Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo Seleção de Microalgas com ... · UMinho | 2016 Universidade do...

UM

inho |

2016

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo

Seleção de Microalgas com Potencial

de Produção de Biocombustíveis

Janeiro de 2016

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Dissertação de Mestrado

Mestrado em Bioengenharia

Trabalho efetuado sob a orientação do

Professor Doutor Giuliano Marcelo Dragone Melnikov

e do

Professor Doutor José António Teixeira

Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo

Seleção de Microalgas com Potencial

de Produção de Biocombustíveis

Janeiro de 2016

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

ii

DECLARAÇÃO

Nome: Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo

Endereço eletrónico: [email protected]

Número do Bilhete de Identidade: 134359895

Título da Dissertação: Seleção de Microalgas com Potencial de Produção de Biocombustíveis

Orientadores:

Professor Doutor Giuliano Marcelo Dragone Melnikov

Professor Doutor José António Teixeira

Ano de conclusão: 2016

Designação do Mestrado: Mestrado em Bioengenharia

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE

INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE

COMPROMETE;

Universidade do Minho, 11 de Janeiro de 2016

Assinatura: ______________________________________________________________

iii

AGRADECIMENTOS

Gostaria de expressar o meu profundo agradecimento ao meu orientador, Dr. Giuliano

Dragone, pela simpatia, disponibilidade, conhecimento, dedicação, conselhos e sugestões.

Às minhas amigas, Marisa, Ana, Diana e Joana que sempre me apoiaram, encorajaram e

me proporcionaram muitos momentos felizes. Muito obrigada, sem vocês teria sido mais difícil!

Para finalizar, gostaria de agradecer aos meus pais, Isabel e Cipriano, e ao meu irmão

Miguel, que ao longo da minha formação académica sempre me apoiaram e incentivaram, nunca

deixando de acreditar em mim. Pedro, obrigada pelo conforto que sempre encontrei junto de ti e

pelo teu apoio incondicional.

Obrigada por tudo!

Seleção de microalgas com potencial de produção de biocombustíveis v

RESUMO

A dependência contínua dos combustíveis fósseis é insustentável, devido ao esgotamento das

reservas mundiais e às emissões de gases de efeito de estufa associadas à sua utilização. Portanto,

existem iniciativas de investigação vigorosas destinadas a desenvolver alternativas renováveis. A biomassa é

a fonte de energia renovável mais promissora porque está naturalmente disponível, pode ser produzida em

grandes quantidades e permite a produção de combustíveis líquidos, gasosos ou sólidos com potencial em

diferentes setores. Além disso, é um recurso capaz de ser totalmente renovável e ambientalmente,

socialmente e economicamente sustentável. A biomassa microalgal tem sido reconhecida recentemente.

Microalgas são microrganismos fotossintéticos, com requisitos mínimos de crescimento, que

podem produzir lípidos, proteínas e carbohidratos em grandes quantidades, durante um curto período de

tempo. Estes podem ser processados em biocombustíveis e em coprodutos de valor acrescentado.

Esta dissertação teve como principal objetivo avaliar o potencial de produção de biocombustíveis

de algumas espécies de microalgas. As microalgas selecionadas, Chlorella emersonii ACOI 516, Chlorella

vulgaris ACOI 879 e Chlorella saccharophila ACOI 96, foram cultivadas em cinco meios de cultura

diferentes, MP12, TAP, BG-11, BBM e Chu_13 mod., em fotobiorreatores, com 6 % (v/v) de CO2, uma taxa

de arejamento de 0,2 vvm e 100 µmol de fotões m-2.s-1. Após o cultivo das microalgas nestas condições,

estas foram transferidas para os mesmos meios, no entanto, desprovidos de azoto, durante cerca de 4

dias, a fim de aumentar a concentração de lípidos e/ou amido nas células. O crescimento das microalgas

selecionadas foi monitorizado através da determinação da concentração celular e quantificação da

biomassa produzida. No final dos cultivos nas condições com e sem azoto, as quantidades de lípidos,

amido e proteínas obtidas foram registadas.

Os resultados obtidos demonstraram que o meio MP12 foi um dos melhores para o crescimento

das microalgas. C. vulgaris foi a microalga que obteve valores de concentração celular e peso da biomassa

seca superiores. Para além disso, esta microalga apresentou um conteúdo lipídico de 39,2 % na condição

sem azoto do meio TAP, tendo também atingido o maior valor de produtividade lipídica, nas mesmas

condições (109,57 mg L-1 d-1). Em relação ao conteúdo de amido, C. emersonii foi a microalga que obteve

percentagens superiores – 42,7 % na condição sem azoto do meio BG-11. No entanto, C. vulgaris

demonstrou ser mais adequada para a produção de amido, por ter obtido valores de produtividade

superiores. Estes resultados fazem valer a pena a concretização de mais estudos relativos à otimização das

condições de cultura destas microalgas, visando ainda maiores produções de lípidos e amido e são

passíveis de levar a futuros estudos de ampliação de escala com possibilidade de diminuição dos custos de

produção de biomassa e seus produtos sem necessidade de investimentos adicionais.

Screening of microalgae with potential for biofuels production vii

ABSTRACT

The continuous reliance on fossil fuels is unsustainable, due to the depletion of global

reserves and the greenhouse gas emissions associated with their use. Therefore, there are

vigorous research initiatives intended to develop renewable alternatives. Biomass is the most

promising source of renewable energy because it is naturally available, can be produced in large

quantities and allows the production of liquid, gaseous or solid fuels with potential in different

sectors. Besides, it is a resource capable of being completely renewable and environmentally,

socially and economically sustainable. Microalgal biomass has been recently recognized.

Microalgae are photosynthetic microorganisms with minimum growth requirements that

can produce lipids, proteins and carbohydrates in large quantities in a short period of time. These

products can then be processed into biofuels and in co-products of added value.

The present dissertation aimed to evaluate the potential for biofuels production of some

microalgae species. The selected microalgae, Chlorella emersonii ACOI 516, Chlorella vulgaris

ACOI 879 e Chlorella saccharophila ACOI 96, were grown in five different culture mediums MP12,

TAP, BG-11, BBM and Chu_13 mod., in photobioreactors, with 6 % (v/v) of CO2 at an aeration rate

of 0.2 vvm and 100 µmol photons m-2 s-1. After cultivation of microalgae in these conditions, they

were transferred to the same media, however, with nitrogen deficiency, for about 4 days, in order

to increase the concentration of lipids and/or starch in cells. The microalgae growth was monitored

by determining the cell concentration and quantification of biomass. At the end of cultivation with

nitrogen supply and nitrogen deficiency, the amounts of lipids, starch and proteins obtained were

registered.

The results obtained showed that MP12 is one of the best mediums for microalgae growth.

The highest cellular concentration and biomass dry weight obtained was found to be in C. vulgaris.

In addition, this microalga produced a lipid content of 39.2 % in TAP nitrogen deficiency, having

also reached the highest lipid productivity value, under the same conditions (109.57 mg L-1 d-1). In

relation to starch content, C. emersonii was the one who got higher values – 42.7 % in BG-11

nitrogen deficiency. However, C. vulgaris proved to be the most suitable for starch production by

having higher productivity values. These results makes worthwhile the realization of more studies

on optimization of culture conditions of these microalgae aiming higher yields of lipid and starch

and are likely to lead to future studies of expanding scale with the possibility of reducing production

costs of biomass and its products without need for additional investment.

ix

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS...................................................................................................................... iii

RESUMO ......................................................................................................................................v

ABSTRACT .................................................................................................................................. vii

ÍNDICE ........................................................................................................................................ ix

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................... xiii

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................................... xv

ABREVIATURAS......................................................................................................................... xvii

PREFÁCIO ................................................................................................................................. xix

1. CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO.. .............................................................................................. 1

1.1. Questões ambientais salientes .................................................................................. 3

1.2. Desenvolvimento de recursos de biocombustíveis ...................................................... 5

1.3. Características das microalgas .................................................................................. 6

1.4. Vantagens de usar microalgas para a produção de biocombustíveis ........................... 9

1.5. Biocombustíveis derivados de microalgas ................................................................ 10

1.5.1. Biodiesel ......................................................................................................... 11

1.5.2. Bio-óleo e Gás de Síntese ................................................................................ 14

1.5.3. Bioetanol ........................................................................................................ 15

1.5.4. Bio-hidrogénio ................................................................................................. 19

1.5.5. Biometano ...................................................................................................... 20

1.6. Impacto da seleção da estirpe ................................................................................. 21

1.7. Tecnologias de produção de microalgas .................................................................. 21

1.7.1. Sistemas de produção fotoautotróficos ............................................................ 21

1.7.1.1. Sistemas de cultura abertos ........................................................................ 22

1.7.1.2. Sistemas de cultura fechados ..................................................................... 23

1.7.1.3. Sistemas híbridos ....................................................................................... 24

1.8. Tecnologias de recuperação da biomassa microalgal ............................................... 25

x

1.9. Biocombustíveis de microalgas: que futuro? ............................................................. 26

2. CAPÍTULO II – MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 29

2.1 Microrganismos ............................................................................................................ 31

2.2 Meios de crescimento ................................................................................................... 31

2.3 Cultivo fotoautotrófico ................................................................................................... 37

2.3.1 Crescimento em meio com azoto ........................................................................... 37

2.3.2 Crescimento em meio sem azoto ........................................................................... 38

2.4 Monitorização do crescimento celular ........................................................................... 38

2.5 Caracterização da biomassa ......................................................................................... 38

2.5.1 Análise de amido ................................................................................................... 39

2.5.2 Análise de Proteínas .............................................................................................. 40

2.5.3 Análise de Lípidos ................................................................................................. 40

2.6 Determinação das Produtividades ................................................................................. 41

3. CAPÍTULO III – RESULTADOS ............................................................................................ 43

3.1 Crescimento das microalgas em meio com azoto .......................................................... 45

3.1.1 Chlorella emersonii ................................................................................................ 45

3.1.2 Chlorella vulgaris ................................................................................................... 46

3.1.3 Chlorella saccharophila .......................................................................................... 47

3.2 Crescimento das microalgas em meio sem azoto .......................................................... 48

3.3 Análise da Biomassa .................................................................................................... 51

3.3.1 Proteínas ............................................................................................................... 51

3.3.2 Lípidos .................................................................................................................. 52

3.3.3 Amido ................................................................................................................... 53

3.4 Determinação das Produtividades ................................................................................. 54

xi

4. CAPÍTULO IV – DISCUSSÃO DOS RESULTADOS .................................................................. 57

5. CAPÍTULO V – CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS ................................... 71

6. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 75

xiii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO

Figura 1 - Vias de produção de biocombustíveis a partir de microalgas. ...................................... 11

Figura 2 - Transesterificação do óleo para biodiesel. R1-3 são grupos hidrocarboneto. ................... 14

Figura 3 - Procedimento para a produção de bioetanol a partir de microalgas. ............................ 18

Figura 4 - Vista aérea de um raceway pond. ............................................................................... 22

CAPÍTULO III - RESULTADOS

Figura 5 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C.

emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto. .................................. 45

Figura 6 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris

ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto. ................................................. 47


saccharophila ACOI 89, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto. ............................. 48


emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto. .................................. 49

Figura 9 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris

ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto. .................................................. 50


saccharophila ACOI 96, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto. .............................. 51

Figura 11 - Percentagem de proteínas em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e

C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, nas condições com e sem azoto e

com e sem pré-tratamento com NaOH. N – Não determinado. ................................................... 52

Figura 12 - Percentagem de lípidos em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C.

saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e

sem azoto. N – Não determinado. .............................................................................................. 53

Figura 13 - Percentagem de amido em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C.

saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e

sem azoto. N – Não determinado. .............................................................................................. 54

xv

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II – MATERIAIS E MÉTODOS

Tabela 1 - Concentração dos reagentes usados no meio MP12. .................................................. 31

Tabela 2 - Concentração dos reagentes usados na preparação das soluções stock do meio TAP. 32

Tabela 3 - Composição do meio BG-11. ...................................................................................... 33

Tabela 4 - Composição da solução de micronutrientes do meio BG-11. ....................................... 33

Tabela 5 - Composição do meio Chu_13 modificado. ................................................................. 34

Tabela 6 - Soluções stock constituintes do meio BBM. ................................................................ 34

Tabela 7 - Soluções stock constituintes do meio BBM. ................................................................ 35

Tabela 8 - Concentração dos reagentes utilizados nos cinco diferentes meios de cultura. ............ 35

CAPÍTULO III - RESULTADOS

Tabela 9 - Produtividades obtidas (biomassa, lípidos, amido e proteínas) para as microalgas C.

emersonii ACOI 516, C. vulgaris ACOI 879 e C. saccharophila ACOI 96 nos meios MP12, TAP, BG-

11, BBM e Chu_13 mod. nas condições com e sem azoto. ........................................................ 56

xvii

ABREVIATURAS

MMbbl Million barrels

EISA Energy Independence and Security Act

ATP Adenosina trifosfato

AGL Ácidos gordos livres

TAG Triacilglicerídeo

FBR Fotobiorreator

vvm Volume de gás por volume de suspensão de cultura por minuto

rpm Rotações por minuto

xix

PREFÁCIO

Tendo em conta a crise energética em que se vive atualmente, causada pelo aumento da

população mundial e pelas tendências atuais de consumo (nomeadamente de combustíveis

fósseis), surgiu a necessidade de investigar energias renováveis que possam substituir

parcialmente os recursos petroquímicos. As microalgas têm sido reconhecidas recentemente

como fontes promissoras de biocombustíveis. Estas caracterizam um grupo diversificado de

microrganismos aquáticos, capazes de produzir O2, aumentando a sua concentração na atmosfera.

O crescimento de uma população de microalgas está dependente de vários fatores,

nomeadamente, o tempo de exposição à luz, a intensidade e o comprimento de onda da fonte

luminosa, a presença de nutrientes essenciais no meio, tais como, azoto (N) e fósforo (P); o local

onde as microalgas são cultivadas, o arejamento das culturas e as variações de pH. Sob todas as

condições favoráveis, estes microrganismos são capazes de elevadas velocidades de crescimento.

Para além disso, quando comparadas com outras fontes de biocombustíveis, como é o caso dos

biocombustíveis de 1ª e 2ª geração, algumas das suas principais vantagens são o facto de

permitirem a melhoria da qualidade do ar; possuírem alta capacidade de adsorção de carbono;

alto teor de lípidos; exigirem um meio de crescimento simples; apresentarem taxas de crescimento

rápidas e tempos de geração curtos; não necessitarem de terrenos aráveis e poderem ser

cultivadas em águas salobres; a sua produtividade não ser suscetível a variações sazonais e

geográficas; não necessitarem de herbicidas; terem capacidade de remover fosfatos e nitratos de

águas residuais e produzirem subprodutos valiosos para fins comerciais ou com propósito

farmacêutico.

O conceito de bioconversão em microalgas traduz-se na utilização do processo

fotossintético para a produção de biomassa para ser usada como uma fonte de energia e de

produtos químicos. Algumas espécies de microalgas são conhecidas como produtores naturais de

ácidos gordos e hidratos de carbono, o que faz destas, candidatas ideais para a produção de

biodiesel e bioetanol. O teor de óleo nalgumas espécies do género Chlorella pode variar de cerca

de 14 a 63 % do peso seco. Estima-se que aproximadamente entre 46,760 - 140,290 L ha-1 de

etanol podem ser produzidos a partir de microalgas. Adicionalmente, a biomassa microalgal pode

ser submetida a um processo de digestão anaeróbio, fazendo, desta forma, com que possa ser

usada para a produção de biometano. A produção de hidrogénio também é possível graças à

produtividade fotossintética reconhecida nestes microrganismos.

xx

O conteúdo em lípidos e hidratos de carbono pode aumentar nalgumas espécies de

microalgas, se algumas condições do cultivo forem alteradas, como por exemplo, reduzindo a

composição de elementos químicos necessários ao crescimento e divisão das células. Para além

disso é possível aumentar o conteúdo destas macromoléculas no interior das células, otimizando

alguns fatores determinantes como é o caso da intensidade da luz, da temperatura, salinidade e

da concentração de CO2 no meio de crescimento.

Desta forma, o principal objetivo da presente dissertação foi avaliar o potencial de

produção de biocombustíveis de três espécies diferentes de Chlorella – C. emersonii, C. vulgaris e

C. saccharophila. Para isso, estas espécies foram colocadas a crescer em diferentes meios de

cultura, em condições específicas. A concentração celular e a quantidade de biomassa produzida

foram analisadas ao longo do tempo. No final de cada crescimento, procedeu-se à extração de

lípidos, amido e proteínas presentes nas células. Para além disso, metade da biomassa obtida no

final do crescimento em condições normais foi transferida para meios desprovidos de azoto, com o

objetivo de aumentar a concentração de lípidos e/ou amido nas células.

A presente dissertação está organizada em cinco capítulos. O capítulo 1 apresenta uma

breve revisão das bases teóricas associadas a este trabalho, incluindo as questões ambientais

salientes; o desenvolvimento de recursos de biocombustíveis; características das microalgas e as

vantagens do seu uso para a produção de biocombustíveis. O capítulo 2 inclui os materiais e

métodos utilizados no trabalho experimental. No capítulo 3, todos os resultados obtidos são

apresentados. O capítulo 4 apresenta a discussão dos resultados obtidos. Finalmente, o capítulo 5

destaca as principais conclusões obtidas a partir do trabalho realizado e apresenta algumas

sugestões para trabalho futuro.

1. CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO | 3

1.1. Questões ambientais salientes

O rápido crescimento da população mundial e a ascensão de países em desenvolvimento

tem levado ao aumento das necessidades energéticas (Harun, Danquah, et al. 2010). Por isso,

hoje em dia, a escassez dos recursos da petroquímica e o problema de poluição ambiental são

dois desafios críticos, que precisam de ser abordados pela nossa sociedade.

Segundo a revisão estatística da energia mundial referente ao ano de 2013, da British

Petroleum (BP), o petróleo continua líder do combustível no mundo, com 32,9 % do consumo

mundial de energia. Globalmente, o gás natural representa 23,7 % do consumo de energia

primária. A participação do carvão no consumo global de energia primária atingiu 30,1 %,

enquanto a energia nuclear e a hidroeletricidade contam com 4,4 % e 6,7 % do consumo total de

energia primária, respetivamente (BP 2014).

No Reference case do International Energy Outlook 2014 (IEO2014), prevê-se que o

consumo de combustíveis líquidos no mundo aumente por mais de um terço (33 milhões de barris

de petróleo por dia (MMbbl d-1), de 87 MMbbl d-1 registados em 2010 para 119 MMbbl d-1 em 2040

(EIA-DOE 2014).

Todas as fontes de energia não-renováveis que existem para além do petróleo, como é o

caso do gás natural, da energia nuclear (proveniente do urânio, por exemplo) e do carvão mineral

são limitadas e inevitavelmente a sua disponibilidade também diminuirá. O carvão é o candidato

imediato provável para substituir o petróleo como fonte de energia quando este se esgotar de

forma definitiva. É rico em energia, pode ser convertido em combustível líquido, e ainda é muito

abundante. No entanto, como o uso de carvão, em relação ao petróleo produz ainda maior

quantidade de emissões de CO2, o esgotamento do petróleo não irá ajudar na diminuição dos

níveis de CO2 na atmosfera (Campbell 2008).

