UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE PROGRAMA DE …app.uff.br/riuff/bitstream/1/3305/1/Marques, Leila...
110
CARACTERIZAÇÂO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus ISOLADOS DE QUEIJO MINAS FRESCAL UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PESQUISA E MONITORAMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE NITERÓI 2014 LEILA MÁRCIA PERES MARQUES
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE PROGRAMA DE …app.uff.br/riuff/bitstream/1/3305/1/Marques, Leila...
CARACTERIZAÇÂO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA
DE Staphylococcus aureus ISOLADOS DE QUEIJO
MINAS FRESCAL
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PESQUISA E
MONITORAMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE
NITERÓI 2014
LEILA MÁRCIA PERES MARQUES
LEILA MÁRCIA PERES MARQUES
CARACTERIZAÇÂO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus
ISOLADOS DE QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos
para a Saúde da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, para a obtenção do
título de Mestre.
ORIENTADORA: PROFª DRA ALICE GONÇALVES MARTINS GONZALEZ
CO-ORIENTADORA: PROFª DRA LUCIANA MARIA RAMIRES ESPER
Niterói
2014
CARACTERIZAÇÂO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus
ISOLADOS DE QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Aplicadas
a Produtos para a Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para a obtenção do título de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________________
Profa. Dra. Alice Gonçalves Martins Gonzalez – Orientadora – UFF
________________________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Aguiar Alves – UFF
________________________________________________________________
Dra. Adriana Hamond Regua Mangia - FIOCRUZ
_________________________________________________________________
Prof Dr. Raphael Hirata Junior - UERJ
Niterói
2014
“Buscai em primeiro lugar o Reino de Deus e sua justiça,
e tudo o mais vos será dado por acréscimo.
Portanto, nos vos preocupeis com o dia de amanhã,
pois amanhã terá sua própria preocupação.
A cada dia basta o seu cuidado! “
Mt 6, 33 - 34
“Espera no Senhor, seja firme,
Fortaleça seu coração e
Confia no Senhor e
Tudo o mais ELE fará.”
Salmo 27 (26), 14
“Combati o bom combate,
terminei a carreira, guardei a fé.
Desde agora está reservado para mim a coroa da justiça,
que o Senhor, justo juiz, me dará naquele dia,
não somente a mim, mas a todos que
tiverem esperado com amor a sua manifestação.”
2Tm 4, 7 – 8
Dedico
Ao meu Senhor e meu Deus,
Que com sua presença fiel e amorosa me capacitou para este trabalho, fazendo-
me perseverar e superar cada obstáculo.
Que em todos os momentos esteve ao meu lado, acalentando o meu coração e
fortalecendo a minha fé.
Que acampou seus Santos Anjos ao meu redor, para me guardarem, me livrarem
dos perigos, me defenderem e me protegerem de todo mal.
Que me iluminou, me guiou e me sustentou em todas as etapas realizadas.
“Que marcou o tempo certo para cada coisa:
Tudo neste mundo tem seu tempo; cada coisa tem sua ocasião. .....”
Eclesiastes 3: 2, 8
Ofereço
Aos meus pais Carlos Marques e Maria da Penha Peres Marques, in memorian,
que me ensinaram os verdadeiros valores e virtudes.
Ao meu querido filho Renato Marques, minha vocação maior, amor incondicional.
Acima de tudo a Deus, pelo dom da minha vida e por todas as bençãos recebidas.
Nada pode se comparar à ternura do seu amor! Obrigada pela Mãezinha do Céu,
Maria, que me envolve com seu manto e sempre me conduz ao seu Filho Jesus.
Agradeço
A Jesus, meu amparo de todas as horas e a Maria Santíssima, medianeira de
todas as graças.
A Universidade Federal Fluminense, na pessoa do diretor da Faculdade de
Farmácia Professor Wilson da Costa Santos, pelo incentivo e oportunidade de
realização deste mestrado.
A minha orientadora, Alice Gonzalez, por suas orientações, pelos inestimáveis
conhecimentos transmitidos e partilhados e por sua experiência profissional,
principalmente na execução dos testes da PCR.
A minha co-orientadora, Luciana Esper, pelo seu auxílio, co-orientação e
colaborações, principalmente na escolha dos artigos para seminários.
Aos professores Geraldo de Paula e Lenise Teixeira por suas valiosas
sugestões, ensinamentos e auxílio, principalmente na execução do PFGE.
Ao professor Fabio Alves por sua relevante contribuição na realização das
técnicas de MLST e SpA.
A todos os professores do PPG-CAPS, em especial a Professora Katia Lima,
coordenadora da Pós Graduação.
A todos os meus professores, que durante toda minha formação acadêmica,
foram exemplos, referências e incentivadores, todo o meu respeito e carinho.
Aos professores da banca examinadora, Adriana Regua, Fabio Alves e Raphael
Hirata, que gentilmente aceitaram nosso convite, contribuindo com meu
crescimento profissional.
A Prof. Lenise Teixeira pela revisão e toda contribuição a este trabalho.
Aos meus colegas de mestrado, Armando, Barbara, Carolina, Daniela, Francine,
Gabriel, Gabriela, George, Hanna, José Carlos, Kelly, Luana, Manuela, Marcieli,
Muniqui, Ricardo, Roberta e Zoraide pela amizade e momentos partilhados.
Aos alunos de iniciação científica Carolina Antunes, Thalita Martins, Luciana
Castilho, Raquel Nogueira e em especial a Marcel Amorim, a todos eles, que com
sua disponibilidade, boa vontade, jovialidade, simpatia e agradável convivência,
me ajudaram bastante na execução deste projeto, inclusive nas minhas
“limitações tecnológicas”. Peço que onde estiverem, o Senhor os acompanhe.
Aos técnicos de laboratório, Wilmar, Oséias, Debora e Sandra, pela ajuda e apoio.
As técnicas Aline, Adriana e especialmente a Fátima, pelo relevante apoio
técnico, sempre com muita competência, dedicação, boa vontade e generosidade.
A técnica Lucia, do Laboratório LHIMA, que com sua experiência e paciência
ouviu minhas inquietudes e me ajudou com suas palavras sábias e encorajadoras,
e também se alegrou louvando com minhas conquistas.
Aos funcionários da secretaria, Adelina, Carla, Moacir, Suzana e da biblioteca
da Faculdade de Farmácia da UFF, por toda atenção, ajuda imprescindível,
prestatividade e carinho dispensados.
A Juliana, que trabalha na xerox, por toda sua alegria, agilidade, ajuda e simpatia
sempre com muita solicitude e profissionalismo.
A Daiane e Leila da cantina da Faculdade de Farmácia, pelos seus deliciosos
almoços e lanches, sempre nos atendendo e servindo com eficiência e paciência.
A toda equipe de manutenção e limpeza da Faculdade de Farmácia da UFF, em
especial Dona Marilza, Mara e Carlos, que deixam nossos laboratórios e
biblioteca impecáveis!
Aos demais funcionários da Faculdade de Farmácia, que não estão citados
especificamente, mas que de alguma forma contribuíram e enriqueceram com um
sorriso, um bom dia e uma palavra de encorajamento e otimismo.
A todos os “anjos”, em especial Maria da Paz, que Deus colocou no meu
caminho durante esse período, que em pequenos detalhes, palavras, conselhos e
atitudes, fizeram a grande diferença, a todos vocês meu sincero agradecimento.
A minha família, amigos e por cada irmão de comunidade, por seu amor,
respeito e presença nos momentos que mais precisei, principalmente com suas
orações incentivando-me a não desanimar! “Amigo fiel é poderoso refúgio, quem
o descobriu, descobriu um tesouro. Amigo fiel não tem preço, é imponderável o
seu valor. Amigo fiel é bálsamo vital e os que temem o Senhor o encontrarão.”
(Eclesiástico 6,14-16).
Por todos meus erros e acertos, que me fizeram crescer, recomeçar, concretizar
sonhos e continuar traçando metas e caminhos dos quais me orgulho.
A todos que de forma direta ou indireta contribuíram com este trabalho, que foi
realizado, graças a ajuda, apoio, amizade, esforço, espírito de equipe, incentivo,
orações, união e carinho de todos.
A todos que torceram e acreditaram em mim, meu amor imenso, gratidão eterna e
meu sincero muito obrigada!
RESUMO
O presente trabalho tem por objetivo caracterizar fenotípica e
genotipicamente cepas de S. aureus isoladas de queijo Minas frescal (QMF),
quanto a qualidade microbiológica, perfil de resistência a diferentes
antimicrobianos, presença do gene de resistência a meticilina (mecA), presença
de genes que codificam para enterotoxinas estafilocócicas (SE) clássicas; e para
cepas resistentes a meticilina, pesquisa dos genes que codificam para a citotoxina
Panton Valentine Leukocidin (PVL) e o perfil de diversidade genética, através da
tipificação dos tipos SCCmec, Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e do
sequenciamento da proteína estafilococócica A (SpA). Estafilococos coagulase-
positivos (CoPS) foram isolados a partir de 4 amostras (13,3%) de QMF, sendo
que 3 (10%) amostras estavam impróprias para consumo segundo a legislação
(acima de 5,0.10² UFC/g). As 31 cepas de CoPS isoladas apresentaram a
sequência gênica 16S rRNA e o gene nuc, sendo confirmadas como S. aureus.
As 31 cepas S. aureus apresentaram resistência a penicilina, 21 (67,74%) a
eritromicina, 12 (38,71 %) a ciprofloxacina, 4 (12,9%) a clindamicina, 4 (12,9%) a
oxacilina e cefoxitina, 2 (6,45%) a rifampicina, 1 (3,23%) ao cloranfenicol e a
tetraciclina. Todas as 31 cepas foram sensíveis ao trimetoprim-sulfametoxazole,
gentamicina e a linezolida. Sete cepas (22,58%) carreavam o gene mecA, destas,
4 apresentaram fenótipo de resistência a meticilina, sendo classificadas como
S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), sendo todos sensíveis a vancomicina e
com resistência constitutiva a clindamicina. Cinco cepas (16,1%) apresentaram
resistência induzida a clindamicina. Os genes que codificam para as SE clássicas
(sea/seb e seb/sec) foram encontrados em 2 isolados (6,45%) MRSA. Através da
PFGE e da tipificação SpA, as cepas MRSA isoladas, apresentaram 3 diferentes
perfis genotípicos. Essas cepas MRSA não apresentaram os tipos SCCmec I a V,
nem os genes que codificam para PVL. Os resultados obtidos neste trabalho
indicam que cepas MRSA estão sendo veiculadas através do QMF,
provavelmente por manipulação humana inadequada e/ou condições higiênico-
sanitárias precárias. O potencial enterotoxigênico destas bactérias indica que o
QMF pode causar intoxicação alimentar, sendo um risco para a saúde pública.
Palavras-Chave: S. aureus, MRSA, mecA, enterotoxinas estafilocócicas, queijo
Minas frescal, PFGE, SpA.
ABSTRACT
This study aimed to characterize genotypic and phenotypically S. aureus
strains isolated from Minas frescal cheese (MFC) to evaluate the microbiological
quality, resistance profile to diferent antimicrobials, the presence of methicillin
resistance (mecA) gene and the presence of genes encoding classical
staphylococcal enterotoxins (SE). Only for methicillin resistant S. aureus (MRSA)
strains were performed the gene encoding Panton Valentine Leukocidin cytotoxin
(PVL) and the genetic diversity profile through Pulsed-field gel electrophoresis
(PFGE), typing of SCCmec and SpA typing. Coagulase-positive staphylococci
(CoPS) were identified in four MFC samples (13.3%), and three (10%) samples
showed the number of colony forming units (CFU) higher than allowed to MFC by
Brazilian legislation (5,0x10² UFC/g). All the 31 CoPS strains carried the gene
sequence 16S rRNA and nuc gene, and were confirmed as S. aureus. All 31
strains of S. aureus were resistant to penicillin, 21 (67.74%) to erythromycin, 12
(38.71%) to ciprofloxacin, 4 (12.9%) to clindamycin, 4 (12.9%) to oxacillin and
cefoxitin, 2 (6.45%) to rifampicin, 1 (3.23%) to chloramphenicol and tetracycline.
All the 31 CoPS strains were susceptible to trimethoprim-sulfamethoxazole,
gentamicin and linezolid. Seven strains (22.58%) encoded mecA gene, four of
them showed the methicillin resistance phenotypic, been classified as methycilin
resistant S. aureus (MRSA). All MRSA isolates were susceptible to vancomycin
and showed constitutive clindamycin resistance. Five strains (16.1%) showed
induced clindamycin resistance. The gene encoding the classical SE (sea/seb and
seb/sec) were detected in two isolates (6.45%) MRSA. Genetic analysis of MRSA
strains was performed by PFGE and SpA typing showed three different profiles.
The strains that showed mecA gene, did not show PVL genes coding, neither the
types of SCCmec typing. The results obtained in this study showed that MRSA
strains are being transmitted by MFC samples, probably due to inadequate human
manipulation and/or poor and inefficient hygienic-sanitary conditions. The
enterotoxigenic potential of these strains is a concern for public health due to the
risk of food poisoning among the MFC consumers.
Keywords: S. aureus, MRSA, mecA, staphylococcal enterotoxins, Minas
fresh cheese, PFGE, SpA.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Antibiograma ilustrando a resistência induzida a clindamicina
(teste D positivo).
FIGURA 2 - Perfil de resistência a antimicrobianos em cepas de S. aureus.
FIGURA 3 - Dendrograma construído através das médias UPGMA utilizando-se
o coeficiente de similaridade de Dice ilustrando a diversidade genética das cepas
MRSA e das cepas de S. aureus entrotoxigênicas, a partir do PFGE.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Parâmetros importantes para o desenvolvimento de S. aureus
e produção de enterotoxinas em alimentos.
TABELA 2 - Número de amostras de queijo Minas frescal (QMF) analisadas
segundo a marca e o estabelecimento comercial.
TABELA 3 - Genes, primers, condições de ciclagem, concentração dos primers,
tamanho pares de base e referências.
TABELA 4 - Sequência dos primers utilizados na PCR multiplex para
determinação dos tipos de SCCmec.
TABELA 5 - Contagem de unidades formadoras de colônia de estafilococos
coagulase positiva em queijo Minas frescal.
TABELA 6 - Características fenotípicas e genotípicas das cepas de
Staphylococcus aureus isoladas.
TABELA 7 - Características das cepas com fenótipo MRSA isoladas do QMF
(Q28).
LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS
Aa Atividade de água
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC Association of Analytical Communities
APHA American Public Health Association
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
BP Agar Baird-Parker
CA-MRSA Community Associated Methicillin Resistant Staphylococcus aureus
ccr cassette chromosome recombinase
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CEB Clone Epidêmico Brasileiro
CFO Cefoxitina
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIP Ciprofloxacina
CLI Clindamicina
CLO Cloranfenicol
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNAse Desoxirribonuclease
dNTP Triphosphate desoxinucleotide
DOA Doença de origem alimentar
DTA Doenças transmitidas por alimento
ECP Estafilococos coagulase positiva
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
ERI Eritromicina
FAO Food Agriculture Organization
FDA Food and Drug Administration
FUNED Fundação Ezequiel Dias
GEN Gentamicina
HA-MRSA Healthcare-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for Foods
KDa Kilodalton
LEMB Laboratório de Epidemiologia e Biologia Molecular
LNZ Linezolida
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MgCl2 cloreto de magnésio
MHA Mueller Hinton Ágar
MLST Multilocus Sequence Typing
MLSBi Resistência induzida a Macrolideos-licosaminas-streptogramina B
mM Milimolar
MRS Methicilin-Resistant Staphylococcus
MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
MSSA Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus
mg / ml miligrama / mililitro
ng Nanograma
µg micrograma
µl microlitro
µm micrômetro
NaCl Cloreto de sódio
NMP Número Mais Provável
OMS Organização Mundial da Saúde
OXA Oxacilina
pb Pares de base
PBP Penicillin-binding protein
PCR Polymerase Chain Reaction
PEN Penicilina G
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
pH potencial hidrogênio-iônico
PM peso molecular
PVL Panton-Valentine leucocidina
QMF Queijo Minas Frescal
RDC Resolução de Diretoria Colegiada
RIF Rifampicina
rpm Rotação por minuto
SCCmec Staphylococcal Cassette Chromosome mec
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SE Enterotoxina estafilocócica
SEA a SEE Enterotoxinas estafilocócicas A a E
sea a see genes das enterotoxinas A a E
SpA Staphylococcus protein A
ST Sequence Type
SUT Sulfametazole-trimetropima
TBE Tampão Tris/borato/EDTA
TE Tris – EDTA
TET Tetraciclina
Tris - HCl Tris (hydroxymethyl) Amiomethane Hydrochloride
TSA Tripticase Soy Agar
UFC Unidades formadoras de colônia
UV Ultra violeta
VAN Vancomicina
VISA Staphylococcus aureus com resistência intermediária à vancomicina
VRSA Staphylococcus aureus vancomicina resistente
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
Epígrafe ................................................................................................................x
Dedicatória ..................................................................................................... ....xi
Agradecimentos ...................................................................................................xii
Resumo ..............................................................................................................xiii
Abstact ................................................................................................................xiv
Lista de Figuras ...................................................................................................xv
Lista de Tabelas .................................................................................................xvi
Lista de Abreviaturas e Siglas ............................................................................xvii
1. INTRODUÇÃO ..............................................................................................18
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral ...............................................................................................21
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................21
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Doenças transmitidas por alimentos (DTA) ................................................22
3.2 Queijo minas frescal (QMF) ........................................................................23
3.3 Staphylococcus spp ...................................................................................24
3.4 Enterotoxinas estafilocócicas (SE) .............................................................27
3.5 Aspectos epidemiológicos da intoxicação estafilocócica .............................32
3.6 Resistência antimicrobiana ....................................................................... 33
3.6.1 Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) ........................ 36
3.7 Técnicas moleculares para tipificação de cepas de estafilococos ............ 41
3.7.1 Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE ) ..................................... 42
3.7.3 Tipificação da Proteina A estafilocócica (SpA typing) ............................. 43
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostragem ..................................................................................................45
4.1.2 Processamento da amostra .......................................................................46
4.2 Contagem e seleção das colônias de Staphylococcus coagulase-positiva ... 47
4.3 Testes bioquímicos ..................................................................................... 47
4.4 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ................................................ 48
4.4.1 Teste de disco difusão ..............................................................................48
4.4.2 Teste de difusão de duplo disco (Teste D) ...............................................49
4.4.3 Concentração Mínima Inibitória (CMI) da vancomicina ...........................50
4.5 Fatores genotípcos ....................................................................................50
4.5.1 Extração de DNA .....................................................................................50
4.5.2 Pesquisa de genes por PCR ...................................................................50
4.5.3 Determinação do tipo estrutural SCCmec ..................................................51
4.6 Análise de da diversidade genética ..............................................................52
4.6.1 Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) .........................................52
4.6.2 Tipificação por Sequenciamento da Proteína A (SpA typing) .....................53
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da qualidade de QMF através da contagem de CoPS ..................54
5.1.2 Cepas Staphylococcus aureus ...................................................................54
5.1.3 Suscetibilidade antimicrobiana ....................................................................57
5.1.4 Pesquisa do gene mecA por PCR ...............................................................58
5.1.5 Pesquisa dos genes que codificam PVL (Panton Valentine Leukocidin) ...58
5.1.6 Pesquisa dos genes das enterotoxinas clássicas por PCR ....................... 58
5.1.7 Tipificação do SCCmec ................................................................................59
5.1.8 Diversidade genética – PFGE ......................................................................59
5.1.9 Tipificação por Sequenciamento do gene da Proteína A (SpA typing) .......60
6. DISCUSSÃO ................................................................................................... 61
7. CONCLUSÃO ..................................................................................................75
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................77
9. ANEXOS ......................................................................................................104
18
1. INTRODUÇÃO
O gênero Staphylococcus faz parte da família Staphylococcacea e é
subdividido em pelo menos 46 espécies e 24 subespécies (EUZÉBY, 2012),
sendo algumas frequentemente associadas a uma ampla variedade de infecções,
tanto em seres humanos como em animais. Staphylococcus spp possui
distribuição ubiquitária, sendo seu reservatório primário a pele e mucosas,
especialmente a região naso-faríngea de mamíferos e aves (ATANOSSOVA et
al., 2001). Dentro deste gênero, estão os Staphylococcus aureus, os quais se
destacam como a espécie mais envolvida em doenças humanas (KONEMAN et
al., 2001).
A doença de origem alimentar provocada por Staphylococcus spp é uma
intoxicação, decorrente da ingestão de enterotoxinas estafilocócicas (SE) pré-
formadas no alimento (AYDIN et al., 2011). A intoxicação estafilocócica é a
terceira maior causa de doença veiculada por alimentos no mundo, sendo
considerado um dos maiores problemas de saúde pública (SPANU et al., 2012). A
maior parte destas toxinas é produzida por S. aureus, embora outras espécies do
gênero tenham sido demonstradas como enterotoxigênica (PINCHUK et al.,
2010).
A SE é uma toxina termorresistente, que persiste no alimento, mesmo
após eliminação da bactéria, levando a intoxicação (Le LOIR et al., 2003). O
agente causador da intoxicação não é o microrganismo em si, mas a enterotoxina
liberada no alimento durante o desenvolvimento bacteriano. A produção da toxina
é afetada por diferentes fatores, incluindo pH, atividade de água, temperatura e
atmosfera (SCHELIN et al., 2011).
S. aureus é o microrganismo mais frequente em surtos e investigações
epidemiológicas de intoxicação estafilocócica (Le LOIR et al., 2003; IKEDA et al.,
2005, EFSA, 2009). Após a ingestão do alimento os sintomas aparecem
rapidamente, constituído de vômitos, dor abdominal, náusea, cefaleia com ou sem
febre e diarreia (JETT et al., 2001).
A produção de SE está correlacionada com a multiplicação da bactéria no
alimento, ou seja, um maior número de bactérias acarreta maior quantidade de
toxina. Logo, a contagem do número de bactérias no alimento é utilizada para
19
determinar a segurança do produto em relação à saúde do consumidor (SCHELIN
et al., 2011).
As intoxicações alimentares por estafilococos são causadas,
predominantemente, por cepas produtoras da enzima coagulase (SCHELIN et al.,
2011). Em vista disso, a Reunião Diretiva Colegiada (RDC) n° 12, através do
Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos (BRASIL,
2001) estabelece a contagem de estafilococos coagulase-positiva (CoPS) como
indicador de qualidade e segurança para diferentes alimentos. A produção da
coagulase é uma das provas mais amplamente utilizadas para correlacionar a
cepa isolada com a produção de SE, embora essa relação não seja absoluta
(BERGDOLL, 1989). No entanto, trabalhos na literatura demonstram que
estafilococos coagulase-negativa (CoNS) também são capazes de produzir SE
(LAMAITA, 2005; VERAS et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2010; OLIVEIRA et al.,
2011).
Estafilococos têm capacidade de adquirir genes de resistência a muitos
antimicrobianos (CHAMBERS, 2001). Penicilina e outros β-lactâmicos lisam a
bactéria por interferirem na síntese da parede celular. Sabe-se que a maioria dos
S. aureus produzem penicilinase (HIRAMATSU et al., 2001). Meticilina é um beta-
lactâmico, que foi introduzido no tratamento de infecções humanas por
Staphylococcus resistentes a penicilina. Contudo em 1961, iniciaram relatos na
literatura científica sobre cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA)
(JEVONS, 1961; MARANAM et al., 1997). A resistência a meticilina é mediada
pelo gene mecA que codifica uma proteína alterada, que se liga a penicilina
(PBP2a; Penicillin Binding Proteins 2a) (CHAMBERS, 1997). Devido à alta taxa de
antimicrobianos usados indiscriminadamente e aos mecanismos de transferência
de genes de resistência entre os microrganismos, cepas MRSA são também
frequentemente resistentes a múltiplos antimicrobianos (CUNHA et al., 2006;
NORMANO et al., 2007). A identificação e o monitoramento de cepas de
estafilococos resistentes a meticilina (MRS), assim como MRSA, em alimentos é
importante devido à capacidade desta bactéria em adquirir resistência a diferentes
antimicrobianos, tornando-se um importante problema de saúde pública
(MULLIGAN et al., 1993).
20
A tipificação de S. aureus é uma importante ferramenta no estudo da
origem das cepas, da relação clonal e da epidemiologia dos surtos (SHOPSIN et
al., 1999). Uma variedade de técnicas tem sido descrita para caracterização da
diversidade genética do gênero Staphylococcus (MELLES et al., 2007), tendo
como Padrão Ouro a Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) (ENRIGHT,
2000). A tipificação da proteína A (SpA) tem sido proposta como um complemento
para o estudo da diversidade genética de Staphylococcus aureus (SHOPSIN et
al., 1999).
A versatilidade nutricional e a capacidade de crescerem em diferentes
condições ambientais fazem com que o gênero Staphylococcus se desenvolva
com facilidade em vários alimentos, (CARMO, 2002; Le LOIR et al., 2003) como
leite e derivados (NORMANO et al., 2007; RALL et al., 2008), carne e produtos
cárneos (PEREIRA et al., 2009), além de produtos prontos para consumo (OH et
al., 2007).
O QMF é um alimento de grande comercialização, apresentando vantagens
do ponto de vista tecnológico, por ser um produto de fácil aceitação, de valor
nutricional e por possuir um elevado rendimento na fabricação, o que incrementa
seu escoamento e distribuição no mercado (FURTADO et al., 1990). A
contaminação de queijos por bactérias patogênicas, em especial Staphylococcus
spp, tem sido descrita (COSTA et al., 2012; NORMANO et al., 2005; BERNARDI
et al., 2003; RAPINI et al., 2003; FILHO e FILHO, 2000; GONZALEZ et al., 2000).
Mudanças na epidemiologia dos S. aureus torna importante o
monitoramento da disseminação e da evolução clonal desse patógeno, assim
como fontes de contaminação e mecanismos de transmissão devem ser
identificados para o controle e tratamento mais efetivo.
21
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem por objetivo caracterizar fenotípica e
genotipicamente cepas de Staphylococcus aureus isoladas de queijo Minas
frescal (QMF) adquiridas em estabelecimentos varejistas na cidade de Niterói.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a qualidade microbiológica das amostras de QMF, através da pesquisa
do indicador Estafilococos coagulase-positiva (CoPS), segundo a RDC n°12
(BRASIL, 2001).
- Confirmar, através da PCR o gênero e a espécie das cepas de CoPS isoladas.
- Avaliar o fenótipo de resistência a antimicrobianos das cepas de CoPS isoladas.
- Investigar a presença dos genes sea, seb, sec, sed e see e mecA entre as
cepas de CoPS isoladas.
- Investigar a presença dos genes luk PV, que codificam para a citotoxina PVL, e
os tipos de SCCmec (I a V) entre as cepas MRSA isoladas.
- Investigar, por PFGE e SpA, a relação genética das cepas MRSA.
22
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Doenças transmitidas por alimentos (DTA)
Segundo o Ministério da Saúde (BRASIL, 2001), Doenças Transmitidas por
Alimentos (DTA) ou Doença de Origem Alimentar (DOA) é uma síndrome
originada pela ingestão de alimentos e/ou água que contenham agentes
etiológicos (biológicos, físicos, substâncias químicas ou toxinas) em quantidades
tais que afetem a saúde do consumidor em nível individual ou grupo de
população. As DTA são consideradas, atualmente, um grande problema para
saúde pública mundial. Oficialmente os surtos são definidos como sendo a
ocorrência de dois ou mais casos de uma doença, com o mesmo quadro clínico,
resultante da ingestão de um alimento em comum (MEER e MISNER, 1999).
Segundo o CDC (Center for Diseases Control and Prevention, dos Estados
Unidos), ocorrem anualmente 38,6 milhões de casos de doenças gastrointestinais
causadas por patógenos conhecidos e 13,6 milhões (36%) deste total são
atribuídos às DTA (CDC, 2009). No Brasil são poucas as informações a respeito
das DTA (CARMO et al., 2005). Segundo a Organização Mundial de Saúde
(OMS), as DTA são um perigo para a saúde humana e seu controle requer uma
união de esforços entre o governo, as indústrias de alimentos e os consumidores
(WHO, 2013).
