ABCA4, se
produzca deslizamiento (en inglés, slippage) de la polimerasa y se introduzcan nucleótidos de más o de
menos. Las alteraciones menos frecuentes son las que provocan un codon de parada prematuro y las que
alteran el procesamiento de los intrones, que no dejan de ser mutaciones puntuales que generan un codon
específico (de parada) o que ocurren en un lugar concreto (sitios aceptores/donadores de procesamiento),
respectivamente. Sólo dos mutaciones se producen “de novo” (ARDM-40, ARDM-81), a excepción de la
isodisomía parcial de la familia ARDM-61, que sugiere un elevado número de portadores sanos en nuestra
población.
5.1.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO El estudio familiar realizado en cuarenta y nueve familias STGD en las que se identificó al menos un
alelo mutante, permitió determinar que los haplotipos siempre cosegregan con la enfermedad (ver pág.
113). En aquellas familias en las que se pudo excluir ABCA4 como gen responsable, no se identificaron
pacientes que fuesen portadores de mutaciones por azar. Este hecho sugiere que en aquellas familias con
un alelo mutante identificado y que cosegregan, debe existir un segundo alelo mutante. Por tanto, sería
recomendable utilizar un segundo método de cribado que permita detectar nuevas mutaciones, como el
dHPLC, de mayor sensibilidad que métodos anteriores como SSCP y DGGE (Stenirri S et al., 2004).
El análisis de los marcadores microsatélites llevado a cabo en las familias con el alelo
p.Arg1129Leu puede sugerir que esta mutación tenga un origen común. Los microsatélites o repeticiones
cortas en tándem (STR, Short Tandem Repeats) resultan útiles para observar los cromosomas que portan
la mutación p.Arg1129Leu, ya que la variabilidad de los alelos en estos loci se produce principalmente por
adiciones o deleciones de repeticiones de nucleótidos, debido al deslizamiento de la polimerasa (Weber JL,
1990).
142
V- Discusión
En las familias p.Arg1129Leu, se observó que un 50% tienen el haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu -
206] (ver pág. 121). Por lo general, en los análisis de parsimonia (no realizados en este trabajo), se
considera que el alelo más antiguo en: 1) el más frecuente, 2) el que da lugar a un mayor número de alelos
diferentes, 3) el que tiene un mayor número haplotipos asociados. Asumiendo estas premisas, lo esperable
es que a partir del haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu -206], se haya generado el haplotipo [182-146-
P.Arg1129Leu-188] y, finalmente, el haplotipo [172-146-P.Arg1129Leu-188], como se muestra en la figura
anterior. El deslizamiento (en inglés, slippage) en un alelo de uno de los tres loci (microsatélites) es el
mecanismo que genera más haplotipos diferentes (Morral N et al., 1994).
118822 114466
Figura V.5: Posible evolución de los haplotipos asociados al alelo mutante p.Arg1129Leu (c.3386G>T).
El número de cromosomas presentados en este trabajo es muy limitado, por lo que no se puede
realizar un estudio sobre el origen, evolución y dispersión de la mutación p.Arg1129Leu. Sin embargo, su
elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD en población española y la similitud de los
haplotipos puede sugerir un origen común.
118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT118888
117722 114466
cc..33338866GG>>TT118888
118822 114466
cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066
cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066
118822 114466 cc..33338866GG>>TT118888
117722 114466 cc..33338866GG>>TT118888
143
V- Discusión
5.2- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA DE CONOS Y BASTONES AUTOSÓMICA RECESIVA
5.2.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO En nuestra muestra de pacientes DCB, se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4 en
seis pacientes (6/28; 21´4%), un alelo mutante en cuatro pacientes (4/28; 14´3%) y no se identificaron
mutaciones en los restantes dieciocho pacientes (18/28; 64´3%). Por tanto, se ha detectado al menos un
alelo mutante en diez de las veintiocho familias, que representa un 35´7% de los casos. Este porcentaje de
detección es superior que el 33% descrito por Klevering BJ et al., 2004. Sin embargo, las diferencias entre
ambas poblaciones no fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05). De las seis familias en las se
identificaron ambos alelos mutantes, en cuatro de ellas las mutaciones se producen en homozigosis
(ARDM-79, ARDM-86, ARDM-126 y RP-267), dos de ellas son consanguíneas (ARDM-86, ARDM-126).
El alelo asociado a enfermedad más prevalente fue el cambio c.2888delG (6/16), representando el
37´5% de todos los alelos mutantes identificados. Este cambio es el tercer alelo patológico más frecuente
de la muestra de pacientes estudiados (ver pág. 110).
En este trabajo, el estudio clínico evolutivo en la familia ARDM-79 permitió modificar el diagnóstico
de la probandus de STGD a DCB. El hecho de que en nuestros pacientes la mutación c.2888delG está
asociada a un DCB, tanto en homozigosis como en heterozigosis, sugiere que este cambio debe ser
considerado un alelo severo asociado a enfermedad. El alelo c.2888delG aparece en heterozigosis,
constituyendo un alelo doble mutante en las familias ARDM-133 y ARDM-176, que portan las mutaciones
[c.2888delG +p.Leu11Pro] y [c.2888delG + p.Leu2060Arg], respectivamente. Esto es importante ya que los
pacientes que portan este cambio pueden diagnosticarse como STGD en etapas tempranas de la
enfermedad y posteriormente evolucionar a un fenotipo DCB. De hecho, debe tenerse en cuenta
especialmente en las familias ARDM-15 y ARDM-22 (que porta el mismo genotipo que la familia ARDM-
176), actualmente clasificadas como STGD (ver pág. 95). La edad de comienzo de la enfermedad en estos
pacientes se produce entre los ocho-doce años y padecen ceguera nocturna en torno a los dieciocho años
(ver págs. 124-125).
