UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU PROGRAMA DE ......dieta proteica predominantemente animal apresentou...

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

CURSO DE DOUTORADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA

JUREMA CARMONA SATTIN CURY

EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO E DE DIFERENTES

DIETAS PROTEICAS SOBRE O VENTRÍCULO ESQUERDO DE

RATAS IDOSAS OVARIECTOMIZADAS. ASPECTOS

BIOQUÍMICOS, MORFOLÓGICOS, ULTRAESTRUTURAIS E

IMUNOHISTOQUÍMICOS

São Paulo

2015

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

CURSO DE DOUTORADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA

JUREMA CARMONA SATTIN CURY

EFEITOS DO TREINAMENTO RESISTIDO E DE DIFERENTES

DIETAS PROTEICAS SOBRE O VENTRÍCULO ESQUERDO DE

RATAS IDOSAS OVARIECTOMIZADAS. ASPECTOS

BIOQUÍMICOS, MORFOLÓGICOS, ULTRAESTRUTURAIS E

IMUNOHISTOQUÍMICOS

Tese apresentada ao Programa de

Doutorado em Educação Física da

Universidade São Judas Tadeu como

requisito à obtenção do título de Doutor em

Educação Física.

Área de Concentração: Escola, Esporte,

Atividade Física e Saúde.

Linha de Pesquisa: Atividade Física e

Disfunções Orgânicas

Orientadora: Profª. Drª Laura Beatriz

Mesiano Maifrino.

São Paulo

2015

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca

da Universidade São Judas Tadeu Bibliotecária: Daiane Silva de Oliveira - CRB 8/8702

Cury, Jurema Carmona Sattin

C982e Efeitos do treinamento resistido e de diferentes dietas

proteicas sobre o ventrículo esquerdo de ratas idosas

ovariectomizadas. Aspectos bioquímicos, morfológicos,

ultraestruturais e imunohistoquímicos / Jurema Carmona Sattin

Cury. - São Paulo, 2015.

122 f. : il. ; 30 cm.

Orientadora: Laura Beatriz Mesiano Maifrino.

Tese (doutorado) – Universidade São Judas Tadeu, São

Paulo, 2015.

1. Coração. 2. Dieta. 3. Exercícios. 4. Menopausa. I. Maifrino, Laura

Beatriz Mesiano. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-

Graduação Stricto Sensu em Educação Física. III. Título

CDD 22 – 613.71

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho aos meus pais, Gílio e Maria exemplos de amor e união, que me

ensinaram os valores de ética, caráter e respeito, pilares fundamentais de minhas

conquistas.

Ao meu marido Paulo, por toda a felicidade, parceria e paixão que agregou em minha

vida, fazendo de nossa convivência um constante namoro.

Aos meus filhos, Bruno e Pedro, amores incondicionais, pessoas inspiradoras que me

trazem o melhor sentido no crescimento intelectual, emocional e espiritual.

AGRADECIMENTOS

À Profª. Drª Laura Beatriz Mesiano Maifrino, por quem tenho profunda admiração

e respeito, agradeço aos ensinamentos, a compreensão, ao empenho e a dedicação

que estiveram presentes durante toda a orientação e desenvolvimento desse trabalho.

Obrigada pela amizade e confiança demonstrada e pela oportunidade de crescimento

intelectual e pessoal que me concedeu.

À Profª Drª Maria Luiza de Jesus Miranda, Coordenadora do Programa de Pós-

Graduação Stricto Sensu em Educação Física da Universidade São Judas Tadeu pelo

incentivo e apoio ao meu ingresso no Doutorado.

À Universidade São Judas Tadeu pela oportunidade e apoio, e pela concessão

da Bolsa de Estudos e dos subsídios necessários para a realização deste trabalho.

Ao Prof. Antonio José da Silva, da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da

Universidade São Judas Tadeu, pelo incentivo e apoio.

Ao Pró-Reitor de Graduação na época do meu ingresso, Prof.

José Reinaldo Altenfelder Silva Mesquita, pelo apoio e confiança.

Ao Pró-Reitor de Graduação e Diretor das Faculdades de Ciências Biológicas e

da Saúde da Universidade São Judas Tadeu e colega de turma, Prof. Luis Antonio

Baffile Leoni pelo apoio e incentivo.

Aos professores do Departamento de Pós-Graduação Stricto Sensu em

Educação Física da Universidade São Judas Tadeu, pela troca de conhecimentos,

empenho e dedicação expressados, em especial à Profª Drª Cláudia Borim da Silva

pela orientação no tratamento estatístico aplicado nesse trabalho.

A todos os funcionários do Departamento de Pós-Graduação Stricto Sensu em

Educação Física da Universidade São Judas Tadeu, em especial Simone Sevilha Riva

e Daniel Augusto César por toda a assistência e cordialidade.

Ao Supervisor dos laboratórios da Área da Saúde da Universidade São Judas

Tadeu, André Hahne, pelo interesse, apoio, dedicação e competência.

A todos os funcionários dos Laboratórios da Área de Saúde da Universidade São

Judas Tadeu, em especial à Maria Leide Costa, do Biotério, por todo o apoio e brilhante

trabalho, que muito contribuiu para a realização deste estudo.

Aos técnicos em microscopia eletrônica Edson Rocha e Gaspar Ferreira de Lima

do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo pela seriedade e

competência aplicadas em etapas importantes desse estudo.

Às minhas queridas ex-alunas Glaucia Figueiredo Braggion e Elisabete Ornelas

que com extremo orgulho compartilho amizade e o desenvolvimento dessa pesquisa

nesse curso de Pós-Graduação, reiterando minha admiração e respeito por todo o

comprometimento, conduta e profissionalismo presente em vocês.

À Pós-Graduanda Nathália Edwiges Alves de Lima, companheira de biotério e

de pesquisas, por toda a dedicação e contribuição com competência e compromisso na

execução do nosso projeto e no desenvolvimento do nosso trabalho.

À Pós-Graduanda e também ex – aluna Gabriela Bexiga, pelo incentivo e apoio.

Aos alunos de iniciação científica que participaram da etapa de cuidados com os

animais, meus agradecimentos pelo cuidado e carinho dispensados a esse estudo.

Aos colegas de Pós-Graduação Valéria Tanasov e Leandro Gonçalves pelo

otimismo e generosidade sempre demonstrados.

Aos membros das bancas do Exame de Qualificação e da Defesa desse

trabalho, Profª. Drª. Flávia de Oliveira, Prof. Dr. Fernando Luiz Affonso Fonseca, Profª.

Drª. Eliane Florêncio Gama, Profª. Drª. Rita de Cássia Aquino, Profª. Drª. Lucila Simardi

e Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza por todo o cuidado, carinho e atenção

dispensados na leitura do mesmo e pelas valiosas contribuições que agregaram a ele.

Ao meu amigo Prof. Jonas Joaquim pelo companheirismo e compreensão na

condução dessa etapa profissional.

Á minha mãe Maria Carmona Sattin, minha sogra Therezinha Rigato Cury e

meus cunhados Maria Heloísa Cury Nunes e Salvador Nunes Gentil, pela compreensão

no entendimento de minhas ausências e angústias ao longo dessa pesquisa.

A todos os meus amigos pessoais que apoiaram e incentivaram, trazendo força e

coragem nessa etapa.

Aos meus filhos Bruno Sattin Cury e Pedro Luiz Sattin Cury que generosamente

compartilharam sua compreensão e conhecimento contribuindo para essa conquista.

Ao meu marido Paulo Eduardo Cury por toda a parceria, cumplicidade, apoio,

dedicação e amor sempre presentes, com quem divido mais essa realização.

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.”

Albert Eistein

RESUMO

CURY JCS. Efeitos do treinamento resistido e de diferentes dietas proteicas

sobre o ventrículo esquerdo de ratas idosas ovarectomizadas. Aspectos

bioquímicos, morfológicos, ultraestruturais e imunohistoquímica. [tese]. Curso de

Doutorado da Universidade São Judas Tadeu. São Paulo. 122, 2015.

As doenças cardiovasculares (DCV) integram o grupo das doenças crônicas não

transmissíveis que apresentam maiores índices de mortalidade no Brasil e no mundo,

afetando principalmente a população idosa. Nas mulheres além das alterações

promovidas pelo envelhecimento, as modificações endócrino funcionais moduladas pelo

processo da menopausa, contribuem para uma maior incidência das DCV nesse grupo.

É consenso que a alimentação adequada e a atividade física constituem importantes

intervenções no tratamento e prevenção dessas doenças. Assim, o objetivo do presente

trabalho foi avaliar os efeitos do treinamento resistido e de diferentes dietas proteicas

sobre o ventrículo esquerdo de ratas ovariectomizadas quanto aos parâmetros

biométricos, bioquímicos, histomorfométricos, ultraestruturais e imunohistoquímicos.

Foram utilizadas 64 ratas linhagem Wistar, divididas em oito grupos: Grupo controle

vegetal sedentário (CVS), Grupo controle vegetal treinado (CVT) Grupo vegetal

ovariectomizado sedentário (VOS), Grupo vegetal ovariectomizado treinado (VOT),

Grupo controle animal sedentário (CAS), Grupo controle animal treinado (CAT), Grupo

animal ovariectomizado sedentário (AOS), Grupo animal ovariectomizado treinado

(AOT), de acordo com os protocolos de ovariectomia, dieta e treinamento resistido a

que foram submetidos durante 12 semanas. Ao término desse período, os animais

foram eutanasiados, o sangue coletado para as análises bioquímicas e amostras do

ventrículo esquerdo foram retiradas e preparadas para análises histomorfométricas,

ultraestruturais e imunohistoquímicas. Os dados obtidos para cada grupo foram

tabulados e comparados estatisticamente pelo teste ANOVA e post hoc de Tukey com

nível de significância de p < 0,05. Nossos resultados mostraram a influência da

ovariectomia e, portanto, da supressão hormonal no ganho de massa corporal e de

massa do tecido adiposo visceral independente da dieta, que não foram revertidos pela

intervenção do treinamento. O grupo ovariectomizado sedentário submetido a dieta

predominantemente animal apresentou tendência ao aumento da massa cardíaca e

ventricular esquerda. O treinamento resistido aplicado nesse grupo confirmou essa

tendência, diferentemente do grupo ovariectomizado de dieta predominantemente

vegetal, em que tal intervenção promoveu a redução da massa ventricular esquerda,

sugerindo assim um ajuste mais adequado. Embora não se tenha observado alterações

nos parâmetros bioquímicos entre os vários grupos com as intervenções propostas, os

índices glicêmicos exibiram melhores valores nos grupos ovariectomizados treinados.

Em relação aos aspectos morfométricos, o grupo ovariectomizado treinado submetido a

dieta proteica predominantemente animal apresentou maior densidade de volume dos

capilares e menor densidade de volume do interstício quando comparado ao grupo

ovariectomizado submetido à dieta proteica predominantemente vegetal, indicando

assim uma melhor condição do tecido cardíaco, fato também confirmado em relação às

porcentagens das densidades de volume e da distribuição das fibras colágenas do tipo I

e do tipo III no miocárdio desses animais. Nossos dados revelaram que o treinamento

resistido associado às dietas proteicas predominantemente animal e vegetal mostrou-se

eficiente em relação às respostas biométricas, bioquímicas morfométricas e

imunohistoquímicas apresentadas pelas ratas idosas ovariectomizadas estudadas em

nosso trabalho, sugerindo assim, que tal associação possa constituir uma interessante

estratégia de intervenção não farmacológica no tratamento de mulheres

menopausadas, uma vez que propiciou melhorias na condição cardíaca, embora o

maior impacto desse benefício tenha sido conferido aos animais que consumiram a

dieta proteica predominantemente animal.

PALAVRAS-CHAVE: coração, dieta, exercícios, menopausa

ABSTRACT

CURY JCS. Effects of resistance training and different protein diets on the left

ventricle of ovariectomized rats elderly. Biochemical, morphological,

ultrastructural and immunohistochemical aspects. [thesis]. Doctoral Course of the

São Judas Tadeu University. Sao Paulo. 122, 2015.

Cardiovascular diseases (CVD) in the group of chronic noncommunicable diseases with

the highest mortality rates in Brazil and worldwide, affecting mainly the elderly

population. In women beyond the changes brought about by aging, functional endocrine

changes modulated by the menopause process, contribute to a higher incidence of CVD

in this group. There is consensus that proper nutrition and physical activity are important

interventions in the treatment and prevention of these diseases. The objective of this

study was to evaluate the effects of resistance training and different protein diets on the

left ventricle of ovariectomized rats as biometric, biochemical, morphometric,

ultrastructural and immunohistochemical parameters. 64 Wistar rats were used, divided

into eight groups: sedentary vegetable control Group (CVS), trained vegetable control

Group (CVT) sedentary ovariectomized vegetable Group (VOS), trained ovariectomized

vegetable Group (VOT), sedentary animal control Group (CAS) trained animal control

Group (CAT), sedentary ovariectomized animals Group (AOS), trained ovariectomized

animals Group (AOT), according to the ovariectomy protocols, diet and resistance

training that were submitted for 12 weeks. At the end of this period, the animals were

euthanized, the blood is collected for biochemical analysis and left ventricular samples

were taken and prepared for histomorphometric, ultrastructural and

immunohistochemical analyzes. The data obtained for each group were tabulated and

compared statistically by ANOVA and post hoc Tukey with a significance level of p

<0.05. Our results showed the effect of ovariectomy and therefore the hormone

suppression in body weight gain and mass independent of visceral adipose tissue of the

diet, were not reversed by intervention training. The ovariectomized sedentary group

subjected to predominantly animal's diet showed a tendency to increased cardiac and

left ventricular mass. Resistance training applied in this group confirmed this trend,

unlike the ovariectomized group of predominantly vegetable diet in which such

intervention promoted the reduction of left ventricular mass, thus suggesting a more

appropriate setting. Although no observed changes in biochemical parameters between

the various groups of the proposed interventions, the glycemic index showed best

values in trained ovariectomized. Regarding morphometric, the ovariectomized group

trained subjected to predominantly animal protein diet showed higher volume density of

capillaries and lower interstitial volume density when compared to the ovariectomized

group submitted to protein diet predominantly vegetable, thus indicating a better

condition of the heart tissue , a fact also confirmed in relation to the percentage of the

volume densities and distribution of collagen fibers type I and type III in the myocardium

of these animals. Our data revealed that resistance training associated with protein diets

predominantly animal and vegetable was efficient in relation to biometric, biochemical

responses morphometric and immunohistochemical presented by ovariectomized old

female rats studied in our work, thus suggesting that this association can be an

interesting strategy non-pharmacological intervention in the treatment of menopausal

women, since it provided improvements in cardiac condition, although this benefit the

greatest impact has been given to animals fed predominantly animal protein diet.

KEYWORDS: heart, diet, exercise, menopause

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Delineamento do estudo, modelo de formação dos grupos experimentais. .. 35

Figura 2 - Equipamento utilizado para realização do treinamento resistido. ................. 37

Figura 3 - Modelo de carga utilizada durante o treinamento resistido e forma de fixação à base da cauda do animal. .......................................................................................... 38 Figura 4 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400, onde foi medida a área da secção transversa do miócito (µm2), submetida ao software Axion Vision 4.8, Zeiss. ............................................................ 45 Figura 5 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus e aumento de x400 em microscópio de luz polarizada.Barra com 50 µm. .. 46 Figura 6 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus em aumento de x 400 em microscópio de luz polarizada, aplicado o software Image Pró- Plus e sobre ele o software Image J. Barra com 50 µm .............................. 46 Figura 7 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400 submetida ao software Image J. ................................................. 47 Figura 8 - Variação da massa corporal após 8 meses de ovariectomia nos grupos C6M (controle 6 meses), C14M (controle 14 meses) e CO14M (controle ovariectomizado 14 meses). Valores representam média ± EPM. ap<0.05 vs C6M; bp< 0.05 vs C14M. ....... 52

Figura 9- Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corados em H/E em aumento de x400 dos vários grupos, evidenciando cardiomiócitos (cabeça de seta vermelha), interstício (cabeça de seta verde) e capilares sanguíneos (cabeça de seta amarela). Barra: 50 µm ................................................................................................. 67 Figura 10 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em Picrosiruss em aumento de x400 dos animais dos vários grupos, evidenciando em vermelho e alaranjado as fibras colágenas do tipo I e em verde as fibras colágenas do tipo III, presentes no miocárdio. Barra: 50 µm ............................................................... 72 Figura 11 - Histograma da distribuição de frequências do diâmetro das fibras colágenas do tipo III (FCIII), Intermediária (FC Int), e tipo I (FCI), presentes no miocárdio dos animais estudados. ....................................................................................................... 73 Figura 12 – Ultramicrografia eletrônica do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x12000 evidenciando a distribuição das fibras colágenas do tipo I (de maior diâmetro) e das fibras colágenas do tipo III (de menor diâmentro) nos vários grupos estudados. Barra de 10nm. ........................................................................................... 75 Figura 13 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x100 evidenciando a expressão da MMP2 nos vários grupos estudados. Barra de 10µm. .... 76 Figura 14 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x100 evidenciando a expressão da MMP9 nos vários grupos estudados. Barra de 10µm. .... 77 Figura 15 - Análise semi-quantitativa da expressão das MMP-2 e MMP-9 no miocárdio....................................................................................................................................... 78 Figura 16 - Síntese dos efeitos promovidos pelo treinamento resistido associado aos dois tipos de dieta nos animais ovariectomizados. ........................................................ 93

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Esquema de progressão de carga de treinamento resistido para os animais dos grupos CVT, CAT, VOT e AOT. .............................................................................. 39

Quadro 2 Comparação dos ingredientes das dietas oferecidas aos animais. ............... 40

Quadro 3 Composição centesimal das rações oferecidas aos animais de estudo por kg de produto. .................................................................................................................... 41

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Escore para análise da imunoexpressão das MMP2 e MMP9. .................... 50

Tabela 2- Valores biométricos dos animais submetidos a dieta com proteina vegetal. . 53

Tabela 3 - Valores biométricos dos animais submetidos a dieta com proteina predominantemente animal. .......................................................................................... 54

Tabela 4 - Comparação dos valores biométricos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal. ........................................................... 56

Tabela 5 - Valores bioquímicos dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal.57

Tabela 6 - Valores bioquímicos dos animais submetidos a dieta com proteína predominantemente animal ........................................................................................... 58

Tabela 7 - Comparação dos valores bioquímicos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal. ........................................................... 60

Tabela 8 - Valores morfométricos dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal....................................................................................................................................... 61

Tabela 9 - Valores morfométricos dos animais submetidos à dieta com proteína predominantemente animal. .......................................................................................... 63

Tabela 10 - Comparação dos valores morfométricos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal. ................................................. 65

Tabela 11- Valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal. ........ 68

Tabela 12 - Valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos a dieta com proteína animal. ......... 69

Tabela 13 - Comparação entre os valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal. ................................................. 70

