Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em Lactobacillus sp para

Imunização de Frangos de Corte

Depto Biologia GeralDepto MicrobiologiaDepto Bioquímica-Imunologia

Depto Medicina PreventivaDepto Tecnologia e Inspeção UNEB

PROJETO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

Introdução

Coccidiose aviária é uma doença parasitária

gastrointestinal debilitante e às vezes fatal.

Agente etiológico – protozoários parasitas

apicomplexa do gênero Eimeria (9 espécies).

Prejuízos em granjas da ordem de US$ 1,5 bilhões

anuais. US$ 60 milhões só no Brasil.

Anatomia da galinha

Espécie Ciclo (d) Localização da infecção

E. acervulina 5Alça duodenal e intestino delgado superior

E. praecox 4Alça duodenal e intestino delgado superior

E. mitis 5 Intestino delgado

E. maxima 7 Intestino delgado

E. necatrix 7 Intestino delgado e cecos

E. tenella 7 Cecos

E. brunetti 6 Intestino delgado e cecos

• Sítios de infecção em Gallus gallus domesticus

CICLO DE VIDACICLO DE VIDA

Lesão causada por Eimeria tenella em ceco.

1. Isolamento e seleção de cepas de Lactobacillus spp. com elevada capacidade de adesão em porções definidas do trato gastrointestinal de aves de corte;

2. Identificação e clonagem de genes de coccídios com potencial imunogênico. Construção de vetores para expressão de proteínas heterólogas (antígenos) em lactobacilos isolados de frangos;

3. Imunização experimental de aves com lactobacilos recombinantes expressando antígenos de coccídios. Avaliação dos parâmetros imunológicos nas aves vacinadas após desafio;

4. Produção em escala industrial das bactérias recombinantes e testes-piloto de imunização de frangos em granjas.

Objetivos

Endereçamento celular

IntracelularIntracelular

SecretadaSecretada

AncoradaAncorada

DNADNA

Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria

Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria

Eritromicina (1,2 kb)

L

GFP (720pb)

Ancora (600pb)

(344)

BamH IBamH I

BamH IApa I Xho I

Xho IEcoR V /

EcoR I

EcoR I

Hind III

EcoR I

Bst XI

Promotor t7 – M13 Forward LacZ α ATG - M13 Reverse

Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em

Lactobacillus sp para Imunização de Frangos de

CorteIsolamento, Identificação Molecular

e Modificação Genética de

Lactobacilos de Frangos

João Luiz Silva Moreira

Álvaro Cantini Nunes / Jacques R. Nicoli

Frangos abatidos precocemente

(criação intensiva)

Aditivos alimentares

(antimicrobianos e promotores de crescimento)

• Alteração da microbiota

• Depressão imunológica

• Resíduos indesejáveis

Avicultura

UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICOS

(Suplemento com microorganismos vivos)

Melhoram o equilíbrio microbiano intestinal

1. Exclusão competitiva;

2. Modulação imunológica;

3. Inibição da ação de toxinas;

4. Produção de metabólitos bactericidas (AL, H2O2).

PRINCIPAIS GÊNEROS DE BACTÉRIAS DO ÁCIDO LÁTICO

Objetivos

1. Isolamento de lactobacilos de frangos caipira e de granja;

2. Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rRNA;

3. Seleção de isolados de lactobacilos com propriedades probióticas;

4. Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.

Metodologias para determinação de polimorfismos

genéticos• PCR GENE-ESPECíFICO: amplificação específica de genes

polimórficos

• RAPD: amplificação aleatória de polimorfismos

• ARDRA: digestão com enzimas de restrição de genes

polimórficos (p.ex., ITS 16S-23S rDNA)

• DGGE/SSCP: diferenciação dos genes por diferenças na

composição de bases (p.ex., 16S rDNA)

• REP-FINGERPRINTING: amplificação por PCR de elementos

repetitivos bacterianos (p.ex., GTGn)

PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Molecular Diversity of Lactobacillus spp. and Other Lactic Acid Bacteria in the Human Intestine as Determined by Specific Amplification of 16S Ribosomal DNA