En las restantes familias DCB, únicamente se detectó un alelo patológico que en todos los casos
produce un cambio de aminoácido en la proteína (ver pág. 102). En la familia ARDM-99, en la que
previamente se había identificado un alelo mutante, no se identificó el segundo alelo responsable de
enfermedad tras las secuenciación de la región exónica completa y análisis con MLPA. Estos resultados
sugieren que el paciente sea portador de mutación en ABCA4 por azar, ya que no se pudo realizar el
estudio familiar, o que puedan existir mutaciones en zonas no codificantes del gen que no han sido
analizadas, como el promotor o los intrones.
144
V- Discusión
5.2.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO El análisis de haplotipos realizado en aquellas familias en las que se identificó al menos uno de los
alelos mutantes mostró cosegregación con la enfermedad. En dos familias este estudio permitió excluir el
gen ABCA4 (ver pág. 115), sugiriendo la existencia de otro gen responsable. En estas familias excluidas no
se identificaron alelos mutantes, lo que descarta que alteraciones en este gen puedan ejercer algún efecto
modulador o regulador sobre el fenotipo del paciente.
5.3- IMPLICACIÓN EN LA RETINOSIS PIGMENTARIA AUTOSÓMICA RECESIVA
5.3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO
En las diecisiete familias RPAR estudiadas, se identificaron cuatro con un alelo mutante, de las
cuales una fue excluida como ligada a ABCA4 por el análisis familiar (3/17; 17´6%). Este porcentaje de
detección es más elevado que el 5% descrito por Klevering BJ et al., 2004 y que el 16% descrito por
Wiszniewski W et al., 2005. Sin embargo, las diferencias entre nuestra serie de pacientes y las series
reportadas por ambos autores son fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05).
En la literatura, se describe que los pacientes con ambos alelos mutantes identificados en ABCA4
presentan pérdida severa de la función visual, atrofia extensa y respuestas abolidas en el ERG. No
obstante, al no haberse identificado los dos alelos mutantes en ABCA4 en la mayoría de las familias
estudiadas, no es posible establecer en nuestra serie un fenotipo RPAR asociado específicamente a este
gen, ni conocer cuáles son las mutaciones causantes de dicho fenotipo.
5.3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO
En una de las cuatro familias con un alelo mutante en ABCA4, el análisis de haplotipos permitió
descartar su implicación en la patología, sugiriendo que en este paciente la causa primaria de la
enfermedad no es la mutación identificada en este gen (ARRP-700, ver pág. 116).
En RPAR la heterogeneidad genética es enorme. En 4/17 familias, la causa genética
aparentemente es detectada en ABCA4, pudiendo tener mutación(es) en cualquiera de los genes
candidatos conocidos u otros. Incluso en los casos con aparente cosegregación (3/17), pueden existir otras
causas genéticas. Recientemente, se ha localizado un locus en 1p13.3-p21.2 situado a 4´9 cM (7´1 Mb) de
ABCA4, en una familia pakistaní (Zhang Q et al., 2005). La identificación y el estudio de este gen podrían
ayudar a dilucidar la diversidad fenotípica de la RPAR localizada en esta región, ya que quizá las
alteraciones en este nuevo gen podrían ser responsables de este fenotipo más agresivo en nuestros
pacientes.
145
V- Discusión
5.4- IMPLICACIÓN EN OTRAS DISTROFIAS DE RETINA
5.4.1- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA MACULAR AUTOSÓMICA DOMINANTE
Las familias con herencia autosómica dominante se incluyeron en este trabajo, porque no se puede
descartar que progenitor e hijos puedan tener mutaciones en ambas copias del gen ABCA4 y que
compartan un alelo mutante común.
En estas familias con ADDM, se identificaron dos pacientes con un alelo mutante (ver pág. 107). En
la familia ADDM-59, los haplotipos excluyeron el gen ABCA4 como responsable de la patología. En la
familia ADDM-92, se identificó el cambio p.Ile156Val (reportado como asociado a un fenotipo STGD por
Papaioannou M et al., 2000), que no mostró cosegregación con los haplotipos. El análisis mutacional
realizado reveló un total de seis haplotipos diferentes identificados en las tres mujeres afectas (III:5, IV:2,
IV:3), descartando las mutaciones en ABCA4 como causa común a los fenotipos DR observados en esta
familia:
- en la paciente con STGD (IV:3) se identificaron ambos alelos mutantes, que son muy probablemente la
causa de su enfermedad;
- en una paciente con DM (IV:2) se identificó un alelo mutante distinto, que posiblemente se trate de una
asociación fortuita;
- en la tercera paciente con DM (III:5), no se identificaron alelos mutantes en ABCA4, por lo que la causa
genética de su enfermedad es desconocida;
- por último, se identificó un alelo mutante -diferente a los anteriores- en una mujer sana (III:6).