O controle das DTA atualmente é um grande desafio, devido às mudanças
no padrão humano de consumo e a globalização no comércio de alimentos
(SCHELIN et al., 2011). Dentre os vários fatores que contribuem para a
ocorrência de surtos de origem alimentar, pode-se citar a utilização de matéria-
prima de má qualidade, temperatura inadequada de armazenamento,
higienização incorreta de equipamentos e utensílios, ausência de tratamento
térmico, manipuladores sem conhecimentos básicos de higiene, além de
acondicionamento em temperatura inadequada e condições insatisfatórias nos
pontos de comercialização (MACHADO et al., 2011). De modo geral os surtos
alimentares por estafilococos estão associados a alimentos crus ou mal cozidos,
como leite cru e derivados, tortas recheadas com creme, salada de batata, atum,
frango, presunto, carnes, embutidos e produtos à base de ovos (Le LOIR et al.,
2003).
23
3.2 Queijo Minas frescal (QMF)
O QMF é um queijo de origem brasileira, sendo produzido nos mais
diversos estados, tendo sua fabricação iniciada no século XVIII, em Minas Gerais,
em regiões em que o gado de leite era dominante (CAMPOS, 2001). É um dos
queijos mais populares do Brasil, é um produto fresco, para consumo imediato e
de curta durabilidade, sendo consumido por todas as camadas da população
durante o ano todo (FURTADO, 2005).
O QMF apresenta formato cilíndrico, peso de 0,3 a 5,0 Kg, crosta fina,
consistência macia, textura fechada com ou sem olhaduras mecânicas, cor
esbranquiçada, odor e sabor suave e característico. A Instrução Normativa (IN)
nº 4 de 01 de março de 2004 do Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA), através do Regulamento Técnico para fixação de
Identidade e Qualidade do QMF (BRASIL, 2004), estabelece a identidade e os
requisitos mínimos de qualidade que deverá cumprir o QMF destinado ao
consumo humano. Segundo esta IN entende-se por QMF o queijo fresco obtido
por coagulação enzimática do leite com o coalho e/ou enzimas coagulantes
apropriadas, complementada ou não com ação de bactérias lácteas específicas,
sendo classificado como um queijo semigordo, de muito alto teor de umidade a
ser consumido fresco. Apresenta pH de 5,1 a 5,6 e em torno de 1,6% de NaCl
(FREITAS et al., 1993), com validade curta, cerca de até 20 dias (BRASIL, 1997).
Segundo a RDC nº12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001), que estabelece o
Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos, os queijos
de muita alta umidade (em torno de 55%), como o QMF, devem atender os
seguintes padrões microbiológicos: coliformes a 45°C (5,0 x 10² NMP/g),
estafilococos coagulase positiva (5 x 10² UFC/g), Samonella spp e Listeria
monocytogenes (ausência em 25 g).
O interesse pelo QMF está relacionado com o seu envolvimento em DTA,
como as intoxicações estafilocócicas. Muitas espécies enteropatogênicas tem
sido encontradas no QMF armazenados sob temperatura de refrigeração
(GONZALEZ et al., 2000; ZECCONI e HAHN, 2001). A contaminação pós-
pasteurização, produção, manipulação, equipamentos, temperaturas inadequadas
durante o transporte e condições de estocagem podem resultar em altos níveis de
microrganismos patogênicos e enterotoxinas no queijo (ARAUJO et al., 2002).
24
3.3 Staphylococcus spp
A primeira descrição de bactérias do gênero Staphylococcus foi realizada
por Ogston (1880), que relatou cocos em formato de cacho de uva, como a causa
de um grande número de doenças piogênicas (BAIRD-PARKER,1990). O gênero
Staphylococcus foi proposto em 1884 por Rosenbach e inserido na família
Micrococacae. Estudos de biologia molecular, perfis de ácidos graxos,
composição de parede celular e, principalmente, estudos com RNA ribossômico
16S promoveram a inclusão do gênero Staphylococcus em uma nova família, a
família Staphylococcaceae (GARRITY, 2006).
Staphylococcus são cocos Gram positivos, patogênicos tanto para
humanos quanto para animais, podendo aparecer de forma isolada, em pares,
cadeias curtas ou em cachos. São imóveis, anaeróbios facultativos, não
esporulados, fermentadores de glicose, possuem diâmetro variando entre 0,5 a
1,5 µm. São formadores de colônias pigmentadas, em geral não capsuladas.
São mesófilos, halofílicos e produtores de catalase (ZECCONI e HAHN,
2000). Diferem do gênero Micrococcus sp por não produzirem a enzima oxidase,
fermentarem glicose, serem resistentes a furazolidona (RAVEL, 1997). Quanto à
atividade de água (Aa), os estafilococos são os únicos com capacidade de se
multiplicarem em alimentos com valores inferiores ao normalmente considerados
mínimos para outras bactérias halófilas (0,83 a 0,99) (WONG e BERGDOLL,
2002). Essas bactérias se desenvolvem em uma faixa de temperatura entre 7 a
48°C, com temperatura ótima entre 35 e 37°C. São termolábeis, sendo inativados
em temperaturas superiores a 60°C por 3 minutos (CLIVER, 1994). O pH ideal
para o seu desenvolvimento varia entre 6,5 a 7,5, mas é capaz de sobreviver em
alimentos dentro de uma escala de valores de pH entre 4,2 a 9,3. Estes
microrganismos ainda tem capacidade de sobreviver e se multiplicar em uma
concentração de cloreto de sódio (NaCl) de até 10% (WONG e BERGDOLL,
2002).
O gênero Staphylococcus é dividido em dois grupos: estafilococos
coagulase positivo (CoPS) e estafilococos coagulase negativo (CoNS) (KLOSS,
1990; KONEMAN et al., 2006). Esta divisão é fundamentada na produção de uma
enzima extracelular denominada coagulase, capaz de converter o fibrinogênio em
fibrina, conferindo à bactéria a capacidade de coagular o plasma sanguineo
25
(DERESINSK, 2005). A maioria das espécies de Staphylococcus não produz
coagulase (BAIRD-PARKER, 1990). A coagulase é encontrada sob duas formas:
livre e conjugada, e possuem diferentes propriedades. A coagulase conjugada (ou
fator de aglutinação) encontra-se unida à parede celular bacteriana. Esse fator
reage diretamente com o fibrinogênio presente no plasma e produz uma rápida
aglutinação das células bacterianas. A coagulase livre é secretada
extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominada
fator de reação com a coagulase (CRF), formando um complexo que, por sua vez,
reage com o fibrinogênio para produzir o coágulo de fibrina (KONEMAN et al.,
2001). A coagulase é produzida durante o metabolismo microbiano e é capaz de
coagular o sangue humano e de animais por ativação da protrombina, o que
ocasiona a conversão de fibrinogênio em fibrina. Assim, esse fator enzimático
provoca um acúmulo de fibrina ao redor das células bacterianas, isolando a área
infectada e dificultando a ação dos mecanismos de defesas do hospedeiro
(MADIGAN et al., 1997). A enzima coagulase e codificada pelo gene coa
(AARESTRUP et al., 1995).
Entre as 46 espécies de estafilococos, cinco são capazes de produzir
coagulase livre: S. aureus, S. hyicus, S. intermedius, S. schleiferi subespécie
coagulans e S. delphini e, destas, apenas S. aureus, S. hyicus e S. intermedius já
foram associadas à DTA (Le LOIR et al., 2003). Com relação às outras duas
espécies coagulase positiva, não há relato de seu isolamento em alimentos nem
de seu envolvimento em intoxicação alimentar (KONEMAN et al., 2001).
O RNA ribossomal é essencial para a sobrevivência dos organismos e
altamente conservado entre as bactérias (LANGE et al., 2011). O sequenciamento
do gene RNA ribossomal 16S tem sido frequentemente utilizado com finalidade
taxonômica e filogenética e é considerado o método de referência para a
identificação do gênero Staphylococcus (BECKER et al., 2004).
Apesar das várias espécies que constituem este gênero serem hoje em dia
consideradas como potencialmente patogênica, S. aureus é a espécie mais
conhecida por causar DTA (Le LOIR et al., 2003).
As principais características seletivas utilizadas no isolamento de S. aureus,
além da diferenciação pela técnica de Gram e produção de catalase e coagulase,
são a habilidade de se multiplicar em presença de NaCl (5,5 a 10%), telurito de
26
potássio (0,0025 a 0,05%), cloreto de lítio (0,01 a 0,05%), glicina (0,12 a 1,26%) e
polimixina (40 mg/L). As características diferenciais são a capacidade de reduzir o
telurito de potássio (produzindo colônias negras em meio sólidos), a capacidade
de hidrolisar a gema de ovo, a capacidade de fermentar o manitol, crescer a 42-
43°C em condições seletivas e produção das enzimas coagulase e de Tnase
(nuclease termoestável) (ICMSF, 1996). A Tnase é uma fosfodiesterase globular,
que apresenta estabilidade térmica, constituída de uma cadeia polipeptídica
simples, sendo produzida pela maioria dos CoPS. A Tnase é codificada por um
gene denominado gene nuc (BARON et al., 2004). S. intermedius e S. hyicus
também produzem TNase. A diferenciação entre estas três espécies, S. aureus,
S. intermedius e S. hyicus, pode ser feita através da pesquisa, por PCR multiplex,
de uma região espécie-específica do gene nuc, utilizando primers específicos
para cada uma das três espécies (GANDRA et al., 2011).
S. aureus não são resistentes ao calor, sendo facilmente destruído na
pasteurização ou na cocção dos alimentos (ICMSF, 1996). S. aureus é muito
resistente à congelação e descongelação e sobrevive em alimentos conservados
a temperaturas menores ou iguais a -20°C. Contudo, durante a conservação dos
alimentos a temperaturas entre -10°C a 0°C a viabilidade destas bactérias
decresce notavelmente (ICMSF, 1996).
Os reservatórios de Staphylococcus spp, assim como de S. aureus, são
os seres humanos e animais de sangue quente, sendo que o habitat primário em
humanos é a mucosa da nasofaringe, onde a bactéria existe como um membro
persistente ou transitório da microbiota normal, sem quaisquer sintomas, podendo
ser encontrada em outros sítios anatômicos, tais como, a pele, orofaringe e
mucosas, principalmente, de boca e intestino (CHAMBERS, 2006). Portadores
assintomáticos são as principais fontes de transmissão de S. aureus, tanto no
ambiente hospitalar como na comunidade (FUYO et al., 2005).
A importância de S. aureus também reside na combinação da virulência
mediada por suas toxinas, seu caráter invasivo e seu perfil de resistência aos
antimicrobianos (Le LOIR et al., 2003). Por estes motivos, ele é reconhecido como
um patógeno versátil capaz de ocasionar desde processos infecciosos simples
até infecções sistêmicas graves, de elevada morbidade e mortalidade (SANTOS
et al., 2007). Os fatores de virulência incluem as hemolisinas, leucocidinas e um
27
grupo de superantígenos tóxicos pirogênicos. A toxina responsável pela síndrome
do choque tóxico (TSST-1) e as enterotoxinas estafilocócicas (SE), que causam a
intoxicação alimentar estafilocócica, formam o grupo de superantígeno, que são
capazes de induzir a liberação de citocinas para os macrófagos e células T
(BANNERMAN, 2003).
A DTA provocada por S. aureus é classificada pela International
Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF) no grupo de
risco III, que inclui as “doenças de perigo moderado, usualmente de curta duração
e sem ameaça de morte ou sequelas, com sintomas auto limitados, mas, que
causam severo desconforto” (ICMSF,1996). A doença é uma intoxicação
provocada pela ingestão de toxinas formadas no alimento durante a multiplicação
bacteriana (Le LOIR et al., 2003).
A capacidade de produzir a enzima coagulase é usada para indicar
patogenicidade de um isolado toxigênico, assim como a presença de Tnase,
também é sugerida como indicador de enterotoxigenicidade (PEREIRA et al.,
2000; LANCETT e BENNET, 2001). Segundo Bergdoll (1989), se um isolado
apresenta resultados positivos para a produção das enzimas coagulase e Tnase
pode ser considerado como potencialmente produtor de enterotoxinas.
S. aureus é sensível à competição microbiana, tendo demonstrado que
quanto maior a concentração de microrganismos concorrentes, menor a taxa de
multiplicação e menor a produção de SE. Este acontecimento tem sido
particularmente estudado em leites e queijos (VERNOZY-ROZAND et al., 2004).
A presença do microrganismo em altos níveis pode indicar uso inadequado do
binômio tempo/temperatura no processamento e/ou armazenamento dos
alimentos, condição em que S. aureus pode desenvolver-se até níveis suficientes
para produzir enterotoxina e causar doença (BENNET, 2005).
28
3.4 Enterotoxinas estafilocócicas (SE)
As SE são cadeias de proteínas com peso molecular variando de 26 a 29
kDa, produzidas durante todas as fases do desenvolvimento bacteriano, mas
principalmente no fim da fase exponencial (SORIANO et al., 2002). Suas cadeias
polipeptídicas apresentam quantidades apreciáveis de lisina, ácido aspártico,
ácido glutâmico e tirosina. Possui ponto isoelétrico situado na faixa de pH entre
7,0 a 8,6. São resistentes a enzimas proteolíticas do sistema digestório como a
pepsina e tripsina, o que torna possível a passagem pelo trato digestório,
permanecendo ativa após a digestão. Entre outras propriedades, as SE são
relativamente estáveis ao calor, sendo requerida uma temperatura de 100°C
durante 30 minutos para destruí-las, e não são inativadas totalmente pela
pasteurização e por outros tratamentos térmicos usuais (BERGDOLL, 1989).
Alguns fatores podem afetar a produção de enterotoxinas, tais como,
atividade de água, pH, temperatura, concentração de cloreto de sódio, tensão de
O2 e condições atmosféricas (BAIRD-PARKER, 1971). As condições para
produção de SE estão na tabela 1 (ICMSF, 1996).
TABELA 1- Parâmetros físico-químicos importantes para o desenvolvimento de
S. aureus e produção de enterotoxinas em alimentos.
Parâmetros Desenvolvimento Produção de enterotoxinas
Ótimo Variação Ótima Variação
Temperatura
(°C)
35 - 37 7 – 48 35 – 40 10 – 45
pH 6,0 – 7,0 4,0 – 9.8 6,0 – 7,0
4,8 – 9,0
Aa 0,98 - 0,99 0,83 - 0,99 0,99 0,86 - 0,99
NaCl (%) 0,5 – 4 0 – 20 0,5 0 – 20
Atmosfera Aeróbica Aeróbica/
Anaeróbica
Aeróbica
(5-20% de
O2)
Aeróbica/
Anaeróbica
Fonte: ICMSF (1996) adaptado
29
Pelo fato das SE serem termorresistentes, aumenta sua importância na
indústria de alimentos, uma vez que a maioria dos alimentos recebe tratamento
térmico como a pasteurização e a ultrapasteurização (ASPENGER, 1994). Assim,
como a célula bacteriana, as toxinas estafilocócicas demonstraram ser bastante
resistentes e estáveis à congelação (ICMSF, 1996).
O INCSSN (International Nomenclature Comittee for Staphylococcal
Superantigen Nomenclature) recomendou que apenas os superantígenos
estafilocócicos que induzem vômito após a administração oral experimental em
macacos sejam denominados como SE. Aqueles que não promovem emese no
modelo experimental designado devem receber a denominação de SEL
(Staphylococcal enterotoxin-like) (OMOE et al., 2005; CHIANG et al., 2008).
As SE são nomeadas com as letras do alfabeto de acordo com a ordem
cronológica de suas descobertas, as quais compartilham similaridade na estrutura
e sequência (BALABAN e RASSOLY, 2000; Le LOIR et al., 2003). Com base nas
características antigênicas são reconhecidos os tipos sorológicos das
enterotoxinas (JORGENSEN et al., 2005). Já foram descritos 22 tipos distintos de
SE. Os tipos clássicos SEA, SEB, SEC1, 2, 3, SED e SEE são considerados os
de maior ocorrência. Embora sejam similares em sua composição e atividade
biológica, as SE são identificadas separadamente em função das diferenças
antigênicas (OMOE et al., 2005). As SEs são codificadas por genes presentes em
bacteriófagos, plasmídeos e cromossomo (JARRAUD et al., 2002; OMOE et al.,
2002; BLAIOTTA et al., 2004).
A SEA é codificada pelo gene sea, constituído por 771 pb, localizado em
um fago, e codifica uma proteína de 27,1 kDa. Esta toxina é expressa na fase
exponencial do desenvolvimento bacteriano (TREMAINE et al., 1993). SEA é
expressa constitutivamente (sistema agr independente) e, até o momento, não há
dados de mecanismos de regulação controlando a produção desta toxina
(JOHLER e STEPHAN, 2010).
O gene seb apresenta 798 pb, codifica a proteína SEB de 31,4 kDa e está
associado a um elemento genético situado no cromossomo (JOHNS e KHAN,
1988). O fato de SEB ser facilmente aerosolizada e apresentar boa estabilidade
permitiu que esta se tornasse uma potencial arma biológica na década de 70.
Quando inalada em doses elevadas, vários órgãos são acometidos e o desfecho
30
quase sempre é trágico (DINGES et al., 2000). A SEB é classificada como um
“superantígeno”, sendo que uma dose de 0,0004 μg por quilo de massa corporal é
incapacitante para 50% dos infectados sendo a dose letal para 50% dos
infectados (DL50) de apenas 0,02 μg/kg. (BALABAN e RASSOLY, 2000).
A SEC possui algumas variantes, nomeadas de SEC1, SEC2 e SEC3.
Estas foram classificadas com base nas diferenças antigénicas e no animal
hospedeiro ao qual estão associadas (MARR et al., 1993). O gene sec1 tem 801
pb e codifica uma proteína de 27,4 kDa, o gene sec2 tem 801 pb e codifica uma
proteína de 26 kDa (BOHACH e SCHLIEVERT, 1989) e o gene sec3 tem 798 pb e
codifica uma proteína de 27,4 kDa (COUCH e BETLEY, 1989). SEC2 e SEC3 são
os subtipos de SEC mais frequentes em surtos de intoxicação alimentar (CHEN et
al., 2004). SEC é a enterotoxina mais reportada em produtos lácteos de origem
ovina e caprina (HIROOKA et al., 1988).
O gene sed foi encontrado em um plasmídeo de 27,6 kb e codifica uma
proteína de 26,3 kDa (BAYLES e IANDOLO, 1989). A SED é produzida
normalmente em quantidades reduzidas, no entanto, a sua toxicidade não deve
ser menosprezada, visto que doses entre 100 a 200 ng podem causar doença,
especialmente, em crianças e idosos (KOKAN e BERGDOLL, 1987).
O gene see, que codifica para uma proteína de 29 kDa denominada SEE,
está localizado em um fago, que se encontra integrado ao DNA cromossômico
(COUCH et al., 1988), e apresenta homologia com SEA e SED (BALABAN e
RASSOLY, 2000).
A principal importância da presença dos estafilococos nos alimentos é a
sua capacidade de produzir enterotoxinas, levando a quadros de intoxicação
alimentar. O período de incubação da doença pode levar de 30 minutos a 6 horas,
variando de acordo com a sensibilidade individual, mas calcula-se que para
ocorrer a intoxicação, basta a ingestão de menos de 1 µg de toxina pura, para
desencadear a sintomatologia (ADAM e MOSS, 1997).
O desenvolvimento de técnicas moleculares permitiu a utilização de uma
nova ferramenta para a detecção da sequência de nucleotídeos do gene
responsável pela produção de enterotoxina. A técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) pode ser aplicada para detecção de estafilococos
enterotoxigênicos em culturas a partir de alimentos, através da pesquisa dos
31
diferentes genes se (SANTANA et al., 2010). Na técnica da PCR são empregadas
DNA-polimerases termoestáveis e oligonucleotídeos iniciadores 5’ - 3’ específicos,
onde à partir de uma única molécula de DNA podem ser amplificadas até 107
moléculas por uma série de ciclos de amplificação. O DNA amplificado é, então,
detectado por meio de corrida eletroforética em gel de agarose (KONEMAN,
2001). Esta técnica é altamente sensível e específica, permitindo a detecção dos
microrganismos a partir de uma pequena quantidade de amostra (SU e WONG,
1997). Apesar das vantagens da PCR, não é possível a diferenciação entre
células viáveis e não viáveis. Assim sendo, o resultado positivo não indica,
necessariamente, a presença de células viáveis produtoras de SE no alimento,
não sendo o diagnóstico final conclusivo (WONG e BERGDOLL, 2002).
Para avaliar a enterotoxicidade de uma cepa de Staphylococcus é
necessário o desenvolvimento de testes imunológicos por serem mais sensíveis e
específicos (SU e WONG, 1997), através de anticorpos monoclonais e policlonais
específicos (LANCETTE e TATINI, 1992). Até o momento só existem Kits
(conjunto de reagentes) imunológicos disponíveis para detecção das SEs
clássicas, a partir de fluidos sobrenadantes de culturas de Staphylococcus spp e
em extratos de alimentos. Os métodos mais empregados são os ensaios de
aglutinação reversa passiva em látex (RPLA) e ensaio de imunoabsorção ligado à
enzima (ELISA), os quais se baseiam no uso de anticorpos específicos, e têm
permitido níveis de detecção abaixo de 1µg/mL (RASOOLY e RASSOLY, 1998). A
técnica de Sensibilidade Ótima em Placas (OSP) permite a detecção de 0,5 g de
SE/mL, sendo sua sensibilidade adequada para maioria das cepas
enterotoxigênicas (WONG e BERGDOLL, 2002).
O isolamento e determinação da enterotoxigenicidade da cepa de
Staphylococcus isolada a partir de alimentos indica o potencial para a produção
de enterotoxinas, mas não garante que a cepa enteroxigênica irá produzir SE nas
condições ambientais onde se encontra (BAIRD-PARKER, 1971). Segundo
Lancette e Tatini, (1992) o maior problema na identificação das SE em alimentos,
é a pequena quantidade encontrada. O Teste VIDAS Staph Enterotoxin II é um
sistema automatizado da Bio-Merieux, que utiliza a tecnologia ELFA (Enzyme
Linked Fluorescent Assay), para detecção de enterotoxinas de estafilococos em
produtos alimentares (Biomerieux).
32
A determinação do tipo de SE é um fator importante na investigação
epidemiológica de casos e surtos da doença (LANCETTE e BENNET, 2001), e
sua identificação nos alimentos pode indicar a possível fonte de contaminação
(NÁJERA-SANCHEZ et al., 2003), tendo em vista que foi demonstrado que SEA e
SEB são associadas com contaminação de origem humana, através de
manipuladores de alimentos, e que SEC e SED são associadas com
contaminação a partir de animais, geralmente bovinos e suínos (HIROOKA et al.,
1988; NÁJERA-SANCHEZ et al., 2003).
3.5 Aspectos epidemiológicos da intoxicação estafilocócica
S. aureus enterotoxigênico é um dos principais patógenos responsáveis por
casos de intoxicação alimentar no mundo inteiro (DINGES et al., 2000), sendo
estimado, pelo CDC, como causa de 185.000 casos de intoxicação alimentar nos
Estados Unidos anualmente. Aproximadamente 1,5 bilhão de dólares é gasto
anualmente nos Estados Unidos por causa das intoxicações estafilocócicas
(MEAD et al., 1999).
Na França entre 1999 e 2000, S. aureus foi apontado como o segundo
maior responsável pelos casos de DTA microbiana (Le LOIR et al., 2003). Em
Osaka, no Japão, ocorreu um surto provocado pela ingestão de produtos
derivados do leite contaminados com S. aureus. Foi detectada a presença de SEA
previamente formada nos produtos. Supõe-se que a exposição do leite cru a uma
elevada temperatura foi o fator determinante que permitiu o desenvolvimento de
S. aureus e a conseqüente formação da SEA (ASAO et al., 2003). Em 2000, no
Japão, 13.420 pessoas foram envolvidas em um surto de intoxicação ao
consumirem leite desnatado reconstituído contaminado com enterotoxina A e H
produzida por estafilococos (IKEDA et al., 2005).
Normanno et al (2005) encontraram 20,7% das 3.097 amostras de leite e
derivados, coletados em mercados na Itália, contaminadas com CoPS, das quais
56,5% eram S. aureus e destas, 55,5% produziram enterotoxinas SEA, SEB, SEC
e/ou SED, sendo SEC a mais frequente.
As intoxicações estafilocócicas são muito comuns no Brasil, sendo a
maioria dos casos não investigados ou não notificados (PEREIRA et al.,1996).
Sabioni et al (1988), isolaram S. aureus produtores de SEA, SEB e SED em QMF,
33
envolvido em um surto com uma família em Minas Gerais. Saboni et al (1994)
investigaram um surto de DTA em Ouro Preto, MG, oriundo da ingestão de queijo
Minas. Neste surto, onze casos foram relatados, com três hospitalizações. Os
resultados das análises microbiológicas revelaram elevado nível de coliformes
termoresistentes, o que indica possível contaminação de origem fecal, e a
presença de S. aureus na ordem de 108 UFC/g. Em alimentos esse valor implica
em alto risco de intoxicação.
Carmo et al (2002) descreveram um surto de intoxicação ocorrido em Minas
Gerais, em 1999, no qual 50 pessoas apresentaram sintomas de vômito, diarreia,
cólica, calafrios e dor de cabeça, após consumirem QMF. A vigilância sanitária
local foi notificada e coletou amostras de queijos e uma amostra de leite cru
utilizada na fabricação do referido queijo. Nas amostras de queijo foram
identificadas cepas coagulase e termonuclease positivas, confirmando S. aureus,
com contagens maiores que 2 x 108 UFC/g, com a presença de SEA, SEB e SEC;
o leite cru apresentou SEA e SEB.
Veras et al (2003), investigaram surtos de DTA envolvendo leite e produtos
derivados no estado de Minas Gerais, e constataram que os principais agentes
causadores foram Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase-negativa
enterotoxigênicos, e que as principais toxinas envolvidas nos surtos foram SEA,
SEB e SEC.
Arcuri et al (2010) analisaram isolados de S. aureus isolados de leite de vaca
com mastite, amostras de leite de tanques e de QMF dos principais laticínios
inspecionados da região de Minas Gerais e Rio de Janeiro. Em torno de 14% dos
125 isolados de leite foram positivos para um ou mais genes de enterotoxinas
(sea-see, seg, seh, sei e selj e sell), o mesmo ocorreu para 43% dos 96 isolados
de leite de tanques e 73% dos 70 isolados de queijo.
3.6 Resistência antimicrobiana
Os mecanismos pelos quais os genes de resistência são transferidos entre
os organismos são complexos. Em S. aureus a resistência resulta da aquisição de
genes, como plasmídeos ou transposons, por recombinação do DNA exógeno no
cromossoma da bactéria, ou por mutação (HIRAMATSU, 2001).
34
Os antimicrobianos têm sido utilizados de maneira indiscriminada no setor
agrícola, tanto para fins terapêuticos, principalmente no tratamento de mastites
bovinas, como incorporados à alimentação animal (CORBIA et al., 2000).
Dentre os problemas causados pelos resíduos de antimicrobianos nos
alimentos, destaca-se o aparecimento de cepas resistentes, levando-se em conta,
a possibilidade de transferência de resistência para as cepas patogênicas
(MULLIGAN et al., 1993). Mesmo com o desenvolvimento de drogas cada vez
mais específicas e de largo espectro, a resistência permanece como problema
que requer consideração constante. A elevada ocorrência de resistência múltipla
a antibióticos apresenta risco potencial para a saúde pública e pode dificultar o
tratamento de doenças humanas e de animais, agravando quadros clínicos
potencialmente curáveis (RODRIGUEZ e VESGA, 2005).