De acordo com os resultados da literatura científica, a poluição ambiental é causada

principalmente pela utilização de enormes quantidades de combustíveis fósseis, e o impacto dos

seus co - produtos causa a poluição do ar, o aquecimento global, poluição da água e dos solos,

derramamentos de óleo e efeitos na saúde adversos (Arora 2012).

Os principais produtos provenientes da combustão dos combustíveis fósseis são o dióxido

de carbono (CO2), óxidos de azoto e hidrocarbonetos, incluindo uma mistura de gases comumente

denominados por gases do efeito de estufa, que provocam desequilíbrio ambiental e alterações

climáticas. Entre todos os gases emitidos pelos combustíveis fósseis, o CO2 é um dos mais

4 | INTRODUÇÃO

significantes, tendo aumentado a sua percentagem na atmosfera 25 % desde que se iniciou a

combustão dos combustíveis fósseis e prevê-se que aumente 1,9 % cada ano (Arora 2012).

Desta forma, a emissão de CO2 deve ser consideravelmente alta num futuro próximo.

Assim há uma necessidade urgente de neutralizar o efeito do CO2 na atmosfera para continuar o

crescimento económico e manter os padrões de vida. Nesta perspetiva, várias técnicas podem ser

aplicadas. Uma técnica óbvia é reduzir o consumo de energia, no entanto, o aumento da

população e o estilo de vida humana são os principais obstáculos para implementar isso. O

armazenamento do CO2 libertado pode ser outra solução (Chiu et al. 2008; Abbas et al. 2014). No

entanto, tanto barreiras técnicas como económicas limitam esta aplicação.

Devido à preocupação com o aquecimento global, que pode ser atribuído, principalmente,

ao elevado nível de CO2 na atmosfera (Kondili & Kaldellis 2007; Román-Leshkov et al. 2007), a

Organização das Nações Unidas promoveu o Protocolo de Quioto (1997), com o objetivo de

reduzir os gases de efeito estufa 5,2 % com base na emissão de 1990, e mais de 170 países

ratificaram o protocolo (Gutiérrez et al. 2008).

Vários investigadores começaram a procurar alternativas de energias renováveis que

podem substituir parcialmente os recursos dos combustíveis fósseis para o estabelecimento de

uma sociedade mais sustentável e promover a recuperação económica no mundo.

A biomassa é uma das mais importantes fontes de energia renováveis. Esta faz uso do ar,

água, solo e da fotossíntese para produzir bioenergia. Pode ser extraída a partir de cultivos

alimentares, resíduos de cultivos, madeira, lixo, excremento de animais e algas marinhas, etc. As

principais vantagens da utilização de biomassa são o facto de ser renovável e menos poluidora.

Biocombustíveis e biogases são produzidos a partir de biomassa como uma alternativa aos

combustíveis provenientes do petróleo. Atualmente, a nível mundial, o desenvolvimento da

biomassa tornou-se um caminho importante para ajustar a estrutura de energia e reduzir as

emissões dos gases com efeito de estufa a fim de encontrar a sustentabilidade ambiental e

económica (Berndes et al. 2003).

Consequentemente, muitos países estabeleceram metas nacionais de produção de

biocombustíveis e proporcionam incentivos e apoios para acelerar o crescimento da indústria de

bioenergia. Por exemplo, nos EUA a Renewable Fuels Standard (RFS), parte da Energy

Independence and Security Act (EISA) de 2007, estabeleceu a meta de produção anual de ≈ 136

mil milhões de litros de biocombustíveis até 2022 (U.S. Congress 2007).

INTRODUÇÃO | 5

Para evitar impactos adversos sobre a oferta de alimentos para consumo do Homem, a

EISA especifica ainda que 60 dos 136 mil milhões de litros de combustíveis renováveis produzidos

em 2022 devem ser biocombustíveis avançados produzidos a partir de biomassa algal, por

exemplo. No entanto, a capacidade de produção atual de biocombustíveis avançados é inferior a

37 mil milhões de litros em todo o mundo (Yue et al. 2014).

1.2. Desenvolvimento de recursos de biocombustíveis

A biomassa é a fonte de energia renovável mais promissora porque está naturalmente

disponível, pode ser produzida em grandes quantidades e permite a produção de combustíveis

líquidos, gasosos ou sólidos com potencial em diferentes sectores. Além disso, é um recurso

capaz de ser totalmente renovável e ambientalmente, socialmente e economicamente sustentável

(Demirbas 2008).

Os cultivos alimentares têm sido amplamente utilizados na produção industrial de

biocombustíveis, como os principais representantes da primeira geração de biocombustíveis. As

matérias-primas podem ser divididas em três categorias, culturas de açúcar (cana-de-açúcar e

beterraba), culturas de amido (milho, trigo e sorgo) e oleaginosas (colza, soja e girassol). Todas

estas matérias-primas podem ser convertidas para biocombustíveis por meio de técnicas

diferentes. Mas o desenvolvimento da primeira geração de biocombustíveis apresenta alguns

problemas. As culturas alimentícias não só têm um ciclo mais longo de crescimento, como

também exigem grandes áreas de terra arável. À medida que a primeira geração de

biocombustíveis foi alargando a escala de produção, um grande lote de terra arável foi ocupada, o

que conduziu, por um lado, à desflorestação, degradação dos solos e erosão (impactos causados

pela aplicação de fertilizantes, pesticidas e herbicidas) e à devastação da biodiversidade (Puppán

2002; Escobar et al. 2009); por outro lado, ao agravamento da fome e da pobreza nos países em

desenvolvimento, uma vez que, os terrenos aráveis antes dedicados ao cultivo de bens alimentares

estão destinados à produção de matéria-prima para a produção de biocombustíveis para alimentar

os mercados dos países desenvolvidos (C. Ford & Senauer 2007).

Portanto, utilizar culturas alimentares para resolver a crise energética aumenta a crise

alimentar.

A produção de biocombustíveis a partir de Jatropha, mandioca, Miscanthus, materiais

lignocelulósicos, resíduos de exploração florestal, resíduos agrícolas (folhas, palha ou aparas de

6 | INTRODUÇÃO

madeira), bem como os componentes não comestíveis do milho ou da cana-de-açúcar são

exemplos de biocombustíveis de segunda geração (Dragone et al. 2010; de Vries et al. 2010).

Uma vez testada a viabilidade de produção dos biocombustíveis de segunda geração,

espera-se que estas matérias-primas possam desacelerar a escassez de alimentos e os problemas

de recuperação de terras. Mas, mesmo que o preço das matérias-primas dos biocombustíveis de

segunda geração sejam inferiores e que essas matérias-primas apresentem grandes quantidades

de celulose, o custo de produção é muito mais elevado em relação à primeira geração de

biocombustíveis, porque a conversão da biomassa em açúcares fermentáveis envolve um pré-

tratamento com enzimas especiais (Sims & Taylor 2008; Brennan & Owende 2010).

As matérias-primas para os biocombustíveis de terceira geração são os microrganismos

aquáticos. As microalgas estão a liderar o desenvolvimento da terceira geração de

biocombustíveis. As principais vantagens da sua utilização são a alta capacidade de adsorção de

carbono; alto teor de lípidos; meio de crescimento simples e tempo de crescimento curto. O seu

ciclo de colheita varia aproximadamente de entre 1 a 10 dias, dependendo do processo,

permitindo colheitas múltiplas ou contínuas com aumento significativo no rendimento (Schenk et

al. 2008). E, em comparação com a soja, por exemplo, o teor de lípidos de microalgas pode ser

25 a 200 vezes superior. O óleo extraído das microalgas pode ser transformado em biodiesel; os

seus hidratos de carbono podem ser fermentados para álcool, e o azoto e o fósforo podem ser

reciclados e usados como fertilizantes (Maity et al. 2014).

Desta forma, para que os recursos de biocombustíveis sejam tecnicamente e

economicamente viáveis devem cumprir alguns requisitos, tais como (Himmel et al. 2007): ser

competitivos ou custar menos do que os combustíveis de petróleo; exigir baixo ou nenhum uso

adicional de terras; permitir a melhoria da qualidade do ar e exigir o uso mínimo de água. Utilizar

microalgas como fonte de biocombustíveis pode atender a estas condições e, portanto, fazer uma

contribuição significativa para responder à demanda de energia primária, proporcionando

simultaneamente benefícios ambientais (Bai et al. 2008).

1.3. Características das microalgas

Ao contrário das plantas, as microalgas não possuem raízes, caules, folhas e vasos

condutores (xilema/floema) (Croft et al. 2006). O termo microalga é normalmente uma referência

INTRODUÇÃO | 7

a formas eucariotas mas muitas vezes é estendido na literatura para incluir cianobactérias

(Mutanda et al. 2011).

As microalgas caracterizam um incrível e diversificado grupo polifilético de organismos

com representantes procariotas e eucariotas (Croft et al. 2006). Acredita-se que existam entre 200

a 800 mil espécies (Ratha & Prasanna 2012), no entanto, apenas alguns milhares são mantidos

em coleções e apenas algumas são cultivadas em escala industrial (Parmar et al. 2011).

De acordo com Tomaselli (2004), as microalgas têm sido tradicionalmente classificadas

por vários critérios, tais como o tipo de pigmentos, a natureza química dos produtos de reserva e

pelos constituintes da parede celular. Também tem sido tomado em conta aspetos morfológicos e

citológicos, tais como a ocorrência de células flageladas, a estrutura dos flagelos, os processos de

formação do núcleo e a divisão celular, a presença de um envelope no retículo endoplasmático em

torno do cloroplasto e a conexão entre o retículo endoplasmático e a membrana nuclear (Tomaselli

2004; Dragone et al. 2010). Muitas espécies são altamente adaptáveis na sua morfologia, facto

que pode tornar duvidosa a sua classificação (Surek 2008).

As três classes mais importantes em termos de abundância são as diatomáceas

(Bacillariophyceae), as algas castanhas (Chrysophyceae), e as algas verdes (Chlorophyceae). O

grupo maior de Chlorophyceae é constituído por várias formas marinhas e de água doce,

unicelulares e filamentosas, com uma área geográfica ampla e taxas de crescimento rápido. Este

grupo inclui as espécies mais estudadas, tais como Chlorella spp., Chlamydomonas spp.,

Dunaliella spp. e Haematococcus spp. (Pulz & Gross 2004).

As cianobactérias também são referidas como microalgas, que no fitoplâncton,

representam a forma dominante de vida e provavelmente o maior grupo produtor de biomassa na

Terra.

Todas elas são capazes de produzir O2, aumentando a sua concentração na atmosfera,

através do uso de pigmentos fotossintéticos; têm gamas de tamanhos celulares que podem variar

entre 2 a 200 μm e várias estratégias de alimentação, das autotróficas às heterotróficas (Barsanti

& Gualtieri 2006). A grande maioria das microalgas apresenta um metabolismo autotrófico

fotossintético que se caracteriza pela sua capacidade de sintetizar matéria orgânica de reserva a

partir de carbono inorgânico (nomeadamente CO2 atmosférico), através do processo de

fotossíntese (Richmond 2004; Sukahara & Awayama 2005; Eshaq et al. 2010). Dentro das

autotróficas, podem ser fotoautotróficas, usando a luz como fonte de energia, ou

quimioautotróficas, oxidando compostos inorgânicos para obtenção de energia (Dragone et al.

8 | INTRODUÇÃO

2010). Para as algas autotróficas, a fotossíntese é um componente chave na sua sobrevivência,

através do qual convertem radiação solar e CO2, absorvido pelos cloroplastos, em adenosina

trifosfato (ATP) e O2, a energia utilizável a nível celular, que é depois usada na respiração para

produzir energia e apoiar o crescimento celular (Brennan & Owende 2010; Dragone et al. 2010).

Muitas outras espécies apresentam outros tipos de metabolismo, nomeadamente as microalgas

heterotróficas que utilizam somente compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia.

Dentro desta classe, podem ser fotoheterotróficas, usando a luz como fonte de energia, ou

quimioheterotróficas, oxidando compostos orgânicos para receber energia. O meio de cultura

heterotrófico é bastante similar ao meio de cultura autotrófico com a exceção de que é adicionado

um composto de carbono orgânico, normalmente glucose, acetato ou glicerol e crescem na

ausência de luz. Por norma, estas culturas heterotróficas apresentam algumas desvantagens,

nomeadamente na limitação de espécies de microalgas que conseguem crescer desta forma; no

aumento dos custos devido à adição de mais um composto no meio, o carbono orgânico; na

contaminação e competição por outros microrganismos e inibição por excesso de substrato

orgânico (Lee Y.K. 2004; Perez-Garcia et al. 2011). Algumas microalgas fotossintéticas são

mixotróficas, ou seja, são capazes de viver de modo autotrófico ou heterotrófico, dependendo da

concentração de compostos orgânicos e da intensidade de luz disponível, podendo também ser

designadas por autotróficas facultativas (Ferreira & Sousa 1998; Lee 2008).

As respostas aos estímulos ou às mudanças ambientais são inerentes a todos os

organismos vivos. Nas microalgas, as condições ambientais afetam o crescimento celular,

podendo reduzir a sua taxa de crescimento ou alterar alguma reação bioquímica. Pode também

provocar um desequilíbrio metabólico, desencadeando ajustes bioquímicos, induzindo as células a

estabelecer um novo estado de crescimento e biossíntese (Vonshak & Torzillo 2004).

O crescimento de uma população de microalgas é resultado da interação entre fatores

biológicos, físicos e químicos. Os fatores biológicos estão relacionados com as taxas metabólicas

da espécie cultivada. Os fatores físico-químicos são principalmente a luz, a temperatura, a

salinidade e a disponibilidade de nutrientes (Lourenço 2006).

O tempo de exposição à luz, conhecido como fotoperíodo, a intensidade e o comprimento

de onda da fonte luminosa é de importância fundamental para as microalgas, porque o aumento

da luz proporcional ao nível de saturação ou de máxima produção celular pode causar inibição da

atividade fotossintética (Boney 1989)

INTRODUÇÃO | 9

Em relação à nutrição, para um crescimento ótimo, as microalgas têm necessidade de

uma série de nutrientes (Lourenço 2006). O meio de crescimento deve fornecer os elementos

inorgânicos que constituem a célula das algas. Elementos essenciais incluem azoto (N) e fósforo

(P). Requisitos nutricionais mínimos podem ser estimados usando a fórmula molecular

aproximada da biomassa microalgal, que é CO0.48H1.83N0.11P0.01 (Chisti 2007; Dragone et al. 2010;

Grobbelaar 2007). O azoto é muitas vezes fornecido na forma de nitrato (NO3-), mas também

frequentemente através da amónia (NH4+) e da ureia. A ureia é mais favorável como fonte de azoto

porque, para uma concentração equivalente de azoto, proporciona rendimentos mais elevados e

provoca variações de pH inferiores no meio, durante o crescimento celular (Shi et al. 2000;

Dragone et al. 2010). Por outro lado, nutrientes como o fósforo (P) devem ser fornecidos em

excesso significativo porque os fosfatos adicionados ligam-se aos iões metálicos, por isso nem

todos os P ficam disponíveis para consumo (Chisti 2007). Além disso, o crescimento das

microalgas depende não só de um fornecimento adequado de macronutrientes essenciais como

carbono, azoto, fósforo e silício e iões maiores como Mg2+, Ca2+, Cl-, e SO42- mas também de um

número de micronutrientes como ferro, manganésio, zinco, cobalto, cobre e molibdénio (Sunda et

al. 2005; Dragone et al. 2010). Algumas microalgas também necessitam de baixas concentrações

de vitaminas no meio de cultura (Robert R. L. Guillard 1975).

Além dos fatores anteriormente descritos, outros podem influenciar o desenvolvimento das

culturas, como o local onde as microalgas são cultivadas, o arejamento das culturas e as variações

de pH (Richmond 1990).

Sob todas as condições favoráveis, as microalgas podem apresentar elevadas velocidades

de crescimento. Em geral, a maioria das microalgas tem um tempo de duplicação da biomassa de

cerca de 24 h mas, em casos muito favoráveis, poderá atingir 3,5 h durante a fase exponencial de

crescimento (Chisti 2007).

1.4. Vantagens de usar microalgas para a produção de biocombustíveis

As microalgas têm rendimentos elevados de energia solar; taxas rápidas de crescimento e

tempos de geração curtos e são vulgarmente conhecidas por duplicarem a sua biomassa no

período de 24 h, o que permite colheitas múltiplas e contínuas de biomassa durante todo o ano

(Chisti 2007; Schenk et al. 2008). Algumas espécies têm tempos de duplicação tão curtos quanto

3,5 h, o que resulta em múltiplas divisões da sua biomassa por dia; necessitam de menos água

10 | INTRODUÇÃO

doce para cultivo, do que as plantas terrestres (Ahmad et al. 2011; Li, Horsman, Wu, Lan &

Dubois-calero 2008); o cultivo de microalgas pode ocorrer em terrenos não aráveis e em águas

salobres (Li, Horsman, Wu, Lan & Dubois-calero 2008), reduzindo a pressão sobre os recursos

necessários para a produção de culturas alimentares, assim como, prevenindo efeitos ambientais

adversos. Não têm necessidade de utilização de produtos químicos, como herbicidas ou

pesticidas, diminuindo, por isso, os custos e os impactos ambientais (Rawat et al. 2011);

adicionalmente, estes microrganismos requerem menor espaço terrestre para serem cultivados,

cerca de 2 % da terra necessária para produzir a mesma quantidade de biodiesel a partir de

culturas oleaginosas (Ahmad et al. 2011); durante o crescimento das microalgas, estas têm

capacidade de remover fosfatos e nitratos de águas residuais, que usam como substrato para o

seu crescimento, o que consequentemente favorece a produção de biocombustíveis e, ao mesmo

tempo, faz com que estas contribuam para o tratamento terciário de águas residuais. Algumas

microalgas produzem subprodutos valiosos na forma de proteínas, pigmentos, biopolímeros,

incluindo substâncias antioxidantes para fins comerciais ou com propósito farmacêutico (Brennan

& Owende 2010; Ahmad et al. 2011; Rawat et al. 2011; Kumar et al. 2014); o custo associado à

colheita e ao transporte da biomassa é relativamente baixo quando comparado com o de culturas

oleaginosas. A biomassa residual pode ser usada como fertilizante ou na produção de outros

produtos de alta energia, podendo desta forma contribuir para melhoras na economia (Ahmad et

al. 2011).

1.5. Biocombustíveis derivados de microalgas

A biomassa pode ser convertida em formas utilizáveis usando uma variedade de maneiras

diferentes (Figura 1). As reações de conversão da biomassa em energia podem ser bioquímicas e

termoquímicas. A conversão termoquímica é a decomposição térmica dos componentes orgânicos

da biomassa para produzir produtos de combustão. Exemplos deste tipo de conversão são a

gaseificação, a pirólise e a liquefação. Exemplos de conversões bioquímicas são a fermentação, a

digestão anaeróbia, as células de combustível, e outros processos de produção de combustível

utilizando o metabolismo dos organismos. As vias biológicas para conversão da biomassa são

geralmente mais eficientes em termos de reciclagem de nutrientes e de matéria orgânica.