Por tanto, en esta familia se puede concluir que no existe una causa genética común a las distintas DR
presentes en las tres afectas, existiendo un caso típico de STGD con ambas mutaciones identificadas en
ABCA4 y dos pacientes con distrofia macular de otra causa genética. No obstante, no se puede descartar
que el cambio p.Ile156Val desarrolle un posible efecto modulador sobre el fenotipo DM de la probandus
(IV:2).
5.4.2- IMPLICACIÓN EN FAMILIAS CON FENOTIPO DIVERSO
Entre el total de familias en las que se realizó el estudio mutacional del gen ABCA4, se identificaron
tres que resultaron peculiares debido a que los diferentes afectos manifestaban distintos fenotipos,
atribuibles a mutaciones en este gen.
En la familia RP-280 se pudieron confirmar dos diagnósticos clínicos; en el hermano con STGD se
identificó la mutación p.Asn1805Asp en homozigosis en el gen ABCA4, mientras que en la hermana
diagnosticada de RP con preservación del epitelio paraarteriolar se detectó una mutación en el gen CRB1.
Las mutaciones en este gen se transmiten con un patrón autosómico recesivo, por lo que es muy probable
que exista un segundo alelo mutante en CRB1 (no detectado hasta el momento) que justifique su
enfermedad. Esta familia en la que existen distintos fenotipos compatibles con alteraciones en ABCA4,
pone de manifiesto que, independientemente de las combinaciones de alelos que se produzcan
146
V- Discusión
(moderado+severo, severo+severo, etc.), puede existir más de un gen relacionado con las distrofias
retinianas implicado en las patologías familiares (en este caso, CRB1).
En trabajos previos en los que se identificaron disomías uniparentales completas para el cromosoma 1, se
estableció, por un lado, que no deben existir genes improntados y, por otro lado, que el número total de
mutaciones recesivas por cromosoma en un individuo concreto debe ser bajo. Esta afirmación se realizó en
base a que el paciente no presentaba anomalías adicionales a la enfermedad en cuestión causada por una
mutación en homozigosis en un gen determinado (Thompson DA et al., 2002). Sin embargo, en nuestra
familia se han producido dos enfermedades oftalmológicas recesivas, con mutaciones en sendos genes
localizados en el cromosoma 1.
En la familia RP-315 se observa una herencia autosómica dominante, ya que la madre y sus dos
hijos presentan problemas visuales aunque exhiben fenotipos distintos. El análisis de haplotipos mostró que
ambos hermanos comparten uno de los cromosomas 1 paternos, pero cada uno ha heredado un
cromosoma 1 materno diferente (ver pág. 118). Por tanto, el único alelo mutante detectado (p.Gly1961Glu
materno) no es el causante de la enfermedad, al menos en la hija, que además presenta Distrofia Macular
de Best, normalmente asociada a mutaciones en el gen VMD2. Si éste fuese el gen responsable de la
retinopatía en la hija y teniendo en cuenta que el padre era sano, podría haberse producido una mutación
“de novo” que explicase la patología. Por tanto, los haplotipos podrían cosegregar con ABCA4 únicamente
en la madre y en el hijo y sus diferentes manifestaciones clínicas se podrían explicar en función de sus
respectivos alelos mutantes no identificados (Figura IV.34, barras azul y roja).
Al igual que ocurre en la familia ADDM-92 con el alelo mutante p.Ile156Val, es probable que el alelo
p.Gly1961Glu se produzca por asociación fortuita y que la patología se deba a otro gen responsable.
Por último, en la familia RP-532 se observó que el alelo p.Arg1129Leu y los haplotipos
cosegregaban con la enfermedad. Este alelo únicamente se ha visto asociado a STDG en los pacientes
presentados en este trabajo (ver págs. 95-96). Los tres hermanos comparten los mismos haplotipos, sin
embargo, las dos hermanas presentan un fenotipo más agresivo de DCB. Por tanto, es posible que la
patogénesis se deba a un alelo severo aún no identificado y que en principio la enfermedad se manifieste
como STGD y posteriormente evolucione a DCB, como ocurre con el alelo c.2888delG en las familias
ARDM-79 y ARDM-86, comentadas anteriormente (ver pág. 144).
5.5- IMPLICACIÓN EN REORGANIZACIONES CROMOSÓMICAS
A lo largo del estudio mutacional del gen ABCA4 realizado en ciento veintinueve familias, se
identificó una paciente perteneciente a la familia ARDM-61 con la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis.
Sin embargo, el patrón de herencia no fue autosómico recesivo, ya que el alelo en heterozigosis
únicamente se detectó en su padre. La paternidad se confirmó mediante marcadores microsatélites, por
tanto, la paciente podía presentar isodisomía parcial paterna en el cromosoma 1 o un cariotipo anómalo
debido a una microdeleción materna en la región 1p, causando hemizigosidad para el locus ABCA4.
147
V- Discusión
Se realizaron cariotipos convencionales y de alta resolución que no mostraron anomalías
cromosómicas estructurales. El análisis de dosis realizado con MLPA confirmó la presencia de dos copias
del gen ABCA4, sugiriendo isodisomía parcial paterna. La evolución y severidad de la enfermedad fueron
similares a los mostrados por otros pacientes con el alelo p.Arg1129Leu en homozigosis, confirmando que
este alelo mutante produce un efecto moderado en la patogénesis de la STGD.
