Utilização de LC e Utilização de LC e LCMSLCMS ememanálisesanálises de de AlimentosAlimentos

Cláudio Fiuza

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Cláudio FiuzaQuímico de Aplicações

claudio.fiuza@agilent.com

Economia agrícola do Brasil

A segurança alimentar é uma questão importante emtodo o mundo, não só no Brasil.

O Brasil tem um grande e bem desenvolvido setoragrícola, também é um grande exportador de produtosagrícolas, como café, soja, trigo, arroz, milho, cacau,

cana, cítricos, carne, etc.cana, cítricos, carne, etc.

Exporta principalmente para a União Européia e a Ásia-Pacífico

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Comer é seguro?

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O objetivo

•Manter sobre controle os limites de produtos usados durante a produção e industrialização.

Sendo que:

•Os limites estão cada vez menores.

•Número de classes de diferentes compostos.

•Matrizes complexas e variadas.

O que é exigido

•Auto nível de confiança nos resultados.

•Resultados rápidos

•Baixo custo.

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Quem é solicitado?

Solicitado pelos:

•Agricultores

•Exportadores / importadores

•Fabricantes

•Varejistas

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Como controlar os níveis

Cromatografia!!!!!Cromatografia!!!!!

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Cromatografia

Segundo a International Union of Purê andApplied Chemistry (IUPAC), “a cromatografia é uma técnicausada para a separação dos componentes de uma amostra, osquais se distribuem em duas fases, uma estacionária e a outramóvel. A fase estacionária pode ser um sólido, um líquido retidosobre um sólido ou um gel. A fase móvel pode ser líquida ousobre um sólido ou um gel. A fase móvel pode ser líquida ougasosa”.

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Origem

O botânico Russo MikhailSemyonovich Tswett (1872-1920), foi um dos primeiros autilizar a técnica da cromatografia.

Realizou a separação pigmentosde clorofila e gema de ovoutilizando carbonato de cálcio.

Ele foi o primeiro a empregar onome cromatografia

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Princípio

Cromatografia é uma técnica analítica usada para separar componentes de uma mistura para ajudar na identificação e quantificação dos mesmos.

Baseia-se na partição do soluto entre duas fases:

• Fase estacionária• Fase estacionária

• Fase móvel

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Princípio

• Fase estacionária – Coluna contendo uma base especifica para o composto de interesse na qual a amostra passa através.

• Fase móvel – Fase responsável por carregar a • Fase móvel – Fase responsável por carregar a amostra através da fase estacionária, pode ser liquida ou gás.

• O tipo de fase móvel indicará o nome da técnica cromatográfica utilizada.

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Princípio

Amostra é injetada na

coluna

Separação dos componentes da amostra

Amostra sofre

migração

Separação das

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coluna migração das substâncias

Princípio

A migração diferencial resulta da diferença de equilíbrio dos analitos entre as duas fases imiscíveis e é determinada pelos fatores que afetam este equilíbrio:

Composição da fase móvel;

Composição da fase estacionária;Composição da fase estacionária;

Temperatura da separação.

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Técnicas de Cromatografia

CromatografiaCromatografia

Cromatografia Cromatografia GasosaGasosa

Cromatografia Cromatografia LíquidaLíquida

Cromatografia Cromatografia Fluido Super CríticoFluido Super Crítico

Gás Gás -- SólidoSólido Gás Gás -- SólidoSólido

Cromatografia Cromatografia LíquidaLíquida

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Gás Gás -- SólidoSólido Gás Gás -- SólidoSólido

Camada DelgadaCamada Delgada

AdsorçãoAdsorção

ExclusãoExclusão

PapelPapel

PartiçãoPartição

Troca IônicaTroca Iônica

PlanarPlanar ColunaColuna

ClássicaClássicaAlta EficiênciaAlta Eficiência

Mecanismos de Separação

PartiçãoX

m

S Adsorção

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Troca Ionica

Exclusão

S Adsorção

Separação em Partição

Fase Normal Fase Reversa

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Michael W. Dong; MODERN HPLC FOR PRACTICING SCIENTISTS

O cromatografo líquido

•Bomba

•Injetor

•Coluna

•Detector

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Partes do HPLC

Amostrador

Forno

Frascos Fase Móvel

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Bomba

Detector 2

FLR / RIDetector 1

UV / DAD/ RI

Detector 3

ELSD

Escolha do HPLC

O HPLC a ser utilizado esta relacionado com capacidade de detecção dos compostos de interesse.

Sendo assim o produto de analise define a configuração do HPLC que esta baseado no modo de detecção a ser empregado.

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Detectores

Os detectores mais utilizados são:

•Ultravioleta Visível - UV-VIS

•Arranjo de Diodos – DAD ou PDA

•Fluorescência - FL

•Índice de Refração - RI

•Emission Light Scattering – ELSD

•Espectrômetros de Massa - MS

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UltraVioleta-Visível e DAD

Utilizado em compostos que apresentam absorbância na região do ultravioleta visível.