LISTA DE SIGLAS

AOS Grupo dieta animal ovariectomizado sedentário

AOT Grupo dieta animal ovariectomizado treinado

AST Área da Secção Transversa

CAS Grupo controle dieta animal sedentário

CAT Grupo controle dieta animal treinado

CPK Creatinofosfoquinase

CVS Grupo controle dieta vegetal sedentário

CVT Grupo controle dieta vegetal treinado

DCNT Doenças Crônicas Não Transmissíveis

DCV Doença Cardiovascular

Dme Diâmetro menor do cardiomócito

HDL Hight Density Lipoprotein

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatísica

LDL Low Density Lipoprotein

MCF - 17 Massa Corporal Final aos 17 meses

MCI -14 Massa Corporal Inicial aos 14 meses

PCR-us Proteina C reativa ultrassensível

VE Ventrículo Esquerdo

VOS Grupo dieta vegetal ovariectomizado sedentário

VOT Grupo dieta vegetal ovariectomizado treinado

Vv [col I] Densidade de volume das fibras colágenas do tipo I

Vv [col III] Densidade de volume das fibras colágenas do tipo III

Vv[cap] Densidade de volume dos capilares

Vv[int] Densidade de volume do interstício

Vv[mio] Densidade de volume dos miócitos cardíacos

Vv[nuc] Densidade de volume nuclear

Δ% Delta Percentual de Massa Corporal

Sumário

Resumo

Abstrat

1 INTRODUÇÃO ..............................................................................................................................16

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................................18

2.1 DOENÇAS CRÔNICAS NÃO TRANSMISSÍVEIS E AS DOENÇAS CARDIOVASCULARES (DCNT) ........... 18 2.2 DOENÇAS CARDIOVASCULARES E MENOPAUSA ......................................................................... 19 2.3 CORAÇÃO E MENOPAUSA ......................................................................................................... 22 2.4 DIETA ..................................................................................................................................... 26 2.5 EXERCÍCIO .............................................................................................................................. 28 2.6 RELEVÂNCIA DO TRABALHO ...................................................................................................... 31

3. OBJETIVOS .................................................................................................................................32

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................................... 32 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 32

4. MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................................................33

4.1 ANIMAIS DO ESTUDO ................................................................................................................ 33 4.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL .................................................................................................... 33

4.2.1. Ovariectoma e colpocitologia ........................................................................................ 34 4.2.2 Formação dos grupos .................................................................................................... 34 4.2.3. Delineamento do Estudo. .............................................................................................. 35

4.3 PROTOCOLOS ......................................................................................................................... 36 4.3.1 Treinamento resistido .................................................................................................... 36 4.3.2 Dietas............................................................................................................................. 39

4.4 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS ......................................................................................................... 41 4.4.1 Retirada do coração e separação do ventrículo esquerdo............................................. 42 4.4.2 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia de Luz ................................ 42 4.4.3 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia Eletrônica .......................... 43 4.4.4 Processamento para Imunohistoqu ............................................................................... 43 ìmica ....................................................................................................................................... 43

4.5 ANÁLISES MORFOMÉTRICAS E ESTEREOLÓGICAS ....................................................................... 44 4.5.1 Área da secção transversa do miócito (AST) ................................................................. 44 4.5.2 Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[col]) .................................................... 45 4.5.3. Densidade de volume nuclear (Vv[nuc]), dos miócitos (Vv[mio]), do interstício (Vv[int])

e dos capilares (Vv[cap]) ........................................................................................................ 47 4.6 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ........................................................................................................... 48 4.7 ANÁLISES DAS ULTRAESTRUTURAS ........................................................................................... 48 4.8 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA METALOPROTEINASES 2 E 9 ................................................ 49 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................................................. 51

5. RESULTADOS .............................................................................................................................52

5.1 MASSA CORPORAL ................................................................................................................... 52 5.2 BIOMÉTRICOS .......................................................................................................................... 53

5.2.1.Dieta de proteina Vegetal .............................................................................................. 53 5.2.2.Dieta de proteina Animal................................................................................................ 54 5.2.3.Comparação entre as dietas .......................................................................................... 56

5.3 BIOQUÍMICOS .......................................................................................................................... 57 5.3.1.Dieta de proteina Vegetal .............................................................................................. 57 5.3.2.Dieta de proteina Animal................................................................................................ 58 5.3.3.Comparação entre dietas............................................................................................... 60

5.4 MORFOMÉTRICOS .................................................................................................................... 61 5.4.1.Dieta de proteina Vegetal .............................................................................................. 61 5.4.2.Dieta de proteina Animal................................................................................................ 63 5.4.3.Comparação entre dietas............................................................................................... 65

5.5 COLÁGENO ............................................................................................................................. 68 5.5.1.Dieta de proteina Vegetal .............................................................................................. 68 5.5.2.Dieta de proteina Animal................................................................................................ 69 5.5.3.Comparação entre dietas............................................................................................... 70 5.5.4.Diâmetro das fibras colágenas do tipo I e do tipo III ...................................................... 73

5.6 IMUNOEXPRESSÃO DAS METALOPROTEINASES 2 E 9 ( MMP2 E MMP9) ...................................... 76

6. DISCUSSÃO ................................................................................................................................80

7. CONCLUSÃO ..............................................................................................................................92

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................94

I n t r o d u ç ã o 1 6

1 INTRODUÇÃO

Alterações físicas e metabólicas decorrentes do envelhecimento podem conduzir

o organismo ao declínio de suas atividades e em consequência, perda de sua

autonomia e eficiência. O comprometimento fisiológico dessa fase do desenvolvimento

pode ser aferido pelos desequilíbrios funcionais e estruturais dos sistemas orgânicos,

viabilizando o aparecimento de doenças múltiplas e crônicas que afetam

progressivamente todos os órgãos, como osteoporose, diabetes mellitus tipo 2,

hipertensão arterial e em especial, as doenças cardiovasculares (LIMA-COSTA &

VERAS, 2003).

As doenças cardiovasculares (DCV) integram o grupo das doenças crônicas não

transmissíveis (DCNT), sendo que dentre essas, são reconhecidamente as que

apresentam os maiores índices de mortalidade no Brasil e no mundo, afetando

indivíduos de todos os níveis, em especial aos que pertencem a grupos vulneráveis

como os idosos (ANDRADE et al, 2013)

Além das alterações promovidas pelo envelhecimento, os indivíduos do sexo

feminino sofrem as modificações endócrino–funcionais determinadas pela menopausa,

exibindo quadros clínicos diferentes após essa etapa. A perda da função ovariana e

consequente redução da produção de estrógeno nas mulheres em pós-menopausa,

determinam uma elevação dos lipídios sanguíneos (MOZAFFARIAN et al, 2005;

SCHMIDT et al, 2011) e uma vulnerabilidade às DCV (MENDES et al, 2012).

A prevalência da hipertensão arterial em mulheres pós-menopausa assemelha-

se a dos homens, sendo que antes desse período, elas apresentavam menor primazia

quanto à hipertensão e doenças relacionadas, quando comparada a eles (ZANESCO &

ZAROS, 2009). As alterações do perfil lipídico, o ganho de peso, associado ao

sedentarismo e a deficiência de estrógenos podem ser alguns dos fatores

determinantes nessa mudança de perfil pré e pós-menopausa.

Significante impacto é conferido por uma dieta saudável na prevenção e

tratamento das DCV, assim como os benefícios determinados por pequenas melhorias,

também relevantes na diminuição do risco cardiovascular (SACKS et al 2006).

I n t r o d u ç ã o 1 7

A atividade física também parece contribuir positivamente nessa fase, pois

inúmeros trabalhos assinalam que os indivíduos fisicamente ativos desfrutam de uma

melhor qualidade de vida e menor taxa de mortalidade, resultando em uma maior

longevidade (MATSUDO & MATSUDO, 1992; ANTUNES, 2006). Assim, o exercício

físico regular pode intervir de forma positiva no tratamento ou prevenção de diversas

doenças senis como dislipidemias (OLIVEIRA et al, 2013), diabetes mellitus e

hipertensão arterial (MORVAN et al, 2013), dentre outras.

Considerando que o avanço da idade impõe modificações físicas e endócrinas

que podem alterar o equilíbrio metabólico do indivíduo, favorecendo o aparecimento de

DCV, a investigação das alterações impostas ao coração torna-se relevante no

esclarecimento desse quadro clínico.

Sabendo que a menopausa diminui a ação protetora do estrogênio sobre o

sistema circulatório feminino, que a dieta alimentar está estreitamente relacionada com

a saúde do indivíduo e que o exercício físico vem sendo considerado uma importante

intervenção não farmacológica na diminuição dos riscos das DCV, a importância deste

trabalho está em analisar as alterações estruturais do ventrículo esquerdo frente a

estes fatores, no intuito de podermos contribuir para o estabelecimento de estratégias

que possam minimizar estas alterações, visando interferir positivamente na melhora da

qualidade de vida da mulher.

Para tanto, a proposta desse trabalho é avaliar os efeitos do exercício resistido

no ventrículo esquerdo de ratas ovariectomizadas submetidas a dietas à base de

proteína vegetal e de proteína animal por meio de análises histomorfométrica,

estereológica e imunohistoquímica.

R e v i s ã o d e L i t e r a t u r a 1 8

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Doenças Crônicas Não Transmissíveis e as Doenças Cardiovasculares (DCNT)

A prevalência das DCNT tem aumentado mundialmente, atingindo proporções

epidêmicas COSTA & THULER (2012). Dados da Organização Mundial da Saúde

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010) apontam as DCNT como responsáveis por

63,0% (36 milhões) da mortalidade, projetando um aumento da ordem de 15% nesse

parâmetro em todo o mundo entre os anos de 2010 e 2020, que corresponderá a 44

milhões de mortes.

De acordo com o Ministério da Saúde (BRASIL. MS, 2011), as DCNT abrangem

um conjunto de doenças que não tem envolvimento de agentes infecciosos em sua

ocorrência, multiplicidade de fatores de risco comuns, histórico natural prolongado,

grande período de latência, longo curso assintomático com períodos de remissão e

exacerbação, podendo levar ao desenvolvimento de incapacidades.

O desenvolvimento dessas doenças na população mundial é resultado do

aumento da expectativa de vida, decorrente da melhoria nas condições de vida e do

acesso aos avanços tecnológicos e científicos pelos indivíduos (LOPEZ, 2005; WILSON

& SATTERFIELD, 2007), portanto, a prevalência das DCNT aumenta à medida que

avança o envelhecimento da população e que ocorre redução no número de óbitos

precoces, destacando-se como uma das principais causas de morte e com taxas de

mortalidade superior a todas as outras combinadas (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2010), tornando-se dessa forma ponto de interesse em Saúde

Pública (RIBEIRO et al , 2012).

Ainda de acordo com Ribeiro et al (2012), as condições de vida da população

brasileira sofreram o impacto do declínio da taxa de fecundidade, do aumento da

qualidade de vida e do maior acesso aos serviços de saúde resultando numa maior

possibilidade de envelhecimento desse grupo.

Considerando-se que no país a população idosa apresenta rápido crescimento,

aumentando de 8,6% para 11% em dez anos (Brasil, I. B. G. E. (2015). Censo


demográfico, 2010), verifica-se um maior foco no controle dessas doenças, que lideram

como principal causa de morte e incapacidade em idosos, mesmo havendo controle de

alguns fatores de risco, ou ainda maior acesso dessa população à atenção primária.

Recentemente um plano de ações estratégicas de caráter preventivo e de

promoção à saúde, foi publicado pelo Ministério da Saúde (BRASIL. MS, 2011), visando

enfrentar e deter essas doenças e as morbidades a elas relacionadas. Entre estas

ações estão o monitoramento de fatores de risco, orientação de dietas saudáveis,

prática de atividade física, redução do tabagismo e do etilismo.

Constata-se assim um aumento da longevidade e do crescimento da população

idosa tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento favorecendo a

ocorrência das DCNT, com destaque para as DCV cujos índices de mortalidade no

Brasil e no mundo são elevados, afetando indivíduos de todos os níveis, em especial os

idosos, grupo de maior vulnerabilidade (ANDRADE et al,2013).

No Brasil, o aumento no número de idosos é atrelado ao aumento significativo da

prevalência das DCNT, dentre elas as DCV que se destacam como a primeira causa de

morte em ambos os sexos em todas as regiões do país (TIMERMAN et al, 2001).

Durante o processo de envelhecimento o sistema cardiovascular está sujeito a

várias alterações como a diminuição do desempenho cardíaco, da distensibilidade da

aorta e das grandes artérias, hipertrofia e dilatação do ventrículo esquerdo e disfunção

dos mecanismos neuro-humorais de controle cardiovascular. Essas modificações

morfológicas e funcionais em conjunto relacionam-se ao desenvolvimento da

hipertensão, da doença coronariana e da insuficiência cardíaca, determinando nos

idosos a maior incidência das DCV (IRIGOYEN et al, 2000; WICHI et al, 2009;

MOSTARDA et al, 2009).

2.2 Doenças Cardiovasculares e Menopausa

Além das alterações promovidas pelo envelhecimento, os indivíduos do

sexo feminino sofrem as modificações endócrino–funcionais determinadas pela

menopausa, exibindo quadros clínicos diferentes após essa etapa. A perda da função


ovariana e consequente redução da produção de estrógeno nas mulheres em pós-

menopausa, determinam uma elevação dos lipídios sanguíneos (MOZAFFARIAN et al,

2005; SCHMIDT et al, 2011) e uma fragilidade às DCV (MENDES et al, 2012).

Vários trabalhos experimentais demonstraram maior proteção cardiovascular

exibida por indivíduos do sexo feminino antes da supressão dos hormônios ovarianos,

condicionada pelo advento da menopausa (KUO et al, 1999; GREGOIRE et al, 1996;

LEINWAND, 2003).

A preponderância da hipertensão arterial em mulheres pós-menopausa

assemelha-se a dos homens, sendo que antes desse período, elas apresentavam

menor prevalência de hipertensão e doenças relacionadas, quando comparada a eles

(ZANESCO & ZAROS, 2009).

O avanço da idade feminina está também associado com a obesidade, as

dislipidemias, à intolerância à glicose e à hipertensão (KO et al, 1997), e

comparativamente aos homens, apresentam prognósticos menos favoráveis, com maior

frequência de morte após o primeiro episódio cardíaco (WELTY, 2001).

As alterações do perfil lipídico, o ganho de peso, associado ao sedentarismo e a

deficiência de estrógenos podem ser fatores determinantes nessa mudança de perfil

pré e pós-menopausa (VERSIANI et al, 2013), destacando-se também a menor

capacidade de exercício, diminuição da força muscular, aumento a incidência do

diabetes e aumentado risco de DCV (SOWERS & LA PIETRA, 1994; ESHTIAGHI et al,

2010)

A privação do estrógeno nessa fase faz com que haja elevação nos níveis de

colesterol total, de lipoproteínas e de triglicerídeos, desenhando um perfil lipídico

extremamente favorável à aterogênese, em especial quando atrelada à hipertensão e

ao diabetes (PASQUALI et al, 1997; O’BRIEN & NGUYEN, 1997; OLIVEIRA &

MANCINI, 2005).

Estudos comparativos entre mulheres pré e pós-menopausa (STEVENSON et al,

1993; YAMAMOTO et al, 1999;) relacionando os níveis lipídicos e a idade, ressaltam a

dependência dessa variável na elevação desses níveis e ainda sugerem (OLIVEIRA &

JORGE, 2005) que a ocorrência da menopausa resulta no aumento do colesterol total e

do LDL (DE ALOYSIO et al, 1999).


O aumento nos níveis de LDL e triglicerídeos com a idade, principalmente nas

mulheres, já havia sido evidenciado (LUZ et al, 1990; BERTOLAMI et al, 1993;

MARTINS et al, 1997; VENTURINI et al, 2013), bem como o impacto determinante da

DCV na morbidade da população feminina a partir dos 50 anos (GORODESKI, 2002;

WOOTEN et al, 2011; SOAR, 2015).

Os estudos longitudinais de SCHULTE e cols (1999) e KANNEL (2000)

demonstraram que o aumento das doenças cardiovasculares encontra-se diretamente

relacionado aos níveis de colesterol plasmático, apontando principalmente para a

concentração das lipoproteínas (LDL e HDL) que transportam o colesterol no sangue

(BERTOLAMI, 2000).

A correlação entre lipoproteínas e as doenças cardiovasculares abrange a

resposta inflamatória, as alterações plaquetárias, as alterações do endotélio, a

formação de células espumosas e a formação de placas ateroscleróticas (BERTOLAMI,

2000; MARTINAZZO et al, 2013), mostrando-se um processo complexo que possui

vários fatores de risco envolvidos, como o tabagismo, o diabetes, a hipertensão arterial,

as dislipidemias e as concentrações elevadas de homocisteína (SCHAEFER, 2002;

BRUSTOLIN et al, 2010).

Níveis elevados de homocisteína, de proteína C reativa e de lipoproteína (a) são

também associados ao maior risco de DCV, e podem constituir como as dislipidemias,

marcadores de risco para esse evento (CASTRO et al, 2004).

Outros fatores de risco a serem considerados quanto às enfermidades crônicas

em especial as DCV são os hábitos alimentares, já que a dislipidemia, hipertensão,

diabetes e obesidade são desvios muitas vezes resultantes do consumo inapropriado

de colesterol, ácidos graxos saturados e lipídeos (CERVATO et al, 1997; MARTINS et

al,1997; MARCILLA DE PARADA et al,1999; FORNÉS et al,2000; GUEDES &

GUEDES,2001; GAGLIARDI, 2010).

Diversos trabalhos sugerem relação entre as características qualitativas e

quantitativas da dieta e a incidência de doenças crônicas, especialmente as que afetam

o sistema circulatório. (CERVATO et al, 1997; MUSTAD & KRIS-ETHERTON,2001;

SCHAEFER, 2002; VAN HORN al, 2008), especialmente em mulheres na pós

menopausa (MOZAFFARIAN et al, 2004;)


2.3 Coração e Menopausa

Além de assumir papel fundamental no ciclo reprodutivo feminino os hormônios

sexuais desempenham funções biológicas importantes, como no controle de episódios

depressivos (GRAZIOTTIN & SERAFINI, 2009), na redução dos fatores de risco de

comprometimento das doenças cardiovasculares e da aterosclerose (PHILLIPS et al.,

1997; STICE et al., 2009), e ainda como antioxidantes endógenos (YAGI, 1997;

HUANG et al., 1999; AGARWAL et al., 2008).

O estrógeno tem ação cardioprotetora agindo no metabolismo lipídico de forma a

inibir a proliferação das células musculares lisas dos vasos (ABU-TAHA et al., 2009),

assim como a inflamação e a atividade vasodilatadora, apresentando propriedades

antioxidantes que agem na recuperação de células endoteliais após lesões vasculares

(MEYER et al, 2006).

Dessa maneira, sua supressão possibilita o desenvolvimento de alterações na

pressão sanguínea, no perfil lipídico e na aterosclerose (MENDELSOHN & KARAS,

1999; MEYER et al, 2006).

A incidência de doenças arteriais, especialmente a aterosclerose pode levar,

dentre outros problemas, ao infarto do miocárdio (DE BIASE et al., 2007).