Los hallazgos moleculares indicaron que la paciente ha heredado dos copias del cromosoma 1, una
de cada progenitor, a excepción de la región isodisómica identificada en el brazo corto del homólogo
materno. Por tanto, la recombinación ha sido postzigótica (mitótica). Este mecanismo se puede deber a una
recombinación producida en una célula trisómica, seguida de un rescate de la trisomía. También puede
ocurrir por pérdida del cromosoma 1p materno seguida de duplicación del cromosoma 1p paterno.
++
XX
++
XX
Profase (Meiosis I)
Cromosomas homólogos paternos
1ª división meiótica (Meiosis I)
2ª división meiótica (Meiosis II)
Gametogénesis normal No disyunción en Meiosis II⇒ Isodisomía
Isodisomía parcial Isodisomía parcial
Homólogo materno
Homólogo materno
Recombinación (mitótica) en célula
trisómica y rescate de trisomía
⇒Pérdida del 1p
materno y duplicación del 1p paterno
Figura V.6: Posibles mecanismos que producen isodisomía parcial o segmentaria.
148
V- Discusión
La recombinación postzigótica en una célula diploide puede provocar mosaicismo con isodisomía
parcial. No obstante, no se pudo determinar este mecanismo en la paciente ya que únicamente se analizó
el ADN extraído a partir de linfocitos de sangre periférica. Es menos frecuente que se produzca un rescate
de trisomía, ya que las trisomías del cromosoma 1 son extremadamente infrecuentes y los fetos portadores
de estas aneuploidías mueren antes de implantarse (Field LL et al., 1998). Si éste hubiese sido el
mecanismo, ha debido producirse prácticamente durante la primera división celular del zigoto, produciendo
la pérdida completa de las células trisómicas.
También se ha identificado una región en 1q en la que no se puede distinguir entre una segregación
normal (biparental) o heterodisomía materna (ver pág. 114, Figura IV.31). No obstante, que se produzca
este reordenamiento es bastante improbable y quizá esta segregación se deba a que ambos padres
comparten uno de los dos alelos de estos marcadores. Aunque los marcadores microsatélites utilizados
presentan elevada heterozigosidad, es posible que presenten un alelo muy prevalente entre la población
española, que explique que ambos progenitores compartan uno de los dos alelos en un total de catorce
marcadores (D1S2878-D1S2785).
Otros ejemplos de disomía uniparental en el cromosoma 1 se han reportado previamente, tanto de
origen paterno como materno (Pulkkinen L et al., 1997; Gelb BD et al., 1998; Takizawa Y et al., 1998;
Dufourcq-Lagelouse R et al., 1999; Takizawa Y et al., 2000; Rivolta C et al., 2002; Thompson DA et al.,
2002). Entre ellos, existen dos casos con degeneración retiniana; por un lado, un paciente con isodisomía
uniparental completa que produce homozigosidad para una mutación en el gen RPE65 (Thompson DA et
al., 2002), por otro lado, un paciente con heterodisomía uniparental e isodisomía parcial, en el que se
identifica una mutación en homozigosis en el gen USH2A (Rivolta C et al., 2002). En relación con
enfermedades oftalmológicas, también se han descrito casos de isodisomía uniparental en otros
cromosomas (Thompson DA et al., 2002, Pentao L et al., 1992).
Una de las consecuencias de este tipo de reordenamientos es la alteración de la impronta
genómica (Engel E, 1980). Al igual que ha ocurrido en nuestro caso, los pacientes que presentan ambos
cromosomas 1 derivados de un solo progenitor se identificaron por la evolución de sus respectivas
enfermedades recesivas, sin mostrar anomalías genéticas adicionales. Del estudio de estos casos, se ha
descrito que no deben existir genes improntados en el cromosoma 1 que generen alteraciones en el
fenotipo (Thompson DA et al., 2002). No obstante, se debe tener en cuenta que estos reordenamientos
aumentan el riesgo de padecer enfermedades con herencia autosómica recesiva. Por tanto, familias con
retinopatías recesivas pueden tener descendencia afecta, con una mutación en homozigosis, incluso
cuando uno de los progenitores es portador sano de un alelo mutante y el otro progenitor presenta alelos
silvestres.
149
V- Discusión
cas únicamente representan una pequeña fracción de todos los alelos
utantes asociados a ABCA4. Hasta ahora, supone el reordenamiento estructural de mayor tamaño en el
ue se ha visto involucrado este gen (www.hgmd.org). En los casos en los que se identifican mutaciones en
omozig
s con diferentes distrofias de retina ha
ermitido establecer que las alteraciones en este gen son responsables del fenotipo STGD y DCB. Sin
barg
e produce en torno a la segunda década de vida. Cuando esta variante aparece combinada con
tro alelo en trans (doble heterozigoto), se observa que el comienzo de los síntomas no es tan homogéneo
y varía mucho de unos pacientes a otros, por lo que el desarrollo de la enfermedad debe estar determinado
por la patogenidad del otro alelo. Este hecho podría explicar que los pacientes que presentan en trans
Un patrón de herencia no mendeliano para el gen ABCA4 se ha descrito previamente, en un
paciente que presentaba retinosis pigmentaria severa causada por una mutación en homozigosis que
alteraba el procesamiento (1938-1 G>A). Los autores especularon que esta alteración se debía a una
deleción del locus materno, sin embargo, no se pudo comprobar (Rozet JM et al., 1999). Es posible que la
segregación de este alelo se haya producido por disomía uniparental como en nuestra paciente. En este
caso, el análisis con la técnica de MLPA podría determinar el número de copias del locus ABCA4 en el
probandus.
