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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO "STRICTO SENSU" EM

ENGENHARIA QUÍMICA – NÍVEL MESTRADO

USO DE ULTRASSOM NA SÍNTESE DEDIACILGLICEROL VIA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE

ÓLEO DE GIRASSOL

EDUARDO RAIZER

TOLEDO - PR - BRASIL

FEVEREIRO, 2015

EDUARDO RAIZER

USO DE ULTRASSOM NA SÍNTESE DE DIACILGLICEROL VIAHIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE ÓLEO DE GIRASSOL

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa dePós-Graduação em Engenharia Química em cumpri-mento parcial aos requisitos para obtenção do título deMestre em Engenharia Química, área de concentraçãoem Desenvolvimento de Processos.

Orientador: Prof. Dr. Lúcio Cardozo Filho

Coorientador: Prof. Dr. Edson Antônio da Silva

TOLEDO - PR - BRASIL

FEVEREIRO, 2015

Dedico esta dissertação aos meus pais, Elineu e Lídia. Tudo o que conquistei, e tudoque um dia conquistar, devo, em primeiro lugar, a vocês.

ii

Agradecimentos

À minha namorada Franciele por todo amor, apoio e companheirismo.

Aos meus pais, Elineu e Lídia, por todo amor, educação e apoio que me possibilitaramchegar até aqui.

Ao meu melhor amigo Thiago, que cresceu comigo enquanto engenheiro e aindaassim foi capaz de me ensinar lições valiosas que levarei sempre comigo.

Ao meus grandes amigos Bruno, Marlos e Lucas, por todos os momentos de compa-nheirismo e diversão.

Ao meu grande amigo Jamal, que esteve presente e me auxiliou tal como um orien-tador durante todas as etapas do programa.

Aos meus orientadores Edson e Lúcio pela orientação, apoio e paciência.

Ao professor Carlos Eduardo pelo apoio.

À minha amiga Deise pelo apoio, ajuda e amizade.

Aos amigos Canevesi e Gilmar pela ajuda e horas de descontração.

Aos amigos Claudio e Vanessa pelo apoio no laboratório.

À todos os amigos e colegas do LASPEQ.

À LNF Latino Americana pelo fornecimento da enzima utilizada nesse trabalho.

À CAPES pelo apoio financeiro.

iii

Resumo

Óleos e gorduras são alimentos essenciais à dieta humana, porém, o impacto negativo cau-sado por seu consumo excessivo é motivo de grande preocupação no cenário mundial. Óleosricos em diacilglicerol possuem características organolépticas muito semelhantes àquelaspresentes nos óleos comestíveis convencionais, porém, esses óleos não tendem a se acu-mular no organismo, mesmo se consumidos em altas quantidades, tornando-os um granderecurso no combate à obesidade. O óleo de girassol está entre os óleos comestíveis maisconsumidos no mundo e também é, naturalmente, um dos mais saudáveis. Esse trabalho tevecomo objetivo avaliar a influência do ultrassom na hidrólise enzimática do óleo de girassolcom a enzima phospolipase A1 (Lecitase Ultra) e utilizar modelagem matemática para obtersimulações de processos de produção de um óleo rico em diacilglicerol. O ultrassom geraemulsões de água em óleo, aumentando assim a área interfacial do sistema e produzindomaiores taxas de reação em relação aos processos enzimáticos convencionais. A hidróliseparcial do óleo de girassol foi realizada em meio livre de solventes, em períodos de 4 h,em temperaturas variando de 30 a 50 °C, frações enzima/substrato entre 0,6 e 4,0% (m/m) efração água/óleo fixa em 5% (m/m). Para isso, foram desenvolvidos dois planejamentos ex-perimentais fatoriais e um delineamento central composto rotacional. Resultados mostraramcondições ótimas reacionais em 40 °C e 1,7% (m/m). Posteriormente, com os parâmetros óti-mos fixos, a fração água/óleo foi avaliada no intervalo de 2 a 10% (m/m) em um período de12 h para a obtenção de cinéticas reacionais. Através de modelagem matemática aplicada àscinéticas reacionais, demonstrou-se que, entre as frações testadas, a razão água/óleo de 2%é a mais favorável para a produção de diacilglicerol, e a quantidade máxima deste produto éobtida aos 27 minutos de reação.

iv

Abstract

Oils and fats are essential foods to the human diet, nevertheless, the negative impact causedby its overconsumption is of great concern worldwide. Diacylglycerol rich oils have orga-noleptic features very similar to those found in conventional edible oils, however, these oilsdo not tend to accumulate on the body, even when consumed in high quantities, becoming agreat resource in the fight against obesity. Sunflower oil is among the most consumed edibleoils in the world, and also, is naturally one of the healthiest. This study’s goal was to evalu-ate the influence of ultrasound on the enzymatic hydrolysis of sunflower oil with the enzymephospolipase A1 (Lecitase Ultra) and use mathematical modeling to obtain simulations ofproduction processes of a diacylglycerol rich oil. Ultrasound generates emulsions of waterand oil, thus enhancing the system’s interfacial area, and producing higher reaction ratescompared to conventional enzymatic processes. Sunflower oil partial hydrolysis was carriedin a solvent free environment, in 4 hour periods, with temperatures varying from 30 to 50 °C,enzyme/substrate fractions between 0,6 and 4,0% (m/m) and a fixed water/oil fraction of 5%(m/m). with this goal in mind, experimental designs were developed. Results showed optimalreaction conditions on 40 °C and 1,7% (m/m). Subsequently, fixing the optimal parameters,water/oil fraction was evaluated between 2 and 10% (m/m) in a 12 hour period in order toobtain reaction kinetics. Applying a mathematical model to the kinetic curves it was possibleto demonstrate that, for the tested fractions, the 2% water/oil ratio is the most favorable tothe production of diacylglycerol, and the maximum quantity of this product is obtained at 27minutes of reaction time.

v

Lista de abreviações e símbolos

Nomeclatura.

(m/m) Porcentagem mássica.

%Acd Acidez (m/m).

Ci Concentração do componente i.

E Enzima.

F Número fatorial de delineamento.

FOBJ Função objetivo.

K Quantidade de variáveis independentes no planejamento experimental.

ki Constante cinética.

kmi Constante de Michaelis-Menten.

Mi Molaridade, em mol/L, do composto i.

pa Massa da amostra de óleo em g.

PMi Massa molecular, em g/mol, do composto i.

ri Taxa cinética.

Vmaxi Velocidade máxima de reação.

Vol Volume, em mililitros, de solução de hidróxido de sódio.

xi Valor real da variável i.

Xi Valor codificado da variável i.

Y Função resposta.

z Valor real da variável i no ponto central.

Símbolos gregos.

↵ Nível axial codificado.

�0 Coeficiente relativo à intercepção do plano com o eixo de resposta.

�i Coeficientes lineares estimados.

�ii Coeficientes quadráticos estimados.

�ij Coeficiente de interação entre as variáveis.

vi

�Xi Valor do intervalo de variação da variável i.

Acrônimos.

AGL ácidos graxos livres.

DAG Diacilglicerol.

DCCR Delineamento central composto rotacional.

GLI Glicerol.

MAG Monoacilglicerol.

TAG Triacilglicerol.

Subscritos.

calc Calculado.

exp Experimental.

tab Tabelado.

vii

Lista de Figuras

2.1.1 Estrutura e nomenclatura de ácidos graxos livres: (a) 16:0; (b) 20:3 9c12t15c 162.1.2 Estruturas de acilgliceróis: (a) Triacilglicerol; (b) Diacilglicerol; (c) Mo-

noacilglicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.1.3 Representação esquemática de uma molécula de TAG . . . . . . . . . . . 192.1.4 Estruturas gerais de um monoacilglicerol. (a) 2-MAG; (b) 1(3)-MAG . . 202.1.5 Estruturas gerais de um diacilglicerol. (a) 1(3),2-DAG; (b) 1,3-DAG . . . 212.2.1 Consumo mundial de óleos vegetais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.3.1 Ação catalítica das lipases sobre o TAG. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.4.1 Esquema simplificado da reação de hidrólise/esterificação. O termo Hid.

se refere à hidrólise e o termo Est. se refere à esterificação. — Reaçõespossíveis com uso de catalisador não específico; --- Reações espontâneas elentas. Adaptado de (FUREBY et al., 1997) . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4.2 Esquema da reação de glicerólise (Gli.) e suas respectivas migrações acil. 322.5.1 Esquema genérico de um aparelho de ultrassom de sonda . . . . . . . . . 354.2.1 Diagrama de pareto para a produção de AGL, sob um intervalo de 95% de

confiança . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484.2.2 Influência da temperatura e da fração enzima/substrato sobre a acidez . . 494.2.3 Diagrama de pareto para a produção de AGL, sob um intervalo de 95% de

confiança . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514.2.4 Influência da temperatura e da fração enzima/substrato sobre a acidez . . 534.2.5 Diagrama de pareto para a produção de AGL, sob um intervalo de 95% de

confiança . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554.2.6 Distribuição dos resíduos para o modelo quadrático . . . . . . . . . . . . 564.2.7 Influência da temperatura e da fração enzima/substrato sobre a acidez . . 574.3.1 Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato) . . . . 584.3.2 Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato, 2%

magua/moleo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584.3.3 Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato, 5%

magua/moleo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 594.3.4 Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato, 10%

magua/moleo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

viii

Lista de Tabelas

2.1.1 Nomes, símbolos e fórmulas de ácidos graxos (BABICZ, 2009) . . . . . . 172.1.2 Composição percentual média do TAG de alguns óleos e gorduras. L -

linoleico; Ln – Linolênico; O – Oléico; P – Palmítico; S – Saturado; St –Esteárico. Adaptado de (SCRIMGEOUR, 2005) . . . . . . . . . . . . . . 20

2.1.3 Teor de TAG e DAG em diferentes óleos comestíveis (YANAI et al., 2007) 222.2.1 Composição do óleo de girassol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.3.1 Indústrias com destaque na aplicação de lipases (KASAMATSU et al.,

2005; CHENGELIS et al., 2006; BALCÃO et al., 1996) . . . . . . . . . . 283.3.1 Variáveis independentes e dependentes utilizadas no planejamento experi-

mental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.3.2 Níveis de variáveis no planejamento experimental . . . . . . . . . . . . . 383.3.3 Planejamento fatorial 22 com pontos centrais . . . . . . . . . . . . . . . . 393.3.4 Níveis de variáveis no planejamento experimental . . . . . . . . . . . . . 393.3.5 Planejamento fatorial 22 com pontos centrais . . . . . . . . . . . . . . . . 403.3.6 Níveis de variáveis no delineamento central composto rotacional . . . . . 413.3.7 Delineamento central composto rotacional 22 com triplicata no ponto central 414.1.1 Comparação da hidrólise do óleo de girassol com e sem influência de ul-

trassom; 40 ºC; 5% (m/m) água/óleo; 2% (m/m) enzima/substrato; 4 h dereação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.2.1 Planejamento fatorial e acidez experimental . . . . . . . . . . . . . . . . 474.2.2 Efeitos e coeficiente de regressão para a acidez, para um intervalo de con-

fiança de 95% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474.2.3 Análise da variância para o planejamento fatorial, para o AGL . . . . . . 494.2.4 Condições ótimas obtidas pelo modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.5 Planejamento fatorial e acidez experimental . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.6 Efeitos e coeficiente de regressão para a acidez, para um intervalo de con-

fiança de 95% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514.2.7 Análise da variância para o planejamento fatorial, para o AGL . . . . . . 524.2.8 Condições ótimas obtidas pelo modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 534.2.9 Delineamento central composto rotacional . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.2.10 Efeitos e coeficiente de regressão para a acidez, para um intervalo de con-

fiança de 95% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.2.11 Análise da variância para o DCCR, para o AGL . . . . . . . . . . . . . . 564.3.1 Valores dos parâmetros do modelo matemático . . . . . . . . . . . . . . . 60

ix

Sumário

1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.1 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.1.1 Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 Revisão bibliográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.1 Óleos e gorduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.1.1 Ácidos graxos livres (AGL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.1.2 Acilgliceróis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.1.3 Triacilgliceróis (TAGs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.1.4 Monoacilgliceróis (MAG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.1.5 Diacilgliceróis (DAG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.1.5.1 Efeitos causados pelo consumo de DAG . . . . . . . . . . 222.2 Óleo de girassol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.3 Enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.3.1 Lipases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.4 Reações de produção de DAG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.4.1 Hidrólise parcial de TAG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.4.2 Esterificação parcial de glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.4.3 Glicerólise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.5 Irradiação por ultrassom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.5.1 Utilização de ultrassom em reações de produção de DAG . . . . . . 34

3 Materiais e métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.1 Métodos analíticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.1.1 Quantificação de acidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.2 Reações de hidrólise assistidas por ultrassom . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.3 Planejamento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.3.1 Deslocamento do planejamento na direção do ponto ótimo . . . . . 393.3.1.1 Planejamento fatorial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.3.1.2 Delineamento central composto rotacional . . . . . . . . 40

3.4 Obtenção de dados para a construção de cinéticas de reação . . . . . . . . . 413.5 Modelagem matemática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4 Resultados e discussões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464.1 Hidrólise do óleo de girassol assistidas por ultrassom . . . . . . . . . . . . 464.2 Otimização das condições reacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.2.1 Deslocamento do planejamento na direção do ponto ótimo . . . . . 504.2.1.1 Planejamento fatorial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.1.2 Delineamento central composto rotacional . . . . . . . . 53

x

4.3 Modelagem matemática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575 Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

xi

1 Introdução

Nos últimos anos, o impacto negativo causado à saude em decorrência do consumoexcessivo de óleos e gorduras tem recebido muita atenção no cenário mundial, criando umaumento na preocupação com a saúde e com uma melhor qualidade de vida. Em contra-pardida, as atuais tendências nutricionais têm se concentrado cada vez mais em alimentosricos em gorduras, que em conjunto com uma crescente queda na frequência de atividadesfísicas culminam no aumento do número de casos de obesidade e doenças cardiovascula-res (CHEONG et al., 2007). Por essa razão, profissionais e organizações públicas de saúderecomendam a redução do consumo destas dietas (VOLL, 2011).