Pode ser utilizado para analise de:

•Vitaminas

•Antibióticos•Antibióticos

•Pesticidas

•Herbicidas

•Micotoxinas

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Vitaminas

Chromatographic conditions :Column: Pursuit XRs C18, 3 µm, 50x4.6 mm Temperature: 25 °C Mobile phase : 870 mL of hexanesulfonic acid sodium salt solution (3.7 mM in water) + 20 mL of glacial acetic acid + 110 mL acetonitrile

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Flow rate: 1.5 mL/minWavelength for UV detection : 280 nm

Micotoxinas

Deoxynivalenol – DON (VOMITOXINA)

A presença desta toxina é tolerável em rações e grãos em níveis de 4 ppb.

Fase movel: ACN:H2O

Detector UV: 220 nm

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Fluorescência

Trabalha com dois comprimentos de ondas, um de excitação outro de emissão.

Muito sensível.

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Como há necessidade de fluorescência da substância émuito comum realizar derivatização da amostra

Utilizado em análise de aflotoxinas

Fluorescência

Antibioticos em salmão:

Ciprofloxacino, Enrofloxacino, Sarafloxacino, Difloxacino

Fase Móvel: 0,9 mL/minTemperatura:60°CVolume injetado:50 uLExcitação(EX): 278nmEmissão (EM):450nm

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Fluorescência

Aflotoxina utilizando KOBRA® CELL*

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* R-Biopharm

RI

Detector universal.

Compara a refração nas duas células.

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RI

Analise de vinho

Column: Hi-Plex Ca (8% crosslinked), 8 µm, 300 x 7.7 mm (PL1170-6810) Mobile Phase: WaterFlow Rate: 0.6 mL/minTemp: 85 ºC Detector:Temp: 85 ºC Detector:Varian 356-LC RI (PL0880-0000)

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ELSD

Detector Universal

Utilizado para carboidratos, aminoácidos, ácidos graxos sem necessidade de derivatizar a amostra

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Carboidratos

Carboidratos em isotônicos

Padrão Amostra

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Aminoácidos

Column: Thermo-Hypersil ODS 5µm, 250x4.6mm Eluent A: WaterEluent B: AcetonitrileGradient: 100% A 5 min hold, 0-40% B in 20 mins

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20 minsFlow Rate: 0.6ml/minInj Vol: 10µl Detector: PL-ELS 2100 (neb=50°C, evap=50°C, gas=1.6 SLM)

Ácidos Graxos

Analise de triglicerídeos em óleo vegetal

Column: C18 5 µm, 250 x 4.6 mmDetection: Varian ELSD (neb=25 °C, evap=50 °C, gas=1.4 SLM)Materials and ReagentsEluent A: ACNEluent B: DCMFlow Rate: 1.0 mL/minInjection Volume: 20 µLGradient: 30-50 % B in 40 min, 50-90 % in 2 min, hold 3 min

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Espectrômetro de Massa

•Muito sensível

•Muito seletivo

•Não precisa derivatizar

•Analises rápidas

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Espectrômetro de Massa

Amplas opções de trabalho pois monitora o composto desejado.

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Ion Trap Single ou triplo quadupolo

Espectrômetro de Massa

Traps:

• Baixo ciclo

• Espectro completo

SIM/SCAN

Quads:• Alto ciclo• SIM/SIM

Espectrômetro de Massa

Analise de:

•Pesticidas

•Antibióticos

•Hormônios

•Micotoxinas

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MS versus MSMS

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Analise de Multi-resíduo por LCMS

Nº RT (min) Peak Name Nº RT (min) Peak Name Nº RT (min) Peak Name

1 3.150 Ciromazina 53 4.945 Simazina 103 6.317 Cloroxuron2 3.242 Metamidofos 54 4.999 Diclormid 104 6.329 Ciproconazol3 3.317 Thiocyclam 55 5.012 Carbaryl 105 6.387 Fenhexamida4 3.349 Aldicarb Sulfoxido 56 5.038 Imazalil 106 6.439 Mepanipyrin5 3.365 Acefato 57 5.127 Mebendazole 107 6.829 Tebufenocida6 3.386 Propamocarb 58 5.148 Ethiofencarb 108 6.838 Metolaclor7 3.412 Aldicarb Sulfona 59 5.181 Monolinuron 109 6.839 Acetoclor8 3.426 Oxamilo 60 5.185 Fluometuron 110 6.883 Fenamifos9 3.451 Cartap 61 5.254 Dodemorf 111 6.923 Flusilazol10 3.486 Nytenpiram 62 5.278 Isoxaflutol 112 7.303 Diflubenzuron11 3.585 Clopiralid 63 5.330 Metalaxil 113 7.665 Neburon12 3.599 Metomilo 64 5.336 Difenoxuron 114 8.227 Aclonifen13 3.600 Thiamethoxam 65 5.338 Clortoluron 115 8.298 Benalaxyl14 3.619 Monocrotofos 66 5.351 Metobromuron 116 8.352 Haloxifop