Hasta el momento, la isodisomía parcial del cromosoma 1p, como se muestra en nuestro caso, no
se ha descrito previamente. Este hallazgo tiene una consecuencia importante en lo que se refiere al consejo
genético de la paciente; como el riesgo de recurrencia de disomía uniparental parcial es muy bajo, el riesgo
de que sus hermanos y su futura descendencia padezcan STGD es prácticamente inapreciable.
Este estudio, que forma parte del análisis mutacional realizado en setenta y cuatro familias STGD
indica que las alteraciones genómi
m
q
h osis, es recomendable realizar un análisis de haplotipos para descartar una posible disomía
uniparental. Además de la detección de la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis, la información de
homozigosidad de dos polimorfismos intragénicos obtenida mediante el microarray contribuyó a la
sospecha de una no segregación del alelo materno.
5.6- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
El análisis molecular del gen ABCA4 realizado en paciente
p
em o, su implicación en otras retinopatías como la RPAR o la ADDM no es tan evidente, de hecho, en
algunas de estas familias se ha observado que la presencia de alelos mutantes en ABCA4 no cosegrega
con la enfermedad o se produce por asociación fortuita. Este hecho se puede deber a la prevalencia de
alelos mutantes que existe en población control.
Los pacientes con STGD y DCB en los que se han identificado ambos alelos mutantes se han
agrupado en función de la combinación de alelos que exhiben y de la edad de comienzo de la enfermedad
(ver págs. 123-125). De esta manera, se ha observado que el alelo p.Arg1129Leu siempre aparece
asociado a un fenotipo STGD y tiene un efecto moderado en la patogénesis, ya que el comienzo de los
síntomas s
o
150
V- Discusión
al nes más severas (alteran el procesamiento de los intrones -ARDM-76- o que generan un codon de
parada prematuro -ARDM-78-) presenten disminución de la agudeza visual en la primera década de vida.
En los pacientes que presentan alelos complejos, dobles y triples mutantes, también se observa un
desarrollo temprano de la enfermedad (pág. 124). Las excepciones se producen en las familias ARDM-138
y ARDM-12. En la ARDM-138, un comienzo más tardío se podría explicar porque el alelo complejo
p.Gly863Ala
teracio
+p.Arg943Gln se ha descrito como una mutación de efecto patológico limitado (Sun H et al.,
000).
n el ca
ugeriría un
fecto patológico considerable. Cabe destacar que este paciente es de edad avanzada (76 años) y es
osible
ue manifiestan síntomas a partir de los ocho años de
dad (ARDM-38, ARDM-40, ARDM-90; ver pág. 124), que portan un alelo que altera considerablemente la
roteína (4739 del T, Q1315X y IVS22 -2A>T, respectivamente).
iente de la familia ARDM-22 (diagnosticada como STGD)
resenta el mismo genotipo que la paciente perteneciente a la familia ARDM-176 (diagnosticada como
DCB). E
2
E so del paciente perteneciente a la familia ARDM-12, la enfermedad comienza de forma tardía, en
torno a la cuarta década de vida (38 años). Se conoce que el cambio p.Gly1961Glu se considera un alelo
de efecto moderado, pero se desconoce cuál puede ser el efecto del alelo complejo p.Gly1961Glu
+Thr1253Met. El segundo alelo causante de su enfermedad genera una proteína truncada, que s
e
p que no recuerde con exactitud el comienzo de su enfermedad, o bien, que describa el inicio de los
síntomas cuando la disminución de la agudeza visual sea ya crítica. Es posible que alguna de estas
situaciones pudiese explicar que una combinación de alelos severos produzca un aparente, pero no real,
desarrollo tardío de la STGD. No obstante, no se puede descartar que existan otros factores que modulen
la patogenicidad de dichos alelos.
En los pacientes que presentan alelos simples, la enfermedad comienza entre la primera y la
segunda década de vida. Se observan pacientes q
e
p
En el fenotipo DCB, se ha identificado un alelo prevalente (c.2888delG) que aparece en
homozigosis y en heterozigosis en cuatro de los seis pacientes (ver pág. 125). Los dos pacientes restantes
son homozigotos para los cambios c.5041_5055del y p.Gly1977Ser, respectivamente. En todos ellos la
enfermedad comienza en la primera década de vida (6-10 años de edad). Los cambios c.2888delG y
p.Gly1977Ser aparecen como dobles heterozigotos en cuatro pacientes diagnosticados como STGD en la
actualidad (ver págs. 123-124). De hecho, la pac
p
n la paciente de la familia ARDM-22 sería recomendable realizar un seguimiento oftalmológico de
su enfermedad a largo plazo, considerando que porta un alelo asociado a DCB. Los restantes datos de
correlación genotipo-fenotipo en nuestra serie con la mutación c.2888delG pudieran demostrar una
evolución hacia afectación también periférica en el transcurso del tiempo.
