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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA DANIELA GRECO GARCIA FERNANDES DETECÇÃO LABORATORIAL DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ENTRE AMOSTRAS DE Klebsiella pneumoniae ISOLADAS NO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ANTÔNIO PEDRO TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS Niterói 2019
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
DANIELA GRECO GARCIA FERNANDES
DETECÇÃO LABORATORIAL DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ENTRE
AMOSTRAS DE Klebsiella pneumoniae ISOLADAS NO HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO ANTÔNIO PEDRO
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS
Niterói
2019
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DANIELA GRECO GARCIA FERNANDES
DETECÇÃO LABORATORIAL DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ENTRE
AMOSTRAS DE Klebsiella pneumoniae ISOLADAS NO HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO ANTÔNIO PEDRO
Trabalho de conclusão de curso apresentado
ao Curso de Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense como
requisito para obtenção do Grau de
Bacharel. Área de Concentração: Análises
Clínicas
Orientadora: Profa. Dra. Cláudia R. V. de Mendonça Souza
Coorientador: Prof. Dr. Thiago Pavoni Gomes Chagas
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Niterói
2019
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DANIELA GRECO GARCIA FERNANDES
DETECÇÃO LABORATORIAL DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ENTRE
AMOSTRAS DE Klebsiella pneumoniae ISOLADAS NO HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO ANTÔNIO PEDRO
Trabalho de conclusão de curso apresentado
ao Curso de Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense como
requisito para obtenção do Grau de
Bacharel. Área de Concentração: Análises
Clínicas
Aprovada em 13 de dezembro de 2019.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Cláudia R. V. de Mendonça Souza - Orientadora - UFF (Titular)
_____________________________________________________________ MsC Stephanie Gomes Chuster – Hospital Icaraí
(Titular)
_____________________________________________________________ MsC Ivson Cassiano de Oliveira Santos - FIOCRUZ
(Titular)
_____________________________________________________________
Profa Dra. Rachel Leite Ribeiro - UFF (Suplente)
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DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus pais, Rosana e Sérgio Luiz, meus exemplos de
determinação, coragem, amor e força.
À minha avó Noemia por todo apoio, amor e motivação em toda trajetória
acadêmica.
Aos meus avós, Salvador, Jaci e Wilson (in memorian), que não podem estar ao
meu lado neste momento tão importante, que sempre serão grandes exemplos de
dignidade e caráter para mim!
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço aos meus pais Sérgio Luiz e Rosana e minha avó
Noemia por todo carinho, apoio e força que recebi ao longo desses anos. Sem vocês,
com certeza eu não teria chegado até aqui! Obrigada!
Aos professores doutores Cláudia Souza e Thiago Chagas, pela orientação,
confiança e apoio durante o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço por tudo!
Ao meu irmão e minha família, agradeço por tudo! Vocês foram meu apoio
nessa caminhada!
Ao Felipe Piauí, por toda compreensão e apoio durante esses anos junto comigo
nessa caminhada! Obrigada por ter aguentado meu estresse diário nessa reta final! Você
é meu parceiro e estava comigo em todos os momentos! Obrigada!
À minha irmã de outra mãe, Ana Luiza Sousa, obrigada por ser você e estar
comigo sempre! Tenho certeza que sem você, minha caminhada teria sido muito mais
difícil! Obrigada por tudo!!
Aos meus amigos mais antigos, Matheus Mota, Gabriel Damasceno e Rafael
Castro, agradeço a companhia e a amizade de vocês! Obrigada!
À Marcela da Costa, a primeira pessoa com quem esbarrei na Biomed UFF,
minha primeira amiga, muito especial e amada! Obrigada por todas as conversas de
apoio!
À Raissa Ferreira, Natália Rimes, Sofia Latgé, sem dúvidas nós formamos o
melhor quarteto da UFF! Obrigada amigas! Com certeza, a caminhada até aqui foi
muito melhor com cada uma de vocês ao meu lado!
Ao Renan Faustino, meu amigo e dupla de ECO I, quanta brincadeira, quanto
companheirismo durantes todas as manhãs do nosso último período de faculdade
juntos... Obrigada por fazer esse momento mais leve e alegre!
Ao Arthur Souto, não poderia deixar de agradecer o deuso master da 2015.2!! A
pessoa mais incrível e amável que conheci! Só tenho a agradecer por ter sua amizade,
amigo!
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À turma 2015.2 por todo companheirismo! Sem vocês a faculdade não seria a
mesma! Eu não poderia ter escolhido turma melhor! Vocês foram incríveis!! Obrigada!!
À Maikeline, Jéssica e Andréia por toda ajuda em cada etapa desse trabalho.
Muito obrigada meninas!
À Stephanie Chuster e Ana Paula Rodrigues por todo apoio e disposição em
ajudar, nesse meu final de curso! Obrigada por tudo!
À Profª Renata Picão e ao Jhonatha Rodrigo Cordeiro, do Laboratório
de Investigação em Microbiologia Médica/UFRJ, pela ajuda com os testes de
microdiluição em caldo e com a confirmação da identificação das amostras pelo
MALDI-TOF MS.
À Ana Paula Carvalho-Assef, do Laboratório de Pesquisa em Infecção
Hospitalar/LAPIH/Fiocruz, pela ajuda com o método Policimbac.
À Drª Viviane Zahner do laboratório de entomologia médica e forense/LEMEF
pela ajuda nos testes genotípicos, pela oportunidade e apoio na realização deste
trabalho.
Aos profissionais da Rotina Laboratorial de Microbiologia, do Serviço de
Patologia do Hospital Universitário Antônio Pedro, em especial ao Douglas e Natália;
obrigada pela ajuda e solicitude prestadas durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores da UFF e a Coordenação do Curso de Biomedicina, que me
transmitiram seu valioso conhecimento.
Agradeço a todos que me acompanharam e apoiaram nesses quatro anos de
universidade, e a todos que contribuíram na elaboração deste trabalho. Muito obrigada!
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“A diferença entre ganhar e perder,
na maioria das vezes, é não desistir.”
(DISNEY, W; 1901-1966)
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RESUMO
A família Enterobacteriaceae contém alguns dos principais gêneros isolados em amostras biológicas que estão associados às infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), bem como a infecções adquiridas na comunidade. Para tratamento de infecções
causadas por essas bactérias os β-lactâmicos são uma das principais opções, porém a resistência a múltiplos antimicrobianos, incluindo aos carbapenêmicos, vem crescendo
abruptamente, particularmente entre as enterobactérias e em especial, entre amostras de K. pneumoniae. Devido à dificuldade e limitação de opções terapêuticas para o tratamento de infecções por Gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos, as
polimixinas tornaram a ser consideradas opções de tratamento importantes pela escassez de novos antimicrobianos com ação contra esses microrganismos. Entretanto,
consequentemente ao aumento do uso das polimixinas, a resistência a esses fármacos tem emergido no mundo, nos últimos anos, entre cepas de K. pneumoniae e outros Gram-negativos. A implementação de ferramentas de triagem rápidas e confiáveis para
detectar e analisar patógenos resistentes à colistina de forma a se adotar medidas d e precaução de contato e adaptação do tratamento do paciente é uma abordagem
necessária. A microdiluição em caldo é considerada o método de referência para verificação dessa resistência, através da determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMIs) frente a polimixina, porém é um método demorado e muito laborioso
e por isso não muito adequado para as rotinas clínicas. O presente estudo teve como objetivo geral comparar métodos de detecção fenotípica de resistência a polimixina
entre 17 amostras clínicas de K. pneumoniae, de uma coleção de amostras previamente caracterizadas como sendo resistentes (n=11) e sensíveis a polimixinas (n=6), obtidas de pacientes atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro, no período de maio de
2018 a junho de 2019. A identificação das amostras foi confirmada através de MALDI-TOF MS. Os métodos alternativos analisados foram: o sistema comercial Policimbac®,
o sistema automatizado BD Phoenix™, o teste epsilométrico Etest® e o ágar Superpolimixina®. Também foram realizados testes de Hodge Modificado e o Método de Inibição do Carbapenêmico CIM, para detecção de amostras produtoras de
carbanemases. A detecção genotípica dos genes blaKPC, blaNDM-1, blaOXA-48-like e mcr1-5 foi realizada através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). A produção de
carbapenemase foi observada em 84,6% (11/17) dos isolados pelos testes fenotípicos, sendo que 70,6% das 17 cepas foram positivas para o gene blaKPC; 5,9%, para o gene blaNDM-1 e nenhuma blaOXA-48-like. Todas as amostras foram negativas para o gene mcr,
indicando a ocorrência de mecanismos de resistência a polimixinas associados com mutações cromossômicas, entre as amostras analisadas. As taxas obtidas para
sensibilidade e especificidade, respectivamente, dos métodos alternativos em comparação ao padrão-ouro foram as seguintes: Policimbac (92,8% e 66,7%), Etest (86% e 100%), Ágar Superpolimixina (85% e 100%) e BD Phoenix (78,6% e 100%).
Os resultados revelaram discrepâncias entre os métodos testados, levando à necessidade de mais estudos, com um número maior de amostras, para melhor avaliação do
desempenho desses métodos.
Palavras-chave: Klebsiella pneumoniae. Resistência a polimixinas. Detecção
laboratorial.
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ABSTRACT
The Enterobacteriaceae family contains some of the main genres isolated in biological
testing that are associated with healthcare-related infections (HAI) as well as community-acquired infections. For the treatment of infections caused by these bacteria,
β-lactams are one of the main options, but resistance to multiple antimicrobials, including carbapenems, has been growing sharply, particularly among enterobacteria and especially among K. pneumoniae samples. Due to the difficulty and limitation of
therapeutic options for the treatment of carbapenem-resistant gram-negative infections, polymyxins are once again considered important treatment options due to the scarcity of
new antimicrobials acting against these microorganisms. However, as polymyxins have increased in use, resistance to these drugs has emerged worldwide in recent years among K. pneumoniae and other Gram-negative strains. Implementing fast and reliable
screening tools to detect and analyze colistin-resistant pathogens in order to adopt contact precautionary measures and adapt patient treatment is a necessary approach.
Broth microdilution is considered the reference method for checking this resistance through the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) against polymyxin, but it is a time consuming and laborious method and therefore not very
suitable for clinical routines. The present study aimed to compare phenotypic polymyxin resistance detection methods among 17 clinical samples of K. pneumoniae,
from a collection of isolates previously characterized as resistant (n=11) and sensitive (n=6) to polymyxins, obtained from patients treated at the University Hospital Antônio Pedro, from May 2018 to June 2019. The isolates identification was confirmed by
MALDI-TOF MS. The alternative methods analyzed were: the commercial Policimbac® system, the BD Phoenix ™ automated system, the Etest® epsilometric test
and the Superpolimixina® agar. Modified Hodge tests and the CIM Carbapenemic Inhibition Method were also performed to detect carbanemases producing samples. Genotypic detection of the blaKPC, blaNDM-1, blaOXA-48-like and mcr1-5 genes was
performed by Polymerase Chain Reactions (PCR). Carbapenemase production was observed in 84.6% (11/17) of the isolates by phenotypic tests, and 70.6% of the 17
strains were positive for the blaKPC gene; 5.9% for the blaNDM-1gene and no blaOXA-48-like. All samples were negative for the mcr gene, indicating the occurrence of polymyxin resistance mechanisms associated with chromosomal mutations among the analyzed
samples. The rates obtained for sensitivity and specificity, respectively, of the alternative methods compared to the gold standard were as follows: Policimbac (92.8%
and 66.7%), Etest (86% and 100%), Superpolymixin Agar (85%). and 100%) and BD Phoenix (78.6% and 100%). The results revealed discrepancies between the tested methods, leading to the need for more studies with a larger number of samples to better
evaluate the performance of these methods.