Entretanto, os óleos e gorduras são, também, importantes fontes de energia e exercempapel fundamental na dieta humana. São fontes de ácidos graxos essenciais como o linoleico,linolênico e araquidônico, fornecem calorias, transortam vitaminas lipossolúveis, como A,D, E e K e além disso contribuem para a palatabilidade dos alimentos (GURR; JAMES,1980; KARLESKIND, 1996). Dessa forma, o consumo de alimentos que contenham umtipo balanceado de gorduras e não acarretem nos malefícios citados acima é recomendado(CHEONG et al., 2007; YANG et al., 2004).

Dentro desse contexto surgiu o interesse em uma alternativa ao mesmo tempo saudá-vel e detentora de características organolépticas semelhantes às encontradas nos óleos con-vencionais. O diacilglicerol (DAG) é um composto natural, produto da hidrólise parcial deóleos e gorduras comestíveis comuns, que não tende a se acumular no organismo e está pre-sente em pequenas quantidades na maiora dos óleos (AWADALLAK, 2012). Além de pos-suir altos níveis de aceitação entre pessoas habituadas ao consumo de comidas gordurosas,esse é um composto capaz de auxiliar no combate de problemas comumente relacionadosao consumo excessivo de gorduras, como por exemplo, a obesidade (KAWASHIMA et al.,2008; TAGUCHI et al., 2000).

O DAG geralmente é obtido através de três métodos principais empregados com autilização de catalisadores, que podem ser químicos ou enzimáticos. A hidrólise parcial deTAG, onde é obtido como um produto intermediário da hidrólise do TAG em AGL e glicerol(PLOU et al., 1996); a esterificação de glicerol, onde é sintetizado através da esterificaçãode AGL e glicerol com remoção simultânea de água (BERGER et al., 1992; LO, 2004; WA-TANABE et al., 2003); e a glicerólise de triacilgliceróis (TAGs), que envolve a remoção dogrupo acil da molécula de TAG e a acilação do MAG formado durante a reação (KRISTEN-SEN et al., 2005; YAMANE et al., 1994).

A utilização de enzimas apresenta diversas vantagens quando comparada ao uso decatalisadores químicos. Entre elas, a utilização de condições reacionais mais brandas, uma

12

1.1. Objetivos

maior especificidade, capaz de gerar menos produtos indesejáveis e uma maior facilidade deseparação do meio. Os catalisadores químicos em geral são pouco versáteis, necessitam dealtas temperaturas, possuem baixa especificidade e, além disso, geralmente fornecem produ-tos de composição química mista ou contaminada, tornando necessária uma etapa posteriorde purificação (CASTRO et al., 2004). No entanto, o custo de enzimas ainda é muito alto,tornando o uso de catalisadores químicos mais interessante em certas situações.

A síntese de DAG, assim como a utilização de enzimas, é um fator que tem sidoimpulsionado pela busca por novas tecnologias, e como as lipases são, em sua maioria, en-zimas que atuam na interface água/óleo, o uso de homogeneizadores ultrassônicos para aampliação da área interfacial entre os compostos tem se mostrado um promissor aliado nomelhoramento de reações com limitações de miscibilidade (AWADALLAK, 2012).

Grande parte das lipases disponíveis no mercado atualmente é vendida imobilizadaem suportes sólidos. Um dos problemas comumente enfretados na utilização conjunta dessaslipases com homogeneizadores ultrassônicos é a desmobilização da enzima, impossibilitandosua recuperação e reutilização. Com o intuito de endereçar esse problema, o desempenho deenzimas líquidas em meio sonificado é uma promissora área de estudo.

Outro objeto de interesse no estudo da produção de DAG é o óleo utilizado. O giras-sol é uma das quatro culturas oleaginosas produtoras de óleo vegetal comestível em utiliza-ção no mundo, destacando-se por ser uma cultura de baixo investimento, fácil mecanização,matéria-prima de entressafra, fácil usinagem, ótimos lucros e com mercado em ascensão(USDA, 2014; AGUIAR et al., 2014). A versatilidade do óleo de girassol é reconhecida in-ternacionalmente devido a características como seu gosto suave, seu desempenho de fritura eseus benefícios à saúde (NSA, 2014). A alta relação de ácidos graxos insaturados em relaçãoa de saturados confere-lhe boas características para consumo humano quanto a prevenção docolesterol (UNGARO, 2000).

1.1 Objetivos

Este trabalho tem como objetivo avaliar a influência do ultrassom na hidrólise enzi-mática do óleo de girassol e utilizar modelagem matemática para obter simulações de pro-cessos de produção de um óleo de girassol rico em DAG

1.1.1 Objetivos específicos

• Propor uma metodologia de uso do ultrassom, para aumentar a interface água/óleoe dessa forma aumentar a velocidade da reação de hidrólise enzimática do óleo degirassol

13

1.1. Objetivos

• Por meio de um planejamento de experimentos verificar a influência das variáveistemperatura e fração enzima/substrato sobre a hidrólise

• Determinar as condições experimentais do uso do ultrassom que maximizem o rendi-mento da reação para o AGL

• Por meio da construção de curvas cinéticas, verificar a influência da variável fraçãoágua/óleo para o rendimento da reação para o DAG

14

2 Revisão bibliográfica

2.1 Óleos e gorduras

Óleos e gorduras são substâncias pertencentes à classe dos lipídeos, podendo ter ori-gem animal e vegetal. Todos os animais produzem gorduras, enquanto centenas de sementese frutos carregam óleos, que podem ainda ser obtidos através de fontes marinhas.

Os óleos e gorduras comestíveis são substâncias insolúveis em água que consistempredominantemente por ésteres de glicerol e ácidos graxos (VOLL, 2011). A diferença entreóleos e gorduras reside exclusivamente em seu estado físico à temperatura ambiente. Por de-finição, as gorduras são sólidas ou pastosas, enquanto os óleos são líquidos. O limite inferiorpara o ponto de fusão de gorduras, definido pelo Conselho Nacional de Normas e Padrõespara alimentos é de 20 ºC (ANVISA, 2005).

As gorduras animais são, em sua maioria, saturadas e sólidas à temperatura ambi-ente. Manteiga, banha, sebo e a gordura da carne são exemplos de gorduras saturadas. Osóleos vegetais, por sua vez, tendem a ser líquidos e predominantemente insaturados. Entre asgorduras insaturadas estão incluídos os óleos de soja, oliva, milho, girassol, entre outros. Osóleos provenientes de peixes também possuem grande quantidade de ácidos graxos insatura-dos. Esses óleos podem ter a elevação do ponto de fusão através do processo de hidrogenação(BABICZ, 2009).

A composição química é o que define as características de uma gordura ou óleo, deter-minando assim a adequação deste ingrediente para vários processos e aplicações (O’BRIEN,2010). Mais de 95% dos óleos e gorduras são constituídos por triacilgliceróis. A fração res-tante é composta predominantemente por monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos li-vres, proteínas, esteróis, vitaminas e tocoferóis (FARIA et al., 2002; HIDALGO; ZAMORA,2003).

A obtenção dos óleos vegetais é realizada através do processo de extração de semen-tes ou frutos. Existem três métodos para a extração de óleos: prensa hidráulica por batelada,prensa mecânica contínua (expeller) e extração por meio de solventes. Além da aplicaçãoindividual, esses métodos também podem ser combinados (PIGHINELLI; PARK, 2008).

O óleo extraído pode conter diversas impurezas, como gomas, ceras e ácidos graxoslivres, os quais podem prejudicar sua qualidade e estabilidade (AWADALLAK, 2012). Nocaso de óleos comestíveis de baixa acidez efetua-se um processo químico de neutralizaçãochamado de refino alcalino. Este processo é bastante simples e pode ser utilizado na maiorparte das matérias-primas (BATISTA et al., 1999), no entanto, apresenta como desvantagema perda de uma parte do óleo neutro e vitaminas (AWADALLAK, 2012).

15

2.1. Óleos e gorduras

2.1.1 Ácidos graxos livres (AGL)

Os ácidos graxos são ácidos carboxilicos cujas cadeias possuem entre 4 e 36 car-bonos (BOBBIO; BOBBIO, 2003). Quando apresentam apenas ligações simples entre oscarbonos, os ácidos graxos são conhecidos como saturados; na presença de ao menos umadupla ligação, são considerados ácidos graxos insaturados, e em cadeias com mais de umadupla ligação, são chamados poliinsaturados. Os ácidos graxos insaturados e poliinsatura-dos podem ser diferenciados entre si através da posição das duplas ligações ao longo dacadeia carbônica. Essas ligações podem ainda gerar isômeros dos tipos cis ou trans. Na na-tureza, a isomeria trans dificilmente é encontrada em ácidos graxos ou em seus derivados(BABICZ, 2009). Os ácidos graxos trans são largamente aceitos como prejudiciais à saúde,e são produzidos durante o processamento dos óleos, como por exemplo na hidrogenação depoliinsaturados para a fabricação de margarinas (NICHOLS; SANDERSON, 2003) e devidoao aquecimento, como no caso de frituras (AWADALLAK, 2012).

Os ácidos graxos normalmente são expressos pelo número correspondente ao com-primento da cadeia e pelo o número de duplas ligações separados por dois pontos. Dessaforma, um ácido graxo saturado com 16 carbonos é abreviado como 16:0, o ácido oléico,com 18 carbonos e uma dupla ligação entre o primeiro e o segundo carbono da cadeia éabreviado como 18:1 (BOBBIO; BOBBIO, 2003). As posições das duplas ligações são re-presentadas por números seguidos da letra inicial do tipo de isomeria. Dessa forma, um ácidograxo de 20 carbonos, com ligação dupla entre o nono e o décimo carbono (sendo o primeiroo carbono carboxílico), entre o décimo segundo e o décimo terceiro e entre o décimo quintoe o décimo sexto, com isomeria cis nas duas primeiras duplas ligações e isomeria trans naúltima dupla ligação, é designado por 20:3 9c12c15t. A Figura 2.1.1 ilustra como essa no-menclatura pode ser aplicada a diferentes ácidos graxos livres. Vale ressaltar que é comumocultar a posição das duplas ligações e o tipo de isomeria, uma vez que o mais usual é quea primeira ou única dupla ligação, normalmente cis se encontra no carbono “9” e as demaisduplas ligações (quando ocorrem) se encontram com um espaçamento constante de 3 carbo-nos (LEHNINGER et al., 1993). Na Tabela 2.1.1 estão relacionados diferentes ácidos graxosencontrados em óleos e gorduras.

