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ESTÁGIO EM LABORATÓRIOS DE ALIMENTOS ESTÁGIO SUPERVISIONADO Campo Mourão Abril/2013 UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ Campus – Campo Mourão Tecnologia em Alimentos GABRIELA ROCHA DOS ANJOS
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ESTÁGIO EM LABORATÓRIOS DE ALIMENTOS
ESTÁGIO SUPERVISIONADO
Campo Mourão
Abril/2013
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
Campus – Campo Mourão
Tecnologia em Alimentos
GABRIELA ROCHA DOS ANJOS
GABRIELA ROCHA DOS ANJOS
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Sumário
Resumo .......................................................................................................................................... 4
1. Introdução ............................................................................................................................. 5
2. Descrição do local.................................................................................................................. 6
3. Atividades desenvolvidas ...................................................................................................... 7
4. Conclusão ............................................................................................................................ 16
5. Referências Bibliográficas ................................................................................................... 17
Anexo 1 ........................................................................................................................................ 19
Anexo 2 ........................................................................................................................................ 21
Anexo 3 ........................................................................................................................................ 24
Lista de figuras
Figura 1. Fluxograma de análise microbiológica ......................................................................... 10
Figura 2. O sal de sódio que se forma com produto primário da oxidação do AR sofre posterior
oxidação, na sequência da reação. ............................................................................................. 25
Figura 3. O ácido 3,5- dinitrossalicílico é reduzido pelo açúcar redutor em meio alcalino a ácido
3-amino-5-nitrossalicílico formando ácido aldônico. .................................................................. 25
Figura 4.Comparação dos métodos de determinação de açúcares redutores em mel de flores
de Eucalipto ................................................................................................................................. 31
Lista de Tabelas
Tabela 1. Análises microbiológicas e seus respectivos reagentes/meios de cultura e técnicas. 11
Tabela 2. Símbolos de reagentes químicos ................................................................................. 12
Tabela 3. Regras de segurança em laboratório .......................................................................... 15
Tabela 4. Análises físico-químicas de caracterização do mel de flores de Eucalipto ... 29
Tabela 5. Valores do teor de açúcares redutores em mel de flores de Eucalipto, seguido do
desvio padrão. ............................................................................................................................. 30
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Resumo
O estágio foi realizado na área de Ensino e Pesquisa em Alimentos, nos
Laboratórios de Ensino e Pesquisa da Área de Alimentos da Universidade
Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), no campus de Campo Mourão; onde
foram realizadas atividades técnicas como análises físico-químicas, teste e
preparo de aulas práticas etc; e administrativas como controle do estoque de
reagentes e materiais, registro de reservas etc. E por fim foi realizado um
trabalho complementar de comparação de métodos para açúcares redutores.
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1. Introdução
O seguinte estágio foi realizado na área de Ensino e Pesquisa em
Alimentos, com o intuito de aperfeiçoar o conhecimento transmitido pelos
professores durante o curso.
Os trabalhos desenvolvidos durante o estágio não teve um único
enfoque, pois foram desenvolvidas atividades diversas como: teste e
preparo de aulas práticas; organização e limpeza de bancadas, vidrarias e
equipamentos; preparo e padronização de soluções químicas; esterilização
de materiais; acondicionamento e descarte de resíduos químicos e
microbiológicos; apoio as atividades de pesquisa (de professores e alunos);
recebimento e registro de pedidos de aulas práticas; registro de reserva de
laboratórios e equipamentos; controle de estoque de reagentes;
averiguação do cumprimento das normas de segurança pelos usuários dos
laboratórios; além da elaboração de um trabalho paralelo que envolveu
diversas metodologias de análise e técnicas de manipulação de
equipamentos, reagentes e vidrarias que devem ser utilizadas em
laboratório.
Diversos profissionais envolveram-se para que este estágio tivesse
resultado satisfatório, abordando cada atividade desenvolvida de maneira
construtiva, influenciando o estagiário á buscar na literatura metodologias
de análise e trabalhos que proporcionassem embasamento teórico e
prático, facilitando assim o desenvolvimento dos experimentos corriqueiros.
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2. Descrição do local
O estágio foi realizado nos Laboratórios de Ensino e Pesquisa da Área
de Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), no
campus de Campo Mourão.
As atividades foram desenvolvidas nos laboratórios:
2.1 Laboratório C002 - Industrialização de Origem Animal
Neste laboratório são desenvolvidas atividades e aulas baseadas no
processamento de leite, carnes e alimentos vegetais (corte, descasque,
tratamentos térmicos, aplicação de aditivos químicos, embalagem).
2.2 Laboratório C003 - Química Orgânica, Bioquímica e Análise
Sensorial
São realizadas, neste laboratório, aulas e trabalhos nas áreas de
bioquímica e análise sensorial.
2.3 Laboratório C004 - Núcleo de Apoio à Tecnologia de Alimentos
Este laboratório tem a função de servir apoio á todos os demais, neste
laboratório são preparadas as soluções, meios de cultura para as aulas
práticas, onde estão armazenadas as vidrarias e reagentes não controlados e
os equipamentos e utensílios de análise físico-química.
2.4 Laboratório C005 - Microbiologia e Microscopia
Neste laboratório ocorrem exclusivamente aulas e atividades de
microbiologia e microscopia.
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2.5 Laboratório C103 - Panificação
Neste laboratório são desenvolvidos práticas de ensino e pesquisa
envolvendo a produção de pães, biscoitos e massas alimentícias.