Keywords: Klebsiella pneumoniae. Polymyxin Resistance. Laboratorial Detection.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismos moleculares de resistência adquirida às polimixinas. L-Ara4N:
4-amino-4-arabinose; pEtN: fosfoetanolamina. Extraído de BARDET; J. (2018, pág. 2).
Figura 2. Imagem ilustrativa de Testes de Hodge Modificado: amostras positivas (sinal
positivo verde) e negativas (sinal negativo vermelho).
Figura 3. Imagem ilustrativa de testes mCIM & eCIM. À esquerda, resultado sugestivo
de cepa produtora de serino-ß-lactamase; à direita, resultado sugestivo de cepa
produtora de metalo-ß-lactamase.
Figura 4. Imagem ilustrativa do teste de microdiluição em caldo, com a determinação das concentrações mínimas inibitórias frente a Polimixina B, entre amostras de
Klebsiella pneumoniae.
Figura 5. Imagem ilustrativa do teste comercial de microdiluição em caldo
Policimbac® (Probac do Brasil). As setas indicam a amostra (de cima) com CIM = 8
µg/mL e a amostra (de baixo), com CIM = 0,5 µg/mL.
Figura 6. Imagem ilustrativa de verificação do perfil de sensibilidade à polimixina B, de uma amostra de Klebsiella pneumoniae, através do teste epsilométrico Etest®
(BioMerieux).
Figura 7. Imagem ilustrativa dos dois diferentes tipos de crescimento bacteriano,
obtidos no meio seletivo SuperPolimixina® (PlastLabor).
Figura 8. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos nos testes de Microdiluição
em Caldo in house, entre 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Figura 9. Valores de CIMs frente a colistina, obtidos no sistema automatizado BD
Phoenix, entre 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Figura 10. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos no teste comercial
Policimbac, entre 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Figura 11. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos nos testes epsilométricos
Etest, entre 17 amostras de Klebsiella pneumoniae.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características gerais das 17 amostras de Klebsiella pneumoniae isoladas de
pacientes atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro, no período de maio de
2018 a junho de 2019
Tabela 2. Comparação entre testes fenotípicos e genotípicos realizados entre as 17
amostras de Klebsiella pneumoniae
Tabela 3. Comparação entre os resultados obtidos nos testes de Microdiluição em
Caldo, Policimbac, sistema automatizado Phoenix BD e Etest, em 17 amostras de
Klebsiella pneumoniae
Tabela 4. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em
Caldo e o sistema Phoenix BD, de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Tabela 5. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em
Caldo e Policimbac, de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Tabela 6. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em
Caldo e Etest de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Tabela 7. Correlação entre os valores de CIMs obtidos para os testes Microdiluição em
Caldo e Ágar Superpolimixina de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
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LISTA DE ABREVIATURAS
AK Amicacina
AMC Amoxicilina/Ác. Clavulânico
AMP Ampicilina/Subactam
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type and Culture Collection
ATM Aztreonam
CarbR Resistente aos Carbapenêmicos
CAZ Ceftazidima
CBAC Coleção de Bactérias
CEF Cefazolina
CIM Método de Inativação do Carbapenêmico (do inglês, Carbapenem
Inactivation Method)
CIP Ciprofloxacino
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CN Gentamicina
COL Colistina
CRO Ceftriaxona
CTI Centro de Terapia Intensiva
CXM Cefuroxima
DNA Ácido Desoxirribonucleico
eCIM Método de Inativação do Carbapenêmico com EDTA do inglês, EDTA
Carbapenem Inactivation Method
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
ERC Enterobactérias Resistentes as Carbapenêmicos
ERT Ertapenem
ESBL Beta-Lactamases de Espectro Estendido (do inglês, Extended-Spectrum
Beta-Lactamases)
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FEP Cefepime
FOX Cefoxitina
HUAP Hospital Universitário Antônio Pedro
ICS Infecções da Corrente Sanguínea
IMI Imipenem
IRAS Infecções Relacionadas com a Assistência à Saúde
KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LEV Levofloxacino
mCIM Método de Inativação do Carbapenêmico Modificado (do inglês,
Modified Carbapenem Inactivation Method)
MER Meropenem
MβL Metalo-ß-lactamase
NDM Nova Deli Metalo-β-lactamase (do inglês, New Delhi Metallo-ß-
lactamase
OMS Organização Mundial de Saúde
PB Polimixina B
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
SCOPE Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SENTRY Estudo Epidemiológico: Antimicrobial Surveillance Program
SxT Trimetoprim/Sulfametoxazol
TBE Tris-Borato-EDTA
THM Teste de Hodge Modificado
TIG Tigeciclina
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
TZP Piperaciclina/Tazobactam
UFF Universidade Federal Fluminense
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 16
1.1. FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE.......................................................................... 16
1.2 KLEBSIELLA PNEUMONIAE: PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS -
LACTÂMICOS ................................................................................................................ 18
1.3 PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) .................. 18
1.4 PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES...................................................................... 19
1.5 KLEBSIELLA PNEUMONIAE & POLIMIXINAS ........................................................... 21 1.5.1 Polimixinas ....................................................................................................................................... 21 1.5.2 Mecanismo de ação à polimixina ................................................................................................. 22 1.5.3 Mecanismo de resistência à polimixina....................................................................................... 23
1.6 DETECÇÃO LABORATORIAL FENOTÍPICA DE AMOSTRAS RESISTENTES À
POLIMIXINAS................................................................................................................ 27
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 31
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 31
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................... 31
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 32
3.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................................... 32
3.2. AMOSTRAS BACTERIANAS .................................................................................. 32 3.2.1. Confirmação da Identificação das Amostras ............................................................................. 33
3.3. DETECÇÃO DE PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES...............................................332 3.3.1 Testes de Hodge Modificado (THM) ......................................................................................... 332 3.3.2. Teste de Inativação do Carbapenêmico Modificado (mCIM) ................................................. 34 3.3.3. Teste de Inativação do Carbapenêmico com EDTA (eCIM) ................................................... 35
3.4 DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ATRAVÉS DE MÉTODOS FENOTÍPICOS . 36 3.4.1. Microdiluição em Caldo in House ................................................................................................ 36 3.4.2. Microdiluição em Caldo Comercial............................................................................................. 37 3.4.3. Teste Epsilométrico ......................................................................................................................... 38 3.4.4. Meio Seletivo .................................................................................................................................... 38 3.4.5 Análise dos Dados ........................................................................................................................... 39
3.5 DETECÇÃO DOS DETERMINANTES GENÉTICOS DE RESISTÊNCIA AOS
CARBAPENÊMICOS E ÀS POLIMIXINAS. ............................................................................ 40 3.5.1. Isolamento do DNA Bacteriano .................................................................................................... 40 3.5.2 Detecção dos genes codificadores de Carbapenemases por Reações em Cadeia da
Polimerase (PCR)............................................................................................................................................ 40 3.5.3 Eletroforese em Gel de Agarose ................................................................................................... 41
4. RESULTADOS ..................................................................................................... 42
4.1. DETECÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES & DETECÇÃO DOS
DETERMINANTES GENÉTICOS DE RESISTÊNCIA AOS CARBAPENÊMICOS E ÀS POLIMIXINAS. . 42
4.2. DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ATRAVÉS DE MÉTODOS FENOTÍPICOS . 44
4.3. COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DOS TESTES FENOTÍPICOS REALIZADOS ...... 46
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 50
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 57
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 59
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
A família Enterobacteriaceae, da ordem Enterobacterales, é formada por
bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, não esporulados, oxidase negativos e
catalase positivos. As enterobactérias são fermentadores de glicose, produzindo ácidos
e/ou gás, têm a capacidade de reduzir nitratos a nitritos, a maioria possui flagelos, com
exceção de Klebsiella spp., Shigella spp. e alguns sorotipos de Salmonella sp. São
pouco exigentes quanto a nutrientes, e por isso, crescem em diversos meios de cultura,
além de serem encontradas na microbiota do trato gastrointestinal de seres humanos e
animais, facilitando a sua ampla disseminação no meio ambiente 1.
Dentre mais de 30 gêneros, destacam-se: Escherichia spp., Klebsiella spp.,
Citrobacter spp., Enterobacter spp., Salmonella spp. e Shigella spp., como sendo os
principais gêneros isolados a partir de amostras clínicas associadas às infecções
relacionadas a assistência à saúde (IRAS), bem como à infecções adquiridas na
comunidade 2. Dados do Sistema de Vigilância das Infecções Hospitalares do Estado de
São Paulo mostraram que 14% das IRAS em unidades de terapia intensiva (UTIs) foram
causadas por Klebsiella spp. no período de 2005 a 2012 3.
Segundo o grupo SCOPE-Brasil (Surveillance and Control of Pathogens of
Epidemiological Importance), K. pneumoniae foi o terceiro patógeno mais frequente
como agente causal de infecção de corrente sanguínea nos hospitais brasileiros, onde
54% delas eram resistentes às cefalosporinas de terceira geração 4.
A maior parte das infecções relacionadas à K. pneumoniae acometem pacientes
imunodeprimidos, hospitalizados e/ou com dispositivos invasivos, como sondas,
cateteres, punção venosa periférica; situações em que a possibilidade de infecção
bacteriana aumenta5. Já a colonização por K. pneumoniae em seres humanos (orofaringe
e trato intestinal) ocorre por contato com diversas fontes ambientais 6.
Atualmente, a resistência bacteriana tem trazido uma grande dificuldade no
tratamento de infecções e tem sido considerada um grave problema de saúde pública
mundial, uma vez que a resistência a múltiplos antibióticos vem crescendo
abruptamente, particularmente entre as enterobactérias e em especial, entre amostras de
K. pneumoniae 5,7.
Amostras de K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos devido à produção
de carbapenemase do tipo KPC (Carbapenemase de Klebsiella pneumoniae) têm
17
emergido e se disseminado nas últimas décadas e apresentam resistência não só aos
carbapenêmicos e a outros β-lactâmicos, mas em geral, à várias outras classes de
antimicrobianos e estão relacionadas com taxas mais elevadas de mortalidade, além de
aumento nos custos do tratamento. De acordo com a Organização Mundial da Saúde
(OMS), K. pneumoniae produtoras de KPC são patógenos que requerem prioridade no
desenvolvimento de novos antibióticos 8.
A incidência de cepas positivas para produção de KPC aumentou drasticamente
nos últimos anos; em 2001 a taxa observada era de 1% das infecções hospitalares e em
2008, chegou a 30% 2. Vários estudos relatam casos de infecções por K. pneumoniae
produtora de KPC em várias regiões do mundo, tais como Europa, Ásia, Austrália e
América do Sul 9 10; 11; 12.