OH

O (a)

O

OH

(b)

Figura 2.1.1 – Estrutura e nomenclatura de ácidos graxos livres: (a) 16:0; (b) 20:3 9c12t15c

16


Tabela 2.1.1 – Nomes, símbolos e fórmulas de ácidos graxos (BABICZ, 2009)

Nome comum Nome sistemático Símbolo Fórmula

Butírico Butanóico C4 ou C4:0 C4H8O2

Capróico Hexanóico C6 ou C6:0 C6H12O2

Caprílico Octanóico C8 ou C8:0 C8H16O2

Cáprico Decanóico C10 ou C10:0 C10H20O2

Otusilico cis-4-decenóico C10:1 4c C10H18O2

Caproleico cis-9-decenóico C10:2 9c C10H18O2

Láurico Dodecanóico C12 ou C12:0 C12H24O2

Lauroleico cis-5-lauroleico C12:1 5c C12H22O2

Lindérico cis-4-dodecenóico C12:1 4c C12H22O2

Mirístico Tetradecanóico C14 ou C14:0 C14H28O2

Miristoleico cis-9-tetradecenóico C14:1 9c C14H26O2

Tsuzuico cis-4-tetradecenóico C14:1 4c C14H26O2

Palmítico Hexadecanóico C16 ou C16:0 C16H32O2

Palmitoleico cis-9-hexadecenóico C16:1 9c C16H30O2

Esteárico Octadecanóico C18 ou C18:0 C18H36O2

Petroselínico cis-6-octadecenóico C18:1 6c C18H34O2

Oléico cis-9-octadecenóico C18:1 9c C18H34O2

Eládico trans-9-octadecenóico C18:1 9t C18H34O2

Vaccênico cis-11-octadecenóico C18:1 11c C18H34O2

Linoleico cis,cis-9,12-octadecadienóico C18:2 9c12c C18H32O2

Linolênico cis,cis,cis-9,12,15-octadecatrienóico C18:3 9c12c15c C18H30O2

Araquídico Eicosanóico C20 ou C20:0 C20H40O2

Gadoleico cis-9-eicosenóico C20:1 9c C20H38O2

Gadóico cis-11-eicosenóico C20:1 11c C20H38O2

Araquidônico cis,cis,cis,cis-6,9,12,15-eicostetraenóico C20:4 6c9c12c15c C20H32O2

Behênico Docosanóico C22 ou C22:0 C22H44O2

Cetoleico cis-11-docosenóico C22:1 11c C22H42O2

Erúcico cis-13-docosenóico C22:1 13c C22H42O2

Lignocérico Tetracosanóico C24 ou C24:0 C24H48O2

Nervônico cis-15-tetracosenóico C24:1 15c C24H46O2

17


As propriedades físicas dos ácidos graxos e dos compostos que os contêm estão asso-ciadas ao comprimento e ao grau de instauração da cadeia, bem como seu tipo de isomeria. Asolubilidade em água decresce com o aumento na cadeia em função da sua alta apolaridade.Ácidos graxos de cadeia curta e insaturados tendem a ser líquidos em temperatura ambiente,por outro lado, ácidos graxos com cadeias mais longas e saturados tendem a possuir umponto de fusão menor e, por isso, podem ser sólidos à temperatura ambiente (AKOH; MIN,2008; SCRIMGEOUR, 2005).

2.1.2 Acilgliceróis

Quando os ácidos graxos encontram-se esterificados a uma molécula de glicerol, sãodenominados acilgliceróis. Os acilgliceróis consistem em um, dois ou três ácidos graxosesterificados na molécula de glicerol (Kolakowska and Sikorski 2002), recebendo, respec-tivamente, as denominações monoacilglicerol, diacilglicerol e triacilglicerol. A maior partedos ácidos graxos naturais se encontra sob a forma esterificada, tornando essa classe a maiscomum de lipídeos presente nos alimentos. A 2.1.2 mostra diferentes tipos de acilgliceróis.

OOO

O

O

O (a)

OO O

O

HO

(b)

OH O

O

HO

(c)

Figura 2.1.2 – Estruturas de acilgliceróis: (a) Triacilglicerol; (b) Diacilglicerol; (c) Monoa-cilglicerol

2.1.3 Triacilgliceróis (TAGs)

Os TAGs são ésteres compostos por três móleculas de ácido graxo substituídas nashidroxilas da molécula de glicerol através de uma esterificação. Todo TAG possui a mesmaunidade de glicerina, portanto são os ácidos graxos que contribuem para as diferentes propri-edades da molécula. Os componentes ácidos graxos podem diferir através do comprimentode sua cadeia, do número e da posição de suas duplas ligações e também através da posição

18


do ácidos graxos na molécula de glicerol (O’BRIEN, 2010). A Figura 2.1.3 ilustra a estruturageral de um TAG.

O C

O

R2CH

CH2

O C

O

R1

CH2

O C

O

R3

Figura 2.1.3 – Representação esquemática de uma molécula de TAG

Os TAGs são considerados simples, ou monoácidos, quando R1 = R2 = R3, ou mistos,quando no mínimo um dos ácidos graxos esterificados na molécula de glicerol difere dosdemais (O’BRIEN, 2010). A maioria dos TAGs não possui uma distribuição aleatória deácidos graxos na molécula de glicerol. Nos óleos vegetais os ácidos graxos insaturados sãopredominantes na posição central, sn-2, com maior presença de ácidos graxos saturados nasposições extremas da molécula de glicerol, sn-1 e sn-3. A distribuição de ácidos graxos nasposições sn-1 e sn-3 é similar, porém não idêntica (SCRIMGEOUR, 2005).

O TAG é o principal constituinte dos óleos e gorduras naturais, sendo responsávelpor pelo menos 90% de sua composição. Dessa forma, as propriedades dos óleos e gordurasé comumente associada às propriedades das moléculas de TAG que a compõem. As proprie-dades da molécula de TAG, por sua vez estão associadas às propriedades dos ácidos graxosem sua estrutura. Consequentemente, moléculas de TAG formadas por ácidos graxos de ca-deia longa e sem insaturações tendem a possuir um ponto de fusão menor do que moléculasde TAG formadas por ácidos graxos de cadeia mais curta e com presença de insaturações(SCRIMGEOUR, 2005).

A Tabela 2.1.2 indica a composição média dos triacilgliceróis de alguns óleos. Anomenclatura utilizada consiste na sigla sequencial de cada ácido graxo que compõe o TAGem suas respectivas posições.

O TAG é um composto de valor agregado relativamente baixo. No entanto, por meiode reações de modificação da molécula, compostos de maior valor agregado podem ser obti-dos, como os óleos ricos em MAG e DAG.

19


Tabela 2.1.2 – Composição percentual média do TAG de alguns óleos e gorduras. L - lino-leico; Ln – Linolênico; O – Oléico; P – Palmítico; S – Saturado; St – Esteárico.Adaptado de (SCRIMGEOUR, 2005)

Manteiga deCacau Banha de porco Oliva Soja

POP (18-23) PPSt (2) OOL (11) LnLL (7)

POSt (36-41) StPSt (2) OOO (43) LnLO (5)

StOSt (23-31) PPO (8) POP (3) LLL (15)

StOP (13) POL (4) LLO (16)

POO (5) POO (22) LLS (13)

StOO (6) StOO (5) LOO (8)

POP (18) LOS (12)

StPL (2) OOS (5)

OOO (12)

OPL (7)

2.1.4 Monoacilgliceróis (MAG)

Os MAGs são ésteres de glicerol onde apenas um grupo hidroxila é esterificado comácido graxo, podendo apresentar duas formas isoméricas: o 1(3) MAG, também chamado deisômero a, ocorre quando o éster é substituído em uma das posições externas da molécula deglicerol, enquanto o 2-MAG conhecido como isômero b, ocorre quando o éster é substituídona posição central do glicerol. A Figura 2.1.4 ilustra as duas conformações possíveis que amolécula pode apresentar.

O C

O

RCH

CH2

OH

CH2

OH

(a)

OHCH

CH2

OH

CH2

O C

O

R

(b)

Figura 2.1.4 – Estruturas gerais de um monoacilglicerol. (a) 2-MAG; (b) 1(3)-MAG

20


Os MAGs são surfactantes não iônicos amplamente utilizados nas indústrias alimen-tícia e farmacêutica, com a finalidade de promover a formação e a estabilidade de emulsões(TÜTER; AY, 2000). Assim como os DAGs, possuem o status GRAS (Generally Recog-nized as Safe) atribúido pela FDA (Food and Drugs Administration-USA) (DA SILVA etal., 2002), e diferentemente dos tensoativos (surfactantes) iônicos, não apresentam efeitoscolaterais e irritações à pele quando ingeridos (MACHADO et al., 2000).

2.1.5 Diacilgliceróis (DAG)

Os DAGs são ésteres de glicerol onde dois grupos hidroxila são esterificados comácidos graxos, sendo capazes, assim como os MAGs, de apresentar duas formas isoméricas: o1(3),2-DAG, chamado de isômero a,b, ocorre quando os ésteres são substituídos em uma dasposições externas e na posição central da molécula de glicerol, enquanto o 1,3-DAG (isômeroa, a’), ocorre quando os ésteres são substituídos nas posições externas do glicerol. Estudosindicam que, no equilíbrio, a razão entre 1,3-DAG e 1(3),2-DAG é de aproximadamente 7:3(TADA, 2004). A Figura 2.1.5 ilustra as duas possíveis conformações da molécula:

O C

O

R2CH

CH2

O C

O

R1

CH2

OH

(a)

OHCH

CH2

O C

O

R1

CH2

O C

O

R2

(b)

Figura 2.1.5 – Estruturas gerais de um diacilglicerol. (a) 1(3),2-DAG; (b) 1,3-DAG

O DAG é naturalmente presente em grande parte dos óleos e gorduras, porém emníveis bem inferiores aos de TAG, como mostra a Tabela 2.1.3.

Assim como os MAGs, os DAGs também possuem características anfifílicas, po-dendo ser utilizados como emulsificantes não iônicos na indústria de alimentos. Estudos nu-tricionais nas últimas décadas (KAMPHUIS et al., 2003; KRISTENSEN et al., 2005; MAKIet al., 2002; MURASE et al., 2002; NAGAO et al., 2000; OTA et al., 2007; YAMAMOTOet al., 2006; YUAN et al., 2010) indicam que o consumo de 1,3-DAG em detrimento doconsumo de TAG está associado a diversos benefícios na dieta humana e de animais, con-tribuindo com a perda de massa gorda, redução dos níveis de triglicerídeos e auxílio no

21


combate a doenças como diabetes. Dessa forma, o DAG pode ser usado não apenas comoemulsificante alimentício, em conjunto com o MAG, mas também como um alimento funci-onal substituindo parte do TAG presente nas refeições.

Tabela 2.1.3 – Teor de TAG e DAG em diferentes óleos comestíveis (YANAI et al., 2007)

Óleo TAG (% (m/m)) DAG (% (m/m))

Soja 97,9 1,0

Algodão 87,0 9,5

Palma 93,1 5,8

Milho 95,8 2,8

Girassol 96,0 2,1

Oliva 93,3 5,5

Canola 96,8 0,8

Banha 97,9 1,3

O óleo comercial rico em DAG foi introduzido no mercado japonês em 1999 soba marca “Econa™”. Nos Estados Unidos, foi registrado como “Enova oil™” pela empresaKao Corporation of Japan (KASAMATSU et al., 2005). Produzido a partir da esterificação deácidos graxos provenientes de óleo de soja e canola por reação enzimática, o óleo comercialtem uma composição de no mínimo 80% em massa de DAG, sendo 56% 1,3-DAG e 24% de1(3),2-DAG (BABICZ, 2009).

2.1.5.1 Efeitos causados pelo consumo de DAG

Os estudos nutricionais do efeito do consumo de diacilglicerol vêm ganhando desta-que nas últimas duas décadas, indicando o DAG como potencial alimento para o combate àobesidade e outros problemas associados ao consumo de óleos não saudáveis.

Segundo Nagao et al. (2000), o consumo de óleo rico em DAG está associado comuma redução de gordura total, gordura viceral e godura hepática, suprimindo acúmulos degordura e riscos de doenças associadas à obesdiade. O estudo foi realizado durante um pe-ríodo de 16 semanas, através da definição de dois grupos, um grupo de controle, alimentadocom lipídeos compostos majoritariamente por TAG e um grupo de teste, alimentado comóleo rico em DAG.

Um estudo do efeito do consumo prolongado de óleos com elevada concentração deDAG em dietas com alto consumo de gordura em camundongos foi realizado por Murase etal. (2002). As cobaias foram divididas em dois grupos, um alimentado com excesso de óleorico em TAG e outro alimentado com excesso de óleo rico em DAG. O grupo alimentado com

22

2.2. Óleo de girassol

óleo rico em DAG acumulou significativamente menos gordura corporal durante o períodode oito meses de estudo quando comparado ao grupo de controle. Conclui-se, também, queesses efeitos possivelmente estão associados ao diferente metabolismo do DAG no intestinodelgado.

Em um estudo semelhante, o efeito do consumo de óleos ricos em DAG associadosà dietas com baixo nível energético em humanos foi analisado por Maki et al. (2002). Os re-sultados indicaram uma perda de massa gorda significativamente maior no grupo alimentadocom óleos ricos em DAG em relação ao grupo alimentado com óleos ricos em TAG.

O efeito da oxidação dos óleos ricos em DAG, assim como sua influência no apetitehumano, foram analisados por Kamphuis et al. (2003) e Hibi et al. (2008). Em ambos osexperimentos, notou-se que as cobaias alimentadas com óleos ricos em DAG apresentaramuma oxidação de gorduras muito maior em comparação ao consumo de TAG. Não foramconstatadas diferenças significativas no apetite entre grupo alimentado com DAG e TAG.