2.6 Laboratório C105 - Bromatologia e Química Analítica
Apenas atividades e aulas de análises químicas são realizadas neste
laboratório, contudo não são exclusivamente dedicadas ao curso de alimentos,
visto que, comporta uma pequena sala dedicada ao apoio do curso de
Engenharia Ambiental.
2.7 Laboratório de espectrofotometria
Sem apresentar numeração este laboratório localiza-se ao lado do
laboratório C004, ele contém um computador acoplado ao espectrofotômetro,
um espectro de absorção atômica e uma bancada com pia.
3. Atividades desenvolvidas
As atividades desenvolvidas durante o seguinte estágio estão dispostas
nos tópicos abaixo.
3.1 Recebimento e registro de pedidos de aulas práticas.
O registro de pedidos de aulas práticas era realizado em fichas
separadas por curso - Tecnologia em Alimentos, Química, Técnico Integrado
em Informática e Engenharia de Alimentos. As aulas práticas eram agendadas
com no mínimo uma semana de antecedência, para uma melhor programação
dos técnicos para o preparo das mesmas, bem como a limpeza e organização
dos laboratórios. Os roteiros de aula prática eram entregues aos técnicos no
ato do registro, assim era possível preparar aulas coerentes com as
programadas pelo professor.
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3.2 Teste e preparo de aulas práticas.
O teste de aulas práticas eram situações frequentes, com o intuito de
evitar imprevistos, desconhecidos pelos professores e técnicos, durante a aula.
Para o preparo das aulas práticas, seguia-se o roteiro disponibilizado
pelo professor, primeiramente eram separadas as vidrarias e equipamentos
necessários e preparavam-se as soluções químicas e/ou meios de cultura. Em
aulas de microbiologia também era necessário o acondicionamento e
esterilização de materiais, soluções e meios de cultura.
3.3 Organização e limpeza de bancadas, vidrarias e equipamentos.
Antes e após cada aula prática todas as vidrarias, bancadas e
equipamentos utilizados eram limpos com soluções de limpeza específicas
para cada superfície.
Primeiramente eram separadas as vidrarias contaminadas, das não
contaminadas por microrganismos; assim aquelas contaminadas eram
primeiramente esterilizadas em autoclave a 121 ◦C por 20 minutos e depois
lavadas. O processo de lavagem de vidrarias era realizado da seguinte forma,
limpava-se a superfície com detergente neutro, realizava- se três enxágües
com água de torneira e um último com água destilada, com o intuito de retirar
sais residuais da água de torneira que possam influenciar nas próximas
análises. Segundo Ferraz (2004) a lavagem de vidrarias pode produzir vapores
tóxicos de diversos produtos químicos que entram em contato com a água,
dessa forma sempre era lavado alguma vidraria que entrou em contato com
produtos químicos diversas precauções eram tomadas para evitar a inalação
de vapores tóxicos.
As vidrarias não volumétricas eram colocadas em estufa á 50 ◦C, para
rápida secagem e guardadas nos armários. As vidrarias volumétricas eram
secas á temperatura ambiente, pois qualquer exposição á altas ou baixas
temperaturas podem comprometer a calibração da mesma.
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As bancadas eram lavadas com detergente neutro e por fim, com o
auxílio de uma flanela, limpava-se com álcool 70% para redução da carga
microbiana.
Os equipamentos eram limpos com álcool 70%, com auxílio de flanela.
3.4 Preparo e padronização de soluções químicas e meios de cultura.
O preparo de soluções químicas e meios de cultura eram procedimentos
frequentes durante o estágio; contudo bastante distintos, pois cada um exige
precauções e técnicas diferentes.
3.4.1 Preparo de meios de cultura
Os meios de cultura são destinados á proliferação de microrganismos,
eles fornecem condições favoráveis como pH, nutrientes e água, para que
estes microrganismos cresçam. Contudo é desejável que cresça apenas
aqueles presentes na amostra analisada, e não os provenientes de
contaminação do meio de cultura; dessa forma era necessário esterilizá-los em
autoclave antes da inoculação do microrganismo.
Existem vários tipos de meios de cultura, há os seletivos que têm
substâncias inibitórias á certos grupos de microrganismos, sem agir sobre
outros (MacConkey, Selenito do Sódio, Baird-Parker); os de pré-
enriquecimento tem a função de proporcionar a dessensibilização dos
microrganismos injuriados (Água peptonada, caldo lactosado); os de
enriquecimento têm em sua composição sangue, soro ou extrato de tecidos
animais ou vegetais como forma de nutrir microrganismos exigentes com
nutrientes extras (Caldo Tetrationato, Selenito-Cistina, Caldo Tioglicolato); os
diferenciais apresentam substâncias que após a incubação proporcionam
crescimento alterado, proporcionando assim, melhor identificação dos
microrganismos presentes (Ágar sangue, Ágar MacConkey, Baird-Parker,
Teague) (RUIZ, 2000).
A figura 1 apresenta a simulação de uma análise microbiológica em um
fluxograma.
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Quanto a consistência, os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos e
semi-sólidos. O que determina a consistência do meio de cultura é a
quantidade de ágar acrescentada ao sólido e ao semi-sólido, utilizado quando
há interesse em observar o formato, cor e tamanho da colônia; o líquido não
possui ágar e é conhecido como caldo, neste observa-se a produção de gás,
odor e alteração de pH (OKURA, 2008).
Para cada análise microbiológica, utiliza-se uma técnica e meio de
cultura distintos, que estão dispostos na Tabela 1.
Vários meios de cultura foram preparados, dentre eles ágares e caldos,
o preparo dos mesmos exige procedimentos diferentes, determinados de
acordo com a sua finalidade e composição.
