Vortexx ES x Aspergillus Niger (Artigo)

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

Autor Correspondente | Corresponding Author

Recebido | Received: 12/05/2008Aprovado | Approved: 17/02/2009

Resumo

O processo de limpeza Clean in place (CIP) é importante para a correta limpeza e sanitização de equipamentos, evitando a ocorrência de contaminação entre lotes e a formação de biofilme. O objetivo deste trabalho foi determinar um método para limpeza CIP de um equipamento de alta pressão dinâmica contaminado com conídios de Aspergillus niger. Foram realizados testes in vitro em suspensão aquosa para determinar a mínima concentração inibitória (MIC - minimum inhibitory concentration) e teste de atividade esporicida em superfície para determinar a efetividade do detergente alcalino e do sanitizante à base de ácido peracético contra conídios de A. niger. Para avaliar a eficiência do ácido peracético, foram testadas concentrações de 0,0025%-0,2 (v/v) por 20 e 30 min de contato para o ensaio de MIC in vitro e concentrações de 0,01-0,03% (v/v) por 30 min para os ensaios de atividade esporicida. O detergente foi testado em concentrações entre 1,5-2,5% (v/v) por 30 e 40 min em ambos os ensaios. O teste piloto foi realizado no homogeneizador de alta pressão dinâmica após sua utilização para pasteurização de néctar de manga contendo 106 conídios de A. niger.mL–1. Antes da aplicação dos agentes de limpeza e sanitização no teste piloto, foi realizado um enxágue inicial do equipamento, que é uma prática comum na indústria, com água e álcool, por 40 min. Os resultados obtidos para o ensaio de MIC in vitro indicaram que o uso de ácido peracético nas condições de 0,025% (v/v) por 20 min ou 0,01% (v/v) por 30 min de contato inativaram a carga de 103 conídios.mL–1. Resultado similar foi obtido para o detergente nas condições de 1,5% (v/v) por 40 min ou 2,0%(v/v) por 30 min. No ensaio de ação esporicida em superfície, a concentração de peracético requerida foi de 0,05%(v/v) por 30 min e o detergente não apresentou ação contra o fungo. O teste piloto indicou que as condições de uso dos agentes de limpeza e a sanitização determinadas no teste de ação esporicida foram eficientes para a sanificação do equipamento, desde que somado a um eficiente enxágue inicial.

Palavras-chave: Alta pressão dinâmica; Testes de ação esporicida; Teste de MIC; CIP; Aspergillus niger; Ácido peracético; Néctar de manga.

Metodologia para limpeza no local em equipamento de alta pressão dinâmicaClean in place methodology in dynamic high pressure equipment

Autores | Authors

Alline Artigiani Lima TRIBSTUniversidade Estadual de Campinas

(UNICAMP)Faculdade de Engenharia de Alimentos

(FEA)Departamento de Tecnologia de Alimentos

Caixa Postal: 6121CEP: 13083-862

Campinas/SP - Brasile-mail: [email protected]

Marcelo CRISTIANINIUniversidade Estadual de Campinas


(FEA)Departamento de Tecnologia de Alimentos

e-mail: [email protected]

Pilar Rodriguez de MASSAGUERUniversidade Estadual de Campinas


(FEA)Departamento de Ciência de Alimentos

e-mail: [email protected]

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

Summary

Cleaning-in-place (CIP) is an important procedure for the correct cleaning and sanitization of equipment, thus avoiding contamination amongst batches and the formation of biofilms. The purpose of this research was to determine CIP methodology for dynamic high pressure equipment contaminated with Aspergillus niger conidia. In vitro tests were carried out with aqueous suspensions of conidia to determine the minimum inhibitory concentration (MIC), and sporicidal tests of the surface to determine the efficiency of the alkaline detergent and sanitation agent (based on peracetic acid) against A. niger conidia. The efficiency of the peracetic acid was tested at concentrations of 0.0025 to 0.2% (v/v) for 20 and 30 min contact time in the in vitro MIC trials,, and at 0.01 to 0.03% (v/v) for 30 min in the sporicidal trials. The detergent was tested at concentrations of 1.5 to 2.5% (v/v) for 30 and 40 min in both trials. The pilot test was carried out in an ultra-high pressure homogenizer after treatment with mango nectar that had been previously contaminated with 106 A. niger conidia.mL–1. Prior to application of the cleaning and sanitation agents, the equipment was submitted to an initial rinsing with distilled water and alcohol for 40 min, which is a common industrial procedure. The results obtained in the in vitro MIC trials indicated that the application of peracetic acid at 0.025% (v/v) for 20 min or 0.01% (v/v) for 30 min of contact time, inactivated a load of 103 Aspergillus niger conidia.mL–1. Similar results were obtained for the detergent at 1.5% (v/v) for 40 min or 2.0% (v/v) for 30 min. In the sporicidal trial of the surface, the peracetic acid was effective at 0.05% (v/v) for 30 min, but the detergent was not effective against the fungus. The pilot test showed that the application of the sanitizer and detergent agents at the concentrations determined in the sporicidal test was effective in sanitizing the equipment if combined with an efficient initial rinsing procedure.