Estudos de Yuan et al. (2010) indicam que, apesar de reduzir a gordura corporal,o consumo de óleos ricos em diacilglicerol, mesmo após quatro semanas de estudo, nãoapresentaram efeito significativo na redução do nível de lipídeos na corrente sanguínea.

Os estudos presentes na literatura indicam um enorme potencial de aplicação do DAGem dietas humanas, não apenas como tensoativo não iônico de grau alimentício, mas princi-palmente como alimento funcional capaz de auxiliar no combate da obesidade e dos proble-mas causados em decorrência da obesidade. Esse falto ressalta a necessidade do desenvol-vimento de técnicas que permitam a produção de um óleo rico em DAG, com alto grau depureza a partir de substratos naturais e em tempo reduzido (AWADALLAK, 2012).

2.2 Óleo de girassol

O girassol (Helianthus annuus) é uma planta nativa da América do Norte que podeser encontrada das planícies do Canadá até a América do Sul. Essa é uma cultura que sedesenvolve bem na maioria dos solos agricultáveis, podendo ser cultivada em praticamentetodo o território nacional, desde o Rio Grande do Sul até o hemisfério norte, no Estado de Ro-raima. Atualmente, o setor de industrialização do girassol no país é formado, principalmente,por um pequeno número de médias e grandes indústrias, localizadas, sobretudo, nos estadosde Mato Grosso, Minas Gerais, Goiás, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Rondônia,Paraná, Bahia e Ceará, possuindo como principal destino a indústria de óleo comestível, omercado de pássaros, o de silagem e até mesmo a produção de biodiesel (EMBRAPA, 2014).

O girassol se destaca nacional e internacionalmente por ser uma planta de múltiplosusos e da qual quase tudo se aproveita. O sistema radicular pivotante permite reciclagem denutrientes no solo, as hastes podem ser utilizadas na fabricação de material para isolamentoacústico, as folhas juntamente com as hastes promovem uma boa adubação verde, podendo a

23


massa seca atingir de 3 a 5 toneladas por hectare. Mel pode ser produzido a partir das flores.Estas fecundadas dão origem a frutos aquênios que contêm sementes ricas em óleo (47%) deexcelente qualidade nutricional (GAZZOLA et al., 2012).

No Brasil, mesmo com a expansão desordenada da cultura, a falta de zoneamentoagroclimático e fitossanitário, além da assistência técnica pouco capacitada, a produtividademédia está em torno de 1.500 kg/ha, acima da média mundial de 1.300 kg/ha. Contudo, emcondições de campo e em regiões com mais tradição de cultivo, as produtividades médiasalcançam 2.000 kg/ha. Com base nas produtividades alcançadas e levando em consideraçãoo fato de o girassol ser considerado uma cultura de segunda safra, estima-se que, no futuro, opaís pode tornar-se um dos protagonistas em sua produção, não só em produtividade, comotambém em área cultivada (EMBRAPA, 2014).

Em termos de consumo de óleos enquanto produtos alimentícios, os óleos vegetaissão vistos como a alternativa mais saudável, pois contêm mais ácidos graxos insaturadosque as gorduras animais. Um dos óleos mais utilizados no mundo é o óleo de girassol. Odesenvolvimento dessa oleaginosa em diversas regiões brasileiras ocorre como consequênciade algumas de suas particularidades agronômicas, como

• resistência a fatores abióticos;

• fácil adaptação;

• curto ciclo reprodutivo;

• época de semeadura favorável;

• crescente demanda do setor industrial e comercial.

Essas características em conjunto com os atuais sistemas agrícolas, que utilizam ro-tação restrita de culturas e são caracterizados pelos altos custos de produção e problemasfitossanitários, transformaram a cultura do girassol em uma importante alternativa econô-mica a outras culturas produtoras de grãos (SILVA, 2005).

Devido à sua capacidade de ser produzido na entressafra, após a colheita de culturasde verão, o girassol fornece uma melhor utilização da estrutura de produção, auxiliando naeliminação de áreas ociosas e no aproveitamento de máquinas agrícolas (EMBRAPA, 2014).

Em volume de produção, o girassol ocupa o quarto lugar no mundo como fonte deóleo vegetal comestível, perdendo apenas para a soja, palma e canola, respectivamente, com34,3%, 28,1% e 14,9%. O girassol contribui com 8,8%. Mais de 90% da produção mundialde girassol é destinada à produção de óleo comestível (ROSSI, 1998; USDA, 2014). A Figura2.2.1 representa o consumo mundial das principais culturas oleaginosas, entre 1995 e 2014.

24


Con

sum

o m

undi

al (M

t)

0

45

90

135

180

1995/1996 2005/2006 2006/2007 2007/2008 2008/2009 2009/2010 2010/2011 2011/2012 2012/2013 2013/2014*

Óleo de palma Óleo de soja Óleo de canola Óleo de girassol Outros*resultados preliminares

Figura 2.2.1 – Consumo mundial de óleos vegetais

Em média, a semente de girassol apresenta em sua composição 24% de proteínas,47% de ácidos graxos, 20% de carboidratos totais e 4% de minerais. Para cada toneladade semente de girassol são produzidos 400 kg de óleo, 250 kg de casca e 350 kg de torta,contendo de 45 a 50% de proteína (CASTRO et al., 1996).

O óleo é rico em ácidos graxos essenciais, ou seja, aqueles que não podem ser pro-duzidos pelo organismo humano e devem ser ingeridos através da alimentação. Os ácidosgraxos essenciais contribuem para a redução dos níveis do mau colesterol (LDL) e, dessemodo, auxiliam na prevenção da arteriosclerose e reduzem doenças cardiovasculares comoenfarto do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais e tromboses (MENSINK, 1995). Umdos ácidos graxos essenciais mais importantes é o ácido linoleico (ômega-6), presente emgrandes concentrações no óleo de girassol, cerca de 60% (Tabela 2.2.1). Em conjunto com oóleo de canola, são os dois melhores óleos para consumo humano (GAZZOLA et al., 2012;USDA, 2014).

A Tabela 2.2.1 mostra a quantidade de ácidos graxos presentes no óleo de girassol.

Além de suas aplicações alimentícias, o óleo de girassol também atua como uma al-ternativa atual para a produção de energia, já que pode ser utilizado como matéria-primapara a produção do biodiesel. No Brasil existem diversas pequenas indústrias que estão pro-cessando a oleaginosa para esse fim. No entanto, esse tipo de finalidade é, ainda, bastanteincipiente (LEITE et al., 2005).

25

2.3. Enzimas

Tabela 2.2.1 – Composição do óleo de girassol

Ácidos graxos EstruturaFração mássica (%)

a b c

C < 14 < 0,4 < 0,3 0,0

Ácido Mirístico C14:0 < 0,5 < 0,2 0,1

Ácido Palmítico C16:0 3,0 - 10,0 2,0 - 7,6 5.7

Ácido Palmitoleico C16:1 < 1,0 0,0 - 0,3 0,0

Ácido Esteárico C18:0 1,0 - 10,0 1,0 - 6,5 4,8

Ácido Oleico (Ômega 9) C18:1 14,0 - 35,0 14,0 - 39,4 15,3

Ácido Linoleico (Ômega 6) C18:2 55,0 - 75,0 48,3 - 74,0 71,2

Ácido Linolênico (Ômega 3) C18:3 < 0,3 < 0,3 0,5

Ácido Araquídico C20:0 < 1,5 0,1 - 0,5 0.3

Ácido Eicosenoico C20:1 < 0,5 < 0,3 0,2

Ácido Behênico C22:0 < 1,0 0,3 - 1,5 1,2

Ácido Erúcico C22:1 < 0,5 < 0,3 0,0

Ácido Lignocérico C24:0 < 0,5 < 0,5 0,3

Ácido Nervônico C24:1 < 0,5 0,0 0,4

a. ANVISA (1999)

b. ALIMENTARIUS (2001)

c. ZAMBIAZI et al. (2007)

2.3 Enzimas

As enzimas são catalisadores formados por longas cadeias de aminoácidos, sendo, emgeral, as proteínas responsáveis por catalisar as reações que ocorrem nos sistemas biológicos.

As enzimas são bastante versáteis e possuem um número de propriedades que astornam altamente requisitadas como catalisadores e as diferem dos catalisadores não enzi-máticos. Dentre tais propriedades destacam-se: seletividade, atuação em condições brandasde temperatura e em pressão atmosférica (PATEL, 2002).

Devido à sua alta especificidade, a utilização de enzimas minimiza a formação deprodutos indesejados, tornando seu uso muito interessante do ponto de vista industrial, umavez que catalisadores inorgânicos como ácidos, bases, óxidos e metais, além de gerarem sub-produtos indesejáveis ainda podem apresentar grande dificuldade de separação dos produtosapós a reação (BON et al., 1999).

26

2.3. Enzimas

O aumento da preocupação com o meio ambiente, com a qualidade dos produtose com o custo em energia torna o uso de catalisadores enzimáticos mais atraente a váriossetores industriais que buscam tecnologias “limpas”, mais sofisticadas e com menor custo(MATOS, 2010).

A nomenclatura das enzimas se dá pela adição do sufixo “ase” ao nome do seu subs-trato, ou à palavra ou frase que descreve sua atividade. Dessa forma, lipases são enzimas queatuam sobre gorduras (LEHNINGER et al., 1993).

2.3.1 Lipases

As lipases são classificadas pelo Comitê de Nomenclaturas da União Internacionalde Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB, 2014) como éster hidrolases (E.C. 3.1.1).São capazes de catalisar reações de hidrólise e síntese de grupos ésteres de diversos compos-tos. As lipases são amplamente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de mi-crorganismos naturais ou geneticamente modificados e também a partir de fontes animais evegetais (BABICZ, 2009). A principal forma de produção de lipases se dá através de culturasde microrganismos, pois esses são os processos que apresentam maior facilidade de controle,maior capacidade produtiva e custo de obtenção reduzido (ROSADO; MONTEIRO, 2001;YASUKAWA; KATSURAGI, 2004).

As áreas nas quais a aplicação das lipases vêm tendo maior destaque estão descritasna Tabela 2.3.1.

Uma das principais características das lipases é a capacidade de atuar apenas quandoadsorvidas em uma interface água/óleo, ou seja, em meio a ésteres emulsionados, o queas diferencia das esterases, outra classe de enzimas capazes de atuar nas ligações ésteres(SHARMA et al., 2001). Na ausência dessas interfaces, alguns elementos de sua estruturasecundária, chamados de “lid” cobrem seus sítios ativos impedindo o contato com outrossubstratos. Quando em contato com a interface água/óleo, essas estruturas “se abrem” ex-pondo sua parte hidrofóbica que pode, então, interagir com a interface, conferindo funciona-lidade à enzima (BASTIDA et al., 1998).

No caso de reações de modificação de lipídeos, as lipases diminuem a energia deligação entre o carbono ligado ao oxigênio (por simples ligação) nos ésteres. Essa posiçãose torna reativa (MARANGONI; ROUSSEAU, 1995), permitindo a hidrólise dos ésterescarboxílicos em meio aquoso ou a reação reversa de esterificação dos ácidos carboxílicosem meio a solventes orgânicos e ainda a esterificação cruzada (transesterificação) em meioalcoólico (REETZ, 2002). A Figura 2.3.1 ilustra a reação de hidrólise do triacilglicerol e areação reversa de esterificação.

27

2.4. Reações de produção de DAG

Tabela 2.3.1 – Indústrias com destaque na aplicação de lipases (KASAMATSU et al., 2005;CHENGELIS et al., 2006; BALCÃO et al., 1996)

Área Aplicação

Farmacêutica

Síntese de intermediários de fár-macos (ex.: ibuprofeno e na-proxeno, fármacos com atividadeanti-inflamatória)

Resolução de misturas racêmicas(ex.: síntese de atenolol, fármacoanti-hipertensivo)

Alimentícia Síntese de aromas (ex.: maturaçãode queijos)

Síntese de edulcorantes (ex.: as-partame)

Produtos delimpeza

Remoção de manchas de gordurasdos tecidos

Agroquímica Síntese de inseticidas e pesticidas

Tratamentode efluentes

Redução do teor de gorduras emefluentes da indústria de laticínios

Oleoquímica Hidrólise e interesterificação deóleos e gorduras

O C

O

R2CH

CH2

O C

O

R1

CH2

O C

O

R3

TAG

+ 3 H2OLipase OHHC

H2C

OH

H2C

OH

Glicerol

+ 3

OH

O

Ácido Graxo

Figura 2.3.1 – Ação catalítica das lipases sobre o TAG.

