Virologia, Epidemiologia e Diagnóstico Laboratorial
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Virologia, Epidemiologia e
Diagnóstico Laboratorial
UFF
28 de Abril de 2011
Flávia Barreto dos Santos, PhDLaboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
Família Flaviviridae
Gênero Flavivirus
Causa DC e FHD
É um arbovirus
Transmitidos por mosquitos
Possui 4 sorotipos distintos (DENV-1, 2, 3, 4)
Organização da Partícula e Genoma Virais
RNA fita simples (+)
prM
Bicamada
Lipídica
M
E
Nucleocapsídeo
3 ptns estruturais 7 ptns não- estruturais
30-50nm
Cada sorotipo confere imunidade sorotipo específica
permanente e contra outros sorotipos por curto período
Todos os sorotipos podem causar doença grave e fatal
Variação genética dentro dos sorotipos (Genótipos)
Algumas variantes genéticas (Genótipos) parecem ser
mais virulentas e possuir maior potencial epidêmico
Vírus DengueAlguns fatos...
Mosquitos do gênero Aedes.
Nas Américas, a espécie Aedes aegypti é a responsável
pela transmissão do dengue.
Aedes albopictus, um importante vetor na Ásia.
Aedes aegypti Aedes albopictus
Vetores Hospedeiros
O vírus Dengue é transmitido por fêmeas do
mosquito infectado
Principalmente se alimenta durante o dia
Possui hábitos domésticos
Coloca os ovos e gera larvas
preferencialmente em recipientes artificiais.
Aedes aegypti
ADSORÇÃOVírus – Célula
hospedeira
via
receptor
celular
CITOPLASMA
MONTAGEMdo nucleocapsídeo
Diminuição do pH
Fusão da membrana
do vírus
Ptn E sofre mudança
conformacional
Nucleocapsídeo é
liberado no
citoplasma
DESNUDAMENTO
ssRNA(+)
genômico
ssRNA(+)
TRADUÇÃO
Mediada pelo CAP
CITOPLASMA
poliproteína
ProteínasNão-estruturais
Proteínas
Estruturais
Proteases virais e celulares
Helicase + RNA polimerase RNA-dependente & Cofatores
Progênies de
ssRNA (+)Síntese de molde
de ssRNA (-)ENDOCITOSE
MORFOGÊNESEVIRALOcorre noRER LIBERAÇÃO
Via secretora do Complexo de Golgi
Replicação dos Vírus Dengue(monócitos, macrófagos, linfócitos B, células endoteliais e dendríticas
Barth OM, 2000
Replicação dos Vírus Dengue
ADSORÇÃOVírus – Célula hospedeira via
receptor
celular
Monócitos,
Macrófagos
Linfócitos B
Células Endoteliais
Células Dendríticas
Citoplasma
63.000X
Barth OM, 2000
Replicação dos
Vírus DengueENDOCITOSE
pH ÁCIDO
Rearranjo de dímeros trímeros
LIBERAÇÃO DO
NUCLEOCAPSÍDEO
Barth OM, 2000
40.000X
MORFOGÊNESE VIRAL
Montagem da particula
viral associada ao
retículo endoplasmático
rugoso
ÚCLEO
ITOCÔNDRIA
ETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
RUGOSO
Replicação dos Vírus Dengue
48000X
Barth OM, 2000
LIBERAÇÃOVia secretora do Complexo de Golgi
Replicação dos Vírus Dengue
Rico-Hesse (1990) definiu esses “genótipos” como grupos de vírus que apresentam
uma divergência em sua sequência nucleotídica menor que 6% dentro de uma
determinada região do genoma viral (junção E/NS1).
V Filipinas (1956), Japão (1973), China (1980) América do Sul (2002-2004)
Weaver & Vasilakis (2009)
Infecção por Dengue
Assintomática Sintomática
Febre indiferenciada
Dengue Clássico
Com manifestações hemorrágicas
Sem manifestações hemorrágicas
Febre do Dengue
Hemorrágico
Sem choqueCom Choque
(SCD)
Grau
I
•Febre acompanhada de sintomas inespecíficos. A única manifestação hemorrágica é o
teste de torniquete positivo.