Figura 1. Fluxograma de análise microbiológica
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Tabela 1. Análises microbiológicas e seus respectivos reagentes/meios de cultura e técnicas.
Análise Reagentes/Meios de cultura Técnica
Mesófilos
aeróbios
PCA e SP. Plaqueamento
em profundidade
Bolores e
leveduras
Ágar batata glicose; Ácido tartárico e SP. Plaqueamento
em superfície
Coliformes Caldo EC; SP; VB; Cristal violeta; LST; BEM; PCA;
Caldo e Ágar Citrato; Caldo Triptona; Caldo VM-VP;
Reagentes de Kovac’s; Vermelho de Metila; Alfa-
Naftol e KOH.
Plaqueamento1,
NMP2 e NMP em
água e gelo3
Salmonella
sp.
SP; SP tamponada; α- naftol; os caldos Rappaport
Vassiliadis, Uréia, Selenito cistina, Vm/VP e os
Ágares BPLS, XLD, Hectoen, Rambach, LIA.
Plaqueamento
em superfície
S. aureus Ágar BP; Ágar DNAse; Caldo triptona; BHI; SP;
Solução de azul de toluidina; Telurito de potássio;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
Peróxido de hidrogênio 3%; e reagentes para
coloração de Gram.
Plaqueamento
em superfície1,
NMP2 ou
Presença/
Ausência4
PCA- Ágar padrão para contagem; BDA- Ágar batata glicose; VB- Caldo verde brilhante; BPLS-
Ágar verde Brilhante, BP- Baird Parker; BHI- Caldo cérebro-coração; LIA- Ágar lisina ferro
Solução salina peptonada; TSI- Ágar ferro três açúcares; SP- Salina Peptonada. 1Aplica-se
quando o limite máximo tolerado é ≥100UFC/g ou mL;
2Utilizadoquandoolimitemáximotoleradoforinferiora100UFC/g ou mL;
3Aplica-se a amostras de
água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor é obtido em
NMP/ 100mL; 4Utilizado em alimentos processados, com baixa contagem e provável incidência
de células injuriadas.
3.4.2 Preparo e padronização de soluções químicas
No preparo de soluções químicas era essencial ter cautela, para que
acidentes não ocorressem. O primeiro passo no preparo de uma solução
química é ler o rótulo do reagente ou solvente, e de acordo com o grau de
periculosidade tomava-se os cuidados necessários.
A Tabela 2 apresenta os principais símbolos a serem observados no
rótulo de produtos químicos antes de manuseá-los.
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Tabela 2. Símbolos de reagentes químicos
Identificação Efeitos Medidas Preventivas
Comburente
Pode provocar incêndios e explosões
Armazenar em local arejado. Não manusear perto de fonte de calor. Não fumar perto dos produtos. Não usar vestes de nylon e ter sempre extintor perto. Não guardar produtos inflamáveis junto com comburentes.
Inflamável
Explosivo
Pode provocar incêndios e explosões
Evitar aquecimento excessivo e choques. Proteger do sol. Não colocar perto de fontes de calor.
Nocivo/Irritante
Perigoso para a saúde
Evitar contato com a pele – utilizar meios de proteção como luvas e viseiras. Trabalhar preferencialmente em capelas ou local arejado.
Tóxico
Corrosivo
Perigoso para a saúde
Manter o frasco sempre bem fechado. Utilizar sempre luvas e óculos de proteção. Proteger os olhos e pele de salpicos.
Perigoso para o ambiente
Perigoso para o ambiente
Eliminar o produto ou seus resíduos através de empresas que tratam de produtos perigosos. Nunca atirar para o meio ambiente.
Um laboratório pode tornar-se um local potencialmente perigoso para
quem não sabe interpretar os símbolos contidos em reagentes. Em razão disso
antes de qualquer manuseio, por parte de alunos e professores, de produtos
químicos era ressaltado os cuidados necessários.
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3.5 Acondicionamento e esterilização de materiais.
Em análises microbiológicas é indesejável o crescimento microbiano
proveniente dos materiais utilizados na análise, assim antes de toda análise
microbiológica, tanto na preparação das aulas quanto durante as aulas, todo
material – vidrarias, meios de cultura e soluções em geral-que entraria contato
direto com a amostra a ser analisada era esterilizado em autoclave.
Para esterilizar apenas vidrarias, utilizavam-se as autoclaves horizontais,
para isso elas tinham que ser acondicionadas, processo onde recebem
embalagem de papel Kraft, sendo que vidrarias como tubo de ensaio,
erlenmeyer e balão de fundo chato ainda recebiam um tampão de algodão
inserido em seu orifício. Na esterilização de meios de cultura e soluções em
geral utilizavam-se as autoclaves verticais, que comportam maior volume de
material, nesse caso as vidrarias utilizadas eram erlenmeyers e balões de
fundo chato, acondicionados da mesma maneira citada anteriormente.
3.6 Descarte de resíduos químicos e microbiológicos.
Os resíduos microbiológicos antes de serem descartados eram
esterilizados em autoclave, em seguida descartavam-se os líquidos no esgoto
e os sólidos em lixeira própria para resíduos orgânicos.
Os resíduos químicos eram separados em frascos identificados, e
recolhidos por empresa especializada em descarte de agentes químicos.
3.7 Apoio às atividades de pesquisa.
Durante o estágio foi fornecido apoio os cursos de Engenharia e
Tecnologia de Alimentos, Química e Técnico Integrado em Informática, dessa
forma trabalhos bastante distintos entre si foram observados e auxiliados. Além
de auxiliar na utilização de equipamentos e vidrarias, no fornecimento de
materiais e reagentes, também foi possível acompanhar de perto diversos
trabalhos e obter, assim, experiência com os resultados satisfatórios e com os
não satisfatórios dos pesquisadores.