Nos últimos anos, no Brasil, a emergência da resistência aos carbapenêmicos
associada à produção da carbapenemase do tipo KPC tem aumentado radicalmente. A
primeira descrição foi feita em Recife/PE, em 2006, em cepas de K. pneumoniae, e no
Rio de Janeiro, em 200913; 14. Após estes relatos, outros casos foram observados em
diversas localidades do país e vários outros trabalhos já relataram a presença dessa
carbapenemase em cepas de K. pneumoniae bem como em outras enterobactérias em
diversos estados, tais como Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, entre outros,
sendo já considerada endêmica no Brasil 15; 16; 17; 18.
K. pneumoniae produtora de carbapenemase do tipo KPC pode causar diversas
infecções tais como: infecções da corrente sanguínea, do trato urinário, pneumonia,
endocardite e sepse. Pacientes submetidos a transplantes de órgãos, ventilação
mecânica, tratamentos com agentes antimicrobianos por tempo prolongado e longo
tempo de internação apresentam um risco maior de desenvolver infecções por essas
cepas e a taxa de mortalidade entre esses pacientes pode ultrapassar 40%, em 30 dias 2.
Devido à dificuldade e limitação de opções terapêuticas para o tratamento de
infecções por Gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos, as polimixinas tornaram
a ser consideradas opções de tratamento importantes. Em um estudo do SENTRY
conduzido por Gales e colaboradores (2011), que incluiu 40.625 amostras de bacilos
Gram-negativos isoladas entre 2006 a 2009, de diversas áreas geográficas, se verificou
taxas baixas de resistência a polimixina B e a colistina, indicando essas drogas como
tendo excelente atividade contra bactérias Gram-negativas, inclusive aquelas resistentes
aos carbapenêmicos. Entretanto, também observou-se que, nos últimos anos, houve
18
uma tendência ao aumento da resistência às polimixinas, principalmente em isolados de
Klebsiella spp. isoladas de hospitais da América Latina e da região da Asiática do
Pacífico19. Em adição, um outro estudo mostrou que, entre os isolados de K.
pneumoniae, as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) frente a polimixina, foram
mais elevadas, se comparadas à CIMs de isolados de bacilos Gram-negativos não
fermentadores, com o mesmo fenótipo de resistência à polimixina 20.
1.2 KLEBSIELLA PNEUMONIAE: PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS -
LACTÂMICOS
Uma das classes de antimicrobianos mais utilizada na clínica médica é a dos β-
lactâmicos. Em bactérias Gram-negativas o principal mecanismo de resistência aos β-
lactâmicos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que promovem a degradação
do anel β-lactâmico, inativando o antimicrobiano e impedindo que ele se ligue às
transpeptidases, enzimas responsáveis pela síntese da parede celular bacteriana,
também denominadas de “Proteínas Ligadoras de Penicilina” (PBPs). Atualmente, as β-
lactamases de espectro estendido (ESBL, do inglês “Extended-Spectrum Beta-
lactamases”) e as carbapenemases, são os grupos mais preocupantes dentre as β-
lactamases, mais particularmente, o grupo das carbapenemases 21.
No entanto, além da produção de carbapenemases, outros mecanismos podem
estar envolvidos na resistência a essa classe de antibióticos, como a perda de porinas em
associação à produção de ESBL ou hiperprodução de AmpC 22.
1.3 PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASES DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL)
As cefalosporinas são antimicrobianos β-lactâmicos ligados diretamente com as
penicilinas, estruturalmente e funcionalmente, e possuem estruturas análogas
conhecidas como cefamicinas (cefoxitina). São classificadas em primeira, segunda,
terceira, quarta e quinta geração, de acordo com seu espectro de ação. Como os outros
β-lactâmicos, as cefalosporinas são inibidoras seletivas da síntese da parede celular
bacteriana. Seu mecanismo de ação é por inibição das transpeptidases, através de sua
fixação nas proteínas ligadoras de penicilina (PBPs), impedindo que a última molécula
de glicina se ligue ao quarto resíduo do pentapeptídeo, impedindo assim as ligações
cruzadas e prejudicando a formação da peptidoglicana, que compõe a parede celular 23.
19
Cepas produtoras de ESBL apresentam resistência a todas as cefalosporinas de
terceira (ceftriaxona e ceftazidima) e quarta geração (cefepime) e ao aztreonam, além de
geralmente serem resistentes as quinolonas (ciprofloxacino e levofloxacino),
aminoglicosídeos (amicacina e gentamicina) e sulfametoxazol-trimetoprin24. Essas
enzimas são inativadas por inibidores de β-lactamases, tais como, o clavulanato,
sulbactam e tazobactam, permanecendo sensíveis aos carbapenêmicos. As ESBLs são
codificadas por genes presentes em plasmídeos ou transposons, que também são
capazes de carregar genes de resistências a diversas classes de antibióticos; esse é um
dado relevante, uma vez que o isolamento de cepas produtoras de ESBL
multirresistentes é uma das causas principais de falha terapêutica, levando ao aumento
da morbidade por infecções bacterianas 7. Vários estudos relatam a ocorrência de cepas
de Klebsiella sp. produtoras de ESBLs 25; 26; 27.
1.4 PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES
Já foram descritos diversos mecanismos de resistência aos carbapenêmicos,
entre eles, o de maior importância clínica e epidemiológica entre as enterobactérias é a
produção de carbapenemases, enzimas que degradam os carbapenêmicos. As
carbapenemases são capazes de hidrolisar, além dos carbapenêmicos, outros β-
lactâmicos, como penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos 28. De acordo com
Ambler, as carbapenemases podem ser divididas em 4 grupos (A, B, C e D), de acordo
com a sua sequência de aminoácidos29. Em enterobactérias, as carbapenemases mais
encontradas são as do tipo KPC e OXA-48 (serino-β-lactamases; classes A e D,
respectivamente), bem como os tipos IMP, VIM e NDM (metalo-β-lactamases; classe
B) 30; 31.
Os antimicrobianos carbapenêmicos possuem espectro de atividade mais amplo
do que outros antibióticos β-lactâmicos. Esta classe é representada principalmente pelo
imipenem, meropenem, ertapenem e doripenem. Esses fármacos possuem em sua
estrutura um anel β-lactâmico fundido a outro anel não β-lactâmico de cinco membros,
se diferenciando das penicilinas por terem o segundo anel insaturado e conter um átomo
de carbono no lugar do átomo de enxofre. Têm o mesmo mecanismo de ação dos outros
-lactâmicos, que é o de se ligarem às PBPs, interrompendo a síntese da parede celular
bacteriana e provocando a morte dos microrganismos 23. Os carbapenêmicos eram
considerados drogas de escolha no tratamento de infecções causadas por enterobactérias
produtoras de ESBL, entretanto nos últimos anos, houve uma emergência de
20
enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos (ERCs) e, muitas vezes, produtoras de
ESBL. Essas cepas são consideradas uma ameaça à saúde pública, uma vez que causam
infecções que estão associadas com taxas mais elevadas de morbidade e mortalidade 32.
As taxas de resistência aos carbapenêmicos em K. pneumoniae no Brasil subiram de
14% em 2011, para 33% em 2012, segundo dados do Sistema de Vigilância das
Infecções Hospitalares do Estado de São Paulo 3.
Nos Estados Unidos e no Brasil, o principal mecanismo de resistência aos
carbapenêmicos em enterobactérias é a produção da carbapenemase do tipo KPC 33.
A KPC é uma carbapenemase da classe A de Ambler, que inativa os
carbapenêmicos, bem como todos os outros β-lactâmicos, identificada inicialmente em
K. pneumoniae, porém já descrita em várias outras espécies de enterobactérias, bem
como em bactérias Gram-negativas de outras famílias da ordem Enterobacteriales 21.
Essa enzima é codificada por sequências relacionadas à transposons e identificadas em
plasmídios conjugativos com alto poder de disseminação34. Amostras produtoras de
KPC se disseminaram mundialmente, devido à sua alta capacidade de conferir
resistência aos carbapenêmicos e transferência plasmidial do gene blaKPC para outras
bactérias9; 35. No Brasil, o primeiro relato de KPC foi em quatro amostras de K.
pneumoniae, isoladas de quatro pacientes internados em um Unidade de Cuidado
Intensivo, de um hospital terciário, localizado na cidade do Recife, em 200614. Desde
então, houve uma grande disseminação de amostras KPC positivas no território
nacional, não só entre K. pneumoniae como também em várias espécies de
Enterobacteriales 36.
A enzima NDM-1 foi identificada inicialmente em 2008, em Nova Deli, na
Índia, em K. pneumoniae. A NDM-1 é uma metalo-β-lactamase (ML), enzimas que
possuem habilidade de hidrolisar carbapenêmicos, através de íons divalentes (zinco),
que são utilizados como cofatores para sua atividade catalítica. Atualmente, o gene
plasmidial blaNDM-1 e suas variantes já foram detectados em vários gêneros e espécies de
enterobactérias, bem como em bacilos Gram-negativos não fermentadores, em várias
áreas geográficas 37. No Brasil, a primeira descrição dessa enzima foi em uma amostra
de Providencia rettgeri, isolada no sul do país, em 2013 38.
A produção de OXA-48 foi relatada em K. pneumoniae isolada de uma infecção
do trato urinário em Istambul, em 2001. A partir daí, surgiram surtos nosocomiais na
21
Turquia, sendo essa uma das carbapenemases mais comumente identificadas entre
ERCs isoladas em países europeus e mediterrâneos. No Brasil, em 2013, uma nova
variante da OXA-48 foi descrita, a OXA-370, em uma amostra de Enterobacter
hormaechei, isolada em um hospital do Rio Grande do Sul 39. As OXA-48 possuem alta
atividade hidrolítica contra penicilinas e hidrólise baixa para carbapenêmicos, entre eles,
para o imipenem e meropenem, sendo o ertapenem um melhor substrato para a enzima.
Outras variantes de OXA-48, que diferem por alterações de deleções ou substituições de
aminoácidos possuem baixa ou nenhuma atividade hidrolítica frente aos
carbapenêmicos. Os genes semelhantes ao blaOXA-48 são mediados por plasmídeos, em
sua maioria, porém foi descrita recentemente uma variante codificada por cromossomos
40;41.
1.5 KLEBSIELLA PNEUMONIAE & POLIMIXINAS
1.5.1 POLIMIXINAS
Descobertas há mais de 60 anos, a partir do microrganismo de solo Bacillus
polymyxa, as polimixinas foram bastante utilizadas inicialmente, no tratamento de
infecções por bacilos Gram-negativos. Porém, por sua alta toxicidade, deixaram de ser
utilizadas gradualmente, após introdução de novos fármacos no mercado, como as
cefalosporinas de terceira geração. Atualmente, esses antimicrobianos voltaram a ser
utilizados e considerados uma importante opção terapêutica, pela escassez de novos
antimicrobianos com ação contra microrganismos Gram-negativos multirresistentes,
inclusive com resistência aos carbapenêmicos 33; 42.
As polimixinas são antimicrobianos polipeptídeos que possuem espectro de ação
contra bactérias Gram-negativas, através da interação com moléculas de polissacarídeos
da membrana externa das bactérias Gram-negativas, retirando cálcio e magnésio,
necessários para a estabilidade dessas moléculas 43;23.