Grau II
• Sangramento espontâneo, além das manifestações apresentadas no Grau I. Geralmente sangramentos na pele
e outras formas de sangramento.
Grau III
• Insuficiência circulatória manifestada por pulso rápido e fraco, redução da
pressão do pulso ( 20mmHg) ou hipotensão, com a pele pegajosa e
fria, inquietação
Grau IV
• Choque profundo com pressão arterial e pulso não detectáveis.
Foi em grande parte baseada em estudos em crianças na Tailândia na
década de 60
Insatisfação devido a dificuldade de uso em diversas situações
Ex.:casos de choque sem plaquetopenia
Pacientes que evoluem a óbito sem apresentarem os critérios
estabelecidos
É insuficiente para contemplar os casos graves
Ex.: casos que apresentam comprometimento hepático e
manifestações neurológicas.
Necessidade de Revisão da
Classificação da OMS
Classificação dos casos de dengue de acordo com observações do DENCO (OMS, 2009)
Nív
eis
de a
nti
co
rpo
se a
ntí
gen
o
IgM
IgM
IgG
Infecção Primária(início dos sintomas)
Infecção Secundária(início dos sintomas)
Vírus Vírus
NS1NS1
Tempo
RESPOSTA IMUNE NAS INFECÇÕES POR DENGUE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 >10
Diagnóstico Laboratorial do DengueIsolamento Viral
• Cultura de células de mosquito A. albopictus clone C6/36
Detecção de ácido nucléico viral
• RT-PCR, PCR em tempo real
Sorologia
• Mac-ELISA,IgG-ELISA,Captura de antígeno NS1, Kits comerciais, PRNT
Histopatologia e Imunohistoquímica
Kits comerciais para o diagnóstico do dengue
Coleta e Processamento de Amostras para
o Diagnóstico Laboratorial do Dengue
Tipo de
Espécime
Momento da
Coleta
Tipo de
Análise
Soro de fase
aguda
De 0-5 dias após o
início dos sintomas
Isolamento viral,
métodos sorológicos,
moleculares e captura
de NS1
Soro de fase
convalescente
Entre os dias 6-21 após o
início dos sintomas
Métodos
sorológicos
Cultura de células de mosquito A.
albopictus clone C6/36Imunofluorescência IndiretaAnticorpos Monoclonais tipo-específicos (Gubler et al., 1984)
Isolamento Viral (Igarashi, 1978)
MAC-ELISA (PanBio)Captura de anticorpos IgM
Placa
Substrato
Título
IgG> 40,960
< 40,960
> 10 dias
> 10,240
< 10,240
6 – 9 dias
Secundária
Primária
Resposta
Imune
> 160
< 160
< 5 dias
Dias após o início dos sintomas
Placa
Fluidohiperimune
Antígeno Dengue
Soro paciente
IgG
AnticorpoSecundário
Anti-IgG
Substrato
IgG-ELISADetecção de anticorpos IgG
Segunda etapa de amplificação – Nested PCR
Amplicon DENV-1 (482 bp)
D1
5’ 3’
TS1TS4TS3TS2
511 pb
produto
Amplicon DENV-4 (392 bp)
Amplicon DENV-3 (290 bp)
Amplicon DENV-2 (119 bp)
Transcrição reversa e primeira etapa de
amplificação
cDNA
produto 511 pb
5’
CAPSIDEO prM
5’3’D2
DENVRNA
1 hora/ 42ºC
3’ 5’
5’ 3’
D1
5’
3’
3’
5’
35 ciclos30sec/ 94ºC1 min / 55ºC2 min / 72ºC
3’
RT- PCR para a Tipagem dos vírus Dengue (Lanciotti et al, 1992)
7
43 2 1 1
17
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fígado Pulmão Cérebro Rim Baço Líquor Soro
DETECÇÃO DE DENV-3 POR RT-PCR E/OU ISOLAMENTO VIRAL
INVESTIGAÇÃO DE ÓBITOS, RIO DE JANEIRO, 2002
Detecta sequências específicas de produto de PCR conforme estas se
acumulam em tempo real durante o processo de amplificação por PCR.