Vários estudos já haviam relacionado a privação dos hormônios ovarianos ao

aumento da pressão arterial e à ocorrência de eventos cardiovasculares nas mulheres

(WEISS, 1972; STAESSEN et al ,1997), demonstrando que a falta do estrógeno e

envelhecimento estão intimamente relacionados ao desenvolvimento de doenças

cardíacas femininas.

Donato et al (2008) relataram que os baixos níveis estrogênicos e o avanço da

idade favorecem a elevação das citocinas séricas como TNF-α e interleucina-6,

maximizando o processo inflamatório.

Sob o ponto de vista morfofuncional, alguns autores (GARDNER et al,2005;

LIOU et al, 2010) salientam que a ovariectomia propicia aumento da apoptose dos

cardiomiócitos. Sabe-se ainda que em relação ao sistema cardiovascular a idade

aumentada promove maior rigidez e ampliação da área de fibrose, depleção da função


contráctil, crescimento de espécies reativas de oxigênio e disfunção endotelial

(KNOWLTON & LEE, 2012).

Tais eventos agem negativamente na função cardíaca, comprometendo a

eficiência da contração, que se torna pior quanto maior for a porcentagem do colágeno

no interstício cardíaco (BROWER et al, 2006).

Speiser et al, (1991) localizaram 5 tipos de colágeno (I, III, IV, V e VI) no coração

humano adulto. O colágeno é a proteína estrutural mais presente na rede conjuntiva do

coração, particularmente o colágeno I e III, representando apenas 2 a 4% do total do

volume miocárdico (BORG & CAUFIELD, 1981; MEDUGORAC, 1982; MEDUGORAC &

JACOB,1983; ROBINSON et al., 1983; WEBER 1989; JANICKI et al. 1995; LEGRICE et

al. 1995; ROSSI et al. ,1998; PRADO et al. ,2003; BENEDICTO & BOMBONATO 2003;

SILVA, 2004). Encontrado principalmente nas artérias aorta e tronco pulmonar como

também na estrutura histológica cardíaca entre a musculatura atrial e ventricular e ainda

envolvendo individualmente os miócitos e os grupos de miócitos (MACCHIARELLI et al.,

2002). Esse tipo de organização das fibras mostra-se de fundamental importância para

a função ventricular modulando a contração e o relaxamento cardíaco, atrelando o

comportamento do miocárdio à proporção, tipo e diâmetro das fibras colágenas

presentes (BROWER et al, 2006).

O colágeno tipo I é formado por conjuntos de fibras grossas (com diâmetro médio

de 2 a 10 µm) e têm como principal função a resistência à tensão (PARRY & CRAIG,

1998), enquanto que o colágeno do tipo III formado por conjuntos de fibras finas (com

diâmetro médio de 0,5 a 2,0 µm), tendo como função a formação de uma delicada rede

de sustentação celular (MONTES, 1996; ALBERTS et al; 2002).

No modelo proposto pelo grupo do Prof. Pietro Motta em 2001, uma trama

tridimensional de fibras colágenas envolveria os miócitos e os capilares, sendo dessa

forma responsável por muitas propriedades visco elásticas do coração, evitando o

excessivo estiramento ou lesão dos miócitos (MACCHIARELLI et al, 2002).

Pesquisas de Clausen (1963), Vezár (1969); Medugorac (1982), Dolber e Spach

(1987), e Debessa et al. (2001) indicaram que deposição do colágeno cardíaco é

estimulada pela idade, alertando que o envelhecimento do indivíduo promove o

aumento dessa proteína no coração, favorecendo o risco de morte por acidente


cardiovascular devido a alterações morfológicas no tecido, que interferem em sua

fisiologia.

Complementando esse raciocínio, os trabalhos de Becker e Anderson (1983),

Thomas (1987) e Debessa et al. (2001) reforçam modificações não só quantitativas,

mas também qualitativas no colágeno cardíaco determinadas por um remodelamento

muscular nesse órgão, embora Burgess (2001) considere a fibrose cardíaca como fator

determinante das alterações.

O processo de envelhecimento também altera as características do tecido

conjuntivo, aumentando o diâmetro das fibrilas de colágeno, diminuindo a linearidade

das bainhas do miócito e aumentando a desorganização estrutural desse tecido

(DEBESSA, 2001; De SOUZA, 2002; MASSON et al, 2005).

A concentração de colágeno ventricular é proporcional à variação de colágeno de

cada ventrículo cardíaco, podendo sofrer alterações com a idade, estados patológicos e

fisiológicos compensatórios, que são temporários (DINIZ et al, 2011).

Sabe-se que variações nas quantidades de colágeno ou nas proporções relativas

de seus tipos, podem promover importantes efeitos quanto às propriedades mecânicas

do coração, como na hipertrofia ventricular, em que a concentração de colágeno no

ventrículo esquerdo passa de 1,8% para 2,6% (SHIRWANY & WEBER, 2006).

Denomina-se insuficiência cardíaca a uma doença que acomete

predominantemente os idosos (KANNEL, 2000) e que impõe um remodelamento

estrutural e funcional do miocárdio. Esse remodelamento está centrado nas alterações

das propriedades da matriz extracelular cardíaca, constituída basicamente por fibras

colágenas que são protagonistas desse evento (CAULFIELD & BORG,1979; JALIL et

al,1989; GRAHAM & TRAFFORD,2007).

As propriedades de extensão cardíaca e a correta forma do miócito são

garantidas pela matriz extracelular cardíaca, conferindo resistência ao tecido, que pode

alterar as funções sistólica e diastólica do coração (ROBINSON et al, 1986). Tais

alterações podem ocorrer mesmo na ausência de disfunção contráctil do miócito

(BAICU et al, 2003) pela presença do colágeno tipo III, que estabelece relação inversa

à função ventricular (BURGUESS et al, 1996).


De acordo com Montes (1996) as diferenças quanto ao diâmetro das fibras

colágenas I e III, promovem modificações em seu entrelaçamento e disposição espacial

evidenciando que, quanto maior concentração de fibras do tipo I, mais resistente à

tração será o tecido, quando comparado com maior concentração do tipo III.

A fibrose intersticial ou o acúmulo do colágeno, em geral resulta em rigidez

ventricular e redução da complacência do miocárdio (BROWER et al, 2006), enquanto

que sua depleção promove modificações nos miócitos e dilatação ventricular (SPINALE,

et al, 1999; GRAHAM et al, 2007).

O equilíbrio entre a síntese e a degradação de colágeno determina a

manutenção da homeostase na matriz extracelular cardíaca, sendo que as

metaloproteinases são enzimas-chave responsáveis pela degradação dessa matriz,

ajustadas pelos seus inibidores (SPINALE, et al, 1998; QUEREJETA et al, 2004).

O avanço da idade conduz a uma fibrose que resulta em maior rigidez passiva do

miocárdio e insuficiência diastólica (CAPPELLI et al, 1984; CIESLIK et al, 2011) sendo

que os níveis das metaloproteinases e de seus inibidores antes do início da doença

cardíaca, podem influir decisivamente na resposta da matriz ao comprometimento

cardíaco (HAYASHIDANI et al, 2003; IKONOMIDIS et al, 2005; KANDALAM et al, 2010;

KOSKIVIRTA et al, 2010).

Assim, as alterações no perfil do colágeno miocárdico decorrentes do

envelhecimento são moduladas pelas metaloproteinases e seus inibidores, que

interferem diretamente sobre o resultado da remodelação cardíaca (LINDSEY et al,

2005).

HORN et al (2012), num estudo que investigou o impacto do envelhecimento e

da insuficiência cardíaca sobre o conteúdo de colágeno na matriz extracelular cardíaca,

indicaram que a idade aumentada promove dilatação cardíaca, redução da

contractilidade, alterações na fibrilogênese e no processamento de colágeno. Os

autores também sugerem que a idade deve ser considerada na pesquisa cardíaca

experimental e no desenvolvimento de intervenções terapêuticas visando corrigir a

remodelação da matriz extracelular cardíaca nas doenças cardíacas.

A carência do estrógeno possibilita a reação inflamatória vascular, promovendo

hiperplasia e consequentemente o espessamento da camada íntima, a partir de células


musculares lisas (COSTA& FAGUNDES, 2002), contribuindo assim para a diminuição

da luz arterial, limitando o fluxo sanguíneo (COSTA & FAGUNDES, 2002; CARAMORI

et al, 1997) e dessa maneira, favorecendo o estabelecimento da aterosclerose a partir

dessas disfunções endoteliais.

Em resposta à sobrecarga hemodinâmica crônica ocorre a remodelação cardíaca

com a hipertrofia do miocárdio, caracterizada por alterações morfofuncionais do coração

que, inicialmente apresenta-se como um importante mecanismo na manutenção da

função cardíaca em resposta ao aumento de carga, mas que a longo prazo, aumenta o

risco de morbimortalidade (PFEFFER & BRAUNWALD, 1990; ZORNOFF et al, 2002).

Vários trabalhos experimentais são encontrados atrelando a ação dos

estrógenos e dos fitoestrógenos sobre o sistema reprodutor das ratas, porém poucos

avaliam os efeitos estrogênicos sobre o músculo cardíaco (NGUYEN et al, 2012).

2.4 Dieta

A dieta apresenta-se como um fator crítico na área da pesquisa em saúde.

Estudos já revelaram a associação da dieta à etiologia de importantes

comprometimentos como dislipidemia e obesidade, podendo atuar também como

agravante do diabetes melitus (KANNEL, 2000; KRIS-ETHERTON et al, 1988; SJOL et

al, 1991; BOLTON-SMITH et al, 1992).

Parâmetros bioquímicos como a glicemia e o perfil lipídico podem apresentar-se

alterados no indivíduo idoso e, modificações na qualidade nutricional da dieta podem

reverter essa condição (BUYKEN et al, 2010)

Sabe-se que os aspectos nutricionais também contribuem para a minimização da

exposição cardíaca aos fatores de risco, já que populações com diferentes dietas

apresentam variações na mortalidade cardiovascular (KEY & APPLEBY, 2001).

Alimentos funcionais são tidos como protetores cardíacos e são definidos como

alimentos naturais ou processados que, além de seus nutrientes possuírem

componentes adicionais que atuam no metabolismo e fisiologia humana, promovem

efeitos benéficos à saúde, retardando o aparecimento de doenças crônico-


degenerativas e promovendo melhoria na qualidade e expectativa de vida das pessoas

(PARRY et al.,2005; COSTA, 2008).

Tais alimentos são classificados quanto à fonte de origem em animal ou vegetal

ou quanto aos benefícios que oferecem às seis áreas do organismo (sistema

gastrointestinal; sistema cardiovascular; no metabolismo de substratos; no crescimento,

desenvolvimento e diferenciação celular; no comportamento das funções fisiológicas e

como antioxidantes) (SOUZA et al., 2003).

Considerando a origem animal, evidências recentes sustentam a teoria de que as

proteínas do leite, incluindo as proteínas do soro, além de seu alto valor biológico,

possuem peptídeos bioativos, que atuam como agentes antimicrobianos, anti-

hipertensivos, reguladores da função imune, antioxidantes, anticancerígenos, assim

como, supressores do crescimento tumoral, entre outras funções (PARODI, 2007;

SAITO, 2008; KORHONEN, 2009; PINA & ROQUE, 2009).

A importância das proteínas do soro no controle da hipertensão tem sido foco de

inúmeras pesquisas (LICASTRO et al. 2005; SIU & ALWAY, 2005; FUJITA et al. 2007),

já que o leite apresenta em suas proteínas, peptídeos que depreciam a enzima

conversora de angiotensina, relacionada à hipertensão, sendo os peptídeos da caseína

(casocininas) e das proteínas do soro (lactocininas) os que apresentam potente efeito

inibidor dessa enzima (BARNÁRD et al, 1971; BU et al, 2005).

A elevação do risco de doenças metabólicas também pode ser reflexo da

deposição de gordura resultante da ingestão alimentar e gasto energético mediado pela

presença do estrógeno no organismo feminino (COOKE & NAZZ, 2004). Esse efeito

deve ser foco de atenção, pois alterações no balanço energético associadas à depleção

do estrógeno já foram relatadas em camundongos ovariectomizados e em mulheres na

pós-menopausa (ROGERS et al., 2009).

Os hormônios sexuais têm papel fundamental regulando o apetite, o

comportamento alimentar e o metabolismo energético, sendo diretamente relacionados

a diversos distúrbios metabólicos na mulher, em especial na menopausa (BUTERA,

2010; HIRSCHBERG, 2012).


Kroenke et al, 2012 obteve a redução nos sintomas vasomotores em mulheres

menopausadas submetidas a uma intervenção dietética com redução da ingestão de

gordura e aumento da ingestão de frutas, legumes e cereais integrais.

Rebholz et al (2012) numa metanálise de estudos randomizados controlados

para avaliar a associação da ingestão de proteína dietética com pressão arterial

baseada em artigos publicados a partir de 2011, verificaram que a redução da pressão

arterial não foi significativamente diferente quando a proteína vegetal foi comparada

diretamente com proteína animal. Esses resultados sugeriram que a substituição parcial

de carboidratos dietéticos com proteína parece ser importante para a prevenção e

tratamento da hipertensão.

Estudo de coorte de 22 anos em uma grande comunidade com mais de 12 mil

adultos entre 45 e 64 anos realizado por Haring et al (2014) não encontrou nenhuma

relação entre o tipo de proteína, de fonte animal ou vegetal, e o risco de incidência de

doenças cardíacas.

Embora verificando que existem na literatura diversos trabalhos relacionados à

interferência dos hábitos alimentares ao risco de vários resultados adversos para a

saúde, a associação da qualidade da dieta ao risco cardíaco nas mulheres

menopausadas ainda parece não bem esclarecido.

2.5 Exercício

A busca de estratégias que possam minimizar os efeitos deletérios do

envelhecimento nos indivíduos não pode deixar de levar em conta os efeitos benéficos

preconizados em todo o corpo pela atividade física. Dentre eles estão o aumento do

HDL-colesterol, redução dos triglicerídeos, redução da pressão arterial de repouso,

diminuição da sensibilidade vascular à adrenalina, estímulo de fatores endoteliais de

vasodilatação, redução da agregação plaquetária, estímulo a fibrinólise, aumento da

sensibilidade das células à insulina, estímulo ao metabolismo dos carboidratos,

estímulo hormonal anabolizante, modulação imunológica, maior gasto calórico,

tendência à elevação da taxa metabólica basal, estímulo trófico músculo-esquelético,


melhora na estabilidade articular dinâmica e analgesia neuroendócrina (PATE et al,

1995).

A atividade física promove adaptações fisiológicas positivas, sobretudo nas

respostas cardiovasculares em indivíduos de diversas faixas etárias (GENNARIET al,

1997). O foco principal para alcançar os objetivos relacionados à saúde consiste na

prescrição de exercícios capazes de aprimorar a aptidão cardiorrespiratória, a

composição corporal e a força muscular (GRAVES & FRANKLIN, 2001).

Morvan et al, 2013 em estudo experimental com animais, indicou o treinamento

de baixa intensidade como uma prática altamente favorável no tratamento das

desordens morfológicas, funcionais e metabólicas determinadas pela síndrome

metabólica.

A falta de atividade física aumenta o estresse oxidativo, a disfunção endotelial e

a aterosclerose (JANSSEN et al, 2002).

Muitos estudos confirmam que a prática efetiva de exercícios físicos promove

nos indivíduos redução na rigidez arterial quando comparados aos sedentários.

(FERREIRA et al., 2002; BOREHAM et al., 2004).

Respostas positivas na conformação aórtica ascendente, determinadas pelo

treinamento aeróbico moderado, foram obtidas por Marchon et al, 2015 em estudo

realizado com animais dislipidêmicos ovariectomizados. Houve uma redução na rigidez

da parede do vaso e um aumento das lamelas elásticas no grupo ovariectomizado

submetido ao exercício.

Estudos realizados por Mandarim de Lacerda et al (1998) e Graves & Franklin

(2001) em miocárdio esquerdo de ratos Wistar jovens e idosos mostraram que no

envelhecimento ocorrem perdas de miócitos cardíacos, hipertrofia das células

remanescentes e que a prática regular de atividade física ameniza os efeitos do

envelhecimento. Nosso grupo estudando miocárdio direito de ratas ovariectomizadas,

sugeriu que o exercício moderado promoveu remodelamento ventricular direito com

hipertrofia dos cardiomiócitos e aumento do tecido conjuntivo, como estratégia de

adaptação às alterações promovidas pelo exercício no ventrículo esquerdo

(RESSURREIÇÃO et al, 2012).


Durante o exercício o coração se ajusta aos requeridos aumentos nas atividades

metabólicas e mecânicas. O treinamento físico provoca adaptações bioquímicas,

elétricas, morfológicas e mecânicas no músculo cardíaco que, em conjunto,

proporcionam uma melhora na função cardíaca (PATE et al, 1995). Estas adaptações

ocorrem basicamente para reduzir o estresse sobre as paredes ventriculares e, ao

mesmo tempo, atender a maior demanda de suprimento sangüíneo dos músculos em

exercício (GRAVES & FRANKLIN, 2001; RESSURREIÇÃO et al, 2012).

Exercícios de resistência, quando comparados ao controle sedentário,

determinam um aumento de 15% a 20% na dimensão da parede posterior do ventrículo

esquerdo, 10% de aumento na dimensão diastólica final ventricular esquerda, e um

aumento de massa calculada em até 45% conferindo assim alterações morfofuncionais

do tecido cardíaco e seus componentes (EVANS, 1999).

Estudos com miócitos isolados intactos indicam que o exercício contínuo de

longa duração aumenta o comprimento das células do ventrículo esquerdo (VE) de

ratos, sem alteração na espessura, embora alguns estudos não tenham observado

estas adaptações (MOORE et al,1993; PALMER & MOORE, 1996; MOKELKE et al,

1997; PALMER et al, 1998). Ao mesmo tempo, em outros estudos, foi observado que o

exercício do tipo intermitente aumentou a espessura dos miócitos ventriculares em

ratos, sem alteração no comprimento, sendo esta adaptação mais acentuada nos

miócitos da região próxima ao endocárdio. (NATALI, 2001; NATALI, 2002). Portanto,

estes estudos com células isoladas, reforçam os achados em seres humanos e animais

in vivo: exercício aeróbio de baixa e média intensidade induz hipertrofia excêntrica

(células longas), enquanto que o exercício anaeróbio de alta intensidade causa

hipertrofia concêntrica (células espessas).

Benefícios da combinação entre o exercício aeróbico e o resistido foi estudado

por Souza et al, 2014 no ventrículo esquerdo de ratos Wistar, indicando que o

miocárdio dos animais treinados apresentou um efeito combinado de cada tipo de

intervenção aplicada.

O exercício resistido promove o aumento da pressão intraventricular imprimindo

uma condição de estresse na parede miocárdica, funcionando como um estímulo para a

hipertrofia desse tecido (BARAUNA et al, 2005). O coração, em resposta, aumenta a


espessura da parede ventricular esquerda, desenvolvendo dessa maneira a hipertrofia

concêntrica (HAYKOWSKY et al, 2000; LEVINGER et al, 2005) e os cardiomiócitos

aumentam sua área de secção transversa no intuito de promover o aumento da

contractilidade intrínseca celular (KEMI et al, 2005; MARON & PELLICCIA, 2006).