A produção fotobiológica de combustíveis e produtos químicos a partir de microalgas é,

provavelmente, uma das iniciativas mais importantes no sentido de estabelecer uma importante

INTRODUÇÃO | 11

fonte de fornecimento de energia renovável. O conceito de bioconversão por microalgas é a

utilização do processo fotossintético para a produção de biomassa para ser usada como uma fonte

de energia e de produtos químicos. Um rendimento de produção de microalgas de 15 - 25 tpeso-seco

ha-1 ano-1 foi alcançado ao longo de um período relativamente longo e algumas microalgas são

conhecidas como produtores naturais de ácidos gordos e hidratos de carbono (Du et al. 2008).

Figura 1 – Vias de produção de biocombustíveis a partir de microalgas (Mussatto et al. 2010).

1.5.1. Biodiesel

O conceito de utilização de combustível à base de óleos vegetais remonta a 1895, quando

o Dr. Rudolf Diesel desenvolveu o primeiro motor de ignição por compressão especificamente para

funcionar com óleos vegetais. Uma vez que o biodiesel tem propriedades semelhantes ao diesel

convencional, pode ser misturado em qualquer proporção com o diesel proveniente do petróleo e

pode ser utilizado em motores diesel sem grandes modificações (Puppán 2002).

Trata-se de um combustível de queima limpa, oxigenado e à base de ésteres

monoalquílicos, que pode ser feito a partir dos lípidos extraídos das microalgas. É renovável,

simples de usar, apresenta características de alta combustão, biodegradável, não tóxico, e

essencialmente livre de enxofre e compostos aromáticos (Puppán 2002).

12 | INTRODUÇÃO

A produção de biodiesel a partir de microalgas é um processo de quatro etapas: cultivo

das microalgas, colheita, extração dos lípidos, e conversão em biodiesel. A extração dos lípidos

exige rompimento celular por métodos que podem ser mecânicos, químicos, ou biológicos ou

podem também ser extraídos com a utilização de solventes.

Para maior rendimento deste processo, já foram avaliadas técnicas que envolvem a

utilização de enzimas, radiação micro-ondas, sonicação, água quente, e organoclorados

(compostos orgânicos que contêm, pelo menos, um átomo de cloro ligado covalentemente) (Halim

et al. 2012).

Pelo facto da parede celular das microalgas ser tipicamente espessa e forte, foram

sugeridos métodos de rutura celular severos, que usam peróxido de hidrogénio como agente

oxidante ou água quente contendo ácido sulfúrico, para obtenção de rendimentos de extração de

lípidos superiores (Lee et al. 2013; Park et al. 2014). Os lípidos extraídos das microalgas podem

ser de diversos tipos, tais como, lípidos neutros (triacilglicerídeos), glicolípidos, fosfolípidos e

ácidos gordos livres (AGL) (Prabhakara Rao et al. 2013). Entre todos, os triacilglicerídeos e os AGL

são os principais recursos para a conversão em biodiesel.

Muito do trabalho de investigação em curso foca-se num pequeno número de espécies de

microalgas de rápido crescimento que tenham sido descritas como capazes de acumular

quantidades substanciais de lípidos, embora sob condições específicas. Dentro das algas verdes,

espécies típicas incluem Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella salina, e várias espécies de

Chlorella, bem como Botryococcus braunii, que apesar de crescimento lento podem acumular

grandes quantidades de lípidos (Dragone et al. 2010).

O rendimento de óleo das microalgas e o perfil dos ácidos gordos pode variar de acordo

com as espécies e com as condições do cultivo. O teor de óleo nalgumas espécies do género

Chlorella (Chlorophyta) pode variar de cerca de 14 a 63 % do peso seco, e a composição de ácidos

gordos foi relatada como podendo variar de C-14:0 a C-20:0 (Tang et al. 2011).

O conteúdo lipídico pode aumentar nalgumas espécies de microalgas, se algumas

condições do cultivo forem alteradas, como por exemplo, reduzindo a composição de elementos

químicos necessários ao crescimento e divisão das células (Sheehan et al. 1998). Nesta situação,

as células param de proliferar, mas é mantida a fixação de CO2, que é então convertido em

glucose, em seguida em ácidos gordos e, finalmente, em triacilglicerídeos (TAG) (Hu et al. 2008).

Isto pode ser explicado pelo facto de, por exemplo, o azoto ser essencial para a síntese de

proteínas e ácidos nucleicos e a sua privação faz com que a célula deixe de ter substrato para se

INTRODUÇÃO | 13

multiplicar, continuando a contar, no entanto, com o mecanismo desenvolvido para a fixação de

CO2 (Xin et al. 2010). Desta forma, o conteúdo lipídico pode aumentar até 2 vezes (Illman et al.

2000; Fidalgo et al. 1998).

De forma a aumentar a concentração de lípidos no interior das células de microalgas, é

possível otimizar alguns fatores de crescimento determinantes, como a intensidade da luz, os

níveis de azoto, a temperatura, a salinidade, a concentração de CO2 e os procedimentos de

colheita (Dragone et al. 2010).

No entanto, aumentar a acumulação de lípidos não resultará no aumento da produtividade

de lípidos, uma vez que a produtividade da biomassa e a acumulação de lípidos não estão

necessariamente correlacionados (Rodolfi et al. 2009; Sheehan et al. 1998). A acumulação de

lípidos refere-se ao aumento da concentração de lípidos no interior das células de microalgas sem

ter em conta a produção total de biomassa. A produtividade de lípidos leva em conta tanto a

concentração de lípidos no interior das células, como a biomassa produzida por estas células e é,

portanto, um indicador mais útil dos potenciais custos de produção de biocombustíveis líquidos

(Brennan & Owende 2010; Dragone et al. 2010).

A adaptação das microalgas a mudanças ambientais é normalmente resultado de uma

mudança no padrão dos lípidos e na síntese de vários compostos incomuns (Guschina & Harwood

2006). Esta é provavelmente a razão pela qual as microalgas têm uma superprodução de ácidos

gordos quando sujeitas a condições de stresse.

A caracterização dos lípidos é um requisito, uma vez que, espécies diferentes de

microalgas produzem diferentes tipos de ácidos gordos. Alguns ácidos gordos são mais adequados

para a transesterificação em biodiesel do que outros. A maior parte dos óleos das microalgas são

ricos em ácidos gordos polinsaturados com quatro ou mais ligações duplas. O problema associado

a este grau de polinsaturação é, estes ácidos gordos e os ésteres metílicos de ácidos gordos são

suscetíveis à oxidação durante o armazenamento, reduzindo assim a sua aceitabilidade para

utilização no biodiesel (Chisti 2007).

Para a produção de biodiesel, três moléculas de ácidos gordos são esterificadas com uma

molécula de glicerol (Chisti 2007). Os TAG são colocados a reagir com metanol numa reação

conhecida como transesterificação ou alcoólise. A transesterificação produz ésteres metílicos de

ácidos gordos, que são biodiesel, e glicerol (Figura 2). A reação ocorre por etapas: inicialmente, os

TAG são convertidos para diglicerídeos, depois para monoglicerídeos e, em seguida, para gliceróis.

A transesterificação requer 3 mol de álcool por cada mol de TAG, para produzir 1 mol de glicerol e

14 | INTRODUÇÃO

3 mol de ésteres metílicos (Figura 2). A reação é um equilíbrio. Os processos industriais usam 6

mol de metanol por cada mol de TAG (Fukuda et al. 2001). Este excesso de metanol garante que a

reação é conduzida na direção dos ésteres metílicos, ou seja, no sentido do biodiesel. A

transesterificação é catalisada por ácidos, bases (Fukuda et al. 2001; Meher et al. 2006) ou por

lipases (Sharma et al. 2001). Quando catalisada por uma base é cerca de 4000 vezes mais rápida

do que quando catalisada por um ácido (Fukuda et al. 2001). O uso de lipases oferece vantagens

importantes, mas não é atualmente possível por causa do custo relativamente alto deste

catalisador (Fukuda et al. 2001).

Figura 2 - Transesterificação do óleo para biodiesel. R1-3 são grupos hidrocarboneto (Chisti 2007).

Outros álcoois, em vez do metanol, podem ser usados, mas o metanol é o menos caro.

Para evitar a perda de rendimento devido a reações de saponificação (ou seja, formação de

sabão), o óleo e o álcool devem estar secos e o óleo deve ter um mínimo de AGL. O biodiesel é

recuperado por lavagens repetidas com água para remover o glicerol e o metanol (Chisti 2007).

A colheita das microalgas é vista como um dos principais desafios da sua utilização para a

produção de biodiesel. As microalgas que armazenam lípidos são geralmente unicelulares, têm

baixas densidades e são encontradas em suspensão, tornando a separação difícil. Os

procedimentos de extração em grande escala para os lípidos de microalgas são complexos e ainda

estão em fase de desenvolvimento (Rawat et al. 2011). Outros desafios no que diz respeito à

utilização do biodiesel como combustível são a sua suscetibilidade a oxidação bacteriana, podendo

causar corrosão interna dos tanques de armazenamento (Antoni et al. 2007). No entanto, o

biodiesel tem potencial para ser um combustível 100 % biológico no futuro (Antoni et al. 2007).

1.5.2. Bio-óleo e Gás de Síntese

Quando a biomassa é processada sob altas temperaturas (entre ≈ 400 °C e 800 °C) na

ausência de oxigénio, os produtos são produzidos em três fases: a fase de vapor (≈ 800 °C), a

fase líquida (≈ 500 °C) e a fase sólida (≈ 400 °C) (Li, Horsman, Wu, Lan & Dubois-Calero 2008;

INTRODUÇÃO | 15

Bridgwater 2003). A fase líquida é uma mistura complexa chamada bio-óleo, também conhecido

como óleo de pirólise (Ringer et al. 2006). O gás de síntese, derivado da biomassa microalgal, a

partir do processo de gaseificação, é um gás de mistura composto principalmente por CO e H2.

O bio-óleo tem várias características indesejáveis, tais como, conteúdo de oxigénio (35 % –

40 % p/p) e água (15 % - 30 %) muito elevado, é altamente corrosivo e quimicamente instável

devido ao elevado teor de sólidos (Czernik & Bridgwater 2004; Bridgwater et al. 1999; Chiaramonti

et al. 2007; Bridgwater 2003). Além disso, o seu teor de metais alcalinos pode conduzir a

incrustações e contribuir para o envenenamento do catalisador. A elevada viscosidade do óleo de

pirólise em comparação com o petróleo bruto requer maior trabalho de bombeamento. A sua

polaridade devido ao alto teor de oxigénio faz com que o óleo de pirólise seja mais propenso a

agarrar-se às paredes dos tanques. Devido ao seu promissor potencial para substituir o petróleo

bruto, há vários trabalhos de pesquisa sobre a estabilização e modernização dos óleos de pirólise

(Bunting et al. 2010).

Recentemente, alguns estudos têm sido realizados sobre o potencial da biomassa de

microalgas para a produção de bio-óleo (Demirbaş 2006; Miao & Wu 2004; Miao et al. 2004). Foi

demonstrado que, em geral, os bio-óleos de microalgas são de melhor qualidade do que o bio-óleo

da madeira, por exemplo (Demirbaş 2006).

1.5.3. Bioetanol

O bioetanol, sendo um combustível limpo e renovável, é considerado uma boa alternativa

para substituir o petróleo (Mussatto et al. 2010; Bai et al. 2008). Embora a energia equivalente de

etanol seja 68 % inferior ao combustível de petróleo, a combustão do etanol é mais limpa (porque

contém oxigénio). Por conseguinte, a emissão de substâncias tóxicas é inferior (Krylova et al.

2008). O uso de bioetanol como combustível de transporte também pode ajudar a reduzir a

formação de CO2, por substituir a utilização dos combustíveis fósseis, e pela reciclagem do CO2

lançado. Ao usar o bioetanol em vez de combustíveis fósseis, as emissões resultantes da utilização

de combustíveis fósseis são evitadas.

A queima de etanol em vez da queima de gasolina reduz as emissões de carbono em mais

de 80 %, enquanto elimina inteiramente a libertação de chuva ácida causada pelo dióxido de

enxofre (Lashinky & Schwartz 2006).

16 | INTRODUÇÃO

O uso de etanol como combustível de automóveis tem uma longa história. Os primeiros

protótipos de motores de combustão interna construídos no século XIX por Samuel Morey em

1826 e por Nicholas Otto em 1876 foram construídos de forma a ser possível usar etanol como

combustível (Demirbas et al. 2009). O primeiro carro produzido por Henry Ford em 1896 podia

usar etanol puro como combustível e em 1908 o Ford Modelo – T, primeiro carro manufaturado

em série, era um veículo flexível, disponível para a utilização de etanol como combustível, da

mesma forma que também podia usar gasolina ou qualquer mistura de ambos.

O uso de bioetanol para combustível foi utilizado de forma generalizada na Europa e nos

Estados Unidos até ao início do ano 1900. Após a Primeira Guerra Mundial, houve uma

diminuição na demanda por etanol, porque se tornou mais caro para produzir do que o

combustível à base de petróleo, no entanto, houve um interesse (por exemplo, da General Motors

Corporation e DuPont) em etanol como agente antidetonante (ou seja, aumento de octanagem) e

como possível substituto para combustíveis derivados do petróleo (Demirbas et al. 2009; Balat &

Balat 2009; Solomon et al. 2007).

O desejo de promover a produção e o uso de bioetanol recomeçou no início de 1980, em

grande parte para revitalizar o setor agrícola num momento de excesso de oferta de produtos

agrícolas (Johnson & Rosillo-Calle 2007). Os Estados Unidos refizeram a sua indústria de

combustível de etanol, e são hoje em dia líderes mundiais na sua produção e uso (Mussatto et al.

2010).

Atualmente o etanol é o principal biocombustível utilizado no mundo e seu uso está cada

vez mais generalizado, as perspetivas mundiais são a expansão da produção e do consumo de

etanol (Mussatto et al. 2010).

A produção de etanol tem aumentado em todo o mundo desde a crise do petróleo em

1970. O seu mercado cresceu desde menos de mil milhões de litros em 1975 para mais de 39

mil milhões de litros em 2006, e espera-se chegar a 100 mil milhões de litros no presente ano

(2015) (Licht 2006). O continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com os

Estados Unidos e o Brasil representando um papel importante neste setor.

Certas espécies de microalgas têm capacidade de produzir altos níveis de carbohidratos

em vez de lípidos como polímeros de reserva. Estas espécies são candidatas ideais para a

produção de bioetanol, uma vez que os hidratos de carbono das microalgas podem ser extraídos

para produzir açúcares fermentáveis. Estimou-se que aproximadamente entre 46,760 - 140,290 L

INTRODUÇÃO | 17

ha-1 de etanol podem ser produzidos a partir de microalgas (Cheryl 2008). Este rendimento é

bastante maior do que o que se obtém para produções com outras matérias-primas.

Mesmo Panicum virgatum (“switchgrass”), considerado o biocombustível celulósico da

segunda geração de biocombustíveis, atinge rendimentos de produção de etanol que são apenas

uma fração dos rendimentos atingidos por microalgas.

Chlorella vulgaris, particularmente, tem sido considerada como uma matéria-prima

promissora para a produção de bioetanol, porque consegue acumular até 37 % (peso seco) de

amido (Hirano et al. 1997). Em condições climáticas favoráveis, podem ser alcançados

rendimentos entre 80 - 100 t de biomassa seca de Chlorella por ha, para um tempo de cultura de

300 dias (Doucha & Lívanský 2009). Segundo esses autores a estirpe Chlorella sp. é capaz de

acumular amido até 70 % de peso seco de algas sob condições de supressão de síntese de

proteínas.

A produção de etanol é geralmente realizada em três passos: (1) obtenção de uma

solução de açúcares fermentáveis, (2) fermentação dos açúcares em etanol, (3) separação do

etanol e purificação, geralmente por destilação - retificação – desidratação (Demirbas 2005). O

passo anterior à fermentação, para obtenção de açúcares fermentáveis, constitui a principal

diferença entre os processos de produção de etanol a partir de açúcares simples, amido ou

material lignocelulósico.

A produção de etanol a partir de microalgas pode ser realizada de acordo com o seguinte

procedimento (Figura 3). Na primeira etapa, o cultivo de microalgas usando a energia da luz solar

é realizado em tanques abertos ou cobertos (open or covered ponds) ou em fotobiorreatores

fechados, com base tubular, placa plana ou outros designs. Na segunda etapa, a biomassa tem de

ser concentrada por um fator inicial de pelo menos cerca de trinta vezes, requerendo, desta forma,

processos de colheita de baixo custo. Após a colheita, o amido microalgal é extraído das células

com o auxílio de um dispositivo mecânico ou através da utilização de enzimas. Após a extração do

amido, as enzimas amilolíticas são utilizadas para promover a formação de açúcares fermentáveis.

S. cerevisiae é então adicionada para iniciar a fermentação alcoólica. No final da fermentação, o

caldo fermentado que contém etanol é drenado do tanque e bombeado para um tanque de

retenção, para ser alimentado para uma unidade de destilação (Amin 2009).

À parte disto, há também espécies de algas capazes de realizar autofermentação. A

Seambiotic, em colaboração com a Inventure Chemicals, demonstrou com sucesso a produção de

etanol por fermentação de polissacarídeos de microalgas.

18 | INTRODUÇÃO

Seambiotic é a primeira empresa no mundo que está a utilizar gases de combustão de

centrais elétricas, provenientes da queima de carvão, como fonte de CO2, para o cultivo de

microalgas (Goh & Lee 2010).

Figura 3 - Procedimento para a produção de bioetanol a partir de microalgas (Mussatto et al. 2010).

Nas espécies de microalgas capazes de produzir amido, a sua acumulação pode ser

estimulada pela indução de estados de stresse metabólico. O estado de tensão resulta tipicamente

da privação de nutrientes essenciais. Alguns autores (Douskova et al. 2008) induziram uma

acumulação de amido na microalga Chlorella vulgaris pela privação de fósforo, azoto e enxofre e o

teor em amido nas células aumentou de 83 %, 50 % e 33 %, respetivamente. Também estudaram

o efeito de inibir a proteossíntese, o que se refletiu no dobro da quantidade de amido na biomassa.

A adição de ferro às culturas de microalgas induz a produção de hidratos de carbono,

pelas microalgas, devido ao aumento da eficiência fotossintética. No entanto, esta acumulação

depende da luz incidente e é resultado de um efeito sinérgico entre a suplementação da cultura e

da luz incidente (Van Oijen et al. 2005). Fatores como o aumento da temperatura ou da salinidade

também têm sido descritos como tendo efeito estimulador sobre a acumulação de amido nas

microalgas (Warr et al. 1985).

Todos estes passos concomitantemente aumentam os custos de energia de produção de

bioetanol (González-Fernández et al. 2012).

Hoje em dia, este biocombustível é amplamente distribuído e utilizado como um

componente de mistura de combustível pelos EUA. O seu ponto baixo de congelação torna-o

adequado para utilização em climas frios. Pode ser misturado com gasolina, em qualquer

combinação, e atualmente está aprovado como integrante dos combustíveis (10 %) de todos os

veículos e, como uma mistura de 85 % nos veículos de combustível duplo (Yue et al. 2014).