Key words: Dynamic high pressure; Sporicidal test; MIC test; CIP; Aspergillus niger; Peracetic acid; Mango nectar.

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Metodologia para limpeza no local em equipamento de alta pressão dinâmica

TRIBST, A. A. L. et al.

www.ital.sp.gov.br/bj

O ácido peracético é um sanitizante que apre-senta ação de oxidante orgânico e não é degradado pela catalase dos microrganismos (GREENSPAN e MACKELLAR, 1951). Seu mecanismo de ação envolve interações com as células através de radicais livres de oxidação, com ação sobre os grupos tiol de enzimas e proteínas, inibindo a produção de metabólitos e causando consequente morte celular (DENYER, 1998). É um líquido incolor, de odor pungente e de fácil diluição em água. Características como baixa toxicidade, custo baixo e facilidade de aplicação tornam o ácido peracético um dos principais agentes sanitizantes utilizados em processos de desinfecção de um modo geral (KOIVUNEN e HEINONEM-TANSKI, 2005), especialmente em indús-tria de alimentos. A eficiência do ácido peracético como sanitizante foi avaliada por vários autores (GREENSPAN e MACKELLAR,1951; VIZCAINO-ALCAIDA et al., 2003; REYNOLDS et al., 2004) sobre bactérias, bolores e leveduras. Estudo realizado por Greenspan e MacKellar (1950) indicou que a mínima concentração inibitória de ácido peracético para o Aspergillus niger foi de 0,005% (v/v) em tampão fosfato e 0,05% (v/v) em caldo nutriente e que, a adição de 0,3% (v/v) de ácido peracético na água de lavagem de tomates e uvas foi capaz de reduzir à metade a contaminação em tomates e a 1/5 em uvas.

Detergentes alcalinos são compostos que contêm em sua formulação álcalis e são utilizados para a remoção de matéria orgânica em equipamentos. Apresentam propriedades emulsificantes, saponificantes e peptizantes (CRAMER, 2006). Em altas concentrações, podem apre-sentar efeito bactericida (HOLAH, 2003).

Teste de MIC in vitro em suspensão aquosa, de atividade esporicida em superfícies (carregadores) e piloto são os três tipos de ensaios que podem ser utili-zados para determinar a concentração de uso de um sanitizante (REYBROUCK, 1998). A escolha do tipo de ensaio deve considerar a contaminação presente e o tipo de equipamento. O teste de MIC in vitro em suspensão aquosa é um teste qualitativo inicial ou aplicado em situ-ações em que não ocorre aderência dos microrganismos à superfície (KLINGEREN, 1995). Os ensaios de atividade esporicida em superfície são quantitativos e representam um maior desafio aos sanitizantes (KLINGEREN, 1995). O teste piloto é utilizado para certificar que as condições de CIP estabelecidas são suficientes para a descon-taminação dos equipamentos (REYBROUCK,1998), garantindo segurança nos processamentos de alimentos subsequentes.

Este estudo teve por objetivo determinar as mínimas concentrações de uso de detergente alcalino e sanitizante à base de ácido peracético para a realização do processo de CIP de um homogeneizador a ultra-alta pressão, tendo como microrganismo alvo o Aspergillus niger. Foram também avaliados os efeitos dos agentes

Introdução1

Durante a 2ª guerra mundial, o aço inox se tornou escasso, forçando a indústria de alimentos a procurar novos materiais para seus equipamentos. O vidro passou a ser utilizado em muitos equipamentos, exigindo o desenvolvimento de um novo processo de limpeza (sem desmontes) para evitar quebras. Esse processo foi chamado de CIP e é utilizado atualmente para limpeza e sanitização de equipamentos (SEIBERLING, 2003).

Um equipamento a ser submetido ao processo de CIP deve ser desenhado para permitir que as soluções de limpeza circulem e atinjam todos os pontos do equi-pamento que tiveram contato prévio com alimentos e que seja possível realizar, posteriormente, a drenagem total destas soluções (STANFIELD, 2003). Parâmetros como tempo de contato, temperatura de aplicação, turbulência, concentração do agente sanitizante e ciclos de enxágue são importantes para determinar a eficiência do processo CIP (STANFIELD, 2003).