O aumento na contractilidade intrínseca dos miócitos é um mecanismo potencial

para a explicação da melhora da função contrátil do miocárdio induzida pelo exercício

(FULLER & NUTTER, 1981).

O treinamento resistido mostrou-se eficiente quanto à minimização das

mudanças promovidas no tecido cardíaco de ratas idosas ovariectomizadas em

pesquisa realizada por nosso grupo de estudos (Lima et al, 2012).

É fato que o exercício físico tem um impacto positivo na função vascular, como

comprovado por Nyberg et al, 2014 em estudos com mulheres na pré e pós

menopausa, como também uma intervenção de importância na prevenção das

disfunções cardíacas (PHUNGPHONG et al, 2015), no entanto nem todos os

mecanismos de cardioproteção estão claramente definidos.

Assim, torna-se importante discutir as adaptações mecânicas ao exercício,

considerando que neste processo os ajustes na contractilidade dos miócitos cardíacos.

Dentre estes ajustes se destaca a hipertrofia cardíaca, pois se relaciona diretamente

com o desenvolvimento da força celular.

2.6 Relevância do trabalho

Considerando que as doenças crônicas representam um problema de saúde

pública mundial sendo as cardiovasculares as que apresentam índices mais

impactantes, e que o Brasil com população idosa de maioria feminina exibe dados de

envelhecimento progressivo, é de extrema importância o desenvolvimento de novas

pesquisas que possam contribuir para a elaboração de melhores estratégias a serem

aplicadas, no intuito de minimizar os efeitos deletérios impostos por essas doenças, em

especial nos determinados pelo evento da menopausa.

O b j e t i v o s | 3 2

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Nosso estudo tem por objetivo avaliar os efeitos do treinamento resistido

associado a dietas proteicas vegetal e animal sobre o ventrículo esquerdo de animais

idosas ovariectomizadas.

3.2 Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos do treinamento resistido no ventrículo esquerdo de ratas idosas

ovariectomizadas submetidas a dietas à base de proteínas vegetal e animal através de

análises biométricas, bioquímicas, histomorfométricas, estereológicas, ultraestruturais e

imunohistoquímicas.

M e t o d o l o g i a | 3 3

4. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo, do tipo experimental prospectivo e randomizado, foi

submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Judas Tadeu e

aprovado pelo parecer nº A-00610 de 2010.

4.1 Animais do Estudo

Foram utilizadas 64 ratas adultas (Rattus norvegicus albinus - Rodentia

Mammalia), linhagem Wistar, com 21 dias de vida, oriundas do Biotério Central do

Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da Universidade de São Paulo (USP). Todos os

animais da pesquisa receberam cuidados segundo as Normas Nacionais de Vivisseção

Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e em consonância

com a Lei Federal n° 11.794 de 8 de outubro de 2008 em relação à utilização de

animais para ensino e pesquisa.

4.2 Protocolo Experimental

No biotério da Universidade São Judas Tadeu, os animais foram alojados em

caixas de polipropileno próprias para criação de animais, vedadas, que possuíam

entrada de ar filtrado controlada para adequada manutenção de temperatura, providas

de bebedouro e comedouro próprios, forradas de serragem estéril. Em cada caixa foram

alojados 4 animais, distribuídos de forma aleatória, que foram mantidos até os 14

meses de idade sob condições ambientais controladas de temperatura (23ºC) e

iluminação (12 h de claro e 12 h de escuro por dia) e oferta sem restrições de água e

alimentação composta exclusivamente de ração tradicionalmente oferecida para

animais de laboratório (NUVILAB CR1, NUVITAL Nutrientes LTDA, Curitiba, PR)

composta por proteína exclusivamente de fontes vegetais.


4.2.1. Ovariectoma e colpocitologia

Aos seis meses de idade, após serem pesados (balança Ohauss com precisão de

10g), 32 animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico de ovariectomia de acordo

com protocolo descrito por Moreira et al. (2005).

Cada animal foi anestesiado com uma injeção intraperitoneal de uma solução de

xilazina e quetamina (1:1) na proporção 0,20ml/kg do peso corporal do animal e

colocados em decúbito lateral. Após tricotomia da região do abdome, realizou-se uma

incisão de cada lado da região, a fim de se localizar os ovários e tracioná-los com uma

pinça para fora da cavidade abdominal. Em seguida, com um fio de nylon (tech-lon 4-0),

o conjunto ovário, ovarioducto e vasos sanguíneos foram isolados e removidos. Após

sutura da parede muscular e da pele e aplicação de álcool iodado na região suturada,

os animais receberam uma injeção intraperitoneal de Benzetacil (1mg/kg) para evitar

riscos de infecção. Posteriormente, as ratas foram deixadas livres em caixas de

polipropileno individuais, providas de bebedouro e comedouro e mantidas em condições

ambientais controladas para observação por um período de quatro dias (OLSON et al.,

1986).

A citologia vaginal foi avaliada em duas etapas, antes e 20 dias após a

ovariectomia, para confirmação do estado de menopausa induzida. A coleta do lavado

vaginal das ratas ovariectomizadas foi realizada com o auxílio de uma micropipeta com

solução salina (NaCl a 0,9%) colocada em lâmina e observada em microscópio de luz

em aumento de x400. Foi caracterizado o estado de menopausa quando observada a

ausência de células epiteliais (MARCONDES et al, 2002; VILELA et al, 2007). Todos os

animais do estudo submetidos ao procedimento de ovariectomia apresentaram

ausência de células epiteliais, sendo então utilizados para o seguimento do protocolo.

4.2.2 Formação dos grupos

A partir dos 6 meses de idade os animais foram divididos em 8 grupos, a saber:

CVS: Animais não ovariectomizados, dieta de proteína vegetal e sedentários (n = 8);


CVT: Animais não ovariectomizados, dieta de proteína vegetal e treinados (n = 8);

VOS: Animais com dieta de proteína vegetal, ovariectomizados e sedentários (n = 8);

VOT: Animais com dieta de proteína vegetal, ovariectomizados e treinados (n = 8);

CAS: Animais não ovariectomizados, dieta de proteína animal e sedentários (n = 8).

CAT: Animais não ovariectomizados, dieta de proteína animal e treinados (n = 8).

AOS: Animais com dieta de proteína animal, ovariectomizados e sedentários (n = 8).

AOT: Animais com dieta de proteína animal, ovariectomizados e treinados (n = 8).

4.2.3. Delineamento do Estudo.

O Delineamento do estudo está apresentado na figura 1.

64

Ratas Wistar

32

Sem Ovariectomia

CVS (n=8)

CVT (n=8)

CAS (n=8)

CAT (n=8)

32

Com Ovariectomia

VOS (n=8)

VOT (n=8)

AOS (n=8)

AOT (n=8)

DESMAME20 DIAS

OVARIECTOMIA6 MESES

INÍCIO DE PROTOCOLO14 MESES

EUTANÁSIA17 MESES

Figura 1 - Delineamento do estudo, modelo de formação dos grupos experimentais.


4.3 Protocolos

4.3.1 Treinamento resistido

O equipamento utilizado para a realização do programa de treinamento resistido

com os animais dos grupos CVT, VOT, CAT e AOT foi uma escada em madeira com

degraus de ferro. A altura do equipamento é de 110 cm com inclinação de 80°. No topo

do equipamento existe uma caixa para a acomodação dos animais. A escada foi

confeccionada na marcenaria da Universidade São Judas Tadeu a partir do descrito por

Duncan et al., (1998) (Figura 2).

A sobrecarga atribuída ao esforço durante o treinamento foi promovida por meio

de pesos de chumbo fixados na base da cauda do animal, por meio de fita adesiva

(Figura 3). Quando os animais atingiram 14 meses de idade, tendo passado um período

de 8 meses após a ovariectomia (realizada aos 6 meses de idade), foram iniciados os

protocolos experimentais de treinamento resistido e de dieta.

Todos os grupos foram submetidos ao processo de adaptação prévia ao protocolo

de treinamento com duração de uma semana. Nessa etapa, as ratas escalaram o

equipamento sem adição de carga com o objetivo de alcançar a área de descanso no

topo da escada. O procedimento foi repetido 6 vezes por sessão, tendo sido realizadas

3 sessões na semana em dias alternados (Adaptado de LEE et al., 2004).


Figura 2 - Equipamento utilizado para realização do treinamento resistido.

Os animais dos grupos CVS, CAS, VOS e AOS realizaram os exercícios uma vez

na semana sem sobrecarga até sua eutanásia, com o objetivo de provocar um estresse

semelhante ao dos grupos treinados.

O programa de treinamento dos grupos CVT, CAT, VOT e AOT foram baseados

no princípio da sobrecarga com números de repetições e descanso que mais se

aproximam do treinamento em seres humanos. Portanto, a cada 2 semanas foi

adicionada uma sobrecarga à base da cauda do animal, com os pesos de chumbo

(Figura 3 e Quadro 1).


Figura 3 - Modelo de carga utilizada durante o treinamento resistido e forma de fixação à base da cauda do animal.

A sobrecarga inicial foi estabelecida a partir de um percentual (75%) do peso

corporal de cada animal. Semanalmente, os animais foram pesados (balança Oasus)

para correção da carga inicial caso houvesse alteração no peso do mesmo.

O reajuste de incremento das cargas iniciais para promover a progressão do

treinamento foi feito quinzenalmente, mantendo sempre 75% do peso atualizado tendo

sido acrescidas de mais 10% a cada 2 semanas, como forma de provocar um

incremento progressivo na carga de treino (Quadro 1).

Os ratos foram treinados 3 vezes por semana, durante 12 semanas. Cada animal

escalou a escada até atingir o topo, 6 vezes por sessão por cada dia de treinamento,

com intervalo aproximado de 2 minutos entre uma subida e outra. A característica do

treinamento resistido foi de intensidade moderada (Adaptado de Lee et al., 2004)


Quadro 1 Esquema de progressão de carga de treinamento resistido para os animais dos grupos CVT, CAT, VOT e AOT.

Semanas 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12

Carga75% do

peso inicial

85% do

peso 2

95% do

peso 3

105% do

peso 4

115% do

peso 5

125% do

peso 6

Incremento --- +10% +10% +10% +10% +10%

Pesagem Peso 2 Peso 3 Peso 4 Peso 5 Peso 6 Peso final

Após o período de intervenção, os animais foram eutanasiados para as análises

dos parâmetros de estudo.

4.3.2 Dietas Os 64 animais foram mantidos desde o desmame até os 14 meses de idade

ingerindo ração a base de proteína vegetal específica para ratos de laboratório

(seguindo as recomendações do National Research Council e National Institute of

Health – USA - NRC, 2011) da marca Nuvital (NUVILAB CR1, Nuvital Nutrientes LTDA,

Curitiba, PR).

Essa ração à base de proteína vegetal contém em sua composição 52% de

carboidratos, 21% de proteínas e 4% de lipídeos e os ingredientes que a compõem são:

milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato

bicálcico, cloreto de sódio, premix vitamínico mineral (Quadro 3).

A partir dos 14 meses de idade, os grupos CVS, CVT, VOS e VOT (32 animais) se

mantiveram com a mesma ração proteica vegetal até o término do protocolo (17 meses

de idade)

Os grupos que receberam ração à base de proteína animal, assim denominados

CAS, CAT, AOS e AOT (32 animais) permaneceram com a dieta proteica animal até o

término do protocolo (17 meses). A dieta à base de proteína animal foi composta pela


ração da marca Rhoster (AIN-93, Rhosterlab – Rhoster Ltda) cuja composição foi

adaptada e especialmente formulada para o presente estudo. Sua composição foi feita

à base de proteína de leite de vaca (caseína) na seguinte formulação: 52% de

carboidratos, 21% de proteínas e 4% de lipídeos em relação ao total de energia. Essa

ração foi introduzida na rotina dos animais simultaneamente ao início do treinamento

resistido, em substituição à ração da Nuvilab com proteínas vegetais.

Os ingredientes presentes nas dietas oferecidas aos animais estão elencados não

Quadro 2.

Por questões tecnológicas de produção, para conseguir obter textura ideal de

peletização, não foi possível fornecer 100% de proteína da dieta proveniente de fonte

animal, sendo incluídos aproximadamente 15% de proteína vegetal proveniente da soja

na ração (Quadro 3).

O uso se deu conforme as recomendações do National Research Council e

National Institute of Health – USA (NRC, 2011), por meio da administração à vontade

disponível em comedouros suspensos (Figura 5).

Quadro 2 Comparação dos ingredientes das dietas oferecidas aos animais.

Proteína Animal* Proteína Vegetal**

Milho moído Farelo de milho

Farelo de soja Farelo de soja

Farelo de trigo Farelo de trigo

Caseína láctea

Farelo de arroz

Calcário Carbonato de cálcio, Fosfato bicálcico

Melaço em pó

Óleo de soja Óleo de soja

Sal Cloreto de sódio

Sacarose

Premix Vitamínico Mineral Premix Vitamínico Mineral, Metionina e Lisina

Fonte: * Rhoster Ind e Com Ltda, Araçoiaba da serra, SP. CNPJ 00 984 201/0001-04. **Nuvital. Colombo, PR. CNPJ 77 043 511/0001-15


Quadro 3 Composição centesimal das rações oferecidas aos animais de estudo por kg de produto.

Proteína Animal*

%

Proteína Vegetal**

%

Umidade (Máx.) 7,60 12,50

Proteína Bruta (Min.) 22,5 22,0

Extrato etéreo (Máx.) 4,80 4,00

Fibra bruta (Máx.) 2,76 8,00

Matéria mineral (Máx.) 7,32 9,00

Cálcio (Mín.) 1,40 1,40

Fósforo (Min.) 0,80 0,80

Fonte: * Rhoster Ind e Com Ltda, Araçoiaba da Serra, SP. CNPJ 00 984 201/0001-04. **Nuvital. Colombo, PR. CNPJ 77 043 511/0001-15

4.4 Eutanásia dos Animais

O protocolo de eutanásia dos animais foi realizado aos 17 meses de idade, ao

final do período de doze semanas de treinamento resistido e dieta específica (CVS,

CVT, VOS, VOT, CAS, CAT, AOS e AOT).

A decapitação foi escolhida como método de eutanásia visando a isenção de

qualquer interação medicamentosa ou farmacológica nos parâmetros estudados.

O procedimento ocorreu nas instalações do biotério da Universidade São Judas

Tadeu, seguindo normas de higiene e cuidados com os animais conforme estabelecido

pelo biotério, em sala separada do local onde os animais ficaram alojados ao longo do

experimento. Foi realizado o procedimento com um animal de cada vez, sendo feita

total higienização e lavagem das bancadas e equipamentos no intervalo entre cada

animal, evitando assim contato dos mesmos com qualquer odor de sangue para evitar o

estresse dos animais.

Os mesmos foram mantidos em jejum de 8 horas antes da eutanásia para coleta

de sangue para análises bioquímicas. Os animais foram pesados e em seguida


decapitados por meio de guilhotina. O sangue, visando a análise dos parâmetros

bioquímicos, foi coletado em tubos de ensaio com auxílio de um funil.

4.4.1 Retirada do coração e separação do ventrículo esquerdo

Em seguida os animais foram colocados em decúbito dorsal, realizada a

toracotomia, onde os corações foram evidenciados e retirados. Após lavagem dos

corações com solução fisiológica, estes foram pesados, os átrios foram seccionados,

sendo os ventrículos separados em ventrículos direito e esquerdo e novamente

pesados. Logo após, parte das amostras do ventrículo esquerdo foram processadas

para análise morfológica e estereológica em microscopia de luz, parte para análise de

ultraestruturas em microscopia eletrônica e parte para análise da expressão enzimática

por imunohistoquímica.

4.4.2 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia de Luz

As amostras do ventrículo esquerdo foram fixadas em solução tamponada de

formol a 10% por um período de 24 horas. Após esse período, foram desidratadas em

sequências de álcool etílico (70%, 80%, 95% e 100%), diafanizadas em xilol e incluídas

em parafina. Posteriormente, as amostras foram lavadas em solução salina fosfatada

(PBS) a 0,1M e pH 7,4 e seccionadas por micrótomo em cortes histológicos semi

seriados com 5 µm de espessura cada um. Os cortes realizados foram perpendiculares

ao eixo longitudinal das fibras musculares. Os fragmentos de tecido foram coletados em

lâminas de vidro, sendo a resina Entellan utilizada para fixação da lamínula sobre a

lâmina.

A coloração de Hematoxilina/Eosina (HE) foi utilizada para a visualização dos

núcleos, citoplasma dos miócitos e dos capilares do interstício ao microscópio de luz da


marca Zeiss, do Laboratório de Estudos Morfológicos e Imunohistoquimicos da

Universidade São Judas Tadeu).

A coloração de Picrossirius foi utilizada para a visualização de fibras colágenas I e

III (Junqueira et al., 1979), realizadas no microscópio de luz polarizada da marca Zeiss

da Universidade de São Paulo.

4.4.3 Processamento do Ventrículo Esquerdo para Microscopia Eletrônica

Amostras do ventrículo esquerdo foram retiradas e imediatamente colocadas em

uma solução fixadora de glutaraldeído a 2% em tampão fosfato de sódio a 0,1 M e pH

7,4 e imersos em uma solução aquosa de tetróxido de ósmio a 2% por duas horas.

Posteriormente as amostras foram lavadas na mesma solução tampão, seguido de

água destilada para então serem mantidas em uranila durante cerca de 12 horas na

geladeira. Após esta etapa, as peças foram desidratadas em séries crescentes de

alcoóis: 50% (10 minutos), 70% (10 minutos), 90% (10 minutos) e 100% (20 minutos),

incluídas em Araldite e deixadas por dois dias. Os blocos foram cortados em secções

de 70 a 90 nm de espessura em navalha de diamante. As secções transversais foram

colocadas em telas de cobre e coradas com acetato de uranila (Reagen ®) a 3% e

citrato de chumbo (Sigma ®).

4.4.4 Processamento para Imunohistoqu

ìmica

Para a realização da análise imunohistoquímica, as amostras do ventrículo

esquerdo foram fixadas em solução tamponada de formol a 10% por um período de 24

horas. Após esse período, foram desidratadas em sequências de álcool etílico (70%,

80%, 95% e 100%), diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Posteriormente, os

blocos com os segmentos do ventrículo esquerdo foram cortados com espessura de 4

m em micrótomo e aderidos em lâminas silanizadas.


4.5 Análises Morfométricas e Estereológicas

A morfometria aplicada foi analisada através de um sistema digital de

processamento e análise de imagens em computador, do Laboratório de Estudos

Morfológicos e Imunohistoquímicos da Universidade São Judas Tadeu. O sistema

consiste de uma microcâmera de vídeo Sony, acoplada ao Microscópio Zeiss, que

capta as imagens das lâminas histológicas e as transmite para um computador

equipado com software específico para análises quantitativas.

Para a realização da análise morfométrica das imagens digitalizadas foi utilizado o

programa de análise de imagens Software Axio Vision 4.8, Zeiss.