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3.8 Registro de reserva de laboratórios e equipamentos.
Os registros de laboratório e equipamentos eram essenciais devido á
grande procura por parte dos pesquisadores em relação ao número de
equipamentos e laboratórios. Uma vez feita reserva a pessoa pode atrasar-se
em apenas uma hora, após isso a reserva é cancelada e repassada á outra
pessoa. No Anexo 1 são apresentadas as planilhas de reserva de
equipamentos e laboratórios.
3.9 Controle de estoque de reagentes.
O controle de reagentes era realizado periodicamente, para que a
reposição daqueles que foram esgotados fosse realizada o mais rápido
possível, impedindo, assim, a interrupção de trabalhos pela falta de reagentes.
3.10 Averiguação do cumprimento das normas de segurança.
O laboratório, local do estágio, apresentava um manual de Boas práticas
de segurança em laboratório, disponível a todos os usuários. Assim que
qualquer atividade era iniciada no laboratório uma versão resumida desse
manual (Anexo 2) era entregue a cada pesquisador, e este assinava uma lista
de recebimento do mesmo.
Assegurar o cumprimento dessas normas era de extrema necessidade,
com a finalidade de não expor as pessoas à situações perigosas. A Tabela 3
apresenta algumas regras de segurança que devem ser seguidas segundo
Ferraz (2004).
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Tabela 3. Regras de segurança em laboratório
É proibido: Deve-se Usar: Fique atento:
Ingerir alimentos e bebidas
Jaleco de algodão ou material pouco inflamável
Aos sinais de advertências
Tocar boca e olhos quando usar reagentes químicos
Calçados fechados, de preferência couro
Aos rótulos dos reagentes
Brincadeiras ou qualquer exaltação desnecessária
Lenços de papel e não de tecidos
Á sons incomuns
Manipular substâncias inflamáveis perto de fogo
Pipetadores sempre que utilizarem pipetas
Á odores incomuns
Nunca corra, sempre ande
Equipamentos de segurança extra sempre que necessário
Á compatibilidade de reagentes
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4. Conclusão
Todas as atividades desenvolvidas durante o estágio foram executadas
com êxito, e além de complementarem todas as informações adquiridas
durante as aulas, possibilitaram novos horizontes no que se trata de pesquisa
na área de alimentos.
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5. Referências Bibliográficas
BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Instrução
Normativa 11, de 20 de outubro de 2000, Regulamento técnico de identidade e
qualidade do mel.Diário Oficial, Brasília, 20 de outubro de 2000 a, Seção 001,
p.16-17.
CARVALHO, Carlos A. L.; SOUZA, Bruno A. S.; SODRÉ, Geni S.;MARCHINI,
Luís C. M.; ALVES, Rogério M. O. Mel de abelhas sem ferrão: contribuição
para a caracterização físico-química. 1 ed, Cruz das Almas – Bahia. 2005.
EVANGELISTA-RODRIGUES, A.; SILVA, E.M.S; BESERRA, E.M.F.;
RODRIGUES, M.L. Análise físico-química dos méis das abelhas Apis mellifera
e Melipona scutellarisproduzidos em duas regiões no Estado da
Paraíba.Ciência Rural, v.35, p.1166-1171, 2005.
FERRAZ, Flávio César; FEITOZA, Antônio Carlos. Técnicas de segurança em
laboratórios: regas e práticas. São Paulo: Hemus, 2004.
IAL. Instituto Adolfo Lutz. Métodos físico-químicos para análise de
alimentos/Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Brasília: Ministério da Saúde, 2005. (Série A: Normas Técnicas e Manuais
Técnicos).
MARCHINI, L.C., SODRÉ, G.S., MORETI, A.C.C.C. Mel brasileiro :
composição e normas. Ribeirão Preto: A S Pinto. 111p. 2004.
RUIZ, R.L. Manual prático de microbiologia básica. São Paulo: Universidade
de São Paulo, 2000. 50-51p.
SILVA, Claudete M.; RODRIGUES, Adriana E.; COELHO, Márcia S.; GOIS,
Glayciane C.; GOMES, Alexandre M. A.; GUEDES, Henrique S. Avaliação
físico-química do mel da região de Salgado de São Félix- PB. 2009. 4 f.
Trabalho de conclusão de curso (Zootecnia) - Departamento de Zootecnia –
CCA/UFPB. 2009. Águas de Lindóia- SP.
SILVA, N. R.; MONTEIRO, N. V.; ALCANFOR X. D. J.; ASSIS, M. E.;
ASQUIERI, R. E. Comparação de métodos para determinação de açúcares
redutores e totais em mel. Ciência e Tecnologa de Alimentos, v.23,
n.3,p.337-341, set-dez 2003.
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SODRÉ, G.S.; MARCHINI, L.C.; MORETI, A.C.C.C.; OTSUK, I.P.; CARVALHO,
C.A.L. Caracterização físico-química de amostras de méis de Apis mellifera L.
(Hymenoptera: Apidae) do Estado do Ceará. Ciência Rural, v.37, p.1139 –
1144, 2007.
WELKE, J.E.; REGINATTO, S.; FERREIRA, D.; VICENZI, R.; SOARES, J.M.
Caracterização físico-química de méis de Apis mellifera L. da região noroeste
do Estado do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v.38, p.1737-1741, 2008.