Aspergillus niger é um bolor deuteromiceto comum em regiões de clima quente e úmido (PITT e HOCKING, 1985). Tem temperatura ótima de 35-37 °C, mas é capaz de desenvolver-se em temperaturas extremas de 6 ou 47 °C e tolera ambiente com pH até 2,0 e de baixa ativi-dade de água (HOCKING, 2006). Essas características tornam o A. niger um contaminante comum de frutas e de produtos obtidos a partir desta matéria-prima e, conse-quentemente, das indústrias processadoras. A presença de A. niger nos produtos embalados leva à deterioração destes, com escurecimento, amolecimento dos tecidos e separação de fases pela ação das enzimas do micror-ganismo (HOCKING, 2006).

Em produtos à base de frutas, o tratamento térmico para inativação microbiológica e enzimática causa perdas nutricionais e sensoriais aos produtos, pela degradação térmica de vitaminas, compostos de cor e aroma. A alta pressão dinâmica (APD) é um processo de inativação a frio e pode ser utilizada como alternativa ao tratamento térmico, visto que é capaz de inativar alguns microrga-nismos (CAMPOS e CRISTIANINI, 2007; FANTIN et al., 1996) e enzimas (LACROIX et al., 2005). Para realizar este processo, porém, é preciso utilizar homogeneizadores que possuem selos de vedação especiais, para evitar a ocorrência de vazamentos. Esses selos são constituídos de materiais como ligas de cobre e alguns polímeros que podem ser quimicamente danificados por saniti-zantes. Além disso, o homogeneizador pode ter pontos mortos e baixa velocidade de circulação, não atingindo a velocidade requerida para eficiência do processo CIP (STANFIELD, 2003). Por isso, a determinação do processo de CIP para este equipamento deve considerar as suas limitações e ser específico para um microrganismo alvo, evitando a utilização de concentrações acima das neces-sárias de detergente e sanitizante.





de água. O sanitizante foi testado em concentrações de 0,0025; 0,005; 0,0075; 0,01; 0,02; 0,025; 0,05; 0,1 e 0,2% (v/v) de ácido peracético por 20 e 30 min de contato e o detergente em concentrações de 1,5; 2,0; e 2,5% (v/v) por 30 e 40 min de contato. O teste foi realizado à tempe-ratura ambiente. A neutralização do ácido peracético foi feita com solução de tiossulfato de sódio 0,6% e do detergente com caldo nutriente. Após a neutralização, foi realizada a diluição e plaqueamento das amostras em meio MEA formulado. As amostras foram posteriormente incubadas a 35 °C por 5 dias. Foram determinadas como míninas concentrações inibitórias (MIC) as menores concentrações de detergente e sanitizante nas quais não foi possível a recuperação de nenhuma célula após o tratamento.

2.6 Determinação do tipo de ação do detergente alcalino

Foram realizados ensaios para determinação do tipo de efeito – fungistático ou fungicida – do detergente alcalino sobre os conídios de A. niger. Para tanto, foi realizado novamente o teste de MIC in vitro utilizando concentrações mais baixas de detergente (0,002; 0,02; 0,2; e 0,2% v/v). As demais condições do ensaio foram mantidas.

O efeito fungicida do detergente seria determinado pela inibição do microrganismo em todas as placas obtidas apenas a partir da maior concentração de deter-gente, e o fungistático, caso as placas obtidas a partir das menores diluições das concentrações mais baixas de detergente apresentassem inibição do fungo, enquanto que as placas obtidas a partir das maiores diluições apresentassem crescimento positivo. Foi realizada, para-lelamente, a contagem de conídios de uma amostra sem tratamento com detergente para comparar a velocidade de crescimento das colônias.

2.7 Teste de atividade esporicida em superfície frente a conídios de A. niger

Os ensaios foram realizados segundo adaptação da metodologia número 955.17 da AOAC (1995), que originalmente é descrita para a avaliação da atividade esporicida de desinfetantes sobre esporos bacterianos. Foram utilizados carregadores de aço inox 316, na forma de cilindros ocos com 10 mm de altura, 6,1 mm de diâmetro interno e 8 mm de diâmetro externo. Os carre-gadores foram imersos em uma suspensão de conídios de A. niger de 105.mL–1 por 15 min e, em seguida, foram secos em estufa a vácuo por 24 h a 30 °C. Este proce-dimento permitiu que ficassem retidos nos carregadores 103 conídios.mL–1 (ou o equivalente a 0,01 mL), represen-tando a mesma concentração do fungo utilizada no ensaio de MIC in vitro. Foram utilizados os mesmos tempos de

de limpeza e sanitização sobre os selos de vedação do equipamento, para certificar se o processo não ocasio-naria danos às peças do equipamento.