151
V- Discusión
152
En la siguiente figura se muestran las mutaciones identificadas en ABCA4, situadas en los
correspondientes dominios de la proteína codificada por este gen:
Figura V.7: Localización de las mutaciones identificadas en ABCA4 en la proteína Rim.
Las mutaciones puntuales están indicadas con flechas negras, mientras que las mutaciones que alteran la
pauta de lectura o el procesamiento se muestran con flechas rojas.
El modelo de la proteína es de Sun H et al., 2000.
Según el modelo de Sun H et al., las mutaciones en el dominio NBD-1 (Nucleotide Binding Domain
1) eliminarían la actividad ATPasa de la proteína tanto a nivel basal como cuando es estimulada por el
retinal. En cambio, las mutaciones en el NBD-2 (Nucleotide Binding Domain 2) no alteran la actividad
TPasa basal pero tienden a inhibir la hidrólisis del ATP dependiente de retinal por parte del NBD1. Aunque
stas observaciones muestran cómo se ve alterada la funcionalidad de la proteína, no permiten establecer
a co
minar posibles interacciones de
ABCA4 con otras proteínas retinianas.
A
e
un rrelación genotipo-fenotipo en nuestros pacientes. En el caso de la familia ARDM-126 (alelo
p.Gly1977Ser en homozigosis), presenta ambas mutaciones en el NBD-2 y muestran un fenotipo DCB,
aunque es posible que la actividad ATPasa basal se siga manteniendo. Además, el cambio en homozigosis
que presenta es una mutación puntual que cambia el aminoácido, sin alterar los residuos restantes de la
proteína.
Para determinar la severidad de los alelos mutantes que se producen en ABCA4, es necesario
realizar un estudio funcional que permita establecer qué pérdida de funcionalidad genera cada variante
alélica. Es preciso tener en cuenta que generalmente, se producen más de una mutación en cada alelo
(alelos complejos) y que es posible que cada uno conlleve un efecto patológico asociado, por mínimo que
sea. Por otro lado, sería recomendable realizar un estudio para deter
RR115522QQ
RR11110088CC RR22110077HH
GG886633AA
RR11005555WW
VV993311MM 22888888 ddeell GG
PP..AARRGG11
RR660022WW
RR221122CC II115566VV VV225566VV
PP11338800LL
RR994433QQ
RR22110077PP
GG11996611EE GG11996611RR
GG11997777SS
EE11112222KK
WW11440088RR
RR11664400WW
CC11449900YY
44553377iinnssCC
IIVVSS4400++55GG>>AA
33221111iinnssGGTT
PP11448866LL
RR440088XX
TT11225533MM
NN11779999DD
TT11001199MM
TT889977II
LL22224411VV
TT990011AA
44773399ddeellTT
VV11443333II
QQ22118877XX
IIVVSS2222--22AA>>TT
ddeellVVVVAAIICC11668811
LL1111PP
PP11994488LL
VV776677DD
NN11880055DD
GG117722SS
VV22005500LL
NN
QQ11331155XX
SS11664422RR
NN338800KK
mmeemmbbrraannaa
CCNNBBDD--11 NNBBDD--22
LL11994400PP
LL22006600RR
V- Discusión
5.7- EPIDEMIOLOGÍA DE LOS ALELOS MUTANTES EN ABCA4
El estudio del gen ABCA4 realizado en individuos control ha permitido estimar la frecuencia de
ortadores sanos entre nuestra población en 7´87%. El hecho de que entre 5-10% de la población general
(este trabajo; Jaakso dora de alelos asociados a
enfermedad tiene consi ías retinianas atribuibles a
ABCA4 y sugiere que la r revisada. La frecuencia de
portadores observada considerablemente mayor de
retinopatías debido a muta
La prevalen se ha determinado, pero la
frecuencia de portadore dios previos puede haberse
sobreestimado por do nalizados sea relativamente
pequeño y, por tanto, se trate de un mbinaciones de
alelos (mutantes) o de los
denomina n
alteraciones retinianas.
‐ DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE LAS MUTACIONES EN LOS PACIENTES ESTUDIADOS.
s, que se ha originado independientemente (ver pág. 88). Sin embargo, esta mutación muestra un
fecto fundador en población europea, concretamente en población finlandesa, en la que uno de cada tres
ciente
En ABCA4, el espectro de variantes alélicas se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de
todas las regiones geográficas. Cabe destacar que se identifican un número muy considerable de alelos
mutantes en Madrid y Castilla La Mancha (ver pág. 127), aunque quizá esté producido por el sesgo en la
p
n K et al., 2003; Yatsenko AN et al., 2001) sea porta
derables implicaciones en la proporción de patolog
prevalencia actual de la enfermedad (1:10000) debe se
en este estudio muestra una frecuencia estimada
ciones en este gen, aproximadamente 1/600.
cia precisa de retinopatías asociadas a ABCA4 aún no
s hallada en nuestra población así como en otros estu
s razones: por un lado, que el número de controles a
a estimación sesgada; por otro lado, que existan co
que no produzcan alteraciones (tempranas) en el fenotipo. Este sería el cas
dos polimorfismos proteicos, que se han identificado en homozigosis en individuos si
6
Las mutaciones identificadas en los distintos genes analizados se distribuyen homogéneamente por
toda la geografía española. En la ND, la mutación p.Arg38Cys se identificó en dos familias que compartían
haplotipos procedentes de Madrid y Guadalajara, y en una familia francesa (Royer et al., 2003). El número
de pacientes estudiados es muy limitado y, a excepción del cambio p.Arg38Cys, cada paciente presenta
una mutación distinta, por lo que no se observa agregación asociada a una región geográfica concreta (ver
pág. 83).