A análise estereológica tem por função determinar a ocupação relativa das

estruturas na área teste e, de acordo com GUNDERSEN (1987), permite a observação

quantitativa das estruturas tridimensionais, possibilitando quantificar as modificações

adaptativas patológicas ou normais das estruturas celulares (PEREIRA et al., 1998).

Para a realização da análise estereológica das imagens digitalizadas, utilizamos o

software Image J, do Instituto Nacional de Saúde, USA.

4.5.1 Área da secção transversa do miócito (AST)

A morfometria visa medir a área da secção transversa do miócito, realizada em

imagens digitalizadas, de maneira semiautomática, com o referido programa de análise,

utilizando-se aumento de 400x e imagens em JPG.

Cada miócito foi delimitado e medido sua área em micrômetros² (Figura 4). Seus

valores foram anotados e utilizados nos tratamentos estatísticos. Foram capturadas 4

imagens em 5 campos aleatórios de cada animal (20 imagens por animal, 100 imagens

por grupo, 800 imagens total).


Figura 4 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400, onde foi medida a área da secção transversa do miócito (µm2), submetida ao software Axion Vision 4.8, Zeiss.

4.5.2 Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[col])

As lâminas foram coradas pelo método Picrossirius e examinados ao microscópio

de luz dotado de filtros polaroides. A disposição e concentração do colágeno no

interstício ventricular cardíaco foi analisada em 3 campos aleatórios de cada lâmina por

animal (15 análises por grupo, 120 análises totais). As análises foram realizadas

através de estereologia (MANDARIM DE-LACERDA, 1995), com sistema teste de 252

pontos com auxílio do software Image J (versão 1.47 - National Institutes of Health;

Collins, 2007) (Figura 5) e pelo software Image Pró-Plus (Figura 6).


Figura 5 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus e aumento de x400 em microscópio de luz polarizada.Barra com 50 µm.

Figura 6 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado com Picrossirus em aumento de x 400 em microscópio de luz polarizada, aplicado o software Image Pró- Plus e sobre ele o software Image J. Barra com 50 µm


4.5.3. Densidade de volume nuclear (Vv[nuc]), dos miócitos (Vv[mio]), do interstício (Vv[int]) e dos capilares (Vv[cap])

A densidade de volume expressa a fração de volume ocupada pela estrutura de

interesse pelo número total de pontos. Para ser estimada a densidade de volume de

cada componente utiliza-se um sistema teste composto por pontos delimitados e por

linhas de exclusão e inclusão, dispostas sistemática e uniformemente sobrepostas às

imagens capturadas.

Foram utilizados 5 cortes não seriados por animal, sendo analisados 4 campos

aleatórios de cada corte (20 imagens por animal, 100 imagens por grupo, 800 imagens

total), em aumento de 400X, e um sistema teste dotado de 252 pontos, com auxílio do

software Image J (versão 1.47 - National Intitutes of Health; Collins, 2007) (Figura 7).

As densidades de volume de cada estrutura de interesse foram expressas levando

em consideração para efeito de contagem somente os pontos que coincidiram sobre a

estrutura estudada e os valores foram apresentados em porcentagens.

Figura 7 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em H/E em aumento de x400 submetida ao software Image J.


4.6 Análises Bioquímicas

As análises dos parâmetros bioquímicos avaliados nos animais de estudo foram

realizadas segundo técnicas tradicionalmente utilizadas em laboratórios de análises

clínicas (Molinaro, 2012) e foram os seguintes:

Dosagem sérica de glicose: O soro obtido após centrifugação do sangue foi utilizado

para análise da glicemia pelo método da glicose oxidase realizados no laboratório de

análises clínica da Universidade São Judas Tadeu (USJT).

Dosagem de Triglicérides, Colesterol e Creatinafosfoquinase (CPK): por meio de

Kits comerciais ELITech EL200 (ELITechGroup vital ® científico) seguindo as

recomendações do fabricante com utilização do analisador automatizado FLEXOR-

EL200 (ELITechGroup vital ® científico), no Laboratório de Análises Clínicas da

Faculdade de medicina do ABC (FMABC).

Dosagem de Homocisteína e Proteína C Reativa Ultrassensível (PCR-us): pelo

método de quimioluminescência utilizando kits comerciais IMMUNOLITE 1000 (DPC)

seguindo as recomendações do fabricante no aparelho Analisador Automático

IMMULITE-1000 (Siemens), realizadas no Laboratório de Análises Clínicas da

Faculdade de Medicina do ABC (FMABC).

4.7 Análises das Ultraestruturas

As grades contrastadas contendo os cortes ultrafinos do miocárdio dos animais

foram observadas e analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão (JEOL JSM)

do Laboratório de Investigação do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de

São Paulo e fotografadas com sistema digital. Foram registradas três imagens por

fragmento de cada animal, 15 imagens por grupo, 120 imagens no total em aumento de


x12000. As imagens capturadas foram submetidas ao software Axion Vision 4.8, Zeiss

para a mensuração do diâmetro das fibras colágenas do tipo I, tipo III e intermediária.

4.8 Análise Imunohistoquímica para Metaloproteinases 2 e 9

Para detecção da expressão de Metaloproteinases 2 e 9 as lâminas silanizadas

contendo amostras do ventrículo esquerdo, foram desparafinizadas utilizando estufa a

57ºC pernoite e imersas em banhos de xilol na seguinte sequência de duração: 30, 5 e

mais 5 minutos. Em seguida foram hidratadas em álcool etílico nas concentrações

decrescentes de 100%, 80% e 70%, cada uma com duração de 5 minutos e

posteriormente lavadas em água corrente. Na sequência iniciou-se a etapa da

recuperação antigênica, feita em banho Maria a 900C, sendo as lâminas colocadas em

tampão de citrato de sódio, pH=6,0, durante 45 minutos, e a seguir, lavadas em água

corrente.

O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com 4 banhos de 5 minutos

cada, em peróxido de hidrogênio (H2O2) a 20 volumes, seguido de lavagem em água

corrente destilada e em PBS (solução salina tamponada com fosfatos), pH= 7,4 . Foi

utilizado o anticorpo primário MMP9- 1:300 e MMP2-1:250 diluído no leite (9g de leite

Molico para 300ml de PBS). Todas as lâminas foram então colocadas em câmara

úmida a 4ºC, pernoite. O material foi lavado com tampão PBS e incubado com anticorpo

secundário biotinilado por 30 minutos, lavado novamente com PBS e incubado com

anticorpo streptoavidina-peroxidase por mais 30 minutos. A seguir, lavagem com

solução PBS e para a revelação da reação foi utilizado como substrato cromogênico, a

solução DAB (33-Diaminobenzidina) na proporção de1:1 por cinco minutos a

temperatura ambiente.

Como produto final da reação, observou-se ao microscópio a forma de um

precipitado castanho escuro. O material foi lavado em água corrente e contracorado

com “Hematoxylina Mayer” por 1 minuto. A seguir, foi submetido a 3 banhos de xilol


para diafinizar e de 2 de álcool. Por fim, as lâminas foram montadas com lamínulas e

Entellan®.

Para a análise imunohistoquímica da MMP2 e MMP9 foi utilizado o escore

proposto por SINICROPE et al (1995), onde foram atribuídas notas de zero a quatro de

acordo com a proporção de células imunomarcadas na área do corte histológico

analisado (Tabela 1).

Tabela 1 - Escore para análise da imunoexpressão das MMP2 e MMP9.

Classificação no escore Proporção de imunomarcação no corte

0 0 - ≤ 5%

1 5 - 25%

2 25 - 50%

3 50 - 75%

4 >75%

(Sinicrope et al ,1995)


4.9 Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. O teste

de análise de variância (ANOVA) two- way, e post-hoc de Tukey foram devidamente

aplicados para análise dos dados. O nível de significância adotado em todos os testes

foi de p< 0,05.

R e s u l t a d o s | 5 2

5. RESULTADOS

5.1 Massa corporal

A figura 8 visa elucidar a variação da massa corporal dos animais ao longo do

estudo, uma vez que o próprio desenvolvimento e envelhecimento dos animais

implicariam em variação e dessa forma, poderiam interferir na interpretação dos

resultados de nossa amostra.

Para análise da massa corporal média dos animais ovariectomizados e não

ovariectomizados, foram realizadas pesagem quinzenais desde o início do protocolo

aos 6 meses de idade até o início das intervenções propostas aos 14 meses de idade,

sendo os valores elencados abaixo:

0

50

100

150

200

250

300

350

400

C 6M C 14M CO 14M

Massa c

orp

ora

l em

(g

)

IDADE

a

ab

Figura 8 - Variação da massa corporal após 8 meses de ovariectomia nos grupos C6M (controle 6 meses), C14M (controle 14 meses) e CO14M (controle ovariectomizado 14 meses). Valores representam média ± EPM. ap<0.05 vs C6M; bp< 0.05 vs C14M.

Observou-se que a massa corporal média dos animais do grupo de 14 meses

(C14M) apresentou aumento de +11,3%, considerado adequado devido ao

desenvolvimento do animal no período de 8 meses. No entanto, nos animais que


sofreram a intervenção da ovariectomia (CO14M), houve um incremento maior nessa

variável no mesmo período, representando um aumento significante de +24,5% em

relação ao animal de mesma idade não ovariectomizado (C14M) e um aumento

também significante de +38,5% na média da massa corporal em relação ao animal de 6

meses de idade (C6M). Esse registro indicou a influência da ovariectomia e, portanto,

da supressão hormonal, no maior ganho médio da massa corporal dos indivíduos.

5.2 Biométricos

5.2.1.Dieta de proteina Vegetal Tabela 2- Valores biométricos dos animais submetidos a dieta com proteina vegetal.

MCI-14 (g) 263 ± 6,63 262 ± 7,52 311 ± 13,17 342 ± 11,58

MCF-17 (g) 304 ± 7,48 260 ± 14,83 316 ± 18,93 341 ± 15,2

MCF-17 - MCI-14 (g) 41,00 ± 7,97 -2,00 ± 9,43 5,00 ± 8,51 -1,00 ± 6,20

∆% MASSA 15,77 ± 3,09 -0,98 ± 3,65 a 1,36 ± 2,88 a -0,39 ± 1,83 a

Massa Tecido Adiposo (g) 11,12 ± 1,95 7,58 ± 1,95 23,42 ± 5,67 23,15 ± 3,74

Adiposo g/100g massa corporal (%) 3,65 ± 0,61 2,82 ± 0,68 7,09 ± 1,42 b 6,66 ± 0,7

Massa Coração (g) 1,12 ± 0,04 1,31 ± 0,18 1,12 ± 0,05 1,28 ± 1,15

Coração g/100g massa corporal (%) 0,37 ± 0,01 0,51 ± 0,07 0,36 ± 0,04 0,38 ± 0,05

Massa Ventrículo Esquerdo (g) 0,77 ± 0,03 0,81 ± 0,1 0,72 ± 0,01 0,65 ± 0,12

VE g/100g massa coração (%) 68,85 ± 2,85 61,94 ± 2,55 64,96 ± 3,89 55,95 ± 11,91

MCI-14: Massa Corporal Inicial 14 meses; MCF-17: Massa Corporal Final 17 meses.

∆% : Delta Percentual da Massa Corporal; VE: Ventrículo Esquerdo.

a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT.

(n=8)

Valores representam média ± erro padrão da média (EPM)

(n=8) (n=8) (n=8)

GRUPOS

DIETA DE PROTEÍNA VEGETAL

CVT VOS VOTCVS

A análise dos resultados dos parâmetros biométricos no grupo de dieta proteica

vegetal (Tabela 2) evidenciou uma redução significante no Δ de massa corporal dos

indivíduos CVT, VOS e VOT em relação aos indivíduos CVS.


Quanto à massa do tecido adiposo, houve uma tendência ao aumento desse

parâmetro no grupo VOS e VOT quando comparados aos respectivos controles,

indicando que ovariectomia favoreceu a esse aumento e que o treinamento não se

mostrou eficiente para promover sua redução.

A massa do coração, bem como a massa do ventrículo esquerdo, apresentou

valores semelhantes em todos os grupos dessa dieta, apesar do grupo VOT registrar

tendência à redução dos valores da massa ventricular esquerda em relação aos demais

grupos, sugerindo que a ovariectomia não estabeleceu influência direta, mas que o

treinamento pode promover um ajuste em termos de valores, próximo aos dos

indivíduos controles treinados.

5.2.2.Dieta de proteina Animal

Tabela 3 - Valores biométricos dos animais submetidos a dieta com proteina predominantemente animal.

MCI-14 (g) 277 ± 6,44 266 ± 16,69 340 ± 15,76 332 ± 18,56

MCF-17 (g) 300 ± 8,22 256 ± 13,17 342 ± 16,57 329 ± 17,72

MCF-17 - MCI-14 (g) 23,00 ± 7,18 -10,00 ± 3,54 1,67 ± 4,77 -3,33 ± 2,79

∆% MASSA 8,39 ± 2,74 -3,47 ± 1,13 a 0,49 ± 1,44 -0,92 ± 0,77

Massa Tecido Adiposo (g) 11,56 ± 2,15 11,07 ± 2,35 31,58 ± 4,46 33,71 ± 3,75

Adiposo g/100g massa corporal (%) 3,85 ± 0,70 4,21 ± 0,74 9,09 ± 0,89 a b 10,06 ± 0,72 a b

Massa Coração (g) 1,15 ± 0,06 1,13 ± 0,06 1,29 ± 0,09 1,08 ± 0,05

Coração g/100g massa corporal (%) 0,39 ± 0,02 0,44 ± 0,02 0,38 ± 0,03 0,33 ± 0,01

Massa Ventrículo Esquerdo (g) 0,78 ± 0,03 0,70 ± 0,02 0,83 ± 0,05 0,75 ± 0,02

VE g/100g massa coração (%) 68,16 ± 0,93 62,76 ± 2,12 65,00 ± 2,15 70,14 ± 2,41



a p < 0.05 vs CAS; b p < 0.05 vs CAT.


CAT AOS AOT

(n=8)

CAS

(n=8) (n=8) (n=8)

GRUPOS

DIETA DE PROTEÍNA ANIMAL


Os resultados dos parâmetros biométricos obtidos no grupo de dieta proteica

animal e expostos na Tabela 3 permitiram a verificação de menores valores do Δ da

massa corporal em todos os grupos quando comparados ao grupo CAS, porém

somente no grupo CAT, essa redução foi significante. Assim, pode-se afirmar que com

relação à essa variável, o treinamento não estabeleceu impacto nos animais

ovariectomizados de dieta animal, mas foi significante nos animais controles.

Em relação à massa do tecido adiposo visceral, houve aumento significante nos

grupos experimentais AOS e AOT quando comparados aos respectivos controles CAS

e CAT, apontando a interferência da ovariectomia sobre esse aumento, e a ineficácia

do treinamento na reversão.

Os parâmetros massa do coração e massa do ventrículo esquerdo exibiram

valores semelhantes em todos os grupos analisados, com destaque para o grupo AOS

que apresentou uma tendência ao aumento desses parâmetros em relação aos demais

grupos, evidenciando que a ovariectomia e o sedentarismo nessa dieta, induzem a

aumento da massa cardíaca e da massa ventricular esquerda.


5.2.3.Comparação entre as dietas

Tabela 4 - Comparação dos valores biométricos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal.

MCI-14 (g) 263 ± 6,63 262 ± 7,52 311 ± 13,17 342 ± 11,58 277 ± 6,44 266 ± 16,69 340 ± 15,76 332 ± 18,56

MCF-17 (g) 304 ± 7,48 260 ± 14,83 316 ± 18,93 341 ± 15,2 300 ± 8,22 256 ± 13,17 342 ± 16,57 329 ± 17,72

MCF-17 - MCI-14 (g) 41,00 ± 7,97 -2,00 ± 9,43 5,00 ± 8,51 -1,00 ± 6,20 23,00 ± 7,18 -10,00 ± 3,54 1,67 ± 4,77 -3,33 ± 2,79

∆% MASSA 15,77 ± 3,09 -0,98 ± 3,65 1,36 ± 2,88 0,39- ± 1,83 8,39 ± 2,74 -3,47 ± 1,13 a 0,49 ± 1,44 a -0,92 ± 0,77 a

Massa Tecido Adiposo (g) 11,12 ± 1,95 7,58 ± 1,95 23,42 ± 5,67 23,15 ± 3,74 11,56 ± 2,15 11,07 ± 2,35 31,58 ± 4,46 33,7 ± 3,75

Adiposo g/100g massa corporal (%) 3,65 ± 0,61 2,82 ± 0,68 7,09 ± 1,42 6,66 ± 0,7 3,85 ± 0,70 4,21 ± 0,74 9,09 ± 0,89 a b 10,1 ± 0,72 a b

Massa Coração (g) 1,12 ± 0,04 1,31 ± 0,18 1,12 ± 0,05 1,28 ± 1,15 1,15 ± 0,06 1,13 ± 0,06 1,29 ± 0,09 1,08 ± 0,05

Coração g/100g massa corporal (%) 0,37 ± 0,01 0,51 ± 0,07 0,36 ± 0,04 0,38 ± 0,05 0,39 ± 0,02 0,44 ± 0,02 0,38 ± 0,03 0,33 ± 0,01 b

Massa Ventrículo Esquerdo (g) 0,77 ± 0,03 0,81 ± 0,1 0,72 ± 0,01 0,65 ± 0,12 0,78 ± 0,03 0,70 ± 0,02 0,83 ± 0,05 0,75 ± 0,02

VE g/100g massa coração (%) 68,85 ± 2,85 61,94 ± 2,55 64,96 ± 3,89 55,95 ± 11,91 68,16 ± 0,93 62,76 ± 2,12 65,00 ± 2,15 70,1 ± 2,41



a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT.

(n=8) (n=8) (n=8) (n=8)(n=8) (n=8) (n=8) (n=8)



CVS CVT VOS VOT CAS CAT AOS AOT

GRUPOS


A comparação entre as duas dietas exposta na Tabela 4 indica ausência de diferenças significantes nos

parâmetros biométricos analisados, embora tanto nos grupos de dieta vegetal como nos de dieta animal, verificou-se que

a ovariectomia promoveu o aumento do tecido adiposo visceral e que esse aumento não foi revertido pelo treinamento.


Além disso, os animais ovariectomizados de dieta animal e que foram

submetidos ao treinamento, apresentaram aumento da massa ventricular esquerda,

enquanto que os de mesmas intervenções, mas de dieta vegetal apresentaram redução

nessa variável, sugerindo um ajuste mais adequado no grupo de dieta vegetal.

5.3 Bioquímicos

5.3.1.Dieta de proteina Vegetal Tabela 5 - Valores bioquímicos dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal.