Material e métodos2

2.1 Meios de cultura

Foram utilizados os meios Ágar e Caldo Extrato de Malte (MEA e MEB, respectivamente) formulados segundo Pitt e Hocking (1985), para a preparação da suspensão de conídios e realização dos testes.

2.2 Microrganismo alvo e obtenção da suspensão de conídios

Foi utilizada uma linhagem de A. niger isolada por Silva (2006) por ser a linhagem mais termorresistente de bolores obtidos em 50 amostras analisadas de 1 L de néctar de manga processado industrialmente. Essa linhagem sobreviveu a tratamentos de 110 °C por 15 min. A suspensão de conídios foi obtida segundo metodologia descrita por Baglioni (1998), e sua enumeração foi reali-zada através de procedimento padrão de contagem de bolores, conforme descrito por Downes (2001).

2.3 Sanitizante e detergente alcalino

O sanitizante utilizado (Vortexx ES® - ECOLAB) tem em sua formulação 12% de ácido peracético, 3% de peróxido de hidrogênio e baixas concentrações de ácido peroctanóico. As concentrações de uso do sani-tizante foram determinadas utilizando-se como base a concentração de ácido peracético na fórmula, de maneira que fosse possível estender os resultados obtidos para outras formulações. O detergente utilizado foi um deter-gente desincrustante alcalino (MIP FPC® - ECOLAB), que contém em sua composição 6% de tolueno sulfonato de sódio e 1% de cloreto de dodecilmetilamônio. Não foram verificados relatos prévios de inibição de fungos por este produto.

2.4 Equipamento para processamento à alta pressão dinâmica

Foi utilizado um equipamento de ultra-alta pressão tipo homogeneizador (Stansted Fluid Power Ltd., Essex, Inglaterra), Modelo FPG7400H:350, que opera com vazão fixa de 270 mL.min–1 e pode atingir pressões de trabalho de até 300 MPa.

2.5 Teste de MIC in vitro em suspensão aquosa frente a conídios de A. niger

O ensaio foi realizado conforme procedimento descrito por Vizcaino-Alcaide et al. (2003), utilizando uma concentração desafio de conídios de A. niger de 103.mL–1





ácido peracético sobre os selos, especialmente sobre os de liga de Berílio-Cobre. Após cada procedimento do processo CIP, amostras de 50 mL da água de lavagem foram assepticamente coletadas, para a verificação da efetividade de cada etapa.

A efetividade do processamento à alta pressão, bem como do processo de CIP desenvolvido, foi testada através da contagem de células viáveis em cada amostra coletada, por diluição e plaqueamento das amostras em profundidade em MEA formulado. As amostras foram então incubadas a 35 °C/5 dias, quando tiveram suas contagens determinadas (Nf). Foi também realizada a contagem de células viáveis de uma amostra sem trata-mento, para ser estabelecido como contagem inicial (No). O número de reduções decimais (NRD) obtidos para cada processamento e para as etapas do CIP foram expressos segundo a Equação 1.

NRD = log (No/Nf) (1)

Em um segundo teste piloto, o enxágue inicial foi realizado em 40 min, revezando-se água e álcool etílico 96%, visando mudar a solubilidade do néctar de manga, facilitando a sua remoção do equipamento. As demais condições foram mantidas.

2.10 Roteiro de realização dos ensaios

A realização dos ensaios citados no material e métodos seguiu uma ordem específica de forma a esta-belecer um processo de CIP para o homogeneizador à ultra-alta pressão e avaliar sua eficiência sobre o microrganismo alvo e seu efeito sobre os selos do equi-pamento. A Figura 1 esboça a sequência de avaliações efetuadas.

Resultados e discussão3

Os resultados obtidos para o sanitizante são mostrados na Tabela 1.

A MIC após 20 min de contato foi de 0,025% (v/v) e após 30 min, 0,01% (v/v). Foi observada uma diferença na MIC do sanitizante quando o microrganismo foi exposto aos diferentes tempos de contato, o que era esperado, devido à aplicação de um tempo de contato 10 min maior (50%) em um dos ensaios. Esse resultado indica que o sanitizante usado não perdeu atividade em até 30 min de contato.

Com relação ao microrganismo alvo, que apresenta uma termorresistência incomum para sua espécie (capaz de sobreviver a 110 °C por 15 min), não foi observado o mesmo comportamento de resistência química frente ao agente de sanitização, visto que a MIC determinada está próxima à faixa estimada pelo fabricante (Ecolab, 2006) para inibição de bolores comuns (0,012 a 0,024% de ácido peracético).

contato e neutralizantes do teste acima mencionado. No ensaio, foram testadas concentrações de 0,01; 0,03; e 0,05% (v/v) de ácido peracético em 30 min de contato e 2,5% (v/v) de detergente em 40 min de contato. O teste foi realizado à temperatura ambiente. A AOAC estabelece, com 95% de certeza, que a concentração de sanitizante que resulta em apenas 1 tubo com crescimento positivo entre 60 tubos inoculados apresenta ação esporicida. Considerando-se que os conídios são esporos fúngicos, é possível utilizar esta denominação de ação esporicida do detergente e do sanitizante.