RNA
PCR em Tempo Real (real time PCR)
0/11
2/11
3/11
6/11
Investigação de Casos Fatais por Dengue
Rio de Janeiro, 2002PCR em Tempo Real em 11 espécimes de cérebros de casos fatais
Isolamento Viral Imunohistoquímica RT-PCR PCR em Tempo Real
Soro Paciente (Ag NS1)
Anti-NS1 mAb
Anti-NS1 mAbHRP
Substrato (TMB)
Unidade
BioRad
RESULTADO INTERPRETAÇÃO
< 0,5 negativoNão há evidencia do
antígeno NS1 do
dengue.
0,5 ≤ a <1,0 inconclusivo
Amostra considerada
dúbia quanto a
presença do antígeno
NS1 dengue.
≥ 1.0 positivoPresença do antígeno
NS1 do dengue.
Solução de Parada
Platelia NS1
(Biorad Laboratories)
Resultado Positivo
Resultado Negativo
Prova Inválida
NS1 Ag STRIP
(Biorad Laboratories)
Sensibilidade dos testes de captura de NS1 de acordo com
o número de dias de sintomas (n=220)
Sensibilidade total dos testes de captura de NS1 em
relação ao diagnóstico por MAC-ELISA, isolamento viral e
RT-PCR, de acordo com o número de dias de sintomas
SD BIOLINE DENGUE DUO TEST
Teste de uma etapa para detecção de NS1 e IgG/IgM em soro ouplasma2cassetes: Dengue NS1 Ag test e Dengue IgG/IgM test
Novembro de 2008 :pactuadas 68
Unidades Sentinela para
monitoramento viral, utilizando o
teste NS1 como triagem
Total: 25 municípios em16 Estados
PE
RR
RO
AC
AP
CE
PB
SEBA
GO
MS
PR
SP
MGES
RJ
Epidemiologia do
Dengue
Novas estimativas:
~70-500 milhões de pessoas contraem a doença
Cerca de 3,6 bilhões de pessoas (55% da população mundial)
vivem em risco de contrair a doença
124 países endêmicos
Distribuição global dos
sorotipos de vírus dengue,
1970
Distribuição global dos sorotipos de
vírus dengue, 2004
Mackenzie et al., 2004
Mudança na distribuição dos sorotipos
de dengue nos últimos 30 anos
http://www.paho.org/English/AD/DPC/CD/dengue.htm
BRASIL
(560,000)~90%
630,0002007
BRASIL
(734.384)
865.6972008
~85%
BRASIL
(332.083)
480.9092009*
~69%
1.015.420BRASIL
(780,644)~80%
2002
741,865BRASIL
(535,388)~73%
1998
Casos de Dengue Clássico nas Américas,
1980–2009*
2000 - DENV-3
Rio de Janeiro
1986 - DENV-1
1990 - DENV-2
Roraima
1982 - DENV-1
DENV-4
2010-DENV-4
São Paulo
1998- DENV-3
Caso Importado
Belém
1989- DENV-2
Caso Importado
Casos notificados e Hospitalizações*
por Dengue no Brasil, 1986-2007
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07
Caso
s n
oti
ficad
os
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Ho
sp
itali
zaçõ
es
Casos notificados Hospitalizações
DENV2DENV1
DENV3
Without positive
Without virus circulation
DEN 1
DEN 2
DEN 3
DEN 1, DEN 2
DEN 2, DEN 3
DEN 1, DEN 2, DEN 3
Without positive
Without virus circulation
DEN 2
DEN 3
DEN 1, DEN 2
DEN 2, DEN 3
DEN 1, DEN 2, DEN 3
Source: CGLAB/SVS/MS
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2009
Casos de DC: 529.237
FHD: 2.271 e 154 óbitos
DCC: 5.952 e 144 óbitos
Fonte: SVS-MS
Nordeste: 170.674
Sudeste: 152.119
Centro-Oeste: 125.722
Norte: 70.399
Sul: 10.323
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2010*
Casos NOTIFICADOS de DC:
942.153
Casos CONFIRMADOS:
482.284
FHD: 2.271
Óbitos : 367
Até a 26º SE (03/07/2010)
Fonte: SVS-MS
Predomínio DENV-1
Isolamento DENV-4
Isolamento
DENV-4
ISOLAMENTO DO DENGUE TIPO 4 NO BRASIL
2010
três casos confirmados de DENV 4 no município de Boa Vista, classificados clinicamente como dengue clássica. Houve evolução para cura sem necessidade de internação de nenhum dos casos.