En RS1, aparecen dos mutaciones prevalentes. Por un lado, el cambio p.Gln154Arg que sugiere la
existencia de un ancestro común en todos los pacientes (ver pág. 87) y, por otro lado, el cambio
p.Glu72Ly
e
pa s con XLRS presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). El cambio p.Gln154Arg se
localiza en Asturias, País Vasco, Andalucía y en el archipiélago canario. Pese a que la distribución
geográfica es dispersa, se especula que esta mutación ha debido producirse a lo largo de un periodo de
tiempo relativamente corto ya que los pacientes comparten un haplotipo idéntico para cuatro marcadores
microsatélites y éstos son hipermutables (Jones MH & Nakamura Y, 1992).
153
V- Discusión
recogida de datos. En el alelo p.ArgG1129Leu, se observó cierta agregación en el País Vasco, Navarra,
urgos
omparando los alelos prevalentes de estas retinopatías en otras poblaciones europeas (alelo
p.Glu72
n sobre las poblaciones, alterando las frecuencias alélicas y las características de
us individuos (deriva genética). Por lo general, estos cambios conllevan la pérdida de los alelos menos
ecuentes, disminuyendo la diversidad genotípica de la población. Es posible que, a lo largo del tiempo,
stos procesos hayan generado frecuencias alélicas diferentes entre las poblaciones del norte y del sur de
peos
B y Madrid (15/22 alelos p.ArgG1129Leu), estando ausente en ambos archipiélagos y noroeste
peninsular. Si se asumiese que este alelo ha tenido un origen común, es posible que esta variante haya
surgido hace bastante tiempo, ya que se ha producido cierta divergencia entre los marcadores
microsatélites y se han originado haplotipos ligeramente diferentes, aunque similares. No obstante, sería
necesario realizar un estudio de haplotipos en población control para poder determinar qué haplotipos
pueden estar asociados al mutante ancestral y estimar en qué momento se ha producido esta alteración.
C
Lys en Finlandia (RS1); alelo p.Gly1961Glu en Alemania, Países Bajos, Eslovenia e Italia (ABCA4)
con las frecuencias de estas mutaciones en población española, se observan diferencias genéticas con
nuestros vecinos europeos. Estas diferencias se pueden deber, en gran parte, al elevado número de
migraciones e invasiones que ha sufrido la Península Ibérica a lo largo de su historia. Estos
desplazamientos de población pueden diseminar un alelo (mutante) en concreto. Por el contrario, si la
población se asienta, puede originar un efecto fundador. La evolución y la selección natural son procesos
estocásticos que ocurre
s
fr
e
Europa, estableciendo un gradiente (clina) de mutaciones desde los países nórdicos y centro euro
hasta la cuenca mediterránea.
Figura V.8: Distribución geográfica y frecuencia relativa de diferentes mutaciones identificadas en RS1 y
ABCA4 en diversos países europeos (The Retinoschisis Consortium, 1998; Jaakson K et al., 2003; este trabajo).
pp..AArrgg11112299LLeeuu
pp..GGllyy886633AAllaa
pp..GGllnn115544AArrgg pp..GGlluu7722LLyyss
pp..GGllyy11996611GGlluu
154
V- Discusión
7‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA LIGADA AL CROMOSOMA X
A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la
Enfermedad de Norrie/Vitreorretinopatía exudativa familiar y de la Retinosquisis juvenil:
Figura V.1 nes en ABCA4.
Figura V.9: Algoritmo diagnóstico para la ND/VREF y la XLRS.
8‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA
A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la
Enfermedad de Stargardt y otras formas asociadas a mutaciones en el gen ABCA4, compatibles con una
herencia autosómica recesiva:
P
0: Algoritmo diagnóstico para la STGD, DCB, RPAR y formas asociadas a mutacio
Paacciieennttee AADDNN
A
SSeeccuueenncciiaacciióónn aauuttoommááttiiccaa::NNDDPP,, RRSS11
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155
157
VI- Conclusiones
VI- Conclusiones
158
VI- CONCLUSIONES
1- En el gen NDP, se ha observado que las mutaciones más agresivas (asociadas a proteína truncada)
producen un fenotipo más severo (ND), con afectación oftalmológica, auditiva y retraso mental.
2- En el gen RS1, las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en
pacientes procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de
novo”, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia.
Esta situación se asocia a una ausencia de efecto fundador y origen múltiple de la XLRS.
3- La identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el diagnóstico clínico y
facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite predecir la evolución
(prognosis) del paciente.