2.8 Teste da ação dos sanitizantes sobre os selos do equipamento

Foi avaliado o efeito do detergente e do sanitizante sobre os selos de vedação do equipamento constituídos de material não inoxidável (Poli-etil-etil-cetona - PEEK), teflon, e de ligas de berílio-cobre – conforme descrito pelo fornecedor do homogeneizador. Foram testados todos os tipos de selos do equipamento presentes nos pistões, válvula de entrada de amostra e válvula de homogeneização, em um total de 10 amostras. Esses selos foram previamente mensurados com paquímetro, as suas massas determinadas em balança analítica e seus aspectos visualizados por meio de uma lupa. Todas as medidas foram obtidas em triplicata. Em seguida, os selos foram imersos em soluções dos agentes e mantidos pelo tempo de contato de 30 min, sendo, posteriormente, secos e avaliados segundo os mesmos parâmetros descritos anteriormente. O procedimento foi repetido 4 vezes para simular a realização de 4 processos de limpeza e sanitização.

2.9 Teste piloto de limpeza e sanitização em homogeneizador

O teste piloto foi feito no equipamento de homo-geneização à alta pressão, no qual foi previamente realizado um processamento de néctar de manga conta-minada intencionalmente com suspensão de A. niger na concentração de 106 conídios.mL–1, de forma a simular um processo da indústria de alimentos. Foram avaliadas as pressões de 100, 150, 200 e 300 MPa para a inativação do microrganismo, sendo coletadas assepticamente amostras de 50 mL após cada processo.

Após os processamentos, o equipamento passou por um processo de limpeza CIP, incluindo enxágue inicial com água corrente e pressurizada (40 min), uso dos agentes de limpeza e sanificação nas concentrações e tempos determinados no ensaio de atividade esporicida e enxágues intermediários e finais, de 10 min cada com água corrente. A aplicação do sanitizante foi realizada com o equipamento sem circulação (apenas inundado) de forma a minimizar os possíveis efeitos negativos do





menor concentração possível do ácido peracético no equipamento de APD.

Para os ensaios de MIC com detergente alcalino, foi observado, inesperadamente, que este foi capaz de inibir o A. niger em todas as concentrações e tempos estudados, sendo o tratamento com 1,5% (v/v) de detergente e 30 min de contato o único que apresentou sobrevivência (1 UFC.mL–1), o que foi equivalente a 3,04 reduções decimais. Já, com concentrações ≥1,5% (v/v) durante 40 min ou ≥2,0% (v/v) durante 30 min de contato, não houve crescimento, sendo então estas concentrações estabelecidas como MIC. Como essa ação inibitória não era esperada, foram realizados testes para avaliar se o efeito do detergente sobre os conídios foi fungistático ou fungicida. Uma subs-tância é fungistática quando a sua presença inibe ou retarda o desenvolvimento do fungo, sem destruí-lo, e fungicida quando o tratamento com a substância, em uma determinada concentração, é capaz de inativar o microrganismo (MAGAN et al., 2003).

Em termos práticos, para o ensaio realizado, o efeito do detergente seria fungistático se o arraste de

Os resultados deste experimento estão em acordo com os obtidos previamente por Greesnpan e MacKellar (1950), que determinaram a MIC de ácido peracético para A. niger, como 0,05% (v/v) por 10 min, em caldo nutriente. Para o atual projeto, optou-se pelo uso do sanitizante a 0,01% (v/v) (inativação em 30 min), visando o uso da

Etap

a 1

Etap

a 2

Etap

a 3

Etap

a 4

Teste de MIC em suspensão aquosa para sanificante a 0,0025-0,2% por 20 e 30' de contato

in vitro Teste de MIC em suspensão aquosa para detergente a 1,5-2,5% por 30 e 40' de contato

in vitro

Teste de atividade esporicida do detergente a 2,5% por 40 min de contato

Teste de atividade esporicida do sanificante a 0,01; 0,03 e 0,05% por 30'de contato

Avaliação do efeito dos detergente e sanificante nas concentrações escolhidas sobre os selos de

vedação do equipamento de alta pressão dinâmica

Escolha das concentrações de uso de detergente e sanificante eficientes contra o . A.niger

Realização do teste piloto no equipamento de alta pressão dinâmica previamente contaminado com o ............, utilizando as concentrações de detergente e sanificante determinados na Etapa 2 e enxágues

sucessivos com água e álcool 96%

A.niger

Determinação do efeito fungicida ou fungistático do detergente, utilizando concentrações de

0,002-0,2% por 40'contato

Figura 1. Diagrama dos ensaios realizados para determinação da metodologia CIP para o equipamento de alta pressão dinâ-mica.