Glicose (mg/dL) 91 ± 2,06 100 ± 18,88 109 ± 12,49 73 ± 8,97

Triglicérides (mg/dL) 92 ± 3,57 89 ± 11,11 82 ± 6,12 110 ± 11,76

Colesterol Total (mg/dL) 72,60 ± 4,89 75,40 ± 10,98 69 ± 6,49 75,14 ± 8,37

HDL-col (mg/dL) 32,20 ± 2,22 27,00 ± 4,85 51,71 ± 5,51 50,10 ± 6,67

HDL-col (mg/dL) 32,20 ± 2,22 27,00 ± 4,85 51,71 ± 5,51 b 50,10 ± 6,67 b

CPK (mg/dL) 18908,00 ± 3822,48 2130,00 ± 890,59 a 3090,00 ± 1130,2 a 2591,67 ± 919,73 a

Homocisteina (umol/L) 11,16 ± 0,71 21,04 ± 2,58 a 8,043 ± 0,74 b 9,76 ± 1,24 b

PCR-us (mg/L) 0,54 ± 0,24 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00


HDL: High density Lipoprotein ; CPK: Creatinofosfoquinase; PCR-us: Proteina C reativa ultra sensível.

a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT.

CVT

(n=8)

VOS

(n=8)

VOT

(n=8)

GRUPOS


CVS

(n=8)

Os indivíduos de dieta proteica vegetal apresentaram quanto aos parâmetros

bioquímicos (Tabela 5) valores médios similares de glicose, triglicérides, colesterol total

e de proteína C ultrassensível em todos os grupos.

Porém, foi verificada uma tendência de aumento nos índices glicêmicos dos

animais VOS quando comparados aos animais controle CVS, minimizada pelo

treinamento, quando observados os valores dessa variável no grupo VOT em relação


ao grupo VOS. A intervenção do treinamento nos animais ovariectomizados também

propiciou tendência ao aumento nos índices de triglicérides e de colesterol total no

grupo VOT em relação ao grupo VOS.

Os animais VOT também apresentaram elevação significante nos valores médios

de HDL colesterol e diminuição significante de homocisteína quando comparados aos

animais VT, indicando no caso, a influência da ovariectomia sobre esses parâmetros

nos animais treinados.

Quanto ao CPK, houve aumento significante nos indivíduos CVT e VOS quando

comparados aos controles VS, indicando um incremento condicionado ao treinamento e

outro, mais acentuado, atrelado à ovariectomia.


Tabela 6 - Valores bioquímicos dos animais submetidos a dieta com proteína predominantemente animal

Glicose (mg/dL) 91 ± 2,29 99 ± 2,74 109 ± 15,02 67 ± 4,77

Triglicérides (mg/dL) 97 ± 3,12 97 ± 6,98 101 ± 8,67 99 ± 12,58

Colesterol Total (mg/dL) 72 ± 3,22 94,25 ± 27,01 85,57 ± 8,84 69,38 ± 4,90

HDL-col (mg/dL) 29,8 ± 1,46 29,5 ± 6,74 55,79 ± 3,12 41,85 ± 4,50

NHDL-col (mg/dL) 42,2 ± 2,13 64,75 ± 20,86 29,79 ± 7,37 27,53 ± 4,95 b

CPK (mg/dL) 27740,00 ± 5240,93 1770,00 ± 431,16 a 1771,00 ± 598,04 a 1770,00 ± 598,05 a

Homocisteina (umol/L) 12,3 ± 0,46 22,25 ± 2,01 a 8,99 ± 0,68 b 10,56 ± 0,48 b

PCR-us (mg/L) 0,55 ± 0,24 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00



a p < 0.05 vs CAS; b p < 0.05 vs CAT.

(n=8)(n=8)(n=8)(n=8)

GRUPOS


CAS CAT AOS AOT

Os dados referentes aos parâmetros bioquímicos do grupo de dieta proteica

animal (Tabela 56) indicaram que os níveis de glicose, triglicérides, colesterol total, HDL

colesterol e de proteína C ultrassensível variaram com similaridade entre os grupos,


embora os animais do grupo AOS tenham apresentado tendência à elevação dos

valores glicêmicos, de triglicérides e de HDL colesterol, quando comparados aos

animais do grupo controle CAS, fato possivelmente decorrente da ovariectomia. Essa

tendência foi amenizada pelo treinamento, pois o grupo AOT exibiu valores reduzidos

desses parâmetros quando comparados ao grupo AOS, demonstrando o benefício

dessa intervenção nessas variáveis.

Em relação ao NHDL colesterol e a homocisteína, houve redução significante no

grupo AOT quando comparado ao grupo CAT, indicando a influência positiva da

ovariectomia sobre esses parâmetros.

Os valores de CPK foram significantemente reduzidos nos grupos CAT e AOS

em relação ao grupo controle CAS, demonstrando a interferência da ovariectomia e do

treinamento nesses grupos.


5.3.3.Comparação entre dietas

Tabela 7 - Comparação dos valores bioquímicos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal.

Glicose (mg/dL) 91 ± 2,06 100 ± 18,88 109 ± 12,49 73 ± 8,97 91 ± 2,29 99 ± 2,74 109 ± 15,02 67 ± 4,77

Triglicérides (mg/dL) 92 ± 3,57 89 ± 11,11 82 ± 6,12 110 ± 11,76 97 ± 3,12 97 ± 6,98 101 ± 8,67 99 ± 12,58

Colesterol Total (mg/dL) 72,60 ± 4,89 75,40 ± 10,98 69 ± 6,49 75,14 ± 8,37 72 ± 3,22 94,25 ± 27,01 85,57 ± 8,84 69,38 ± 4,90

HDL-col (mg/dL) 32,20 ± 2,22 27,00 ± 4,85 51,71 ± 5,51 50,10 ± 6,67 29,80 ± 1,46 29,50 ± 6,74 55,79 ± 3,12 a b 41,85 ± 4,50

NHDL-col (mg/dL) 40,40 ± 3,34 48,40 ± 9,35 17,29 ± 2,46 25,04 ± 3,76 42,20 ± 2,13 64,75 ± 20,86 c d 29,79 ± 7,37 27,53 ± 4,95

CPK (mg/dL) 18908,00 ± 3822,48 2130,00 ± 890,59 3090,000 ± 1130,20 2591,67 ± 919,73 27740,00 ± 5240,93 b c d 1770,00 ± 431,16 a 1771,00 ± 598,04 a 1770,00 ± 598,05 a

Homocisteina (umol/L) 11,16 ± 0,71 21,04 ± 2,58 8,043 ± 0,74 9,76 ± 1,24 12,3 ± 0,46 b 22,25 ± 2,01 a c d 8,99 ± 0,68 b 10,56 ± 0,48 b

PCR-us (mg/L) 0,54 ± 0,24 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00 0,55 ± 0,24 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00 0,30 ± 0,00



a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT; c p < 0.05 vs VOS; d p < 0.05 vs VOT.

(n=8) (n=8) (n=8)(n=8) (n=8)(n=8) (n=8) (n=8)

GRUPOS

DIETA DE PROTEÍNA VEGETAL DIETA DE PROTEÍNA ANIMAL

CVT VOS VOT CAS CAT AOS AOTCVS

Os tipos de dieta proteica, vegetal ou animal, bem como as intervenções aplicadas, ovariectomia e treinamento,

não imprimiram alterações quanto aos parâmetros bioquímicos dos animais (Tabela 7). Porém, o treinamento nos

animais ovariectomizados destacou-se beneficamente nos ajustes dos índices glicêmicos, independente da dieta

consumida.


5.4 Morfométricos

5.4.1.Dieta de proteina Vegetal

Tabela 8 - Valores morfométricos dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal.

AST (µm2) 91203,80 ± 1225,44 90611,11 ± 1021,17 101223,54 ± 1397,39 a 83793,19 ± 879,37 a b

Dme (µm) 320,35 ± 3,34 316,86 ± 2,63 338,75 ± 3,33 a b 317,83 ± 2,26 c

Vv[mio] (%) 84,63 ± 0,70 82,33 ± 0,70 81,07 ± 0,56 a 79,63 ± 0,62 a b

Vv[nuc] (%) 0,84 ± 0,05 1,14 ± 0,07 1,30 ± 0,08 0,99 ± 0,06

Vv[cap] (%) 2,14 ± 0,18 3,95 ± 0,24 a 3,95 ± 0,21 a 3,43 ± 0,22

Vv[int] (%) 12,39 ± 0,70 12,58 ± 0,61 13,67 ± 0,52 15,95 ± 0,64 a b c


AST: Área de Secção Transversa dos Miócitos; Dme: Diâmetro Menor do Miócito; Miócitos;

Vv[mio]: Densidade de Volume dos Miócitos; Vv[nuc]: Densidade de Volume de Núcleos dos Miócitos;

Vv[cap]: Densidade de Volume dos Capilares; Vv[int]: Densidade de Volume de Interstício.

a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT; c p < 0.05 vs VOS.

(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

GRUPOS


CVS CVT VOS VOT

Os parâmetros morfométricos na dieta proteica vegetal, apresentados na Tabela

8 indicaram um aumento significante na área da secção transversa dos miócitos (AST)

no grupo VOS e um diminuição significante no grupo VOT, quando comparados aos

seus respectivos controles, CVS e CVT. A análise do diâmetro menor do miócito (Dme),

também apontou aumento significante no grupo VOS em relação ao CVS, mas também

uma redução significante dessa variável no grupo VOT quando comparado ao grupo

VOS. Esses resultados sugerem que a ovariectomia promoveu o aumento da AST no

indivíduo sedentário, que foi minimizado pelo treinamento, e esse fato foi confirmado

quando se observou os valores do Dme no grupo VOT em relação aos grupos CVS e

VOS.


Com relação densidade de volume dos miócitos cardíacos (Vv[mio]), o grupo

VOS sofreu uma redução significante quando comparado ao grupo CVS, assim como o

grupo VOT quando comparado ao grupo CVT, apontando que o treinamento é eficiente

quanto à essa variável.

Já a média da densidade de volume dos núcleos (Vv[nuc]) nessa dieta,

apresentou tendência de aumento no controle treinado (CVT) em relação ao controle

sedentário (CVS), bem como nos indivíduos ovariectomizados sedentários (VOS).

Porém, o treinamento no grupo ovariectomizado de dieta vegetal (VOT), apontou

tendência à redução, próxima aos valores dos Controles, CVS e CVT.

Quanto a densidade de volume dos capilares (Vv[cap]), os grupos CVT e VOS

apresentaram aumento significante em relação ao controle CVS, indicando que tanto a

ovariectomia quanto o treinamento promovem o aumento dessa variável sob esse tipo

de dieta, salientando uma tendência à redução no grupo ovariectomizado treinado

(VOT) quando comparado ao sedentário (VOS).

Em relação às médias das densidades de interstício (Vv[int]) verificou-se que o

grupo VOT apresentou aumento significante em relação aos demais grupos (CVS, CVT

e VOS), sinalizando que a ovariectomia induz ao aumento dessa variável no indivíduo

sedentário e que o treinamento promove o aumento desse parâmetro no indivíduo

ovariectomizado desse tipo de dieta.



Tabela 9 - Valores morfométricos dos animais submetidos à dieta com proteína predominantemente animal.

AST (µm2) 91164,8 ± 1089,73 87557,27 ± 1262,58 103385,37 ± 1615,94 a b 94310,23 ± 1487,19 b c

Dme (µm) 317,8 ± 2,86 317,06 ± 3,24 344,88 ± 3,80 a b 326,8 ± 3,62 c

Vv[mio] (%) 85,69 ± 0,57 76,65 ± 0,7 a 88,11 ± 0,29 b 84,17 ± 0,40 b c

Vv[nuc] (%) 2,41 ± 0,17 2,00 ± 0,09 a 1,60 ± 0,06 a b 1,52 ± 0,07 a b

Vv[cap] (%) 2,91 ± 0,11 5,99 ± 0,22 a 2,76 ± 0,08 b 4,88 ± 0,07 a b c

Vv[int] (%) 9,00 ± 0,57 15,36 ± 0,64 a 7,53 ± 0,29 b 9,43 ± 0,39 b c


AST: Área de Secção Transversa dos Miócitos; Dme: Diâmetro Menor do Miócito; Miócitos;

Vv[mio]: Densidade de Volume dos Miócitos; Vv[nuc]: Densidade de Volume de Núcleos dos Miócitos;


a p < 0.05 vs CAS; b p < 0.05 vs CAT; c p < 0.05 vs AOS.

(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

CAS CAT AOS AOT

GRUPOS


Nos grupos submetidos a dieta proteica animal, as áreas da secção transversa

dos miócitos (AST) apresentaram aumento significante no grupo AOS em relação ao

grupo CAS, assim como no grupo AOT em relação ao grupo CAT, indicando

interferência da ovariectomia sobre esse parâmetro. Além disso, houve redução

significante no grupo AOT quando comparado ao grupo AOS, evidenciando que o

treinamento possibilita a reversão do efeito promovido pela ovariectomia.

Praticamente essa mesma situação foi verificada quanto ao diâmetro menor do

miócito (Dme), embora não tenha havido significância estatística entre os valores do

Dme do grupo AOT quando comparado ao grupo CAT.

As médias da densidade de volume dos miócitos cardíacos (Vv[mio]) mostrou

significante redução no grupo CAT em comparação ao grupo AS, realçando o efeito do

treinamento nos animais controle. Dentre os grupos ovariectomizados dessa dieta, os

sedentários (AOS) apresentaram tendência ao aumento nos valores dessa variável em


relação aos controles (CAS), que foi minimizado pelo treinamento, pois o grupo AOT

mostrou valores significantemente menores quando comparados ao grupo AOS.

Quanto a densidades de volume dos núcleos (Vv[nuc]) os indivíduos controle

treinados (CAT) e os ovariectomizados sedentários (AOS) apresentaram diminuição

significante em relação aos controles sedentários (CAS). Também houve redução nos

valores dessas médias nos indivíduos ovariectomizados treinados (AOT) quando

comparados aos controles treinados (CAT).

Os valores das médias das densidades de volume dos capilares ( Vv[cap]) e do

interstício cardíaco (Vv[int]) comportaram-se de maneira semelhante nessa dieta,

havendo aumento significante nos animais controle treinados (CAT) em relação aos

controles sedentários (CAS), redução significante nos animais ovariectomizados

sedentários (AOS) quando comparados aos controles sedentários (CAS) e , aumento

significante nos indivíduos ovariectomizados treinados (AOT) quando comparados aos

indivíduos ovariectomizados sedentários (AOS).

Esses dados indicaram que o treinamento tanto nos animais controle (CAT)

quanto nos ovariectomizados (AOT) promoveu aumento nas densidades de volume dos

capilares e do interstício cardíaco quando comparados aos seus pares.



Tabela 10 - Comparação dos valores morfométricos entre os animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal.

AST (µm2) 91203,80 ± 1225,44 90611,11 ± 1021,17 101223,54 ± 1397 83793,19 ± 879,37 91164,8 ± 1089,73 87557,27 ± 1262,58 103385,37 ± 1615,94 94310,23 ± 1487,19

Dme (µm) 320,35 ± 3,34 316,86 ± 2,63 338,75 ± 3,33 317,83 ± 2,26 317,8 ± 2,86 317,06 ± 3,24 344,88 ± 3,80 326,8 ± 3,62

Vv[mio] (%) 84,63 ± 0,70 82,33 ± 0,70 81,07 ± 0,56 79,63 ± 0,62 85,69 ± 0,57 b c d 76,65 ± 0,70 a b c d 88,11 ± 0,29 a b c d 84,17 ± 0,40 b c d

Vv[nuc] (%) 0,84 ± 0,05 1,14 ± 0,07 1,30 ± 0,08 0,99 ± 0,06 2,41 ± 0,17 a b c d 2,00 ± 0,09 a b c d 1,60 ± 0,06 a b c d 1,52 ± 0,07 a b c d

Vv[cap] (%) 2,14 ± 0,18 3,95 ± 0,24 3,95 ± 0,21 3,43 ± 0,22 2,91 ± 0,11 a b c d 5,99 ± 0,22 a b c d 2,76 ± 0,08 a b c d 4,88 ± 0,07 a b c d

Vv[int] (%) 12,39 ± 0,70 12,58 ± 0,61 13,67 ± 0,52 15,95 ± 0,64 9,00 ± 0,57 a b c d 15,36 ± 0,64 a b c d 7,53 ± 0,29 a b c 9,43 ± 0,39 a b c d

Valores representam média ± erro padrão da média (EPM).

AST: Área de Secção Transversa dos Miócitos; Dme: Diâmetro Menor do Miócito; Vv[mio]: Densidade de Volume dos Miócitos; Vv[nuc]: Densidade de Volume de Núcleos dos Miócitos;


a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT; c p < 0.05 vs V0S; d p < 0.05 vs VOT.

(n=5) (n=5) (n=8)(n=5) (n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

GRUPOS



Na comparação entre as dietas verificou-se que os controles sedentários de dieta animal (CAS) apresentaram

aumento significante das densidades de volume nuclear (Vv[nuc]), e dos capilares (Vv[cap]) e diminuição significante da

densidade de volume de interstício (Vv[int]) quando comparados controles sedentários de dieta vegetal (CVS). Entre os

controles treinados houve aumento significante das densidades de volume nuclear (Vv[nuc]), dos capilares (Vv[cap]) e do

interstício (Vv[int]) e diminuição da densidade de volume dos miócitos cardíacos (Vv[mio]) quando comparados os

animais CAT com os animais CVT.


Esses dados apontaram nos controles sedentários de dieta animal (CAS) uma

melhor condição do tecido cardíaco em decorrência da ampliação dos capilares e do

interstício.

Com relação aos animais ovariectomizados sedentários, os de dieta animal

(AOS) apresentaram aumento significante da densidade de miócitos (Vv[mio]), da

densidade de volume nuclear (Vv[nuc]) e redução significante da densidade de volume

dos capilares (Vv[cap]) e da densidade de volume do interstício (Vv[int]), quando

comparados aos de dieta vegetal (VOS).

Nos indivíduos ovariectomizados treinados de dieta animal (AOT) houve

aumento significante da densidade de miócitos (Vv[mio]), da densidade de volume

nuclear (Vv[nuc]), da densidade de volume dos capilares (Vv[cap]) e diminuição

significante da densidade de volume de interstício (Vv[int]) quando comparados aos

indivíduos de dieta vegetal (VOT).

Esses resultados indicaram que a ovariectomia no indivíduo sedentário de dieta

animal (AOS) causou uma redução mais impactante da densidade de volume dos

capilares (Vv[cap]) e da densidade de volume de interstício (Vv[int]) do que no indivíduo

de sedentário de dieta vegetal (VOS). Embora tenha havido um aumento da densidade

de volume dos capilares (Vv[cap]) e da densidade de volume de interstício (Vv[int]) no

indivíduo ovariectomizado sedentário de dieta vegetal (VOS), o treinamento nesse

grupo não se mostrou tão eficiente quanto no ovariectomizado de dieta animal (AOT).


A organização dos componentes morfológicos do miocárdio do ventrículo

esquerdo dos animais estudados está apresentada na Figura 9.

Figura 9- Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corados em H/E em aumento de x400 dos vários grupos, evidenciando cardiomiócitos (cabeça de seta vermelha), interstício (cabeça de seta verde) e capilares sanguíneos (cabeça de seta amarela). Barra: 50 µm


5.5 Colágeno

5.5.1.Dieta de proteina Vegetal Tabela 11- Valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos a dieta com proteína vegetal.