2.4 Reações de produção de DAG

2.4.1 Hidrólise parcial de TAG

A hidrólise completa do TAG é composta por complexas reações reversíveis e temcomo produtos finais o glicerol e AGL, e como intermediários DAG e MAG. Diversos fatoresdefinem se a reação será completa ou não, como o tempo de reação e a disponibilidadede reagentes para a conversão completa (AWADALLAK, 2012). A Figura 2.4.1 mostra asetapas da reação de hidrólise completa do triacilglicerol, assim como a reação reversa deesterificação completa do glicerol.

A reação inicia com a hidrólise do TAG na posição sn-1(3) ou na posição sn-2, ori-ginando o 1(3),2-DAG ou o 1,3-DAG, respectivamente. As moléculas de DAG podem sofrer

28


ROCO

OCO R

OCO R

Hid.Est. ROCO

OH

OCO R

MigraçãoA

cil

OH

OCO R

OCO R

Hid.Est. ROCO

OH

OH

MigraçãoA

cil

OH

OH

OCO R

Hid.Est. OH

OH

OH

Hid.Est.

Hid.Est.

Hid.Est.

Hid.

Est.

Figura 2.4.1 – Esquema simplificado da reação de hidrólise/esterificação. O termo Hid. serefere à hidrólise e o termo Est. se refere à esterificação. — Reações possí-veis com uso de catalisador não específico; --- Reações espontâneas e lentas.Adaptado de (FUREBY et al., 1997)

uma reação interna de migração do grupo acila para outra posição não esterificada, essa rea-ção é chamada de migração acil e pode ocorrer também com a molécula de MAG. As reaçõesde migração acil estão representadas por linhas tracejadas na Figura 2.4.1.

Ao levar em consideração a regioespecificidade das lipases em relação aos substra-tos acilgliceróis, é possível dividi-las em dois grupos distindos. As enzimas do primeirogrupo não apresentam regioespecificidade alguma e, portanto, são capazes de catalisar rea-ções em qualquer carbono da molécula de glicerol, enquanto as lipases do segundo grupoatuam exclusivamente nas posições sn-1 e sn-3, os carbonos externos da molécula de gli-cerol. A regioespecificidade é quase absoluta entre as lipases e é causada pela dificuldadede acesso ao carbono sn-2. Esse tipo de enzima é dependente da migração acil para promo-ver a hidrólise completa, pois é incapaz de hidrolisar o 2-MAG. Essa característica pode seraproveitada para dificultar o avanço da reação completa e contribuir para a obtenção de con-centrações maiores de DAG ou MAG através da supressão da migração acil (HOLMBERG;OSTERBERG, 1988). As reações possíveis por meio da catálise através da utilização de en-zimas específicas estão representadas pelas setas pretas na Figura 2.4.1. As setas vermelhasindicam as reações adicionais possíveis com o uso de catalisadores não específico.

29


Em geral, a produção de DAG através da hidrólise parcial de TAG não é capaz deatingir concentrações elevadas. No entanto, essa reação apresenta como vantagem o uso deapenas substratos naturais: óleo e água (AWADALLAK, 2012).

A produção de DAG via hidrólise enzimática utilizando oleína de palma como subs-trato foi investigada por Cheong et al. (2007). Foram avaliados o tempo de reação na forma-ção de DAG (6 – 16h), a influência da concentração de água (30 – 70% em relação à massa deenzima), a carga de enzima (5 – 15% em relação à massa de óleo) e a temperatura da reação(45 – 85 ºC). Foi utilizada a enzima comercial Lipozyme RM IM e a produção de DAG foiotimizada com base na metodologia da superfície de resposta. Um óleo enriquecido contento32% (m/m) foi obtido em 12h de reação a 65 °C, 10% (m/m) de carga de enzima e 50 % deágua (em relação à massa de enzima). Os autores foram também capazes de aumentar essaconcentração para 60% (m/m) de DAG através de um processo de destilação à vácuo.

A hidrólise parcial do óleo de soja catalisado pela enzima comercial phospolipaseA1 (Lecitase Ultra) em reator batelada, com o objetivo de produzir DAG, foi avaliada por(WANG et al., 2010). Foram testados o tempo de reação na formação de DAG (0,5 – 8h),o pH da reação (0,7 - 12,5) e a temperatura da reação (40 – 50 ºC). Os experimentos foramrealizados sob agitação mecânica (150 rpm), com fração água/óleo de 40% (m/m) e 0,1 mLde enzima. Os valores ótimos de tempo de reação, pH e temperatura na hidrólise parcial doóleo de soja para a produção de DAG obtidos no estudo foram de 8h, 6,8 e 40 ºC, respecti-vamente. Nessas condições foi possível obter 26,51 % de DAG em relação à massa de óleototal, com uma proporção de duas moléculas de 1,3-DAG para cada três de 1,2-DAG.

A produção de DAG por meio da hidrólise parcial do óleo de palma utilizando a en-zima comercial PS Amano IM como catalisador foi avaliada por Matos et al. (2011) em reatorirradiado por microondas e em reator contínuo recheado. O uso de microondas mostrou-sepromissor, possibilitando a obtenção de um óleo com 30% (m/m) de DAG em apenas 5 mi-nutos, porém de acordo com os próprios autores essa técnica apresenta grandes dificuldadesde aplicação em maior escala. O uso do sistema contínuo permitiu a produção de um óleocontendo 48% de DAG à um fluxo de 0,5 ml de substrato por minuto. O composição dosubstrato consistiu em óleo, água e solvente (hexano ou ciclo-hexano).

Voll (2011) avaliou a produção de diacilglicerol em reator batelada pela hidróliseenzimática do óleo de palma catalisado pela enzima comercial Lipozyme RM IM. A hidróliseparcial do óleo de palma foi realizada em meio livre de solvente, a 55°C, 400 rpm. Foramavaliados a concentração de enzima, a concentração inicial de água e o tempo de reação. Asmelhores condições preditas pelo modelo cinético foram de 2,87% (m/m) enzima/substrato,2,10% (m/m) água/óleo e 72h de reação. Para essas condições, foi possível obter óleo depalma com 35,91% (m/m) em DAG. As simulações de extração líquido-líquido indicaram apossibilidade de obtenção de um óleo de palma com 87,64% (m/m) em DAG e 0,53% (m/m)de acidez.

30


Awadallak (2012) estudou a influência exercida por ultrassom de sonda na produçãode diacilglicerol pela hidrólise enzimática do óleo de palma catalisado pela enzima comer-cial Lipozyme RM IM. No estudo, foram utilizadas duas formas diferentes de aplicação:acompanhando todo o período reacional e gerando emulsões em uma etapa pré-reacional.O autor constatou que o uso do ultrassom de sonda durante todo o período de reação emsistema aberto causou diversos empecilhos indesejáveis, como a desativação da enzima e aevaporação de água do meio reacional, resultando em taxas de reação muito baixas, comvalores próximos de zero após seis horas de reação enquanto o uso do ultrassom apenas paraa formação de emulsões em uma etapa pré-reacional melhorou significativamente as taxasde hidrólise no início da reação. As condições reacionais ótimas foram obtidas em 24h dereação, com substrato pré-emulsificado com 11,2% (m/m) de água durante 1,2 min, a 200 We à 55 ºC, com carga enzimática de 1,36% (m/m) enzima/substrato. Para essas condições, foipossível obter um óleo concentrado com 36,40% (m/m) de DAG.

Os óleos enriquecidos são comercializados com um mínimo de 85% (m/m) de DAG(YASUKAWA; KATSURAGI, 2004). Tendo em vista que a hidrólise parcial dificilmenteultrapassa concentrações de 40% (m/m), é possível afirmar que a utilização de apenas essatécnica não é suficiente para a produção de DAG. No entanto, a hidrólise é uma forma di-reta de produção, que elimina a necessidade de reações prévias, como aquelas necessáriasna esterificação e na glicerólise. A utilização de técnicas de purificação, como a destilaçãomolecular ou a extração líquido-líquido permitem alcançar concentrações que atendam asespecificações comerciais, tornando a hidrólise parcial um potencial objeto de estudo para aprodução de óleos enriquecidos em DAG.

2.4.2 Esterificação parcial de glicerol

A esterificação do glicerol com ácidos graxos é reação inversa à hidrólise. A reação,mostrada anteriormente na Figura 2.4.1, ocorre em três etapas sequenciais, onde em cadaetapa uma molécula de ácido graxo é adicionada à molécula de glicerol, liberando uma mo-lécula de água e formando, sequencialmente, MAG, DAG e TAG. O substrato da reação écomposto por glicerol e doadores acil (geralmente AGLs). Esses substratos são altamenteimiscíveis entre si, o que prejudica a velocidade da reação (AWADALLAK, 2012).

Segundo Voll (2011), o uso de enzimas 1,3 regioespecíficas torna possível a produçãode grandes quantidades de DAG através de esterificação, uma vez que essas enzimas não sãocapazes de converter o 1,3-DAG em TAG. Essa reação ainda pode ser favorecia pela remoçãoda água formada em cada etapa, tornando a reação irreversível e deslocando o seu equilíbriopara uma maior formação de MAG e DAG (FREITAS et al., 2008).

A enzima Lipozyme RM IM foi utilizada por Watanabe et al. (2005) para a produçãode DAG através da esterificação de ácidos graxos provenientes de óleo de soja em um reatorde recheio com recirculação. Para deslocar e o equilíbrio da reação e favorecer a produção

31


de DAG, os autores utilizaram uma câmara com alto vácuo para promover uma remoçãoconstante da água formada durante a esterificação. Com um tempo reacional de aproxima-damente de 3 horas, utilizando uma concentração de 5% (m/m) de enzima, com razão 1:2molar de ácido graxo para glicerol, temperatura de 50°C e pressão de 0,4 kPa, foi obtida umafração de 70% (m/m).

??) produziram um óleo concentrado de DAG com 74,8% (m/m) a partir da esterifi-cação de ácidos graxos com glicerol. Nesse estudo, os autores utilizaram a enzima comercialphospolipase A1 (Lecitase Ultra) com um tempo reacional de 6 horas. Através de destilaçãomolecular a 170 °C, os autores obtiveram um óleo enriquecido com 83,1% (m/m) de DAG,com um rendimento de 42,7% na destilação.

2.4.3 Glicerólise

A glicerólise consiste basicamente em uma reação de esterificação onde substratoda reação é formando por glicerol e TAG. Por meio de uma reação de dupla troca, um dosgrupamentos acila do TAG une-se à molécula de glicerol dando origem ambos, um DAG eum MAG. A Figura 2.4.3 sintetiza a reação de glicerólise.

ROCO

OCO R

OCO R

+ OH

OH

OH

Gli.ROCO

OH

OCO R

+OH

OCO R

OH

Gli.

OH

OCO R

OCO R

+ROCO

OH

OH

MigraçãoA

cil

MigraçãoA

cil

Figura 2.4.2 – Esquema da reação de glicerólise (Gli.) e suas respectivas migrações acil.

Teoricamente, a glicerólise catalisada por lipases é mais vantajosa do que os outrosmecanismos de obtenção de DAG, pois resulta na conversão total dos três ácidos graxos doTAG (FREITAS et al., 2008).

32

2.5. Irradiação por ultrassom

O uso de surfactantes como aditivos na reação de glicerólise enzimática do óleo depeixe utilizando a enzima Novozym 435 foi estudado por Camino Feltes et al. (2012). Foramavaliados dois surfactantes alimentícios, um sintético (Tween) e um natural (lecitina de soja).Os autores demonstraram preocupação especial com o fato da enzima atuar também sobreos surfactantes, pois estes possuem ésteres em sua composição. Os resultados sugerem queseu uso deve ser bem avaliado pois as modificações enzimáticas sobre o surfactante podemgerar complicações posteriores em relação à purificação.

Hu et al. (2013) compararam a glicerólise enzimática de TAG com a esterificaçãoparcial de ácidos graxos, tendo como objetivo a produção de DAG e a conversão do doadoracil. Em relação à conversão, a esterificação se mostrou superior em relação à glicerólise.As conversões obtidas foram de 94,42% e 74,21%, respectivamente. No entanto, através daglicerólise foi possível obter uma maior conversão de DAG + MAG.

2.5 Irradiação por ultrassom

Um importante fator a ser levado em consideração nas reações de modificação de li-pídeos é a baixa miscibilidade dos compostos que formam o substrato. Uma das alternativaspara contornar esse problema é a utilização de surfactantes, porém seu uso pode gerar sub-produtos e complicações de separação (Camino Feltes et al., 2012). Outras técnicas propostastambém incluem a adição de novos reagentes, criando a necessidade de processos adicionaisde separação e possíveis reações paralelas. O problema comum de todas essas técnicas cul-minou na busca por uma forma efetiva de mistura, capaz de emulsionar os substratos, sem aadição de novos compostos à reação.