Apesar dos antimicrobianos β-lactâmicos ainda serem os mais utilizados
no tratamento das doenças infecciosas, outras classes merecem destaque como
os macrolídeos (eritromicina), lincosaminas (clindamicina) e estreptograminas os
quais também são amplamente utilizados no tratamento de infecções
estafilocócicas (ZELAZNY et al., 2005; ROSSI e ANDREAZZI, 2005). No entanto,
a resistência a estas drogas já foi descrita, e ocorre principalmente por efluxo
ativo ou por alteração de enzimas ribossômicas (LECLERCQ, 2002). O
mecanismo de efluxo ativo é codificado pelo gene msrA (specific methionine
sulfoxide reductase), que confere resistência a macrolídeos e estreptograminas,
mas não à clindamicina. A resistência por alteração de enzimas ribossômicas
ocorre através do gene erm (erythromycin ribosome methylase) que codifica
enzimas que conferem resistência a macrolídeos, estreptograminas e
lincosaminas (WEISBLUM, 1995). No caso das lincosaminas, esta resistência
pode ser induzida (MLSBi; macrolide lincosamide streptogramin type B inducible
resistance) ou constitutiva (MLSBc; macrolide lincosamide streptogramin type B
constitutive resistance). Quando a expressão do gene é constitutiva, a rRNA
metilase é sempre produzida, e as cepas mostram-se resistentes a todos os
antimicrobianos do grupo MLSB. Quando a resistência é induzida, as cepas
mostram resistência apenas aos macrolídeos e a metilase é produzida somente
na presença de um indutor (STEWARD et al., 2005). A resistência induzida a
clindamicina é verificada por um achatamento ou embotamento da zona de
35
inibição do disco de clindamicina adjacente ao disco de eritromicina dando um
formato de letra D para a zona de inibição induzida, motivo pelo qual, este teste é
comumente denominado de teste D (ZELAZNY et al., 2005).
A ciprofloxacina é uma quinolona, no qual o alvo primário é a DNA girase
bacteriana, sem a qual a replicação do DNA é inibida. Assim, bactérias resistentes
apresentam mutação cromossomal, reduzindo a afinidade da quinolona aos seus
alvos (DNA girase e Topoisomerase IV) (LOWY, 2003). Os mecanismos de
resistência a esta droga podem ser por: alteração de enzimas, mecanismo de
efluxo e redução da permeabilidade por alteração das porinas (FLUIT et al.,
2001).
Os aminoglocosídeos são antimicrobianos que inibem a síntese protêica
por interferir na formação do complexo de iniciação formado por subunidades
ribossomais (MALIK et al., 2005). Exemplos desta classe são gentamicina,
tobramicina e amicacina. A resistência em S. aureus aos aminoglocosídeos
resulta de um dos três eventos: mutação cromossômica levando a uma ligação
alterada do aminoglicosídeo aos ribossomos; transporte deficiente da droga ao
interior da célula bacteriana; ou a modificação enzimática dos aminoglicosídeos.
As formas de aminoglicosídeos acetilados, fosforilados ou adenilados, não se
ligam aos ribossomos, não ocorrendo inibição da síntese protêica (SCHITO,
2006).
Outro antimicrobiano que interfere na síntese protêica é o cloranfenicol. A
resistência ocorre por inativação enzimática por meio da enzima acetiltransferase
codificada por gene pasmidial (MALIK et al., 2005).
As tetraciclinas atuam na síntese protêica por impedir a entrada de novos
aminoácidos na cadeia peptídica. Os mecanismos de resistência consistem no
efluxo do antimicrobiano ou proteção ribossomal, que é o seu alvo. Vários genes,
denominados tet, estão associados à resistência (MALIK et al., 2005).
As oxazolidinonas (linezolida) são antimicrobianos sintéticos. Seu
mecanismo de ação consiste em inibir a síntese protêica ao ligar-se à subunidade
50S do ribossomo, deformando o RNA transportador e inibindo sua ligação ao
ribossomo. Dessa forma, impede o início da formação do complexo peptídico
(DRESSER et al., 1998).
36
As sulfonamidas, assim como o trimetoprim, agem sobre microrganismos
que não utilizam o ácido fólico do meio, apenas os que são produzidos pela
própria bactéria. O mecanismo de ação se dá por inibição da produção do ácido
fólico. Um dos mecanismos pelos quais as bactérias adquirem resistência a
sulfonamidas está associado a uma mutação cromossomial. Já o mecanismo pelo
qual as bactérias adquirem resistência ao trimetoprim é pela produção de
dihidrofolato redutases, com baixa afinidade por este antimicrobiano (MALIK et al.,
2005).
No tratamento de infecções por MRSA, os glicopeptídeos (teicoplanina e
vancomicina) são os antimicrobianos de escolha. O isolamento de cepas
S. aureus resistentes a vancomicina (VRSA) tem sido relatado desde 1998 nos
Estados Unidos (CHAMBERS, 2001). A vancomicina pertence à classe dos
glicopeptídeos e é empregado no tratamento de infecções causadas por bactérias
Gram-positivas, resistentes aos β-lactâmicos. Seu mecanismo de ação é a
inibição da síntese do peptideoglicano da parede celular, porém ela não atua nas
PBP, mas sim, reconhecendo e ligando-se à terminação D-alanina-D-alanina do
pentapeptídeo, que faz as ligações transversais inibindo sua incorporação no
peptideoglicano (JONES, 2006). Em 2006, o CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute), reduziu o ponto de corte de susceptibilidade de S. aureus em
relação à vancomicina, de 4 µg/ml para 2 µg/ml, devido a redução da eficácia
deste antimicrobiano para CMI igual a 4 µg/ml. Em 2009, o CLSI, estabeleceu que
deve ser realizada a CMI para vancomicina através de microdiluição em caldo
para todos os estafilococos. A CMI é um método considerado padrão para a
avaliação quantitativa da resistência bacteriana aos antimicrobianos. Este método
é usado para determinar a concentração mínima de um agente antimicrobiano,
em microgramas por mililitro (μg/mL), necessária para inibir o desenvolvimento de
um microrganismo. No entanto, estudos recentes têm reportado que a
vancomicina apresenta atividade reduzida para MRSA com CMI próximas do
limite de susceptibilidade conforme critérios da CLSI (2012), indicando falha
terapêutica (SAKOULAS et al., 2004; STEVENS, 2006).
37
3.6.1 Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)
Os antimicrobianos podem variar quanto à sua estrutura química e
mecanismo de ação, espectro de atividade pertencendo a grupos diferentes. No
grupo dos β-lactâmicos, encontram-se os antimicrobianos representados pelas
penicilinas naturais e sintéticas, as cefalosporinas, carbapenemas e
monobactans. Os β-lactâmicos são antimicrobianos que têm como principais
alvos de ação as enzimas que atuam nas etapas finais da formação da parede
celular bacteriana. Essas enzimas, são proteínas de membrana que por se
ligarem aos antimicrobianos β-lactâmicos, são chamadas de proteínas de ligação
à penicilina (PBP; penicillin binding protein). A ligação do β-lactâmico às PBPs
impede que estas exerçam sua atividade de transpeptidase, endopeptidase e
glicoxidase, levando à alteração na formação da camada de peptidoglicano da
parede celular, o que parece desencadear a morte bacteriana por um processo
ainda pouco conhecido (MURRAY, 2003).
São descritos dois mecanismos principais pelos quais pode ocorrer
resistência bacteriana aos β-lactâmicos. Um deles é através da produção de
β-lactamases. As β-lactamases são enzimas produzidas pela bactéria, capazes
de degradar os β-lactâmicos. A produção desta enzima é responsável pelo
aparecimento das primeiras resistências à penicilina (CHAMBERS, 1997). Este
fato levou ao desenvolvimento de penicilinas resistentes às β-lactamases, como
alternativa ao tratamento das doenças infecciosas. No caso das infecções
estafilocócicas, a oxacilina e a meticilina, passaram a ser antimicrobianos de
primeira escolha no tratamento das enfermidades causadas por estas bactérias
(LOWY, 2003). O outro mecanismo de resistência é através da alteração da
proteína PBPs (LOWY, 2003). Os estafilococos produzem quatro tipos de PBPs,
denominadas PBP1 a 4. As cepas resistentes expressam o subtipo denominado
PBP2a ou PBP2’ (KATAYAMA et al., 2000).
Nos anos 50 foi introduzido o antimicrobiano meticilina, primeira penicilina
semisintética anti-estafilocócica utilizada no tratamento de todas as infecções por
S. aureus produtores de penicinilase. Entretanto, a resistência a meticilina foi
reportada muito precocemente, logo após sua introdução, em 1961 (JEVONS,
1961). Tal processo ocorre devido à aquisição cromossômica do gene,
denominado mecA, que codifica para a produção de uma PBP alterada definida
38
como PBP2a (Penicillin Binding Proteins 2a). Esta proteína possui uma baixa
afinidade com a molécula do antibiótico, permitindo que as reações na síntese da
parede celular bacteriana ocorram. Desta forma ela confere resistência a todos os
agentes β-lactâmicos (LOWY, 2003). Durante muitos anos as infecções causadas
por MRSA foram documentadas apenas em serviços de saúde, sendo estas
cepas denominadas HA-MRSA (healthcare-associated methicillin-resistant
S. aureus), recentemente cepas MRSA emergiram associadas à comunidade CA-
MRSA (community-associated methicillin-resistant S. aureus) (CHAMBERS,
2001). CA-MRSA tende a provocar doença principalmente em pacientes jovens
sadios, estando associado predominantemente a infecções de pele. HA-MRSA
tem sido isolado a partir de indivíduos mais velhos, hospitalizados ou expostos a
ambientes hospitalar e que apresentam algum tipo de comorbidade, causando
principalmente pneumonia, bacteremia ou infecções invasivas (DAVID e DAUM,
2010). Atualmente não há uma definição única e globalmente adotada, que
identifique com precisão um isolado como CA-MRSA. Algumas definições têm
sido propostas, baseadas em informações epidemiológicas e clínicas; e/ou por
técnicas laboratoriais de biologia molecular (KLUYTMANS et al., 2006; SHOPSIN
et al., 2003). De acordo com o critério do CDC, infecções causadas por CA-MRSA
são definidas quando algum isolado MRSA é coletado de um paciente em
ambiente ambulatorial ou diagnosticado por cultura do material clínico de um
paciente com até 48h de hospitalização e sem história de infecção ou colonização
anterior por MRSA, sem internação ou procedimento cirúrgico no último ano, sem
admissão em casas de saúde, hospício, lar de idosos, serviços especializados de
enfermagem, que não faz ou fez uso de diálise ou ainda de cateteres ou
dispositivos intravenosos que passam através da pele para dentro do corpo
(RYBAK e La PLANTE, 2005). Em contraste com as cepas HA-MRSA, as cepas
CA-MRSA são geralmente sensíveis à maioria das classes de antimicrobianos,
exceto aos β-lactâmicos (WANNET et al., 2005). Uma característica que pode ser
observada nas cepas CA-MRSA é a presença da toxina Panton-Valentine
leucocidina (PVL). Esta citotoxina é capaz de destruir leucócitos humanos e infligir
grave dano tecidual, estando relacionada com lesões necróticas de pele e grave
pneumonia necrotizante, geralmente associada a uma alta letalidade
(PALAVECINO, 2004). A citotoxina PVL é considerada um marcador molecular
39
associado a CA-MRSA (VANDENESCH et al., 2003). No entanto, dados indicam
que PVL não está sempre presente entre as cepas CA-MRSA (TEIXEIRA et al.,
1995; CARVALHO et al., 2012).
Os termos HA-MRSA, CA-MRSA e LA-MRSA, são utilizados para destacar
as diferenças genotípicas, epidemiológicas e características clínicas de certos
isolados MRSA (DAVID e DAUM, 2010). CA-MRSA carreia preferencialmente os
SCCmec dos tipos IV, V e eventualmente o tipo VII (IWG-SCCmec, 2011).
Enquanto HA-MRSA carreia principalmente os tipos I, II, III e evrentualmente o
tipo VIII (ZHANG et al., 2005). LA-MRSA carreia os tipos Iv e V. A maioria das
cepas LA-MRSA são resistentes a tetraciclina e não são tipificados pelo PFGE
com a enzima de restrição SmaI (LI et al., 2011).
MRSA também coloniza e provoca infecções em uma variedade de
animais, incluindo de fazenda (pecuária) e alguns selvagens (DOYLE et al.,
2012). MRSA do tipo ST398 foi primeiramente identificado em porcos, na Holanda
em 2003, sendo denominado MRSA pecuária-associado (LA-MRSA; Livestock-
associated MRSA) (ARMAND-LEFEVRE et al., 2005; LOEFFEN et al., 2005). LA-
MRSA são geneticamente distintos dos isolados humanos (VANDERHAEGHEN
et al., 2010). ST398 também foi isolado de humanos e outros animais de fazenda
(CUNY et al., 2010). Pesquisas indicam que suínos, vitelos e frangos são os
principais reservatórios para ST398 (ECDC 2009), mas esta cepa também foi
encontrada no gado leiteiro e no leite (KREAUSUKON et al., 2012). LA-MRSA
estão associados principalmente com o complexo clonal (CC) 398 (van LOO et
al., 2007).
A resistência fenotípica à oxacilina é extremamente variável
(heterorresistência) e depende da expressão do gene mecA (MARANAM et al.,
1997). Na expressão heterogênea de resistência à meticilina, somente uma fração
de colônias expressa resistência à oxacilina, apesar da presença do gene mecA,
dificultando a interpretação do teste. Desde 2004, o CLSI indica a utilização do
disco de cefoxitina (30 μg) para determinação da suscetibilidade a oxacilina em
cepas de Staphylococcus, pelo fato deste antimicrobiano ter apresentado uma
capacidade de indução da expressão da resistência a meticilina, através do gene
mecRI, mais forte e mais eficiente do que a oxacilina (SHARP et al., 2004;
POTTUMARTHY et al., 2005). Nos últimos anos, vários autores têm demonstrado
40
essa eficácia do teste de disco difusão com cefoxitina para o diagnóstico da
resistência à oxacilina em estafilococos (VELASCO et al., 2005; MÍMICA et al.,
2007; SILVA-CARVALHO et al., 2009).
O gene mecA é um segmento de DNA exógeno de 2,1Kb que está inserido
em um elemento genético móvel denominado de cassete cromossômico
estafilocóccico mec (SCCmec), localizado em um sítio específico do cromossomo
dos estafilococos (attBscc), próximo ao ponto de origem de replicação do DNA
flanqueado por sequências diretas e repetidas (KATAYAMA et al., 2000). Este
segmento de DNA, variando entre 21 e 67 kb, carreia, além do gene mecA, os
genes mecR1 e mecI, que codificam o indutor MecR e a proteína repressora
MecI. Outros genes múltiplos de resistência, além da meticilina, também podem
ser encontrados (OLIVEIRA et al., 1998). O elemento SCCmec é composto por
três elementos genéticos essenciais: o complexo gênico mec, responsável pela
resistência; o complexo gênico ccr (cassette chromosome recombinase), que
codifica recombinases responsáveis pela sua mobilidade e responsável pela
excisão e integração do cassete no genoma bacteriano; e a região J (junkyard)
que codifica resistência para antibióticos não β-lactâmicos e metais pesados
(HIRAMATSU et al., 2002; ZHANG et al., 2005).
Com base na combinação das classes do gene mec com os alótipos do
gene ccr, onze tipos de SCCmec (I a XI) foram descritos (TURLEJ et al., 2011;
ZONG et al., 2011; SHORE et al., 2011). No entanto, os tipos SCCmec podem
ser diferenciados em subtipos dependendo das variações nas regiões J
(HANSSEN e SOLLID, 2005; CHAMBERS e De LEO, 2009; MALACHOWA e De
LEO, 2010). Os elementos SCCmec tipo I, II, III, VI e VIII, em geral, estão
associados a centros hospitalares. Diferentemente, os tipos IV, V ou VII que têm
sido amplamente disseminados entre cepas de CA-MRSA (CHAMBERS e De
LEO, 2009). A tipificação do SCCmec é importante para entender a epidemiologia
e a relação clonal das cepas MRSA (ZHANG et al., 2005). O tipo I (34,3 Kb) foi
identificado na primeira cepa isolada em 1961, no Reino Unido, o tipo II (53 Kb),
em uma cepa isolada no Japão em 1982, o tipo III (66,6 Kb) em uma cepa isolada
em 1985 na Nova Zelândia. Esses cassetes são caracterizados pela presença de
outros genes de resistência, além do gene mecA, como antibióticos não
β-lactâmicos e metais pesados (ITO et al., 2001; OLIVEIRA e LENCASTRE,
41
2002). Em 2002 foi identificado o SCCmec tipo IV, bem menor que os tipos
anteriores (21 a 24,3 Kb), isolado do Clone Pediátrico MRSA adquirido na
comunidade e caracterizado por possuir somente o gene mecA (DAUM et al.,
2002). Ito et al (2004) identificaram o SCCmec tipo V (28Kb), que também não
carreia outros genes de resistência, a não ser o mecA (ITO et al., 2004). Em
2006, foi descrito por Oliveira e colaboradores o SCCmec tipo VI (20,9 Kb),
porém, com diferenças na estrutura genômica e alótipos de recombinases,
caracterizando origem hospitalar (OLIVEIRA et al., 2006). Em 2008, Berglund e
colaboradores, em estudos desenvolvidos utilizando um isolado proveniente de
uma mulher sem fatores de risco associados, identificaram o SCCmec tipo VII
(35,9 Kb), cujo elemento móvel se caracteriza também por conter somente o gene
mecA como determinante de resistência (BERGLUND et al., 2008). Através de
análises de sequencias genéticas foi identificado o SCCmec tipo VIII (32 Kb), que
pode ser derivado da recombinação homóloga entre duas cepas de S. epidermidis
ou via recombinação de outras cepas de estafilococos, que carreiam cassetes
móveis similares. SCCmec tipo VIII é um isolado tipicamente hospitalar, menor
que os tipo I, II e III, porém, maior que os tipos associados a CA-MRSA (IV e V)
(ZHANG et al., 2005). SCCmec IX (43,7 pb), isolado em 2006 a partir da cepa
JCSC6943, originária da Tailândia (LI et al., 2011) e SCCmec X (50,803 pb)
também isolado em 2006 a partir da cepa JCSC6945 originário do Canadá (LI et
al., 2011). A região J dos tipos SCCmec IX e X carreiam genes relativos a
desintoxicação de metais pesados, como o cádmio, o cobre e o zinco. E ambos
possuem número de acesso ao Gene Bank. SCCmec XI (http://www.sccmec.org/),
foi identificado pelo Instituto Sanger, como ST425, isolado da cepa LGA251, cepa
MRSA bovina, listados no site do Grupo de Trabalho Internacional sobre a
classificação dos SCCmec, e ainda não possui número de acesso no GeneBank.
Essas descobertas reportam à capacidade dos elementos SCCmec de se
transferirem horizontalmente entre o gênero Staphylococcus ou passarem por
recombinações para gerarem novos tipos SCCmec (ZHANG et al., 2009).
42
3.7 Técnicas moleculares para tipificação de cepas de estafilococos
Alguns estudos têm avaliado e comparado diferentes métodos de
tipificação, tais estudos mostraram que as características fenotípicas como
antibiograma, biotipagem e fagotipagem apresentam uma instabilidade maior do
que os resultados das técnicas moleculares (TENOVER et al., 1994). A tipificação
molecular tem a finalidade de diferenciar cepas, assim como analisar uma
provável origem comum, sendo de grande importância epidemiológica,
principalmente na pesquisa de um surto. A análise do genoma bacteriano permite
detectar, entre outras características, variações na sequência de DNA, as quais
são mais estáveis do que as características fenotípicas e muito mais
discriminativas, visto que o genoma de cada indivíduo é único. O desenvolvimento
de métodos de tipificação de alta resolução baseados principalmente na análise
do polimorfismo do genoma, tem contribuído para o estudo de muitos agentes
infecciosos. Estes métodos de tipagem devem apresentar reprodutibilidade,
estabilidade, poder discriminatório, rapidez, facilidade de execução e
manipulação, baixo custo e concordância. Entretanto, não existe um método ideal
que satisfaça todos os critérios acima mencionados e para uma caracterização
mais precisa, recomenda-se a combinação de diferentes métodos (TENOVER et
al., 1995).
Após a descoberta do SCCmec por Katayama e colaboradores (2000),
protocolos de identificação dos tipos de SCCmec foram desenvolvidos e
incorporados aos estudos de epidemiologia molecular de MRSA (OLIVEIRA e
LENCASTRE, 2002). PFGE, conhecida como Eletroforese em Gel de Campo
Pulsado, é uma variação de eletroforese em gel de agarose, com alto poder
discriminatório para inúmeros microrganismos, pois a alternância entre os
sentidos do campo elétrico, ou pulsos, permite separar fragmentos que,
convencionalmente, não seriam diferenciados em gel de agarose convencional
que utilizam corrente elétrica constante (MASLOW e MULLIGAN, 1996). A
tipificação do gene da proteína A (SpA; S. aureus protein A) tem sido usada no
estudo da epidemiologia molecular e evolução dos MRSA. A combinação destes
métodos tem aprimorado a classificação das cepas MRSA (DEUREMBERG et al.,
2007).
43
3.7.1 Pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE)
É indicado para estudos com finalidade epidemiológica, e útil
principalmente na investigação de surtos hospitalares (TEIXEIRA et al., 1995),
devido ao alto poder discriminatório (WELLER, 2000), e devido a sua alta
reprodutibilidade e boa correlação com dados epidemiológicos (SENNA, 2002).
PFGE é considerada “padrão ouro” para tipificação de MRSA, determinando sua
relação genética (WELLER, 2000).
Este método é baseado no padrão de restrição de endonucleases na
molécula do DNA bacteriano. Enzimas de restrição reconhecem estes sítios e
clivam o DNA em fragmentos grandes. O número de fragmentos vai variar de uma
cepa para outra, possibilitando a formação de padrões eletroforéticos de fácil
análise e comparação (BANNERMAN, 1995). Alterações na sequência de
nucleotídeos são refletidas nos padrões de restrição pela endonuclease do DNA
cromossômico quando os fragmentos são separados em gel de agarose. A
análise de fragmentos cromossômicos obtidos por restrição é baseada no fato de
que os cromossomos não são estáticos e podem sofrer rearranjos e mutações. A
PFGE permite que o DNA genômico total seja separado em um número limitado
de fragmentos de restrição com distintas mobilidades eletroforéticas (TENOVER
et al., 1995). Foi proposto um sistema para padronizar a interpretação dos
padrões da PFGE com relação à determinação da correlação entre cepas, onde
cepas bacterianas que geram o mesmo padrão de PFGE são consideradas a
mesma cepa; cepas bacterianas diferindo em um único evento genético,
representado como uma diferença de uma a três bandas são estreitamente
relacionadas; cepas diferindo de quatro a seis bandas, representando duas
alterações genéticas independentes, são possivelmente relacionadas e cepas
bacterianas contendo seis ou mais bandas diferentes, representativas de três ou
mais alterações genéticas, são consideradas não correlacionadas (TENOVER et
al., 1995).
A técnica da PFGE é capaz de detectar rearranjos, aquisições ou perda de
determinantes genéticos, ou seja, eventos genéticos que ocorrem em períodos
curto de tempo (OLIVEIRA et al., 2002).
44
3.7.2 Tipificação da Proteina A estafilocócica (SpA typing)
A proteína A estafilocócica (SpA; Staphylococcus protein A) é uma proteína
de superfície espécie-específica ancorada à parede celular do S. aureus, e tem a
capacidade de interagir com muitos componentes do hospedeiro, possivelmente
desenvolvendo um papel como fator de virulência em infecções (PALMQVIST et
al., 2002). Spa-typing é um método proposto para caracterização de cepas
MRSA. Possui alto poder discriminatório e reprodutibilidade (SHOPSIN et al.,
2000). É baseado no sequenciamento da região polimórfica X do gene spa e tem
sido proposto como método alternativo para tipificação de S. aureus. A
diversidade do gene spa consiste no número de pequenas sequências de
repetição (repeats) contidas na região X. De acordo com o número e tamanho
(21, 24 ou 27 pb) das repetições, é gerado o spa type correspondente
(HARMSEN et al., 2003). Apesar do sequenciamento do gene spa possuir
vantagens em termos de velocidade de execução, facilidade de uso e
interpretação, não apresenta o poder discriminatório e de resolução da PFGE na
detecção de subtipos clonais (DEUREMBERG et al., 2007). A tipificação do gene
spa fornece dados concordantes com o MLST (Multilocus Sequence Typing) e o
PFGE (COOKSON et al., 2007). Enquanto a tipagem spa envolve uma única
região do cromossomo, sujeita à recombinação entre clones independentes, o
PFGE e o MLST investigam várias regiões do cromossomo. A tipificação do spa,
representa uma abordagem intermediária para análise de micro e macrovariações
(HARMSEN et al., 2003). Resultados de MLST e tipagem spa podem ser
comparados com bancos de dados internacionais (http://www.mlst.net e
http://www.ridom.de/spaserver). Nesses bancos de dados, as sequências de DNA
podem ser armazenadas com a informação clínica correspondente de cada
isolado, o que permite obter o perfil alélico e estabelecer relações filogenéticas de
ancestralidade dos principais clones MRSA (COOKSON et al., 2007).
45
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostragem
Foram analisadas 30 amostras de queijo Minas frescal (QMF), de 18
marcas industriais diferentes, sendo dois das marcas A, F, H e I, três das marcas
D e G, cinco da marca E, e um das marcas B, C, J, K, L, M, N, O, P, Q e R
(Tabela 2), todas com registro no Serviço de Inspeção Federal (SIF) e/ou
Estadual (SIE), pertencentes a diferentes lotes de fabricação. As amostras de
queijo, dispostas em embalagens plásticas hermeticamente fechadas, foram
compradas aleatoriamente em quatro diferentes estabelecimentos varejistas no
município de Niterói, durante o período de julho a setembro de 2012. As amostras
foram acondicionadas e transportadas em recipiente isotérmico e conservadas
sob refrigeração até a chegada do laboratório de Higiene e Microbiologia de
Alimentos (LHIMA) da Faculdade de Fármácia da UFF para análise imediata.
46
Tabela 2 – Número de amostras de queijo Minas frescal (QMF) analisadas
segundo a marca e o estabelecimento comercial.
Marca N° de amostras Estabelecimento
comercial
A 2 I
B 1 I
C 1 II
D 3 I
E 5 III
F 2 II
G 3 IV
H 2 II
I 2 IV
J 1 IV
K 1 IV
L 1 IV
M 1 IV
N 1 I
O 1 I
P 1 I
Q 1 II
R 1 II
18a
30b
4c
a. Total de marcas de QMF analisadas. b. Total de amostras de QMF analisadas. c. Total de estabelecimentos comerciais.
4.1.2 Processamento da amostra
O QMF foi cortado em pedaços bem pequenos de modo asséptico. Foram
retirados e pesados aleatoriamente 25 g da amostra em uma balança de precisão,
e colocados dentro de um saco plástico estéril, ao qual foram acrescentados
225 mL de água peptonada 0,1% (p/v) (HIMEDIA), seguido de homogeneização
em Stomacher por dois minutos, obtendo-se a diluição 10-1 e procedendo em
seguida as demais diluições. As diluições de 10-1 a 10-4 foram semeadas, em
duplicata, através da técnica de semeadura em superfície, em Ágar Baird-Parker
(BP), suplementado com emulsão de ovo (5%; v/v) e telurito de potássio (0,01%;
p/v) estéril, em seguida as placas foram incubadas a 36°C ±1 por 24-48h. Após o
isolamento, as colônias foram armazenadas a -20° em caldo Brain Heart Infusion
(BHI) (Difco) suplementado com glicerol (20%; v/v).
47
O meio de cultura BP foi desenvolvido por Baird Parker (1962), sendo o
meio de escolha padronizado e mais amplamente utilizado para a contagem de
S. aureus a partir de alimentos, uma vez que possui inibidores seletivos, como o
telurito de potássio e cloreto de lítio (inibidor de crescimento de Gram negativo) e
estimuladores seletivos de crescimento, tais como glicina e o piruvato de sódio,
considerados excelente para reparação de células injuriadas, porque evita o
acúmulo de peróxido de hidrogênio, que é tóxico para as células. Possui também
características diferenciais como a redução do telurito e a hidrólise da gema de
ovo. Tais fatores agem inibindo os microrganismos competidores, mas não
suprimindo completamente, e estimulando a multiplicação dos estafilococos. A
redução do telurito de potássio confere às colônias uma cor negra a acinzentada
brilhante característica e, pode-se observar também, uma zona clara ao redor da
colônia devido à lipólise e proteólise da lipovitelina e da lecitinase presente na
gema do ovo (BAIRD-PARKER,1962; ICMSF,1996; ADAM e MOSS, 1997).