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Anexo 1
FICHA DE RESERVA DE EQUIPAMENTO
Identificação do equipamento:__________ Localização:____________
Datas e horários de início e
término do uso
Nome do
requisitante e
Assinatura
Data Técnico Situação
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FICHA DE RESERVA DE LABORATÓRIO
Laboratório: _____________________________________________________
Datas e horários de início e
término do uso
Nome requisitante
e Assinatura
Data Técnico Situação
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Anexo 2
Ministério da Educação
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
Campus Campo Mourão
Coordenação dos Cursos Superiores de Engenharia de Alimentos e
de Tecnologia em Alimentos
INSTRUÇÕES BÁSICAS PARA USO DOS LABORATÓRIOS DE ENSINO E
PESQUISA
1. Ao chegar e sair dos laboratórios comunique os técnicos ou o professor responsável pelo
local.
2. Não é permitido o desenvolvimento de quaisquer atividades nos laboratórios sem o uso de
jaleco fechado até os joelhos, preferencialmente de manga longa, calça comprida até os
pés, calçado completamente fechado e o cabelo preso, se longo.
3. Procedimentos necessários antes de iniciar qualquer trabalho nos laboratórios:
a. tenha a metodologia determinada e faça um estudo prévio buscando elucidar as
dúvidas;
b. estabeleça um cronograma de atividades, liste os equipamentos necessários e
faça as reservas dos mesmos com os técnicos em função da disponibilidade deles;
c. cheque a disponibilidade de reagentes e meios de cultura;
d. verifique com os técnicos se é possível executar o trabalho com o número e
natureza de atividades previstas. Ao planejar as atividades é importante certificar-
se que a capacidade dos equipamentos é suficiente;
e. verifique os horários disponíveis para uso do laboratório requerido. Os horários de
atendimento dos técnicos ficam dispostos na porta dos laboratórios C004 e C105.
4. Medidas de segurança:
a. em casos de acidentes (cortes, queimaduras, etc.) com equipamentos, vidrarias,
reagentes, microrganismos procure manter a calma, comunique os técnicos e
solicite ajuda. Existe um procedimento de atendimento para estes casos;
b. execute os trabalhos com atenção:
compostos voláteis devem ser manipulados na capela;
ácidos e bases corrosivos, irritantes e/ou nocivos devem ser
manipulados com luvas, óculos de proteção, e na capela, quando for o
caso;
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procedimentos de esterilização de materiais devem ser acompanhados
completamente: se preciso, solicite ajuda dos técnicos. Equipamentos
que usam calor e pressão precisam de cuidados redobrados no uso;
não deixe materiais sob aquecimento sem o seu acompanhamento. Peça
auxílio aos técnicos, se necessário;
coloque vidrarias quentes sobre panos ou flanelas, nunca as coloque
diretamente sobre a bancada ou outras superfícies mais frias, pois
podem trincar ou quebrar;
cuidado ao trabalhar com vidrarias: elas são frágeis, fáceis de quebrar, e
o estoque é limitado;
mantenha um comportamento apropriado e com disciplina: não corra e
faça somente o barulho necessário. Podem existir outros trabalhos
sendo conduzidos próximos a você.
c. não misture soluções químicas sem o conhecimento de suas reações, bem como
não as ingira, as inale ou as experimente com o tato.
5. Ao precisar de reagentes e meios de cultura, solicite-os aos técnicos, e após o uso deixe-
os sobre a bancada indicada por eles, avisando o término do uso.
6. Certifique-se que sabe usar os equipamentos que precisa. Não use equipamentos que
você não tem certeza do seu funcionamento. Peça explicação de uso aos técnicos nestes
casos.
a. equipamentos de medição analítica (balanças, pHmetros, espectrofotômetros, etc.)
devem ser manuseados com muita cautela, delicadeza, segurança e atenção.
b. antes de usar equipamentos de medição verifique a sua limpeza, pois a presença
de resíduos de qualquer natureza podem interferir nos resultados da sua pesquisa.
c. nunca enrole fios elétricos dos equipamentos em torno dos mesmos, em especial
aqueles que realizam aquecimento, pois podem danificar a proteção isolante
existente ao longo do fio.
d. equipamentos reservados cujo uso não se iniciou após uma hora do início do
tempo marcado ficam à disposição de uso para outro usuário, exceto se o atraso
for comunicado até uma hora do início da reserva.
e. logo após o uso do equipamento, deixe-o limpo para outro usuário e para você
mesmo.
7. Organização e limpeza:
a. procure executar suas atividades em uma única bancada. Isto vai facilitar a
organização e limpeza que você terá que fazer durante e/ou no final do trabalho;
b. para que as suas vidrarias sujas não se misturem com as de outros trabalhos,
mantenha-as na sua bancada de trabalho até o momento da lavagem das
mesmas, quando poderão ser levadas até a pia principal;
c. marcações com canetinha, etiqueta ou fitas adesivas em vidrarias devem ser
completamente retiradas após o término de uso;
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d. no final dos trabalhos organize e limpe as vidrarias, equipamentos e bancadas que
utilizou. Deixe limpo para receber limpo;
e. se for preciso deixar material em solução detergente para lavar no dia seguinte,
comunique os técnicos, e fixe um bilhete junto do recipiente em que ele está.
Lembre-se desse compromisso para o dia seguinte;
f. planeje suas atividades de modo que seja possível deixar o espaço e os materiais
que utilizou limpos e organizados no final do trabalho.
8. É proibido comer, beber e/ou fumar nos laboratórios. A ingestão de alimentos é permitida
apenas em trabalhos envolvendo análise sensorial e/ou industrialização de alimentos, com
ciência do professor orientador.