Tabela 1. Ação do Vortexx ES® sobre conídios de Aspergillus niger em suspensão.* Concentração de ácido

peracético (%)NRD**

20’ 30’0,2000 >3 >30,1000 >3 >30,0500 >3 >30,0250 >3 >30,0200 2,82 >30,0100 2,82 >30,0075 1,50 2,350,0050 1,42 1,590,0025 0,15 0,20

* Inóculo: 1,0 x 103 conídios.mL–1; e ** NRD = número de reduções decimais.





metais e plásticos de maior rugosidade do que aço inox, que podem ocasionar também a formação de biofilme. Assim sendo, este teste foi imprescindível para estimar a concentração de ácido peracético necessária para o processo de sanitização do equipamento.

Além disso, conforme estabelecido por Klingeren (1995), o método de MIC in vitro em suspensão aquosa, apesar de ser bastante simples, é inadequado para a predição da eficiência de um sanitizante; especialmente quando se refere à descontaminação de superfícies, sendo necessária a realização de teste de carregadores para estabelecer a sua eficiência.

Os resultados obtidos para o ensaio de atividade esporicida do Vortexx® demonstraram que as concen-trações de ácido peracético de 0,01 e 0,03% (v/v) foram ineficientes na inibição do fungo e que somente a concen-tração de 0,05% (v/v) com 30 min de contato resultou em apenas 1 tubo com crescimento positivo entre 60 tubos inoculados (requisito da AOAC para determinar atividade esporicida). Esses resultados indicam ser necessária a aplicação de uma concentração 5 vezes maior para a inibição do microrganismo alvo no ensaio e de ativi-dade esporicida com relação ao teste de MIC in vitro em suspensão aquosa, concordando com Reybrouck (1998).

Para o detergente alcalino, optou-se pela reali-zação do teste de ação esporicida apenas com a maior concentração de sanitizante sugerida pelo fabricante (2,5% (v/v), 40 min de contato). Este ensaio obteve como resultado 14 tubos com crescimento positivo em 60 tubos inoculados, indicando que, para se obter uma atividade esporicida no detergente, seria necessário aumentar sua concentração de uso. Como a principal função do detergente era a limpeza do equipamento e não a sua desinfecção, o aumento da concentração de detergente foi desnecessário e, portanto, não foi testado. A inibição parcial observada no ensaio (46 tubos sem crescimento) corrobora os resultados obtidos no teste de MIC in vitro, indicando que este detergente apresenta alguma ação fungicida, podendo ser complementar à ação do sani-tizante.

solução de detergente para as placas de contagens de sobreviventes após o procedimento de diluição tivesse inibido o crescimento do fungo e fungicida, se a concen-tração de detergente (1,5-2,5%) utilizada pelo tempo de contato (30-40 min) tivesse sido capaz de inativar o microrganismo. As contagens das diferentes diluições de detergente testadas e os números de reduções decimais obtidos são mostrados na Tabela 2.

Os resultados obtidos demonstram que apenas a concentração de 2% e de 1,5% (MIC) apresentou ação sobre a suspensão de fungos, inibindo-os em todas as diluições testadas. As diferenças observadas nas conta-gens da primeira diluição decimal de 2% do detergente (<1 UFC.mL–1) e dos plaqueamentos sem diluição de 0,2% de detergente (>250 conídios.mL–1) evidenciaram que a ação do detergente não foi fungistática, visto que, se fosse, a inibição de crescimento destes dois plaque-amentos seria a mesma, pois ambas continham a mesma concentração de detergente nas placas.

Desta forma, foi possível concluir que o detergente apresentou ação fungicida contra o Aspergillus niger, com MIC de 1,5%, que foi a condição de uso sugerida pelo fabricante. Esse resultado concorda com Holaj (2003), que indicou que detergentes alcalinos podem apresentar efeito microbiocida.

Uma vez determinada as MICs do sanitizante à base de ácido peracético e do detergente alcalino para o Aspergilllus niger pelo ensaio de MIC em suspensão aquosa, foram realizados os testes de atividade espo-ricida, para verificação da efetividade dos agentes de limpeza e sanitização na eliminação dos conídios do fungo em superfície lisa.