4.2 Contagem e seleção das colônias de Staphylococcus coagulase-positiva
(CoPS)
A partir do BP foram contadas, separadamente, as colônias suspeitas de
Staphylococcus típicas: pequenas, negras, brilhantes e rodeadas por uma zona
(halo) clara e colônias não típicas: pequenas e/ou grandes, negras, brilhantes
e/ou foscas e sem halo. Foram selecionadas no mínimo cinco colônias de cada
tipo, sendo semeadas em caldo BHI (Brain and Heart Infusion; Difco) e ágar BHI
(Difco), incubadas a 36°C ±1 por 24 h. As colônias selecionadas foram
submetidas aos testes bioquímicos confirmatórios: coloração de Gram, produção
de catalase e coagulase.
Foi realizada a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) de
CoPS, utilizando a fórmula matemática como descrito por Silva et al (2010):
UFC CoPS/g = (N° de colônias suspeitas típicas x diluição-1 x FC x % de colônias
confirmadas) + (N° de colônias suspeitas atípicas x diluição-1 x FC x % de
colônias confirmadas)
Onde: FC (fator de correção) = 10
48
4.3 Testes bioquímicos
Os testes bioquímicos de coloração de Gram, catalase e coagulase foram
realizados a fim de confirmar as colônias de CoPS, e assim realizar a contagem
das mesmas. As colônias CoPS foram submetidas a testes complementares de
fermentação de manitol e resistência a furazolidona. Os testes bioquímicos e de
coloração de Gram foram realizados segundo metodologia descrita no
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods
(LANCETTE e BENNET, 2001) e o teste de resistência a furazolidona segundo
Rheinbaden e Hadlok (1981). Para os testes bioquímicos foram utilizados como
controle positivo a cepa S. aureus ATCC 25923 e como controle negativo E. coli
ATCC 25922 (coloração de Gram), Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 (teste
de catalase), S. epidermidis ATCC 12228 (teste de coagulase e fermentação de
manitol) e Micrococcus luteus ATCC 14452 (resistente a furazolidona).
4.4 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
4.4.1 Teste de disco difusão
As 31 cepas de CoPS foram semeadas em caldo BHI e incubados a 36
±1°C por 24 h. A cultura foi diluída em solução salina a 0,85% (p/v) até obter
turvação correspondente a solução padrão 0,5 da escala de MacFarland (1,5 x
108 UFC/ml). Um swab (zaragatoa) de algodão estéril foi mergulhado na cultura
padronizada e friccionado nas placas de Petri contendo o meio Ágar Muller-Hinton
(AMH; HIMEDIA) a fim de se obter um crescimento denso e confluente. Em
seguida foram depositados 12 discos de antimicrobianos (Sensibiodisc, CECOM,
Brasil): eritromicina (15 µg), clindamicina (2 µg), sulfametoxazole-trimetoprima (25
µg), rifampicina (5 µg), cloranfenicol (30 µg), linezolida (30 µg), ciprofloxacina (5
µg), penicilina G (10 U), oxacilina (1 µg), tetraciclina (30 µg), gentamicina (10 µg)
e cefoxitina (30 µg). Os discos foram colocados em pontos determinados da placa
de AMH, com auxílio de uma pinça, sendo pressionado levemente sobre o meio.
As placas foram incubadas a 36 ±1°C por 18 h. Após o período de incubação foi
realizada a leitura dos halos formados ao redor de cada antimicrobiano
comparando com os valores da CLSI (2012). S. aureus ATCC 25923 foi utilizado
como controle para o teste de disco difusão.
49
4.4.2 Teste de difusão de duplo disco (Teste D)
As cepas resistentes a eritromicina e sensíveis a clindamicina foram
submetidas ao teste D para identificação de cepas com resistência induzida a
clindamicina. A cultura bacteriana foi padronizada de acordo com a escala 0,5 de
MacFarland e semeada em AMH. Os discos de clindamicina (2 µg) e eritromicina
(15 µg) foram colocados em posições adjacentes de 20 mm. As placas foram
incubadas a 36 ±1°C por 18 a 24 h. O fenótipo MLSBi é detectado pelo
achatamento do halo de inibição em forma de D ao redor do disco de clindamicina
(CLSI, 2012) (Figura 1). S. aureus ATCC 25923 foi utilizado como controle de
qualidade para o teste D.
Figura 1 - Antibiograma ilustrando a resistência induzida a clindamicina (teste D
positivo). Fonte: Caio Roberto Salvino (SILVEIRA e d’AZEVEDO, 2011).
4.4.3 Concentração Mínima Inibitória (CMI) para vancomicina
A CMI foi realizada somente para as cepas MRSA, de acordo com as
normas da CLSI (2012). Foi utilizada a cepa S. aureus ATCC 29213 como
controle positivo, e apenas o caldo Mueller-Hinton como controle negativo.
A CMI foi considerada como a menor concentração de antimicrobiano que
inibiu completamente o crescimento do microrganismo.
50
4.5 Fatores genotípicos
4.5.1 Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada utilizando o kit QIAamp DNA miniKit
(Qiagen, Hiden, Germany), segundo protocolos do fabricante, acrescentando
tampão de lise (Tris-EDTA Triton X), lisozima (20 mg/ml) e lisostafina (10 mg/ml).
O DNA extraído foi armazenado a -20°C e posteriormente uma alíquota foi
utilizada para as reações de biologia molecular.
4.5.2 Pesquisa de genes por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Todas as cepas de CoPS foram submetidas a pesquisa dos genes 16S
rRNA (ZHANG et al., 2004), nuc (GANDRA et al., 2011), mecA (OLIVEIRA e
LENCASTRE, 2002) e genes das toxinas sea, seb, sec, sed e see, (BECKER et
al., 1998), e para as cepas mecA positivas, o gene luk-PV que identifica os genes
luk-S-PV e luk-F-PV (LINA et al., 1999). As reações ocorreram em um
termociclador (Biocycler). Foram utilizados 5 µl de DNA molde, tampão PCR 10X
(10 mM Tris-HCl, 25 mM KCl), 2,0 mM de MgCl2, 2,5 mM do mix de dNTP (A, G,
C e T), 1U de Taq polimerase e os iniciadores específicos, a reação foi
completada com água ultrapura perfazendo um volume final de 25 µl. Como
controle positivo foi utilizado a cepa S. aureus ATCC 25923. Como controle
negativo foi utilizado E. coli ATCC 25922, para a PCR 16S rRNA e S. epidermidis
ATCC 12228 para as PCR nuc e mecA. Foram utilizados os controles S. aureus
ATCC 13565, ATCC 14458, ATCC 19095, ATCC 23235 e ATCC 27664 como
controle positivo para os respectivos genes sea, seb, sec, sed e see. Para PVL,
como controle positivo foi utilizado uma cepa cedida pelo Laboratório de
Epidemiologia e Biologia Molecular da UFF (LEMB) e como controle negativo a
cepa HU25 (BEC). Os produtos das reações foram analisados por eletroforese em
gel de agarose a 1% (p/v) em TBE 1X (Tris 1M, ácido bórico 1M, EDTA Na2
0,01M, pH 8,5) a 90 V por 90 min. Após a corrida, o gel foi corado em solução de
brometo de etídeo 0,5% (p/v) e observado em um transluminador (Vilber Lourmat,
França) a imagem foi obtida através Photodoc-It Imaging System (UVP). Foi
utilizado marcador de peso de 100 pb DNA ladder (Invitrogen) como padrão de
DNA. Os iniciadores e as condições de amplificação estão descritos na Tabela 3.
49
TABELA 3 - Genes, iniciadores, condições de ciclagem, concentração dos iniciadores, tamanho pares de base, referências.
Genes Iniciadores (5’ 3’) Condições de ciclagema
iniciador
pb
Referência Db
A Ec
T T T t T t
sea CCT TTG GAA ACG GTT AAA ACG
TCT GAA CCT TCC CAT CAA AAA C
95° 60 55° 60 72° 120 0,5 pmol/µl 127 Becker et al,
1998
seb TCG CAT CAA ACT GAC AAA CG
GCA GGT ACT CTA TAA GTG CCT GC
95° 60 55° 60 72° 120 0,5 pmol/µl 477 Becker et al,
1998
sec CTC AAG AAC TAG ACA TAA AAG CTA GG
TCA AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC
95° 60 55° 60 72° 120 0,5 pmol/µl 271 Becker et al,
1998
sed CTA GTT TGG TAA TAT CTC CTT TAA ACG
TTA ATG CTA TAT CTT ATA GGG TAA ACA TC
95° 60 55° 60 72° 120 0,5 pmol/µl 319 Becker et al,
1998
See CAG TAC CTA TAG ATA AAG TTA AAA
CAA GC TAA CTT ACC GTG GAC CCT TC
95° 60 55° 60 72° 120 0,5 pmol/µl 178
Becker et al,
1998
16S
rRNA
AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA
CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC
94° 30 50° 30 72° 60 20 pmol/µl 756 Zhang et al,
2004
nuc ATGAAGTCAAATAAATCGCT
TTTGGTGAAAAATACTTCTC
95° 120 50° 120 72° 120 20 pmol/µl 458 Gandra et al.
2011
mecA TCCAGATTACAACTTCACCAGG
CCACTTCATATCTTGTAACG
94° 30 55° 30 72° 60 20 pmol/µl 162
Oliveira e
Lencastre2002
Spa AGACGATCCTTCGGTGAGC
GCTTTTGCAATGTCATTTACTG
95° 30 55° 30 72° 45 20 pmol/µl 556 Shopsin et al,
1999
Luk-PV ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA
GCATCAATSGTATTGGATAGCAAAGC
94° 60 55° 60 72° 60 20 pmol/µl 433 Lina et al, 1999
a: 30 ciclos.; b: uma etapa inicial de desnaturação por 5 min.; c: uma etapa final de extensão por 5 min.; e: concentração dos iniciadores;. D:
desnaturação; A: anelamento; E: elongação; T: temperatura em graus celsius; t: tempo em segundos; pb: tamanho do amplicon em pares de
base.
50
4.5.3 Determinação do tipo estrutural do SCCmec
A tipificação do cassete SCCmec foi realizada por PCR-multiplex como descrito
por Oliveira e Lencastre (2002), que inclui a utilização de oito loci (A – H) baseados
nas diferentes estruturas do SCCmec e um fragmento do gene mecA como controle
interno. Por serem os tipos de maior circulação entre as cepas MRSA no Brasil,
investigamos somente os cinco primeiros tipos SCCmec descritos, e suas variantes.
Lócus A específico para o SCCmec do tipo I; lócus B específico para SCCmec do
tipo II; lócus C encontrado nos SCCmec dos tipo II e III; lócus D presente nos
SCCmec dos tipos I, II e IV; lócus E específico para o SCCmec do tipo III; lócus F
específico para o tipo III; lócus G e lócus H utilizados para diferenciar os SCCmec
dos tipos I e III dos tipos IA e IIIA, respectivamente (Tabela 4).
A reação foi realizada em um volume final de 50 µl, contendo tampão PCR
10X, 50 mM MgCl2, 20 mM de cada dNTP(A, T, C e G), 400 nM dos iniciadores
CIF2 F2, CIF2 R2, MECI P2, MECI P3, RIF5 F10, RIF5 R13, pUB110 R1 e pT181
R1; 800 nM dos iniciadores IS431 P4, DCS F2, DCS R2, MECA P4 e MECA P7; 200
nM dos iniciadores KDP F1, KDP R1, RIF4 F3, RIF4 R9 (MWG Biotech AG,
Ebersberg, Alemanha), 1U de Taq DNA Polimerase e 3,0 µl do DNA molde. Foram
utilizados os controles positivos para os tipos I e V (cepas S. aureus cedidas pelo
LEMB), para o tipo II (cepa S. aureus US 100), para o tipo III (cepa S. aureus HU 25)
e para o tipo IV (cepas S. aureus WB45 e FPR), e como controle negativo da reação
foi utilizada água ultrapura MilliQ®. A amplificação ocorreu em um ciclo inicial de
94°C por 4 min seguidos de 30 ciclos de 94°C por 30 seg, 53°C por 30 seg e 72°C
por 1 min; e um ciclo de extensão final por 72°C por 4 min. Os amplicons foram
submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v) em TBE 0,5X durante 2 h a
100V. Foi utilizado como marcador de peso molecular um padrão de 100 pb
(Invitrogen). O DNA foi corado em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e,
posteriormente fotografado sob luz UV. A combinação das bandas amplificadas pela
PCR-multiplex definiu o tipo SCCmec, conforme Oliveira e Lencastre (2002).
51
TABELA 4 - Sequência dos iniciadores utilizados na PCR multiplex para
determinação dos tipos de SCCmec (OLIVEIRA e LENCASTRE, 2002).
Locus Iniciador Sequência de Oligonucleotídeos
(5’ – 3’)
pb Tipo
SCCmec
A CIF2F2
CIF2 R2
TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG
ATTTACCACAAGGACTACCAGC
495 I
B KDPF1
KDPR1
AATCATCTGCCATTGGTGATG
CCGAATGAAGTGAAAGAAAGGG
284 II
C MECIP2
MECIP3
ATCAAGACTTGCATTCAGGC
GCGGTTTCAATTCACTTGTC
209 II e III
D DCSF2
DCSR1
CATCCTATGATAGCTTGGTC
CTAAATCATAGCCATGACCG
342 I, II e IV
E RIF4R9 GTGATTGTTCGAGATATGTGG
CGCTTTATCTGTATCTATCGC
243 III
F
RIF5R13 GTCACAGTAATTCCATCAATGC 414 III
G IS431P4
pUB110R1
CAGGTCTCTTCAGATCTACG
GAGCCATAAACACCAATAGCC
381 IA
H IS431P4
pT181R1
CAGGTCTCTTCAGATCTACG
GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC
303 IIIA
mecA MECAP4M
ECAP7
TCCAGATTACAACTTCACCAGG
CCACTTCATATCTTGTAACG
162 mecA
pb: tamanho do amplicon em pares de base
52
4.6 Análise da diversidade genética
As cepas classificadas como MRSA foram avaliadas quanto a sua diversidade
genética através da PFGE e SpA.
4.6.1 Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
As cepas MRSA foram cultivadas em placas contendo TSA (Tryptcase Soy
Agar, Difco) por 18 h a 36 ±1C, sendo em seguida diluídas em tampão PIV (NaCl
1M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,6), a fim de obter turvação comparada com a solução
padrão 4,0 da escala MacFarland. A esta suspensão bacteriana foi adicionado
agarose de baixo ponto de fusão (LMP; Promega,USA) (1:1) na concentração de 2%
(p/v), a mistura foi distribuída em moldes para a montagem dos blocos, os quais
foram submetidos ao tratamento com solução de lise (NaCl 1 M, EDTA sódico 100
mM, Brij-58 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 0,2% [p/v], N-laurilsarcosinato de sódio
a 0,5% [p/v], Tris-HCl 6 mM, pH 7,6), contendo 20 mg/mL de lisozima e 10 mg/ml de
lisostafina, incubados por 18-24 h a 37C. Após incubação, a solução de lise foi
retirada e substituída pela solução ESP (EDTA 0,5 M, N-lauril sarcosinato de sódio a
1% [p/v], 1 mg/mL proteinase K, pH 8,0), seguida de incubação a 50C por 18-24 h,
sob agitação. Após esse período, nova solução ESP foi acrescentada, seguida de
incubação a 50C por 18-24 h. Após desproteinização, foram realizadas cinco
lavagens sucessivas durante 1 h cada com tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1
mM, pH 7,6) a 37C, a fim de retirar completamente a proteinase K. Para a digestão,
os blocos de agarose contendo o DNA bacteriano foram incubados com
endonuclease de restrição SmaI, por 18 h a 30C.
Os fragmentos de restrição obtidos foram separados em gel de agarose
(Molecular Biology Certified Agarose, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) a
1% (p/v), num sistema de eletroforese em gel de campo pulsado (CHEF DR-III,
BioRad) em tampão TBE 0,5X. A separação eletroforética foi realizada usando os
seguintes parâmetros: tempo de pulso inicial de 1 e final de 30 segundos por 25
horas a 11,3C em um gradiente de voltagem de 6V/cm e ângulo de 120°. Para
estimar o tamanho dos fragmentos gerados, foi utilizado um marcador de peso
molecular (Pulse Marker 50 a 1000 kb; Sigma). O gel foi corado com solução de
brometo de etídeo 0,5% (p/v) e fotografado sob a luz ultravioleta. Os perfis de
fragmentação foram submetidos à análise visual considerando-se os critérios
53
sugeridos por Tenover et al (1995). Para construir a matriz de dados, a presença de
uma banda representativa de um sítio de restrição foi codificada com “1” e a
ausência de banda com “0”. Os perfis de similaridade foram analisados utilizando o
coeficiente de correlação de Dice (DICE, 1945) conduzido pelas médias UPGMA
(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic) incluso no programa MEGA 6
(TAMURA et al., 2013).
4.6.2 Tipificação do gene da Proteína A por Sequenciamento
A amplificação da região SSR do gene spa foi realizada com adição de 1 µl de
uma diluição 1:200 de DNA genômico, obtido como descrito anteriormente para as
reações da PCR, a um volume final de reação de 25 µl contendo 0,5 µM de cada
iniciador, 2,5 U de Ampli Taq DNA Polymerase, 2 mM de MgCl2 , 350 µM de dNTP e
25 mM de KCL. Um controle negativo (água MiliQ estéril) e um controle positivo
(S. aureus da coleção de cultura do LEMB) foram incluídos. A reação foi realizada
no termociclador Nexus (Eppendorf, AG, Hamburg) com os parâmetros de ciclagem
conforme descrito na Tabela 3. Os amplicons foram ressuspendidos em 10 L
tampão TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH, 8,0) e enviados para sequenciamento
automatizado na Plataforma de Sequenciamento da Universidade da Califórnia em
Berkeley. O sequenciamento do DNA teve um volume total de 20 µl, e foi realizado
no sistema de PCR GeneAmp 9600 com as seguintes condições de reação: 13 µl do
mix contendo AmpliTaq FS Dye Terminator e os primers (PA1095F e PA1517R), 3 µl
do produto amplificado e 4 µl de água MilliQ®. O ciclo do sequenciamento foi de
96C por 10 segundos para a desnaturação, seguido a 65C para o
anelamento/extensão, e diminuídos a 1C por vez, até alcançar a temperatura de
55C, totalizando 66 ciclos. As sequências foram agrupadas no Software SeqMan
Pro (Lasergene-Dnastar, Winsconsin), dando origem a diferentes grupos de tipagem
por SpA.
54
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da qualidade das amostras de QMF através da contagem de
Staphylococcus coagulase positiva (CoPS)
A partir de 30 amostras de QMF analisadas, CoPS foi identificado em quatro
(13,3%) amostras (Q5, Q18, Q24 e Q28), sendo que em três (10%) amostras (Q5,
Q24 e Q28) o número de unidades formadoras de colônia (UFC) estava acima do
permitido pela legislação para o QMF, que é um queijo de muita alta umidade
(BRASIL, 2004), com valor máximo permitido de 5,0 x 10² UFC/g de CoPS (BRASIL,
2001) (Tabela 5).
5.1.2 Cepas Staphylococcus aureus
Foram isoladas 250 colônias suspeitas de pertencerem ao gênero
Staphylococcus spp, a partir das 30 amostras de QMF investigadas. Trinta e uma
(12,4%) colônias foram identificadas como CoPS e 219 (87,6%) como
Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Os 31 CoPS, isolados a partir das
amostras de QMF Q5, Q18, Q24 e Q28, foram confirmados como S. aureus por
apresentarem o gene 16S rRNA, específico para o gênero Staphylococcus spp e o
gene nuc específico para a espécie S. aureus (Tabela 6).
55
TABELA 5 - Contagem de unidades formadoras de colônia de estafilococos
coagulase positiva em 30 amostras de queijo Minas frescal.
Amostras de QMF Número de UFC
Q1 ≤ 10 Q2 ≤ 10 Q3 ≤ 10 Q4 ≤ 10 Q5 2,2 x 10⁵ Q6 ≤ 10 Q7 ≤ 10 Q8 ≤ 10 Q9 ≤ 10
Q10 ≤ 10 Q11 ≤ 10 Q12 ≤ 10 Q13 ≤ 10 Q14 ≤ 10 Q15 ≤ 10 Q16 ≤ 10 Q17 ≤ 10 Q18 4,4 x 10² Q19 ≤ 10 Q20 ≤ 10 Q21 ≤ 10 Q22 ≤ 10 Q23 ≤ 10 Q24 2,1 x 10⁴ Q25 ≤ 10 Q26 ≤ 10 Q27 ≤ 10 Q28 5,5 x 10³ Q29 ≤ 10 Q30 ≤ 10
QMF: Queijo Minas Frescal; UFC: Unidade Formadora de Colônia
56
TABELA 6 - Características fenotípicas e genotípicas das cepas de S. aureus
isoladas em queijo Minas frescal.
Cepas genes Resistência
antimicrobiana
Antibiotipo Teste D
16S nuc se mecA
Q05/41 + + - - pen,eri B _
Q05/42 + + - - pen A _
Q05/43 + + - - pen A _
Q05/44 + + - - pen A _
Q05/45 + + - - pen,eri B _
Q05/46 + + - - pen,eri B _
Q05/48 + + - - pen,eri B _
Q05/49 + + - - pen A _
Q05/50 + + - - pen A _
Q18/176 + + - - pen,eri B _
Q18/180 + + - - pen,eri B _
Q24/231 + + - - pen A _
Q24/232 + + - - pen A _
Q24/233 + + - - pen A _
Q24/234 + + - - pen,eri B _
Q24/235 + + - - pen A _
Q24/236 + + - - pen A _
Q24/237 + + - - pen,eri, cip, rif, C _
Q24/238 + + - - pen,eri, cip,clo, E _
Q24/239 + + - - pen,eri, cip D _
Q24/240 + + - - pen,eri, cip, rif, C _
Q28/271 + + - + pen, eri, cip, clin, oxa, cfo F RC
Q28/272 + + - - pen,eri, cip D +
Q28/273 + + - + pen, eri, cip, clin, oxa, cfo F RC
Q28/274 + + - - pen,eri, cip D +
Q28/275 + + - + pen, eri, cip, tet G +
Q28/276 + + + + pen, eri, cip, clin, oxa, cfo F RC
Q28/277 + + - - pen,eri B _
Q28/278 + + - + pen,eri, cip D +
Q28/279 + + - + pen,eri B +
Q28/280 + + + + pen, eri, cip, clin, oxa, cfo F RC
eri: eritromicina; clin: clindamicina; cip:ciprofloxacina; pen: penicilina G; oxa: oxacilina; gen: gentamicina; cfo: cefoxitina; tet: tetraciclina; rif: rifampicina; Teste D (difusão duplo disco); RC: resistência constitutiva à clindamicina; genes: 16S (específico do gênero Staphylococcus spp), nuc (termonuclease, espécie-específico S. aureus), mecA (resistência a meticilina) e se (enterotoxina estafilocócica).
57
5.1.3 Resistência antimicrobiana
Através do teste de disco difusão, as 31 cepas de S. aureus isoladas
apresentaram resistência a penicilina, 21 (67,74%) a eritromicina, 12 (38,71 %) a
ciprofloxacina, 4 (12,9%) a clindamicina, 4 (12,9%) a oxacilina e cefoxitina, 2 (6,45%)
a rifampicina, 1 (3,23%) ao cloranfenicol e 1 (3,23%) a tetraciclina. Todos S. aureus
isolados foram sensíveis a sulfametoxazole-trimetoprima, a gentamicina e a
linezolida (Figura 2). Não foi observada resistência intermediária para nenhum dos
antimicrobianos testados.
FIGURA 2 – Perfil de resistência a antimicrobianos em cepas de S. aureus.
Um total de 27 (87,1%) cepas foi sensível a oxacilina e cefoxitina, sendo
classificadas como S. aureus sensíveis à meticilina (MSSA). As quatro cepas
resistentes a oxacilina e cefoxitina, foram classificadas como S. aureus resistentes a
meticilina (MRSA): Q28/271, 273, 276 e 280. As cepas MRSA foram definidas como
multirresistentes, por apresentarem resistência a mais de cinco classes de
antimicrobianos, incluindo os β lactâmicos (Tabela 6).
Das 17 cepas resistentes a eritromicina e sensíveis a clindamicina, cinco
(29,4%) apresentaram resistência induzida a clindamicina (MLSBi) (Tabela 6),
observado através do Teste D (Figura 1).
58
De acordo com o perfil de resistência a antimicrobianos, as cepas de
S. aureus foram classificadas em sete diferentes perfis (A a G), denominados de
antibiotipos (Tabela 5). Entre os nove isolados da amostra Q5 foram identificados
dois perfis diferentes, A (resistência a penicilina) e B (resistência a penicilina e
eritromicina). Na amostra Q18, os dois isolados apresentaram antibiotipo B. As dez
cepas isoladas a partir da amostra Q24 foram distribuídas entre cinco diferentes
antibiotipos A, B, C (resistência a penicilina, eritromicina, ciprofloxacina e
rifampicina), D (resistência a penicilina, eritromicina e ciprofloxacina) e E (resistência
a penicilina, eritromicina, ciprofloxacina e cloranfenicol). Finalmente na amostra Q28,
os dez isolados foram distribuídos em quatro antibiotipos distintos, B, D, F
(resistência a penicilina, eritromicina, ciprofloxacina, clindamicina, oxacilina e
cefoxitina) e G (resistência a penicilina, eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina).
Por ser um antimicrobiano de escolha no tratamento das infecções por MRSA,
a vancomicina foi testada somente para estas cepas. O resultado da CMI para
vancomicina foi igual a 2 µl/ml.
5.1.4 Pesquisa do gene mecA por PCR
Sete (22,6%) das 31 cepas de S. aureus estudadas, carreavam o gene mecA,
embora apenas quatro (57,1%) tenham sido classificadas fenotipicamente como
MRSA no teste de disco difusão utilizando oxacilina e cefoxitina. Todas as cepas
mecA positivas foram isoladas de uma única amostra de queijo (Q28) (Tabela 6).
5.1.5 Pesquisa dos genes que codificam para PVL (Panton Valentine
Leukocidin)
A pesquisa dos genes que codificam para citotoxina PVL foi realizada por
PCR nas cepas mecA positivas. Não foi observada a presença do gene luk-PV em
nenhuma das cepas.
59
5.1.6 Pesquisa dos genes das enterotoxinas clássicas por PCR
Apenas duas (6,5%) cepas de S. aureus carreavam genes que codificam para
as SE clássicas. As duas cepas enterotoxigênicas são MRSA, uma cepa (Q28/276)
carreava os genes seb e sec e a outra cepa (Q28/280) carreava os genes sea e seb
(Tabela 6).
5.1.7 Tipificação do SCCmec
As cepas MRSA analisadas não apresentaram nenhum dos cinco tipos
SCCmec investigados através da reação de PCR multiplex.
5.1.8 Diversidade genética
Somente as cepas classificadas como MRSA através do teste de disco
difusão foram investigadas quanto à diversidade genética.
Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
A análise genética das quatro cepas MRSA por PFGE após digestão pela
endonuclease SmaI permitiu a obtenção de três diferentes perfis eletroforéticos
compostos por 13 a 16 bandas polimórficas, agrupado em três grupos clonais (A, B
e C). O clone A inclui duas cepas idênticas (271 e 273), os clones B e C incluem
uma cepa cada (Tabela 7). Segundo os critérios de Tenover et al (1995) as duas
cepas idênticas MRSA isoladas pertencem ao mesmo clone (A) e as outras cepas
MRSA não são relacionadas, com percentual de similaridade entre 79 e 83%,
pertencentes a clones diferentes (B e C) (Figura 3).
60
271
273
276
280
0.000.050.100.150.20
FIGURA 3 - Dendrograma construído através das médias UPGMA utilizando o
coeficiente de similaridade de Dice ilustrando a diversidade genética das cepas
MRSA, a partir do PFGE.
5.1.9 Tipificação por Sequenciamento do gene da Proteína A (SpA typing)
Entre as quatro cepas MRSA analisadas, identificamos três regiões spa SSR,
as quais foram atribuídas códigos com letras como sugerido por Frenay et al (1996).
