Um sistema de sinalização intracelular que envolve as cascatas das MAP quinases (cascatas de três membros de proteína quinase). Diversos ativadores situados nos passos iniciais da cascatas reagem a um estímulo extracelular, deflagrando a cascada através da ativação do primeiro membro da cascata, a map quinase quinase quinases (MAPKKKs). As MAPKKKs ativadas fosforilam as quinases de proteína quinase ativadas por mitógeno, que por sua vez, fosforilam as proteínas quinases ATIVADAS PELO MITÓGENO (MAPKs).As MAPKs atuam, então, em vários alvos situados em passos mais avançados da cascata, que afetam, por sua vez, a expressão gênica. Em mamíferos, existem distintas vias de MAPs Quinase, incluindo a via ERK (quinase regulada pela sinalização extracelular), a via SAPK/JNK (proteína quinase c-jun ativada pelo estresse) e a via quinase p38. Existem alguns componentes compartilhados por essas vias, dependendo do tipo de estímulo que deu origem à ativação da cascata.

MAP Quinase (Mitogen Activated Protein Kinases - Proteíno-quinases ativadas por mitógenos) é uma subfamília de proteínas-quinase específicas de serina/treonina que respondem a estímulos extracelulares (mitógenos) e regulam várias atividades celulares, como expressão gênica, mitose, diferenciação, sobrevivência celular e apoptose (morte celular).

Estímulos extracelulares levam à ativação de uma MAP quinase via uma cascata de sinais (cascata de MAP quinase), composta por uma MAP quinase, MAP quinase-quinase (MKK ou MAP2K) e MAP quinase-quinase-quinase (MKKK ou MAP3K).

Uma MAP3K, ao ser ativada por estímulos extracelulares, fosforila a MAP2K em seu resíduo de serina e treonina, e então a MAP2K ativa a MAPK através de fosforilação em seu resíduo de serina e tirosina. Essa cascata de sinas por MAP quinase tem sido evolutivamente bem conservada desde leveduras até mamíferos.

A ativação pelo TCR desencadeia eventos diversos como a alteração no arranjo do citoesqueleto (que permitirá a polarização de células T em direção a APC), a ativação de vias que vão desencadear eventos no núcleo e no citosol e as alterações no transporte da membrana. Existem algumas vias bem reconhecidas: a via cálcio-calcineurina, a via diacil

glicerol (DAG) e a via das proteínas ativadas por mitógenos (MAP - mitogen activated protein). A transmissão do sinal está representada esquematicamente no Anexo G (para revisão, Halloran, 1999; Gudmunsdottir,1999).

Via cálcio-calcineurinaO TCR é um dímero formado por cadeias a e ß que interagem com o peptídeo associado ao MHC. Na interação do TCR, a cadeia a do TCR liga-se à região N-terminal do peptídeo e o TCR-ß liga-se à região C-terminal. O evento mais inicial consiste na remoção de grupos fosfato inibitórios pela fosfatase tirosina CD45. Isto resulta no desencadeamento da ativação de tirosina-quinases da família Src (Lck e Fyn associadas, respectivamente, ao co-receptor CD4/CD8 e ao complexo TCR-CD3) e subseqüente ativação da ZAP-70 (zeta associated protein -70).

As tirosina-quinases fosforilam tirosinas que, por sua vez, promovem o recrutamento da fosfolipase C (PLCg) para a membrana, ativando-a. Esta co-enzima, a PLCg, uma vez ativada, lisa, por hidrólise, o fosfolípide fosfatidil inositol bifosfato (PIP2 - phosphotidylinositol-4,5-biphosphate) presente na membrana celular. A hidrólise do fosfatidil-inositol PIP2 produz dois componentes: inositol trifosfato (IP3 - inositol trisphosphate) e o DAG.

O IP3 liga-se a receptores da membrana do retículo endoplasmático liberando cálcio intracelular. No entanto, esta transitória liberação de cálcio ionizado intracelular a partir de organelas não-mitocondriais é insuficiente para desencadear os eventos de ativação. Por outro lado, a IP3 também ativa canais de cálcio. A abertura destes canais de cálcio cria uma corrente de íons cálcio. A manutenção de uma concentração alta de cálcio no citoplasma ativa a calcineurina.