Vv[col I] (%) 1,35 ± 0,27 1,54 ± 0,17 2,13 ± 0,20 2,17 ± 0,20

Vv[col III](%) 0,34 ± 0,11 1,29 ± 0,22 0,64 ± 0,12 2,59 ± 0,29 a b c


Vv[col I]: Densidade de Volume de Colágeno I; Vv[col III]: Densidade de Volume de Colágeno III;

a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT; c p < 0.05 vs VOS.

GRUPOS


CVS CVT VOS VOT

(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

Os indivíduos controle treinados de dieta vegetal (CVT) apresentaram tendência

ao aumento das densidades de colágeno do tipo I (Vv[col I]), quando comparados aos

controles sedentários (CVS), tendência essa confirmada e de maior impacto quando se

observou os indivíduos VOS e VOT comparados entre si e com os respectivos controles

(CVS) e (CVT). Esses fatos sugerem que a ovariectomia pode promover considerável

aumento nessa variável e que o treinamento, tanto dos controles (CVT) quanto dos

ovariectomizados (VOT) parece manter esse aumento (Tabela 11).

Em relação às densidades de colágeno do tipo III (Vv[col III]), também foi

observada uma tendência ao aumento nos indivíduos ovariectomizados sedentários

(VOS) quando comparados aos controles sedentários (CVS), porém a tendência mais

expressiva foi verificada no controle treinado (CVT) em relação ao controle sedentário

(CVS). Aumento significante nessa variável foi apresentado pelo grupo VOT quando

comparado aos grupos CVT e VOS. Esses dados sugerem que a ovariectomia, no

indivíduo sedentário desse tipo de dieta, pode conduzir ao aumento da densidade de


volume do colágeno do tipo III (Vv [col III]) e que o treinamento no animal controle pode

promover um aumento mais acentuado dessa variável. No entanto, o indivíduo

ovariectomizado que se submeteu ao treinamento exibiu aumento mais efetivo nesse

parâmetro.


Tabela 12 - Valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos a dieta com proteína animal.

Vv[col I] (%) 1,82 ± 0,43 1,12 ± 0,11 2,56 ± 0,22 b 1,38 ± 0,22 c

Vv[col III](%) 0,45 ± 0,13 1,59 ± 0,16 a 1,45 ± 0,25 1,87 ± 0,33 a



a p < 0.05 vs CAS; b p < 0.05 vs CAT; c p < 0.05 vs AOS.

CAS CAT AOS AOT

(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

GRUPOS


As densidades de volume do colágeno I (Vv[col I]) nos indivíduos de dieta animal

apresentaram tendência à diminuição no grupo CAT quando comparado ao grupo CAS,

indicando a ação do treinamento nos animais controle. A ovariectomia no grupo

sedentário (AOS) possibilitou tendência ao aumento dessa variável em relação ao

controle (CAS) e o efeito do treinamento pode ser verificado, pois houve redução

significante no grupo AOT em relação ao AOS quanto a esse parâmetro.

Em relação aos valores das médias das densidades de volume do colágeno III

(Vv [col III]) houve aumento significante no grupo CAT em comparação ao CAS.

Quando ovariectomizados, os indivíduos sedentários (AOS) exibiram tendência ao

aumento das densidades dessas fibras quando comparados ao grupo controle

sedentário (CAS) e o treinamento não foi efetivo na reversão desse efeito, ocorrendo

uma tendência a maiores valores dessa variável no grupo AOT em relação ao AOS.



Tabela 13 - Comparação entre os valores das densidades de volume das fibras colágenas do tipo I e do tipo III presentes no miocárdio dos animais submetidos as dietas proteicas predominantemente vegetal e animal.

Vv[col I] (%) 1,35 ± 0,27 1,54 ± 0,17 2,13 ± 0,20 2,17 ± 0,20 1,82 ± 0,43 1,12 ± 0,11 2,56 ± 0,22 1,38 ± 0,22

Vv[col III](%) 0,34 ± 0,11 1,29 ± 0,22 0,64 ± 0,12 2,59 ± 0,29 0,45 ± 0,13 c 1,59 ± 0,16 a 1,45 ± 0,25 a c 1,87 ± 0,33 a c



a p < 0.05 vs CVS; b p < 0.05 vs CVT; c p < 0.05 vs VOS; d p < 0.05 vs VOT.

GRUPOS



(n=5) (n=5) (n=5)(n=5) (n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

Na comparação entre as dietas, os indivíduos AOS apresentaram aumento significante em relação aos indivíduos

VOS quanto à densidade de volume do colágeno III (Vv[col III]), apontando que a ovariectomia no grupo sedentário de

dieta animal promove um efeito mais protetor no tecido cardíaco.

A observação dos valores da Tabela 13 indicou que a ovariectomia no indivíduo sedentário nas duas dietas impôs

uma tendência ao aumento das densidades de colágeno do tipo I e também nas do tipo III, embora essa tendência tenha

sido mais efetiva nos grupos de dieta proteica vegetal. Com relação ao treinamento, nos controles CVT e CAT as

variações foram semelhantes quando comparados aos sedentários CVS e CAS, embora tenha havido uma tendência à

redução das densidades das fibras do colágeno I na dieta animal.

R e s u l t a d o s 7 1

Já, considerando os indivíduos ovariectomizados VOT e AOT, a intervenção do

treinamento promoveu tendência à redução das fibras colágenas do tipo I no grupo de

dieta animal e uma tendência ao aumento das densidades das fibras colágenas do tipo

III, com maior expressão na dieta vegetal.

Esses dados parecem indicar que existe uma melhor conformação no tecido

cardíaco nos indivíduos treinados que consumiram dieta de fonte proteica animal,

sinalizando o efeito protetor promovido por esse tipo de dieta.


A organização das fibras colágenas do tipo I e do tipo III no miocárdio do

ventrículo esquerdo dos animais estudados está apresentada na Figura 10.

Figura 10 - Fotomicrografia de corte transversal do ventrículo esquerdo corado em Picrosiruss em aumento de x400 dos animais dos vários grupos, evidenciando em vermelho e alaranjado as fibras colágenas do tipo I e em verde as fibras colágenas do tipo III, presentes no miocárdio. Barra: 50 µm


5.5.4.Diâmetro das fibras colágenas do tipo I e do tipo III

Figura 11 - Histograma da distribuição de frequências do diâmetro das fibras colágenas do tipo III (FCIII), Intermediária (FC Int), e tipo I (FCI), presentes no miocárdio dos animais estudados.

A análise ultaestrutural dos diâmetros das fibras colágenas presentes no

miocárdio dos vários grupos estudados (Figura 11) apontou aumento das fibras

colágenas do tipo I e diminuição das do tipo III nos animais CVS quando comparados

aos CVT, enquanto que no grupo CAT houve redução das fibras do tipo I e manutenção

das do tipo III quando comparado ao se controle sedentário (CAS). Esse fato sugere

que os animais controle submetidos à dieta animal apresentaram melhor resposta ao

treinamento

Quando submetidos à ovariectomia, os animais sedentários de dieta

predominantemente vegetal e sedentários (VOS) apresentaram aumento das fibras

colágenas do tipo I e diminuição das do tipo III, quando comparados aos controles

sedentários (CVS), embora tais valores sejam inferiores aos apresentados pelos


controles treinados (CVT) nessa comparação. Já os animais ovariecomizados

sedentários de dieta predominantemente animal apresentaram redução das fibras do

tipo I e pequeno aumento das do tipo III em relação aos controles CAS, comportando-

se similarmente ao grupo CAT. Assim, a ovariectomia parece ter maior impacto

negativo quanto à esse parâmetro nos indivíduos sedentários submetridos à dieta

proteica vegetal do que nos ovariectomizados de dieta proteica animal.

Em relação à intervenção do treinamento aplicado nos animais

ovariectomizados, o grupo VOT indicou acentuado aumento das fibras colágenas do

tipo I e diminuição das fibras colágenas do tipo III em comparação aos grupos CVS e

VOS. Os animais de dieta predominantemente animal treinados (AOT) apresentaram

aumento expressivo das fibras do tipo I e diminuição das do tipo III em relação aos

animais AOS e também aos CAS, embora com valores não tão acentuados quanto à

esse último grupo.

Comparando-se as dietas quanto à distribuição das frequências dos diâmetros

das fibras colágenas, verificamos que as fibras intermediárias mantiveram um mesmo

padrão em quase todos os grupos, exceto no grupo CAT, onde houve aumento quando

comparado ao CAS e diminuição desse parâmetro nos animais do grupo AOT quando

comparado aos grupos CAS, CAT e AOS.

Esses resultados sugerem que o treinamento imposto nos indivíduos

ovariectomizados que consumiram dieta de fonte proteica animal favorece a um melhor

equilíbrio na distribuição das fibras colágenas no miocárdio.


A distribuição das fibras colágenas do tipo I e do tipo III no miocárdio do

ventrículo esquerdo dos animais estudados está apresentada na Figura 12

Figura 12 – Ultramicrografia eletrônica do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x12000 evidenciando a distribuição das fibras colágenas do tipo I (de maior diâmetro) e das fibras colágenas do tipo III (de menor diâmentro) nos vários grupos estudados. Barra de 10nm.


5.6 Imunoexpressão das Metaloproteinases 2 e 9 ( MMP2 e MMP9)

A expressão da MMP2 (Figura 13) e da MMP9 (Figura 14) no miocárdio do

ventrículo esquerdo dos animais de estudo estão apresentadas a seguir:

Figura 13 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x100 evidenciando a expressão da MMP2 nos vários grupos estudados. Barra de 10µm.


Figura 14 - Fotomicrografia do miocárdio do ventrículo esquerdo em aumento de x100 evidenciando a expressão da MMP9 nos vários grupos estudados. Barra de 10µm.


A análise semiquantitativa da e expressão da metaloproteinase 2 (MMP2) e da

metaloproteinase 9 (MMP9) está representada na Figura 15.

Figura 15 - Análise semi-quantitativa da expressão das MMP-2 e MMP-9 no miocárdio.

Quanto à expressão das MMP2 e MMP9 no miocárdio dos animais que

consumiram dieta predominantemente vegetal, o grupo CVT apresentou redução da

expressão da MMP2 como também da MMP9 quando comparado ao grupo CVS. Após

a ovariectomia, os animais VOS apresentaram aumento da MMP2 e também da MMP9

quando comparados aos do grupo CVS, indicando fibrose e remodelamento cardíaco.

O treinamento conferiu ao grupo ovariectomizado de dieta vegetal (VOT) um

expressivo aumento da MMP2 e uma diminuição da MMP9 em relação ao grupo VOS

indicando maior ação fibrótica e menor remodelamento no coração desses animais. Na

dieta predominantemente animal, o treinamento imposto aos controles (CAT)

determinou uma impactante redução na atividade das MMP2 e MMP9 quando

comparado aos sedentários (CAS), sugerindo redução da fibrose e do remodelamento

nesse grupo.

Os animais submetidos a dieta proteica animal, quando ovariectomizados e

sedentários (AOS) apresentaram aumento da MMP2 e diminuiçao da MMP9 quando


comparados aos controles CAS, sugerindo assim uma intensificação da fibrose e uma

contenção do remodelamento cardíaco.

Quando submetidos ao treinamento os animais AOT exibiram sensível redução

da MMP2 e também da MMP9 em relação aos animais AOS, sugerindo minimização

do processo fibrótico e da remodelação cardíaca nesses animais.

Ao compararmos as diferentes dietas proteicas verificou-se que os indivíduos

ovariectomizados sedentários submetidos à dieta proteica animal respondem de

maneira semelhante aos da dieta proteica vegetal, porém quando aplicada a

intervenção do treinamento resistido nesses animais ovariectomizados, apresentam

melhora na situação principalmente nos animais integrantes do grupo de dieta com

proteina predominantemente animal.

Nossos resultados em relação às densidades de volume, a distribuição dos

diâmetros das fibras colágenas I e III no miocárdio dos animais de estudo confirmaram-

se na análise semiquantitativa da expressão das MMP2 e MMP9 nesse tecido.

D i s c u s s ã o 8 0

6. DISCUSSÃO

O aumento da expectativa de vida, aliado à queda nas taxas de fecundidade e de

mortalidade, determinam o processo de envelhecimento populacional, tido hoje como

uma realidade mundial (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).

Esse fato motivou o desenvolvimento de vários estudos sobre o envelhecimento

humano e seu impacto sobre os sistemas e órgãos (MATSUDO et al, 2000; DA CRUZ,

2002; MENDES & THEMUDO BARATA, 2008; BOENGLER et al, 2009; GAI et al, 2010;

VERAS RP, 2012), com atenção ao sexo feminino frente as importantes alterações

promovidas pelo advento da menopausa (WENDER & CAMPOS, 2001; ALDRIGHI et al,

2002; MARTINS & SILVA, 2006; DA SILVA DIAS et al,2011; OLIVEIRA et al, 2013;

BRAGGION, GF,2014; MARCHON et al, 2015).

Diversas estratégias foram propostas no intuito de amenizar os efeitos do

envelhecimento e da menopausa sobre todo o organismo, destacando-se a dieta e o

exercício como intervenções de impacto positivo, determinantes de uma melhor

qualidade de vida (NELSON et al, 2007; WIPFLI et al, 2008; CARVALHO et al, 2010;

PRONK et al; 2011; TIERNEY et al, 2011; FOSTER‐SCHUBERT et al, 2012;

BRAGGION, GF, 2014).

Nesse sentido, nosso trabalho visou abordar os efeitos promovidos pelo

exercício resistido associado a dietas de diferentes fontes proteicas sobre o ventrículo

esquerdo de ratas idosas ovariectomizadas.

Parâmetros Biométricos

Massa corporal e tecido adiposo visceral

Dentre as alterações impostas em decorrência do envelhecimento, destaca-se o

aumento na massa corporal dos indivíduos, como apontado por Campos et al (2006) e

Mazo et al (2007) em estudos com idosos de ambos os gêneros, e por Woodrow (2009)


que em sua revisão, destacou a importância da análise da composição corporal no

envelhecimento e suas consequências para a saúde.

Andrade & Matsudo (2010), avaliando a força e a potencia muscular em

mulheres, também relacionou a alteração da massa corporal à potência muscular e ao

comprometimento funcional determinado pelo envelhecimento. Pesquisas

desenvolvidas por nossa equipe (BRAGGION, 2014), com modelo dieta/exercício, em

estudo sobre os músculos sóleo e gastrocnêmio medial, sugeriram que o aumento da

massa corporal poderia estar associado também a alterações no arranjo das fibras

musculares esqueléticas, condicionado pelo envelhecimento, pela fonte proteica e pelo

exercício.

Além da atuação do envelhecimento sobre esse parâmetro, verificamos ainda

que o incremento na massa corporal se mostrou mais efetivo nos animais submetidos à

ovariectomia, sugerindo dessa maneira a influência da depleção hormonal sobre essa

variável, também verificado nos trabalhos de Lins & Sichieri (2001) e de Donato et al

(2006) em estudos de coorte transversal com mulheres pós menopausadas. Os autores

atribuíram a baixa produção dos hormônios ovarianos, ao estabelecimento da

menopausa, ao ganho de massa corporal, resultado também observado na pesquisa de

Cabanelas et al (2012) sobre a morfologia dos cardiomiócitos de ratas ovariectomizadas

tratadas com estrogênios ou isoflavonas.

O sobrepeso mostrou-se inversamente proporcional ao consumo de proteínas no

trabalho de Herbert et al (2003), estudando mulheres americanas entre 50 e 79 anos,

resultado também encontrado recentemente por Steiner et al (2015) pesquisando

mulheres brasileiras na pós –menopausa.

Cabe lembrar que Gordon et al (2008) ao submeter mulheres obesas pós

menopausadas a dietas hipo e hiperproteicas, demonstraram que embora não tenha

havido diferenças em relação à perda de peso entre elas, o grupo que consumiu mais

proteína apresentou menor perda de massa magra.

As mudanças no perfil biofísico feminino pós-menopausa manifestadas pela

redução dos componentes da massa isenta de gordura também foram objeto de estudo

de Messier at al (2011), assim como o aumento nos níveis de adiposidade total,

revelado por Kuczmarski et al (2010) em seu artigo de revisão. Esses fatos arrestam


diretamente com nossos resultados, uma vez que houve aumento de massa corporal e

do tecido adiposo visceral dos animais ovariectomizados nas duas dietas, embora

tenha sido mais pontual nos indivíduos submetidos à dieta proteica animal.

Parâmetros Bioquímicos

O envelhecimento também é atrelado a comprometimentos cardiovasculares

associados a fatores de risco e à insuficiência cardíaca, como as alterações

metabólicas citadas por Alberti et al (2009) em importante artigo, resultante da

unificação de critérios para qualificar a síndrome metabólica.

As modificações como aumento da pressão arterial e de níveis de triglicérides,

redução de colesterol e lipoproteína de alta densidade (HDL), hiperglicemia, obesidade

e principalmente a adiposidade abdominal, são parâmetros abordados por Miura et al

(2010) em estudo clínico envolvendo 3603 pacientes com doença cardíaca isquêmica.

Esses indicadores também estavam presentes em artigo Ferland & Eckel (2011) que

estudaram as evidências clínicas e experimentais para a reversão das complicações

metabólicas na perda de peso sustentável.

Estudos de Janssen et al (2008), Cho et al (2009) e de Eshtiaghi et al (2010)

demonstraram que o estado de menopausa foi preditor independente para a síndrome

metabólica, o que foi reforçado pela análise de vários estudos sobre a prevalência

dessas alterações na transição menopáusica realizado por Mendes et al (2012) em sua

revisão sistemática.

A relação entre a composição corporal e o perfil lipídico - glicêmico de mulheres

sedentárias na pós–menopausa e, analisada por Rodrigues & Chagas (2015) sugere

que o envelhecimento possa ser o fator de maior impacto sobre as alterações nos

níveis lipídicos dessa população.

Nossos resultados bioquímicos apontaram hiperglicemia nas ratas idosas

ovariectomizadas sedentárias, concordando com os autores supracitados, e ajustada

com a intervenção do treinamento, corroborando com as pesquisas de Roussel et al

(2009), Bateman et al (2011), Gremeaux et al (2012) e Choi (2012), que avaliaram o


impacto do exercício físico em mulheres menopausadas sedentárias sobre as variáveis

metabólicas plasmáticas.

A intervenção da ovariectomia em nosso trabalho, também relevou elevação nos

níveis glicêmicos em todos os indivíduos e promoveu aumento de triglicérides nos

indivíduos tratados com dieta proteica animal. Sabe-se que a elevação das

concentrações sanguíneas de glicose caracteriza-se por ser um fator de risco

independente para os eventos cardiovasculares (SPOSITO et al, 2007) e que as

variações nos níveis das triglicérides e do colesterol podem determinar um

agravamento dessa condição (FIGUEIREDO NETO et al, 2010) assim, intervenções

como o exercício e a dieta, parecem contribuir para a minimizar esses agravos.

O efeito negativo da menopausa sobre as variáveis hemodinâmicas também foi

apontado nos trabalhos de Fahlman et al (2002); Correa et al (2014) e de Chagas et al

(2015), diferentemente dos nossos resultados onde os níveis de HDL-col e de CPK se

mostraram significantemente aumentados nos indivíduos ovariectomizados tanto

sedentários, como treinados.