Existem cinco tipos de polimixina (A, B, C, D e E), mas somente as polimixinas
B e E (colistina) são utilizadas na prática clínica 44. Ambas possuem a mesma atividade
in vitro, tendo como diferença apenas a presença de um aminoácido D-Leucina na
molécula da colistina e D-fenilalanina, na molécula da polimixina B 20.
22
Os dados do Programa de Vigilância Antimicrobiana SENTRY (2008-2010),
mostrou uma taxa de 3,2% de incidência de isolados K. pneumoniae resistentes a
polimixina. Um outro estudo, com amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC-2
isoladas em 12 diferentes estados brasileiros, em 2010, revelou uma taxa de 15% de
resistência concomitante a polimixina, entre esses isolados, indicando uma associação
dessa resistência com outro importante mecanismo de resistência adquirida 45.
Segundo Fernandes et al., em 2016 no Brasil, foi descrito pela primeira vez a
presença do gene mcr-1 em animais de produção de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e
Santa Catarina, sendo considerado um alerta para as implicações no agronegócio, já que
o país em questão é um grande produtor e exportador de produtos de origem animal 46.
1.5.2 MECANISMO DE AÇÃO À POLIMIXINA
As polimixinas interagem com a porção do lipídeo A do LPS e com moléculas
de fosfolipídeos da membrana externa das bactérias, causando mudanças na
permeabilidade da célula, com extravasamento do conteúdo celular e consequentemente
levando a morte celular 47; 48.
As polimixinas não possuem atividade contra bactérias Gram-positivas, porém
são efetivas contra a maioria das bactérias Gram-negativas, principalmente
enterobactérias e bacilos não fermentadores. Entre as enterobactérias podemos citar as
principais como Klebsiella spp., E. coli, Citrobacter spp., Salmonella spp. e Shigella
spp. que, a princípio, são suscetíveis à polimixina e entre os bacilos não fermentadores
suscetíveis à polimixina estão Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa 48; 49.
Apesar de algumas bactérias possuírem resistência intrínseca às polimixinas,
como as Gram-positivas (pela incapacidade da droga de penetrar na parede bacteriana) e
algumas Gram-negativas, como Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia,
Proteus spp., Serratia spp., Providencia spp. e Morganella spp., umas das últimas
opções terapêuticas para as infecções causadas por bactérias Gram-negativas
multirresistentes, incluindo K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, tem sido as
polimixinas 43. Entretanto, consequentemente ao aumento do uso desse antimicrobiano,
a resistência a esses fármacos tem emergido no mundo, nos últimos anos, entre cepas de
K. pneumoniae e outros Gram-negativos 50 51. De acordo com o Programa de Vigilância
SENTRY, as taxas de susceptibilidade à colistina em todo o mundo até 2010, ainda
eram altas (Pseudomonas spp., 99,4%, Acinetobacter spp., 98,3% e K. pneumoniae,
23
96,8%). Porém a diminuição dessa susceptibilidade é o desafio terapêutico atual por
conta das opções terapêuticas muito restritas para o tratamento de infecções por Gram-
negativos multirresistentes 52. Estudos brasileiros mostram que as taxas de resistência a
polimixina ainda têm se mantido baixa, entre 1,7% a 4%, embora com uma tendência ao
aumento. 52; 53; 54.
1.5.3 MECANISMO DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA
Os mecanismos de resistência às polimixinas, ainda não estão muito elucidados,
porém sabe-se que mutações cromossômicas resultam na resistência à essas drogas.
Outro mecanismo recentemente descrito e com alto poder de disseminação é a aquisição
do gene plasmidial mcr-155. A resistência às polimixinas também pode estar relacionada
a diversos outros mecanismos como: a síntese de proteinases 56, presença de sistemas de
efluxo 57 e alterações na estrutura do lipídio A, por inativação do gene mgrB 58, 59.
A presença de cápsula também contribui para a resistência a polimixinas em K
pneumoniae. A cápsula bacteriana tem variação em sua composição polissacarídica,
porém a maioria é aniônica60; 61. Segundo Campos e colaboradores (2004) K.
pneumoniae mutantes, desprovidas de cápsula foram mais sensíveis a diversos
antimicrobianos, incluindo a polimixina B, corroborando a correlação entre a
quantidade de polissacarídeos capsulares e a resistência à polimixina B 62.
Esclarecer todos os mecanismos de resistência às polimixinas é um grande
desafio. Porém a compreensão destes mecanismos irá auxiliar no tratamento correto dos
pacientes infectados, além do desenvolvimento de novas drogas e no controle da
disseminação de cepas multirresistentes 63.
Em relação aos mecanismos de resistência à polimixina em K. pneumoniae
ocasionados por mutações, sabe-se que os mesmos podem resultar em modificação do
lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa ou no aumento da produção de
polissacarídeo capsular 20. Essas alterações moleculares ocasionadas por mutação,
conferem baixo nível de resistência e ocorrem de forma lenta, de acordo com estudo de
Lee et al. 33 .
O mecanismo de resistência associado com mutações do LPS depende de um
complexo mecanismo que envolve vários genes que participam do remodelamento da
24
membrana celular bacteriana, como por exemplo, mutações nos genes pmrA e pmrB, ou
ainda mutações no pmrC, que é responsável pela adição de fosfoetanolamina ao lipídio
A da parede celular, causando resistência bacteriana 64. A maioria das estratégias
empregadas por bactérias visam à superfície celular, comprometendo sua integridade e
até modificando-a. Vários outros genes de resistência à polimixina já foram descritos,
porém não foram totalmente analisados. Esses achados são de extrema importância,
dado o significado da polimixina atualmente na prática clínica e o aumento da
resistência a essa droga 65. A grande variedade de genes que codificam resistência às
polimixinas por sofrerem mutações limita o acesso à rápida detecção desse mecanismo
por biologia molecular 66.
A resistência às polimixinas por regulação gênica envolve sistemas de dois
componentes. Os sistemas de dois componentes são sistemas conhecidos e globais de
regulação gênica, e são utilizados por diversas bactérias para regulação da expressão de
diversos fatores de virulência e de resistência20. Esses sistemas sofrem influências
ambientais como presença de ferro, concentrações altas de cálcio ou baixas de
magnésio, ou até por alteração do pH do meio 67.
Em K. pneumoniae, a alteração na estrutura do lipídio A está associada a dois
componentes PmrAB (pmr = polymyxin resistance) e PhoPQ (pho = phosphatase). Uma
proteína de cada composto funciona como um sensor quinase presente na membrana
citoplasmática, que recebe estímulos ambientais, como os já citados, e sofre auto
fosforilação em um resíduo de histidina. Essas condições acarretam na fosforilação da
segunda proteína de superfície (PmrB ou PhoQ), que quando ativada, transfere o
grupamento fosforil para um resíduo de aspartato, que fica no domínio receptor de uma
proteína citoplasmática (PmrA ou PhoP), responsável pela transcrição de genes
envolvidos na adaptação da bactéria no ambiente20; 68.
O sistema PhoPQ pode modular o sistema PmrAB com o auxílio de uma
proteína conectora PmrD. Esta se liga à proteína PmrA fosforilada, protegendo-a da
desfosforilação, deixando assim, o estado ativo da PmrA por mais tempo e a expressão
dos genes que ela regula 69. A deleção dos genes pmrA, phoP ou pmrD resulta numa
redução drástica da resistência à polimixina B 70.
O principal mecanismo de resistência de origem cromossômica já descrito é
devido a modificação do LPS, que ocorre através da substituição dos grupos fosfato do
25
lipídio A, carregados negativamente, por grupos de 4-amino-4-desoxi-L-arabinose (L-
Ara4N) e fosfoetanolamina (PEtN), carregados positivamente. A síntese de L-Ara4N e
PEtN é mediada pelos dois sistemas reguladores PmrA-PmrB e PhoP-PhoQ, cuja
ativação é desencadeada por mutações específicas nos próprios sistemas ou perante a
exposição a estímulos ambientais adversos, como por exemplo, na presenta do
antibiótico colistina. Estas moléculas reduzem, assim, a carga resultante do LPS e
consequentemente, impedem a sua ligação à colistina, o que se traduz no
desenvolvimento de resistência antibacteriana (Figura 1) 71.
Figura 1. Mecanismos de resistência à colistina. Extraído de COSTA, A. (2017, pág. 50) 71
Esses sistemas PmrA/PmrB e PhoP/PhoQ foram identificados como sistemas
envolvidos na regulação da resistência à polimixina B. A inativação do regulador
PhoP/PhoQ, que codifica o MgrB, também foi associada à resistência à colistina 72.
Alterações na síntese do peptídeo de 47 aminoácidos, chamado de MgrB,
também está associado à resistência às polimixinas. O MgrB regula negativamente os
dois componentes do sistema PhoPQ por meio de sua ligação com o domínio
periplasmático da proteína PhoQ e essa ligação impede a fosforilação de PhoP 73. Aires
e colaboradores (2016) mostraram que a interrupção do gene mgrB estava associada à
resistência a polimixina B, em amostras de K. pneumoniae, isoladas no Rio de Janeiro,
em 2016 74.
A resistência à colistina mediada pelo gene plasmidial mcr-1 foi descrita
inicialmente em amostras de E. coli e K. pneumoniae isoladas na China, entre 2011 e
2014, tendo se disseminado mundialmente desde então 75;76. Por ser codificado por um
26
gene localizado em um elemento genético móvel, esse mecanismo de resistência pode
ser transferido horizontalmente para várias outras espécies e gêneros de bactérias Gram-
negativas. Cabe ressaltar que o gene mcr-1 tem sido encontrado em várias
enterobactérias isoladas não só em seres humanos, mas também em animais e, no
ambiente, além de produtos alimentícios de origem vegetal e animal 75.
A enzima mcr-1 pertence à família fosfoetanolamina transferase que tem como
função, adicionar fosfoetanolamina no lipídeo A. Esse gene pode ser encontrado em
diversos plasmídeos como Incl2, IncP, IncX4, entre outros. Alguns desses plasmídeos
tem a capacidade de carrear outros genes de resistência a fármacos como β-lactamases,
quinolonas e aminoglicosídeos, o que se torna preocupante, uma vez que o uso
inadequado destes antimicrobianos no tratamento de indivíduos, pode levar à seleção e
disseminação de cepas carreadores do gene mcr-1 77.
Em um estudo recente, conduzido na América Latina entre os anos 2000 e 2018,
a frequência desses genes foi de 2,9% em um total de 18.705 amostras. Os países com o
maior número de isolados positivos para mcr foram Brasil, Bolívia e Argentina e apenas
o Brasil e a Colômbia apresentaram genes mcr diferentes do tipo 1 (mcr-3 e mcr-5,
respectivamente) 78.
A resistência à polimixina em isolados de K. pneumoniae produtores de KPC
atingiu taxas alarmantes no ano de 2015, em São Paulo, cerca de 25%, porém, até então,
só haviam sido descritos mecanismos cromossomais de resistência às polimixinas.
Recentemente, em 2016, houve a primeira descrição de isolados de E. coli resistentes à
polimixina carreando o gene mcr-1 tanto em animais, como em humanos, isolados em
São Paulo 46.