As regiões repetidas spa SSR identificadas não apresentam similaridade com
nenhuma região registrada no banco de dados SPA Ridom. Provisoriamente,
enquanto aguardamos o registro das novas regiões no banco de dados, codificamos
as diferentes regiões spa SSR em tipos spa representados por números romanos.
O código das letras é a identificação dos alelos sequenciados atribuído a cada cepa
MRSA de acordo com a classificação do banco de dados SPA Ridom
(www.spaserver.ridom.de) assim como os tipos de SpA atribuídos neste trabalho,
estão descritos abaixo na Tabela 7.
TABELA 7 - Características das cepas com fenótipo MRSA isoladas do QMF (Q28).
Cepas van genes Antibiotipo PFGE SpA Código de letras
SpA mecA luk-PV se
Q28/271 S + - - F A I J-G-F-M-G-M
Q28/273 S + - - F A I J-G-F-M-G-M
Q28/276 S + - seb/sec F B II J-F-K-B-P-E
Q28/280 S + - sea/seb F C III K-B-M-D-M-G-M-K
van: vancomicina; S: sensibilidade a vancomicina através da concentração mínima inibitória;
genes:mecA (resistência a meticilina), luk-PV (citotoxina PVL) e se (enterotoxina estafilocócica);
PFGE: Eletroforese em gel de campo pulsado; SpA: Proteina A estafilocócica.
61
6. DISCUSSÃO
S. aureus é um patógeno ubíquo que está associado a várias doenças, tanto
em animais quanto em humanos, e aproximadamente 30% dos indivíduos não
hospitalizados são portadores assintomáticos deste patógeno (De LEO, 2010). A
pele e a mucosa do homem atuam como reservatórios desses microrganismos,
resultando em importante fonte de veiculação dos mesmos para os alimentos
(RAPINI et al., 2004). Das 30 amostras de QMF analisadas neste trabalho, CoPS foi
encontrado em quatro (13,3%) amostras, sendo que três (10%) apresentaram
contagem de CoPS acima do valor estabelecido para o QMF, que é de 5 x 10²
UFC/g (BRASIL, 2001). Apesar de poucas amostras de QMF impróprias para o
consumo, em relação ao indicador estafilococos coagulase-positivo, podemos dizer
que o QMF pode oferecer risco à saúde do consumidor, ressaltando a importância
do cuidado higiênico-sanitário com a manipulação destes alimentos.
Outros autores encontraram números maiores de amostras de QMF com
valores de CoPS superiores ao permitido pela legislação brasileira. Filho e Filho
(2000) analisaram 80 amostras de QMF produzido artesanalmente e comercializado
na cidade de Poços de Caldas, MG, os resultados obtidos evidenciaram a presença
de S. aureus em 40 amostras (50%), cujas contagens revelaram valores médios em
torno de 105 UFC/g. Freitas (2005) também analisou 30 amostras de QMF, sendo
que 40%, apresentaram contagem para CoPS acima de 5 x 10² UFC/g, e 10%
apresentaram valores acima de 5 x 105 UFC/g. Peresi et al (2001) analisaram 30
amostras de QMF artesanal e 30 amostras de QMF industrial comercializados em
São José do Rio Preto (SP) e encontraram valores acima do permitido pela
legislação brasileira, sendo 76,7% nas amostras artesanais e 23,3% nas industriais.
Brant et al (2007), avaliaram a qualidade microbiológica de 20 amostras de queijo
Minas Frescal da região de Serro/MG e encontraram níveis de contaminação por
estafilococos acima dos padrões legais em 82,5% das amostras, com contagens
superiores a 10³ UFC/g. Ferreira et al (2010) avaliaram 20 amostras de QMF,
comercializadas em Uberlândia (MG) e encontraram 18 amostras com contagem de
CoPS entre 10³ e 105 UFC/g. Komatsu et al (2010) analisaram 50 amostras de QMF
no município de Uberlândia (MG), os resultados obtidos indicaram que 88% das
amostras estavam fora do padrão estabelecido para CoPS. Senger e Bizani (2011),
em Canoas/RS, analisaram 30 amostras de QMF artesanal e 30 amostras de QMF
industrial, sendo que 23,3% dos queijos industriais e 40% dos queijos artesanais
62
estavam fora dos padrões vigentes. Pinto et al (2011), no Paraná, avaliaram a
qualidade microbiológica de 40 amostras de QMF (artesanal e inspecionadas pelo
Serviço de Inspeção Estadual e Federal), 100% das amostras artesanais e 25% das
amaostras inspecionadas estavam fora dos limites legais para CoPS.
Valores iguais ou inferiores ao relatado neste estudo já foram descritos.
Salotti et al (2006) avaliaram 60 amostras e QMF, sendo 30 artesanais e 30
industriais adquiridas no comércio do município de Jaboticabal (SP), somente 10%
das amostras industriais, apresentaram-se em desacordo com o estabelecido pela
legislação. Quintana e Carneiro (2007) avaliaram 60 amostras de QMF coletadas e
produzidas em um laticínio de Morrinhos (GO). Com relação às análises de
Staphylococcus coagulase positivo, apenas uma amostra (1,7%) estava acima do
valor permitido pela legislação. Mirlei et al (2010) não encontraram CoPS entre as
amostras de QMF coletadas de supermercados em Santa Catarina.
A contaminação de queijo, produzido com leite pasteurizado, por S. aureus
surge em diferentes etapas do processamento. Lamaita et al (2005), pesquisaram 80
amostras de leite cru coletadas em propriedades produtoras de leite em Belo
Horizonte, no período de outubro a dezembro de 2002, e observaram que 100% das
amostras do leite refrigerado apresentavam contagens que variaram de 1,0 × 105 a
2,5 × 107 UFC/g de Staphylococcus spp, demonstrando assim que este
microrganismo pode, facilmente, ser encontrado no leite cru. No entanto, a
pasteurização elimina este microrganismo (ICMSF, 1996). A presença de CoPS ou
E. coli em produtos lácteos pasteurizados pode indicar falha na pasteurização ou
recontaminação após a pasteurização, devido à falta de higiene (O'BRIEN et al.,
2009). S. aureus é muito vulnerável a destruição por aquecimento e a agentes
sanitizantes, portanto, sua presença em alimentos processados é, geralmente,
indicativo de má higienização (CRAGO et al., 2012). Considerando que a
pasteurização do leite elimina as células viáveis de S. aureus, e pelas amostras de
QMF analisadas neste trabalho terem sido produzidas a partir de leite pasteurizado,
podemos sugerir que a contaminação pode ter ocorrido por falha na pasteurização
do leite, pelos equipamentos mal higienizados, ou principalmente, pelo manipulador.
O homem tem sido a principal fonte de contaminação de queijos por S. aureus
(CALLON et al., 2008), sendo o QMF um alimento bastante manipulado, a
contaminação microbiana é facilitada.
63
A principal importância da presença de Staphylococcus spp em alimentos é
sua capacidade de produzir enterotoxinas, levando a um quadro de intoxicação
alimentar, e por esse motivo sua pesquisa em alimentos é importante no que diz
respeito à avaliação de riscos para a saúde (AYDIN et al., 2011). A doença alimentar
transmitida por S. aureus está associada à produção de enterotoxinas e exige uma
contagem bacteriana acima de 105–106 UFC/g (ERTAS et al., 2010). Santana et al
(2010), realizaram revisão bibliográfica sobre estafilococos em alimentos e
descreveram que as SE foram identificadas a partir de amostras de alimentos que
apresentaram contagens de S. aureus acima de 105 UFC/ml. Uma amostra de QMF
analisada neste estudo apresentou contagem de CoPS acima de 105 UFC/g,
contudo as cepas isoladas, a partir desta amostra, não abrigavam os genes que
codificam para as SE clássicas. Diferente de grande parte dos trabalhos
encontrados na literatura, no presente estudo, S. aureus enterotoxigênico foi isolado
apenas de uma amostra de QMF (3%) com contagem inferior a 105 UFC/g. O
potencial para causar intoxicação estafilocócica não pode ser assegurado somente
por elevados números de CoPS ou S. aureus no alimento. Uma vez que a simples
determinação populacional dos mesmos para se estabelecer a presença ou não de
enterotoxinas é de valor limitado, devido a toxina ser termoestável e uma vez
produzida persistir em alimentos aquecidos ou fermentados, ou até mesmo em
queijos elaborados a partir de leite pasteurizado; enquanto as células viáveis
declinam em número, atingindo níveis não detectáveis (FURLANETTO et al., 1987).
Além disso, o QMF é um alimento pronto para consumo e não precisa passar por
mais nenhum tratamento antes de ser consumido. Devido a este fato, se não for
armazenado nas condições adequadas, a bactéria poderá aumentar sua população.
Estima-se que 95% dos surtos de intoxicação estafilocócica ocorrem devido à
produção de SE clássicas (OMOE et al., 2002; CHAPAVAL et al., 2006). Com base
nos dados da literatura, o presente trabalho se deteve somente na pesquisa de SE
clássicas entre as cepas de S. aureus isoladas, observando a presença
concomitante de sea/seb em uma cepa e seb/sec em outra cepa. O percentual de
cepas de S. aureus enterotoxigênicos (6,5%) isolados neste trabalho foi pequeno.
Resultados semelhantes foram descritos por Silva et al (2005), os quais encontraram
baixa frequência de cepas de S. aureus enterotoxigênico em leite de vacas com
mastite; das 64 cepas isoladas, somente quatro (6%) apresentaram os genes sea e
64
seb e apenas duas (3%) continham o gene sec. Sá et al (2004), avaliaram 209
amostras de leite oriundas de vacas com mastite subclínica por S. aureus e somente
nove amostras (4,39%) foram produtoras de SE, sendo que uma (0,49%) dentre elas
foi produtora de SED, três (1,46%) de SEC, e três (1,46%) de SEB. Em uma
amostra(0,49%), detectou-se concomitantemente SEA e SEB e em outra SEB e
SEC.
A principal importância da presença de Staphylococcus spp em alimentos é a
sua capacidade de produzir enterotoxinas, levando a um quadro de intoxicação
alimentar, e por esse motivo sua pesquisa em alimentos é importante no que diz
respeito à avaliação de riscos para a saúde (AYDIN et al., 2011). O desenvolvimento
de métodos rápidos e sensíveis de detecção de patógenos de origem alimentar tem
recebido muito incentivo nos últimos anos, devido a um aumento da consciência
sobre os perigos para a saúde, associados a contaminação microbiana nos
alimentos (HASSAN et al., 2008). A PCR tem sido a metodologia de escolha para
pesquisa dos diferentes genes se em cepas de S. aureus isoladas de alimento.
S. aureus pode produzir uma ou mais SE simultaneamente (LETERTRE et al., 2003;
SILVA et al., 2005; OMOE et al., 2005; VERAS et al., 2008). Entre as SE clássicas,
SEA é responsável por mais de 75% dos surtos, seguida, em ordem decrescente de
frequência, por SED, SEC e SEB (VERNOZY-ROZAND et al., 2004). Borges et al
(2008), na região metropolitana de Fortaleza (Ceará), constataram a presença dos
genes sea e sec em amostras de queijo de coalho. Silva et al (2005) encontraram
baixa frequência de cepas de S. aureus enterotoxigênicas em leite de vacas com
mastite; das 64 amostras isoladas, quatro (6%) apresentaram os genes sea e seb e
apenas duas (3%) continham o gene sec. Veras et al (2008) estudando 30 cepas de
CoPS e CoNS, isoladas de produtos lácteos envolvidos em surtos de enfermidades
alimentares ocorridos no estado de Minas Gerais em um período de quatro anos,
mostraram que 38% das cepas carreavam somente o gene sea, 29% somente o
gene seb e 24% sea e seb. Em outros países, alguns autores encontraram S. aureus
enterotoxigênicos a partir amostras de queijos (Bianchi et al., 2013, Rosengren et al.,
2010, Pereira et al., 2009, Little et al., 2008).
Can e Çelik (2012) investigaram a presença de S. aureus enterotoxigênicos
em queijos na Turquia. Um total de 200 amostras de queijos foi isolado, sendo três
65
cepas de S. aureus enterotoxigênicos, duas SEC e uma SEC/SED
concomitantemente.
A simples presença de genes enterotoxigênicos não indica, necessariamente,
a capacidade dos microrganismos produzirem toxina biologicamente ativa suficiente
para induzir manifestações clínicas (MCLAUCHLIN et al., 2000). No entanto, o fato
de uma cepa conter um ou mais genes enterotoxigênicos deve ser significante, pois
pode oferecer risco à saúde pública, caso encontre condições favoráveis à produção
de enterotoxinas. É fundamental entender quais os fatores que levam a produção de
enterotoxinas no alimento e com isso ser capaz de avaliar a sua segurança a fim de
evitar a intoxicação alimentar estafilocócica.
Embora a frequência, neste estudo, de cepas carreadoras de genes se tenha
sido baixa, o QMF é um alimento pronto para o consumo, o que levanta
preocupação especial, pois potencializa a probabilidade de ser veículo de
intoxicação alimentar.
Estudos têm demonstrado a relação entre a fonte de contaminação e o tipo de
SE produzida por S. aureus. SEA e SEB são associadas a contaminações de origem
humana, isto é, contaminações cruzadas durante e após processamento (FUEYO et
al., 2005), enquanto SEC e SED, estão relacionadas com contaminações
proveniente de animais bovinos e suínos respectivamente (NÁJERA-SANCHEZ et
al., 2003; JORGENSEN et al., 2005). Baseado nestes dados, podemos sugerir que
as cepas isoladas neste estudo podem ser provenientes de humanos devido aos
genes sea e seb encontrados. Embora tenhamos encontrado o gene sec,
relacionado a bovino, este estava presente em uma cepa também carreadora de
seb. Esta hipótese pode ser reforçada, devido às amostras de QMF analisadas
terem sido produzidas a partir de leite pasteurizado, o que eliminaria os S. aureus
provenientes do animal.
Uma importante característica de S. aureus é a sua versatilidade em adquirir
resistência a diferentes antimicrobianos (BARTON, 2000; YUCEL et al., 2011).
Bactérias isoladas de alimentos de origem animal frequentemente carreiam
resistência a uma variedade de agentes antimicrobianos usados em tratamentos de
doenças humanas. Bactérias multirresistentes são um importante problema de
saúde pública, sendo o alimento um possível transmissor destes microrganismos
66
para os seres humanos (ANGULO et al., 2004; GHOSH e LaPARA, 2007;
HAMMERUM e HEUER, 2009), especialmente MRSA (PEREIRA et al., 2009).
O conhecimento dos padrões de resistência antimicrobiana de S. aureus é
necessário e fundamental para o controle do uso de antimicrobianos no animal e no
homem, favorecendo assim o desenvolvimento de tratamentos que sejam efetivos. A
tipificação de cepas por antimicrobianos tem sido utilizada principalmente por não
ser um método caro, fácil de realizar e ainda contribuir com informações sobre a
resistência antimicrobiabna (ACCO et al., 2003; KLUYTMANS et al., 1997).
Podemos observar diferentes antibiotipos a partir de uma mesma amostra de queijo
o que indica contamição por diferentes cepas de S. aureus. No entanto, o poder
discriminatório da antibiotipagem é baixo (AARESTRUP et al., 1995; TONDO et al.,
2000), sendo recomendado outros métodos de tipificação mais sensíveis e
discriminatórios.
Das 31 cepas analisadas, 12,9% foram identificadas como MRSA através do
teste fenotípico de resistência a oxacilina e cefoxitina. As cepas MRSA foram
isoladas a partir de uma única amostra (3,3%) de QMF. Resultados semelhantes
foram observados na literatura, a partir de alimentos de origem animal. Normanno et
al (2007), na Itália, observaram que 3,75% das amostras de leite bovino e queijo
estavam contaminados com MRSA. Pu et al (2009) observaram que 5% das 120
amostras de carne do varejo, adquiridas em supermercados de uma cidade nos
EUA, estavam contaminadas com MRSA. Na Turquia, Can e Çelik (2012) isolaram
12 cepas de S. aureus a partir de queijo, duas carreavam o gene mecA, 10 cepas
apresentavam resistência a um ou mais antibióticos, sendo todas sensíveis a
vancomicina e gentamicina. Zinke et al (2012), na Alemanha, não observaram
nenhum MRSA entre as 72 amostras de queijos analisadas. No entanto,
Shanehbandi et al (2014) encontraram números superiores, ao analisarem 100
amostras de queijo de cabra, no noroeste do Irã, onde observaram que 21% das
amostras estavam contaminadas com MRSA.
No Brasil, poucos estudos investigaram MRSA a partir de alimentos. Peresi et
al (2006) observaram que 16% das cepas de S. aureus isoladas de diferentes tipos
de alimentos apresentaram resistência a oxacilina. André et al (2008), encontraram
resistência à oxacilina em quatro isolados (5,5%) de S. aureus, sendo um a partir de
QMF e três a partir de manipuladores de alimentos. Pesavento et al (2007),
67
estudando carne crua, e Silveira-Filho et al (2014), estudando leite e produtos
lácteos, não encontraram nenhuma cepa MRSA.
Vários métodos fenotípicos para a detecção de resistência à oxacilina em
isolados de S. aureus foram desenvolvidos, incluindo o teste de ágar screen para
oxacilina (NaCl 4% [p/v], oxacilina 6 µg/ml) e o teste de difusão em ágar com disco
de cefoxitina (FELTEN et al., 2002). Nos testes utilizando o disco de oxacilina foi
observada uma “névoa” em torno do halo do disco deste antimicrobiano. No entanto,
a resistência ou sensibilidade a meticilina foi facilmente determinada através do
disco de cefoxitina. Para S. aureus, o CLSI (2012) preconiza a utilização de disco de
cefoxitina (30 μg) e oxacilina (1μg) para a detecção de resistência à oxacilina
mediada pelo gene mecA. De acordo com o resultado da cefoxitina, é reportado o
resultado da oxacilina como suscetível ou resistente. O uso de cefoxitina é
preferencial ao uso de oxacilina, pois a cefoxitina está mais relacionada à presença
do gene mecA, predizendo a presença deste gene (CLSI, 2012). Como estes
métodos muitas vezes não são suficientemente sensíveis ou específicos, a detecção
por PCR do gene mecA é aplicada e considerada padrão ouro para identificar cepas
MRSA (MIYAZAKI, 2006).
Mathews et al (2010) realizaram um estudo para avaliar e comparar os testes
fenotípicos para detecção de MRSA, destacando o método de disco difusão com
cefoxitina como melhor preditor para detecção de resistência à oxacilina. Ao utilizar
os discos de oxacilina, estes autores obtiveram mais falsos positivos, pois todos
isolados que foram resistentes a oxacilina e sensíveis a cefoxitina foram negativos
para o gene mecA e com CMI entre 4-8 µg/ml. Além disso, o método utilizando o
disco de cefoxitina produz, para leitura, uma zona de inibição facilmente
interpretada. Estudos demonstram acurácias variadas na qualificação de cepas
MRSA pelo método de disco difusão utilizando cefoxitina e oxacilina e este evento é
atribuído à expressão heterogênea desta resistência (MOHANASOUNDARAM e
LALITHA, 2008).
Neste trabalho, as quatro cepas MRSA isoladas (12,9%) apresentaram o gene
mecA. Contudo, observamos três cepas sensíveis a oxacilina e a cefoxitina, no teste
de disco difusão, apresentando o gene mecA. Resultado semelhante foi observado
por Rizek et al (2011), que estudando diferentes amostras de alimentos prontos para
o consumo, isolaram S. aureus carreando o gene mecA a partir de cinco amostras,
68
sendo uma QMF, no entanto, estas cepas não apresentaram resistência a oxacilina
e cefoxitina no teste de disco difusão. A presença do gene mecA em cepas
sensíveis a oxacilina tem sido descrito (KAMPF et al., 2003; GONZALO et al., 2010).
Moussallem et al (2007) encontraram três cepas mecA positivas, porém oxacilina
sensível em uma UTI neonatal, mas esses autores não investigaram resistência a
cefoxitina. Pereira et al (2009) demonstraram que 38% das cepas de S. aureus
isoladas de vários alimentos, dentre eles o queijo, foram resistentes a meticilina
(oxacilina) e somente 0,68% apresentaram o gene mecA, porém, nesse estudo não
foi usado o disco de cefoxitina. A presença do gene mecA em cepas sensíveis a
cefoxitina nos leva a questionar a integridade do gene. Trabalhos futuros deverão
ser realizados a fim de investigar a expressão gênica.
Podemos considerar que 22,6% de cepas MRSA é um valor considerável e
requer atenção especial do serviço de saúde pública para QMF. Embora S. aureus
seja reconhecido como agente de intoxicação alimentar, não deve ser descartado o
fato desta bactéria atingir o sistema circulatório de indivíduos imunocomprometidos
levando a infecções neste órgão (YUCEL et al., 2011). Kluytmans et al (1995)
descreveram grave surto de infecção estafilocócica veiculado por alimento
contaminado MRSA, tendo manipulador como fonte de contaminação do alimento.
Por razões práticas, ainda é util discriminar HA-MRSA, CA-MRSA e LA-MRSA
por suas origens epidemiológicas (CUNY et al., 2013). MRSA causando infecções
graves em seres humanos era restrito a hospitais, no entanto, estão sendo cada vez
mais relatados em pacientes imunocompetentes da comunidade (SILVA-
CARVALHO et al., 2009). Os termos HA-MRSA e CA-MRSA são utilizados para
destacarem as diferenças genotípica, epidemiológicas e características clínicas de
certos isolados MRSA (DAVID e DAUM, 2010). Por serem isolados de alimento de
origem animal, se considerarmos possível falha na pasteurização, podemos sugerir
que as cepas MRSA isoladas são LA-MRSA. No entanto, CA-MRSA tem sido isolado
de infecções de pele de individuos sadios (DEUREMBERG et al., 2008), e com base
no que já foi discutido, podemos propor que a origem das cepas MRSA isoladas
neste trabalho, seja por contaminação do QMF pelo manipulador, o que nos faz
supor serem CA-MRSA. No entanto tanto cepas HA-MRSA quanto CA-MRSA
circulam na comunidade (DAVID e DAUM, 2010). Cepas CA-MRSA tem várias
características que as tornam distinguíveis das cepas hospitalares (HA-MRSA). Em
69
contraste com infecções por HA-MRSA, para os quais existe um fator ou condição
de risco predisponentes, as infecções CA-MRSA podem ocorrer em indivíduos
saudáveis (HEROLD et al., 1998), sugerindo que as cepas CA-MRSA têm virulência
aumentada em comparação com as cepas HA-MRSA (DeLEO et al., 2010). As
cepas CA-MRSA são sensíveis a vários antimicrobianos não β-lactâmicos,
enquanto os HA-MRSA são tipicamente resistentes a múltiplos antibióticos. As
cepas CA-MRSA no setor comunitário possuem, até em 90% dos isolados, a toxina
PVL (LINA et al., 1999). CA-MRSA carrega preferencialmente SCCmec do tipo IV, V
ou eventualmente VII (IWG-SCCmec, 2011). Esse tipo de cassete cromossômico é
menor que os outros tipos e não possui genes acoplados que codificam resistência a
outros antimicrobianos não beta-lactâmicos, assim, de forma geral, o CA-MRSA é
susceptível a maioria dos antimicrobianos não β-lactâmicos (NAIMI et al., 2003).
Kadlec et al (2009, 2012) estudando cepas LA-MRSA, verificaram que em torno de
70% das cepas avaliadas foram resistentes a três ou mais classes de
antimicrobianos, todas as cepas foram PVL negativo e somente quatro cepas
carreavam algum gene que codifica para enterotoxina. LA-MRSA pertence a um
complexo clonal (CC) 398 que incluem os clones ST398, ST752 ou ST753 (van LOO
et al., 2007). As cepas MRSA isoladas neste trabalho não apresentaram os tipos
SCCmec IV e nem V (tipo VII não avaliado), não apresentaram os genes que
codificam para a citotoxina PVL e apresentaram multirresistência antimicrobiana.
Alguns estudos na literatura têm descrito multirresistência entre cepas CA-MRSA
(SILVA-CARVALHO et al., 2009), entretanto, esses relatos não são muito comuns
(AVDIC e COSGROVE, 2008; GELATTI et al., 2013), especialmente a partir de
cepas isoladas de alimentos (NORMANNO et al., 2007). Embora a citotoxina PVL
seja considerada um marcador molecular associado com CA-MRSA (VANDENESCH
et al., 2003), dados indicam que PVL não está sempre presente entre as cepas CA-
MRSA (ZHANG et al., 2008), principalmente no Brasil (TEIXEIRA et al, 1995;
CARVALHO et al., 2012). Não concluímos as análises de MLST, mas os resultados
obtidos até o momento, principalmente a tipificação SpA, nos mostram que as cepas
MRSA isoladas pertencem a linhagens clonais ainda não descritas nos bancos de
dados internacionais. Com isso, não podem ser classificadas dentro dos tipos
clonais já descritos para LA-MRSA. Diante de todas as considerações expostas, as
70
cepas MRSA isoladas de QMF neste trabalho não podem ser classificadas como
CA-MRSA, nem LA-MRSA e nem tampouco HA-MRSA.
De qualquer maneira, independente de sua classificação hospitalar,
comunitária ou pecuária, o tratamento de infecções por MRSA é mais caro e mais
difícil do que infecções por MSSA (PURCELL et al., 2006). Com isso, o controle
efetivo na produção de QMF deve ser realizado, a fim de impedir a contaminação
dos mesmos e assim a disseminação destas cepas através do alimento.
Microrganismos isolados de alimentos têm demonstrado nas últimas décadas
um considerável aumento de resistência para a maioria dos antibióticos e esta
resistência pode ocorrer através de resíduos de antimicrobianos encontrados nos
alimentos (PESAVENTO et al., 2007; PEREIRA et al., 2009).
Todas as cepas S. aureus isoladas neste trabalho apresentaram resistência à
penicilina, resultado esperado e descrito por vários autores a partir de cepas de
Staphylococcus spp. isoladas de várias fontes, incluindo alimentos. Costa (2012)
observou elevado percentual de resistência à penicilina a partir de 95 cepas de
Staphylococcus spp. isoladas de QMF. Rapini et al (2004), ao analisarem 45 cepas
de Staphylococcus sp. isoladas de queijo tipo coalho, nas praias do nordeste,
verificaram 100% de resistência à penicilina. André et al (2008) observaram, a partir
de 20 cepas de S. aureus isoladas de manipuladores, de leite cru e de QMF, em um
laticinio em Goiás, 12 (60%) apresentaram resistência à penicilina. Yucel et al
(2011), observaram que 92% das cepas de estafilococos isoladas de leite cru e
queijo, na Turquia, apresentavam resistência a penicilina, resultados semelhantes
também foram relatados por Souza (2005), Dantas et al (2006), Kérouaton et al
(2007), Menegotto e Picoli (2008).
Dados do Programa de Vigilância Epidemiológica e de Resistência
Antimicrobiana (SENTRY, 1997 a 2001), que abrangeram hospitais brasileiros e
latino americanos, apontam o S. aureus como o patógeno prevalente nas infecções
de modo geral. Segundo Tizotti et al (2009), foi observado alto índice de resistência
à penicilina entre os isolados de culturas de pacientes hospitalizados (91,1%), o que
está de acordo com dados da literatura nacional (MÍMICA et al., 2007) assim como
os dados relatados neste presente trabalho.
De um modo geral das 31 cepas de S. aureus analisadas neste estudo,
observamos um relevante percentual de resistência a eritromicina (67,7%) e um
71
considerável percentual de cepas resistentes a ciprofloxacina (38,7%). Estudos em
outros países demonstram percentuais menores de resistência a eritromicina e/ou
ciprofloxacina entre cepas de estafilococos (YUCEL et al., 2011; KUCHENBECKER
et al., 2009; NORMANNO et al., 2007; SIBERRY et al., 2003). No Brasil, André et al
(2008) não encontraram resistência a ciprofloxacina entre as cepas de S. aureus
isoladas de QMF e apenas uma cepa apresentou resistência a eritromicina. Os
resultados encontrados neste estudo foram semelhantes aos citados por Tizotti et al
(2009), o qual observaram entre as cepas MRSA, isoladas no Hospital Universitário
de Santa Maria, um índice considerável de resistência a diferentes antimicrobianos,
incluindo eritromicina e ciprofloxacina.