INTRODUÇÃO | 19

A Agência de Proteção Ambiental (EPA) dos Estados Unidos também aprovou uma mistura

de 15 % em todos os veículos a partir do ano 2001, no entanto, a disponibilidade de bioetanol

ainda é muito limitada e há vários desafios relacionados com a sua distribuição (Yue et al. 2014).

Adicionalmente, vários estudos têm citado o papel do etanol na corrosão das paredes das

tubagens. Devido a todos estes desafios, muitas das principais operadoras de tubos dos EUA

proíbem expressamente etanol e misturas de etanol-gasolina nas tubagens (Bunting et al. 2010).

1.5.4. Bio-hidrogénio

Relacionadas com a sua produtividade fotossintética e eficiência de utilização da luz, as

microalgas podem realizar reações bioquímicas e fotoquímicas especiais com requisitos mínimos

que tornam a produção de hidrogénio possível em ambientes aeróbios e anaeróbios (Das &

Veziroǧlu 2001; Benemann 2000).

Elas usam nitrogenases e hidrogenases, que estão intimamente relacionadas com o

processo final de geração de hidrogénio na fotossíntese (Masukawa et al. 2002; Kosourov et al.

2005). A nitrogenase é uma enzima que participa na fixação biológica do azoto e a hidrogenase é

capaz de catalisar as reações de consumo de hidrogénio. A produção de hidrogénio com base

nestas enzimas difere no consumo de energia. Reações mediadas pela hidrogenase são cerca de

três vezes mais eficientes do que as catalisadas pela nitrogenase, com base na energia

despendida sob a forma de ATP. Por outro lado, as nitrogenases são relativamente menos

sensíveis ao oxigénio em comparação com as hidrogenases (Miyake et al. 2004; Dasgupta et al.

2010), no entanto, ambas são sensíveis ao oxigénio. É importante controlar as condições de

cultura para a produção ótima de hidrogénio.

As vias metabólicas para a produção de hidrogénio diferem de acordo com o

microrganismo (Murugesan et al. 2009; Levin et al. 2004). No caso das microalgas, a produção de

hidrogénio ocorre através da fotólise (neste processo, a energia luminosa é utilizada para separar

os átomos que compõem a molécula de água, havendo libertação de eletrões, que são depois

usados para repor os perdidos pela clorofila na sua excitação. A molécula de oxigénio (O2)

resultante é libertada para a atmosfera, como resíduo da reação química) direta e indireta da

água. A fotólise direta envolve a energia da luz e os sistemas fotossintéticos das microalgas para

converter água em energia química. No entanto, durante a fotossíntese, o oxigénio produzido pode

inibir a atividade da enzima hidrogenase. A fotólise indireta supera a limitação da inibição da

20 | INTRODUÇÃO

hidrogenase pelo oxigénio através da produção de oxigénio fotossintético e hidrogénio em duas

fases separadas. O hidrogénio é produzido na segunda fase onde a anaerobiose é forçada pela

privação de enxofre (González-Fernández et al. 2012):

(a) Fotólise direta: 2H2O Luz 2H2 + O2

(b) Fotólise indireta:

(1) 12H2O + 6CO2 Luz C6H12O6 + 6O2

(2) C6H12O6 + 12H2O 12H2 + 6CO2

Obviamente, a estratégia indireta confere uma complexidade adicional ao sistema. Neste

ponto, deve-se ressaltar que de acordo com Benemann (2000) para a biofotólise ser uma fonte de

energia competitiva, a eficiência da conversão de energia solar deve ser em torno dos 10 %. Os

valores mais elevados encontrados na literatura foram relatados por Kruse et al. (2005) que

alcançou 2 % de eficiência de conversão em escala laboratorial através da fotólise direta. Assim, a

produção de hidrogénio por microalgas ainda tem de ser desenvolvida para que esta tecnologia

possa desempenhar um papel importante no desenvolvimento da produção de biocombustíveis

sustentáveis.

1.5.5. Biometano

O biometano é produzido a partir da digestão anaeróbia da matéria orgânica (neste caso,

microalgas), por bactérias anaeróbias, ou seja, que se desenvolvem em ambientes sem oxigénio.

Os principais produtos deste processo são os gases metano (55 - 75 %) e dióxido de carbono (25 –

45 %) (biogás), uma parte sólida que decanta no fundo do tanque (biofertilizante), e uma parte

líquida que corresponde ao efluente mineralizado (tratado) (Pienkos & Darzins 2009; GOLUEKE et

al. 1957; Mussgnug et al. 2010).

O metano é uma forma de energia renovável, enquanto os outros dois produtos (efluente

mineralizado e o dióxido de carbono) podem ser reciclados para o sistema de cultivo de

microalgas (GOLUEKE et al. 1957; Schenk et al. 2008).

A biomassa microalgal, tendo nas suas células quantidades altas de lípidos, amido e

proteínas, baixa quantidade de celulose e, por outro lado, a ausência de lenhina, possibilita uma

digestão anaeróbia fiável e eficaz. Estas especificações fazem das microalgas uma boa alternativa

INTRODUÇÃO | 21

para a produção eficaz de biometano em comparação com as outras (Pienkos & Darzins 2009;

Mussgnug et al. 2010; Schenk et al. 2008). A biomassa de microalgas que resta após a digestão

anaeróbia pode ainda ser processada para fabricar fertilizantes que podem acrescentar um valor

adicional ao processo global (Mussgnug et al. 2010; Doušková et al. 2010).

1.6. Impacto da seleção da estirpe

Na produção de biocombustíveis, para se obter sucesso, é essencial escolher a estirpe de

microalga apropriada. Geralmente, a microalga deve ser capaz de sobreviver a uma grande

variedade de temperaturas de forma a sobreviver às variações sazonais; possuir alta eficiência

fotossintética; não necessitar de muitos nutrientes; ser capaz de dominar estirpes selvagens em

sistemas de produção open pond; sobreviver às tensões de cisalhamento comuns nos

fotobiorreatores; elevada produção de lípidos, hidratos de carbono (especialmente amido); alta

capacidade de captação de CO2; características de autofloculação e produção de coprodutos

valiosos. No entanto, atualmente, nenhuma estirpe de microalgas possui todas estas

características ao mesmo tempo (Brennan & Owende 2010).

1.7. Tecnologias de produção de microalgas

O princípio por trás do desenvolvimento e produção de microalgas é relativamente

simples. Para responder aos requisitos biológicos destas culturas, foram desenvolvidos vários tipos

de tecnologias. A tecnologia mais favorável à produção de microalgas depende do produto alvo,

por isso, é necessário ter atenção cuidada na seleção da espécie e no conhecimento da sua

fisiologia (Dimitrov 2007).

1.7.1. Sistemas de produção fotoautotróficos

Neste tipo de sistemas de produção, as microalgas usam luz como fonte de energia única

e CO2 como fonte de carbono. Foram os primeiros sistemas a ser criados, sendo atualmente os

mais difundidos. Os sistemas de produção fotoautotróficos podem ser abertos, fechados ou

híbridos.

22 | INTRODUÇÃO

1.7.1.1. Sistemas de cultura abertos

Os sistemas de cultura abertos são os mais baratos para produção de biomassa

microalgal em grande escala porque, como podem ser implementados em áreas com potencial

produtivo de cultura marginal, não competem forçosamente por terra com culturas agrícolas.

Quando comparados com os sistemas de cultura fechados, os sistemas de cultura abertos

são menos dispendiosos para construir e operar, mais duráveis e com grande capacidade de

produção. No entanto, geralmente são mais suscetíveis às condições meteorológicas, devido a

ciclos diurnos e variações sazonais, não permitindo o controlo da temperatura da água, nem o

controlo dos níveis de CO2, devido à sua difusão na atmosfera. Para além disso, normalmente

possuem mecanismos de agitação ineficientes; apresentam riscos de contaminação elevados,

nomeadamente por outras espécies de algas, protozoários, bactérias e outros contaminantes

biológicos. Para as microalgas receberem energia solar suficiente para crescer, o nível de água

não pode ser mantido muito mais alto do que 15 cm (Benemann & Oswald 1996; Carlsson et al.

2007). Todos estes fatores tornam estes sistemas menos eficientes, quando comparados com os

sistemas fechados (Richmond 2004).

Normalmente, os sistemas de cultura abertos são projetos "raceway", nos quais as

microalgas são cultivadas (Figura 4). Estes representam o design mais eficiente para a produção

em larga escala (Spolaore et al. 2006). A água é normalmente mantida em movimento por rodas

de pás ou estruturas rotativas (Mata et al. 2010). Os nutrientes podem ser fornecidos através de

águas de escoamento de terras próximas, ou através da canalização da água das estações de

tratamento de resíduos (Spolaore et al. 2006).

Figura 4 - Vista aérea de um raceway pond (Brennan & Owende 2010).

INTRODUÇÃO | 23

As lagoas circulares representam os sistemas mais antigos de cultivo de algas, em grande

escala. Estes sistemas possuem um agitador rotativo articulado central e a sua profundidade é de

cerca de 0,3 m. A conceção destes sistemas limita o tamanho da lagoa a cerca de 10,000 m2

porque misturar usando o braço rotativo não é possível em tanques maiores. Estes sistemas têm a

limitação de requerer uma construção em cimento caro e entradas de alta energia para satisfazer

as necessidades de mistura (Borowitzka 2005).

No que diz respeito aos sistemas inclinados, a cultura é continuamente bombeada a partir

do topo para o fundo de uma superfície inclinada, obtendo um fluxo altamente turbulento, que

conduz à existência de camadas muito finas de cultura (menos de 1 cm). Estas características

conduzem a concentrações de células mais elevadas (até 10 g L-1) (Šetlík et al. 1970).

1.7.1.2. Sistemas de cultura fechados

Devido às dificuldades encontradas na operação dos sistemas abertos, foi proposta uma

outra abordagem para a produção de biomassa de microalgas. Esta nova abordagem baseia-se em

sistemas fechados, mais conhecidos como fotobiorreatores (FBRs), onde a maioria dos problemas

associados aos sistemas abertos são resolvidos. No entanto, isso não significa que os sistemas

fechados não têm obstáculos técnicos e operacionais a serem superados. Os FBRs são

caracterizados pela regularização e controlo de parâmetros quase todos bióticos e abióticos

importantes para o cultivo de microalgas e têm uma série de benefícios, quando comparados com

os sistemas abertos (Pulz 1992). A maioria da investigação atual e experiências relativas ao cultivo

de microalgas acontecem em FBRs (Eriksen 2008). Os mais utilizados são os FBRs tubulares,

planos e em coluna (Eriksen 2008).

Os FBRs tubulares podem ser dispostos na horizontal, inclinados, na vertical, ou em forma

de espiral. Em relação ao modo de operação, existem dois tipos de FBRs tubulares: os reatores

em que a mistura é levada a cabo através de bombeamento mecânico, ou tecnologia airlift, o meio

líquido existe apenas no reator e as trocas de gás ocorrem num compartimento separado; e os

reatores nos quais o líquido e a fase de gás estão presentes no mesmo compartimento, ocorrendo

por isso a transferência contínua de gás no reator. Hoje em dia, os FBRs maiores usam a

configuração tubular (Pulz 2001). Este FBR permite a troca de gases com o meio ambiente onde

ocorre a saída de O2 e entrada de CO2 no meio de cultura. Além disso, este sistema proporciona

meios para a recuperação da biomassa produzida. A série de tubos tem o objetivo de expor a

24 | INTRODUÇÃO

cultura de microalgas à luz solar. Tipicamente, os tubos têm diâmetros limitados a 0,1 m ou

menos, porque com diâmetros maiores, a luz torna-se um fator limitante, uma vez que não pode

penetrar completamente na cultura (Chisti 2007). O tamanho dos tubos também é limitado devido

à potencial acumulação de O2 que limita a fotossíntese e, por conseguinte, provoca uma

diminuição na produtividade, esgotamento do CO2 e mudanças de pH no meio de cultura (Eriksen

2008).

No que diz respeito aos FBRs planos, estes ganharam atenção especial devido a dois

fatores muito importantes que influenciam a produção de microalgas: maior superfície de captação

solar e elevada densidade de biomassa obtida. Este facto é extremamente importante, uma vez

que reduz muito o custo do processo. Além disso, os FBRs planos têm baixa acumulação de

oxigénio dissolvido e alta eficiência fotossintética (Brennan & Owende 2010). As desvantagens

associadas a FBRs planos incluem dificuldade em controlar a temperatura da cultura, algum grau

de crescimento na parede, possibilidade de stresse hidrodinâmico para algumas estirpes de

microalgas e o aumento de escala requer muitos compartimentos e materiais de apoio.

Em relação aos FBRs estes são constituídos por uma unidade de geração de bolhas de ar,

que tem duas funções distintas: misturar o meio de cultura para aumentar a eficiência

fotossintética e realizar a transferência de gases. Em comparação com os outros tipos de FBRs,

estes proporcionam uma mistura mais eficiente da cultura, maior transferência de gás volumétrico

e um maior controlo sobre as condições do meio de cultura (Eriksen 2008; Mata et al. 2010;

Suzuki et al. 1995).

1.7.1.3. Sistemas híbridos

Sistemas híbridos combinam os FBRs fechados e os sistemas abertos para a produção de

biomassa de microalgas. Estes sistemas foram concebidos a fim de maximizar as vantagens e

minimizar as desvantagens inerentes a ambos, sem aumentar muito o custo de produção (Huntley

& Redalje 2007). A operação dos sistemas híbridos ocorre em duas fases distintas. A primeira fase

consiste na produção de biomassa em FBRs num meio de cultura rico em nutrientes e com as

condições de cultura controladas. A segunda fase opera em sistemas de lagoas abertas, onde a

biomassa produzida no passo 1 é sujeita a pressões ambientais, tais como o défice de azoto e de

fósforo e de elevada luminosidade, que aumenta a síntese do produto lipídico e dos carbohidratos.

INTRODUÇÃO | 25

Os stresses ambientais podem ocorrer naturalmente por meio da transferência da cultura do FBR

para o sistema aberto (Huntley & Redalje 2007; Rodolfi et al. 2009).

1.8. Tecnologias de recuperação da biomassa microalgal

Recolher a biomassa do meio de cultura é um dos passos mais caros da produção de

microalgas e envolve um custo que pode rondar 20 a 30 % do custo total de produção (Molina

Grima et al. 2003). Isto acontece devido às baixas concentrações de biomassa encontradas nos

sistemas de produção e ao tamanho das células das microalgas que tipicamente varia desde 3 a

30 µm. A concentração ideal para a conversão industrial da biomassa rondará entre 300 g L-1 –

400 g L-1.

No entanto, o custo de colheita nos FBRs é uma fração do valor nos sistemas abertos,

porque a concentração de biomassa é cerca de 30 vezes superior nos FBRs (Packer 2009). Vários

métodos de recolha de biomassa são praticados, mas a centrifugação, filtração e floculação são os

mais adequados à larga escala, embora também apresentem limitações e possam não ser sempre

os menos dispendiosos. Não existe um método de recolha de biomassa que sirva para todos os

sistemas de produção, por isso, selecionar a tecnologia mais apropriada é crucial, de um ponto de

vista económico, técnico e operacional.

A floculação é a primeira etapa do processo de recuperação de biomassa e destina-se a

agregar as microalgas para facilitar e aumentar a eficiência dos processos que se seguem

(Elmaleh et al. 1991). Como as microalgas têm carga negativa, existem forças de repulsão que

não permitem a agregação das células. No entanto, esta carga pode ser neutralizada ou reduzida

através da adição de produtos químicos, melhor conhecidos como floculantes. Os floculantes

normalmente utilizados são os sais de sulfato de alumínio (Al2(SO4)3), cloreto de ferro (FeCl3), e

sulfato de ferro (Fe2(SO4)3) (Molina Grima et al. 2003). A autofloculação é um processo que

também já começou a ser investigado e verificou-se que algumas espécies de microalgas podem

flocular naturalmente, em resposta a estímulos ambientais, tais como alterações no pH do meio

de cultura (Benemann & Oswald 1996).

A flotação corresponde a um método simples através do qual as microalgas podem ser

forçadas a flutuar na superfície do meio para de seguida serem removidas. São usadas

microbolhas de ar, dispersas no meio aquoso, que vão adsorver as células e arrastá-las para a

superfície do meio. Ao contrário da floculação, não exige qualquer adição de produtos químicos

26 | INTRODUÇÃO

(Brennan & Owende 2010). Há poucas provas da sua viabilidade técnica ou económica (Brennan

& Owende 2010).

A centrifugação envolve a aplicação de forças centrífugas para separar a biomassa

microalgal do meio de crescimento. Uma vez separadas, as microalgas podem ser removidas por

simples drenagem do excesso de meio (Harun, Singh, et al. 2010). A recuperação centrífuga é um

método rápido de recuperação das células das algas. No entanto, as forças gravitacionais e de

cisalhamento durante o processo de centrifugação podem danificar a estrutura da célula. Outra

desvantagem deste método é o elevado consumo de energia, especialmente quando se considera

grandes volumes (Harun, Singh, et al. 2010).

No que diz respeito aos processos de filtração, estes consistem na separação da fase

sólida (algas) da fase líquida (meio de cultura), passando a mistura através de um filtro, onde as

algas são retidas. Os processos de filtração convencionais incluem filtração dead end,

microfiltração, ultrafiltração, filtração sob pressão, filtração sob vácuo e filtração de fluxo tangencial

(TFF) (Dragone et al. 2010). Para recuperar a biomassa em culturas de microalgas com

dimensões mais pequenas, são comummente utilizadas as técnicas de microfiltração e

ultrafiltração que fazem uso de membranas com poros de menores dimensões (Petrusevski et al.

1995). Os principais custos desta técnica estão associados à substituição das membranas e ao

sistema de bombeamento. Em comparação com outras opções de colheita, a filtração é o método

mais competitivo (Dragone et al. 2010).

1.9. Biocombustíveis de microalgas: que futuro?

Numa série de artigos publicados em várias edições da Biofuels International Magazine,

Thurmond destacou vários passos estratégicos necessários para a comercialização bem-sucedida

de biocombustíveis de algas (Thurmond 2009a; Thurmond 2009b; Thurmond 2010). Segundo o

autor, a principal necessidade dos produtores é identificar espécies que possuam alto teor de óleo,

e que cresçam rapidamente, para produzir biodiesel.

Se os produtores de algas usarem espécies mais “gordas”, com 60 % de teor de óleo,

podem reduzir o tamanho e a pegada ecológica dos sistemas de produção de biocombustíveis até

metade, reduzindo os custos operacionais e facilitando a entrada no mercado dos biocombustíveis.

Uma vez que os sistemas de produção de algas são uma combinação complexa de vários

subconjuntos de sistemas (ou seja, produção, colheita, extração, sistemas de secagem), reduzir o

INTRODUÇÃO | 27

número de etapas na produção de biocombustíveis de algas é essencial para fornecer sistemas de

produção com custo inferior.