A calcineurina é uma fosfatase serina (que consiste numa cadeia enzimática de 61 kD) associada com a calmodulina. Na ativação, a calcineurina separa-se da calmodulina agindo em diferentes substratos, que são proteínas conhecidas como fatores nucleares de células T ativadas (NFAT - nuclear factor of activated T cells).

A calcineurina age nestes substratos causando a translocação de NFAT do citoplasma para o núcleo, dando início à transcrição do gene da IL-2 e de outras citocinas. Isto acontece através de uma interação não-enzimática entre a calcineurina e o NFAT formando um complexo no citoplasma. Quando a calcineurina é ativada, ela desfosforila serinas chaves na região reguladora da NFAT induzindo a exposição de seqüências de localização no núcleo. Isto força a passagem do complexo calcineurina-NFAT através dos poros da membrana nuclear para dentro do núcleo permitindo a sua ligação a locais específicos no DNA (região promotora), desencadeado a transcrição gênica.

Quando o sinal do cálcio é retirado, a calcineurina não é mais ativada e assim a ligação nos locais do DNA são retirados.

Via DAG O DAG, na presença do aumento do cálcio livre citosólico, une-se e ativa a proteína quinase C (PKC), que por sua vez, ativa o fator de transcrição NF-kB (nuclear factor--kB).

Via quinase MAP ou via RasA ativação da via quinase MAP é importante em muitas formas da sinalização celular em resposta particularmente ao stress celular. Os sinais de stress incluem, entre outros, IL-1, TNF, radiação ultravioleta, anoxia.

O sinal do TCR também ativa várias quinases MAP incluindo Ras e ERK (extracellular signal receptor regulated kinase) Estas quinases levam à ativação de Fos, um componente do fator de transcrição AP-1.

A interação CD28-B7 recruta PI3K (phosphatidyl inositol 3 hydroxy kinase) para a zona de ativação do linfócito T. Os eventos de ativação desta via ainda não foram totalmente esclarecidos. Aparentemente, ocorre aumento da sinalização via JNK (c-Jun N-terminal kinase), que por sua vez, fosforila proteinas da família Jun (c-Jun) aumentando a atividade promotora de transcrição da AP-1 (composto pelas proteínas Jun-Fos). Por outro lado, a ativação de PI3K pode induzir, via Ras, a ativação de ERK.

O resultado final de toda a cascata de transmissão do sinal é a ligação de fatores de transcrição na região promotora 5' do gene da IL-2 desencadeando a transcrição de IL-2.

Para o TCR ( receptor do linfócito T) ficar exposto na superfície da célula, é necessário a presença do CD3, que é formado por um conjunto de 5 polipeptídeos. Quando o TCR unido ao CD3 se combina com o antígeno, o CD3 envia sinais de ativação para o citoplasma. Esse sinal é feito através da ativação da fosforilação pelo GTP (guanosina trifosfato). O complexo TCR:CD3 ativado faz com que o GTP transfira um radical fosfato para os aminoácidos tirosina dos polipeptídeos do CD3, que estando fosforilado vai ativar a enzima fosfolipase C. Essa enzima hidroliza o PIP2 (4,5-bifosfato de fostatidil-inositol) em IP3 (trifosfato de inositol) e DAG (diacil glicerol). O IP3 estimula a liberação do cálcio das reservas intracitoplasmaticas para o citoplasma. O Ca+2 agora livre no citoplasma vai ativar várias enzimas quinases, que retiram um fosfato do ATP e põem em proteínas. As proteínas fosforiladas vão o núcleo do linfócito e ativam a transcrição do RNA mensageiro para a síntese de interleucinas, como a IL-2 p. exemplo. O DAG ativa proteína fosfoquinase C, que em presença de cálcio livre, fica ativada. A enzima fosfoquinase C (PKC) faz fosforilação de proteínas igual ao IP3. Essas fosfoproteínas vão ao núcleo e estimulam transcrição de genes. Oncogenes (genes de cresimento celular e mitose) são também estimulados à transcrição (como na expansão clonal). A PKC faz também a fosforilação de proteínas de liberação das vesículas, que vão liberar as interleucinas para o meio externo. Essas interleucinas vão estimular a RIC ou a RIH (resposta imune humoral).Todo esse mecanismo que causa ativação de genes vindo da interação TCR-CD3-epítopo é chamado de 1º sinal.