data de inicio dos sintomas do primeiro caso:26.06.2010
Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos
circulantes no Brasil, 2011*
Casos NOTIFICADOS de DC: 254.734
Casos graves:2.208 confirmados
Óbitos : 95 confirmados
Até março de 2011
Fonte: SVS-MS
Região Sudeste - 81.179; 32%
Região Norte – 76.671; 30%,
Região Nordeste - 47.404; 19%
Região Sul - 28.445; 11%
Região Centro-Oeste 21.035; 8%
Predomínio DENV-1
Dispersão DENV-4(RR,AM,PA,PI,BA,RJ,SP,PE)
7732
957
1188
446378
532580
448
79
1627
615
363
6390 12
76
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2007 2008 2009 2010 2011
DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4
Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2011
Introdução do DENV-4
Incidência de dengue no Brasil, 2010-2011
•Até março 2011
•Fonte:SVS/MS
Dengue no Brasil por Regiões, 1982–2011*
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
Norte Nordeste Sudeste Sul Centro-Oeste
Vigilância Epidemiológica
do Dengue
no Rio de Janeiro
DENV-1 DENV-2 DENV-3
1986 1990 2000
Introdução do Vírus Dengue no Estado
do Rio de Janeiro
Região
Metropolitana
Fatores responsáveis pela
ocorrência de epidemias de
dengue no Rio?
Crescimento sem precedentes
da população
Urbanização não planejada e
não controlada
Abastecimento de água e
tratamento de resíduos
inadequados
Ausência no controle efetivo do
mosquito
Aumento na disseminação do
vírus
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2008
Re-emergência do DENV-2
0
10
20
30
40
50
60
70
J M M J S N J M M J S N J M M J S N J M M J S N
0
20
40
60
80
100
120
140
160
J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D
DENV-1 DENV-2 DENV-3
2001 2002 2003
0
1
2
3
4
5
6
7
8
J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D
2004 2005
2006 2007 2009
Sorotipos de Dengue circulantes no Rio de Janeiro, 2001-2009
Re-emergência do Dengue tipo 2
DENV-2
2008
Impacto da re-emergência do DENV-2Casos Notificados de Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2007-2008*
SES/SVS
2007 2008
Impacto da re-emergência do DENV-2Internações por Dengue por mês no Estado do Rio de
Janeiro, 2007-2008*
2007 2008
Percentual de Internações por Dengue de
acordo com faixa etária, 2001-2008
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Ano
< 15 ANOS >=15 ANOS
Perc
en
tual d
e I
nte
rnaçõ
es (
%)
Fonte: SESDEC-RJ/SAS/SVS/CVE/DDT/GDTVZ * Dados sujeitos à revisão
Dengue no Rio de Janeiro:2002-2008
Casos notificados, FHD, Internações e óbitos,
Ano Notificados FHD Internações Óbitos
2002 285702 1689 2397 91
2003 9460 48 540 3
2004 2936 5 533 0
2005 3140 17 326 5
2006 30567 77 1431 17
2007 67275 21 452 46
2008 250026 1632 13808 181
Experiência do Laboratório de
Flavivirus, IOC - FIOCRUZ
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2007-2008
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2008Laboratório de Flavivírus IOC/FIOCRUZ
Casos confirmados/ estudados: 310 / 754 (41 %)
Sorotipos identificados: DENV-2: 138 DENV-3: 68
ÓBITOS
Óbitos confirmados / estudados: 73/146 (50%)
Virus identificados: DENV-2 : 46 (92 %)DENV-3: 4
0
10
20
30
40
50
DENV-2 DENV-30
10
20
30
40
50
Primária Secundária
EPIDEMIA DE DENGUE
NO RIO DE JANEIRO
2009-2011Re-emergência do DENV-1
Introdução do DENV-4
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2007 2008 2009 2010
DENV-1 DENV-2 DENV-3
Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2010
Emergência do DENV-1
Vigilância Epidemiológica de Dengue,2011Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
DENV-1
DENV-2
DENV-3
DENV-4 ?