Emulsão é a mistura entre dois líquidos imiscíveis em que um deles, chamado defase dispersa, encontra-se na forma de finos glóbulos no seio do outro líquido, chamaodode fase contínua, formando uma mistura estável. Uma emulsão pode ser obtida por diversasformas, como forte agitação mecânica ou homogeinização de alta pressão. O ultrassom éuma tecnologia muito promissora, que além de possuir um baixo consumo energético, for-nece um mecanismo muito mais eficiente de agitação e mistura se comparado às alternativasanteriores (YACHMENEV et al., 2004; CUCHEVAL; CHOW, 2008). Os equipamentos deultrassom ainda são capazes iniciar várias reações através da formação de íons livres (ra-dicais), acelerar reações químicas através da facilitação da mistura dos reagentes, aumentartaxas de difusão, melhorar reações de polimerização ou despolimerização pela dispersão deagregados ou quebra de ligações, auxiliar a extração de substâncias como enzimas de células,eliminar de vírus de tecidos, quebrar partículas suscetíveis, incluindo microrganismos; entremuitas outras (KULDILOKE, 2002).

O ultrassom pode ser de baixa intensidade (alta frequência) ou alta intensidade (baixafrequência). Aparelhos de baixa intensidade são geralmente utilizados para análises não des-

33


trutivas, como a observação de órgãos por ultrassonografia ou a localização de falhas emmetais, enquanto os de alta intensidade são usados para a promoção de mistura, dispersãoe emulsão (AWADALLAK, 2012). Quando um líquido está sob a influência de ultrassomde alta intensidade, as ondas sonoras se propagam no meio, alternadamente, resultando emintervalos de alta pressão e baixa pressão. Durante um intervalo de baixa pressão, pequenasbolhas de vácuo são criadas no líquido. Quando estas bolhas atingem um volume que nãopodem mais absorver energia, elas colapsam violentamente. Esse fenômeno é chamado decavitação. Quando bolhas de cavitação microscópicas colidem na superfície do substrato,elas geram poderosas ondas de choque que causam agitação e mistura efetivas na camadade líquido. Além disso, o efeito da cavitação é centenas de vezes mais forte em sistemasheterogêneos quando comparados a sistemas homogêneos (YACHMENEV et al., 2004). Acavitação é capaz de produzir condições locais extremas, como aquecimento em torno de5000 K, pressões de mais de 1000 atm, enormes taxas de aquecimento e resfriamento (> 109K/s) e fluxos maiores que 400 km/h (SUSLICK; SKRABALAK, 2008).

Os aparelhos para a geração de cavitação através de ondas ultrassônicas são com-postos basicamente por um gerador de frequência, responsável por transformar a frequênciada rede elétrica (50 - 60 Hz) na frequência desejada para o aparelho, um transdutor pie-zoelétrico, responsável por transformar a energia elétrica em energia mecânica e um meiode propagação, em geral chapas metálicas para banhos ultrassônicos e sonotrodos para son-das ultrassônicas (BABICZ, 2009). A Figura 2.5.1 representa o esquema de um aparelho deultrassom.

Comercialmente o emulsificador ultrassônico se apresenta em duas formas: o ultras-som de banho e o ultrassom de sonda. No primeiro caso, o equipamento é composto poruma cuba preenchida de água com o transdutor (equipamento que converte a oscilação elé-trica em oscilação acústica) localizado geralmente na parte inferior da cuba. Nesse tipo deultrassom um recipiente contendo o substrato é imerso na cuba e parte das ondas acústicasque percorrem o meio líquido é absorvida pelo substrato. No segundo caso, o equipamentoé composto por uma haste (chamada de sonda, probe ou ponteira) com o transdutor locali-zado em uma de suas extremidades. A extremidade livre da haste é inserida no substrato etransmite a energia de forma concentrada (AWADALLAK, 2012). O ultrassom de banho écapaz de transmitir a energia de forma mais homogênea, porém em menor intensidade, poisgrande parte é dispersa no meio condutor, enquanto o ultrassom de sonda transmite a energiaconcentrada diretamente no substrato.

2.5.1 Utilização de ultrassom em reações de produção de DAG

Devido ao fato de a natureza dos efeitos de sonificação em processos heterogêneosjá ter sido alvo de muitos estudos e tornado-se um assunto bem compreendido, a utilizaçãode ultrassom em próximos químicos tem se tornado vastamente difundida tanto em escala

34


Figura 2.5.1 – Esquema genérico de um aparelho de ultrassom de sonda

laboratorial quanto em escala industrial (TUULMETS; SALMAR, 2001).

Estudos comparando a hidrólise do óleo de soja em sistemas livres de solvente embanho agitado e em banho ultrassônico foram realizados por Liu et al. (2008). O uso deultrassom foi capaz de aumentar muito as taxas iniciais de hidrólise em relação ao banhoagitado (94, 64, 58, 41 e 34% para 1, 2, 3, 4 e 5 h, respectivamente). No entanto, o equilíbrioda reação foi pouco afetado. Esse fato pode ser justificado pelo momento em que as emulsõessão formadas, ocasionando maiores taxas reacionais: com o uso de ultrassom, as emulsõesformam-se logo no início do experimento, enquanto no sistema agitado, a formação dasemulsões é iniciada com a formação de DAG e MAG, que atuam como agentes surfactantes.

O efeito do ultrassom na hidrólise enzimática do óleo de soja em meio livre de sol-ventes foi avaliado por ??). As reações foram realizadas, inicialmente, através de agitaçãomecânica e, em uma segunda etapa, o uso simultâneo de ultrassom foi adicionado. A adiçãodo ultrassom diminuiu o tempo reacional e também contribuiu para a formação de maioresquantidades de DAG. No estudo, foram utilizadas as enzimas Novozyme 435, Lipozyme TLIM e Lipozyme RM IM. Utilizando 2% (m/m) da enzima Lipozyme TL IM e 6 horas dereação foi possível obter um óleo com concentração de 30% de DAG. Com o ultrassom eapenas 1% (m/m) de enzima, foi possível obter um óleo com 40 % de DAG em apenas 1,5

35


h. Os resultados, no entanto, apontam um constante decréscimo na atividade enzimática emfunção do número de reutilizações.

A produção de MAG e DAG por meio de reação de glicerólise com a enzima Li-pozyme 435 em meio a diversos surfactantes foi estudada por Fiametti et al. (2011). Nesseestudo foi utilizado o uso de irradiação ultrassônica por meio de um sonotrôdo, sem agi-tação, e também o uso de agitação mecânica (600 rpm) em meio a banho ultrassônico. Osresultados mostraram que para ambos métodos foi possível obter uma conversão satisfatória(>50% (m/m)) em MAG + DAG, em tempos relativamente curtos (< 2h).

O ultrassom na hidrólise parcial do óleo de palma catalisado pela enzima comerciallipozyme RM IM em reator batelada foi avaliado por Awadallak et al. (2013) através dedois métodos distintos. O primeiro método consistiu da exposição do substrato a irradiaçãoultrassônica por meio de um sonotrodo durante todo o tempo reacional. Devido à dispersãoconcentrada de energia, a enzima foi completamente desativada. Por esse motivo, no segundométodo, a reação foi realizada em duas etapas. Inicialmente foi realizada a emulsificação dosistema água/óleo sem a presença de enzima, e em seguida, a reação foi feita sem o uso deultrassom, com a utilização de agitação magnética. A emulsificação do substrato com o usode ultrassom durante períodos de 1,2 min possibilitou a produção de um óleo com 34,17%(m/m) de DAG. Semo ultrassom, a mesma conversão necessitou de mais de 70 h para seratingida.

Com base na revisão apresentada acerca da produção enzimática de DAG, verificou-se a ausência de estudos do uso de ultrassom na produção de DAG com a utilização deenzimas líquidas. Além disso, nenhum estudo sobre a produção de DAG a partir do óleo degirassol foi encontrado.

36

3 Materiais e métodos

O substrato da reação de hidrólise utilizado neste trabalho foi o óleo de girassol Su-avit. A lipase comercial Lecitase Ultra, utilizada como catalisador, foi gentilmente cedidapor LNF Latino Americana. Uma solução de fenolftaleína (Synth) foi utilizada como indi-cador para medidas de acidez do óleo. Etanol absoluto (Chemco) foi utilizado no processode medição. Hidróxido de sódio (Synth) foi utilizado na determinação de acidez.

3.1 Métodos analíticos

3.1.1 Quantificação de acidez

A determinação da quantidade de AGL presentes no óleo foi realizada através detitulação com solução de hidróxido de sódio. Aproximadamente 1 g de óleo e duas gotasde solução de fenolftaleína foram diluídos em 15 ml de uma solução 1:1 Etanol/Éter. Estasolução foi titulada com uma solução de hidróxido de sódio 0,05 M sob agitação vigorosaaté a ocorrência de uma mudança súbita de de coloração, da cor branca para a cor rosa. Aacidez do óleo foi calculada de acordo com a seguinte relação:

Acidez (m/m) = 100 · V ol ·MNaOH · PMAGL

pa(3.1)

A massa molecular dos AGL foi calculada como a média ponderada pela fração molardas massas moleculares dos ácidos graxos constituintes do óleo de girassol.

3.2 Reações de hidrólise assistidas por ultrassom

As reações de hidrólise enzimática do óleo de girassol assistidas por ultrassom foramconduzidas em frascos de vidro (50 mL). As quantidades de reagentes utilizados foram de 10g de óleo, 0,5 g de água deionizada e uma massa variável de enzima, determinada de acordocom o planejamento experimental. As amostras foram imersas no aparelho de ultrassom(Eco-sonics Q5.9/37A), configurado em potência máxima (154 W) e a reação teve início(reações realizadas sem o uso de ultrassom foram conduzidas com agitação mecânica a 150rpm). Ao término de cada tempo de reação (4 h) os frascos foram removidos do aparelhoe aquecidos até 100 �C para interromper a reação e diminuir a viscosidade do meio e entãoa amostra foi centrifugada a 3 g (5 min) com o intuito de separar a face aquosa contendo aenzima e o óleo. Com o objetivo de comparar o efeito do ultrassom, as condições do pontocentral do planejamento experimental também foram reproduzidas em reações sem o uso doultrassom, utilizando agitação mecânica.

37

3.3. Planejamento experimental

3.3 Planejamento experimental

Primeiramente, um planejamento experimental fatorial com triplicata no ponto cen-tral foi utilizado para avaliar o efeito das variáveis independentes sobre a variável dependenteconforme a Tabela 3.3.1

Tabela 3.3.1 – Variáveis independentes e dependentes utilizadas no planejamento experi-mental

Variáveis independentes Variável dependente

Temperatura (ºC) Quantidade de AGL em relação

Fração enzima/substrato (m%) a massa total do produto final (%)

Foram utilizados 7 tratamentos, sendo 4 fatoriais (combinações entre os níveis -1 e+1); e 3 centrais (todas as variáveis no nível 0). A determinação do ponto central se baseouem testes preliminares que indicaram bons resultados na produção de DAG. As variáveisindependentes do processo foram avaliadas em três níveis codificados (-1, 0 e +1), que foramcalculados pela Equação 3.2

Xi =xi � z

�Xi(3.2)

Nas Tabelas 3.3.2 e 3.3.3 encontram-se, respectivamente, os níveis das variáveis in-dependentes os tratamentos realizados.

Tabela 3.3.2 – Níveis de variáveis no planejamento experimental

-1 0 +1

Temperatura (ºC) 40 50 60

Fração enzima/substrato (m%) 2 3 4

Para a análise dos resultados experimentais através da metodologia da superfície deresposta foi utilizado o software Statistica 10®. O ajuste dos dados empregou um polinômiode primeira ordem representado de forma genérica na Equação 3.3.

Y = �0 + �1 ·X1 + �2 ·X2 + �12 ·X1 ·X2 (3.3)

38


Tabela 3.3.3 – Planejamento fatorial 22 com pontos centrais

Variáveis codificadas Variáveis reais

Ensaio X1 X2 Temperatura (ºC) Fraçãoenzima/substrato (m%)

1 0 0 50 3

2 0 0 50 3

3 0 0 50 3

4 -1 -1 40 2

5 -1 +1 40 4

6 +1 -1 60 2

7 +1 +1 60 4

3.3.1 Deslocamento do planejamento na direção do ponto ótimo

3.3.1.1 Planejamento fatorial

Através das informações obtidas a partir do primeiro planejamento, um novo pla-nejamento fatorial foi realizado utilizando as mesmas variáveis. Os níveis dos fatores e ostratamentos realizados são apresentados, respectivamente, nas Tabelas 3.3.4 e 3.3.5.

Tabela 3.3.4 – Níveis de variáveis no planejamento experimental

-1 0 +1

Temperatura (ºC) 35 40 45

Fração enzima/substrato (m%) 0,6 1,3 2,0

39


Tabela 3.3.5 – Planejamento fatorial 22 com pontos centrais



1 0 0 40 1,3

2 0 0 40 1,3

3 0 0 40 1,3

4 -1 -1 35 0,6

5 -1 +1 35 2,0

6 +1 -1 45 0,6

7 +1 +1 45 2,0

3.3.1.2 Delineamento central composto rotacional

A partir do resultado do segundo planejamento experimental, realizou-se um deline-amento central composto rotacional 22 com triplicata no ponto central. O ajuste dos dadosempregou um polinômio de segunda ordem representado de forma genérica na Equação 3.4.