A interleucina 1 é um co-estimulador. Ele estimula um segundo sinal mensageiro intracelular que é indispensável para a ativação dos LThelpers. Esse sinal ainda não esclarecido quando a sua natureza resulta na ativação da transcrição de genes para citosinas (como p.ex. a interleucina 2). Temos como conclusão que o linfócito necessita de 2 sinais para a sua ativação: o primeiro sinal vindo a interação TCR:CD3-antígeno e o segundo sinal vindo do co-estimulador IL-1.

A Interleucina 2 formada é uma substância autócrina, que age sobre o próprio linfócito T helper que a produziu e quando liberada também age nos linfócitos T citotóxicos. É chamada de fator de proliferação, pois estimula a mitose. Quando o complexo TCR:CD3 é ativado pelo antígeno ele estimula a transcrição do gene do receptor de interleucina 2 e a expressão desse receptor na superfície da célula. Quando a IL-2 se liga a esse receptor, ocorre ativação de vários mensageiros intracelulares (desconhecidos) que leva a uma maior ativação da síntese DNA (replicação do DNA), o que propicia a mitose aumentada. Então quando os linfócitos entram em contato

com a IL-2, ocorre a expansão clonal (ou seja, uma proliferação de LT específicos que vieram de um só (clone)) do LT helper que a produziu, e expansão do LT citotóxico para a RIC. O gene para IL-2 é ativado para transcrição sob o estímulo de proteínas fosforiladas no citoplasma como foi descrito antes. A ciclosporina é um imunossupressor que inibe essa ativação da transcrição, inibindo a produção de IL-2, o que indiretamente inibe a proliferação dos linfócitos T helper e principalmente os LTcitotóxicos, inibindo a RIC.

Os linfócitos T citotóxicos (LTc) são as células que são capazes de lisar células estranhas, ou infectadas por vírus e também destróem os vírus diretamente. As células estranhas podem ser células tumorais, células de outro indivíduo (aloenxerto), células que expõe na sua superfície o antígeno capsular de vírus, ou fungos...

O reconhecimento das células rejeitadas num enxerto pelos linfócitos T citotóxicos se faz pelo reconhecimento do MHC-classe I. O MHC-classe I é o antígeno de histocompatibilidade principal e está presente na membrana celular de quase todas as células do organismo, exceto em hemácias e plaquetas. É uma glicoproteína que possui duas cadeias , uma cadeia alfa e uma beta. A parte lateral do MHC-classe-1 possui uma estrutura espacial que se encaixa com o CD8 presente nos linfócitos T citotóxicos. O MHC possui uma seqüência de aminoácidos própria para cada indivíduo e se apresenta semelhante para todas as células do organismo. O MHC-1 da células de um indivíduo só é igual ao outro se eles forem gêmeos univitelinos.

A seqüência de aminoácidos presente nas cadeias do MHC estando alteradas na superfície da célula é reconhecida pelo linfócito T citotóxico através da interação com o receptor TCR e CD8. Peptídeo de proteínas endógenas virais produzidas por uma célula infectada será unida em cima da cadeia de aminoácidos de MHC-1 no citoplasma e será levada à superfície da célula. Então o MHC-1 terá na sua ponta uma seqüência de aminoácidos estranha (inválida). Esse MHC-1 alterado é, então, reconhecido pelo LTc. (Veja fig.1.4).

O MHC-I possui um nível de expressão leve, e provém da tradução de RNA-m que foram transcritos por genes HLA-A, HLA-B e HLA-C (cromossoma 6). A expressão desse gene é levada a um nível alto se for estimulada por IFN-gama liberada pelos LT-helper-1 ativados numa infecção.