4- La detección de alelos mutantes en ABCA4, utilizando como método previo de cribado el microarray
ABCR400, sólo puede ser implementada mediante un método posterior de análisis mutacional
(secuenciación+dHPLC) y a través de una caracterización clínica precisa en pacientes con STGD. En el
fenotipo DCB, la baja tasa de detección de mutaciones puede deberse a la existencia de otros genes
responsables (heterogeneidad genética).
5- En aquellos pacientes en los que los haplotipos cosegregan con la patología y se ha identificado un alelo
mutante en ABCA4 o no se han detectado mutaciones, la utilización de un método de cribado adicional al
microarray de genotipado (secuenciación o dHPLC) aumenta la tasa de detección (6/10 familias).
6- La implicación de ABCA4 en la STGD y en DCB es patente. No obstante, su etiopatogenia en los otros
fenotipos (RPAR y ADDM) no es tan evidente y la presencia de mutaciones puede deberse a una
asociación fortuita.
7- Los grandes reordenamientos genómicos únicamente representan una pequeña fracción de todos los
alelos mutantes asociados a ABCA4.
8- Algunos alelos mutantes de ABCA4 se asocian de forma clara a un fenotipo retiniano:
- p.Arg1129Leu a STGD de inicio tardío
- c.2888delG a DCB.
9- En este tipo de retinopatías tan heterogéneas (genética, alélica y clínicamente), se debe tener en cuenta
que los distintos fenotipos exhibidos en una misma familia pueden deberse:
- a la variación fenotípica por un alelo mutante
- o a la coexistencia de diferentes genes implicados, que pueden ser conocidos o no.
VI- Conclusiones
159
10- La mutación p.Arg1129Leu es la más prevalente en población española. Pese al número limitado de
cromosomas estudiados, su elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD y la similitud de los
haplotipos pueden sugerir un origen ancestral común.
11- La prevalencia de alelos mutantes en ABCA4 en población general española, analizada mediante la
medida de la frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en población control, se podría estimar en el 7´87%. Si
bien, estos datos deberían ser confirmados con un estudio más exhaustivo mediante el microarray de
genotipado en un número elevado de sujetos control.
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VIII- Bases de datos
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VIII- Bases de datos
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VIII- BASES DE DATOS
Las bases de datos de Internet utilizadas han sido las siguientes:
- Retinal Information Network: www.sph.uth.tmc.edu/Retnet
- Retina International: www.retina-international.org
- The GDB Human Genome Database: www.gdb.org
- The Human Genome Mutation Database: www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php
- The National Center for Biotechnology Information: www.ncbi.nih.gov
Además de las bases de datos anteriores, se han consultado las siguientes páginas Web:
- Asper Biotech: www.asperbio.com
- Eye Design Book by Curt Deckert, PhD: www.eyedesignbook.com
- Retinosis Pigmentaria: www.retinosis.org
- The World Medical Association: www.wma.net
- German Resource Center for Genome Research: www.rzpd.de
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IX‐ Publicaciones
IX- Publicaciones
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IX- PUBLICACIONES
A) Enfermedad de Norrie / Vitreorretinopatía exudativa
· Genotype-phenotype variations in five Spanish families with Norrie disease or X-linked FEVR. R.Riveiro-Alvarez, M.J. Trujillo-Tiebas, A.Gimenez-Pardo, M.Garcia-Hoyos, D.Cantalapiedra, I.Lorda-
Sanchez, M.Rodriguez de Alba, C.Ramos, C.Ayuso.
Molecular Vision 2005: 11: 705-12.
· Submission of Mutation Data. NDP. Human Genetics (2005) 118, 534. Temporary accession number:
M20051121/14.00.56. R Riveiro-Alvarez, Trujillo MJ, Gimenez A, Cantalapiedra D, Vallespin E, Villaverde C,
Ayuso C.
B) Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X
· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 534. Accession number: Hi0503. R
Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C
Ramos, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 535. Accession number: Hm0512b. R
Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C
Ramos, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 535. Accession number: Hm0513b. R
Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C
Ramos, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 536. Accession number: Hm0514b. R
Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C
Ramos, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 536. Accession number: Hm0515b. R
Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C
Ramos, C Ayuso.
IX- Publicaciones
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C) Enfermedad de Stargardt
· Microarray-based mutation analysis of the ABCA4 gene in Spanish patients with Stargardt disease: evidence of a prevalent mutated allele. Valverde D, Riveiro-Alvarez R, Bernal S, Jaakson K, Baiget M, Navarro R, Ayuso C.
Revista: Molecular Vision (en prensa).
· Spectrum of the ABCA4 gene mutations implicated in severe retinopathies from Spanish patients. D Valverde, R Riveiro-Alvarez, M Baiget, M Carballo, G Antiñolo, JM Millan, B Garcia-Sandoval, C Ayuso.
Revista: IOVS (en prensa).
- Partial paternal uniparental disomy (UPD) of chromosome 1 in a patient with Stargardt disease. R Riveiro-Alvarez, D Valverde, I Lorda-Sanchez, MJ Trujillo-Tiebas, D Cantalapiedra, E Vallespin, J Aguirre-
Lamban, C Ramos, C Ayuso.
Revista: Molecular Vision (en prensa).
· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number:
Hm0536. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number:
Hm0537. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.
· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number:
Hm0538. R Riveiro-Alvarez, J Aguirre, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C
Ayuso.
· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hs0512.
R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.