Um desafio económico crucial é descobrir métodos de colheita de algas e extração de óleo

de baixo custo. Por exemplo, a Origin Oil desenvolveu uma tecnologia que combina os sistemas de

colheita e extração num processo único, que é desenhado para reduzir a complexidade do sistema

global e os custos para os produtores. Outro exemplo é a utilização de um método que utilize as

células de algas como miniprocessadores que irão consumir CO2 e excretar combustíveis de

hidrocarbonetos diretamente.

De acordo com Singh & Gu 2010, o futuro dos biocombustíveis de algas prevê-se brilhante

de várias maneiras. Alguns analistas do mercado sentem que apesar de todos os fatores positivos

associados à utilização de microalgas para os biocombustíveis, o sucesso da implementação

comercial dos biocombustíveis de algas deverá depender do desenvolvimento de coprodutos de

alto valor, por exemplo, polímeros renováveis ou pigmentos. As algas contêm produtos químicos

valiosos ou compostos moleculares que podem ser utilizados na produção de plásticos verdes,

detergentes verdes, produtos de limpeza, e polímeros biodegradáveis, não-tóxicos, e que podem

ser vendidos a um preço premium em relação aos produtos tradicionais.

2. CAPÍTULO II

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS E MÉTODOS | 31

2.1 Microrganismos

As microalgas utilizadas para a elaboração do trabalho experimental foram a Chlorella

emersonii ACOI 516, Chlorella vulgaris ACOI 879 e Chlorella saccharophila ACOI 96. As estirpes

foram adquiridas à Algoteca do Departamento de Botânica da Universidade de Coimbra (ACOI -

Coimbra Collection of Algae), tendo sido repicadas periodicamente e mantidas à temperatura

ambiente.

2.2 Meios de crescimento

O cultivo autotrófico das microalgas referidas decorreu em cinco meios de cultura

diferentes (MP12, TAP, BG-11, Chu_13 mod. e BBM).

O meio baseado na composição elementar de C. vulgaris P12, e denominado no presente

trabalho como MP12 foi preparado de acordo com Douskova et al. (2008). Para a preparação

deste meio, a 900 mL de água destilada adicionaram-se 2 mL de uma solução de micronutrientes,

assim como os reagentes KH2PO4, MgSO4.7H2O, C10H12O8N2NaFe e CaCl2.2H2O, nas concentrações

apresentadas na Tabela 1. À parte, a 100 mL de água destilada juntaram-se 1,10 g de (NH2)2CO

(ureia). Depois de autoclavar as soluções a 121ºC durante 15 min, aos 900 mL de solução

adicionaram-se os 100 mL da solução de ureia. A solução de ureia foi autoclavada separadamente

para evitar a precipitação de sais.

Tabela 1 - Concentração dos reagentes usados no meio MP12.

Reagentes Concentração (g L-1)

KH2PO4 0,237

MgSO4.7H2O 0,204

C10H12O8N2NaFe 0,040

CaCl2.2H2O 0,116

(NH2)2CO 1,100

Solução de micronutrientes

H3BO3 0,416

CuSO4.5H2O 0,473

MnCl2.4H2O 1,647

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,086

ZnSO4.7H2O 1,339

CoSO4.7H2O 0,308

(NH4)VO3 0,007

32 | MATERIAIS E MÉTODOS

O meio Tris - Acetate - Phosphate (TAP) elaborou-se segundo Starr & Zeikus (1993). Para

isso, fizeram-se quatro soluções stock, cujos reagentes e correspondentes concentrações podem

ser consultados na Tabela 2.

Tabela 2 - Concentração dos reagentes usados na preparação das soluções stock do meio TAP.


Solução Beijerinck’s

NH4Cl 8

CaCl2·2H2O 1

MgSO4·7H2O 2

Solução tampão fosfato

Na2HPO4 11,62

KH2PO4 7,26

Solução Hunter's Trace

Na2EDTA·2H2O 50

ZnSO4·7H2O 22

H3BO3 11,4

MnCl2·4H2O 5,1

FeSO4·7H2O 5

CoCl2·6H2O 1,6

CuSO4·5H2O 1,16

(NH4)6Mo7024·4H2O 1,1

Solução Tris Acetato

Trisma Base 242 Ácido acético

glacial 100 1

1 Unidade em mL L-1.

Na elaboração deste meio, a um volume de 400 mL de água destilada, adicionaram-se 50

mL L-1 da solução Beijerinck’s; 8,5 mL L-1 da solução tampão fosfato; 1 mL L-1 da solução Hunter's

Trace e 10 mL L-1 da solução Tris Acetato, com agitação contínua. No final perfez-se o volume até 1

L com água destilada.

O meio BG-11 também foi preparado segundo Starr & Zeikus (1993), conforme o que vem

descrito nas tabelas 3 e 4.


Tabela 3 - Composição do meio BG-11.

Reagentes Quantidade (mL L-1) Concentração da

solução stock

NaNO3 10 30 g 200 mL-1

dH2O

K2HPO4 10 0,8 g 200 mL-1

dH2O

MgSO4·7H2O 10 1,5 g 200 mL-1

dH2O

CaCl2·2H2O 10 0,72 g 200 mL-1

dH2O

Citric Acid·H2O 10 0,12 g 200 mL-1

dH2O C6H8O7.xFe3+.yNH3 (citrato de ferro

amoniacal) 10

0,12 g 200 mL-1 dH2O

C10H14N2Na2O8· 2H2O 10 0,02 g 200 mL-1

dH2O

Na2CO3 10 0,4 g 200 mL-1

dH2O Solução de

micronutrientes1 1

Na2S2O3·5H2O (usado só em meio

com agar)

1

49,8 g 200 mL-1 dH2O

1 Ver Tabela 4.

Tabela 4 - Composição da solução de micronutrientes do meio BG-11.


H3BO3 2,86

MnCl2·4H2O 1,81

ZnSO4·7H2O 0,22

Na2MoO4·2H2O 0,39

CuSO4·5H2O 0,079

Co(NO3)2·6H2O 0,049

No que diz respeito ao meio Chu_13 modificado, este foi preparado de acordo com

Kaewkannetra et al. (2012). Os reagentes utilizados e respetivas concentrações apresentam-se na

Tabela 5.


Tabela 5 - Composição do meio Chu_13 modificado.


KNO3 0,2

K2HPO4 0,04

MgSO4·7H2O 0,1

CaCl2·2H2O 0,054

C6H5FeO7 0,01

C6H8O7 0,1

Solução de micronutrientes

H3BO3 2,85

MnCl2 1,80

ZnSO4·7H2O 0,02

CuSO4·5H2O 0,08

CoCl2·6H2O 0,08

Na2MoO4·2H2O 0,05

Em relação ao meio Bold’s Basal Medium (BBM), este foi preparado de acordo com Starr

& Zeikus (1993). Para a elaboração deste meio, fizeram-se 6 soluções stock com os reagentes e

respetivas concentrações mencionados na Tabela 6, sendo que se retiraram 10 mL de cada uma

para o volume final (1 L). Adicionalmente e de acordo com o que vem descrito na Tabela 7,

também se prepararam 4 soluções stock diferentes, sendo que destas, o volume retirado para a

preparação do meio foi 1 mL.

Tabela 6 - Soluções stock constituintes do meio BBM.

Reagentes Concentração da

solução stock

NaNO3 2,5 g 100 mL-1

dH2O

MgSO4.7H2O 0,75 g 100 mL-1

dH2O

NaCl 0,25 g 100 mL-1

dH2O

K2HPO4 0,75 g 100 mL-1

dH2O

KH2PO4 1,75 g 100 mL-1

dH2O

CaCl2.2H2O 0,25 g 100 mL-1

dH2O


Tabela 7 - Soluções stock constituintes do meio BBM.


Solução Stock 1

ZnSO4.7H2O 8,82

MnCl2.4H2O 1,44

MoO3 0,71

CuSO4.5H2O 1,57

Co(NO3)2.6H2O 0,49

Solução Stock 2

H3BO3 11,42

Solução Stock 3

EDTA 50,0

KOH 31,0

Solução Stock 4

FeSO4.7H2O 4,98 H2SO4

(concentrado) 1,0 1

1 Unidade em mL L-1.

Também foi preparado meio sólido de todos os meios de crescimento acima

mencionados. Para isso, bastou adicionar 1,5 % de agar a cada meio.

Na Tabela 8 apresentam-se todos os reagentes usados na elaboração dos cinco meios de

crescimento, assim como a sua concentração, de forma a ser possível comparar as diferentes

concentrações utilizadas para o mesmo reagente.

Tabela 8 - Concentração dos reagentes utilizados nos cinco diferentes meios de cultura.

Reagentes1 Meios de Cultura

Nomenclatura Símbolo químico

Meio M (µM)

TAP (µM)

BBM (µM)

Chu_13 mod. (µM)

BG-11 (µM)

Ácido acético glacial CH3CO2H 1700

Ácido bórico H3BO3 0,027 184 185 46 46

Ácido cítrico C6H8O7 520

Ácido cítrico monohidratado C6H8O7.H2O 240

Ácido sulfúrico H2SO4 18,76

Carbonato de sódio Na2CO3 190

Citrato de ferro C6H5FeO7 41

Citrato de ferro amoniacal C6H8O7.xFe3+.yN

H3 21

Cloreto de amónio NH4Cl 7500 1 Todos os reagentes foram adquiridos à empresa Sigma-aldrich®.


Tabela 8 – Continuação.

Reagentes1 Meios de Cultura

Nomenclatura Símbolo químico

Meio M (µM)

TAP (µM)

BBM (µM)

Chu_13 mod. (µM)

BG-11 (µM)

Cloreto de cálcio dihidratado CaCl2·2H2O 790 350 170 340 240

Cloreto de cobalto hexahidratado

CoCl2·6H2O 7 0,34

Cloreto de manganês (II) MnCl2 14

Cloreto de manganês (II) tetrahidratado

MnCl2·4H2O 0,033 26 7,3 9

Cloreto de sódio NaCl 430

EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)

C10H16N2O8 170

EDTA dissódico dihidratado C10H14N2Na2O8·

2H2O 134 2,7

EDTA férrico sódico C10H12O8N2NaFe 110

Fosfato de potássio dibásico K2HPO4 430 230 230

Fosfato de potássio monobásico

KH2PO4 1740 450 1290

Fosfato de sódio dibásico Na2HPO4 690

Hidróxido de potássio KOH 550

Molibdato de amónio tetrahidratado

(NH4)6Mo7024·4H2O

0,000275 0,8

Molibdato de sódio dihidratado

Na2MoO4·2H2O 0,21 1,6

Nitrato de cobalto hexahidratado

Co(NO3)2·6H2O 1,7 0,17

Nitrato de potássio KNO3 1980

Nitrato de sódio NaNO3 2940 17600

Sulfato de cobre heptahidratado

CoSO4·7H2O 0,0043

Sulfato de cobre pentahidratado

CuSO4·5H2O 0,0076 5 6,3 0,32 0,3

Sulfato de ferro heptahidratado

FeSO4·7H2O 18 18

Sulfato de magnésio heptahidratado

MgSO4·7H2O 830 400 300 410 300

Sulfato de zinco heptahidratado

ZnSO4·7H2O 0,019 77 30,60 0,070 0,77

Tiossulfato de sódio pentahidratado2

Na2S2O3·5H2O 1000

Trióxido de molibdénio MoO3 4,90

Tris base NH2C(CH20H)3 20000

Ureia (NH2)2CO 18310

Vanadato de amónio (NH4)VO3 0,000239 1 Todos os reagentes foram adquiridos à empresa Sigma-aldrich®. 2 Usado somente em meio sólido.


2.3 Cultivo fotoautotrófico

2.3.1 Crescimento em meio com azoto

Para a preparação dos inóculos, retirou-se uma ansada de microalgas a crescer nos meios

de cultura em estado sólido e inocularam-se em 35 mL de cada meio, em tubos de ensaio com

capacidade de 50 mL. Os inóculos foram preparados em duplicado para cada um dos meios. O

seu tempo de crescimento foi de cerca de 7 dias e ocorreu à temperatura ambiente

(aproximadamente 25 °C). Durante esse tempo, estiveram sujeitos a uma irradiação de 100 µmol

de fotões m-2 s-1 fornecidos por duas lâmpadas fluorescentes (Sylvania Standard F18W). Todos os

inóculos estiveram sob arejamento usando ar enriquecido com 6 % (v/v) de CO2 a uma taxa de 0,2

vvm (volume de gás por volume de suspensão de cultura por minuto). Assim, foi fornecido um

caudal de ar de 7 mL min-1 (0,42 mL min-1 CO2 e 6,58 mL min-1 ar) a cada tubo de ensaio.

No final do tempo de crescimento das microalgas nos inóculos, procedeu-se à passagem

das células para os fotobiorreatores. Assim, após contagem celular das amostras retiradas dos

inóculos, no microscópio, com o auxílio da câmara de Neubauer (Carl Zeiss, West Germany), e

determinação do volume a retirar dos mesmos, as células foram recolhidas por centrifugação

(4000 rpm, 10 min) e ressuspendidas em 350 mL de meio de cultura, em provetas com

capacidade de 500 mL. A concentração celular inicial para cada cultivo foi 1 x 106 cél. mL-1 e todos

os cultivos foram realizados em duplicado. O cultivo das microalgas ocorreu nas mesmas

condições referidas para os inóculos (100 µmol de fotões m-2 s-1 e 6 % (v/v) de CO2 a uma taxa de

0,2 vvm). Desta forma, foi fornecido um caudal de ar de 70 mL min-1 (4,2 mL min-1 CO2 e 65,8 mL

min-1 ar), para cada proveta.

Durante o tempo em que o ensaio decorreu (≈ 15 dias) retirou-se um volume diário de 3

mL de amostra, que foram usados para a medição do pH, determinação do peso da biomassa

seca e determinação da concentração celular, tal como descrito no ponto 2.4.

Tendo em conta que o cultivo em cada meio foi realizado em duplicado, no final do

mesmo uma das réplicas foi utilizada para o crescimento em meio sem azoto e a outra para

caracterização da biomassa.


2.3.2 Crescimento em meio sem azoto

No final de cada ensaio em meio com azoto, as células foram centrifugadas a 9000 rpm

durante 2 min em frascos de 250 mL. Depois, foram ressuspendidas no volume de 350 mL de

cada um dos meios descritos no ponto 2.2, sendo que a cada um destes foi retirada a sua

principal fonte de azoto. Foram retirados os reagentes (NH2)2CO, NH4Cl, NaNO3, KNO3 e NaNO3 aos

meios MP12, TAP, BG-11, Chu_13 modificado e BBM, respetivamente.

O ensaio em meio sem azoto também foi realizado em duplicado e decorreu durante cerca

de 4 dias nas mesmas condições de arejamento, temperatura e irradiação de luz referidos para o

ensaio em meio com azoto. A monitorização do crescimento celular em meio sem azoto também

foi feita de acordo com o que está descrito no ponto 2.4.

2.4 Monitorização do crescimento celular

Para a monitorização do crescimento celular, retiraram-se, diariamente, 3 mL de amostra

dos fotobiorreatores. Após centrifugação (4000 rpm, 5 min) procedeu-se à medição do pH do

sobrenadante. No final, o pellet foi ressuspendido com o auxílio do vortex.

A determinação do peso da biomassa seca efetuou-se usando filtros de nitrocelulose de

0,45 µm de poro. Estes filtros foram colocados no micro-ondas durante 15 min à potência de 90

W. Em seguida, foram colocados a arrefecer no exsicador durante 5 a 10 min e foram pesados.

Depois filtraram-se 2 mL de amostra e colocaram-se os filtros novamente no micro-ondas, nas

mesmas condições. O peso da biomassa seca foi obtido subtraindo ao peso final o peso do filtro.

Para a determinação da concentração celular, através da contagem na câmara de

Neubauer, procedeu-se a uma diluição inicial das amostras em 1,5 M de EDTA (pH = 8,2) de

forma a facilitar a contagem, uma vez que as espécies estudadas demonstraram ser

extremamente floculantes, à exceção de C. vulgaris, embora também tenha sido diluída na mesma

concentração de EDTA. Este esteve 2 h em contacto com as células, que foram agitadas

periodicamente durante 1 min.

2.5 Caracterização da biomassa

No final de cada ensaio, tanto na condição com azoto como na condição sem azoto, as

células foram centrifugadas a 9000 rpm durante 2 min em frascos de 250 mL. Depois, foram


liofilizadas e moídas com o auxílio do almofariz, para se proceder à sua caracterização no que diz

respeito ao conteúdo de lípidos, amido e proteínas.

2.5.1 Análise de amido

O conteúdo de amido nas células foi determinado por um método de hidrólise enzimática,

tendo sido utilizado um kit produzido pela Megazyme (Wicklow, Ireland) e aceite pela AOAC

(Método Oficial 996.11) e AACC (Método 76.13), baseado no uso das enzimas termoestáveis α-

amilase e amiloglucosidade.

O protocolo disponibilizado pela Megazyme foi seguido e iniciado na alínea (e). Pesaram-se

10 mg de biomassa liofilizada e moída (em vez de 100 mg, como indica o protocolo). Adicionaram-

se 5 mL de etanol aquoso (80 % v/v) e incubou-se a 80 - 85 °C durante 5 min. Misturou-se depois

a amostra no vortex e adicionaram-se mais 5 mL de etanol aquoso (80 % v/v). Centrifugou-se a

amostra durante 10 min a 1800 x g e descartou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se o pellet em

10 mL de etanol aquoso (80 % v/v) e misturou-se no vortex. Centrifugou-se novamente e

descartou-se o sobrenadante. Retomou-se o procedimento no passo 4 da alínea (b) do protocolo,

tendo-se, por isso, adicionado 3 mL da enzima termoestável α-amilase diluída 1:30 no reagente

MOPS 50 mM a pH 7,0. Incubou-se num banho de água a ferver durante 12 min. De seguida,

colocou-se a amostra num banho a 50 °C, adicionou-se 4 mL de tampão acetato de sódio 200

mM a pH 4,5, seguido de 0,1 mL da enzima amiloglucosidase 20 U. Misturou-se tudo no vortex e

manteve-se no banho a 50 °C durante 30 min. Passou-se, depois, para a alternativa do passo 6,

alínea (a). Ajustou-se o volume da amostra para 10 mL com água destilada e depois centrifugou-se

a 3000 rpm durante 10 min. Transferiram-se 0,1 mL da solução diluída para tubos de vidro e

adicionaram-se 3 mL do reagente GOPOD a cada tubo. Também se adicionaram 3 mL de GOPOD

a 0,1 mL de D-glucose padrão (controlo) e a 0,1 mL de água (branco) e incubaram-se todos os

tubos a 50 °C durante 20 min. No final, leu-se a absorvância a 510 nm.

O cálculo do conteúdo de amido presente nas amostras das microalgas foi obtido a partir

da utilização do programa de cálculo disponibilizado pela Megazyme “Mega-calc™ Total Starch

Determination (Solids)”.


2.5.2 Análise de Proteínas

Para a análise do conteúdo proteico das células, utilizou-se o método de Bradford. Para C.

emersonii, pesou-se 0,1 g de biomassa liofilizada e moída e, para otimizar a extração das

proteínas, juntaram-se 2 mL de H3PO4 0,15 M e levou-se a mistura a um banho a 100 °C durante

10 min. Parou-se a reação com gelo e centrifugou-se a 3000 rpm durante 10 min. Separou-se o

sobrenadante e diluiu-se o mesmo numa proporção de 1:20. Adicionaram-se 300 µL do reagente

de Coomassie a 10 µL da amostra diluída. Incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente e,

no final, leu-se a absorvância a 595 nm.