O aumento das infecções por Staphylococcus e a mudança no perfil de
resistência destas cepas tem levado ao uso de clindamicina no tratamento das
infecções (FRANK et al., 2002), tanto por MRSA como por MSSA (FIEBELlKORN et
al., 2003). A clindamicina é ativa, in vitro, contra 80% ou mais das cepas CA-MRSA,
sendo utilizada com sucesso no tratamento de infecções por CA-MRSA (MARTINEZ-
AGUILAR et al., 2003). No estudo aqui apresentado, quatro cepas (12,9%), todas
MRSA, apresentaram resistência constitutiva e cinco cepas (16,1%) resistência
induzida (MLSBi) a clindamicina. O fenótipo MLSBi foi observado entre três cepas de
S. aureus mecA positivas mas com fenótipo de sensibilidade a oxacilina e cefoxitina
e duas cepas MSSA. Ortiz et al (2009), observaram um maior percentual (76,9%) de
cepas que apresentaram Teste D positivos (fenótipo MLSBi) e sensibilidade a
oxacilina, frente a apenas três cepas (23,1%) que apresentaram Teste D positivo e
resistência a oxacilina. Na resistência induzida, a metilase é produzida somente na
presença de um indutor, neste caso a eritromicina (STEWARD et al., 2005). O teste
D é um teste laboratorial importante para auxiliar no uso efetivo de clindamicina nas
infecções estafilocócicas que apresentam o fenótipo MLSBi, e assim, evitar falhas
terapêuticas na prática clínica (MARTINEZ-AGUILAR et al., 2003). O fenótipo
MLSBc (constitutivo) ocorre quando há resistência tanto a clindamicina, quanto a
eritromicina, indicando produção contínua da enzima metilase (De MOUY et al.,
2001). Martins et al (2013) encontraram 16% de S. aureus, isolados de carcaça de
frango, com fenótipo de resistência constitutiva a clindamicina. Coutinho et al (2010)
avaliaram 152 amostras clínicas de pacientes internados no Hospital de Clínicas de
Porto Alegre, sendo 94 S. aureus e destes, três cepas apresentaram o fenótipo de
72
resistência MLSBi. O restante das cepas apresentaram o fenótipo de resistência
MLSBc. Kuchenbecker et al (2009) estudando cepas de S. aureus isoladas de
diferentes tipos de alimentos, encontraram resistência a clindamicina em 5,7% das
cepas. Peresi et al (2006) avaliaram a susceptibilidade antimicrobiana de 25 cepas
de S. aureus isoladas de alimentos envolvidos em surtos de doenças bacterianas
transmitidas por alimentos e constataram que todos os isolados testados mostraram-
se sensíveis à clindamicina.
A rápida resistência a rifampicina tem sido o grande motivo da exclusão do uso
deste antimicrobiano em infecções por CA-MRSA (GORWITZ et al., 2006). Neste
trabalho, resistência a rifampicina foi observada somente em duas cepas (6,5%)
MSSA, as cepas MRSA foram sensíveis a este antimicrobiano. Resultado
semelhantes foram observados por Kuchenbecker et al (2009) a partir de cepas de
S. aureus isoladas de diferentes tipos de alimentos.
As tetraciclinas são utilizadas no tratamento de doenças veterinárias como
suplemento alimentares (LEMOS et al., 2013). Na prática veterinária, cloranfenicol
pode ser utilizado como antibiótico contra bactérias infecciosas devido ao amplo
espectro de ação e baixo custo (FDA, 2002). Entretanto, na terapêutica humana,
cloranfenicol é utilizado somente como fármaco de última escolha, quando não
existe a disponibilidade de outros fármacos eficazes com menor risco toxicológico
(SILVA et al., 2010). Neste trabalho a resistência a tetraciclina e cloranfenicol foi
muito baixa (3,23%, uma cepa de cada antimicrobiano). André et al (2008)
observaram que 25% das cepas de S. aureus isoladas de QMF apresentavam
resistência a tetraciclina. Kuchenbecker et al (2009) investigando alimentos de
origem animal de diferentes regiões do Brasil, observaram 16,7% das cepas de
S. aureus resistentes a tetraciclina e 1,2% resistentes ao cloranfenicol. Normanno
et al (2007), na Itália, não isolaram nenhuma cepa de S. aureus resistentes a
tetraciclina a partir de leite bovino.
Sulfametazole-trimetoprima (TMP-SMX) é ativa contra 90-100% de cepas
CA-MRSA isoladas (VELASQUEZ et al., 2002). Contudo, cepas de S. aureus
resistentes a TMP-SMX têm sido isoladas de diferentes alimentos no Brasil
(KUCHENBECKER et al., 2009). Todas as cepas isoladas no presente trabalho
foram sensíveis a TMP-SMX. Freitas et al (2005) encontraram alta resistência a
TMP-SMX entre as cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina em um município
73
de Pernambuco. Normanno et al (2007) encontraram 33,3% de amostras de leite
bovino contaminadas com S. aureus resistentes a TMP-SMX. As sulfas são
principalmente utilizadas no tratamento preventivo de septicemias em animais com
mastites (OLIVEIRA et al., 2000), sendo também utilizadas no tratamento de
parasitoses como a coccidiose bovina (FREITAS et al., 2005).
Gentamicina é um antibiótico eficaz para o tratamento das mastites bovinas
de origem bacteriana (LANGONI et al., 2000). Todas as cepas isoladas neste
trabalho foram sensíveis à gentamicina. Estes resultados foram semelhantes aos
encontrados por André et al (2008), os quais não isolaram nenhuma cepa resistente
a gentamicina a partir de cepas de S. aureus isoladas de QMF. Vários autores têm
demonstrado sensibilidade à gentamicina a partir de S. aureus isoladas de mastite
bovina e alimentos (NORMANNO et al., 2007; COSTA et al., 2000; BRITO et al.,
2001; WATANABE et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; BYARUGABA, 2004), porém,
altos índices de resistência a gentamicina já foram descritos (FREITAS et al., 2005).
Linezolida e vancomicina são importantes antimicrobianos para tratamento de
infecções por MRSA. Neste estudo nenhuma cepa apresentou resistência a
linezolida. Resistência à vancomicina foi investigada somente entre as cepas MRSA,
sendo todas sensíveis a este antimicrobiano. Nossos resultados estão de acordo
com os de Yucel et al (2011), André et al (2008), Normanno et al (2007), Peresi et al
(2006), Silveira et al (2006), Rodriguez et al (2005), Khare e Keady (2003) e
Paladino (2002) que não encontraram cepas de S. aureus resistentes a estes
antimicrobianos. No entanto, cepas de S. aureus resistentes à vancomicina têm sido
descritas. Acco et al (2003) estudando cepas de S. aureus isoladas da mucosa nasal
de manipuladores de alimentos, observaram 2,4% de cepas resistentes a
vancomicina. A vancomicina é considerada um antimicrobiano de grande eficácia no
tratamento de infecções causadas por MRSA, sendo durante anos considerados
como o único antimicrobiano efetivo contra estas cepas (FOUCAULT et al, 2009). No
entanto, o primeiro relato de sua eficácia reduzida foi descrito no Japão em 1997 ao
fracassar no combate à infecção humana causada por MRSA (HIRAMATSU et al.,
1997). A vancomicina continua a ser o agente intravenoso de amplo espectro para
infecções por MRSA graves, tanto para CA-MRSA quanto para HA-MRSA.
Martins et al (2013) identificaram apenas uma cepa de carne de frango
refrigerada identificada por PCR como S. aureus resistente a meticilina (MRSA)
74
sendo esta cepa vancomicina-resistente (VRS), e duas de outra espécie
(S. intermedius), a partir de diferentes amostras de carne de frango refrigerados.
Esses VRS foram submetidos ao teste de CMI, e dois isolados de vancomicina-
resistente S. intermedius (VRSI) apresentaram CMI de 64lg/mL, enquanto a cepa
MRSA (VRSA) isolada apresentou CMI de 512lg/mL. Todas as três cepas de VRS
carreavam o gene vanA, vanB e vanC. O VRSA isolado foi resistente à penicilina,
oxacilina, clindamicina, rifampicina, cefalotina e teicoplanina e não carreavam
nenhum gene de enterotoxina clássica.
A presença de resistência a antibióticos em bactérias potencialmente
patogênicas em alimentos de origem animal justifica novas investigações sobre o
papel dos antibióticos quando eles são usados para fins terapêuticos ou como
promotores de crescimento em alimentos de origem animal (EFSA, 2004). A análise
por PFGE e a caracterização clonal SpA foram realizadas a fim de verificar a relação
genética entre as cepas MRSA isoladas. As cepas MRSA isoladas no presente
estudo apresentaram o mesmo antibiotipo, no entanto através da análise da relação
genética por PFGE e SpA, observamos mais de um tipo MRSA isolado a partir de
um mesmo queijo. Essa diversidade reflete, provavelmente, as múltiplas fontes de
contaminação por MRSA, como ambiente de processamento e/ou manipuladores. O
papel e a fonte de contaminação dos alimentos com MRSA, ainda não estão claros,
uma vez que apenas poucos relatos sobre a presença e a possível origem destas
em alimentos estão disponíveis. Os perfis clonais encontrados não são similares aos
circulantes e podem estar relacionados com LA-MRSA, pois estes tipos quase não
são depositados no site do SPA RIDOM. Alimentos de origem animal podem
representar fonte de infecção por MRSA para os seres humanos (LEE, 2003). Os
resultados deste estudo, embora tenha investigado poucas amostras de QMF,
podem indicar que este alimento constitui um risco para o consumidor,
especialmente para indivíduos imunocomprometidos, no que diz respeito a
considerável presença de cepas MRSA enterotoxigênicas e multirresistentes. Em
pessoas imunodeprimidas as respostas imunológicas específicas e não específicas
não são capazes de agir como barreira para impedir a colonização do trato
gastrintestinal, e a ingestão de alimentos contaminados por MRSA pode levar à
doença, às vezes letal (KLUYTMANS et al., 1995).
75
7. CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos nos permite concluir que:
1. Amostras de QMF, mesmo sofrendo inspeção federal, apresentaram-se
impróprias para o consumo, por não estarem de acordo com os Padrões
estabelecidos para o indicador CoPS.
2. S. aureus foi a única espécie identificada entre todos os CoPS isolados de
QMF, corroborando com a importância desta bactéria dentro do gênero
Staphylococcus.
3. Entre os antimicrobianos utilizados, as cepas de S. aureus isoladas
apresentaram resistência, principalmente, a penicilina, eritromicina e
ciprofloxacina. Um número considerável de cepas com fenótipo de resistência
induzida, além de cepas MRSA com resistência constitutiva a clindamicina,
estão circulando no QMF.
4. O QMF é um importante veículo de transmissão de S. aureus, tornando um
problema de saúde pública por carrearem, principalmente, cepas MRSA
enterotoxigênicas multirresistentes.
5. Cepas mecA positivas com fenótipo MSSA estão circulando no QMF. O uso
exclusivo do teste de disco difusão pode levar a um diagnóstico falso
negativo destas cepas MRSA.
6. As cepas MRSA isoladas não apresentaram o gene que codifica para PVL,
nem tampouco os tipos SCCmec investigados.
76
7. Apesar de sua suposta origem humana na comunidade, assim como sua
característica de multirresistência, as cepas MRSA isoladas, não podem,
diante dos testes realizados até o momento, serem definidas como CA-MRSA
ou HA-MRSA, nem tampouco LA-MRSA.
8. A análise genética por PFGE e SpA demonstraram diferentes clones MRSA
isolados de um mesmo queijo, o que leva a indicação de múltiplas fontes de
contaminação.
9. Programas de Boas Práticas de Fabricação devem ser implantados nas
indústrias de produtos lácteos, a fim de se garantir um produto de qualidade
que não ofereça risco à saúde do consumidor.
77
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aarestrup, F. M., Wegener, H. C., & Rosdahl, V. T. Evaluation of phenotypic and
genotypic methods for epidemiological typing of Staphylococcus aureus isolates from
bovine mastitis in Denmark. Veterinary Microbiology, v. 45, p. 139–150, 1995.
Acco, M.; Ferreira, F. S.; Henriques, J. A. P.; Tondo, E. C. Identification of multiple
strains of Staphylococcus aureus colonizing nasal mucosa of food handlers. Food
Microbiology, v.20, p.489-493, 2003.
Adams, M. R.; Moss, M. O. Microbiologia de los Alimentos. Zaragoza, Ed. Acribia,
p. 464, 1997.
Andre, M. C. D. P. B.; Campos, M. R. H.; Borges, L. J.; Kipnis, A.; Pimenta, F. C.;
Seraiini, A. B. Comparison of Staphylococcus aureus isolates from food handlers,
raw bovine milk and Minas Frescal cheese by antibiogram and pulsed-field gel
electrophoresis following Smal digestion. Food Control, v. 19, p. 200-207, 2008.
Angulo, F. J.; Nargund, V. N.; Chiller, T. C. Evidence of an association between use
of anti-microbial agents in food animals and anti-microbial resistance among bacteria
isolated from humans and the human health consequences of such resistance.
Journal of Veterinary Medicine Series B, v. 51, p. 374-379, 2004.
Araújo, V. S.; Pagliares, V. A.; Queiroz, M. L. P.; Freitas-Almeida, A. C. Occurrence
of Staphylococcus and enteropathogens in soft cheese commercialized in the city of
Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Applied Microbiology, v. 92, p. 1172-1177, 2002.
Arcuri, E. F.; Angelo, F. F.; Guimarães, M. F.; Talon, R.; Borges, M. D. E., Leroy, S.;
Loiseau, F.; Lange, C.; Andrade, N. J.; Montet, D. Toxigenic status of
Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk and minas frescal cheese in
Brazil. Journal of Food Protection v. 73, p. 2225 - 2231, 2010.
Asao, T., kumeda, Y., kawai, T., Shibata, T., Oda, H., Haruki, K., Nakazawa, H.;
Nozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low fat
milk in Japan: estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim
milk. Epidemiology and Infection v.130, p. 33–40, 2003.
Aspenger H. S. aureus In: International Dairy Federation. Group of experts A 10/11.
The significance of pathogenic microorganisms in raw milk. Brussels: IDF, p. 24-42
(Special Issue, 9405) 1994.
78
Atanossova, V.; Meindl, A.; Ring, C. Prevalence of S. aureus and staphylococcal
enterotoxins in raw pork and uncooked ham – a comparison of classical culturing
detection and RFLP-PCR. International Journal of Food Microbiology. v. 68,
p. 105-113, 2001.
Avdic, E.; Cosgrove, S. E. Managementand control strategies for community-
associated methicillin resistant S. aureus. Expert Opin. Pharmacother. v. 9,
p. 1463 -1479, 2008.
Aydin, A.; Sudagigam, M.; Muratoglu, K.Prevalence of staphylococcal enterotoxins,
toxin genes and genetic-relatedness of foodborne S. aureus strains isolates in the
Marmara Region of Turkey. International Journal of Food Microbiology, v. 148, p. 99-
106, 2011.
Baird-Parker, A. C. Journal of Applied Bacteriology, v. 25, p.12, 1962.
Baird-Parker, A. C. Factors affecting the production of bacterial food poisoning
toxins. Journal of Applied Bacteriology, v. 34, p. 181–197, 1971.
Baird-Parker, A. C. The Stataphylococci “an introduction”. Journal of Applied
Bacteriology, p. 1S-8S (Supplement), 1990.
Balaban, N.; Rassoly, A. Staphylococcal enterotoxins. International Journal of Food
Microbiology vol. 61, p. 1-10, 2000.
Bannerman, T. L. Staphylococcus, Micrococcus, and other catalase positive cocci
that grow aerobically. Manual of clinical microbiology, v.1, p. 384-404, 2003.
Baron, F.; Cochet, M. O.; Pellerin, J. L.; Zakour, N. B.; Lebon, A.; Navarro, A.;
Proudy, I.; Le Loir, Y.; Gautier, M. Development of a PCR test to differentiate
between Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius. Journal of Food
Protection, v. 67, p. 2302–2305, 2004.
Barton, M. D. Antibiotic use in animal feed and its impact on human health. Nutrition
Research Reviews, v. 13, p. 279–299, 2000.
Bayles, K. W., Iandolo, J. J. Genetic and molecular analyses of the gene encoding
staphylococcal enterotoxin D. Journal of Bacteriology, v. 171, p. 4799- 4806, 1989.
Becker, K.; Roth, R.; Petres, G. Rapid and specific detection of toxigenic S. aureus:
use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization
of Staphylococcal enterotoxin genes, esfoliative toxin genes, and toxic syndrome
toxin-1 gene. Journal of Clinical Microbiology, v. 36, p. 2548 – 2553, 1998.
79
Becker, K.; Harmsen D.; Mellamnn A.; Meier, C.; Schumann, P.; Peters, G.;
von Eiff , C. Development and evaluation of a quality controlled ribosomal sequence
database for 16S ribosomal DNA based identification of Staphylococcus species.
Journal of Clinical of Microbiology, v. 42, p. 4988- 4995, 2004.
Bennett, R. W. Staphylococcal enterotoxins. Micro-slide double diffusion and ELISA
based methods. FDA/ Bacteriological Analytical Manual. Chapter 13A, 2001.
Bennett, R. W. Staphylococcal enterotoxin and its rapid identification in foods by
enzyme-linked immunosorbent assay-based methodology. Journal of Food
Protection, v. 68, p. 1264-1270, 2005.
Bergdoll, M. S. S. aureus . In: Foodborne bacterial pathogens – NY, 1989.
Bergdoll, M. S. Staphylococcal food poisoning. In: Cliver, D.O. Foodborne Diseases.
4ºEd. San Diego: Academic Press, cap. 5. p. 86-106, 1990.
Berglund, C. T.; Ito, M.; Ikeda, X.; Hiramatsu, K. Novel type of staphylococcal
cassette chromosome mec in a methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain
isolated in Sweden. Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 52, p. 3512– 3516, 2008.
Bernardi, E.; Armas, R. D.; Caldeira, M. F.; Ribeiro, G. A.; Tessmann, C. Ocorrência
e perfil de sensibilidade de Staphylococcus coagulase positiva em queijos colonial
tipo minas, obtidos em feiras livres da cidade de Pelotas, RS. Agropecuária Técnica,
v. 24, p. 113–117, 2003.
Biomerieux, VIDAS, enterotoxinas estafilocócicas. Disponível em
http:// www.cvs.saude.sp.gov.br/pp02 relfinal.asp. Acessado em 20/02/2013.
Blaiotta, G.; Ercolini, D.; Pennacchia, C.; Fusco, V.; Casaburi, A.; Pepe, O.; Villani, F.
PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcal spp strains
isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seg e sei in
S. aureus. Journal of Applied Microbiology, v. 97, p. 719 - 730, 2004.
Bohach, G. A.; Schlievert, P. M. Conservation of the Biologically Active Portions of
Staphylococcal Enterotoxins C1 and C2. Infection and Immunity, v. 57, p. 2249 -
2252, 1989.
Borges, M. F.; Arcuri, E. F.; Pereira, J. L.; Pereira, J. L.; Feitosa, T.; Kuaye, A. Y. Staphylococcus enterotoxigênicos em leite e produtos lácteos, suas enterotoxinas e genes associados: revisão. Boletim do Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos, v. 26, p. 71- 86, 2008.
80
Brant, L. M. F.; Fonseca, L. M.; Silva, M. C. C. Avaliação da qualidade microbiológica
do queijo-de-minas artesanal do Serro-MG. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, v.59, p.1570-1574, 2007.
Brasil, MAPA. Portaria nº 352 de 4/9/1997 – Regulamento Técnico para fixação de
identidade e qualidade do Queijo Minas Frescal –1997
Brasil, Ministério da Saúde, ANVISA – Resolução nº 12 de 2/1/2001 – Regulamento
Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos. Brasília, 2001.
Brasil, MAPA. Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade do queijo
minas frescal, alterada pela IN nº4 de 1/03/2004. Altera portaria nº352 de
04/09/1997, Brasília p. 5, seção 1, 2004.
Brito, M. A. V. P.; Brito, J. R. F.; Silva, M. A. S.; Carmo, R. A. Concentração mínima
inibitória de dez antimicrobianos para amostras de S. aureus isoladas de infecção
intramamária bovina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinário e Zootecnia, v. 53,
p.10 -17, 2001.
Byarugaba, D. K. A view on antimicrobial resistance in developing countries and
responsible risk factors. International Journal Antimicrobial Agents, v.24, p.105-110,
2004.
Callon, C.; Gilbert, F. B.; Cremoux, R. D.; Montel, M. C. Application of variable
number of tandem repeat analysis to determine the origin of S. aureus contamination
from milk to cheese in goat cheese farms. Food Control, v. 19, p. 143–150, 2008.
Campos, D. C. Queijo: breve histórico e principais características. Núcleo de Apoio a
Pesquisa em Microbiologia Agrícola. Piracicaba: ESALQ - NAPMA, v. 11, p. 59,
2001.
Can, H. Y.; Çelik, T. H. Detection of enterotoxigenic and antimicrobial resistant
S. aureus in Turkish cheeses. Food Control, v. 24, p. 100 – 103, 2012.
Carmo, L. S.; Dias, L. S.; Linardi, V. R.; Sena, M. J.; Santos, D. A.; Faria, M. E.;
Food poisoning due to enterotoxigen strains of Staphylococcus present in Minas
cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiology, v.19, p. 9-14, 2002.
Carmo, G. M. I.; Oliveira, A. A.; Dimech, C. P.; Santos, D. A.; Almeida, M. G.; Berto,
L. H.; Alves, R. M. S.; Carmo, E. H. Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA):
Vigilância epidemiológica das Doenças Transmitidas por Alimentos no Brasil,
1999 - 2004. Boletim Eletrônico Epidemiológico, Secretaria de Vigilância em Saúde
(SVS), v. 5, p. 1- 7, 2005. Acessado em 13 de maio de 2013.
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/bol_epi_6_2005_corrigido.pdf>
81
Carvalho, R. L. B.; Berezin, E. N.; Mimica, M. J. Avaliação da presença dos genes
lukS-PV e lukF-PV em cepas pediátricas de Staphylococcus aureus. Arquivos
Médicos dos Hospitais e das Faculdades de Ciências Médicas da Santa Casa de
São Paulo, v.57, p. 59-62, 2012.
Center for Disease Control and Prevention (CDC), US – Food Safety, 2009.
Disponível em http://www.cdc.gov/briefing/fncidod/eid/vol05/mead.htm. Acessado em
12.10.2012.
Center for Disease Control and Prevention, US – Community associated MRSA, 2003. Disponível em http://www.cdc.gov/ncidod/hip/Aresist/mrsacommfaq.htm. Acessado em 12.10.2012.
Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clinical Microbiology Reviews, v.10, p. 781-791,1997.
Chambers, H. F. The changing epidemiology of S. aureus. Emerging Infectious Disease. v. 7, p. 178-182, 2001.
Chambers, H. F.; De Leo, F. R. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the
antibiotic era. Nature Reviews Microbiology, v. 7, p. 629 - 641, 2009.
Chapaval, L.; Moon, D. H.; Gomes, J. E.; Duarte, F. R.; Tsai, S. M. Use of PCR to
detect classical enterotoxin genes (ent) and toxic shock syndrome toxin-1 gene (tst)
in staphylococcus aureus isolated from crude milk and determination of toxin
productivities of S. aureus isolates harboring these genes. Arquivos do Instituto
Biológico v. 73, p. 165–169, 2006.
Chen, T. R., Chiou, C. S., Tsen, H. Y. Use of novel PCR primers specific to the
genes of staphylococcal enterotoxin G, H, I for the survey of Staphylococcus aureus
strains isolated from food-poisoning cases and food samples in Taiwan. International
Journal of Food Microbiology, v. 92, p. 189-197, 2004.
Chiang, Y. C.; Liao, W. W.; Fan, C. M.; Pai, W. Y.; Chiou, C. S.; Tsen, H. Y.
PCR detections of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N,O,P,Q,R,U and survey
of types in S. aureus isolates from food- poisoning cases in Taiwan. International
Journal of Food Microbilogy, v. 121, p. 66 - 73, 2008.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing, 2012.
Cliver, D. O. Foodborne Disease Handbook. NY: Marcel Dekker, Inc, p. 613, 1994.
Cookson, B. D.; Robinson, D. A.; Monk, A. B.; Murchan, S.; Deplano, A.; O'Hanlon,
S.; Enright, M. C. Evaluation of molecular typing methods in characterizing an
82
European collection of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains:
Harmony collection. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, p. 1830-1837, 2007.
Corbia, A. C. G.; Nascimento, M. G. F.; Oliveira C. Z. F.; Nascimento, E. R.
S. aureus: importância para saúde pública e aspectos epidemiológicos. Seropédica:
Embrapa Agrobiologia, p.15, 2000.
Costa, J. C. B.; Freitas, E. I.; Lemos, A. A.; Rosas, C. O.; Medeiros, V. M.; Warnken,
M. B.; Marin, V. A. Isolamento de Staphylococcus de queijo minas frescal e
detecção de genes de enterotoxinas. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 71, p. 250 -
258, 2012.
Costa, E. O.; Benitis, N. R.; Guerra, J. L.; Melville, P. A. Antimicrobial susceptibility of
Staphylococcus spp. Isolated from mammary parenchymas of slaughtered dairy
cows. Journal of Veterinary Medicine, v.47, p.99 -103, 2000.
Couch, J. L.; Soltys, M. T.; Bettley, M. J. Cloning and nucleotide sequence of the
type E staphylococcal gene. Journal of Bacteriology, v. 170, p. 2954 – 2960, 1988.
Couch, J. L.; Betley, M. J. Nucleotide sequence of the type C3 staphylococcal
enterotoxin gene suggests that intergenic recombination causes antigenic variation.
Journal of Bacteriology, v. 171, p. 4507- 4510, 1989.
Coutinho, V. L. S.; Paiva, R. M.; Reiter, K. C.; Barth, A. L.; Machado, A. B. M. P.
Distribution of erm genes and low prevalence of inducible resistance to clindamycin
among staphylococci isolates. Brazilian Infectious Disease, v. 14, p. 564 – 568, 2010.
Crago, B,; Ferrato, C,; Drews, S.J.; Svenson, L. W,; Tyrrell, G,; Louie, M. Prevalence
of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in food
samples associated with foodborne illness in Alberta, Canada from 2007 to 2010.
Food Microbiology, v. 32, p. 202–205, 2012.
Cremonesi, P.; Peres, G.; Pisoni, G.; Moroni, P., Morandi, S., Luzzana, M., Brasca,
M., Castiglioni, B. Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates in raw
milk cheese. Letters in Applied Microbiology, v. 45, p. 586–591, 2007.
Cunha, M. L. R. S.; Peresi, E.; Calsolari, R. A. O.; Araujo, J. P. J. Detection of
enterotoxins genes in coagulase-negative staphylococci isolated from foods.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 37, p. 70 – 74, 2006.
Cunha, A.; Cunha, M. R. Toxinfecção alimentar por S. aureus através do leite e seus
derivados, bem como o elevado potencial patogênico de resistência às drogas.
Revista Saúde e Ambiente, v. 2, p. 105 –114, 2007.
83
Cuny, C.; Friedrich, A.; Kozytska, S.; Layer, F.; Nubel, U.; Ohlsen, K.; Strommenger, B.; Walther, B.; Wieler, L.; Witte, W. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in different animal species. International Journal Medical Microbiology, v. 300, p. 109–117, 2010. Cuny, C.; Köck, R.; Witte, W. Livestock associated MRSA (LA-MRSA) and its
relevance for humans in Germany. International Journal of Medical Microbiology,
v. 303, p. 331– 337, 2013.
Dantas, M. C.; Santos, P. P.; Campos, M. R. H.; Borges, L. J.; Serafini, A. B.
Utilização do antibiograma como ferramenta de tipagem fenotípica de S. aureus
isolados de manipuladores de leite cru e Queijo Minas Frescal em laticínio de Goiás.
Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 43, p. 102–
108, 2006.
Daum, R. S.; Ito, T.; Hiramatsu, K.; Hussain, F.; Jamklang, M.; Boyle-Vavra, S.
A novel methicillinresistance cassette in community-acquired methicillinresistant
Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds. Journal of Infectious
Disease, v. 186, p. 1344 –1347, 2002.