Um estudo relatou um isolado de E. coli produtor de KPC e positivo para o gene
mcr-1, recuperado a partir de swab retal, de um paciente hospitalizado em um hospital
geral de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, em setembro de 2014 79. Um outro estudo,
conduzido no Rio de Janeiro, também mostrou a ocorrência de K. pneumoniae
produtora de KPC positiva para o gene mcr-1 55.
Esclarecer todos os mecanismos de resistência às polimixinas é um grande
desafio. Porém a compreensão destes mecanismos irá auxiliar no tratamento correto dos
27
pacientes infectados, além do desenvolvimento de novas drogas e no controle da
disseminação de cepas multirresistentes 63.
A resistência à colistina é um fenômeno global recente, com isso a
implementação de ferramentas de triagem rápidas e confiáveis para detectar e analisar
patógenos resistentes à colistina de forma a se adotar medidas de precaução de contato e
adaptação do tratamento do paciente é uma abordagem necessária. Além disso, a
heterorresistência à colistina é um fenômeno comum, que é amplamente subestimado,
exigindo métodos específicos 66.
1.6 DETECÇÃO LABORATORIAL FENOTÍPICA DE AMOSTRAS RESISTENTES À
POLIMIXINAS
Em 2016, o CLSI/EUCAST Joint Polymyxin Breakpoints Working Group
recomendaram o método ISO-20776 para a detecção de resistência à polimixina,
preconizando a microdiluição em caldo como o método de referência para verificação
dessa resistência, através da determinação das concentrações mínimas inibitórias
(CMIs) frente a essa droga, uma vez que as moléculas catiônicas das polimixinas se
difundem pouco no ágar Mueller-Hinton, tornando o método de disco difusão
inadequado 80; 81; 82.
Assim como o método de disco difusão, o teste epsilométrico para
colistina/polimixina B não é recomendado pelo CLSI 83, justamente pela fraca difusão
do antibiótico em ágar e por apresentarem altas taxas de erros e MICs inferiores,
quando comparadas ao padrão ouro (microdiluição em caldo), por esses motivos, muitos
estudos mostraram ser contra essa técnica para avaliar a resistência às polimixinas. 80; 84.
Por outro lado, o método da microdiluição em caldo é demorado e muito
laborioso e por isso não muito adequado para as rotinas clínicas. Além disso, o método
apresenta uma alta probabilidade de erros, como uso de uma concentração incorreta de
polimixina ou de uma diluição errada; o método também apresenta limitações para
avaliar heterorresistência, podendo apresentar resultados não interpretáveis, já que a
presença de subpopulações resistentes pode ocasionar em poços omitidos ou
“pulados”(sem crescimento bacteriano em um poço com concentração de colistina em
28
que a bactéria deveria crescer, e no poço seguinte, com concentração maior da droga, a
bactéria cresce) 66.
Entre os diferentes métodos alternativos para a detecção laboratorial da
resistência a polimixina, podemos citar o teste rápido de polimixina NP (Elitech, Signes,
França) que se baseia na detecção de resistência à colistina, baseado no metabolismo da
glicose com consequente mudança de pH, que resulta na alteração de cor do indicador
de pH presente no meio. Outra metodologia é baseada na tecnologia MALDI-TOF MS
(do inglês, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass
Spectrometry”), que possui uma abordagem promissora baseada em espectometria de
massa. O Micromax Assay (Halotech DNA SL, Madrid, Spain), se baseia na detecção
de fragmentação de DNA e danos na parede celular na presença de colistina. Cabe
ressaltar que esses dois métodos ainda são de uso restrito na rotina laboratorial de países
em desenvolvimento, por seu custo elevado66.
Outra metodologia utilizada para triagem de amostras resistentes à polimixina é
baseada em meios seletivos contendo polimixina, como por exemplo, os meios
SuperPolimixina (PlastLabor, SP, Brasil), COL-PSE (CHROMagar, Paris, France) ou o
ChromID (BioMerieux, NC). Meios cromogênicos e seletivos são práticos e de custo
não muito elevado. Entretanto os meios de cultura contendo polimixina disponíveis
atualmente não são capazes de detectar todas as cepas resistentes, uma vez que a
concentração de polimixina em sua composição pode ser muito alta; além disso, essa
metodologia requer incubação overnight 66; 85.
O Ágar Superpolimixina foi o primeiro ágar seletivo para bactérias resistentes à
polimixina, inicialmente criado para uso de rastreamento dessa resistência, em pacientes
colonizados, a partir de swab retal 86. Esse meio de cultura é composto por eosina azul
de metileno, inibidor de bactérias Gram-positivas, colistina (3,5 mg/mL) e daptomicin
(inibidor de Gram-positivas) 87.
Vários sistemas comerciais para detecção da resistência à colistina, baseados em
microdiluição em caldo, têm sido disponibilizados. Entre eles podemos citar o UMIC
Colistina kit (Biocentric, NT) e o Sensititre (Thermo Fisher, Waltham, MA), entre
outros.
29
Esses sistemas são de fácil execução, porém um estudo conduzido por Jayol e
colaboradores (2017) verificou que esses métodos podem perder sua acurácia,
dependendo da CMI da amostra, bem como apresentar taxas altas de erros muito graves,
particularmente o UMIC (11,3%) 88. Os sistemas automatizados de identificação e
verificação do perfil de sensibilidade através do método de microdiluição, como os
sistemas BD Phoenix (Becton Dickison, NJ, EUA) e o MicroScan (Beckman Couter,
Brea, CA), também detectam a resistência a colistina, mas apresentam a limitação de
não fornecerem valores de CMIs verdadeiros 85. Recentemente, um teste comercial de
microdiluição em caldo foi lançado no mercado nacional (Policimbac, PROBAC do
Brasil). Esse teste consiste em uma galeria com poçinhos contendo diferentes
concentrações de polimixina B, já diluídas em caldo Mueller Hinton ajustado, tornando
a execução mais fácil e rápida. Porém ainda há poucos dados sobre a acurácia do
mesmo para a determinação das CMIs frente à polimixina B.
Considerando que o método considerado padrão ouro para a detecção de cepas
com essa resistência é extremamente laborioso para ser utilizado na rotina do
laboratório de microbiologia clínica, métodos fenotípicos que permitam a detecção
precisa e rápida e que apresentem maior facilidade técnica são necessários, visto que a
detecção dessas cepas é uma importante estratégia para o tratamento correto de
infecções, bem como para o controle da disseminação desses microrganismos
multirresistentes no ambiente hospitalar. Em adição, o conhecimento dos mecanismos
de resistência às polimixinas e a detecção precoce e correta de cepas portadoras desses
mecanismos são de extremo valor para manter a atividade dessa droga até que novas
opções terapêuticas sejam desenvolvidas e possam ser utilizadas 20.
A relevância desse estudo, portanto, é justificada pela extrema importância da
detecção da resistência às polimixinas e da escassez de dados sobre a prevalência dessas
cepas no hospital que recebe a pesquisa.
Além da resistência às polimixinas limitar ainda mais os recursos terapêuticos,
geralmente amostras resistentes às polimixinas também apresentam outros mecanismos
de resistência concomitantes. No momento, há uma dificuldade na detecção dessa
resistência na rotina laboratorial, uma vez que a metodologia recomendada para a
avaliação da sensibilidade às polimixinas é a da microdiluição em caldo, um método
demorado e laborioso. Nesse contexto, diferentes métodos fenotípicos têm sido
descritos, uma vez que os testes genotípicos também são limitados, não só devido à
30
diversidade dos genes envolvidos no mecanismo de resistência relacionado com
mutações cromossômicas e às muitas variantes já descritas do gene mcr, mas também
porque os testes genotípicos podem não estarem associados com a expressão do
fenótipo.
A detecção rápida e confiável de amostras com esse mecanismo de resistência,
principalmente em área hospitalar, visando não apenas o controle da disseminação
dessas amostras, mas também o auxílio do direcionamento da terapia adequada a ser
utilizada no tratamento se faz necessária e premente.
Desta forma, o presente estudo tem como objetivo geral comparar diferentes
testes fenotípicos para a detecção de cepas resistentes a polimixina, com o método de
referência, da microdiluição em caldo. Desse modo, um possível benefício futuro seria a
validação de algum desses testes fenotípicos, tendo em vista sua implementação na
rotina do Laboratório de Microbiologia do Hospital investigado.
31
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Comparar métodos de detecção fenotípica de resistência a polimixina entre
amostras clínicas de K. pneumoniae, de uma coleção de amostras previamente
caracterizadas como sendo resistentes e sensíveis a polimixinas, obtidas de pacientes
atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro (Niterói-RJ).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A. Verificar as concentrações mínimas inibitórias frente à polimixina das amostras,
através do método de microdiluição em caldo.
B. Detectar fenotipicamente a produção de carbapenemase entre as amostras de K.
pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, através do Teste de Hodge Modificado
e do Método de Inibição do Carbapenêmico com e sem EDTA.
C. Analisar o desempenho dos seguintes métodos fenotípicos de detecção da
resistência a polimixina: sistema comercial Policimbac®, sistema automatizado BD
Phoenix™ e teste epsilométrico Etest®, em comparação com o método de
referência, de microdiluição em caldo.
D. Verificar o crescimento de amostras sensíveis e resistentes a polimixina, de
acordo com o método de microdiluição em caldo, em meio seletivo
SuperPolimixina®.
E. Verificar a presença dos genes blaKPC, blaNDM, blaOXA-48 e mcr-1 a mcr-5 entre as
amostras, através de PCR.
32
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente estudo faz parte de um projeto de pesquisa mais amplo, intitulado
“Caracterização fenotípica e molecular de bactérias Gram-negativas de importância
médica com perfis de multirresistência aos antimicrobianos, isoladas no Hospital
Universitário Antônio Pedro”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, da
Faculdade de Medicina, da UFF, sob o número 2.920.186.
3.2. AMOSTRAS BACTERIANAS
Um total de dezessete amostras de K. pneumoniae, obtidas de treze pacientes
admitidos no Hospital Universitário Antônio Pedro e isoladas no período de maio de
2018 a junho de 2019, foram incluídas no presente estudo. A identificação das amostras,
bem como a verificação dos seus perfis de susceptibilidade foram realizadas através do
sistema automatizado BD PhoenixTM (BD Diagnostics, São Paulo, Brasil), durante a
rotina laboratorial do Laboratório de Microbiologia, do Serviço de Patologia, do
Hospital Universitário Antônio Pedro.
Do total de dezessete amostras, onze (65%) foram identificadas como sendo
resistentes à polimixina E (valores de CMIs = 4 e 8 mg/mL), e seis (35%) foram
verificadas como sendo sensíveis (valores de CMIs = < 1mg/mL), de acordo com o
sistema automatizado BD Phoenix. As fontes de isolamento das amostras foram: sangue
(n=9), urina (n=4), líquor (n=2), catéter (n=1) e secreção de ferida (n=1). As amostras
foram mantidas em meio BHI, contendo 10% de glicerol, a -20oC. A Tabela 1 resume as
características das dezessete amostras do estudo.