RT- PCR (Tipagem de DENV)
DENV-1
482pb
DENV-2
119pb
DENV-3
290pb
DENV-4
392pb
Repetição da extração do RNA do material original
Amplificação com primers tipo-específicos separados
Sequenciamento do genoma
Isolamento viral em cultura de células
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*Até a 16ª semana epidemiológica de 2011 (23 de abril): 63.996 casos notificados
+500% em relação 2010
41 municípios (44,6%) : alta incidência
25 municípios (33,5%) : média incidência
5654
17312
28312
12719
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Jan Fev Mar Abr
Fonte: Lacen-RJ e FIOCRUZ/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 20 ABR 2011 e sujeitos à revisão.
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Sorotipos circulantes
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Distribuição dos Óbitos e Casos Graves Confirmados
Casos Notificados no Estado do Rio de Janeiro,
2009-2011*
3330 2506 214212471445 2052
331253485654
17312
28312
12719
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Jan Fev Mar Abr
2009 2010 2011
Fonte: SINANNET/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 27 ABR 2011 e sujeitos à revisão.
Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*
Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ
Total confirmados/ Total recebidos: 207/677 (30.6%)
Isolamento viral e/ou PCR: 80 DENV-1
20 DENV-2
6 DENV-4*
*2 casos (+) de Niterói em 27/04/2011 por PCR
Óbitos: 20/41 (48.8%) – 10 DENV-1 e 2 DENV-2
Não há uma tratamento específico
Indica-se repouso e hidratação
Vacina contra a dengue?
Não há uma vacina licenciada no momento.
Maior Desafio:
Necessidade do desenvolvimento de 4 vacinas que sejam
combinadas em uma única (tetravalente)
Induza um nível de proteção permanente e contra infecção
por qualquer um dos 4 sorotipos.
Vacinas candidatas para dengue em desenvolvimento
Tipo de Vacina Fabricantes
Viva atenuada WRAIR/GSK Biologicals*
Viva atenuada Mahidol Universidade/Sanofi Pasteur
Viva atenuada,quimérica NIAID, NIH
Viva atenuada,quimérica Acambis/Sanofi Pasteur*
Viva atenuada,quimérica CDC/ InViragen*
Vírus Inativado WRAIR
Subunidade Hawaii Biotech
DNA Navy Medical Research Center
Revisado em Whitehead et al., 2007
+ adiantada: Sanofi Pasteur
envolve o Núcleo de Doenças Infectocontagiosas da Universidade
Federal do Espírito Santo e 11 países tropicais.
Administração de 3 doses, com intervalo de 6 meses.
Meta: ter produto no mercado em 2015
Bio-Manguinhos (Fiocruz), RJ-em parceria com a GlaxoSmithKline
Instituto Butantan (SP) -com os Institutos Nacionais de Saúde dos
EUA (NIH)
Vacina contra a dengue?
Obrigada !