Universidade Técnica de Lisboa

Instituto Superior Técnico

Engenharia Biomédica2009/2010

Novas formas de produção de vacinas

Paula Antunesnº 64407

João Tiago n.º64408

Motivação e objectivos

Comparação dos vários métodos de produção de vacinas da gripe:

-Produção em ovos-Produção com cultura de células-Produção de hematoglutinina (HA) em células de insecto infectadas com baculovírus.

Produção de hematoglutininas (HA):

-DNA recombinado-BEVS – Baculovirus expression vector systems-Monitorização da produção de rHA

substância derivada, ou quimicamente semelhante, a um agente infeccioso

particular causador de doença

Reconhecida por Sistema

imunitário

como se tivesse realmente sido infectado pelo agente

reage

1ª vez - lenta e inespecífica, memorização

2ª vez – rápida e específica

Princípio base da vacinação

Não contem o agente com capacidade para se multiplicar rapidamente e causar doença,

-dos antecedentes de estimulação do sistema imunitário do indivíduo vacinado

-da genética subjacente às características do sistema imunitário

-do seu estado geral de saúde

Reacção individual a uma vacina depende sempre:

Vivas atenuadas

Inactivadas/inertes

Recombinadas geneticamenteTipos de

vacinas

- Camada mais externa do virusglicoproteína;- ligar o vírus ao receptor da célula hospedeira- Promove a aglutinação de glóbulos vermelhos às células a que se liga por reconhecimento do ácido siálico

- ajudar o vírus a deixar a célula invadida.- reconhece e remove o ácido siálico.- existem 9. N1 e N2 em humanos

Vírus da gripe – Influenza vírus

Este vírus ataca as células das vias respiratórias e é altamente contagioso.

Método dos ovos – 6 a 9 meses

Desvantagens:- Milhões de ovos- Necessidade de seleccionar as estirpes que apresentam alta taxa de crescimento em ovos- Cada ovo produz 2-3 doses de vacina injectável- Contra indicada para pessoas alérgicas a ovos

Seed virus

Métodos de produção de vacinas da gripe

Método por cultura de células – 4 ou 6 semanas a menos que nos ovos

Desvantagem:- Continua a haver uma selecção das estirpes que consigam sobreviver num substrato de células específicas

Meio de crescimento do vírus

• Células derivadas de células tumorais de fígado

• Meio de culturaMultiplicação de virus

• Células multiplicam-se• Vírus adicionado• Faz copias de si mesmo

• Sai para infectar mais células

proteínas superficiais

- solução de crescimento

- fragmentos das células (quimicamente

inactivados) e divididos em partes

-RNA -proteínas estruturais

Removidos

Vantagens:- Os vírus não têm que se adaptar ao crescimento em ovos.- Fácil controlo do suporte de vida.

Método de DNA recombinante

BEVS – Baculovirus expression vector systems

Reservatório onde há células de insecto num

fermento(bioreactor).

recolhidas através de centrifugação

purificada

Baculovirus passa a produzir HA igual ao das produzidas pelo vírus da

gripe.

Método de produção e purificação de HA

Workshop “New Cells

for New Vaccines II”, Wilmington,

2007

Método de DNA recombinante (rDNA)

Ocorre quando fragmentos de código genético de dois ou mais organismos diferentes são ligados in vitro.

Obtém-se DNA recombinante

Encaixa-se o fragmento de DNA de interesse no DNA do baculovírus

Enzimas de restrição (cortam o material genético em pontos definidos e conhecidos)

Plasmídeo (material genético secundário) Plasmídeo

Cromossoma

Quebra por enzima de restrição

Vector recombinante

Fragmento de DNA – gene de HA completo, do vírus da gripe

Plasmídeo – DNA do baculovirus

BEVS – Baculovirus expression vector systems

Infecção de células de insecto com baculovirus recombinante

Produção e purificação de rHA de interesseBaculovirus recombinante

Apto para produzir as HA recombinantes de interesse

Método de DNA recombinante

Alteração duma parte do código genético destas células

McPherson, 2008

Linha de células de insecto

- expressSF+- Fenótipo e características genotipicas únicas- Estáveis até 50 passagens- São infectadas usando uma baixa quantidade de baculovirus-Master Cell Bank (MCB)- Não tumorogénicas

Baculovirus:- Gama de hospedeiros restrita (Lepidopteran –

traças e borboletas)- Encontra-se nos vegetais

verdes (couve)- Seguro para os humanos

Bae et al., 2005

Monitorização do processo de infecção e da expressão de HA

Hemadsorção

Durante a fermentação das células de insecto são contadas as células que têm 3 ou mais GV à superfície.

Análise celular

Amostras recolhidas a cada intervalo de tempo

Analisador de células automático avalia a densidade e viabilidade celular

SRID Single Radial ImunodiffusionDifusão de rHA em gel de agarose. Anel de precipitação com diâmetro proporcional à concentração de HA

Tempo de colheitaDeterminação do

tempo óptimo de colheita do rHA das células de insecto.

Células não infectadas com baculovirus

Células nfectadas com baculovirus que contem genes de HÁ do virus de gripe A/New Caledonia/20/99 (H1N1)

Células não infectadas com baculovirus que não contem genes de HA.

-O rHA é altamente purificado e não contem proteínas de ovo – segura para pessoas alérgicas a ovo

- Produção mais rápida de vacinas

- Não é usado o vírus da gripe vivo. Passos de inactivação desnecessários.

- Não há necessidade de selecção de estirpes. Existe uma correspondência perfeita entre a HA da estirpe e da vacina. - Produção de rHA em células de insecto foi testada clinicamente e obteve resultados de segurança excelente (ICH document).

Vantagens

-Bae K, Choi J, Jang Y, Ahn S, Hur B (2009). Innovative vaccine production technologies: the evolution and value of vaccine production technologies. Arch Pharm Res.

-McPherson, Clifton E (2008). Development of a novel recombinat influenza vaccine in insect cells. Biologicals.

- Wang K, Holtz KM, Anderson K, Chubet R, Mahmoud W, Cox MM (2006). Expression and purification of an influenza hemagglutinin - one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine. Vaccine.

Referências Bibliográficas