A homocisteína também sofreu incremento significativo nesses animais,

antagonicamente aos trabalhos de Vincent et al (2006) e Okura et al (2007) que

associaram o efeito benéfico do exercício físico à redução dos níveis de homocisteína

no sangue.

Esses resultados divergentes da literatura consultada podem estar relacionados

ao modelo proposto, uma vez que os autores trabalharam com mulheres idosas e

menopausadas, enquanto que em nosso estudo foi utilizado um modelo animal, com

indução da menopausa pela ovariectomia. Outro fator que pode ter interferido foi o tipo

de exercício aplicado e o tempo de intervenção que também foram diversos nos

trabalhos consultados.

As demais variáveis bioquímicas analisadas, triglicérides, colesterol total, NHDL-

col, PCR-us não apresentaram variações significantes.

Em relação ainda aos parâmetros biométricos, agora direcionados ao risco

cardiovascular, cabe salientar a abordagem experimental de Gardner et al (2005) que

verificaram a cardioproteção em ratas fêmeas tratadas com fitoestrógenos, reforçando o

fato de que o advento da menopausa está associado a alterações hemodinâmicas e a


um remodelamento ventricular esquerdo. Na verdade, a associação entre a instalação

da menopausa e a predisposição aos comprometimentos cardiovasculares é um

consenso mundial entre autores tanto em estudos transversais em países como o

Taiwan (LIN et al, 2006), a China (FENG et al, 2008) e o Brasil (FIGUEIREDO NETO,

2010), como de coorte realizado na Holanda por Henneman et al (2010).

Em nossos registros, apesar de não terem sido constatadas variações nos

parâmetros da relação coração/massa corporal e massa ventricular esquerda/coração

nos grupos, observou-se uma tendência ao aumento dessas variáveis nos grupos

ovariectomizados de dieta animal. Esse fato pode estar associado ao tipo de proteína

presente na dieta oferecida, já que a proteína de origem animal pode promover

aumento da massa muscular esquelética e hipertrofia em animais submetidos a

treinamento resistido, como verificado na revisão realizada por Graf em 2011 e

confirmada por nosso grupo, nos estudos de Braggion (2014) com relação aos

músculos sóleo e gastrocnêmio medial, no mesmo modelo estudado.

Importantes estudos têm apontado para os efeitos positivos do exercício

sobre os parâmetros biométricos e bioquímicos no envelhecimento, como o de Martins

et al (2010) envolvendo homens e mulheres idosos sedentários em um programa de

treinamento aeróbico e de força por um período de 16 semanas que obteve benefícios

significativos nos indicadores de saúde desse grupo. A comparação entre a eficácia do

treinamento aeróbico em relação ao treinamento resistido, e ainda sua combinação em

indivíduos dos dois gêneros entre 18 e 70 anos de idade, proposto por Bateman et al

(2011) apontou a maior eficiência do treinamento aeróbico na melhoria da saúde

cardiometabólica. A atividade física de intensidade moderada como a caminhada ao

longo de 16 semanas em mulheres na pós-menopausa, proposta por Roussel et al

(2009), e em ratas ovariectomizadas submetidas ao treinamento em esteira sugerida

por FLUES et al (2010) mostraram minimização das desordens metabólicas.

As variáveis biométricas e bioquímicas apresentaram melhora significante nos

resultados obtidos por Wang et al (2014), imposta pela aplicação de exercícios de

resistência em mulheres menopausadas por 12 semanas. Nessa mesma linha de

raciocínio, Friedenreich et al (2015) observaram a eficácia do exercício aeróbico

moderado e vigoroso na gordura corporal de indivíduos femininos na menopausa.


Os incontestáveis benefícios impostos pela intervenção do treinamento podem

ser potencializados pela sua integração com a dieta, como propôs Lavoie et al (2013)

em estudo que revelou a atuação positiva dessas duas intervenções em mulheres

menopausadas quanto ao controle do risco cardiometabólico. Esse tipo de associação

de dieta e exercício também se mostrou relevante no trabalho de Braggion (2014) sobre

a musculatura estriada esquelética e foi pontuado pelos nossos grupos treinados.

Nossos animais ovariectomizados treinados exibiram melhores ajustes glicêmicos

independentes da dieta consumida, muito embora em termos de condição ventricular,

os índices mais ajustados pertenceram aos indivíduos ovariectomizados treinados

submetidos à dieta animal.

Parâmetros Morfométricos

A condição cardíaca está também atrelada à arquitetura do miocárdio, às

propriedades dos cardiomiócitos e da matriz cardíaca com seus elementos

constituintes. Assim, torna-se importante a análise do tecido cardíaco como um todo,

considerando as alterações sofridas por esse órgão em decorrência do envelhecimento

e da menopausa.

Diversas alterações estruturais e funcionais ocorrem no sistema circulatório

devido ao avanço da idade. Essas modificações atuam como mecanismos adaptativos

compensatórios às situações de sobrecarga, sendo a hipertrofia da parede ventricular e

a rigidez arterial respostas a esse processo (CHAUDHARY et al, 2011).

A alteração fisiológica mais comum relacionada ao envelhecimento no sistema

cardiovascular é a disfunção diastólica, determinada pelo aumento da massa ventricular

esquerda caracterizada na hipertrofia, e as limitações nas propriedades elásticas da

musculatura cardíaca que se impõem com a idade (MANDINOV et al, 2000; BOOGERS

et al, 2011).


O aumento na espessura da parede ventricular, instituído por um decréscimo

numérico dos cardiomiócitos hipertrofiados, é acompanhado pelo aumento do conteúdo

de colágeno no interstício, determinado pela alteração do metabolismo mitocondrial que

contribui para uma elevação na secreção do colágeno e ainda induz a apoptose de

células musculares lisas da parede arterial, colaborando para o aumento da rigidez

aórtica. (DAI et al, 2012). Essa rigidez aumentada contribui para hipertrofia ventricular

esquerda, disfunção diastólica e insuficiência cardíaca congestiva.

A redução da área ocupada pelos miócitos cardíacos promovida pelo

envelhecimento também foi verificada no trabalho de Gonçalves et al (2012) estudando

o miocárdio de ratos.

Sant'Anna et al (2012) estudando 90 corações de homens e mulheres com

hipertrofia ventricular esquerda verificaram a prevalência dessa condição no grupo

feminino menopausado quando comparado ao grupo pré-menopausado, resultado

indicativo da intervenção hormonal.

Na mesma linha de raciocínio, Liou et al (2010) e Liu et al (2012) documentaram

a ação atenuante do estrógeno sobre o processo hipertrófico cardíaco em pesquisas

com ratas que apresentaram redução nos índices apoptóticos e de necrose das células

endoteliais.

Panorama semelhante foi observado em relação aos nossos animais

ovariectomizados em relação aos componentes do tecido cardíaco e sua matriz. Na

análise dos cardiomiócitos ventriculares esquerdos verificou-se um aumento significante

na AST, no Dme, no Vv[nuc] no Vv[cap] e uma diminuição na Vv[mio], acompanhado de

discreta tendência ao aumento do VV[int]. Esses dados corroboram com os achados da

literatura e delineiam um processo hipertrófico, uma vez que houve um aumento das

dimensões celulares com redução da sua ocupação em termos de volume, condição

que possibilitou uma maior presença dos vasos sanguíneos determinados pelo

aumento do Vv[cap] e pela tendência de aumento do Vv[int].


A hipertrofia dos miócitos cardíacos determinando o aumento do coração é uma

resposta a vários estímulos, dentre eles a depleção estrogênica imposta pela

ovariectomia. Esse processo hipertrófico, também sinalizado nos trabalhos de Mori et

al (2011), Knowlton et al (2012), Murase et al (2012), Dalpiaz et al (2014) mostrou-se

atenuado pela intervenção do treinamento no estudo de Lima et al 2012, que aplicando

um treinamento de resistência em ratas idosas sedentárias, obteve diminuição na perda

da densidade de volume dos cardiomiócitos, diminuição de volume das fibras colágenas

e aumento da densidade de volume dos capilares. Barauna et al, 2005 verificaram que

o exercício resistido promove aumento da pressão intraventricular, maximizando o

estresse na parede do miocárdio servindo assim como estímulo para a hipertrofia desse

tecido. Em resposta a esse estímulo, o coração aumenta a espessura da parede

ventricular esquerda, desencadeando a hipertrofia concêntrica (HAYKOWSKY et al,

2000; LEVINGER et al, 2005) e os cardiomiócitos nesse contexto, aumentam sua área

de secção transversa, no intuito de promover aumento da contractilidade intrínseca

celular (KEMI et al, 2005; MARON & PELLICIA, 2006). Esses resultados também

estiveram presentes em nosso trabalho, pois embora tenha havido um ligeiro aumento

no Vv[int] nos grupos VOT, todos os demais parâmetros em questão mostraram-se

significantemente reduzidos, indicando a ação benéfica do treinamento na constituição

miocárdica dos indivíduos ovariectomizados de ambas as dietas, com destaque para os

animais do grupo AOT que exibiram uma melhor resposta em relação a Vv[cap].

A estrutura da matriz intersticial do miocárdio é fundamental para a manutenção

da integridade cardíaca e, quando nos referimos ao interstício celular no caso dos

cardiomiócitos, torna-se relevante considerar os tipos de fibras presentes nesse tecido,

em especial as fibras colágenas, não só em termos quantitativos, mas também

qualitativamente, já que são responsáveis diretas por certas propriedades cardíacas.

Em seu artigo de revisão, Bower et al, 2006 descreveu a organização estrutural

do colágeno no miocárdio, e os efeitos dessa arquitetura sobre a função ventricular,

relacionando a resposta miocárdica diretamente à proporção, tipo e diâmetro das fibras

colágenas presentes na matriz extracelular cardíaca.


Estudo experimental em humanos sobre a quantificação do colágeno no

ventrículo esquerdo realizado por Mendes et al, 2012 revelou que há aumento do

colágeno tipo I e diminuição do colágeno tipo III de acordo com o avanço da idade nos

indivíduos.

A quantificação do colágeno em ratas ovariectomizadas também foi avaliada por

Cabanelas et al, 2012 apontando para aumento da deposição do colágeno entre as

fibras musculares cardíacas, sendo revertido pela ação do estrógeno e das isoflavonas,

garantindo assim a preservação das propriedades mecânicas do coração nos animais.

Os resultados das porcentagens das densidades de colágeno I e III em nossa

pesquisa, mostraram que a ovariectomia promoveu uma tendência ao aumento desses

parâmetros em todos os animais, alinhando com os dados da literatura, sendo mais

marcante nos grupos de dieta proteica vegetal.

Modificações na distribuição dos componentes estruturais cardíacos com

aumento da área ocupada pelo interstício e pelo colágeno atrelados ao envelhecimento

foram sinalizados por Gonçalves et al, 2012 em trabalho com ratos , salientando que o

exercício resistido estabelece reversão do acumulo de colágeno miocárdico decorrente

da idade avançada, uma vez que esse tipo de treinamento em animais adultos promove

um incremento maior no conteúdo de colágeno ventricular esquerdo, como observado

por Souza et al, 2014.

Recentemente, nosso grupo de estudos conferiu a minimização dos efeitos

negativos no ventrículo esquerdo promovidos pelo déficit estrogênico em ratas idosas

determinada pelo treinamento resistido em trabalho experimental de Lima et al 2012,

obtendo uma redução significante de 19% na densidade de volume de fibras colágenas

nos animais submetidos a esse tipo de exercício.

A intervenção do treinamento resistido proposto em nosso trabalho mostrou-se

concordante com os autores consultados, pois configurou uma tendência à redução nas

densidades de volume das fibras colágenas do tipo I na dieta animal e aumento nas


densidades de volume das fibras colágenas do tipo III em ambas as dietas, sendo mais

expressivo no grupo de dieta vegetal.

Dessa forma, em termos de distribuição quantitativa das fibras colágenas do tipo

I e III, o tecido cardíaco dos indivíduos treinados de dieta proteica animal se apresentou

com melhor conformação.

Com relação aos aspectos de distribuição qualitativa das fibras colágenas, a

análise ultraestrutural baseou-se nos arranjos de aglomerados (clusters) densos de

fibras colágenas do tipo I, com média de 75nm de espessura e de aglomerados

(clusters) finos de fibras colágenas do tipo III, com média de 45nm de espessura,

classificados por Junqueira & Carneiro, 1995.

Essas bases de medidas foram consideradas no trabalho de Benedicto, 2005

que através da microscopia eletrônica de varredura aplicada em corações de cães,

avaliou o arranjo estrutural das fibras colágenas após maceração por NaOH, tendo

como resultado a presença de fibras mais grossas nos animais mais velhos e fibras

mais finas nos mais jovens.

A predominância de fibras colágenas de maior espessura na musculatura

cardíaca de idosos, sinalizando fibras do tipo I, foi também evidenciado por Mendes et

al, 2012 em estudo de corações humanos de diferentes faixas etárias.

Nossos dados de análise ultraestrutural seguem a mesma tendência dos

trabalhos consultados, demonstrando a presença em maior quantidade das fibras

colágenas do tipo I e uma diminuição das fibras colágenas do tipo III nos animais

ovariectomizados sedentários independente da dieta consumida.

Outros componentes de importância na matriz extracelular cardíaca são as

metaloproteinases 2 e 9, enzimas que atuam na sua decomposição e protagonizam o

processo de remodelação cardíaca.


Pereira et al, 2010 pesquisando em tendões calcâneos de ratas

ovariectomizadas submetidas ao treinamento de resistência, concluíram que tanto a

privação hormonal como o tipo de exercício modulam a atividade da MMP2.

No tecido ósseo, trabalho realizado por Shiguemoto et al, 2012, apontou que o

exercício de resistência foi eficiente na minimização dos efeitos deletérios causados

pela menopausa, mas que a ovariectomia reduziu a atividade das MMP2 sobre esse

tecido, similarmente à menopausa.

Estudando a musculatura cardíaca de ratas ovariectomizadas Voloshenyuk &

Gardner, 2010 verificaram que a reposição de estrógeno promoveu a elevação da

MMP9 embora não tenha impedido a ativação da MMP2 e ainda, que houve um

aumento significativo nos níveis de colágeno III no tecido.

Estudos experimentais de Wang et al, 2011 e Lindsey et al, 2012 associaram a

maior atividade cardíaca das MMPs 2 e 9 aos processos de remodelação e insuficiência

cardíacas.

A expressão da MMP2 em nosso estudo indicou um aumento dessa enzima no

miocárdio dos animais ovariectomizados nas duas dietas, que foi revertido pelo

treinamento, somente nos indivíduos ovariectomizados de dieta animal. Quanto à

expressão da MMP9, a ovariectomia não determinou alterações nos animais que

consumiram dieta proteica vegetal, mas apresentou redução nos animais que

consumiram dieta animal. Na expressão dessa enzima, o exercício resistido proposto

promoveu redução nos animais ovariectomizados independente da dieta oferecida.

O comportamento da expressão das MMPs em nosso trabalho vai de encontro

aos achados da literatura, reforçando a associação da MMP2 ao processo fibrótico e

depleção da função contráctil, determinado pela ovariectomia e revertido pelo

treinamento somente nos indivíduos tratados com dieta proteica animal. Em relação à

MMP9, associada ao remodelamento cardíaco, houve diminuição determinada pelo

treinamento proposto em todos os indivíduos ovariectomizados.


Assim, com relação às metaloproteinases, verificou-se que o exercício resistido

nos animais ovariectomizados que consumiram dieta proteica animal mostrou-se com

melhor eficácia quanto ao processo de fibrose e perda da função contráctil miocárdica.

Benefícios do treinamento resistido sobre a condição cardíaca verificada em

nosso trabalho também integraram o artigo de revisão de Leite et al, 2010, destacando

a importância dessa intervenção na prevenção e reversão das alterações impostas nos

vários órgãos e sistemas pelo advento da menopausa.

C o n c l u s ã o 9 2

7. CONCLUSÃO

A intervenção da ovariectomia, em ratas idosas submetidas a diferentes dietas,

proposta nesse trabalho promoveu:

- maior ganho médio corporal em todos os animais.

- aumento do tecido adiposo visceral independente da dieta, fato não revertido

pelo treinamento aplicado.

- aumento da massa ventricular esquerda no grupo AOS, sem reversão pela

intervenção do treinamento.

- aumento dos índices glicêmicos, ajustados pelo exercício nas duas dietas.

- aumento da AST e do Dme em ambas as dietas, revertidos pelo treinamento.

- expressiva redução na Vv[cap] e na Vv[int] no grupo AOS, sendo

significantemente atenuada pelo treinamento, mostrando maior eficiência dessa

intervenção no grupo AOT do que no grupo VOT.

- aumento significante da Vv[col III] no grupo AOS, indicando um maior efeito de

proteção cardíaca em relação ao grupo VOS.

- tendência ao aumento da Vv[colI] e da Vv[col III] nos grupos AOS e VOS sendo

nesse mais efetiva, com reversão imposta pelo treinamento reduzindo a densidade das

fibras do tipo I no grupo AOT e aumentando a densidade das fibras do tipo III nas duas

dietas, sendo mais expressivo no grupo VOT.

- impacto mais negativo quanto à distribuição das fibras colágenas do tipo I e III

no miocárdio ventricular do grupo VOS, sendo que a intervenção do treinamento nesse

parâmetro exibiu um melhor equilíbrio no grupo AOT.

- aumento da MMP2 e da MMP9 nos indivíduos VOS, indicando fibrose e

remodelamento, não atenuado pelo exercício.

- aumento da MMP2 e redução da MMP9 no grupo AOS, indicando intensificação

da fibrose e contenção do remodelamento, que foi sensivelmente influenciado pelo

treinamento, sugerindo minimização do processo fibrótico e da remodelação cardíaca

no grupo AOT.

C o n c l u s ã o 9 3

O treinamento resistido associado à dietas proteicas predominantemente animal

e vegetal mostrou-se eficiente em relação às respostas biométricas, bioquímicas

morfométricas e imunohistoquímicas apresentadas pelas ratas idosas ovariectomizadas

estudadas em nosso trabalho, sugerindo assim, que tal associação possa constituir

uma interessante estratégia de intervenção não farmacológica no tratamento de

mulheres menopausadas, uma vez que propiciou melhorias na condição cardíaca,

embora o maior impacto desse benefício tenha sido conferido pelos animais que

consumiram a dieta com proteína predominantemente animal ( Fig. 16)

OVARIECTOMIA

Proteína Vegetal Proteína Animal

Massa Corporal

Massa do Tecido Adiposo Visceral

Massa do Ventrículo Esquerdo

Índices Glicêmicos

AST e DME

Vv[cap] e Vv[int]

Vv[Col I] e Vv[Col III]

MMP2 e MMP9 MMP2 e MMP9

Distribuição de Fibras Colágenas

do Tipo I e III no miocárdio

ventricular

TREINAMENTO

Reverte

Ajusta Atenua

Figura 16 - Síntese dos efeitos promovidos pelo treinamento resistido associado aos dois tipos de

dieta nos animais ovariectomizados.

R e f e r ê n c i a s B i b l i o g r á f i c a s | 9 4

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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