150 pesticides in 15 minut analysisPesticidas in tomate

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14 3.619 Monocrotofos 66 5.351 Metobromuron 116 8.352 Haloxifop15 3.653 Carbendazima 67 5.351 Isocarbofos 117 8.383 Tebuconazol16 3.752 Ethiofencarb Sulfona 68 5.363 Fenpropidin 118 8.385 Etrimfos17 3.792 Methiocarb Sulfoxido 69 5.399 Lenacilo 119 8.488 TPP18 3.802 Ethiofencarb Sulfoxido 70 5.400 Atrazina 120 8.517 Diazinon19 3.818 Imidacloprid 71 5.415 Desmedifan 121 8.661 Famoxadona20 3.819 Thiabendazol 72 5.420 Isoproturon 122 8.681 Spinosin A21 3.900 Imazapyr 73 5.433 Flazasulfuron 123 8.815 Piraclostrobin22 3.903 Clotianidin 74 5.442 Fenmedifan 124 9.028 Triflumuron23 3.990 Carbofurano 3-OH 75 5.444 Bensultap 125 9.061 Procloraz24 3.995 Methiocarb Sulfona 76 5.464 Triforina 126 9.121 Bitertanol25 4.006 Acetamiprid 77 5.467 Ametryn 127 9.215 Clofentezina26 4.010 Amitraz 78 5.490 Azoxystrobin 128 9.404 Bifenox27 4.113 Dimetoato 79 5.498 2,4-D 129 9.456 Spinosin D28 4.123 Fenuron 80 5.508 Fenpropimorf 130 9.487 Difenoconazol29 4.152 Metamitron 81 5.538 Diuron 131 9.550 Trifloxistrobin30 4.162 Cloridazon 82 5.540 Metidation 132 9.732 Triflumizol31 4.180 Imazamox 83 5.587 Albendazol 133 9.795 Hexaflumuron32 4.191 Thiacloprid 84 5.617 Ethoxyquin 134 9.887 Prosulfocarb33 4.278 Cymoxanil 85 5.622 MCPA 135 9.902 Benfuracarb34 4.279 Quinmerac 86 5.684 Ioxynil 136 10.272 Emamectin35 4.514 Oxfendazol 87 5.702 Spiroxamina 137 10.399 Lufenuron36 4.527 Etririmol 88 5.835 Boscalid 138 10.540 Teflubenzuron37 4.595 Aldicarb 89 5.885 Linuron 139 10.605 Hexythiazox38 4.621 Quinclorac 90 5.887 Metoxyfenocide 140 10.671 Spiromesifen39 4.700 Fluroxipyr 91 5.897 Dimetomorf 141 10.802 Etoxazol40 4.737 Metolcarb 92 5.905 Methiocarb 142 10.945 Flufenoxuron41 4.741 Metil Tiofanato 93 5.946 Terbutilazina 143 11.137 Fenpiroximato42 4.828 Bentazona 94 5.986 Dicloprop (2,4 D-p) 144 11.161 Quinoxyfen43 4.844 Bendiocarb 95 6.007 Promecarb 145 12.875 Fenazaquin44 4.848 Propoxur 96 6.046 Clorbromuron 146 13.903 Ivermectin45 4.856 Monuron 97 6.063 Terbutrina 147 13.905 Fenbutatin Oxido46 4.862 Carbofurano 98 6.088 Paclobutrazol 148 14.066 Carbosulfan47 4.864 Butoxycarboxim 99 6.101 Ditianona 149 14.776 Etofenprox48 4.901 Difenil Sulfona 100 6.122 Malation 150 14.923 Dinocap49 4.902 Thiodicarb 101 6.225 Bromuconazol 151 15.098 Doramectin50 4.940 Bromazil 102 6.287 Diclofluanida

QuEChERS

O método QuEChERS foi desenvolvido por Anastassiades,

Lehotey et al1 at the USDA designiram:

• Quick

• Easy

• Cheap

recuperação de dados de cerca de 400 substâncias activaswww.QuEChERS.com•

• Effective

• Rugged

• Safe

Ref: 1 Anastassiades, M., Lehotay, S.J., Stajnbaher, D., and Schenck, F., Fast and Easy MultiresidueMethod Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and .Dispersive Solid-Phase Extraction. for the Determination of Pesticide Residues in Produce (QuEChERS method) J. AOAC Int., 86 (2003) 412-431.

Further developments by Lehotay et al JAOAC Int., 88 (2005).

QuEChERS

O método

Quick - um único técnico pode preparar extratopara10 GC/ LC em menos de uma hora

Easy - multiplas transferencias e manipulaçõesde amostras são eliminadas

Cheap - mesmo com a moagem criogênica doCheap - mesmo com a moagem criogênica docusto das matérias por amostra é baixo.

Effective - Boa recuperação para um range elevadode pesticidas

Rugged - o método pode ser reproduzido após umsimples traino

Safe - os solventes usados em análise de pesticidaspodem reduzir em mais de 90%

QuEChERS

Antibióticos

Nitrofuranos em carne e mel.

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Antibioticos

Cloramfenicol

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Micotoxinas

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Micotoxinas

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Micotoxinas

Confirmação com dois canais

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Necessidade

Temos que saber o que comemos, pois somos aquilo que comemos!

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Necessidade

Pois assim vamos viver melhor!

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