Y = �0 + �1 ·X1 + �2 ·X2 + �11 ·X21 + �22 ·X2

2 + �12 ·X1 ·X2 (3.4)

Em adição aos níveis presentes em planejamentos do tipo fatorial, o DCCR apresentadois níveis axiais codificados em +a e -a. O valor de a depende de F e de K e pode sercalculado através da Equação 3.5.

↵ = F14 (3.5)

onde

F = 2K (3.6)

Como K = 3, tem-se:

↵ =�22� 1

4 =p2 ⇡ 1, 4142 (3.7)

Os níveis dos fatores e os tratamentos realizados estão apresentados, respectivamente,nas Tabelas 3.3.6 e 3.3.7.

40

3.4. Obtenção de dados para a construção de cinéticas de reação

Tabela 3.3.6 – Níveis de variáveis no delineamento central composto rotacional

-1,4142 -1 0 +1 +1,4142

Temperatura (ºC) 26 30 40 50 54

Fração enzima/substrato (m%) 0,5858 1 2 3 3,4142

Tabela 3.3.7 – Delineamento central composto rotacional 22 com triplicata no ponto central



1 0 0 40 2,0000

2 0 0 40 2,0000

3 0 0 40 2,0000

4 -1 -1 30 1,0000

5 -1 +1 30 3,0000

6 +1 -1 50 1,0000

7 +1 +1 50 3,0000

8 -1,4142 0 26 2,0000

9 +1,4142 0 54 2,0000

10 0 -1,4142 40 0,5858

11 0 +1,4142 40 3,4142

3.4 Obtenção de dados para a construção de cinéticas de rea-ção

Reações de hidrólise enzimática assistidas por ultrassom foram conduzidas com ointuito de coletar dados para a construção de curvas cinéticas.

Para essa etapa, as quantidades de reagentes foram de 10 g de água, com fraçõeságua/óleo de 2, 5 e 10% (m/m) e fração enzima/substrato de 1,7% (m/m). Amostras doóleo foram coletadas durante os primeiros 15, 30 e 60 minutos de reação e, em seguida, emintervalos de uma hora até atingir 8 horas de reação.

3.5 Modelagem matemática

A cinética reacional da hidrólise enzimática do óleo de girassol foi descrita por meiode modelagem matemática. Na elaboração do modelo foram consideradas as seguintes hipó-

41

3.5. Modelagem matemática

teses:

i Hipótese do Estado Pseudo-Estacionário (HEPE), a qual considera que, como um in-termediário reativo reage tão rápido quanto é formado, a velocidade de formação dointermediário ativo resultante é nula (FOGLER, 2009);

ii Cinética de Michaelis-Menten.

O mecanismo proposto para a reação é apresentado pelas Equações 3.8 a 3.16.

TAG+H2OE�! DAG+ AGL (3.8)

DAG+H2OE�! MAG+ AGL (3.9)

MAG+H2OE�! GLI + AGL (3.10)

Entretanto, as reações 3.8, 3.9 e 3.10 possuem reações intermediárias. A reação 3.8é intermediada pelas reações 3.11 e 3.12, a reação 3.9 é intermediada pelas reações 3.13 e3.14 e a reação 3.10, pelas reações 3.15 e 3.16, onde [TAG · E], [DAG · E] e [MAG · E]

representam os complexos formados por tri, di e monoacilgliceróis, respectivamente, com aenzima.

TAG+ Ek1�*)�k2

[TAG · E] (3.11)

[TAG · E]E�! DAG+ AGL+ E (3.12)

DAG+ Ek1�*)�k2

[DAG · E] (3.13)

[DAG · E]E�! MAG+ AGL+ E (3.14)

MAG+ Ek1�*)�k2

[MAG · E] (3.15)

[MAG · E]E�! GLI + AGL+ E (3.16)

Aplicando o balanço molar para cada espécie e considerando a produtividade combase na estequiometria, obtém-se o modelo da cinética enzimática para as diversas espécies

42


envolvidas no mecanismo de produção de ácidos graxos, conforme as Equações 3.17 a 3.22,onde rTAG, rDAG e rMAG representam as velocidades de reação para cada componente.

dCTAG (t)

dt= �rTAG (t) (3.17)

dCDAG (t)

dt= rTAG (t)� rDAG (t) (3.18)

dCMAG (t)

dt= rDAG (t)� rMAG (t) (3.19)

dCH2O (t)

dt= � (rTAG (t) + rDAG (t) + rMAG (t)) (3.20)

dCGLI (t)

dt= �rMAG (t) (3.21)

dCAGL (t)

dt= rTAG (t) + rDAG (t) + rMAG (t) (3.22)

E pela consideração de HEPE, tem-se que:

dC[TAG·E] (t)

dt= �r[TAG·E] (t) = 0 (3.23)

dC[DAG·E] (t)

dt= �r[DAG·E] (t) = 0 (3.24)

dC[MAG·E] (t)

dt= �r[MAG·E] (t) = 0 (3.25)

As taxas dos complexos enzimáticos r[TAG·E], r[DAG·E] e r[MAG·E] foram represen-tadas pelas equações 3.26, 3.27 e 3.28. Essas equações foram utilizadas para calcular asconcentrações dos complexos enzimáticos.

r[TAG·E] (t) = k1 ·CTAG (t)·CE (t)�k2 ·C[TAG·E] (t)�k3 ·CH2O (t)·C[TAG·E] (t) = 0 (3.26)

r[DAG·E] (t) = k4·CDAG (t)·CE (t)�k5·C[DAG·E] (t)�k6·CH2O (t)·C[DAG·E] (t) = 0 (3.27)

43


r[MAG·E] (t) = k7 · CMAG (t) · CE (t)� k8 · C[MAG·E] (t)� k9 · CH2O (t) · C[MAG·E] (t) = 0

(3.28)

As taxas das reações para TAG, DAG e MAG foram representadas pelas Equações3.29, 3.30 e 3.31.

rTAG (t) = �k1 · CTAG (t) · CE (t) + k2 · C[TAG·E] (t) (3.29)

rDAG (t) = k3 · C[TAG·E] (t) · CH2O (t)� k4 · CDAG (t) · CE (t) + k5 · C[DAG·E] (t) (3.30)

rMAG (t) = k6 · C[DAG·E] (t) · CH2O (t)� k7 · CMAG (t) · CE (t) + k8 · C[MAG·E] (t) (3.31)

Dessa forma, a partir da manipulação matemática, foi possível obter as seguintestaxas reacionais:

rTAG (t) = �kmb (t) · kmc (t) · V maxa · CTAG (t)

K(3.32)

rTAG (t) = �kma (t) · kmc (t) · V maxb · CDAG (t)

K(3.33)

rTAG (t) = �kma (t) · kmb (t) · V maxc · CMAG (t)

K(3.34)

Onde

K = kma (t) · kmb (t) · kmc (t) + CTAG (t) · kmb (t) · kmc (t)+

CDAG (t) · kma (t) · kmc (t) + CMAG (t) · kma (t) · kmb (t)(3.35)

Em que a concentração enzimática é dada pela Equação 3.36 e os parâmetros deMichaelis-Menten são dados pelas reações de 3.37 a 3.42.

CtE (t) = CE (t) + CTAG·E (t) + CDAG·E (t) + CMAG·E (t) (3.36)

V maxa = k3 · CH2O (t) · CtE (t) (3.37)

44


V maxb = k6 · CH2O (t) · CtE (t) (3.38)

V maxc = k9 · CH2O (t) · CtE (t) (3.39)

kma =k2 + k3 · CH2O (t)

k1(3.40)

kmb =k5 + k6 · CH2O (t)

k4(3.41)

kmc =k7 + k8 · CH2O (t)

k9(3.42)

Para o cálculo das concentrações iniciais, analisou-se acidez do óleo de girassol(0,09%) e considerou-se que o óleo possui, inicialmente, apenas TAG (96,0%), DAG (2,1%)e AGL (YANAI et al., 2007).

Os parâmetros do modelo matemático (k1, k2, k3, k4, k5, k6, k7, k8 e k9) foram estima-dos a partir dos dados experimentais da cinética da hidrólise enzimática do óleo de girassol(teor de acidez do óleo) e da minimização da função objetivo representada pela Equação3.43. O método de otimização simplex Dowhill, desenvolvido por Nelder & Mead (1965) foiutilizado na busca do mínimo da função objetivo.

FOBJ =nX

i=1

✓Cexp

AGL[i]� CcalcAGL[i]

CexpAGL[i]

◆2

(3.43)

Para a otimização das constantes cinéticas e simulação do modelo matemático pro-posto foi utilizada a linguagem computacional Python, com as bibliotecas NumPy e SciPy.

45

4 Resultados e discussões

4.1 Hidrólise do óleo de girassol assistidas por ultrassom

Para avaliar o efeito do ultrassom na hidrólise enzimática do óleo de girassol, primei-ramente foram realizados experimentos na ausência de ultrassom. Os experimentos foramrealizados a 40 ºC e com 2% (m/m) de enzima em relação à massa de substrato (óleo maiságua) com duração de 4 h. Então, experimentos nas mesmas condições reacionais foramrealizados sobre influência do ultrassom durante todo o período reacional.

Apesar de o produto de interesse ser o DAG, a reação de hidrólise tem como pro-duto final AGL, dessa forma, a avaliação das reações nesta etapa baseou-se na quantificaçãodos AGL gerados pelo método de titulação, uma vez que essa técnica de detecção é muitomais simples que a técnica utilizada para os outros produtos. A quantificação específica dosdemais produtos reacionais foi realizada apenas nos casos em que a produção de AGL foisignificativa.

A Tabela 4.1.1 ilustra os resultados obtidos para ambos os casos.

Tabela 4.1.1 – Comparação da hidrólise do óleo de girassol com e sem influência de ultras-som; 40 ºC; 5% (m/m) água/óleo; 2% (m/m) enzima/substrato; 4 h de reação

Acidez (% (m/m))

Agitação mecânica Ultrassom

16,73 37,02

15,92 35,41

16,34 36,21

O uso do ultrassom altera nitidamente o meio, em poucos minutos a mistura água/óleoadquire aparência homogênea e opaca, sendo capaz de gerar emulsões estáveis mesmo semo uso de surfactantes (HIELSCHER, 2007).

4.2 Otimização das condições reacionais

Em busca de um maior rendimento da reação foram avaliadas as condições capazesde atingir a maior produção de AGL através de um planejamento experimental fatorial comtriplicata no ponto central para a análise de duas variáveis: A temperatura (T) e a fração más-sica enzima/substrato (E/S). A partir dos resultados, tornou-se possível desenvolver modelosquadráticos através da regressão dos pontos experimentais e gerar superfícies de resposta,

46

4.2. Otimização das condições reacionais

as quais permitem uma melhor visualização do efeito simultâneo das variáveis. Os valoresexperimentais obtidos para a acidez sob as diferentes condições testadas estão apresentadosna Tabela 4.2.1.

Tabela 4.2.1 – Planejamento fatorial e acidez experimental


Ensaio Temperatura (ºC)Fração

enzima/substrato (%(m/m))

Acidez (% (m/m))

1 50 3 30,79

2 50 3 34,46

3 50 3 32,73

4 40 2 36,43

5 40 4 11,65

6 60 2 35,42

7 60 4 14,42

A Tabela 4.2.2 mostra a estimativa dos efeitos das variáveis e de suas interações, oerro padrão, o p-valor e o coeficiente de regressão de cada variável. Os fatores consideradossignificativos estão destacados em negrito.

Tabela 4.2.2 – Efeitos e coeficiente de regressão para a acidez, para um intervalo de confi-ança de 95%

Variável Efeito Erro Padrão p-valor Coeficiente deregressão

Intercepto 27,98 2,41 0,00136 98,1368

T -22,90 6,36 0,89876 -1,4290

E/S 0,87 6,36 0,036825 -4,3050

T x E/S 1,90 6,36 0,78581 0,0948

R2 = 0,8131

A nível de significância de 95%, apenas a variavél temperatura mostrou-se relevante.A Figura 4.2.1 mostra os efeitos na forma padronizada, com a linha vertical representando onível de significância de 95%:

O diagrama de Pareto demonstra que a temperatura exerce grande influência sobre oresultado final da hidrólise. O efeito negativo dessa variável sugere que os valores escolhidos

47


Figura 4.2.1 – Diagrama de pareto para a produção de AGL, sob um intervalo de 95% deconfiança

para sua avaliação foram superestimados, enquanto a pequena influência positiva da fraçãoenzima/substrato indica que uma quantidade excessiva de enzima foi utilizada.