David, M. Z.; Daum, R. S. Community-Associated Methicilin-Resistant S. aureus :
Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical
Microbiology Reviews, v. 23, p. 616 – 687, 2010.
DeLeo, F. R.; Otto, M.; Kreiswirth, B. N.; Chambers, H. F. Community-associated
meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet, v. 375, p. 1557-1568, 2010.
Delialioglu, N.; Aslan, G.; Ozturk, C.; Baki, V.; Emckadas, G. Inducible clindamycin
resistance in Staphylococci Isolated from Clinical Samples. Japonese Journal of
Infectious Disease, v. 58, p. 104 -106, 2005.
De Mouy, D.; Carvalho, J.D.; Leclercq, R.; Fabre, R. Antibiotic Susceptibility and
mechanisms of eritromycin resistance in clinical isolates of Streptococcus agalactiae.
Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 45, p. 2400- 2402, 2001.
Deresinski, S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an evolutionary,
epidemiologic and therapeutic odyssey. Clinical Infectous Disease, v. 40, p. 562 -
573, 2005.
Deuremberg, R. H.; Vink, C; Kalenic, S; Friedrich, A. W.; Brugemann, C. A.;
Stobberingh, E. E. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Clinical Microbiology Infectious, v. 13, p. 222– 235, 2007.
Dice, L. R. Measures of the amount of ecological association between species.
Ecology, v. 26, p. 297- 302, 1945.
84
Dinges, M. M., Orwin, P. M., Schlievert, P. M. Exotoxins of Staphylococcus aureus.
Clinical Microbiology Reviews, v. 13, p.16 - 34, 2000.
Doyle, E. M.; Hartmann, F. A.; Wong, A. C. L. Methicillin-resistant staphylococci:
implications for our food supply? Animal Health Research Reviews, v. 13, p. 157–
180, 2012.
Dresser L. D, Ryback M. J. The pharmacologic and bacteriologic properties of
oxazolidinones, a new class of synthetic antimicrobials. Pharmacotherapy, v. 18,
p. 456 - 462, 1998.
ECDC (European Center for Disease Prevention and Control). Joint scientific report of ECDC, EFSA and EMEA on methicillin- resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in livestock, companion animals and food. EFSA Scientific Report, v. 301, p. 1–10, 2009.
EFSA (European Food Safety Authority) The European Union Summary report on
Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Foodborne outbreaks, 2009.
EFSA (European Food Safety Authority) The community summary report on trends
and sources of zoonoses, zoonotic agents and antimicrobial resistance in the
European Union in 2004. http://www.efsa.europa.eu. Acessado em 26/3/2013.
Enright, M. C.; Day, N. P.; Davies, C. E.; Peacock, S. J.; Spratt, B. G. Multilocus
sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin
susceptible clones of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology, v. 38,
p. 1008 - 1015, 2000.
Ertas, N.; Gonulalan, Z.,; Yildirim, Y.; Kum, E. Detection of Staphylococcus aureus
enterotoxins in sheep cheese and dairy desserts by multiplex PCR technique.
Intenational Journal of Food Microbiology v. 142, p. 74 – 77, 2010.
Euzéby, J. P. List of Bacterial names with Standing in Nomenclature. Disponível
emhttp://www.bacterio.cict.fr/staphylococcus.html. Acessado em 19/03/2012.
Felten, A.; Grandry, B.; Lagrange, P. H.; Casin, I. Evaluation of three techniques for
detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk
diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system and the MRSA-
screen latex agglutination test. Journal of Clinical Microbiology, v. 40,
p. 2766 - 2771, 2002.
Filho, E. S. de A.; Filho, A. N. Ocorrência de Staphylococcus aureus em queijo tipo
frescal. Revista de Saúde Pública. v. 34, p. 578- 580, 2000.
85
Fluit, A. C.; Visser, M. R.; Scmitz, F. J. Molecular Detection of Antimicrobial Resistance. Clinical Microbiology Reviews, v. 14, p. 836–871, 2001.
Food and Drug Administration (FDA) – Food Microbiological Control. Washington
D.C. Division of Human Resource Development, p.796, 1998.
Food and Drug Administration (FDA). Bacteriological Analytical Manual, 7th Edition.
AOAC International. Cota: Q03-305, 1992.
Food and Drug Administration (USFDA); Laboratory Information Bulletin (LIB)
n° 4290, 2002.
Food and Drug Administration (FDA) – Center for Food Safety Applied Nutrition
Foodborne pathogenic microorganisms and natural toxins handbook. Estados
Unidos, Janeiro 2002. Disponível em http:// www.cfsan.fdda.gov/mow/chap3html.
Acessado em 19/3/2013.
Foucault, M. L.; Courvalin, P.; Grillot-Courvalin, C. Fitness coast of VanA-Type
Vancomycin Resistance in methicillin-resistant S. aureus. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v.53, p. 2354-2359, 2009.
Frank, A. L.; Marcinak, J. F.; Mangat, P. D.; Tihio, J. T.; Kalkar, S.; Schreckenberger,
P. C.; Quinn, J. P. Clindamycin treatment of methicillin-resistant S. aureus infectious
in children. Pediatric Infection Disease Journal, v. 21, p. 530 – 534, 2002.
Freitas, A. C.; Nunes, M. P.; Milhonem, A. M.; Ricciardi, I. D. Occurrence and
characterization of Aeromonas species in pasteurized and white cheese in Rio de
Janeiro, Brazil. Journal of Food Protection, v.5, p. 62 - 65, 1993.
Freitas, E. I. Detecção de genes de enterotoxinas de Staphylococcus spp isolados
de queijo minas frescal. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária)
INCQS/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 2005.
Fueyo, J. M.; Martin, M. C.; Gonzáles-Hevia, M. A.; Mendoza, M. C. Enterotoxin
production and DNA fingerprinting in Staphylococcus aureus isolated from human
and food samples. Relations between genetic types and enterotoxins. International
Journal of Food Microbiology, v. 6, p. 139 – 145, 2001.
Fueyo, J. M.; Mendoza, M. C.; Rodicio, M. R.; Muniz, J.; Alvarez, M. A.; Martin, M. C.
Cytotoxin and pyrogenic toxin superantigen gene profiles of S. aureus associated
with subclinical mastitis in dairy cows and relationships with macrostriction genomic
profiles. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, p. 1278 - 1284, 2005.
Furlanetto, S. M. P.; Nader Filho, A.; Wilson, D. S. aureus enterotoxigênicos a partir
de leite de vacas mastísticas. Reviews of Microbiology, v. 18, p. 138-143, 1987.
86
Furtado, M. M. A arte e a ciência do queijo. São Paulo: Globo, 1990.
Furtado, M. M. Principais problemas dos queijos: causas e prevenção. Edição
Revisada e Ampliada. São Paulo: Fonte Comunicação e Editora, p. 200, 2005.
Gandra, E. A.; Fernandez, M. A.; Silva, J. A.; Silva, W. P. Standardization of
multiplex PCR for the identification of coagulase-positive Staphylococcus. Food
Science and Technology, v. 31, p. 946 - 949, 2011.
Garrity, G. M.; Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. The Low G+C Gram
positives. Springer-Verlang, New York, 2006.
Gelatti, L. C.; Bonamigo, R. R.; Inoue, F. M.; Carmo, M. S.; Becker, A. P.;
Castrucci, F. M. S.; Pignatari, A. C. C.; Azevedo. P. A. Community-acquired
methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying SCCmec type IV in southern
Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 46, p. 34- 38, 2013.
Ghosh, S.; LaPara, T. M. The effect of subtherapeutic antibiotic use in farm animals
on the proliferation and persistence of antibiotic resistance among soil bacteria. The
International Society for Microbial Ecology Journal, v. 1, p. 191-203, 2007.
Gonzalez, A. G. M.; Rosa, A. C. P.; Andrade, J. R. C.; Tibana, A. Enteropathogenicity
markers in E. coli strains isolated from soft White cheese and poultry in Rio de
Janeiro, Brazil. Food Microbiology, v. 17, p. 321-328, 2000.
Gonzalo, M. L. B.; Rosato, A. E.; Assanasen, S.; Kleiner, E. A.; Elam, K.; Wenzel,
R. P. Nasal carriage of inducible dormant and community-associated methicillin-
resistant Staphylococcus aureus in an ambulatory population of predominantly
university students. International Journal of Infectious Diseases, v. 14, p.18–24,
2010.
Gorwitz, R. J., D. B. Jernigan, J. H. Jernigan, and Participants in the CDC-Convened
Experts' Meeting on Management of MRSA in the Community. Strategies for clinical
management of MRSA in the community: summary of an experts' meeting convened
by the Centers for Disease Control and Prevention. Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, GA, 2006. http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/mrsa_cahtml
Hammerum, A. M.; Heuer, O. E. Human health hazards from antimicrobial resistant
Escherichia coli of animal origin. Clinical Infectious Diseases, Oxford, v. 48, p. 916-
921, 2009.
Hanssen, A. M.; Sollid, J. U. E. SCCmec in staphlococci: genes on the move. FEMS.
Immunology and Medical Microbiology, v. 46, p. 18 - 20, 2005.
87
Harmsen, D.; Claus, H.; Witte, W.; Rothganger, J.; Turnwald, D.; Vogel, U. Typing of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using
novel software for spa repeat determination and database management. Journal of
Clinical Microbiology, v. 41, p. 5442 - 5448, 2003.
Hassan, S. R. U.; Verma, V.; Qazi, G. N. Evaluation of three differents molecular
markers for the detection of S. aureus by PCR. Food Microbiology, v. 25, p. 452 -
459, 2008.
Herold, B. C.; Immergluck, L. C.; Maranan, M. C.; Lauderdale, D. S.; Gaskin, R. E.;
Boyle-Vavra, S.; Leitch, C. D.; Daum, R. S. Community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk. The Journal of
the American Medical Association (JAMA), v. 279, p. 593– 598, 1998.
Hiramatsu, K.; Kuroda, M.; Ito, T. The emergence and evolution of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiology, v. 9, p. 486 - 493, 2001.
Hiramatsu, K.; Katayama, Y.; Yuzawa, H.; Ito, T. Molecular genetics of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus. International Journal Medical Microbiology, v. 292,
p. 67 - 74, 2002.
Hirooka, E. Y.; Müller, E. E.; Freitas, J. C.; Vicente, E.; Yoshimoto, Y., Bergdoll, M. S.
Enterotoxigenicity of Staphylococcus intermedius of canine origin. International
Journal of Food Microbiology, v. 7, p. 185 - 190, 1988.
International Commission on Microbiological Specifications for Foods. S. aureus . In:
ICMSF. Microorganisms in food: characterization of microbial pathogens. NY. Kluvers
Academic, v. 5, p. 299 - 333, 1996.
International Working Group on the classification of Sccmec (IWG-SCC), 2011.
http://www.sccmec.org/pages/SCC_TypesEN. html. Acessado em 12.5.2013.
Ikeda, T.; Tamate, N.; Yamaguchi, K.; Makino, S. Outbreak of food poisoning disease
caused by small amounts of staphylococcal enterotoxins A and H. Applied and
Environmental Microbiology, v. 71, p. 2793 - 2795, 2005.
Ito, T.; Katayama, Y.; Asada, K.; Mori, N.; Tsutsumimoto, K.; Tiensasitorn, C.;
Hiramatsu, K. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette
chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 45, p. 1323 -
1336, 2001.
88
Ito, T.; Takeuchi, F.; Okuma, K.; Yuzawa, H.; Hiramatsu, K. Novel type V
staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome
recombinase, ccrC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, p. 2637- 2651,
2004.
Jarraud, S.; Mougel, C.; Thioulouse, J.; Lina, G.; Meugnier, H. Relationships
between S. aureus genetic background , virulence factors, agr groups (alleles) and
human disease. Infection and Immunity, v. 70, p. 631-641, 2002.
Jevons, M. P. “Celbenin” – resistant Staphylococci. British Medical Journal, v.1,
p. 124 - 125, 1961.
Jett, M.; Ionin, R.; Neill, R. The Staphylococcal enterotoxins. In: Sussman, M. Editor.
Molecular Medical Microbiology. San Diego, CA, USA: Academic Press, p. 1089-
1116, 2001.
Johler, S.; Stephan, R. Staphylococcal food poisoning: a current review. Archiv für
Lebensmittelhygiene. v. 61, p. 220-228, 2010.
Johns, R. M. B.; Khan, A. Staphylococcal enterotoxin B gene is associated with
discrete genetic element. Journal of Bacteriology, v, 170, p. 4033-4039, 1998.
Jones, R. N. Microbiological features of vancomycin in the 21 st century: minimum
inhibitory concentration creep, bactericidal statistic activity, and applied breakpoints
to predict clinical outcomes or detect resistant stains. Clinical Infectious Disease,
v. 42, p. 13-24, 2006.
Jorgensen, H. J.; Mork, T.; Hogasen, H. R.; Rovik, L. M. Enterotoxigenic
Staphylococcus aureus in bulk milk in Norway. Journal Applied Microbiology, v. 99,
p. 158 – 167, 2005.
Kadlec, K.; Ehricht, R.; Monecke, S.; Steinacker, U.; Kaspar, H.; Mankertz, J.; Schwarz, S. Diversity of antimicrobial resistance pheno- and genotypes of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 from diseased swine. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 64, p. 1156–1164, 2009.
Kadlec, K.; Fessler, A. T.; Hauschild, T.; Schwarz, S. Novel and uncommon antimicrobial resistance genes in livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection 18: 745–755, 2012.
Kampf, G.; Adena, S.; Rüden, H.; Weist, K. Inducibility and potential role of mecA-
gene-positive oxacillin-susceptible Staphylococcus aureus from colonized healthcare
workers as a source for nosocomial infections. Journal Hospital Infectious, v. 54,
p. 124-129, 2003.
89
Katayama, Y.; Ito, T.; Hiramatsu, K. A new class of genetic element, staphylococcus
cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.44, p.1549–1555, 2000.
Kérouanton, A.; Hennekinne, J. A.; Letertre, C.; Petit, L.; Chesneau, O.; Brisabois,
A.; De Buyser, M. L. Characterization of Staphylococcus aureus strains associated
with food poisoning outbreaks in France. International Journal of Food Microbiology,
v. 115, p. 369–375, 2007.
Khare, M.; Keady, D. Antimicrobial therapy of methicillin resistant S. aureus infection.
Expert Opinion on Pharmacotherapy v. 4, p. 165-177, 2003.
Kloss, W. E. Systematics and natural history os staphylococci. Journal of Applied
Bacteriology Symposium Supplement, v. 69, p. 25 – 37, 1990.
Kluytmans, J.; Van Leeuwen, W.; Goessens, W.; Hollis, R.; Messer, S.; Herwoldt, L.;
Bruining, H.; Heck, M.; Rost, J.; Van Leeuwen, N.; Von Belkun, A.; Verbrugh, H.
Food-initiated outbreak of methicillin-resistant Staphylocococcus aureus analyzed by
pheno and genotyping. Journal of Clinical Microbiology , v. 33, p. 1121-1128, 1995.
Kluytmans, J.; Van Belkum, A.; Verbrugh, H. Nasal carriage of Staphylococcus
aureus: Epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clinical
Microbiological Reviews, v. 10, p. 505– 520, 1997.
Kluytmans-Vandenbergh, M. F.; Kluytmans, J. Community-acquired methicillin-
resistant S. aureus: current perspectives. Clinical Microbiology Infectious, v.1, p. 9-
15, 2006.
Kokan, N. P.; Bergdoll, M. S. Detection of low-enterotoxin producing Staphylococcus
aureus strains. Applied and Environmental Microbiology, v. 53, p. 2675 – 2676, 1987.
Komatsu, R. S.; Rodrigues; M. A. M.; Loreno, W. B. N.
; Santos, K. A. Ocorrência de
Staphylococcus coagulase positiva em queijo Minas frescal produzidos em
Uberlândia –MG. Bioscience Journal, v. 26, p. 316-321, 2010.
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schreckenberger, P. C.; Winn Jr, W. C.
Diagnóstico Microbiológico. São Paulo: Medsi Editora Médica e Científica Ltda.,
p. 1466, 2001.
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schreckenberger, P. C.; Winn Jr, W. C.
Cocos gram positivos: Parte 1. Estafilococos e microrganismos relacionados In:
diagnóstico Microbiológico – Texto e Atlas Colorido, 5ª ed. RJ: Médica e Científica,
p. 619 – 646, 2006.
90
Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schreckenberger, P. C.; Winn Jr, W. C.
Diagnóstico Microbiológico - Texto e Atlas colorido. 6a ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, p. 1760, 2008.
Kreausukon, K.; Fetsch, A.; Kraushaar, B.; Alt, K.; Mueller, K.; Kroemker, V.; Zessin, K. H.; Kaesbohrer, A.; Tenhagen, B. A. Prevalence, antimicrobial resistance, and molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from bulk tank milk of dairy herds. Journal of Dairy Science, v. 95, p. 4382–4388, 2012.
Kuchenbecker, B. S.; Ribeiro, A. R.; Cardoso, M. Perfil de resistência de isolados de
S. aureus, obtidos de produtos de origem animal analisados pelo Serviço de
Inspeção Federal do Brasil. Acta Scientiae Veterinariae, v. 37, p. 143 – 149, 2009.
Lamaita, H. C.; Cerqueira, M. M. O. P.; Carmo, L. S.; Santos, D. A.; Penna, C. F. A.;
Souza, M. R. Contagem de Staphylococcus spp e detecção de enterotoxinas
estafilocócicas e toxina da Síndrome do Choque Tóxico em amostras de leite cru
refrigerado. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 57, p. 702 -
709, 2005.
Lancette, G. A.; Bennet, R. W. Staphylococcus aureus and Staphylococcal
enterotoxins. 4 ed. Washington D.C. In: Downes, F. P.; Ito, K. (Ed.) Compendium of
methods for the microbiological examination of foods, 2001.
Lancette, G. A.; Tatini, S. R. Staphylococcus aureus. In: Vandrzant, C. (Ed).
Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 3 ed.
Washington: American Public Health Association, 1992.
Lange, C. C.; Brito, M. A. V. P.; Brito, J. R. F.; Brito, E. F.; Arcuri, G. N. S.; Machado,
M. A.; Domingues, R.; Salimena, A. P. S. Uso de PCR e sequenciamento do DNA
16S para identificação de bactérias do gênero Staphylococcus isoladas de mastite
bovina. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 31, p. 36 - 40, 2011.
Langoni, H.; Mendonça, A. O.; Develley, A. Avaliação do uso da associação da
bromexina com gentamicina no tratamento da mastite subclínica bovina. Revista
Napgama, v. 1, p. 4 - 7, 2000.
Leclercq, R. Mechanisms of resistance of macrolides and lincosamides: nature of the
resistance elements and their clinical implications. Clinical Infectious Disease, v. 34,
p. 482- 492, 2002.
Lee, J. H. Methicillin (oxacillin)-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from
major food animals and their potential transmission to human. Applied and
Environmental Microbiology, v. 69, p. 6489– 6494, 2003.
91
Leite, M. M. D.; Lima, M. G.; Reis, R. B. Ocorrência de Staphylococcus aureus em
queijo Minas tipo frescal. Revista Higiene Alimentar. v. 19, p. 89 - 92, 2005.
Le Loir, Y. L.; Baron, F.; Gautier, M. Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetic and Molecular Research, v. 2, p. 63 - 76, 2003.
Letertre, C.; Perelle, S.; Dilasser, F.; Fach, P. Identification of a new putative
enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus. Journal of
Applied Microbiology, v. 95, p. 38 - 43, 2003.
Li, S.; Skov, R. L.; Han, X.; Larsen, A. R. ; Larsen, J.; Sorum, M.; Wulf, M.; Voss, A.;
Hiramatsu, K.; Ito, T. Novel types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec
Elements identified in Clonal Complex 398 Methicillin-Resistant Staphylococcus
aureus strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 55, p. 3046–3050,
2011.
Lina, G.; Piémont, Y.; Godail-Gamot, F.; Bes, M.; Peter, M.; Gauduchon, V.;
Vandenesch, F.; Etienne, J. Involvement of Panton-Valentine leukocidin producing
Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia, Clinical Infectious
Disease, v. 29, p. 28-32, 1999.
Lowy, D. F. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus.
Journal of Clinical Investigation, v. 9, p. 1265 -1273, 2003.
Machado, T. F.; Borges, M. F.; Oliveira, F. E. M.; Sousa, C. T. Isolamento e
Identificação de Patógenos em Queijo Coalho. Embrapa Agroindustria Tropical,
2011.
Madigan, M. T.; Martinko J. M.; Parker, J. Biology of Microrganisms. 8ª ed., London:
Prentice Hall International, 1036p., 1997.
Malachowa, N.; De Leo, F. R. Mobile genetic elements of S. aureus. Cellular and
Molecular Life Science, v. 67, p. 3057 – 3071, 2010.
Malik, S.; Peng, H.; Barton, M. D. Antibiotic resistance in staphylococci associated
with cats and dogs. Journal Applied Microbiology, v. 99, p. 1283 –1293, 2005.
Maranan, M. C.; Moreira, B.; Boyle-Vavra, S.; Daum, R. S. Antimicrobial resistance in
Staphylococci: epidemiology, molecular mechanisms and clinical relevance.
Infectious Disease Clinics of North America, v. 11, p. 813 - 849, 1997.
Marr, J. C.; Lyon, J. D.; Roberson, J. R.; Lupher, M.; Davis, W. C.; Bohach, G. A.
Characterization of novel type C staphylococcal enterotoxins: biological and
evolutionary implications. Infection and Immunity, v. 61, p. 4254- 4262, 1993.
92
Martinez-Aguilar, G.; Hammerman, W. A.; Mason, E. O.; Kaplan, S. L. Clindamycin
treatment of invasive infections caused by community-acquired, methicillin-resistant
and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in children. Pediatric Infectious
Disease Journal, v. 22, p. 593 - 598, 2003.
Maslow, J. N.; Mulligan, M. E.; Arbeit, R. D. Molecular epidemiology: application of
contemporary techniques to the typing of microrganisms. Clinical Infectious Disease,
v. 17, p. 153 – 164, 1993.
Matheus, A. A.; Thomas, M.; Appalaraju, B.; Jayalakshmi, J. Evaluation and
comparison of tests to detect methicillin resistant S. aureus. Indian Journal of
Pathology and Microbiology, v. 53, p. 79 – 82, 2010.
Mclauchlin, J.; Narayanan,G. L.; Mithani, V.; O'Neill, G. The detection of enterotoxins
and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase
chain reaction. Journal Food Protection, Des Moines, v. 63, p. 479 - 488, 2000.
Mead, P. S.; Slutsker, L.; Dietz, V.; McCaig, L. F.; Bresee, J. S.; Shapiro, C.; Griffin,
P. M.; Tauxe, R. V. Food-related illness and death in United States. Emerging
Infections Diseases, v.5, p. 607- 625, 1999.
Meer, R.; Misner, S. What is a foodborne illness? Arizona Cooperative Extension,
University of Arizona, p. 1065, 1998. Disponível em:
<http//:ag.arizona.edu/pubs/health/az1065.pdf>. Acessado em 3/9/2012.
Melles, D. C.; Leeuwen, W. B.; Snijders, S. V.; Horst-Kreft, D.; Peeters, J. K.;
Verbrugh, H. A.; Belkum, A. Comparison of Multilocus sequence typing (MLST),
Pulsifield gelelectrophoresis (PFGE), and Amplified fragment length polymorphism
(AFLP) for genetic typing of S. aureus. Journal of Microbiology Methods, v. 69,
p. 371- 375, 2007.
Melo, G. B.; Melo, M. C.; Gama, A. P.; Carvalho, K. S.; Jesus, T. C.; Bonetti, A. M.;
Gontijo Filho, P. P. Analysis of genetic diversity of vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Microbiology, v. 36, p. 126 -130, 2005.
Menegotto, F. R.; Picoli, S. V. Staphylococcus aureus oxacilina resistente
(MRSA): incidência de cepas adquiridas na comunidade (CA-MRSA) e importância
da pesquisa e descolonização em hospital. Revista Brasileira de Analises Clinicas,
v. 39, p. 147–150, 2007.
93
Mimica, M. J.; Berezin, E. N.; Carvalho, R. L. B.; Mimica, I. M.; Sáfadi, M. A. P.;
Schneider, E.; Caiaffa-Filho, H. H. Detection of methicillin resistance in
Staphylococcus aureus isolated from pediatric patients: is the cefoxitin disk diffusion
test accurate enough? Brazilian Journal of Infectious Disease, v. 11, p. 415- 417,
2007.
Miyazaki, N. H. T.; Abreu, A. O.; Marin, V. A.; Rezende, C. A. F.; Moraes, M. T. B.;
Bôas, M. H. S. V. Análise molecular associada ao estudo dos genes de resistência
em Staphylococcus aureus resistentes à meticilina. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz, v. 102, p. 539 - 540, 2007.
Mohanasoundaram, K. M.; Lalitha, M. K. Comparison of phenotypic versus genotypic
methods in the detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Indian
Journal of Medical Research, v. 127, p. 78 - 84, 2008.
Moussallem, B. C.; Kury, C. M. H.; Acosta, E. M. Detection of the mecA and femA
genes, molecular markers of methicillin resistance, in Staphylococcus spp. isolated
from patients admitted to a neonatal intensive care unit. Revista Científica da
Faculdade de Medicina de Campos, v. 2, p. 1- 9, 2007.
Mulligan, M. E.; Murray-Leisure, K. A.; Stamford, H. C.; John, J. F.; Yu, V. L.
Methicilin-Resistant S. aureus: A Consensus Review of the Microbiology,
Pathogenesis and Epidemiology with implications for Prevention and Management.
The American Journal of Medicine, v. 94, p. 313 - 328, 1993.
Murray, P. R.; Baron, E. J.; Jorgensen, J. H.; Pfaller, M. A.; Yolken, R. H. Manual of
Clinical Microbiology, 8th ed., Washington. American Society for Microbiology,
2322p., 2003.
Naimi, T. S.; LeDell, K. H.; Como-Sabetti, K.; Borchardt, S. M.; Boxrud, D. J.;
Etienne, J.; Johnson, S. K.; Vandenesch, F.; Fridkin, S.; O'Boyle, C.; Danila, R. N.;
Lynfield, R. Comparison of communityand health care-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus infection.The Journal of the American Medical Association
(JAMA), v. 290, p. 2976 - 2984, 2003.
Najera-Sanches, G.; Maldonado-Rodriguez, R.; Ruiz Olvera, P.; de la Garza, L. M.
Development of two multiplex PCR for the detection of enterotoxigenic strains
of S. aureus isolated from foods. Journal of Food Protection, v. 66, p. 1055 -1062,
2003.
Normano, G.; Firinu, A.; Virgilio, S.; Mula, G; Dambrosio, A.; Poggiu, A.; Decastelli,
L.; Mioni, R.; Scuota, S.; Balzoni, G.; DI Giannatali, E.; Salinetti, A. P.; LA Salandra,
G.; Bartoli, M; Zuccon, F.; Pirino, T.; Sias, S.; Parisi, A.; Quaglia, N. C.; Celano, G. V.
94
Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products
marketed in Italy. International Journal of Food Microbiology, v. 98, p. 73 - 79, 2005.
Normanno, G.; La Salandra, G.; Dambrosio, A.; Quaglia, N. C.; Corrente, M.; Parisi,
A.; Santagada, G.; Firinu, A.; Crisetti, E.; Celano, G. V. Ocurrence, characterization
and antimicrobial resistence of enterotoxifenic S. aureus isolated from mat dairy
products. International Journal of Food Microbiology, v. 115, p. 290 - 296, 2007.
O’ Brien, M.; Hunt, K.; McSweeney, S.; Jordan, K. Ocurrence of foodborne
pathogens in Irish farmhouse cheese. International Journal of Food Microbiology,
v. 26, p. 910 - 914, 2009.
Ogston, A. Micrococcus poisoning. Journal of Anatomy and Physiology, v. 17, p. 24 –
58, 1880.
Oh, S. K.; Lee, N.; Cho, I. S.; Shin, D. B.; Choi, S. Y.; Koo, M. Ocurrence of toxigenic
S. aureus in ready-to-eat food in Korea. Journal of Food Protection, v. 70, p. 1153 -
1158, 2007.