33
Tabela 1. Características gerais das 17 amostras de Klebsiella pneumoniae isoladas de pacientes
atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro, no período de maio de 2018 a junho de 2019
Sec: secreção; CTI: Centro de Tratamento Intensivo; R: Resistente; S: Sensível; I: Intermediário; NT:
Não Testado; Emerg: Emergência; UTI-Neo: Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal; CMM: Clínica
Médica Masculina; DIP: Doenças Infecciosas e Parasitárias; COL: Colistina; AK: Amicacina; AMP:
Ampicilina; CEF: Cefazolina; FEP: Cefepime; FOX: Cefoxitina; CAZ: Ceftazidima; CRO: Ceftriaxona; CIP:
Ciprofloxacina; ERT: Ertapenem; IMI: Imipenem; GEN: Gentamicina; LEV: Levofloxacina; MER:
Meropenem; TZP: Piperaciclina+Tazobactam; TIG: Tigeciclina; Sxt: Sulfametoxazol+Trimetoprim.
*Perfil de sensibilidade de acordo com os resultados do sistema BD Phoenix
3.2.1. Confirmação da Identificação das Amostras
Todas as dezessete amostras do estudo tiveram sua identificação confirmada
como pertencentes à espécie K. pneumoniae, através da metodologia de espectrometria
de massa, por meio do equipamento MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Alemanha).
Para esta etapa, os isolados foram retirados da coleção em estoque e foram semeados
em meio TSA, sendo incubados a 35+2°C por 18 a 24 horas.
3.3. DETECÇÃO DE PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES
3.3.1 TESTES DE HODGE MODIFICADO (THM)
As amostras bacterianas que foram identificadas como sendo resistentes a pelo
menos um carbapenêmico, através do sistema automatizado BD PhoenixTM (n = 13),
foram submetidas ao teste de Hodge modificado, segundo Lee e colaboradores (2001).
Uma suspensão bacteriana da cepa Escherichia coli ATCC (American Type Culture
Collection) 25922 foi preparada em solução salina até atingir a turvação equivalente à
34
escala 0.5 de Mc Farland. A suspensão foi inoculada em placa contendo ágar Müeller-
Hinton (Oxoid, São Paulo, Brasil). Em seguida, um disco de Ertapenem (10µg –
CEFAR, São Paulo, Brasil) foi adicionado ao centro da placa e, a partir da borda do
disco de antibiótico, foi feita uma estria com a cepa teste em direção à borda da placa.
As placas foram incubadas a 35+2°C, por 16 a 18 horas. Quando o crescimento da cepa
E. coli no interior do halo de inibição do ertapenem formou uma zona distorcida, o
resultado foi interpretado como positivo, ou seja, houve produção de carbapenemase.
Quando o halo de inibição ao redor do disco de ertapenem permaneceu inalterado, o
resultado foi considerado negativo (Figura 2).
Figura 2. Imagem ilustrativa de Testes de Hodge Modificado: amostras positivas (sinal positivo verde)
e negativas (sinal negativo vermelho).
3.3.2. TESTE DE INATIVAÇÃO DO CARBAPENÊMICO MODIFICADO (MCIM)
Todas as amostras bacterianas selecionadas para o estudo e resistentes a pelo
menos um carbapenêmico foram submetidas ao Método de CIM Modificado (mCIM, do
inglês “Modified Carbapenem Inactivation Method”) para verificação da produção de
carbapenemases, segundo os critérios do CLSI (2019). Para este teste, as colônias foram
semeadas em meio TSA para ativação e após incubação overnight, uma alçada das
colônias foi transferida para uma solução de 1mL de caldo Tryptic Soy Broth (TSB,
Probac do Brasil, SP).
Posteriormente, um disco contendo 10µg de meropenem (CEFAR, São Paulo,
Brasil) foi imerso na suspensão e incubado por quatro horas a 35+2°C. Após incubação,
o disco foi removido da suspensão e colocado numa placa de ágar Müeller-Hinton
inoculada com uma cepa indicadora de E. coli sensível (ATCC 29522) e,
subsequentemente, incubada a 35+2°C por 18 a 24h. A suspensão contendo a cepa
indicadora de E. coli sensível foi ajustada ao padrão de turvação 0,5 da escala de
35
McFarland 89;83. A leitura e interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com
os critérios do CLSI 83.
3.3.3. TESTE DE INATIVAÇÃO DO CARBAPENÊMICO COM EDTA (ECIM)
Todas as amostras bacterianas selecionadas para o estudo e resistentes a pelo
menos um carbapenêmico também foram submetidas ao método de eCIM (do inglês
“EDTA Carbapenem Inactivation Method”) para detecção de produção de
carbapenemases e discriminação, nas amostras positivas, entre as enzimas do tipo
serino-β-lactamase e metalo-β-lactamase (MβL), segundo os critérios do CLSI (2019)83.
Para cada amostra, foi preparado um eppendorf contendo 1ml de caldo TSB, no qual
foram adicionados 10μl de EDTA na concentração de 0,5M. A partir da semeadura das
colônias em ágar TSA, uma alçada das colônias foi transferida para o eppendorf. Após,
um disco contendo 10µg de meropenem (CEFAR) foi imerso na suspensão e incubado a
35+2°C, por quatro horas.
Após incubação, o disco foi removido da suspensão e colocado numa placa de
ágar Müeller-Hinton inoculada com uma cepa indicadora de E. coli sensível (ATCC
29522) e, subsequentemente, incubada a 35+2°C, por 18 a 24h. A suspensão contendo a
cepa indicadora de E. coli sensível foi ajustada ao padrão de turvação 0,5 da escala de
Mc Farland. Se o isolado bacteriano produzir carbapenemase do tipo metalo-ß-
lactamase, o EDTA retira o zinco utilizado como cofator pela enzima, o que não permite
a ação da enzima sobre o meropenem e é observada uma zona de inibição. Se o isolado
bacteriano produz carbapenemase do tipo serino-ß-lactamase, o EDTA não atua sobre a
enzima.
Os resultados dos testes eCIM foram considerados em conjunto com os estes
mCIM e a leitura e interpretação dos mesmos foram realizadas de acordo com as
recomendações do CLSI 90 onde um aumento > 5mm no halo de inibição ao redor do
disco de meropenem do teste eCIM, quando comparado ao halo de inibição ao redor do
disco de meropenem do teste mCIM foi considerado um resultado positivo para
produção de ML (Figura 3).
36
Figura 3. Imagem ilustrativa de testes mCIM & eCIM. À esquerda, resultado sugestivo de cepa
produtora de serino-ß-lactamase; à direita, resultado sugestivo de cepa produtora de metalo-ß-
lactamase.
3.4 DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ATRAVÉS DE MÉTODOS FENOTÍPICOS
3.4.1. MICRODILUIÇÃO EM CALDO IN HOUSE
As onze amostras identificadas como sendo resistentes à polimixina pelo sistema
automatizado, bem como as seis amostras identificadas como sensíveis, foram
submetidas ao método de microdiluição em caldo Müeller-Hinton cátion ajustado,
segundo as recomendações do CLSI (2019), para determinação de suas Concentrações
Mínimas Inibitórias (CMIs), frente à polimixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Para a preparação da microplaca, foram colocados 384μL de uma solução de
polimixina B a 1000μg/mL (Sigma-Aldrich) em 2616μL de caldo Müeller Hinton cátion
ajustado com 20-25mg/L de Ca2+ e 10-12,5mg/L de Mg2+ em um tubo estéril. Em
seguida, foram acrescentados 200μL desse caldo contendo polimixina B (128μg/mL)
em cada poço da primeira coluna da placa. Foram adicionados 100μL de caldo ajustado
sem antibiótico a partir da segunda coluna da placa. Após feito isso, foi realizada uma
diluição seriada, retirando 100μL de cada poço por coluna, a partir da primeira coluna, e
acrescentando na coluna seguinte, até a penúltima coluna da placa. Ao final, foi feita
uma suspensão bacteriana, com turbidez equivalente à do padrão 0,5 na escala de
McFarland, em seguida foi diluída em 1:10 e foi colocado 5μL em cada poço, de forma
com que cada linha representasse uma amostra. As placas foram incubadas em uma
estufa a 35ºC, por 16 a 18h. As concentrações utilizadas foram: 0,5µg/mL, 1µg/mL,
2µg/mL, 4µg/mL, 8µg/mL, 16µg/mL, 32µg/mL, 64µg/mL, 128µg/mL e 256µg/mL.
Para a validação do teste foram utilizados como controle uma cepa de E. coli
ATCC 25922 como controle negativo e uma de K. pneumoniae sabidamente resistente,
como controle positivo. As leituras e interpretações foram realizadas de acordo com o
BrCast/EUCAST (2019) 91 (Figura 4).
37
Figura 4. Imagem ilustrativa do teste de microdiluição em caldo, com a determinação das
concentrações mínimas inibitórias frente a Polimixina B, entre amostras de Klebsiella pneumoniae.
3.4.2. MICRODILUIÇÃO EM CALDO COMERCIAL
As dezessete amostras também foram testadas quanto às suas CMIs frente à
polimixina B, através da galeria Policimbac® (Probac do Brasil, São Paulo, SP), de
acordo com as recomendações do fabricante. Cada galeria apresenta capacidade para
testar duas amostras concomitantemente, e a faixa de concentrações da polimixina B
varia de 0,125 a 64 g/mL (Figura 5). Para realização desse teste, foram utilizados 3
tubos (tubo 1, tubo 2 e tubo 3). No tubo 1 foi feita uma suspensão bacteriana, com
turbidez equivalente à do padrão 0,5 na escala de McFarland , no tubo 2 foi colocado
4950 µL de salina e no tubo 3 foi colocado 4500 µL de salina. Em seguida, 50 µL do
tubo 1 foi passado para o tubo 2 e homogeinizado, e em seguida 500 µL do tubo 2 foi
passado para o tubo 3 e homogeinizado. Ao final, foram colocados 100 µL do tubo 3 em
cada poço da galeria. As placas foram incubadas em uma estufa a 35ºC, por 24h e
depois foi adicionada a solução reveladora e após 20 minutos foi feita a leitura. A
amostra sensível E. coli ATCC 25922 foi utilizada como controle do teste.
Figura 5. Imagem ilustrativa do teste comercial de microdiluição em caldo Policimbac® (Probac do
Brasil). As setas indicam a amostra (de cima) com CIM = 8 µg/mL e a amostra (de baixo), com CIM = 0,5 µg/mL.
38
3.4.3. TESTE EPSILOMÉTRICO
Todas as dezessete amostras tiveram suas CMIs frente à polimixina B
verificadas através de testes epsilométricos, utilizando-se para isso fitas de Etest®
(BioMerieux, São Paulo, SP) de acordo com as recomendações do fabricante.
Para o teste epsilométrico, as colônias foram semeadas em Ágar TSA. A partir
desse meio, uma alçada das colônias foi transferida para uma solução salina e a
suspensão foi comparada com o padrão de turvação 0,5 da escala de Mc Farland. Em
seguida, foi semeada em forma de tapete no meio de ágar Müeller-Hinton e a tira de
Etest para Polimixina B (BioMerieux, São Paulo, SP) foram introduzidas no meio. As
placas serão incubadas a 35°C por 16 a 18 horas.
As leituras e suas interpretações foram realizadas de acordo com o
BrCast/EUCAST (2019) 91 (Figura 6).
Figura 6. Imagem ilustrativa de verificação do perfil de sensibilidade à polimixina B, de uma amostra
de Klebsiella pneumoniae, através do teste epsilométrico Etest® (BioMerieux).