Para além disso, também se testou outro químico a fim de otimizar a extração de

proteínas, tendo-se adicionado às células moídas 2 mL de NaOH 1 M e levado a mistura a um

banho a 80 °C durante 10 min. As restantes etapas do procedimento seguiram como descrito

anteriormente. Para C. vulgaris e C. saccharophila, apenas foi aplicado este procedimento.

As concentrações de proteína foram estimadas por referência às absorvâncias obtidas por

uma série de diluições da proteína padrão – Bovine Serum Albumin (BSA) – analisadas

juntamente com as amostras desconhecidas.

2.5.3 Análise de Lípidos

Para a análise de lípidos, seguiu-se o método descrito por Folch et al. (1957), tendo-se

pesado 0,08 g de biomassa liofilizada e moída. Homogeneizou-se a amostra com uma mistura de

clorofórmio e metanol, numa proporção de 2:1, até se perfazer um volume final 20 vezes superior

ao volume da amostra. Centrifugou-se a solução para recuperar a fase líquida. Lavou-se a fase

líquida com um volume 0,2 x volume final, de uma solução de KCl 0,88 % de forma a facilitar a

extração de contaminantes não lipídicos para a fase aquosa (metanol), diminuindo também a

tendência de dissociação dos lípidos com carácter ácido, que se mantiveram deste modo, na fase

orgânica. Centrifugou-se a 2000 rpm para separar as duas fases. Descartou-se a fase superior

(aquosa). Lavou-se a interface 3 vezes, com uma mistura de clorofórmio, metanol e água nas

proporções (3:48:47 v:v) para remover alguns resíduos ainda presentes. No final, removeu-se o

solvente, deixando-se a evaporar na hotte de um dia para o outro. Depois, colocou-se 15 min na

estufa a 80 °C, retirou-se e deixou-se arrefecer no exsicador. O conteúdo lipídico das amostras

obteve-se através da subtração do peso final ao peso inicial. Estes valores foram posteriormente

convertidos em percentagem.


De notar que nas Figuras apresentadas no Capítulo 3 referentes à análise da biomassa, a

ausência de alguns resultados é explicada pela falta de biomassa suficiente.

2.6 Determinação das Produtividades

A determinação das produtividades volumétricas de biomassa foi efetuada de acordo com

a Equação 1.

Pbiomassa (g L-1 d-1) = (X2 – X1) · (t2 – t1)-1 (Equação 1)

Onde X1 e X2 correspondem ao peso da biomassa seca (g L-1) nos dias t1 (início do cultivo) e

t2 (fim do cultivo), respetivamente.

As produtividades de lípidos, amido e proteínas foram calculadas de acordo com a

Equação 2.

Plípidos; amido; proteínas (mg L-1 d-1) = Pbiomassa · Cf (Equação 2)

Onde Pbiomassa é a produtividade da biomassa e Cf é o conteúdo final de lípidos, amido ou

proteínas (valores percentuais).

3. CAPÍTULO III

RESULTADOS

RESULTADOS | 45

3.1 Crescimento das microalgas em meio com azoto

A concentração celular das microalgas em estudo, o peso da biomassa seca e o pH do

meio de crescimento foram acompanhados ao longo do tempo de cultivo. Estes valores

encontram-se apresentados nas Figuras 5, 6 e 7, respetivamente para C. emersonii, C. vulgaris e

C. saccharophila. Os valores representam a média ± desvio padrão de duas réplicas.

3.1.1 Chlorella emersonii

No caso específico de C. emersonii, verificou-se que esta microalga teve um crescimento

superior no meio MP12 (Figura 5.A), em relação aos restantes meios, tendo atingido a fase

exponencial de crescimento às 306 h, o que representa cerca de 13 dias. Nesta altura, a

concentração celular foi 9,16 x 107 ± 1,19 x 107 cél. mL-1, e o valor do peso da biomassa seca 5,10

± 0,28 g L-1 (Figura 5.B).

Figura 5 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.

46 | RESULTADOS

Mais próximo deste crescimento esteve o registado no meio TAP, com o valor 6,75 x 107 ± 6,19 x

106 cél. mL-1 (330 h), sendo que, nesta fase, o valor do peso seco foi 3,20 ± 0,07 g L -1. Nos

restantes meios, o crescimento de C. emersonii foi bastante semelhante apesar de ligeiramente

inferior no meio BBM, com 1,89 x 107 ± 1,94 x 106 cél. mL-1. O valor do peso da biomassa seca

mais baixo também se verificou no meio BBM, com 0,80 ± 0,07 g L -1. No que diz respeito às

variações de pH registadas em cada meio, foi possível observar que, inicialmente, o pH do meio

Chu_13 mod. encontrava-se mais ácido do que o pH dos restantes meios (Figura 5.C). Durante o

tempo de cultivo, observaram-se variações nos valores de pH de cada meio e, no final, os seus

valores estiveram compreendidos entre 7,31 ± 0,01 (no meio BBM) e 8,16 ± 0,20 (no meio BG-

11).

3.1.2 Chlorella vulgaris

No que diz respeito ao crescimento de C. vulgaris, constatou-se que esta microalga atingiu

um valor de concentração celular superior no meio BG-11 (Figura 6.A). Na fase exponencial, o seu

valor foi 3,42 x 108 ± 7,64 x 107 cél. mL-1 e o valor do peso seco 3,80 ± 0,49 g L-1 (Figura 6.B).

Verificou-se também que nos meios Chu_13 mod. e BBM, C. vulgaris atingiu a fase exponencial

primeiro, em comparação com os restantes, com concentrações celulares inferiores.

Quanto aos valores do peso da biomassa seca, representados na Figura 6.B, estes foram

superiores nos meios MP12, BG-11 e TAP, correspondendo a 6,33 ± 1,03 g L-1, 4,30 ± 0,35 g L-1 e

4,05 ± 0,14 g L-1, respetivamente. À semelhança do que aconteceu com a concentração celular, o

peso da biomassa seca nos meios BBM e Chu_13 mod. foi inferior ao observado nos outros meios

de crescimento. Durante o tempo de cultivo, observaram-se variações nos valores de pH de cada

meio, sendo que, no final, estes valores encontraram-se entre 6,68 ± 0,12 no meio MP12 e 7,89

± 0,03 no meio BG-11 (Figura 6.C).

RESULTADOS | 47

Figura 6 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.

3.1.3 Chlorella saccharophila

C. saccharophila teve um crescimento celular superior no meio TAP, tendo atingido, na

fase exponencial, o valor 6,35 x 107 ± 9,19 x106 cél. mL-1 (Figura 7.A). Muito semelhante a este

crescimento, foi o observado no meio MP12 com 5,84 x 107 ± 2,08 x107 cél. mL-1. O meio onde se

verificou uma concentração celular inferior foi o BG-11 com 1,14 x 107 ± 3,98 x106 cél. mL-1.

Quanto aos resultados obtidos referentes ao peso da biomassa seca (Figura 7.B), o valor

máximo obtido foi 3,00 ± 0,00 g L-1, no meio MP12, e o valor mínimo foi 0,05 ± 0,00 g L-1, no

meio BG-11. As variações de pH (Figura 7.C) nos diferentes meios foram registadas ao longo do

tempo de cultivo, sendo que não se verificaram grandes discrepâncias entre os diferentes meios.

No final, estes valores variaram entre 7,18 ± 0,10 e 7,50 ± 0,02 nos meios BG-11 e TAP,

respetivamente.

48 | RESULTADOS

Figura 7 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. saccharophila ACOI 89, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.

Num contexto geral, avaliando a variação do peso da biomassa seca referente às três

microalgas, verificou-se que este aumentou com o aumento da concentração celular.

3.2 Crescimento das microalgas em meio sem azoto

Como referido no Capítulo 2, no final de cada ensaio em meio com azoto, as células foram

centrifugadas e ressuspendidas em cada um dos diferentes meios, sem a principal fonte de azoto.

Relativamente ao crescimento das microalgas nestes meios, não se verificou proliferação celular,

tal como se pode observar nas Figuras 8; 9 e 10 (A).

RESULTADOS | 49

Figura 8 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.

Em C. emersonii (Figura 8.B), apenas se verificaram ligeiras variações do peso da

biomassa seca, em todos os meios de crescimento. Em C. vulgaris (Figura 9.B), somente no meio

MP12 se observou um aumento de cerca de 4 g L-1 e, nos restantes meios, o peso da biomassa

seca manteve-se constante. Em C. saccharophila (Figura 10.B), verificou-se um aumento de cerca

de 1 g L-1 para todos os meios, exceto para o meio BG-11, que se manteve constante e muito

próximo de 0 g L-1.

Seria expectável que a concentração celular inicial na cultura das microalgas na condição

sem azoto fosse aproximadamente igual à concentração celular final observada na condição com

azoto. No entanto, isto não se verificou, o que pode dever-se a perda de material biológico

aquando da transferência das células para os meios sem azoto.

50 | RESULTADOS

Figura 9 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.

No que diz respeito às variações de pH observadas, de uma maneira geral, as curvas de

pH das três espécies encontraram-se mais afastadas, em comparação com o que se verificou na

condição com azoto. Em C. vulgaris, em particular, observou-se que no meio Chu_13 mod., o pH

manteve-se sempre ácido (entre 3 e 4).

RESULTADOS | 51

Figura 10 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. saccharophila ACOI 96, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.

3.3 Análise da Biomassa

Os resultados obtidos após extração de proteínas, lípidos e amido estão representados nas

Figuras 11, 12 e 13, respetivamente. Os valores correspondem à média ± desvio padrão de, pelo

menos, duas réplicas de medições. Os resultados que não apresentam desvio padrão

correspondem a apenas uma medição, sendo que não foi possível fazer mais medições por falta

de biomassa suficiente.

3.3.1 Proteínas

A análise da Figura 11.A permitiu verificar que nas condições em que foi efetuado um pré-

tratamento com NaOH, C. emersonii apresentou valores percentuais superiores, em comparação

com os valores obtidos na extração inicial, com H3PO4. Observou-se também que em meio sem

52 | RESULTADOS

azoto a percentagem de proteínas diminuiu em todos os meios estudados. Em relação a C.

vulgaris, observou-se maior percentagem de proteínas em meio sem azoto, contrariamente ao

observado em C. emersonii. Na microalga C. saccharophila, foi possível observar que a

percentagem de proteínas nos meios TAP e BBM foi superior na condição sem azoto.

Figura 11 - Percentagem de proteínas em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, nas condições com e sem azoto e com e sem pré-tratamento com NaOH. N – Não determinado.

3.3.2 Lípidos

O conteúdo lipídico de C. emersonii, no meio MP12, não apresentou variações relevantes

nas três condições. Nos meios TAP, BG-11 e Chu_13 mod., a percentagem de lípidos foi superior

na condição sem azoto, tendo-se verificado o caso contrário no meio BBM. Em C. vulgaris

verificou-se um aumento desta percentagem nos meios MP12, TAP e BBM, na ausência de azoto.

No entanto, no meio BG-11 a percentagem de lípidos foi superior na condição com azoto. A

RESULTADOS | 53

percentagem de lípidos nas amostras de C. saccharophila permitiu aferir que, na ausência de

azoto, este valor foi superior nos meios BBM e Chu_13 mod..

Figura 12 - Percentagem de lípidos em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e sem azoto. N – Não determinado.

3.3.3 Amido

O conteúdo de amido de C. emersonii aumentou na condição sem azoto, em todos os

meios de cultura. Em C. vulgaris, a percentagem de amido foi superior na presença de azoto nos

meios MP12, TAP, BG-11 e BBM. Para C. saccharophila verificaram-se percentagens superiores

na ausência de azoto nos meios MP12, TAP, BBM e Chu_13 mod..

54 | RESULTADOS

Figura 13 - Percentagem de amido em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e sem azoto. N – Não determinado.

3.4 Determinação das Produtividades

A Tabela 9 apresenta as produtividades de biomassa, lípidos, amido e proteínas obtidas

para as microalgas C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila nos meios MP12, TAP, BG-11,

BBM e Chu_13 mod., nas condições com e sem azoto. De um modo geral, na condição com

azoto, C. vulgaris obteve produtividades de biomassa superiores, em relação às restantes

microalgas, tendo atingido uma produtividade de 0,41 ± 0,34 g L-1 d-1 no meio MP12. C. emersonii

e C. saccharophila também apresentaram produtividades de biomassa superiores neste meio de

cultura. Na condição sem azoto, o maior valor de produtividade de biomassa obtido registou-se em

C. vulgaris, 0,80 ± 0,06 g L-1 d-1, no meio MP12. Em C. emersonii, os valores da produtividade da

biomassa diminuíram da condição com azoto para a condição sem azoto em todos os meios,

exceto no BG-11. O mesmo se verificou em C. vulgaris, exceto nos meios MP12 e TAP. Em C.

RESULTADOS | 55

saccharophila, os valores da produtividade da biomassa aumentaram da condição com azoto para

a condição sem azoto, em todos os meios de cultura. Em relação aos valores de produtividade

lipídica e de amido obtidos, na condição com azoto, estes foram superiores em C. vulgaris,

comparativamente com as restantes microalgas, tendo sido 77,20 ± 0,02 mg L-1 d-1 e 106,82 ±

0,01 mg L-1 d-1 os maiores valores de produtividade lipídica e de amido obtidos, respetivamente.

Num contexto geral, a produtividade de lípidos aumentou da condição com azoto para a condição

sem azoto em C. vulgaris (exceto nos meios BG-11 e BBM) e em C. saccharophila, contrariamente

ao que se verificou para C. emersonii, cuja produtividade de lípidos diminuiu da condição com

azoto para sem azoto (exceto no meio BG-11). Em relação à produtividade de amido, verificou-se a

sua diminuição em C. vulgaris, após cultivo em meio sem azoto, ao contrário do que aconteceu

em C. saccharophila. Em C. emersonii, a produtividade de amido aumentou na condição sem

azoto, nos meios MP12 e BG-11. No que diz respeito à produtividade de proteínas, o maior valor

obtido na condição com azoto foi 56,36 ± 0,01 mg L-1 d-1 em C. emersonii, no meio MP12 e na

condição sem azoto foi 160,50 ± 0,00 mg L-1 d-1 em C. vulgaris, no mesmo meio de cultura. Em C.

vulgaris e C. saccharophila, a produtividade de proteínas aumentou da condição com azoto para a

condição sem azoto, no entanto, em C. emersonii, isso não se verificou.

56 | RESULTADOS

Tabela 9 - Produtividades obtidas (biomassa, lípidos, amido e proteínas) para as microalgas C. emersonii ACOI 516, C. vulgaris ACOI 879 e C. saccharophila ACOI 96 nos meios MP12, TAP, BG-11, BBM e Chu_13 mod. nas condições com e sem azoto.

Meio de crescimento

Produtividade Biomassa (g L-1 d-1)

Produtividade Lipídica (mg L-1 d-1)

Produtividade Amido (mg L-1 d-1)

Produtividade Proteínas (mg L-1 d-1)

Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto

C. e

mer

soni

i

MP12 0,37 ± 0,00 0,13 ± 0,20 53,66 ± 0,01 18,24 ± 0,00 36,36 ± 0,00 46,19 ± 0,00 27,34 ± 0,00 1,81 ± 0,00

MP12 * 0,37 ± 0,00 0,13 ± 0,20 56,36 ± 0,01 15,08 ± 0,00

TAP 0,22 ± 0,01 0,06 ± 0,01 30,34 ± 0,00 11,39 ± 0,00 48,44 ± 0,01 17,83 ± 0,00 4,01 ± 0,00 0,62 ± 0,00

TAP * 0,22 ± 0,01 0,06 ± 0,01 15,69 ± 0,00 ND

BG-11 0,06 ± 0,03 0,23 ± 0,05 7,75 ± 0,00 33,76 ± 0,00 9,95 ± 0,00 97,95 ± 0,01 5,57 ± 0,00 3,97 ± 0,00

BBM 0,07 ± 0,01 0 10,76 0 15,19 ± 0,00 0 0,41 0

Chu_13 mod. 0,08 ± 0,01 0,01 ± 0,07 12,29 ± 0,00 1,80 23,60 ± 0,00 4,99 ± 0,00 0,86 0,09

C. v

ulga

ris

MP12 0,41 ± 0,34 0,80 ± 0,06 50,22 ± 0,00 99,60 ± 0,01 106,82 ± 0,01 65,49 ± 0,00 3,65 ± 0,00 160,50 ± 0,00

TAP 0,28 ± 0,00 0,28 ± 0,03 77,20 ± 0,02 109,57 ± 0,01 54,96 ± 0,01 34,48 ± 0,00 6,74 ± 0,00 72,02 ± 0,01

BG-11 0,29 ± 0,02 0,07 ± 0,02 74,09 ± 0,00 13,97 ± 0,00 60,32 ± 0,01 10,03 ± 0,00 26,24 ± 0,01 ND

BBM 0,17 ± 0,00 0,09 ± 0,08 66,77 ± 0,00 36,44 ± 0,00 26,09 ± 0,00 13,31 ± 0,00 ND 10,13

Chu_13 mod. 0,15 ± 0,00 0,02 ± 0,03 57,62 ± 0,00 ND 23,78 ± 0,00 ND ND ND

C. s

acch

arop

hila

MP12 0,22 ± 0,00 0,34 ± 0,08 28,62 ± 0,00 30,93 ± 0,00 7,51 ± 0,00 19,82 ± 0,00 47,26 ± 0,01 68,07 ± 0,00

TAP 0,15 ± 0,04 0,28 ± 0,11 29,70 ± 0,00 34,10 ± 0,00 3,00 ± 0,00 17,22 ± 0,00 29,07 ± 0,01 71,65 ± 0,01

BG-11 0,01 ± 0,00 0,04 ± 0,02 ND 5,17 0,70 ± 0,00 ND ND ND

BBM 0,10 ± 0,03 0,22 ± 0,02 23,75 ± 0,00 66,17 3,40 ± 0,00 9,97 5,81 24,51

Chu_13 mod. 0,06 ± 0,00 0,14 ± 0,02 11,37 35,07 2,09 ± 0,00 7,32 ± 0,00 ND ND

* Ensaios em que a extração de proteínas foi efetuada com pré-tratamento com NaOH.

4. CAPÍTULO IV

DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 59

A presente dissertação teve como objetivo monitorizar o crescimento celular das

microalgas C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila e avaliar o potencial da biomassa

microalgal como matéria-prima para a produção de biocombustíveis. Para isso, as microalgas

foram cultivadas em cinco meios de cultura diferentes, e depois transferidas para os mesmos

meios, sem a sua principal fonte de azoto.

Relativamente à concentração celular das microalgas nos diferentes meios, na presença

de azoto, observou-se que C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila atingiram valores

superiores nos meios MP12 e TAP; BG-11 e MP12; e TAP e MP12, respetivamente. Desta forma, é

notório que o MP12 foi um dos melhores meios de crescimento para o cultivo das três microalgas.