9. Converse com seu orientador e com a Coordenação de Curso para a aquisição de
materiais (vidrarias especiais e reagentes) para atividades de pesquisa e para averiguação
dos recursos necessários.
RECEBIMENTO DAS INSTRUÇÕES BÁSICAS PARA USO DOS LABORATÓRIOS DE ENSINO E
PESQUISA
Nome Data Assinatura Motivo*
10. * AMB: ambientização; IC: iniciação científica; TCC: trabalho de conclusão de curso; AEC: atividade extra-classe.
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Anexo 3
Comparação de métodos para determinação de açúcares redutores em
amostra de mel
1. Introdução
Os monossacarídeos, glicose e frutose são açúcares redutores devido
ao grupo carbonílico e cetônico livres, capazes de oxidarem na presença de
agentes oxidantes em soluções alcalinas. Já os dissacarídeos não possuem
essa característica sem antes serem hidrolisados, dessa forma são
classificados como não redutores (SILVA, 2003).
A legislação brasileira define mel como produto alimentício produzido
pelas abelhas melíferas, a partir do néctar das flores ou das secreções
procedentes de partes vivas das plantas ou de secreções de insetos sugadores
de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem,
transformam, combinam com substâncias específicas próprias, armazenam e
deixam madurar nos favos da colméia (BRASIL, 2000).
As plantas amilíferas são aquelas que têm flores visitadas pelas abelhas;
o conhecimento da flora apícola visitada pelas colônias Apis mellifera resultará
na identificação da variedade do mel. Existem diversas plantas amilíferas, ou
seja, que fornecem néctar, atrativo às abelhas Apis melífera. Neste trabalho foi
utilizado a variedade originada pela planta eucalipto.
A qualidade do mel está relacionada a um conjunto de determinações
físico-químicas, sensoriais e microbiológicas após a colheita e durante seu
armazenamento. Entre as análises físico-químicas que determinam essa
qualidade estão pH, sólidos solúveis, índice de formol, acidez e umidade
(BRASIL, 2000). A quantificação dos açúcares redutores é de extrema
importância, pois esta é a principal característica do mel, já que açúcares
ocupam quase a totalidade do produto. Essa análise pode ser realizada por
vários métodos, aqui foram realizados Lane-Eynon manual e instrumental,
Somogyi-Nelson e DNS, como intuito determinar o melhor método em relação a
praticidade e economia.
No método de Lane-Eynon o cobre do reativo de Fehling (solução
alcalina de sulfato de cobre em tampão de tartarato duplo de sódio e potássio)
é reduzido a óxido cuproso (Figura 1) (Silva et al, 2003).
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Figura 2. O sal de sódio que se forma com produto primário da oxidação do AR sofre posterior oxidação, na sequência da reação.
No método Somogyi e Nelson, os glicídeos redutores aquecidos em
meio alcalino, transformam-se em enóis que reduzem o íon cúprico presente à
cuproso. O óxido assim formado reduz o arsênio-molibídico a óxido de
molibdênio de coloração azul cuja intensidade de cor é proporcional a
quantidade de açúcares redutores existentes na amostra (Silva et al, 2003).
A química da reação do DNS com açúcares redutores está elucidada em
parte. O DNS é reduzido para ácido 3-amino-5-nitrossalicílico, enquanto que no
caso mais simples o grupamento aldeído parece ser oxidado a ácido aldônico
(Figura 2) Silva et al (2003).
Figura 3. O ácido 3,5- dinitrossalicílico é reduzido pelo açúcar redutor em meio alcalino a ácido 3-amino-5-nitrossalicílico formando ácido aldônico.
Assim, este trabalho teve como objetivo realizar determinação de açúcares
redutores (AR) em mel de flores de Eucalipto, utilizando os métodos para
análise e comparação Lane-Eynon por meio de titulação manual e instrumental,
Somogyi-Nelson e DNS, proporcionando informações que auxiliem o avaliador
de mel.
26
2. Materiais e métodos
2.1 Materiais
O mel de flores de eucalipto foi adquirido no comércio do município de
Campo Mourão- PR. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
2.2 Caracterização do mel
2.2.1 Teor de sólidos solúveis totais
O teor de sólidos solúveis totais (SST) foi obtido com auxílio de
refratômetro de bancada de Abbé, realizando-se a calibração do aparelho, com
água (ponto zero). Posteriormente, colocou-se 2 gotas de mel entre os prismas
do refratômetro, focalizou-se e foi realizado a leitura na escala contida no
aparelho em graus Brix.
2.2.2 Teor de umidade
Para a determinação do teor de umidade, foi utilizado o índice de
refração obtido no refratômetro juntamente com a leitura do teor de SST, sendo
posteriormente esse valor transformado em porcentagem, de acordo com a
tabela de Chataway.
2.2.3 Acidez total titulável
Pesou-se 10g de mel que foi diluído com 75 mL de água deionizada.
Titulou-se com solução de hidróxido de sódio 100mM até atingir pH 8,3, com o
auxílio de pHmetro digital (Tecnopon, mPA 210), sendo o volume gasto na
titulação anotado para o cálculo. Reservou-se a solução titulada para a análise
do índice de formol.
2.2.4 Índice de formol
A solução titulada da análise de acidez teve seu pH reduzido para 8,0,
adicionando-se ácido acético. Então foi inserido 5 mL de formol 35%.
Reservou-se por 1 minuto sob agitação magnética. Por fim esta solução foi
titulada com hidróxido de sódio 100mM até o pH 8,0 com auxílio de pHmetro
digital, sendo o volume gasto na titulação anotado para o cálculo.