O ensaio de atividade esporicida em superfície lisa representa um maior desafio aos agentes de limpeza e sanitização quando comparado ao teste de MIC, uma vez que simula a desinfecção de um equipamento/superfície que foi exposto à contaminação e seco, com aderência do microrganismo (REYBROUCK,1998). O equipamento de alta pressão dinâmica não possui partes expostas à secagem e adesão de conídios, entretanto, apresenta alguns pontos mortos e peças constituídas de

Tabela 2. Número de reduções decimais de Aspergillus niger obtido para diferentes concentrações de detergente e tempo de contato de 40 min.*

Concentração de detergente (% v/v)

Contagem nas diluições (conídios.mL–1) Média da contagem

(conídios.mL–1)

NRD**100 10–1 10–2

2 <1 <1 <1 <1 >3,041,5 (MIC) <1 <1 <1 <1 >3,04

0,2 >250 118 11 1,18 x 103 0,000,02 >250 69 8 6,9 x 102 0,21

0,002 >250 102 7 1,02 x 103 0,03* Inoculo: 1,1 x 103 conídios.mL–1; ** NRD = número de reduções decimais.





zante, observou-se a recuperação de conídios na ordem de 101 conídios.mL–1 e aproximadamente 5 reduções decimais. Além do inesperado aumento da contaminação após o tratamento com ácido peracético, foi observado que, após o uso do sanitizante, apareceram partículas de néctar de manga (grumos) misturadas na água de enxágue. Essas partículas haviam deixado de aparecer ao final dos 40 min de enxágue inicial.

Esses resultados indicam que ainda havia polpa de manga contaminada retida no equipamento após a limpeza e que, durante o tratamento com Vortexx®, ocorreu a solubilização e arraste desta polpa. Esse fato pode ser atribuído à forma de realização do tratamento com sanitizante (equipamento inundado, mas sem circu-lação), ou ao fato do sanitizante ter solubilizado o néctar de manga. Como este néctar estava altamente contami-nado (106 conídios.mL–1) as condições de sanitização não foram suficientes para a completa inativação do fungo, visto que o processo de desinfecção foi desenhado para uma contaminação máxima de 103 conídios.mL–1, espe-rada após o enxágue inicial.

A partir dos resultados observados, foi incluída uma nova etapa no processo CIP, previa à desinfecção, com enxágues alternados de água e álcool etílico 96%, visando facilitar a remoção do néctar do equipamento através da diferença de solubilidade em cada um dos fluidos. No processo desenvolvido, o enxágue inicial com água (40 min) foi dividido entre enxágues com água e álcool e com o equipamento operando (fluxo corrente) ou apenas inundado. Realizando-se este procedimento inicial não foi obtido nenhum sobrevivente após o trata-mento com Vortexx®, indicando que o processo de CIP assim estabelecido foi adequado para a limpeza e sani-tização do equipamento.

A Tabela 4 sumariza os resultados obtidos em cada etapa para o estabelecimento do processo de CIP do equipamento de alta pressão dinâmica.

Tendo sido determinadas as concentrações de detergente (1,5% (v/v) com 40 min de contato) – esta-belecidas pelo teste de MIC – e considerando-se a não necessidade de ação antifúngica no detergente – e sanitizante (0,05% (v/v) por 30 min de contato) – esta-belecida pelo teste de atividade esporicida – a serem aplicadas no processo de CIP, foram avaliados os efeitos desses compostos sobre os selos de vedação do equipamento de alta pressão. Os resultados obtidos após 4 imersões de cada um dos selos na solução sani-tizante e na de detergente não resultaram em alteração de massa e medidas, sendo que os valores obtidos para essas medidas ficaram dentro dos limites esta-belecidos pelo coeficiente de variação de cada selo. Isso indica que a massa e as dimensões dos selos não foram afetadas.

No entanto, a avaliação visual dos selos indicou que o selo composto pela liga de Be-Cu apresentou alte-ração após os tratamentos com sanitizante. Foi verificada a formação de uma superfície brilhante, possivelmente resultado da remoção da camada de oxidação de metal mais externa. Esses resultados indicaram que, possi-velmente, esses selos seriam afetados pelo sanitizante, requerendo reposição mais frequente.

Como as alterações provocadas pelo sanitizante e pelo detergente sobre os selos foram mínimas e acei-táveis, essas concentrações de detergente e sanitizante foram utilizadas no teste piloto.