O azoto e o fósforo são os principais nutrientes essenciais para o crescimento das microalgas

(Dragone et al. 2010). Em cada um dos meios, existe uma fonte de azoto diferente, o que pode

ser um dos motivos diferenciadores da concentração celular obtida para cada microalga. No meio

MP12, a principal fonte de azoto é a ureia, numa concentração de 18310 µM. No meio TAP, é o

NH4Cl (7500 µM), enquanto que nos meios BBM e BG-11 a principal fonte de azoto encontra-se no

composto NaNO3, nas concentrações 2940 µM e 17600 µM, respetivamente. No meio Chu_13

mod., as microalgas consomem o azoto a partir do composto KNO3 (1980 µM). No entanto, a

ureia está descrita, na literatura, como sendo a fonte mais favorável de azoto porque, para uma

concentração de azoto equivalente, permite atingir rendimentos superiores e causa variações de

pH inferiores durante o crescimento das microalgas (Shi et al. 2000). No que diz respeito à

presença de fósforo nos diferentes meios, é também no MP12 que este se encontra em maior

concentração, estando associado ao composto KH2PO4 numa concentração de 1740 µM. Como se

pode verificar na Tabela 8, nenhum outro meio tem uma concentração em fósforo tão elevada

como a que aqui se verifica. É importante que o fósforo esteja presente numa quantidade

significativa visto que, por vezes, encontra-se ligado a iões metálicos, o que dificulta o seu

consumo na totalidade (Chisti 2007).

Ainda sobre a evolução do crescimento celular ao longo do tempo, observou-se uma

característica comum às três microalgas, no meio Chu_13 mod.. Estas mantiveram-se em fase lag

durante mais tempo, o que pode ser justificado pelo valor de pH deste meio no tempo inicial, que

se verificou inferior (≈ 4), em relação aos outros meios (> 6).

Para além disto, verificou-se o fenómeno de auto-floculação com as microalgas C.

emersonii e C. saccharophila, o que poderá ser a causa destas não terem atingido uma

concentração celular e peso da biomassa seca superiores, uma vez que, não estando em

60 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

circulação permanente por todo o meio de cultura, estão privadas do acesso apropriado aos

nutrientes. A auto-floculação pode ter sido provocada por vários fatores, tais como: valores de pH

moderadamente básicos (< 8) ou básicos (≈ 10 – 11) (Dupré et al. 1995; Spilling et al. 2011);

ligações entre as células das microalgas através de matéria orgânica extracelular excretada pela

própria microalga (Tenney & Verhoff 1973); precipitação de sais contidos num meio de cultura

com pH superior (≈ 8,5 – 10,5) causado pela fotossíntese e remoção do CO2 dissolvido nas bolhas

de ar (Sukenik & Shelef 1984).

Como referido acima, no final de cada cultivo, as células foram transferidas para meios

desprovidos de azoto. Sabe-se que o crescimento celular em meio sem azoto é importante para

induzir estados de stresse metabólico nas microalgas (Sheehan et al. 1998). Nesta situação, as

células param de proliferar, mas é mantida a fixação de CO2. Desta forma, a concentração celular

das microalgas em estudo, nesta condição, evoluiu como previsto (Herrera-Valencia et al. 2011;

Widjaja et al. 2009) uma vez que não se verificou crescimento celular. Em relação ao peso da

biomassa seca, num contexto geral, verificou-se um decréscimo destes valores para as três

microalgas em estudo, o que está de acordo com o observado em estudos anteriores (Chu et al.

2013), que registaram uma diminuição destes valores, devido à interrupção do crescimento

celular. Contudo, os autores Illman et al. (2000); Fidalgo et al. (1998); Guschina & Harwood

(2006); Douskova et al. (2008) e Herrera-Valencia et al. (2011) reportaram que, nesta condição, é

expectável o aumento do peso da biomassa seca, uma vez que o estado de stresse induz a

produção de lípidos e / ou amido.

A eficiência de produção das microalgas é estimada com base nos valores de

produtividade (g L-1 d-1) do material gerado, incluindo biomassa, lípidos e hidratos de carbono (Ho

et al. 2010; Fu et al. 2012; Converti et al. 2009; Rodolfi et al. 2009; S.-H. Ho et al. 2012). Desta

forma, o cálculo das produtividades de biomassa, lípidos, amido e proteínas foi efetuado e os

resultados foram analisados. Em relação aos valores de produtividade de biomassa obtidos em C.

emersonii, estes variaram entre 0,06 g L-1 d-1 (no meio BG-11) e 0,37 g L-1 d-1 (no meio MP12), na

condição com azoto. No entanto, na condição sem azoto os valores atingidos foram inferiores e

variaram entre 0,01 ± 0,07 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,23 ± 0,05 g L-1 d-1 (no meio BG-11).

Produtividades inferiores na condição sem azoto devem-se à interrupção do crescimento celular

nesta condição. Em condições normais de crescimento, as produtividades obtidas foram

superiores às publicadas por Illman et al. (2000), que registaram 0,03 g L-1 d-1 em C. emersonii

cultivada em condições normais de crescimento (no meio Watanabe; biorreator agitado a 200


rpm; intensidade de luz de 25 µmol m-2 s-1 na superfície do biorreator, arejamento de 1 L min-1 com

5 % (v/v) CO2 e Tª 25 °C).

De notar que estes autores forneceram ao cultivo apenas ¼ da intensidade de luz utilizada

no presente trabalho. Valores de produtividade de biomassa bastante superiores foram publicados

pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram 1,00 g L-1 d-1 em C. emersonii (células

cultivadas no meio TAP, em condições normais de crescimento, com irradiação de 600 µmol m-2 s-

1 incidente na superfície do fotobiorreator; Tª 23 ºC; 20 mL min-1 de ar contendo entre 2 - 3 % de

concentração de CO2; 0,25 vvm; agitação a 2 rpm, utilizando um agitador rotativo), ou seja, um

valor de produtividade de biomassa elevado, associado a uma intensidade de luz igualmente

elevada e a uma concentração de CO2 inferior à utilizada neste trabalho.

No que diz respeito aos valores de produtividade de biomassa obtidos em C. vulgaris, na

condição com azoto, estes variaram entre 0,15 ± 0,00 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,41 ±

0,34 g L-1 d-1 (no meio MP12). As produtividades obtidas nesta condição mostraram-se superiores a

alguns valores publicados na literatura, nomeadamente pelos autores Illman et al. (2000), que

obtiveram uma produtividade máxima de 0,04 g L-1 d-1 (condições de crescimento supracitadas). O

mesmo se verificou no trabalho realizado por Scragg et al. (2002), que também registaram 0,04 g

L-1 d-1, quando cultivaram C. vulgaris no meio Watanabe, com 6 % (v/v) CO2 (16 h de luz com

intensidade de 76 µmol m−2 s−1; Tª 25 °C; células agitadas a 60 rpm num agitador rotativo), assim,

apesar destes autores Scragg et al. (2002) terem testado a mesma concentração de CO2 que se

usou neste trabalho, a intensidade de luz utilizada foi inferior e foi aplicada durante menos tempo.

A variação da produtividade de biomassa da condição com azoto para a condição sem azoto

também foi analisada, tendo-se verificado uma diminuição destes valores, exceto nos meios MP12

e TAP. O mesmo se verificou nos estudos realizados por Illman et al. (2000), que obtiveram uma

diminuição da produtividade de 0,041 g L-1 d-1 (condição com azoto) para 0,037 g L-1 d-1 (condição

sem azoto) (condições do crescimento mencionadas anteriormente) e por Scragg et al. (2002) que

observaram uma diminuição de 0,040 g L-1 d-1 para 0,024 g L-1 d-1 (condições do cultivo

supracitadas). Esta diminuição da produtividade de biomassa na condição sem azoto é uma

consequência da diminuição do peso da biomassa seca, causada pela interrupção da proliferação

celular. Uma possível explicação para o facto da produtividade de biomassa ter aumentado para o

dobro, no meio MP12 sem azoto, e de se ter mantido no meio TAP sem azoto, foi a constância da

concentração celular e o aumento do conteúdo de lípidos e proteínas, nestes meios, embora o

peso da biomassa seca tenha diminuído cerca de 2 g L-1. Produtividades de biomassa superiores


às observadas no presente trabalho, em condições normais de crescimento foram publicadas por

vários autores. No entanto, em todos os casos analisados em que isso se verificou, os autores

forneceram intensidades de luz superiores, como foi o caso de Ho et al. (2013), que obtiveram

1,36 g L-1 d-1 para C. vulgaris, cultivada sob uma intensidade de luz de 450 µmol m -2 s-1 (no meio

Basal Modificado; 2 % CO2; 0,2 vvm; Tª 28 °C; células agitadas a 300 rpm num agitador rotativo).

Os autores Přibyl et al. (2012) registaram 0,91 g L-1 d-1 de produtividade de biomassa com as

células cultivadas no meio SŠ, com 2 % CO2 (v/v), irradiação de 500 μmol m−2 s−1 e Tª 28 °C. Os

autores Takeshita et al. (2014) observaram em C. vulgaris uma produtividade de biomassa de

0,55 g L-1 d-1 (condições do cultivo supracitadas).

Em relação às produtividades de biomassa obtidas para C. saccharophila, na condição

com azoto, os valores variaram entre 0,06 ± 0,00 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,22 ± 0,00 g

L-1 d-1 (no meio MP12). No meio TAP com azoto, obteve-se 0,15 g L-1 d-1. O mesmo valor foi

publicado pelos autores Herrera-Valencia et al. (2011) (células cultivadas no meio TAP, a 25 ± 2 º

C, sob um ciclo de luz de 16:8 h; intensidade de luz de 20 µmol m -2 s-1 cultivo agitado a 140 rpm),

no entanto, estes autores referiram que, na condição sem azoto, a produtividade aumentou

ligeiramente para 0,16 g L-1 d-1. No presente trabalho, o aumento registado foi superior, para 0,28

± 0,11 g L-1 d-1. Chinnasamy et al. (2010) obtiveram uma produtividade de 0,02 g L-1 d-1, com as

células cultivadas no meio BG-11 (meio suplementado com 5 mL de água residual; crescimento a

25 º C, sob uma intensidade de luz de 75 – 80 µmol m-2 s-1 e um fotoperíodo de 12:12 h), ou seja,

semelhante ao obtido neste trabalho, no mesmo meio (0,01 ± 0,00 g L-1 d-1).

De forma a avaliar o potencial de C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila para a

produção de biocombustíveis, após crescimento celular em meio com e sem azoto, procedeu-se à

extração de lípidos, amido e proteínas.

Uma variedade de fatores ambientais pode influenciar a acumulação de lípidos nas

microalgas, nomeadamente a disponibilidade de nutrientes. Como referido no Capítulo 1, há

nutrientes presentes no meio, cuja carência pode induzir maior acumulação de lípidos, que

funcionam como energia de reserva para ser utilizada após terminar a fase de stresse (Guschina &

Harwood 2006).

Neste trabalho, verificou-se que o conteúdo de lípidos obtido em C. emersonii foi

semelhante em todos os meios, no entanto, observou-se um ligeiro aumento na condição sem

azoto, nos meios TAP, BG-11 e Chu_13 mod.. Os valores variaram de 13,9 % para 19,3 %; 12,5 %

para 14,7 % e 15,4 % para 18,0 %, respetivamente. O aumento do conteúdo de lípidos é


expectável em meio sem azoto, no entanto, os valores obtidos ainda ficam aquém dos publicados

pelos autores Illman et al. (2000), que verificaram o aumento de 29 % para 63 % do conteúdo

lipídico, em C. emersonii. Para além disso, os mesmos autores obtiveram, em meio com azoto,

um conteúdo lipídico superior (29 %), em comparação com o obtido no presente trabalho, ainda

que em diferentes condições de crescimento (supracitadas). De lembrar que em cima referiu-se

que estes autores (Illman et al. 2000) obtiveram valores de produtividade de biomassa, em C.

emersonii, inferiores aos obtidos no presente trabalho, no entanto, o conteúdo lipídico foi superior,

o que poderá significar que as condições de cultivo usadas por estes poderão ser mais favoráveis

à acumulação de lípidos nas células.

A limitação de azoto pode induzir a produção de um elevado conteúdo lipídico, no entanto,

também pode diminuir a produtividade da biomassa. Como consequência, a produtividade de

lípidos também é afetada, ficando inferior ao obtido sob condições normais de crescimento

(Griffiths & Harrison 2009; Widjaja et al. 2009; Wijffels & Barbosa 2010), o que se verificou em C.

emersonii, exceto no meio BG-11. Na condição com azoto, os valores de produtividade lipídica

variaram entre 12,29 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 53,66 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio

MP12). No entanto, na condição sem azoto, a variação esteve entre 1,80 mg L-1 d-1 (no meio

Chu_13 mod.) e 33,76 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio BG-11). Os valores obtidos em condições

normais de crescimento, em comparação com o que foi publicado pelos autores Takeshita et al.

(2014), são bastante baixos, uma vez que estes obtiveram em C. emersonii, uma produtividade

lipídica de 230 mg L-1 d-1, com crescimento no meio TAP (irradiação de 600 µmol m-2 s-1, incidente

na superfície do fotobiorreator), contudo, a intensidade de luz utilizada por estes foi 6 vezes

superior à fornecida no presente trabalho.

Em relação ao conteúdo lipídico obtido para C. vulgaris, é de notar que, para a produção

de lípidos, em condições normais de crescimento, os meios BBM e Chu_13 mod. destacaram-se

em relação aos restantes, embora o crescimento celular desta microalga tenha sido inferior

precisamente nestes dois meios, o que pode ser justificado pelo facto da concentração da principal

fonte de azoto ser mais baixa nestes do que nos restantes, indicando que concentrações inferiores

de azoto no meio de crescimento são mais favoráveis à acumulação de lípidos (Yeh & Chang

2011; Hsieh & Wu 2009; Rodolfi et al. 2009; Takagi et al. 2000). O aumento do conteúdo lipídico

da condição com azoto para a condição sem azoto, foi mais visível no meio TAP, tendo-se

verificado um aumento de 27,8 % para 39,2 %. Em estudos anteriores, verificou-se que, após

diminuir a concentração de azoto até 75 %, a percentagem de lípidos aumentou de 5,9 % para


16,4 %, no meio BBM (usando como fonte de carbono o CO2 presente no ar – 300 ppm) (Converti

et al. 2009), ou seja, em comparação com o que foi obtido, neste trabalho, no meio TAP, o

aumento do conteúdo lipídico foi semelhante, ainda que, para os autores mencionados, os valores

percentuais atingidos tenham sido inferiores. No entanto, no presente trabalho, no meio BBM, o

aumento do conteúdo lipídico, na condição sem azoto foi de apenas 1 %. Illman et al. (2000)

verificaram, em C. vulgaris, que a percentagem de lípidos aumentou de 18 % (condição com azoto)

para 40 % no meio Watanabe sem azoto (condições de crescimento acima citadas), pelo que este

aumento foi superior ao maior aumento observado neste trabalho, em C. vulgaris. Conteúdos

lipídicos superiores aos obtidos no presente trabalho, em condições normais de crescimento,

foram publicados pelos autores Přibyl et al. (2012), que obtiveram uma média de 50,80 %

(condições de crescimento supracitadas) e pelos autores Chu et al. (2013), que registaram um

conteúdo lipídico de 37,60 % no meio BG-11 (células cultivadas com fotoperiodicidade 16:8 h; 0,5

vvm com 4 % CO2; Tª 25 ± 2 °C), sendo que estes últimos verificaram o aumento do conteúdo

lipídico para 50,27 %, na condição sem azoto. No meio BG-11 do presente trabalho verificou-se o

oposto, ou seja, diminuição do conteúdo lipídico na condição sem azoto. Regra geral, tem-se

verificado que os autores que utilizam uma concentração de CO2 inferior à utilizada no presente

trabalho, assim como intensidades de luz superiores, obtêm conteúdos lipídicos mais elevados.

Para além disso, o facto de não se estar a comparar com as mesmas estirpes e adicionalmente as

condições de crescimento serem diferentes, em comparação com as usadas neste trabalho, torna

expectável diferenças nos resultados obtidos.

Em relação aos valores de produtividade lipídica obtidos em C. vulgaris, em condições

normais de crescimento, estes variaram entre 50,22 ± 0,00 mg L-1 d-1 (meio MP12) e 77,20 ± 0,02

mg L-1 d-1 (meio TAP). Produtividades lipídicas superiores às obtidas neste trabalho foram

publicadas por Přibyl et al. (2012), que obtiveram em C. vulgaris uma média de 460 mg L-1 d-1

(condições do cultivo acima mencionadas). Os autores Chu et al. (2013) obtiveram em C. vulgaris

uma produtividade lipídica de 43,17 mg L-1 d-1, no meio BG-11, em condições normais de

crescimento (condições de crescimento supracitadas), tendo este valor aumentado para 58,39 mg

L-1 d-1, na condição sem azoto. Neste trabalho, a produtividade lipídica de C. vulgaris no meio BG-11

variou de 74,09 ± 0,00 mg L-1 d-1 para 13,97 ± 0,00 mg L-1 d-1, ou seja, foi superior na condição

com azoto, em relação aos mesmos autores, no entanto, diminuiu bastante na condição sem

azoto. Esta queda da produtividade lipídica na condição sem azoto foi uma consequência da

diminuição da produtividade de biomassa, no mesmo meio, assim como do conteúdo lipídico.


Estudos anteriores (Widjaja 2010) demonstraram que expondo C. vulgaris a condições de

privação de azoto, são obtidas produtividades lipídicas inferiores, causadas pela diminuição do

crescimento celular, nesta situação. No entanto, estes também verificaram que após exposição a

períodos superiores de limitação de azoto (17 dias), é possível obter não só um conteúdo lipídico

superior como também o aumento da produtividade lipídica para valores semelhantes e até

superiores aos obtidos no final do cultivo sob condições normais. Pelo que, produtividades lipídicas

superiores poderão ser obtidas variando não só a duração do período de privação de azoto, assim

como, do período de cultivo normal (Widjaja 2010; Yeh & Chang 2011).

No que diz respeito ao conteúdo lipídico obtido em C. saccharophila, os valores

percentuais aumentaram da condição com azoto para a condição sem azoto nos meios BBM e

Chu_13 mod., de 22,7 % para 30,5 % e de 19,9 % para 25,9 %, respetivamente, sendo que

também foi nestes meios que se observou o maior conteúdo lipídico. Griffiths & Harrison (2009)

reportaram uma percentagem lipídica média de 23,0 % para algas verdes (Chlorophyta). Assim, as

percentagens obtidas para esta microalga encontram-se próximas desta média. Contudo, o mesmo

não se verificou em meio sem azoto, uma vez que a média referida pelos mesmos autores é 41,0

%. Herrera-Valencia et al. (2011) verificaram na condição com azoto, do meio TAP, uma

percentagem lipídica de 50 %. Na ausência de NH4Cl, observaram o aumento desta percentagem

para 63,6 % (condições de crescimento mencionadas anteriormente). Outros estudos também

obtiveram valores percentuais de lípidos superiores em C. saccharophila, em relação ao que foi

obtido no presente trabalho, como é o caso dos autores Hempel et al. (2012), que obtiveram um

conteúdo lipídico de 27,6 % (células cultivadas no meio Tamiya modificado, com 2 % (v/v) CO2;

irradiação de 200 µmol fotões m-2 s-1). Em condições heterotróficas de crescimento, os autores Tan

& Johns (1991), também registaram um conteúdo lipídico superior – 46,7 %. No presente

trabalho, não foi possível fazer extração de lípidos do meio BG-11 na condição com azoto, por falta

de biomassa suficiente, no entanto, na literatura, vem descrito que, neste meio (suplementado

com solo), C. saccharophila apresenta um conteúdo lipídico aproximado de 12,9 % (células

cultivadas a 25 °C sob uma intensidade de luz a variar entre 75 – 80 µmol fotões m-2 s-1 e com

fotoperiodicidade 12:12 h) (Chinnasamy et al. 2010).