27
2.2.5 Determinação do valor de pH
Pesou-se 10g de mel que foi diluído com 75mL de água destilada recém
fervida e realizada leitura em pHmetro digital.
2.3 Métodos de determinação de açúcares redutores
As determinações do teor de açúcares redutores foram realizadas pelos
métodos de Lane-Eynon (titulação manual), Lane-Eynon (instrumental),
Somogyi-Nelson e DNS (ácido 3-5 dinitrossalicílico).
2.3.1 Lane-Eynon (titulação manual)
Em erlenmeyer foi inserido 10mL da solução A e 10mL da solução B,
dos reativos de Fehling, juntamente com 40mL de água destilada. Levou-se á
ebulição em chapa aquecedora, e então foi realizada a titulação com solução
de mel a 2%, utilizando 3 gotas do indicador azul de metileno próximo ao ponto
de viragem, característico pela coloração vermelho-tijolo (IAL, 2005).
2.3.2 Lane-Eynon (instrumental)
Este método se realiza em equipamento conhecido como Redutec
(Tecnal, TE-088). Para a determinação foi inserido no equipamento 10mL da
solução de Fehling A e 10mL da solução B, 40mL de água destilada e 3 gotas
do indicador azul de metileno. O aquecimento das soluções de Fehling ocorre
por meio de vapor de água da caldeira do equipamento. Após aquecimento,
fez-se a titulação da solução de mel a 2% inserida em bureta adaptada na
parte superior do equipamento, até momento em que no visor de voltagem, a
leitura dada por potenciômetro instalado na lateral da parte onde estão as
soluções de Fehling, se modificou rapidamente e a coloração passou de azul
para vermelho-tijolo. Anotou-se o volume gasto na bureta para realizar os
cálculos (IAL, 2005).
2.3.2 Somogyi-Nelson
Primeiramente foi construída uma curva padrão de glicose. Para isso
preparou-se uma solução de glicose com concentração de 300µg/mL, a partir
desta solução-estoque foram preparadas, em 11 tubos de ensaio, soluções
com concentrações no intervalo de 0 a 300µg/mL. Em cada um dos 11 tubos foi
inserido 1mL do restivo Somogyi e manteve-se em banho-maria fervente por 10
minutos. Depois de resfriados, adicionou-se 1mL do reativo de Nelson e 7mL
28
de água destilada aos tubos. Foi realizada leitura em espectrofotômetro em
comprimento de onda de 540nm. Depois de obtida a equação da reta pôde-se
prosseguir a análise com a amostra. Então, foi preparado uma solução de mel
2% (solução 1), esta foi diluída 5000 vezes (solução 2). Em tubo de ensaio
inseriu-se 1mL da segunda solução de mel e 1mL do reativo Somogyi, após
manter 10 minutos em banho-maria fervente adicionou-se 1mL do reativo de
Nelson e 7mL de água destilada. Foi preparado também um tubo em branco,
ou seja, apresenta todos os componentes menos a amostra. Em seguida
analisadas em espectrofotômetro (PG Instruments, marca T80+) em
comprimento de onda de 540nm.
2.3.3 DNS (ácido 3-5 dinitrossalicílico)
Inicialmente preparou-se a curva padrão, para isso foi utilizado uma
solução-estoque de glicose de concentração 2g/L, a partir desta solução foi
preparado em 11 tubos soluções de glicose com concentrações no intervalo de
0 a 2g/L; em seguida em todos os tubos foi elevado o volume para 500µL
utilizando água destilada. Depois adicionou-se 2,5mL do reativo DNS nos 11
tubos, que foram inseridos em banho maria fervente por 10 minutos, depois de
resfriados, foi inserido 3mL de água destilada e realizado leitura em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 600nm. Obtida a curva padrão
foi preparado uma solução de mel a 2%, a partir desta solução retirou-se
3,38mL e elevado o volume final à 50mL. Esta diluição foi necessária para
obter-se como concentração final da solução 1g/L, valor de encontra-se
exatamente no centro da curva padrão. Então desta solução final retirou-se
500µL que foi transferido para tubo juntamente com 2,5mL do reativo DNS,
este tubo permaneceu em banho-maria por 10 minutos e depois de resfriado
adicionou-se 3mL de água destilada, realizou-se, então, leitura em
espectrofotômetro (PG Instruments, marca T80+) em comprimento de onda de
600nm.
2.3.4 Análise estatística
Os resultados foram avaliados estatisticamente por meio da análise de
variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey em nível de
significância de 1% de probabilidade, com o auxílio do programa BioEstat 5.0.
3. Resultados e Discussões
Os resultados da caracterização físico-química do mel de flores de Eucalipto
podem ser visualizados na Tabela 4.
29
Tabela 4. Análises físico-químicas de caracterização do mel de flores de Eucalipto
Análises Valores médios Legislação1
Sólidos solúveis totais
(°Brix)
80,00 -
Umidade (%) 19,00 Max. 20
Acidez titulável (m.Eq/Kg) 54,58 Max. 50
Indice de formol 7,05 -
pH 3,95 -
1Instrução Normativa do Ministério da Agricultura e do Abastecimento (Brasil, 2000).
Por meio do índice de refração foi possível determinar a quantidade de
sólidos solúveis presente na amostra e está relacionado basicamente à
quantidade de açúcar solúvel. Sua determinação é importante pelo fato do
consumidor ter preferência em méis mais doces (SILVA et al, 2009). Este mel
pode ser considerado doce, já que obteve-se 80 °Brix. Na legislação vigente de
méis, não existe valor determinado para este parâmetro. Por meio da leitura da
escala do índice de refração foi obtido o teor de umidade do mel de acordo com
a Tabela de Chataway.