O processamento de néctar de manga inoculado com 106 conídios.mL–1 foi eficiente a 300 MPa, com inati-vação total do fungo inoculado. O tratamento a 200 MPa foi capaz de promover aproximadamente 2 reduções decimais do fungo na amostra, e processamentos a pressões iguais ou inferiores a 150 MPa não foram efetivas na inativação do A. niger (TRIBST et al.,2006). A comparação dos resultados obtidos demonstrou que o Aspergillus niger foi mais sensível ao tratamento de APD que o Penicillium estudado por Tahiri et al. (2006), que necessitou de 3 passagens de suco de laranja à pressão de 200 MPa para obter 2 reduções decimais. Após o processamento do néctar de manga, foi realizado o procedimento de CIP, utilizando as concentrações de detergente e sanitizantes previamente determinados. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Os resultados obtidos demonstraram que o enxágue realizado com pressurização inicial no equipa-mento resultou na redução total do número de conídios.mL–1. O tempo de enxágue longo foi necessário para que, aparentemente, toda a manga contida no equi-pamento fosse retirada. Isso era esperado, visto que o equipamento opera com uma vazão fixa e baixa e contém cantos mortos.

O processo de limpeza com detergente manteve a redução total de conídios. Após o tratamento com saniti-

Tabela 3. Número de reduções decimais obtidos nas etapas de processo CIP.

Etapa Conídios.mL–1 *NRDNéctar de manga (sem enxágue)

1,74E + 06 -

Após enxágue inicial (40 min)

1 >6,24

Enxágue (10 min) após limpeza*

1 >6,24

Enxágue (10 min) após sanitização**

2,00E + 01 4,94

* 1,5% (v/v) MIP FPC ® por 40 min de contato; ** 0,05% (v/v) de ácido peracético em Vortexx® por 30 min de contato; e *** NRD = número de reduções decimais.





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ECOLAB. (comunicação pessoal), maio 2006. (Alexrandre Medeiros, engenheiro químico responsável por Pesquisa e Desenvolvimento/ECOLAB).

Conclusões4

A partir dos resultados, foi possível concluir que o sanitizante utilizado apresentou um MIC, em base de ácido peracético, frente ao A. niger de 0,01% (v/v) por 30 min de contato, quando em suspensão aquosa, e numa concentração de 0,05% (v/v), quando os conídios estavam aderidos a uma superfície seca. Também foi possível concluir que o detergente alcalino utilizado, apesar de não apresentar relatos prévios de inibição de fungos, foi capaz de inibir parcialmente o A. niger na concentração de 2,5% por 40 min.

Foi observado que, apesar de sua alta resistência térmica, o A. niger apresentou baixa resistência química frente ao sanitizante à base de ácido peracético. Além disso, foi possível concluir que as concentrações deter-minadas do detergente e do sanitizante para aplicação do teste piloto, não ocasionaram grandes alterações nos selos de vedação do equipamento.

Com relação ao processo de limpeza e sanitização do equipamento de alta pressão dinâmica, foi possível concluir que este é um processo crítico devido às partes sensíveis do equipamento, aos seus pontos mortos e à baixa vazão de operação. Porém, é possível a desin-fecção, desde que seja realizado um eficiente enxágue inicial, com alteração da solubilidade do produto.

Agradecimentos

Agradecemos ao CNPq e ao PRODETAB/EMBRAPA pelo fomento da pesquisa e à empresa ECOLAB pela doação das amostras de detergente e sanitizante.

Tabela 4. Resultados sumarizados dos ensaios realizados para determinação do processo de CIP para o equipamento de alta pressão dinâmica.

Etapa Ensaio Resultado

1 Teste de MIC in vitro em suspensão aquosa para sanificante.

0,025% (v/v) por 20 min de contato ou 0,01% (v/v) por 30 min de contato.

1 Teste de MIC in vitro em suspensão aquosa para detergente.

1,5% (v/v) por 40 min de contato ou 2,0% (v/v) por 30 min de contato.

1 Determinação do efeito fungicida ou fungistático do detergente.

Fungicida, em concentração de 2% por 40 min de contato.

2 Teste de atividade esporicida do sanificante. 0,05% (v/v) por 30 min de contato.

2 Teste de atividade esporicida do detergente. Sem atividade esporicida comprovada.

3 Avaliação do efeito do detergente e do sanificante sobre os selos de vedação do equipamento de alta pressão dinâmica.

Sem alteração de massa e dimensões. Alteração visual apenas nos selos de Be-Cu, com formação de superfície brilhante.

4 Teste piloto no equipamento de alta pressão dinâmica contaminado com A. niger, utilizando as concentrações de detergente e sanificante determinados na Etapa 2 e enxágues sucessivos com água e álcool 96%.

Processo com enxágue inicial de 40 min com água e álcool e etílico 96% seguido de limpeza com solução com 2,5% de detergente por 40 min de contato e desinfecção com 0,05% (v/v) de sanificante por 30 min de contato foi eficiente para o CIP do equipamento.





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Vortexx ES x Aspergillus Niger (Artigo)

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