No que diz respeito aos valores de produtividade lipídica obtidos com esta microalga,

verificou-se que, na condição com azoto, variaram entre 11,37 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e

29,70 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio TAP). Estes valores encontram-se abaixo da média reportada para

microalgas cultivadas sob condições normais de crescimento – 50 mg L-1 d-1 (Griffiths & Harrison


2009). Na condição sem azoto, do presente trabalho, as produtividades variaram entre 5,17 mg L-1

d-1 (no meio BG-11) e 66,17 mg L-1 d-1 (no meio BBM). Estes valores também se encontram abaixo

do que publicaram os autores Herrera-Valencia et al. (2011), uma vez que estes registaram em C.

saccharophila uma produtividade lipídica de 99,33 mg L-1 d-1 quando as células foram cultivadas

em meio sem azoto (condições do cultivo acima mencionadas). No entanto, neste trabalho, em C.

saccharophila, verificou-se em todos os meios de crescimento, o aumento da produtividade

lipídica, na condição sem azoto, o que pode ser o resultado da síntese de novo lipid synthesis,

uma característica de algumas microalgas oleaginosas, que consiste em direcionar o excesso de

carbono e energia em lípidos de armazenamento (principalmente TAG), quando cultivadas em

condições de carência de azoto ou sob uma tensão que limita o crescimento (Rodolfi et al. 2009).

Várias microalgas do género Chlorella estão descritas como sendo capazes de produzir

níveis mais elevados de amido do que de lípidos, como polímeros de reserva (Fernandes et al.

2012). Sabe-se que a acumulação de amido pelas microalgas é dependente da estirpe e varia de

acordo com o meio e com as condições da luz (Takeshita et al. 2014; Liu et al. 2008; Dragone et

al. 2011). Várias espécies foram descritas como sendo ideais para a produção de bioetanol, por

produzirem grandes quantidades de amido sob privação de azoto (Mussatto et al. 2010).

No presente trabalho, extraiu-se o amido presente nas microalgas, nas condições com e

sem azoto. Os resultados obtidos em C. emersonii mostraram-se bastante satisfatórios, uma vez

que se verificou em todos os meios o aumento da percentagem de amido na condição sem azoto,

o que de acordo com a literatura é expectável (Douskova et al. 2008; Converti et al. 2009; Lv et al.

2010; Přibyl et al. 2012; Widjaja et al. 2009; Behrens et al. 1989). Para além disso, nos meios

MP12, BG-11 e Chu_13 mod., observou-se um aumento de 9,9 % (com azoto) para 35,2 % (sem

azoto); de 16,1 % para 42,7 % e de 29,5 % para 38,0 %, respetivamente. Assim, o maior conteúdo

de amido obtido é semelhante, ainda que ligeiramente superior, à percentagem máxima registada

pelos autores Dragone et al. (2011), que obtiveram um conteúdo de amido de 41,0 % (na

condição sem azoto) (C. vulgaris cultivada com ar enriquecido com 2 % (v/v) CO2, taxa de

arejamento de 0,83 vvm; irradiação de 70 µmol m-2 s-1 de luz).

Em relação aos valores das produtividades de amido obtidas em C. emersonii, na

condição com azoto, estes variaram entre 9,95 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio BG-11) e 48,44 ± 0,01

mg L-1 d-1 (no meio TAP). Estes valores encontraram-se bastante abaixo do publicado na literatura

pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram uma produtividade de amido de 180 mg L -1 d-

1, em C. emersonii (condições do crescimento referidas anteriormente). No entanto, de notar que


os autores citados forneceram uma intensidade de luz 6 vezes superior à utilizada neste trabalho e

intensidades de luz superiores induzem a produção de polissacáridos em microalgas (Friedman et

al. 1991; Tredici et al. 1991).

Em relação ao conteúdo de amido obtido em C. vulgaris, verificou-se maior percentagem

deste na condição com azoto, em todos os meios. Nesta condição, os valores obtidos são

semelhantes aos reportados pelos autores Cheng et al. (2015), que verificaram nesta microalga

uma percentagem de amido de 21,0 %, numa cultura com 2 % (v/v) CO2. Um conteúdo de amido

superior foi publicado pelos autores Ho et al. (2013), que obtiveram 31,25 % (C. vulgaris cultivada

sob uma intensidade de luz elevada, 450 µmol m -2 s-1). No que diz respeito à variação do conteúdo

de amido da condição com azoto para a condição sem azoto, os estudos encontrados na literatura

apresentam resultados que contrariam os obtidos no presente trabalho. Douskova et al. (2008)

induziram uma acumulação de amido na microalga C. vulgaris (cultivada no meio MP12, numa

concentração de CO2 > 10 %) pela privação de azoto e o teor em amido nas células aumentou 50

%. Os autores Dragone et al. (2009) verificaram que o conteúdo de amido em C. vulgaris (cultivada

no meio MP12, nas mesmas condições utilizadas no presente trabalho) sob condições de privação

de azoto, constituiu 36 % da biomassa algal, enquanto que, sob condições normais, esta

percentagem foi apenas 8 %, o que enfatiza o facto da privação de azoto ser um fator chave para a

acumulação de amido pelas microalgas. De notar que estes autores, não determinaram o

conteúdo de amido pelo mesmo método utilizado no presente trabalho. Ainda assim, tendo em

conta que os resultados obtidos, em C. vulgaris, não foram de encontro à literatura, tudo indica

que alguns dos fatores que podem influenciar a produção de amido pelas células, se possam ter

alterado, nomeadamente a intensidade da luz, a concentração de CO2, a temperatura e / ou a

concentração de ferro (aumenta a eficiência fotossintética) (Van Oijen et al. 2005; Warr et al.

1985) ou até a possibilidade de existência de erros no procedimento de extração de amido das

células.

Em relação aos valores de produtividade de amido obtidos com esta microalga, na

condição com azoto, estes variaram entre 23,78 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e

106,82 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio MP12). Uma produtividade superior foi obtida pelos autores

Dragone et al. (2011), que registaram em C. vulgaris, 199 mg L-1 d-1 (condições de crescimento

referidas anteriormente), que pode estar relacionado com o facto destes autores terem usado uma

taxa de arejamento superior e uma concentração de CO2 inferior, em relação ao que se utilizou

neste trabalho. No entanto, um valor próximo dos que foram obtidos com os meios TAP e BG-11


foi reportado pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram 69 mg L-1 d-1 (condições do

cultivo supracitadas).

No que diz respeito ao conteúdo de amido obtido em C. saccharophila, verificou-se que os

valores obtidos foram inferiores aos observados nas outras microalgas. Nos meios em que foi

possível analisar o conteúdo de amido, na condição sem azoto, verificou-se que estes valores

foram ligeiramente maiores, em comparação com os observados na condição com azoto. Como

demonstram os estudos acima citados, é possível obter conteúdos de amido superiores (para as

microalgas, na generalidade) às observadas em C. saccharophila.

Uma troca entre a acumulação de lípidos e de amido tem sido observada em algumas

espécies de Chlorella (Mizuno et al. 2013). Os autores Ho et al. (2013) verificaram o aumento da

concentração de carbohidratos em condições de privação de azoto. No entanto, o conteúdo lipídico

não variou significativamente durante este período. Alguns estudos demonstraram que o fluxo de

carbono nas microalgas está alocado em compostos ricos em energia, e há uma competição entre

a síntese de lípidos e de amido (Rismani-Yazdi et al. 2011; Siaut et al. 2011). No entanto, o

aumento da síntese de lípidos ou de carbohidratos sob condições de stresse difere entre espécies

(S. H. Ho et al. 2012). No presente trabalho, em C. emersonii foi predominante a produção de

amido, contudo, em C. vulgaris e C. saccharophila, predominou a produção de lípidos.

O elevado conteúdo de proteínas presente em várias espécies de microalgas é uma das

principais razões para considerar estes microrganismos fontes convencionais de proteínas (Soletto

et al. 2005). Como as células são capazes de sintetizar todos os aminoácidos, podem fornecer os

essenciais para os seres humanos e os animais (Guil-Guerrero et al. 2004), desta forma Chlorella

é reconhecida como ingrediente alimentar seguro a nível mundial (Guccione et al. 2014; Spolaore

et al. 2006; Cornet 1998; Soletto et al. 2005). Vários estudos já demonstraram que a alteração na

concentração de nutrientes pode modificar o crescimento e o metabolismo secundário das

microalgas. Como referenciado acima, condições de limitação de azoto induzem a acumulação de

lípidos e / ou amido, o que não se verifica no caso das proteínas, sendo que, nestas condições,

ocorre uma diminuição da sua concentração nas células (Biller et al. 2011; Lv et al. 2010; da Silva

et al. 2009; Pruvost et al. 2011).

No que diz respeito ao procedimento de extração de proteínas efetuado no presente

trabalho, é importante lembrar que foram testadas duas condições diferentes em C. emersonii. Na

primeira condição, as proteínas foram extraídas com o auxílio de uma solução de H3PO4 (0,15 M),

no entanto, após observação dos resultados obtidos, verificou-se que este procedimento não


deveria ser adequado, uma vez que estavam a obter-se percentagens de proteínas muito baixas,

comparativamente com o que vem descrito na literatura (Dragone et al. 2010). Desta forma,

testou-se uma segunda condição que implicou a extração das proteínas com NaOH (1 M). Após

testar a segunda condição, os resultados mostraram-se mais apropriados (ainda assim, aquém do

que se esperaria), pelo que, para a extração das proteínas das microalgas C. vulgaris e C.

saccharophila, apenas se utilizou a segunda condição. No entanto, do ponto de vista prático, o

segundo procedimento apresentou uma desvantagem em relação ao primeiro. Após adicionar a

solução de NaOH à biomassa liofilizada, levou-se a mistura a um banho de 80 °C e, no final,

terminou-se a reação com gelo. Este último passo provocou a solidificação da solução de NaOH

com as amostras de microalgas, pelo que foi difícil retirar volume de sobrenadante suficiente para

a determinação das proteínas. Esta desvantagem pode estar na origem dos resultados obtidos

para as três microalgas em estudo. C. vulgaris apresentou um conteúdo de proteínas superior na

condição sem azoto, o que contradiz os resultados publicados por Ho et al. (2012) e Siaut et al.

(2011) que demonstraram que a privação de azoto diminui o conteúdo de proteínas das células,

uma vez que força estes microrganismos a transformar as proteínas em lípidos ou carbohidratos.

O conteúdo de proteínas médio publicado na literatura para C. vulgaris, em condições normais de

crescimento, encontra-se entre 41 % e 58 % (Dragone et al. 2010), desta forma verificou-se que os

resultados obtidos com esta microalga ficaram abaixo do expectável.

No que diz respeito aos valores de produtividade de proteínas obtidos em C. vulgaris,

variaram entre 3,65 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio MP12) e 26,24 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio BG-11).

Na literatura encontraram-se valores bastante superiores a estes, nomeadamente os que foram

publicados pelos autores Chen et al. (2015), que obtiveram em C. vulgaris uma produtividade de

proteínas de 146 mg L-1 d-1 (cultivada no meio Basal Modificado, com uma intensidade de luz de

150 µmol m-2 s-1; concentração inicial de ureia de 9,3 mM e de Fe2+ de 180 µM) e por Mahboob et

al. (2012), que registaram uma produtividade de proteínas de 2260 mg L -1 d-1 com uma espécie de

C. vulgaris termotolerante cultivada no meio N-8 otimizado. Uma produtividade inferior e

semelhante à que foi obtida, neste trabalho, na condição com azoto do meio BG-11, foi publicada

pelos autores Wang et al. (2014), que obtiveram com outra espécie de Chlorella (ellipsoidea) uma

produtividade de proteínas de 21,67 ± 2,24 mg L-1 d-1 (com células cultivadas no meio BG-11, 16 h

luz por dia e irradiação de 35 µmol m_2 s_1).

Em relação ao conteúdo de proteínas obtido em C. saccharophila, verificou-se que, nos

meios MP12 e TAP, na condição com azoto, os valores foram superiores aos obtidos em C.


emersonii e C. vulgaris. No entanto, também ficaram aquém dos resultados publicados na

literatura, nomeadamente pelos autores Hempel et al. (2012) (condições de crescimento acima

citadas), que reportaram para a microalga C. saccharophila um conteúdo de proteínas de 42,4 % e

para Chlorella sp. 44,3 %. Guccione et al. (2014) demonstraram que o conteúdo de proteínas em

nove estirpes de Chlorella em meio com azoto foi, em média, 39,7 %. Após um período de

limitação de azoto, a percentagem de proteínas registada foi 24,6 % (valor médio). Illman et al.

(2000) obtiveram em C. vulgaris uma percentagem de proteínas de 29,0 %, na condição com

azoto, tendo este valor diminuído até 7,0 % na condição sem azoto. Em C. emersonii, os mesmos

autores obtiveram 32,0 % e 28,0 % nas condições com e sem azoto, respetivamente (condições do

cultivo supracitadas). Ho et al. (2013) verificaram uma diminuição no conteúdo de proteínas de

58,8 % para 20,1 %, quando colocaram C. vulgaris em meio com carência de azoto. Uma razão

possível para justificar que o conteúdo de proteínas diminua na condição sem azoto é o facto de

todas as estruturas de carbono produzidas durante o processo metabólico serem direcionadas

para a produção de carbohidratos e lípidos, enquanto que, na presença de azoto, a maior parte

das estruturas de carbono são incorporadas em compostos azotados (como aminoácidos,

proteínas e ácidos nucleicos) (Dragone et al. 2011; El-Moneim M. R. Afify et al. 2010; Widjaja

2010).

5. CAPÍTULO V

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS | 73

A capacidade de produção atual de biocombustíveis provenientes de microalgas ainda é

inferior ao necessário para o estabelecimento de uma sociedade mais sustentável. Desta forma,

este trabalho surge na tentativa de acrescentar informação nesta área, com a seleção de

microalgas com potencial de produção de biocombustíveis.

A elaboração da presente dissertação permitiu concluir que para as condições avaliadas, o

meio MP12 demonstrou ser um dos melhores para o crescimento das microalgas estudadas, pelo

facto de apresentar concentrações de azoto e fósforo superiores, em relação aos outros meios de

crescimento. Concluiu-se também que C. vulgaris foi a microalga que obteve valores de

concentração celular e peso da biomassa seca superiores, tendo, desta forma atingido o maior

valor de produtividade de biomassa, no meio MP12.

Analisando os conteúdos lipídicos obtidos, concluiu-se que, de uma maneira geral, C.

vulgaris apresentou percentagens superiores (inclusive 39,2 % na condição sem azoto do meio

TAP). O facto de ter sido a microalga que atingiu maior peso da biomassa seca, juntamente com o

facto de ter produzido o maior conteúdo lipídico, refletiu-se na maior produtividade lipídica obtida,

pelo que revelou ter o maior potencial de produção de lípidos. No entanto, para poder afirmar que

tem potencial de produção de biodiesel, por exemplo, seria necessário dar continuidade ao

presente trabalho no sentido de obter a caracterização dos lípidos, uma vez que espécies

diferentes de microalgas produzem diferentes tipos de ácidos gordos e alguns ácidos gordos são

mais adequados para a transesterificação em biodiesel do que outros, nomeadamente os TAG e os

AGL.

O conteúdo de amido obtido em C. emersonii faria crer que esta seria a melhor microalga

para a produção de amido, no entanto, a análise dos valores de produtividade de amido obtidos

demonstraram que C. vulgaris é mais adequada porque, embora tenha produzido, em média,

menos amido, o facto de ter atingido uma concentração de células superior, tornou esta espécie

mais rentável.

Os resultados obtidos referentes ao conteúdo de proteínas não permitiram tirar conclusões

em relação à capacidade de produção das microalgas em estudo.

Estudos experimentais adicionais serão necessários para determinar com melhor precisão

as condições de crescimento ideais, por exemplo, através da alteração de condições ambientais

(pH, temperatura, nível de nutrientes, percentagem de CO2, intensidade da luz e arejamento).

Idealmente, as microalgas deveriam ser colhidas num ponto de elevada concentração de

biomassa e elevada produtividade de lípidos e/ou amido, no entanto, sabe-se que as microalgas

74 | CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS

aumentam o conteúdo de lípidos e/ou amido sob privação de nutrientes e, nestas condições,

estes microrganismos produzem menos biomassa. Desta forma, é importante encontrar um

equilíbrio entre este dilema, através da otimização da concentração de azoto no meio de

crescimento.

De forma a compreender melhor a relação entre o crescimento celular e a acumulação de

lípidos seria útil medir a clorofila presente nas células durante o processo de cultivo, uma vez que

esta é um componente essencial das algas verdes, responsável por capturar CO2 e energia solar

para gerar um fluxo metabólico tanto para o crescimento celular como para a acumulação de

lípidos. Para além disso, e tendo em conta que o cultivo de microalgas em condições mixotróficas

tem sido considerado um processo muito eficiente para a produção de biomassa microalgal,

comparativamente com as condições fotoautotróficas, seria também interessante cultivar as

microalgas estudadas nessas condições.

Um rápido progresso no campo de produção de biocombustíveis a partir de microalgas

tem sido feito a todos os níveis, desde a identificação de espécies de alto rendimento à melhoria

das técnicas de colheita e extração. No entanto, a utilização industrial de microalgas para a

produção de biocombustíveis poderá ser rentabilizada através da utilização de co-produtos de alto

valor produzidos pelas mesmas, para outros fins. Adicionalmente, utilizar espécies de microalgas

de rápido crescimento para a fixação de CO2 é uma alternativa muito promissora para a mitigação

de CO2. O mérito principal desta estratégia reside no facto de que, através do cultivo de

microalgas, a mitigação de CO2 e a produção de biocombustíveis poderiam ser combinados de

uma forma economicamente viável e ambientalmente sustentável. A viabilidade desta estratégia

pode ser reforçada através da fixação de CO2 dos gases industriais e pela integração do cultivo de

microalgas no tratamento de águas residuais. Seria também importante identificar espécies

capazes de manter o cultivo estável, sob uma intensidade de luz elevada, utilizando

fotobiorreatores ao ar livre, uma vez que a luz solar exterior pode variar entre 100 µmol fotões m_2

s_1 (em tempo nublado) e mais de 1000 µmol fotões m_2 s_1 em clima moderado. Pode ainda atingir

um máximo de mais de 2000 µmol fotões m_2 s_1 na luz direta do sol do solstício de verão.

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Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo Seleção de Microalgas com ... · UMinho | 2016 Universidade do...

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