Com base nos coeficientes de regressão e nos p-valores representados na Tabela 4.2.2foi proposto um modelo empírico (R2=0,8131), representado pela Equação 4.1 para descre-ver a acidez final em função das variáveis selecionadas.

%Acd = �1, 429 · T � 4, 305 · E/S � 0, 0948 · T · E/S + 98, 1368 (4.1)

A verificação da validade do modelo foi realizada pela análise do teste F. QuandoFcalc > Ftab, o modelo é valido e se ajusta bem aos dados experimentais. A Tabela 4.2.3mostra a análise da variância para o planejamento experimental, bem como o valor tabeladode F para um intervalo de confiança de 95%: Ftab(3; 3; 0,05) = 9,28.

Como Fcalc > Ftab, o modelo ajustado é válido. Com base no modelo foi construídauma superfície de resposta para a acidez em função da temperatura e da fração enzima/substrato,cujos resultados são apresentados na Figura 4.2.2

Através da Figura 4.2.2, é possível observar que para temperaturas mais altas há

48


Tabela 4.2.3 – Análise da variância para o planejamento fatorial, para o AGL

Fonte devariação SQ GL QM Fcalc Ftab

Regressão 528,52 3 176,17 13,05 9,28

Resíduos 121,52 3 40,51

Total 650,04 6

Figura 4.2.2 – Influência da temperatura e da fração enzima/substrato sobre a acidez

uma baixa conversão e que a fração enzima/substrato não exerce influência significativa. Umrendimento máximo é obtido com a temperatura em torno de 40 ºC e 2% (m/m) de fraçãoenzima/substrato.

A temperatura é uma variável importante, que afeta as taxas de reação bem comoa constante termodinâmica de equilíbrio. No entanto, pode também ser responsável peladesativação da enzima. A quantidade de enzima presente na reação, por sua vez, também éde grande importância, impactando de forma positiva a velocidade da reação até atingir umponto de saturação, onde maiores quantidades não influenciam mais a reação.

Desta forma, a análise do modelo obtido em conjunto com a superfície de respostaindica que tanto a variável temperatura quanto a variável fração enzima/substrato foram su-

49


perestimadas no planejamento e não há um ponto ótimo na área investigada, tornando neces-sário o deslocamento do planejamento nas direções de menor valor destas variáveis.

4.2.1 Deslocamento do planejamento na direção do ponto ótimo

4.2.1.1 Planejamento fatorial

A partir da Equação 4.1 foi possível encontrar o ponto ótimo de produção de AGLpela variação dos parâmetros T e E/S, limitando-os aos valores extremos utilizados no pla-nejamento fatorial.

Tabela 4.2.4 – Condições ótimas obtidas pelo modelo

Temperatura (ºC)Fração


Acidez predita (%(m/m))

40 2 39,95

Os valores dos parâmetros foram então definidos conforme a Tabela 4.2.4. Dessaforma, o valor de 40 ºC foi escolhido como ponto central para o parâmetro T, enquanto,com o intuito de determinar um intervalo estatisticamente relevante, 2% (m/m) foi o valorescolhido como ponto máximo do parâmetro E/S, tornando 1,3% (m/m) o ponto centraldesse parâmetro. Os valores experimentais obtidos para a acidez sob as diferentes condiçõestestadas estão apresentados na Tabela 4.2.5

Tabela 4.2.5 – Planejamento fatorial e acidez experimental




Acidez (% (m/m))

1 40 1,3 30,06

2 40 1,3 30,32

3 40 1,3 29,68

4 35 0,6 25,17

5 35 2,0 31,55

6 45 0,6 24,20

7 45 2,0 31,74

A Tabela 4.2.6 mostra a estimativa dos efeitos das variáveis e de suas interações, oerro padrão, o p-valor e o coeficiente de regressão de cada variável. Os fatores consideradossignificativos estão destacados em negrito.

50




Intercepto 28,96 0,54 0,00001 28,3657

T -0,39 1,43 0,80231 -0,1467

E/S 6,96 1,43 0,01646 1,6571

T x E/S 0,58 1,43 0,71161 0,0829

R2 = 0,8991

A nível de significância de 95%, apenas a variavél fração enzima/substrato mostrou-se relevante. A Figura 4.2.3 mostra os efeitos na forma padronizada, com a linha verticalrepresentando o nível de significância de 95%:


O diagrama de Pareto demonstra que a fração enzima/substrato exerce grande in-fluência sobre o resultado final da hidrólise. O efeito positivo dessa variável, acompanhadopela ausência de um ponto ótimo, sugere que os valores escolhidos para sua avaliação foram

51


subestimados, enquanto a pequena influência da temperatura indica que o intervalo escolhidopara esse parâmetro não foi grande o suficiente para evidenciar alterações significativas sobreo resultado final.

Com base nos coeficientes de regressão e nos p-valores representados na Tabela 4.2.6foi proposto um modelo empírico (R2=0,8991), representado pela Equação 4.2 para descre-ver a acidez final em função das variáveis selecionadas.

%Acd = �0, 1467 · T + 1, 6571 · E/S + 0, 0829 · T · E/S + 28, 3657 (4.2)

A verificação da validade do modelo foi realizada pela análise do teste F. A Tabela4.2.7 mostra a análise da variância para o planejamento experimental, bem como o valortabelado de F para um intervalo de confiança de 95%: Ftab(3; 3; 0,05) = 9,28.

Tabela 4.2.7 – Análise da variância para o planejamento fatorial, para o AGL


Regressão 48,93 3 16,31 24,04 9,28

Resíduos 6,11 3 2,04

Total 55,04 6

Como Fcalc > Ftab, o modelo ajustado é válido. Com base no modelo foi construídauma superfície de resposta para a acidez em função da temperatura e da fração enzima/substrato,cujos resultados são apresentados na Figura 4.2.4.

Através da Figura 4.2.4, é possível observar que a temperatura não exerce influênciasignificativa. Um rendimento máximo é novamente obtido com a temperatura em torno de40 ºC e 2% (m/m) de fração enzima/substrato.

A análise do modelo obtido em conjunto com a superfície de resposta indica que avariável fração enzima/substrato foi subestimada no planejamento, enquanto o intervalo es-colhido para a variável temperatura não cobriu uma região larga o suficiente para evidenciarinfluências significantes sobre o resultado final. Além disso, o ponto ótimo não está na áreainvestigada, tornando necessário um novo deslocamento do planejamento.

52



4.2.1.2 Delineamento central composto rotacional

A partir da Equação 4.2 foi possível encontrar o ponto ótimo de produção de AGLpela variação dos parâmetros T e E/S, limitando-os aos valores extremos utilizados no pla-nejamento fatorial.

Tabela 4.2.8 – Condições ótimas obtidas pelo modelo

Temperatura (ºC)Fração

enzima/substrato(m/m)

Acidez predita (m/m)

40 2 32,44

Os pontos ótimos obtidos no primeiro e no segundo planejamento fatorial foram idên-ticos, portanto decidiu-se pela realização de um novo planejamento, do tipo delineamentocentral composto rotacional. Os valores dos pontos centrais dos parâmetros foram entãodefinidos conforme a Tabela 4.2.8. Os valores experimentais obtidos para a acidez sob asdiferentes condições testadas estão apresentados na Tabela 4.2.9

O aumento dos intervalos utilizados no planejamento experimental surtiu bons resul-tados, evidenciando o comportamento da acidez em função de ambas as variáveis.

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Tabela 4.2.9 – Delineamento central composto rotacional




Acidez (% (m/m))

1 40 2,0 38,69

2 40 2,0 37,85

3 40 2,0 37,01

4 30 1,0 38,04

5 30 3,0 26,90

6 50 1,0 15,39

7 50 3,0 22,14

8 26 2,0 31,32

9 54 2,0 16,83

10 40 0,6 29,83

11 40 3,4 33,77

A Tabela 4.2.10 mostra a estimativa dos efeitos das variáveis e de suas interações,bem como o erro padrão, o p-valor e o coeficiente de regressão de cada variável para asnovas condições experimentais. Os fatores considerados significativos estão destacados emnegrito.



Intercepto 37,88 1,37 0,000001 -38,4206

T (L) -12,04 1,69 0,000838 4.5692

T (Q) -15,16 2,03 0,000672 -0.0758

E/S (L) 0,28 1,69 0,872785 -3,1834

E/S (Q) -7,28 2,03 0,015623 -3,6411

T x E/S 8,95 2,37 0,013059 0,4473

R2 = 0,9611

Em nível de significância de 95%, todas variáveis com exceção da fração enzima/substrato

54


linear mostraram-se relevantes. A Figura 4.2.5 exibe os efeitos na forma padronizada, com alinha vertical representando o nível de significância de 95%.


Com base nos coeficientes de regressão e nos p-valores (Tabela 4.2.9) foi propostoum modelo empírico (R2 = 0, 9611) para descrever a acidez final em função das variáveisselecionadas. O modelo é representado pela seguinte Equação.

%Acd = 4, 5692 · T � 0, 0758 · T 2 � 3, 1834 · E/S � 3, 6411 · E/S2

+0, 4473 · T · E/S � 38, 4206(4.3)

A verificação da validade do modelo foi realizada pela análise do teste F. A Tabela4.2.10 mostra a análise da variância para o planejamento experimental, bem como o valortabelado de F para um intervalo de confiança de 95%: Ftab(3; 3; 0,05) = 5,05.

Como Fcalc > Ftab, o modelo ajustado é válido. A Figura 4.2.6 mostra a distribuiçãodos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo.

A distribuição aleatória mostra que o modelo ajustado não é tendencioso e que nãoexiste a necessidade de um ajuste de maior ordem.

55


Tabela 4.2.11 – Análise da variância para o DCCR, para o AGL


Regressão 756,27 5 151,25 134,15 5,05

Resíduos 28,19 5 5,64

Total 784,46 10

Figura 4.2.6 – Distribuição dos resíduos para o modelo quadrático

Com base no modelo ajustado foi possível traçar a superfície de resposta para a acidezem função da temperatura e da fração enzima/substrato, cujo resultado está expresso naFigura 4.2.7.

56



4.3 Modelagem matemática

A cinética enzimática do óleo de girassol foi descrita por meio da simulação do mo-delo matemático proposto. Na Figura 4.3.1 são apresentados os valores experimentais daconcentração de AGL, livre de glicerol e água, em função do tempo. As curvas correspon-dem a três diferentes frações de água/óleo; respectivamente 2%, 5% e 10% (m/m).

Nas Figuras 4.3.2, 4.3.3 e 4.3.4 são apresentados os valores experimentais da con-centração de AGL em função do tempo, assim como a simulação realizada pelo modelo.

Na Tabela 4.3.1 são apresentados os valores dos parâmetros obtidos a partir do ajustedo modelo matemático aos dados experimentais cinéticos (FOBJ = 0,0058). Baseando-senestes resultados verifica-se que o modelo descreveu satisfatoriamente os dados experimen-tais.

57


Figura 4.3.1 – Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato)

Figura 4.3.2 – Cinéticas de reação (40 °C; 10 g de óleo; 1,7% menzima/msubstrato, 2%magua/moleo)

58




59


Tabela 4.3.1 – Valores dos parâmetros do modelo matemático

Parâmetros (kg.g�1enzima.h�1)

k1 237,8574

k2 1875,2064

k3 164,7892

k4 1234,4484

k5 3276,0464

k6 67,9625

k7 350,7429

k8 218,8114

k9 906,8644R2 = 0,9943

60

5 Conclusões

Com o auxílio das informações obtidas neste estudo é possível fazer uso da meto-dologia utilizada para fundamentar um projeto de produção de um óleo mais saudável, ricoem diacilglicerol, em larga escala. Fazendo uso do modelo matemático para obter parâme-tros ótimos em faixas de temperatura, razão enzima substrato e razão água/óleo ainda nãotestadas.

Os experimentos realizados foram capazes de determinar a temperatura e a fraçãoenzima/substrato ótimos na reação de hidrólise do óleo de girassol com a enzima phospo-lipase A1 (Lecitase Ultra). Os parâmetros ótimos obtidos foram de 40 ºC e 1,7% (m/m),respectivamente.

A partir do estudo cinético, ainda foi utilizado um modelo da literatura para descrevero processo e a partir disso obter resultados que sugerem que a razão água/óleo mais favo-rável para a produção de diacilglicerol, entre as frações testadas, é de 2%, e também que aquantidade máxima de diacilglicerol é obtida aos 27 minutos de reação.

61

Referências

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AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução RDC nº 270, de 22 de se-tembro de 2005. Diário Oficial da União. Brasília, DF, de 23 de setembro 2005. Disponívelem: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/82d8d2804a9b68849647d64600696f00/RDC_n_270.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 04 julho 2014.

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