H.G.H.J. HEILIG, E.G. ZOETENDAL, E.E. VAUGHAN, P. MARTEAU, A.D.L. AKKERMANS and W.M. DE VOS

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,.68(1): 114–123 (2002)

PCR-DGGE da Região V3 do Gene 16S de Bactérias do

Ácido Láticoa = Pediococcus acidilactici DSM 20333

b = Pediococcus pentosaceus DSM 20336c = Enterococcus casseliflavus ATCC 25788

d = Enterococcus durans ATCC 11576e = Enterococcus faecalis ATCC 19433f = Enterococcus faecium ATCC 19434

g = Lactobacillus sakei DSM 20017h = Lactobacillus curvatus LTH 1432

i = Lactobacillus casei ATCC 334j = Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis DSM 20072k = Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM

20081l = Lactobacillus helveticus ATCC 15009m = Lactobacillus plantarum NCDO 1193

n = Leuconostoc mesenteroide subsp. mesenteroides DSM 20343

o = Lactococcus lactis subsp. lactis DSM 20481p = Lactococcus lactis subsp. cremoris DSM 4645

q = Lactococcus lactis subsp. hordniae DSM 20450r = Lactococcus garvieae DSM 20684

s = Leuconostoc lactis DSM 20202t = Weissella paramesenteroides DSM 20288u = Streptococcus thermophilus CNRZ 302

PCR-SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Applied and Environmental Microbiology, 66(3): 930-936 (2000) Succession of Microbial Communities during Hot Composting as Detected by PCR-Single-Strand-Conformation Polymorphism-Based Genetic Profiles of Small-Subunit rRNA Genes Sabine Peters, Stefanie Koschinsky, Frank Schwieger, and Christoph C. Tebbe

Os primers PCR foram desenhados para amplificar as regiões V4 e V5 hipervariáveis eubacterianas dos genes 16S rDNA

RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA)

Identification and Phylogenetic Analysis of Lactobacillus Using Multiplex RAPD-PCR

A.K. DAUD KHALED, B.A. NEILAN, A. HENRIKSSON, P.L. CONWAY

FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 153: 191-197 (1999)

PCR-ARDRA (Amplified Ribosomal

DNA Restriction Analysis)

HpaII HaeIII

Journal of Clinical Microbiology, 39(10): 3555-3562 (2001)

Identification of Clinical Isolates of Actinomyces Species by Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis

Val Hall, P. R. Talbot, S. L. Stubbs, and B. I. Duerden

Identification of Lactobacillus Isolates from the gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons

G. W. TANNOCK, A. TILSALA-TIMISJARVI, S. RODTONG, J. NG, K. MUNRO, AND T. ALATOSSAVA

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 65 (9): 4264–4267, 1999.

Comparação das sequências de DNA da região intergênica 16S-

23S rDNA

SSU rDNA operon

espaçador16S-23S

espaçador23S-5S

16S 23S 5S

Diversidade Microbiana em Amostras de fezes humanas

Purificação de gel de agarose do fragmento de 500 pb da PCR 16-23S

PCR ITS 16S-23S SSU rDNA

Amplificação das Regiões ITS do rDNA de Diferentes

Lactobacillus sp

SEQUENCIAMENTO

Identificação Molecular

SSU rDNA operon

Primer senso (16S): 5'-GAATCGCTAGTAATCG-3'

Primer Reverso (23S): 5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3'

Resultados

Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rDNA

3G14C (Lactobacillus reuteri)

1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII

1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII

3G14L (Lactobacillus johnsonii)

2G14E (Lactobacillus acidophilus )

5G14L (Lactobacillus crispatus)

1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII

4G14C (Lactobacillus vaginalis)

2GB26 (Lactobacillus salivarius)

1AC41 (Lactobacillus agilis)

Seleção das cepas de Lactobacillus sp com propriedades probióticas

1. Seleção de cepas com resistência a suco gástrico

2. Seleção de cepas com resistência a sais biliares

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

16%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

1C14P-CT 1C14P-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

58%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

2M14L-CT 2M14L-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

12%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

1G14P-CT 1G14P-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

72%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

2C14E-CT 2C14E-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

24%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

3C14L-CT 3C14L-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

43%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

4C14C-CT 4C14C-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

36%

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

3D14L-CT 3D14L-SB

0 2 4 6 8 10 120,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

OD

60

0 n

m

Tempo (h)