3.4.4. MEIO SELETIVO
Uma alçada de cada uma das dezessete amostras de K. pneumoniae, ativadas em
meio TSA, foi semeada no meio seletivo, Ágar SuperPolimixina® (Plastlabor, Rio de
Janeiro, RJ), utilizado para triagem de amostras resistentes à polimixina. As leituras
foram categorizadas em: crescimento bacteriano abundante e crescimento bacteriano
escasso, conforme mostrado na Figura 7.
39
Figura 7. Imagem ilustrativa dos dois diferentes tipos de crescimento bacteriano, obtidos no meio
seletivo SuperPolimixina® (PlastLabor).
3.4.5 ANÁLISE DOS DADOS
A categorização das amostras de K. pneumoniae foi realizada de acordo com os
critérios do BrCast/EUCAST (2019) 91, onde os valores de CMIs >2 mg/mL estão
relacionados com resistência a polimixina e valores <2 mg/mL, com sensibilidade a essa
droga.
Os valores de CMIS obtidos nos testes do sistema comercial Policimbac, E-test e
do sistema automatizado BD Phoenix foram analisados se utilizando os valores de CMIs
obtidos através dos testes de Microdiluição em Caldo como sendo os valores de referência.
As comparações entre os resultados encontrados foram interpretadas da seguinte
forma: considerou-se concordância de categoria, quando não houve mudança de
categoria e concordância essencial, quando houve uma diferença no valor da CMI de + 1
log2 de diluição do valor da CMI de referência. Ainda, foram considerados erros graves,
quando o resultado do teste avaliado resultou num falso resistente (mudança de categoria
de sensível para resistente, em comparação com o método padrão-ouro) e erros muito
graves, quando o resultado do teste avaliado resultou num falso sensível (mudança de
categoria de resistente para sensível, em comparação com o método padrão-ouro). Taxas >
1,5% de erros muito graves e > 3%, de erros graves foram consideradas inaceitáveis, de
acordo com a recomendação do documento M23-A2, do CLSI.
Os percentuais de sensibilidade e especificidade foram calculados segundo as
fórmulas: S = VP/VP + FN e E = VN/VN + FP, onde S = sensibilidade; VP = verdadeiro
resistente; FN = falso sensível; E = especificidade; VN = verdadeiro sensível e FP = falso
resistente, comparando-se os resultados obtidos nos testes alternativos com aqueles do
teste de referência.
Crescimento bacteriano abundante Crescimento bacteriano escasso
40
3.5 DETECÇÃO DOS DETERMINANTES GENÉTICOS DE RESISTÊNCIA AOS
CARBAPENÊMICOS E ÀS POLIMIXINAS.
3.5.1. ISOLAMENTO DO DNA BACTERIANO
O DNA das amostras bacterianas foi extraído por lise mecânica, através do
método de sonicação. A partir de um crescimento recente em ágar TSA, foi retirada uma
alça bacteriológica e transferida para tubos tipo eppendorf contendo 500 µL de água
ultrapurificada. Posteriormente, a suspensão bacteriana foi homogeneizada e submetido
a cuba de ultrassom (Critófoli, Paraná, Brasil), três vezes por 30 segundos com um
intervalo de 10 segundos entre esses ciclos de tempo. Após a sonicação, a suspensão foi
submetida a centrifugação (16000 x g por 10 minutos) e armazenada a -20°C até sua
utilização 92.
3.5.2 DETECÇÃO DOS GENES CODIFICADORES DE CARBAPENEMASES POR REAÇÕES EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
Todas as amostras foram submetidas a reações de PCR multiplex, para dos genes
codificadores das carbapenemases blaKPC, blaNDM e blaOXA-48, de acordo com Monteiro
e colaboradores92. As dezessete amostras também foram submetidas a reações de PCR
multiplex para detecção dos genes codificadores de resistência à polimixinas, mcr-1 a
mcr-5 de acordo com Rebelo e colaboradores93.
O volume final de cada reação foi de 25 μL composto por 2,5 μL de água
destilada, 0,5μL de iniciadores a 10pmol/μL (forward e reverse), 2,5μL de tampão PCR
(GoTaq Flexi-Promega), 1μL de solução MgCl2 (GoTaq Flexi-Promega) a 1,5mM,
3,7μL de desoxinocleotídeos (dNTP) a 2mM, 1,5 μL de DMSO, 0,1μL de Taq DNA
polimerase (GoTaq Flexi-Promega) e 2,5 μL de DNA bacteriano.
As condições de amplificação foram: um ciclo de desnaturação inicial a 94ºC
por 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação (94ºC por 1 minuto), anelamento (50ºC por
1minuto), e extensão (72ºC por 1 minuto); finalizando por um ciclo de extensão final
(72ºC por 5 minutos).
41
3.5.3 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Após as reações de PCR, os produtos amplificados foram analisados através de
eletroforese em gel de agarose (Invitrogen) a 1,5% em TBE 0,4X (EDTA 0,5M pH 8,0;
Tris 1M pH 8,0; Ácido Bórico 0,035 M). Posteriormente, os géis foram corados com
brometo de etídio (0,5g/L) por 15 minutos, observados e fotografados sob luz
ultravioleta no sistema de fotodocumentação L - Pix EX (Loccus Biotecnologia, Cotia,
SP).
42
4. RESULTADOS
4.1. DETECÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES & DETECÇÃO DOS
DETERMINANTES GENÉTICOS DE RESISTÊNCIA AOS CARBAPENÊMICOS E ÀS POLIMIXINAS.
Do total das dezessete amostras, treze (76,5%) amostras apresentaram resistência
aos carbapenêmicos (Tabela 1) e foram submetidas ao Teste de Hodge Modificado e aos
Testes de mCIM e eCIM.
Em relação ao THM, verificou-se onze amostras positivas (84,6%) e 2 (15,4%)
negativas. Os resultados obtidos nos Testes de mCIM também mostraram onze amostras
positivas (84,6%) e 2 (15,4%) negativas. Entretanto, uma amostra que foi negativa no
THM, foi positiva no mCIM e uma amostra positiva no THM, foi negativa no mCIM.
Uma amostra foi negativa nos dois testes. Das onze amostras positivas para produção de
carbapenemases nos testes de mCIM, nove amostras (69,2%) apresentaram resultados
negativos para o teste eCIM, sugerindo produção de serino-ß-lactamases; as outras duas
amostras (15,4%) foram positivas para o teste eCIM, caracterizando fenotipicamente a
presença de carbapenemases de tipo ML.
Entre as treze amostras resistentes aos carbapenêmicos (CarbR), oito (61,5%)
apresentaram 100% de concordância entre os resultados do THM, mCIM e os testes
genotípicos por PCR. Dessas treze amostras CarbR, doze apresentaram determinantes
genéticos codificadores de carbapenemases (11/91,7% positivas para blaKPC e 1/8,3%,
para blaNDM). Uma amostra resistente aos carbapenêmicos e positiva nos testes de THM
e mCIM foi negativa para os três genes investigados. Por outro lado, uma amostra
sensível aos três carbapenêmicos testados no sistema BD Phoenix (CBAC244) foi
blaKPC positiva. A amostra CBAC244 foi submetida ao teste de difusão em agar
utilizando-se os discos ertapenem, imipenem e meropenen (CECON) e verificou-se que
a mesma apresentou resistência frente aos três carbapenêmicos, através desse método.
Os resultados obtidos nos testes fenotípicos e genotípicos realizados entre as
amostras de Klebsiella pneumoniae estão sumarizados na Tabela 2.
43
Tabela 2. Comparação entre testes fenotípicos e genotípicos realizados entre as 17 amostras de
Klebsiella pneumoniae
THM: Teste de Hodge Modificado; mCIM: Método de Inativação do Carbapenêmico Modificado; eCIM: Método de Inativação do Carbapenêmico Modificado com EDTA; CB: Resistência a Carbapenêmicos (Ertapenem, Imipenem e Meropenem), de acordo com o sistema BD Phoenix; POL: Resistência a
Polimixinas, de acordo com o método de microdiluição em caldo; NT: Não testado; NEG: Negativo.
Entre as doze amostras positivas para o gene blaKPC, uma (CB201) foi negativa
no THM, mas positiva no CIM. Entre essas mesmas doze amostras, a amostra
CBAC250 foi positiva no THM, mas negativa no CIM. Já a única amostra positiva para
o gene blaNDM (CBAC 257), foi negativa em todos os testes fenotípicos, inclusive nos
testes mCIM e eCIM.
Cabe ressaltar que as duas amostras sugestivas de serem produtoras de ML
(CBAC 129 e 251) pelos testes de eCIM apresentaram o gene blaKPC, que codifica a
KPC, uma serino--lactamase. Em resumo, o teste eCIM proposto para diferenciar
serino de metalo--lactamases, não detectou a única amostra carreadora do gene blaNDM
(falso negativo) e identificou duas amostras produtoras de KPC, como sendo sugestivas
de produtoras de ML (falsos positivos).
Em relação à detecção dos determinantes genéticos de resistência aos
carbapenêmicos observou-se um elevado percentual de positividade para o gene blaKPC,
uma vez que, das treze amostras positivas para um dos dois determinantes investigados,
44
doze amostras (92%) foram positivas para esse gene. Uma (7,7%) amostra foi positiva
para o gene blaNDM-1 e nenhuma amostra apresentou o gene blaOXA-48.
Das quatorze amostras resistentes a polimixina, doze (85,7%) foram produtoras
de carbapenemases, sendo que destas, onze (91,6%) apresentaram o gene blaKPC e uma
(8,3%), o gene blaNDM. Uma das amostras resistentes à polimixina e portadora do gene
blaKPC, foi considerada sensível aos carbapenêmicos pelo sistema automatizado BD
Phoenix.
Nenhuma das dezessete amostras submetidas às reações de PCR para detecção
dos genes codificadores de resistência a polimixinas (mcr-1 a mcr-5) foi positiva para
esses determinantes genéticos.
4.2. DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA À POLIMIXINA ATRAVÉS DE MÉTODOS FENOTÍPICOS
Todas as amostras do estudo foram submetidas ao teste de Microdiluição em
Caldo in house. A faixa de CMIs observada foi de 0,5 a 64 mg/mL. Das 17 amostras, 2
amostras (11,8%) apresentaram MIC = 0,5 µg/mL , 1 amostra (5,9%) apresentou MIC =
1 µg/mL, 2 amostras (11,8%) apresentaram MIC = 8 µg/mL, 5 amostras (29,4%)
apresentaram MIC = 16 µg/mL, 2 amostras (11,8%) apresentaram MIC = 32 µg/mL, 5
amostras (29,4%) apresentaram MIC = 64 µg/mL (Figura 8).
Figura 8. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos nos testes de Microdiluição em Ca ldo in house ,
entr e 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
45
Em relação ao sistema BD Phoenix, os valores de CMIs observados entre as
dezessete amostras do estudo variaram de < 1 mg/mL a > 64 mg/ml. Do total de 17
amostras, 11 (65%) amostras foram identificadas como sendo resistentes à polimixina
E, e 6 (35%) foram verificadas como sendo sensíveis (Figura 9).