Oliveira, A. A. F.; Mota, R. A.; Souza, M. I.; Sá, M. E. P. Perfil de Sensibilidade
Antimicrobiana in vitro frente a amostras de Staphylococcus spp isoladas de mastite
subclínica bovina, no Agreste meridional de Pernambuco. Hora Veterinária, v. 22,
p. 8 -10, 2002.
Oliveira, A. M.; Miya, N. T. N.; Sant’Ana, A. S.; Pereira, J. L. Behavior and
enterotoxin production by coagulase negative Staphylococcus spp in cooked ham,
reconstituted skimmed milk and confectionary cream. Journal Food of Science,
v. 75, p. 475 - 481, 2010.
Oliveira, A. M.; Padovani, C. R.; Miya, N. T.; Sant'ana, A. S.; Pereira, J. L. High
incidence of enterotoxin D producing Staphylococcus spp in Brazilian cow’s raw milk
and relation with coagulase and thermonuclease enzimes. Foodborne Pathogens
and Disease, v. 8, p. 159 – 163, 2011.
Oliveira, D. C.; Sanches, I. S.; Mato, R.; Tamayo, M.; Ribeiro, G.; Costa, D.; de
Lencastre, H. Virtually all methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
infections in the largest Portuguese teaching hospital are caused by two
internationally spread multiresistant strains: the 'Iberian' and the 'Brazilian' clones of
MRSA. Clinical Microbiology Infectious, v. 4, p. 373 - 384, 1998.
Oliveira, D. C.; Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapidy identification of
structural types and variants of the mec element in methicylin-resistant S. aureus.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, p. 2155 - 2161, 2002.
95
Oliveira, D. C.; Tomasz, A.; Lencastre, H. Secrets of sucess of a human pathogen:
molecular evolution of pandemic clones of methicilin- resistant S. aureus. Lancet
Infectious Disease, v. 2, p. 180– 189, 2002.
Oliveira, D. C.; Milheirico, C.; de Lencastre, H. Redefining a structural variant of
staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec type VI. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, v. 50, p. 3457– 3459, 2006.
Omoe, K.; Ishikawa, M.; Shimoda, Y.; Hu, D. L.; Ueda, S.; Shinagawa, K. Detection
of seg, seh or sei genes in S. aureus isolates and harboring seg, seh or sei genes.
Journal of Clinical Microbiology, v. 40, p. 857- 862, 2002.
Omoe, K.; Hu, D. L.; Omoe, H. T.; Nakane, A.; Shinagawa, K. Comprehensive
analysis of classical and newly described staphylococcal superantigen toxin genes in
S. aureus isolates. FEMS Microbiology Letters, v. 246, p. 191-198, 2005.
Ortiz, J. H. T.; Quintanilla, J. C.; Porras, A. A.; Tataje, J. F., Quintana, G. H.; Allison,
H. G. Resistencia a clindamicina inducida por eritromicina en Staphylococcus aureus
aislados de tres hospitales de Lima, Perú. Acta Médica Peruana, v. 26, p. 12 - 16,
2009.
Paladino, J. A. Linelozid: an oxazolidinone antimicrobial agent. American Journal
Health System Pharmacological, v. 59, p. 2413 - 2425, 2002.
Palavecino, E. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus
infections. Clinical Laboratory Medicine, v. 24, p. 403 - 418, 2004.
Palmqvist, N.; Foster, T.; Tarkowski, A.; Josefsson, E. Protein A is a virulence factor
in S. aureus arthritis and septic death. Microbial Pathogenesis, v. 33, p. 239 - 249,
2002.
Pereira, M. L.; Carmo, L. S.; Santos, E. J.; Pereira, J. L.; Bergdoll, M. S. Enterotoxin
H in staphylococcal food poisoning. Journal of Food Protection, v. 59, p. 559 - 561,
1996.
Pereira, M. L.; Pereira, J. L.; Serrano, A. M.; Bergdoll, M. S. Estafilococos: Até onde sua importância em alimentos? Higiene Alimentar, v. 14, p. 32 - 39, 2000.
Pereira, V.; Lopes, C.; Castro, A.; Silva, J.; Gibbs, P.; Teixeira, P.; Characterization
for enterotoxin production, virulence factors and antibiotic susceptibility of S. aureus
isolates from various foods in Portugal. Food Microbiology, v. 26, p. 278 - 282, 2009.
96
Peresi, J. T. M.; Almeida, I. A. Z. C.; Cardiga, E. A.; Marques, D. F.; Carnicel, F. A.;
Hofmann, F. L. Susceptibilidade antimicrobiana de cepas de Staphylococcus aureus
e Salmonella spp. isoladas de alimentos envolvidos em surtos de doenças
bacterianas transmitidas por alimentos, ocorridos na região noroeste do Estado de
São Paulo, no período de abril de 1990 a dezembro de 2003. Revista Instituto Adolfo
Lutz, v. 65, p. 112 - 117, 2006.
Pesavento, G.; Ducci, B.; Comodo, N.; Nostro, A. Antimicrobial resistance profile of
S. aureus isolated from raw meat: a research for methicillin resistant S. aureus
(MRSA). Food Control, v. 18, p. 196 – 200, 2007.
Pfaller, M. A.; Hollis, R. J.; Sader, H. S. Chomosomal restriction fragment analisys
by pulsed-field gel electrophoresis. In: Isemberg, H.D, Editor. Clinical microbiology
procedures handbook. American Society for Microbiology, p. 1–12, 1992.
Pinchuk, I. V.; Beswick, E. J.; Reyes, V. E. Staphylococcal enterotoxins. Toxins, v. 2,
p. 2177- 2197, 2010.
Pinto, F. G. S.; Souza, M.; Saling, S.; Moura, A. C. Qualidade microbiológica do
queijo Minas frescal comercializado no município de Santa Helena, PR, Brasil.
Arquivo do Instituto de Biologia, v.78, p.191-198, 2011.
Pottumarthy, S.; Fritsche, T. R.; Jones, R. N. Evaluation of alternative disk diffusion
methods for detecting mecA-mediated oxacillin resistance in an international
collection of staphylococci: validation report from the SENTRY antimicrobial
surveillance program. Diagnostic Microbiology Infectious Disease, v. 51, p. 57 – 62,
2005.
Pu, S.; Han, F.; Ge, B. Isolation and Characterization of Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus Strains from Louisiana Retail Meats. Applied and
Environmental Microbiology, v. 75, p. 265– 267, 2009.
Purcell, K., J. Fergie, M. D. Peterson. Economic impact of the community-acquired
methicillin-resistant Staphylococcus aureus epidemic on the Driscoll Children's
Health Plan. Pediatr. Infectious Disease Journal, v. 25, p. 178- 180, 2006.
Quintana, R. C.; Carneiro, L. C. Avaliação das condições higiênico-sanitárias dos
queijos minas frescal e mussarela produzidos na cidade de Morrinhos – GO. Revista
Brasileira de Saúde Produção Animal, v.8, p. 205-211, 2007.
Rall, V. L. M.; Vieira, F. P.; Rall, R.; Vieitis, R. L.; Fernandes Jr., A.; Candeias, J. M. G.; Cardoso, K. F. G.; Araújo Jr, J. P. PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in S. aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Veterinary Microbiology, v. 132, p. 408- 413, 2008.
97
Rapini, L. S.; Teixeira, J. P.; Martins, N. E. Perfil antimicrobiano de cepas de
Staphylococcus sp. isoladas de leite cru de cabra, queijo e manipuladores. Revista
Higiene Alimentar, v. 17, p. 162, 2003.
Rapini, L. S.; Teixeira, J. P.; Martins, N. E. Perfil de resistência antimicrobiana de
cepas de Staphylococcus sp. isoladas de queijo tipo coalho. Arquivo Brasileiro de
Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 56, p. 130 -133, 2004.
Rasooly, A.; Rasooly, R. S. Detection and analysis of staphylococcal enterotoxin A in
food by Western immunoblotting. International Journal of Food Microbiology, v. 41,
p. 205 – 212, 1998.
Ravel, R. Laboratório Clínico. Aplicações Clínicas dos dados laboratoriais, 6 ed.
Guanabara Kogan p. 162 - 163, 1997.
Rodriguez, C. A.; Vesga, O. Staphylococcus aureus resistente a vancomicina.
Biomédica, v. 25, p. 575 - 587, 2005.
Rossi, F.; Andreazzi, D. B. Resistência bacteriana: interpretando o antibiograma.
Atheneu; 2005.
Rybak, M. J.; LaPlante, K. L. Community-associated methicillin-resistant S. aureus: a
review. Pharmacotherapy, v. 25, p. 74 – 85, 2005.
Sá, M. E. P.; Cunha, M. S. R. S.; Elias, A. O.; Victoria, C.; Langoni, H. Importância do
Staphylococcus aureus nas mastites subclínicas: pesquisa de enterotoxinas e toxina
do choque tóxico, e a relação com a contagem de células somáticas. Brazilian
Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 41, p. 321- 326, 2004.
Sabioni, J. G.; Hirooka, E. Y.; Souza, M. L. R. Intoxicação alimentar por queijos tipo
Minas frescal contaminado com Staphylococcus aureus. Revista Saúde Pública,
v. 22, p. 458- 461, 1988.
Sabioni, J. G.; Intoxicação estafilocócica causada por queijo tipo minas em Ouro
Preto – MG. Higiene Alimentar, v. 8, p. 22 – 23, 1994.
Sakoulas, G.; Moise-Broder, P. A.; Schenta, G. J.; Forrest, A.; Moellering, R. C. Jr.;
Eliopoulos, G. M. Relationship of MIC and bactericidal activity to efficacy of
vancomycin for treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia.
Journal Clinical of Microbiology, v. 42, p. 2398 - 2402, 2004.
Salotti, B. M.; Carvalho, A.C.F.B.; Amaral, L. A.; Vidal-Martins, A. M. C.; Cortez, A. L.
Qualidade Microbiológica do queijo Minas frescal comercializado no município de
Jaboticabal, SP, Brasil. Arquivo do Instituto de Biologia, v.73, p.171-175, 2006.
98
Santana, E. H. W.; Beloti, V.; Aragon, A. L. C.; Mendonça, M. B. O. C. Artigo de
revisão: Estafilococos em alimento. Arquivo do Instituto de Biologia, v. 77, p. 545 -
554, 2010.
Santos, A. L; Santos, D. O; Freitas, C. C.; Ferreira, B. L. A.; Afonso, I. F.; Rodrigues,
C. R.; Castro, H. C. Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de importância
hospitalar. Jornal Brasileiro de Patologia Médica Laboratorial; v. 43, p. 413-423,
2007.
Schelin, J.; Wallin-Carlquist, N.; Cohn, M. T.; Lindqvist, R.; Barker, G. C.; Rådström,
P. The formation de S. aureus enterotoxin in food environments and advances in
risk assessment. Virulence, v. 2, p. 580 – 592, 2011.
Schito, G. C. The Importance of the Development of Antibiotic Resistance in
Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection, v. 12, p. 3 – 8, 2006.
Senger, A. E. V; Bizani, D. Pesquisa de Staphylococcus aureus em queijo minas
frescal, produzido de forma artesanal e industrial, comercializado na cidade de
Canoas/RS, Brasil. Revista de Ciências Ambientais, v.5, p. 25 - 42, 2011.
Senna, J. P. M. ; Pinto, C. A. ; Santos, D. S. Comparison of Pulsed-Field Gel
Electrophoresis and PCR Analysis of Polymorphisms on the mec Hypervariable
Region for Typing Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical
Microbiology, v. 40, p. 2254-2256, 2002.
Shanehbandi, D.; Baradaran,B.; Sadigh-Eteghad, S.; Zarredar, H. Occurrence of
Methicillin Resistant and Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in Traditional
Cheeses in the North West of Iran. ISRN Microbiology. Hindawi Publishing
Corporation, 2014.
Sharp, S. E,; Warren, J. A,; Thomson, R. B. Cefoxitin disk diffusion screen for
confirmation of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates and utility in the
clinical laboratory. Diagnostic Microbiology Infectious Disease, v. 51, p. 69–71, 2004.
Shopsin, B.; Gomez, M.; Montgomery, S. O.; Smith, D. H.; Waddington, M.; Dodge,
D. E.; Bost, D. A.; Riehman, M.; Naidich, S.; Kreiswirth, B. N. Evaluation of protein A
gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus
strains. Journal of Clinical Microbiology, v. 37, p. 3556 – 3563, 1999.
Shopsin, B.; Mathema, B.; Martinez, J.; Campo, M. L.; Fierman, A.; Krasinski, K.;
Kornblun, J.; Alcabes, P.; Waddington, M.; Riehman, M.; Kreiswirth, B. N. Prevalence
of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in the
community. Journal Infectious Disease, v. 182, p. 359 - 362, 2000.
99
Shopsin, B.; Herring, S.; Kreiswirth, B. N. Hospital acquired and community derived:
the future of MRSA. Clinical Infectious Disease, v.57, p. 151-152, 2003.
Shore, A. C.; Deasy, E. C.; Slickers, P.; Brennan, G.; O'Connell, B.; Monecke, S.;
Ehricht, R.; Coleman, D. C. Detection os Staphylococcal Cassette Chromosome mec
type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mec R1, blaZ e ccr genes in human
clinical isolates of clonal complex methicillin-resistant S. aureus. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, v. 55, p. 3765 – 3773, 2011.
Siberry, G. K.; Tekle, T.; Carroll, K.; Dick, J. Failure of clindamycin treatment of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin
resistance in vitro. Clinical Infectious Disease v. 37, p. 1257 – 1260, 2003.
Silva, E. R.; Boechat, J. U. D; Martins, J. C. D.; Hemolysin production by
Staphylococcus aureus species isolated from mastitic goat milk in Brazilian dairy
herds. Small Ruminant Research, v. 56, p. 271–275, 2005.
Silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F. A.; Taniwaki, M. H.; Santos, R. F. S.; Gomes, R. A. R. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos e Água. 4ª edição Livraria Varela, 2010.
Silva-Carvalho, M. C.; Bonelli, R. R.; Souza, R. R.; Moreira, S.; dos Santos, L. C.; de
Souza, M. C.; de Mello Junior, S. J.; Carballido, J. M.; Rito, P. N.; Vieira, V. V.;
Teixeira, L. A.; Sá Figueiredo, A. M. Emergence of multiresistant variants of the
community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineage ST1
SCCmec IV in two hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. Diagnostical Microbiology
Infectious Disease, v. 65, p. 300 - 305, 2009.
Silveira, P. G.; Nome, F.; Gesser, J. C.; Sá, M. M. Estratégias utilizadas no combate
à resistência bacteriana. Quimica Nova. v. 29, p. 844 - 855, 2006.
Soriano, J. M.; Font, G.; Moltó, C.; Mañes, J. Enterotoxigenic staphylococci and their
toxins in restaurant foods. Trends in Food Science and Technology, v. 13, p. 60 - 67,
2002.
Souza, M. S.; Reis, C.; Pimenta, F. C. Revisão sobre a aquisição gradual de
resistência de Staphylococcus aureus aos antimicrobianos. Revista de Patologia
Tropical. v. 34, p. 27 - 36, 2005.
Spanu, V., Spanu, C., Virdis, S., S. Cossu., Scarano, C. Virulence factors and
genetic variability of S. aureus strains isolated from raw sheep’s milk cheese.
International Journal of Food Microbiology, v. 153, p. 53 - 57, 2012.
100
Stamford, T. L. M.; Silva, C. G. M.; Mota, R. A.; Neto, A. C. Enterotoxidade de
Staphylococcus spp. isolados de leite in natura. Revista de Ciência e Tecnologia de
Alimentos, v. 26, p. 41- 45, 2006.
Stevens, D. L. The role of vancomycin in the treatment paradigm. Clinical Infectious
Disease, v. 42, p. S51- S57, 2006.
Steward, C. D.; Raney, P. M., Morrel, A., K.; Williams, P. P.; Mc Dougal, L. K.;
Tenover, F. C. Testing for induction of clindamycin resistance in erytromicin-resistant
of S. aureus. Journal of Clinical Microbiology. v. 43, p. 1716 – 1721, 2005.
Su, Y. C.; Wong, A. C. L. Current perspectives on detection of Staphylococcal
enterotoxins. Journal of Food Protection, v. 60, p. 195 - 202, 1997.
Swenson, J. M.; Tenover, F. C. Results of disk diffusion testing with cefoxitin
correlate with presence of mecA in Staphylococcus spp. Journal of Clinical
Microbiology, v. 43, p. 3818 - 3823, 2005.
Tamura, K.; Stecher, G.; Peterson, D.; Filipski, A.; Kumar, S. MEGA6: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, v. 30,
p. 2725 - 2729, 2013.
Teixeira, L. A.; Resende, C. A.; Ormonde, L. R.; Rosenbaum, R.; Figueiredo, A. M.; De Lencastre, H.; Tomasz, A. Geographic spread of epidemic multiresistant S. aureus clone in Brazil. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, p. 2400 – 2404,
1995.
Tenover, F. C., R. Arbeit, G. Archer, J. Biddle, S. Byrne, R. Goering, G. Hancock, G.
A. Hebert, B. Hill, R. Hollis, W. R. Jarvis, B. Kreiswirth, W. Eisner, J. Maslow, L. K.
McDougal, J. M. Miller, M. Mulligan, and M. A. Pfaller. Comparison of traditional and
molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical
Microbiology, v. 32, p. 407– 415, 1994.
Tenover, F. C.; Arbeit, R. D.; Goering, R. V.; Mickelsen, P. A.; Murray, B. E.; Persing, D. H.; Swaminathan, B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, p. 2233 – 2239, 1995.
Tenover, F. C.; Weigel, L. M.; Appelbaum, P. C.; McDougal, J.; Chaitram, S.;
McAllister,; N. Clark,; G. Killgore, C. M.; O'Hara, L.; Jevitt, J. B.; Patel,
B.Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus isolate from a Patient in
Pennsylvania, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, p. 275 – 280, 2004.
101
Tizotti, M. K.; Horner, R.; Kempfer, C. B.; Martini, R.; Mayer, L. E.; Roehrs, M.;
Rodrigues, M. A.; Kuhn, F. T.; Veit, A. R.; Santos, S. O. Prevalência e perfil de
sensibilidade em um hospital escolar na cidade de Santa Maria, Brasil. Revista
Saúde, v. 36, p. 47–56, 2010.
Tondo, E. C.; Guimarães, M. C. M.; Henriques, J. A. P.; Ayub, M. A. Z. Assessing
and analysing contamination of a dairy products processing plant by S. aureus using
antibiotic resistance and PFGE. Canadian Journal of Microbiology, v. 46, p.1108–
1114, 2000.
Tremaine, M. T., Brockman, D. K., Betley; M. J. Staphylococcal enterotoxin A gene
(sea) expression is not affected by the accessory gene (agr). Infection and Immunity,
v. 61, p. 356 - 359, 1993.
Turlej, A.; Hryniewicz, W.; Empel, J. Staphylococcal Cassette Chromosome mec
(SCCmec) classification and typing methods: an overview. Polish Journal of
Microbiology, v. 60, p. 95-103, 2011.
Vandenesch, F.; Naimi, T.; Enright, M. C.; Lina, G.; Nimmo, G. R.; Heffernan, H.;
Liassine, N.; Bes, M.; Greenland, T. Community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide
emergence. Emerging Infectious Disease, v. 9, p. 978 – 984, 2003.
Vanderhaeghen, W.; Hermans, K.; Haesebrouck, F.; Butaye, P. Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) in Food Production Animals. Epidemiology
Infectious, v. 138, p. 606-625, 2010.
Velasco, D.; Tomas, M. M,; Cartelle, M,; Beceiro, A,; Perz, A,; Molina, F. Evaluation
of different methods for detecting methicillin (oxacillin) resistance in Staphylococcus
aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 55, p. 379-382, 2005.
Velaquez, J.; Lizaraso, F.; Wong, W.; Alfaro, C.; Véliz, J.L.; Salazar, J.; Larrea, H.;
Gamarra, J.; Smaquispe, R. Vigilancia de la resistencia de Staphylococcus aureus a
la oxacilina-vancomicina y patrones de corresistencia. Revista Sociedade Medica
Internacional, v. 15, p. 345-348, 2002.
Veras, J. F.; Santos, D. A.; Carmo, L. S.; Fernandes, T. M. G.; Azalim, C. C.; Silva, M. C. C.; Martins, R. T.; Cerqueira, M. M.O.P. Levantamento de surtos de toxinfecção alimentar envolvendo leite e produtos derivados no estado de Minas Gerais, Brasil. Higiene Alimentar, v. 17, p. 218 – 219, 2003.
Veras, J. F.; Carmo, L. S.; Tong, L. C.; Shupp, J. W.; Cummings, C.; Santos, D. A.; Cerqueira, M. M. O. P.; Cantini, A.; Nicoli, J. R.; Jett, M. A study of the enterotoxigenicity of coagulase- positive and coagulase- negative staphylococcal
102
isolates from poisoning outbreaks in MG, Brazil. International Journal of Infectious Diseases, v. 12, p. 410 - 415, 2008.
Vernozy-Rozand, C.; Mazuy-Cruchaudet, C.; Bavai, C.; Richard, Y. Comparison of
three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food.
Letters in Applied Microbiology, v. 39, p. 490– 494, 2004.
Von Rheinbaden, K. E.; Hadlok, R. M. Rapid distinction between micrococci and
staphylococci with furazolidone agars. Antonie van Leeuwenhoek, v. 47, p. 41- 51,
1981.
Wannet, W. J.; Spalburg, E.; Heck, M. E.; Pluister, G. N.; Tiemersma, E.; Willems, R.
J.; Etienne, J. Emergence of virulent methicillin-resistant Staphylococcus aureus
strains carrying Panton-Valentine leucocidin genes in The Netherlands. Journal of
Clinical Microbiology, v. 43, p. 3341- 3345, 2005.
Watanabe, E. T.; Ribeiro, A. R.; Silva, J. B.; Garino Junior, F.; Costa, E. O. A
valiação in vitro e in vivo da eficiência dos antimicrobianos no tratamento de casos
de mastite clínica bovina. Revista Napgama, v. 4, p. 9 - 14, 2001.
Weisblum, B. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, v. 39, p. 577- 585, 1995.
Weller, T. M. A. Methicilin-resistant S. aureus typing methods: which should be the
international standard? Journal of Hospital Infection, v. 44, p.160- 172, 2000.
World Health Organization (WHO) Food Safety and foodborne illness. Disponível em
http:// www.who.int.inf-fs/en/fact 237 html, 2013. Acessado em 21/5/2012
Wong, A. C. L.; Bergdoll, M. S. Staphylococcal food poisoning. 2º Ed. Amsterdan.
Academic Press, In: Cliver, D.O.; RieMann, H. P. Foodborne diseases, p. 231-248,
2002.
Yucel, N.; Citak, S.; Bayhün, S. Antimicrobial resistance profile of Staphylococcus
aureus isolate from clinical samples and foods of animal origin. Foodborne
pathogens and disease, v. 8, p. 427- 431, 2011.
Zecconi, A.; Hahn, G. S. aureus in raw milk and human health risk. Bulletin of the
International Dairy Federation, v. 345, p.15 -18, 2001.
Zelazny, A. M.; Ferraro, M. J.; Glennen, A.; Hindler J. F.; Mann, L. M.; Munro,
S.; Murray, P. R.; Reller, L. B.; Tenover, F. C.; Jorgensen, J. H. Selection of Strains
for Quality Assessment of the Disk Induction Method for Detection of Inducible
Clindamycin Resistance in Staphylococci: a CLSI Collaborative Study. Journal of
Clinical Microbiology, v. 43, p. 2613 - 2615, 2005.
103
Zhang, K.; Sparling, J.; Chow, B. L., Elsayed, S., Hussain, Z., Church, D. L.,
Gregson, D. B., Louie, T., Conly J. M. New Quadriplex PCR Assay for Detection of
Methicillin and Mupirocin Resistance and Simultaneous Discrimination of
Staphylococcus aureus from Coagulase-Negative Staphylococci. Journal of Clinical
Microbiology, vol. 42, p. 4947- 4955, 2004.
Zhang, K.; McClure, J. A.; Elsayed, S.; Louie, T.; Conly, J. M. Novel multiplex PCR
assay for characterization and concomitant subtyping of Staphylococcal cassette
chromosome mec types I to V in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.
Journal of Clinical Microbiology, v. 43, p. 5026-5033, 2005.
Zhang, K.; McClure, J. A.; Elsayed, S.; Louie, T.; Conly, J. M. Novel Multiplex PCR
assay for simultaneous Identification of Community-Associated Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus strains USA300 and USA400 and detection of mecA and
Panton-Valentine Leukocidin genes, with discrimination of Staphylococcus aureus
from coagulase-negative staphylococci. Journal of Clinical Microbiology, vol. 46, p.
1118–1122, 2008.
Zhang, K.; McClure, J. A.; Elsayed, S.; Conly, J .M. Novel staphylococcal cassette
chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and
type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, p. 531– 540,
2009.
Zinke, C.; Winter, M.; Mohr, E.; Krömker, V. Occurrence of Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus in Cheese Produced in German Farm-Dairies. Advances in
Microbiology, v. 2, p. 629 - 633, 2012.
Zong, Z.; Peng, C.; Lü, X. Diversity of SCCmec Elements in Methicillin-Resistant
Coagulase-Negative Staphylococci Clinical Isolates. PLoS One, v. 6, p. 201-291,
2011.
104
9. ANEXOS
Gel de agarose (1%) com os produtos da PCR obtidos a partir da amplificação gene
mecA das cepas MRSA isoladas.
1- Kb, 2- controle negativo S. epidermidis (ATCC 12228), 3- cepa Q28/271, 4- cepa
Q28/273, 5- cepa Q28/276, 6- cepa Q28/280, 7- controle positivo – HU25 (BEC).
Gel de agarose 1% com os produtos da PCR obtidos a partir da amplificação do
gene 16S rrnaStaph das cepas MRSA isoladas.
1- Kb, 2- cepa Q28/271, 3- Q28/273, 4- Q28/276, 5- Q28/280.
105
Gel de agarose (1%) com os produtos da PCR obtidos a partir da amplificação dos
genes das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE das cepas MRSA isoladas.
1 – controle negativo S. epidermidis (ATCC 12228), 2- cepa Q28/271, 3- cepa
Q28/273, 4- cepa Q28/276, 5- cepa Q28/280, 6- controle positivo SEA (ATCC
13565), 7- S. epidermidis (ATCC 12228), 8- cepa Q28/271, 9- cepa Q28/273, 10-
cepa Q28/276, 11- cepa Q28/280, 12- controle positivo SEB (ATCC 14458), 13-
S epidermidis (ATCC 12228), 14- cepa Q28/271, 15- cepa Q28/273, 16- cepa
Q28/276, 17- cepa Q28/280, 18- controle positivo SEC (ATCC 19095), 19- Kb, 20-
S. epidermidis (ATCC 12228), 21- cepa Q28/271, 22- cepa Q28/273, 23- cepa
Q28/276, 24- cepa Q28/280, 25- controle positivo SED (ATCC 23235), 26-
S. epidermidis (ATCC 12228), 27- cepa Q28/271, 28- cepa Q28/273, 29- cepa
Q28/276, 30- cepa Q28/280, 31- controle positivo SEE (ATCC 27664), 32 – Kb.
106
Perfis eletroforéticos em gel de agarose 1%, obtidos através da PFGE pela digestão da endonuclease de restrição SmaI das cepas MRSA isoladas. 1 – Marcador de peso molecular, 2 - cepa Q28/271, 3- cepa Q28/276, 4- cepa Q28/280, 5- cepa Q28/273.
107
Gel de agarose (2%) da mPCR dos SCCmec tipos I a V das cepas MRSA isoladas. 1 - Kb, 2 – Tipo I (cepa S. aureus cedida pelo LEMB), 3 – Tipo II (US100), 4 – Tipo III (HU25), 5 – Tipo IVa (WB45), 6 – Tipo IVb (FPR), 7 – Tipo V (cepa S. aureus cedida pelo LEMB), 7 – cepa Q28/271, 8 – cepa Q28/273, 9 – cepa Q28/276, 10 – cepa Q28/280, 11 – controle negativo (água MiliQ).