5C14E-CT 5C14E-SB

3. Teste de Hidrofobicidade

Isolado Espécie Hidrofobicidade (%)   Isolado Espécie Hidrofobicidade (%)

1M14C1M14C L. reuteriL. reuteri 8989 5D14E5D14E L. acidophilusL. acidophilus 8383

1M14E1M14E L. johnsoniiL. johnsonii 3535 2G14E2G14E L. acidophilusL. acidophilus 5555

2M14C2M14C L. reuteri L. reuteri 5858 3G14C3G14C L. reuteriL. reuteri 6767

2M14L2M14L L. acidophilusL. acidophilus 5252 3G14L3G14L L. johnsoniiL. johnsonii 4545

3M14C3M14C L. reuteriL. reuteri 4242 4G14C4G14C L. vaginalisL. vaginalis 2525

3M14L3M14L L. johnsoniiL. johnsonii 6161 4G14L4G14L L. reuteriL. reuteri 3535

4M14C4M14C L. reuteriL. reuteri 6464 5G14C5G14C L. salivariusL. salivarius 6666

4M14L4M14L L. reuteriL. reuteri 3636 5G14L5G14L L. crispatusL. crispatus 3535

5M14C5M14C L. reuteriL. reuteri 7878 2C14E2C14E L. acidophilusL. acidophilus 5555

1D14C1D14C L. salivariusL. salivarius 6060 2C14L2C14L L. acidophilusL. acidophilus 7878

2D14C2D14C L. vaginalisL. vaginalis 6767 3C14C3C14C L. reuteriL. reuteri 8484

2D14E2D14E L. acidophilusL. acidophilus 7676 3C14L3C14L L. johnsoniiL. johnsonii 8383

3D14C3D14C L. reuteriL. reuteri 8383 4C14C4C14C L. salivariusL. salivarius 9292

3D14L3D14L L. crispatusL. crispatus 8888 5C14C5C14C L. salivariusL. salivarius 8383

4D14C4D14C L. reuteri L. reuteri 8888    5C14E5C14E L. acidophilusL. acidophilus 6464

1. Seleção de cepas com capacidade de adesão à epitélio intestinal ou muco;

2. Teste de colonização em modelo murino gnotobiótico;

3. Capacidade de transferência de resistência (in vitro e in vivo);

4. Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.

Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus rhamnosus

Identificação Molecular de isolados vaginais humanos

Lactobacillus gasseri

Lactobacillus fermentum

Identificação Molecular de isolados vaginais humanos

BARROW, P.A. Probiotics for chickens. In: Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992, p. 225–257.CERQUEIRA, M.M.O.P. Isolamento, seleção e efeitos de um probiótico na modulação da infeccção por Eimeria acervulina e no desempenho de frangos de corte. Belo Horizonte: UFMG, 2000. 95 p. (Tese de Doutorado).CUNNINGHAM-RUNDLES, S., AHRNE, S., BENGMARK, S., JOHANN-LIANG,R., MARSHALL, F., METAKIS, L., CALIFANO, C., DUNN, A.M., GRASSEY, C., HINDS, G. AND CERVIA, J. (2000) Probiotics and immune response. Am. J. Gastroenterol. 95, S22-S25. FULLER, R. Nature of the determinant responsible for the adhesion of lactobacilli to the chicken crop epithelial cell. Journal of General Microbiology, v. 87, p. 245–250, 1975.FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, v. 66, p. 365–378, 1989.GEOFFROY M-C, GUYARD C, QUATANNENS B, PAVAN S, LANGE M, MERCENIER A: Use of green fluorescent protein to tag lactic acid bacterium strains under development as live vaccine vectors. Appl Environ Microbiol 2000, 66:383-391.KOS B, SUSKOVIC J, VUKOVIC S, SIMPRAGA M, FRECE J, MATOSIC S: Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J Appl Microbiol 2003, 94:981-987.

Referências

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Referências