A umidade se apresentou dentro do valor máximo da legislação
brasileira. A umidade dos méis é influenciada pela origem botânica, por
condições climáticas, pela época de colheita e pelo grau de maturação do mel,
sendo um parâmetro de grande importância durante o armazenamento do
produto. Teor de umidade abaixo de 21% evita processos indesejáveis de
fermentação do mel (SODRÉ et al., 2007).
A acidez do mel analisado está acima do padrão estabelecido pela
legislação brasileira (BRASIL, 2000). Evangelista-Rodrigueset al. (2005)
avaliaram duas amostras de méis produzido na Paraíba por Apis mellifera e
obtiveram valores de 41,66 e 35,00 mEq kg-1, valores menores que o
determinado neste trabalho. Segundo o autor a origem da acidez do mel deve-
se à variação dos ácidos orgânicos causada pelas diferentes fontes de néctar,
pela ação da enzima glicose-oxidase que origina o ácido glucônico, pela ação
das bactérias durante a maturação do mel e ainda a quantidade de minerais
presentes no mel.
Por meio da determinação do índice de formol avalia-se indiretamente a
presença de compostos como proteínas, aminoácidos e peptídeos. Esta
30
análise é importante, pois se verifica que quando o índice é muito baixo
significa que o mel apresenta produtos artificiais e se for muito alto é sinal que
as abelhas foram alimentadas com hidrolisado de proteínas, e não é permitido
(CARVALHO, 2005; SODRÉ, 2005).
Segundo Marchini et al. (2004), todos os méis são ácidos e o pH é
influenciado pela origem botânica e concentração de diferentes ácidos na sua
composição, além de estar relacionado com a velocidade de formação do HMF
no mel. Em geral, todos os méis apresentam pH baixo, sendo formados por
ácidos orgânicos, alguns voláteis e outros inorgânicos . Esta característica do
mel pode ser influenciada pela sua origem, sendo geralmente inferior a 4,00
para mel de origem floral (CARVALHO 2005). Mesmo o valor de pH não esteja
atualmente descrito na legislação vigente como análise obrigatória no controle
de qualidade dos méis brasileiros, apresenta-se como valor necessário como
variável auxiliar para avaliação da qualidade, pois é um parâmetro de
importância na extração e no armazenamento do mel. O pH influencia na
estabilidade, textura e vida de prateleira do mel, visto que valores alterados de
pH podem indicar fermentação ou adulteração do mel de abelhas (WELKE et
al., 2008).
Os resultados das análises de comparação de métodos de determinação
de açúcares redutores, realizadas em quadruplicada, podem ser observados na
Tabela 5. A legislação estabelece o mínimo de 65% de açúcares redutores
para os méis florais de Apis mellifera.
Tabela 5. Valores do teor de açúcares redutores em mel de flores de Eucalipto, seguido do desvio padrão.
Método Lane-Eynon M Lane-Eynon I DNS Somogyi-
Nelson
Média AR*
(%)
65.8647 ±3,12a 74.2703 ±1,28b 75.7550 ±1,28b 74.6875 ±1,37b
Letras iguais indicam que as médias não diferem significativamente em nível de 1% de significância. *AR-
açúcar redutor.
Os métodos apresentaram diferenças significativas a 0,01 p=0,001158.
O teste de Tukey realizado pelo programa de estatística Bioestat 5.0, detectou
diferença significativa apenas no método Lane-Eynon Manual em relação aos
demais, observando-se a Figura 3, fica evidente essa diferença.
31
Figura 4.Comparação dos métodos de determinação de açúcares redutores em mel de flores de Eucalipto
Isso pode ter ocorrido devido à erros causados pelo analista, uma vez
que o método Lane-Eynon manual exige certa prática na detecção do ponto de
equivalência da titulação, característico pela coloração vermelho-tijolo. Dessa
forma, sabe-se que as demais metodologias testadas apresentaram resultados
semelhantes, contudo no ponto de vista econômico é indicado utilizar o método
Lane-Eynon instrumental, uma vez que torna a análise mais econômica e
padrão, por ser determinada instrumentalmente pelo aparelho chamado de
Redutec. Muitas indústrias de alimentos, já adotaram esse método prático e
econômico, para avaliar a qualidade e a padronização de seus produtos.
O método Somogyi-Nelson apresenta vantagem sobre o Lane-Eynon,
quando trata-se de grande quantidade de amostras, pois este permite analisar
várias amostras simultaneamente, diferentemente do método Lane- Eynon,
contudo é utilizado principalmente para quantificação em amostras com teores
mais reduzidos de açúcares, devido á sua sensibilidade.
A determinação realizada pelo método de DNS iguala-se ao Lane-Eynon
(instrumental) em relação ao desvio padrão, aquele pode ser considerado mais
prático, uma vez que permite analisar várias amostras ao mesmo tempo,
contudo fica em desvantagem devido ao alto custo do reagente utilizado.
4. Conclusão
Com base nos métodos de determinação de açúcares redutores
apresentados, os métodos Somogyi-Nelson e DNS mostraram-se mais práticos
Lane-Eynon (M)
Lane-Eynon (I)
Somogyi-Nelson
DNS
60 62 64 66 68 70 72 74 76 78
Percentagem de Açúcares Redutores
Méto
do
s
32
e rápidos; os métodos Lane-Eynon manual e instrumental são considerados
mais econômicos, contudo menos precisos. Assim conclui-se que a melhor
alternativa, do ponto de vista analítico, é o método DNS.