Figura 9. Valores de CIMs frente a colistina, obtidos no sistema automatizado BD Phoenix, entre 17
amostras de Klebsiella pneumoniae
Todas as dezessete amostras foram também submetidas ao sistema comercial de
microdiluição em caldo, Policimbac® (Probac do Brasil). A faixa de CMIs observada
variou de 1 a 128 mg/mL. Das 17 amostras, 2 amostras (11%) apresentaram MIC = 1
µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 2 µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC =
4 µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 16 µg/mL, 2 amostras (12%) apresentaram
MIC = 32 µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 64 µg/mL, 9 amostras (53%)
apresentaram MIC = 128 µg/mL (Figura 10).
Figura 10. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos no teste comercial Policimbac, entre 17
amostras de Klebsiella pneumoniae.
46
As 17 amostras foram submetidas ao teste epsilométrico Etest. A faixa de CMIs
observada variou de 1 a 24 mg/mL. Das 17 amostras, 1 amostra (6%) apresentou MIC =
0,75µg/mL, 3 amostras (17%) apresentaram MIC = 1µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou
MIC = 1,5 µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 2 µg/mL, 2 amostras (12%)
apresentaram MIC = 3 µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 4 µg/mL, 2 amostras
(12%) apresentaram MIC = 6 µg/mL, 2 amostras (12%) apresentaram MIC = 8 µg/mL,
1 amostra (6%) apresentou MIC = 12 µg/mL, 3 amostras (17%) apresentaram MIC = 16
µg/mL, 1 amostra (6%) apresentou MIC = 24 µg/mL (Figura 11).
Figura 11. Valores de CIMs frente a polimixina B, obtidos nos testes epsilométricos Etest, entre 17 amostras de Klebsiella pneumoniae.
Todas as dezessete amostras foram também semeadas no meio seletivo
Superpolimixina (PlastLabor). Das dezessete amostras, cinco amostras (29%)
apresentaram crescimento discreto, indicando sensibilidade a polimixina, enquanto doze
amostras (71%) apresentaram crescimento de forma abundante, ind icando resistência a
esse antimicrobiano.
4.3. COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DOS TESTES FENOTÍPICOS REALIZADOS
A tabela 3 mostra os resultados de todos os testes realizados para determinação
do perfil de sensibilidade à polimixina/colistina, entre as dezessete amostras do presente
estudo. Para efeitos de comparação, o método de Microdiluição em Caldo foi
considerado o padrão-ouro.
47
Tabela 3. Comparação entre os resultados obtidos nos testes de Microdiluição em Caldo, Policimbac,
sistema automatizado Phoenix BD e Etest, em 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
R: resistente; S: sensível. Letras marcadas em vermelho indicam resultados discrepantes entre os
testes realizados.
As tabelas 4-7 mostram os resultados obtidos nos testes de microdiluição em
caldo (padrão-ouro) em comparação com aqueles obtidos nos testes alternativos
realizados. Os resultados em verde indicam concordância de 100% com os valores de
CMIs do padrão-ouro; os resultados em amarelo indicam diferença nos valores de
CMIs, porém com concordância de categoria; os resultados em azul indicam erro grave
de mudança de categoria (erro com menor risco de afetar o paciente); os resultados em
vermelho indicam erros muito graves de mudança de categoria (com maior potencial de
afetar negativamente o prognóstico do paciente, uma vez que a amostra é resistente ao
antibiótico, de acordo com o método padrão-ouro e o teste avaliado indica sensibilidade,
podendo causar erro e fracasso na terapêutica, se o mesmo for utilizado).
Comparando os resultados da microdiluição em caldo com os do sistema BD
Phoenix, observou-se a ocorrência de três (17,6%) erros muito graves. O percentual de
concordância de categoria foi de 82% (14/17), sendo que três (21,54%) amostras
apresentaram o mesmo valor de CMI verificada na microdiluição em caldo e uma (9%),
das onze amostras restantes, apresentou concordância essencial (Tabela 4).
48
Tabela 4. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em Caldo e o
sistema Phoenix BD, de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Células em verde indicam número de resultados 100% concordantes com o método padrão-ouro; as
células amarelas indicam número de resultados com concordância de categoria; as células
vermelhas indicam número de resultados com erros muito graves.
Na comparação entre os resultados da microdiluição em caldo com os do
Policimbac verificou-se um erro muito grave (6%) e um erro grave (6%); quinze
amostras (88%) apresentaram CIMs dentro da mesma categoria, sendo que em 3 (20%)
verificou-se os mesmos valores de CMIs e nas doze restantes, quatro (26,6%)
apresentaram concordância essencial (Tabela 5).
Tabela 5. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em Caldo e
Policimbac, de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Células em verde indicam número de resultados 100% concordantes com o método padrão-ouro; as células amarelas indicam número de resultados com concordância de categoria; a célula azul indica
número de resultado com erro grave e a célula vermelha indica número de resultado com erro muito grave.
A comparação dos resultados da microdiluição em caldo com aqueles obtidos no
Etest mostrou dois erros muito graves (11,8%). A concordância de categoria foi
observada em quinze amostras (88%), sendo que três (20%), apresentaram os mesmos
valores de CMIs nos dois testes e entre as doze restantes, dois (16,7%) apresentaram
concordância essencial (Tabela 6).
49
Tabela 6. Correlação entre os valores de CIMs obtidos nos testes de Microdiluição em Caldo e Etest de
17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Células em verde indicam número de resultados 100% concordantes com o método padrão-ouro; as
células amarelas indicam número de resultados com concordância de categoria; as células vermelhas indicam número de resultados com erros muito grave.
Comparando-se os resultados da microdiluição em caldo com os resultados de
crescimento no ágar SuperPolimixina verificou-se que houve dois erros muito graves
(17,6%), resultando em falsa-sensibilidade (amostras resistentes à polimixina B pelo
método de referência, mas que apresentaram crescimento discreto no meio seletivo) Por
outro lado, quinze (88%) amostras apresentaram resultados de crescimento no meio
seletivo concordantes com as CMIs obtidas na microdiluição em caldo (Tabela 7).
Tabela 7. Correlação entre os valores de CIMs obtidos para os testes Microdiluição em Caldo e Ágar
Superpolimixina de 17 amostras de Klebsiella pneumoniae
Cresc.: crescimento; Células em verde indicam números de resultados 100% com concordantes com o método padrão-ouro e células vermelhas indicam números de resultados apresentando erros muito
graves.
Os percentuais de sensibilidade e especificidade para os métodos alternativos
também foram calculados. As taxas obtidas para sensibilidade e especificidade,
respectivamente, foram as seguintes: BD Phoenix (78,6% e 100%), Policimbac (92,8%
e 66,7%), Etest (86% e 100%) e Ágar Superpolimixina (85% e 100%).
50
5. DISCUSSÃO
A resistência antimicrobiana está crescendo rapidamente em bacilos Gram-
negativos, particularmente entre as enterobactérias e principalmente em isolados de
Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), e tem se tornado cada vez mais uma ameaça
mundial à saúde pública 52.
O Brasil, assim como a maioria dos países em desenvolvimento, apresenta em
ambiente hospitalar, uma elevada variedade desses isolados resistentes a maioria dos
antibióticos disponíveis atualmente para tratamento 94; 95.
Apesar do desenvolvimento de novas moléculas de antimicrobianos das últimas
décadas, as bactérias estão simultaneamente criando mecanismos de resistência que
permitem a sua sobrevivência quando expostas a essas novas drogas. O que se tem
observado é que as bactérias estão adquirindo resistência aos novos fármacos com maior
rapidez que a capacidade de se desenvolver novas drogas 96.
Entre os mecanismos de resistência em Gram-negativos, a produção de
carbapenemases e a resistência a polimixinas são os que trazem maior preocupação.
Atualmente é de grande importância a rápida detecção dessas resistências para que o
tratamento seja mais adequado e eficaz, diminuindo a taxa de óbitos relacionados a essas
resistências.
O teste de Hodge modificado, utilizado para detecção de amostras produtoras de
carbapenemases, possui boa sensibilidade para detecção de amostras KPC positivas,
porém para enzimas NDM a sensibilidade diminui para 50%; com isso a Anvisa 97
preconiza que o THM não deve ser utilizado para a confirmação de produção de
carbapenemases, principalmente NDM, para o qual é recomendado atualmente, o teste
de mCIMm e eCIM e o Carba NP, entre outros.
O teste de Hodge modificado foi realizado em todas as 13 amostras de pacientes
atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), identificadas como sendo
resistentes aos carbapenêmicos através do sistema automatizado BD PhoenixTM,
detectando 12 (85,7%) amostras positivas para produção de carbapenemases. Esse
resultado foi semelhante ao encontrado nos testes de mCMI. apesar do THM ser
caracterizado por apresentar baixa sensibilidade e especificidade 98. Segundo um estudo
recente, realizado nos Estados Unidos, que comparou testes fenotípicos para a detecção
51
de produção de carbapenemases, o mCMI obteve 98% de sensibilidade e 99% de
especificidade; já o THM obteve 95% de sensibilidade e 91% de especificidade 99.
Segundo o estudo de Pierce e colaboradores, em 2017, o teste mCIM foi bastante eficaz.
De acordo com os resultados obtidos, 91 dos 92 isolados, previamente caracterizados
como portadores de genes para carbapenemases, foram positivos nos testes de mCIM
(99% de sensibilidade) e todos os 23 isolados caracterizados como não portadores de
genes para carbapenemases, foram negativos (100% de especificidade) 100.
Nossos resultados mostraram desempenhos semelhantes entre os dois testes
fenotípicos e uma boa eficiência de ambos os testes para triagem de amostras produtoras
de KPC, em hospitais onde a prevalência dessa carbapenemase é elevada. Entretanto, o
padrão-ouro para diagnóstico do mecanismo de resistência aos carbapenêmicos é a
detecção molecular dos possíveis determinantes genéticos para carbapenemases, como
os genes blaKPC, blaNDM e outros.
Em relação à detecção molecular através de reações de PCR para detecção dos
genes codificadores de carbapenemases, a taxa elevada (93%) de bactérias produtoras
de carbapenemases encontrada no presente estudo, indica ser esse o principal
mecanismo de resistência aos carbapenêmicos entre as amostras analisadas,
particularmente a produção de KPC (92%).
Nos últimos anos, no Brasil, a emergência da resistência aos carbapenêmicos
associada à produção da carbapenemase do tipo KPC tem aumentado drasticamente.
Um trabalho mais recente de São Paulo, realizado com isolados de 9 hospitais
demonstrou que > 80% de K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, eram
portadoras do gene blaKPC 15; 16; 17; 18. Apesar do pequeno número de amostras
analisadas, os resultados obtidos estão de acordo com a literatura, que aponta a espécie
K. pneumoniae como sendo aquela mais associada com a produção de carbapenemase
do tipo KPC no Brasil, sendo também essa carbapenemase a mais prevalente no
território nacional36.
Todas as amostras positivas para o gene blaKPC, foram resistentes a polimixina
com exceção de uma (92%). Esse resultado está de acordo com vários outros estudos
que mostram um percentual mais elevado de resistência a polimixina na população de
amostras produtoras de KPC, do que na população em geral, especialmente quando a
espécie K. pneumoniae é considerada 51.
52
O aumento do uso das polimixinas para o tratamento de infecções causadas por
bactérias CarbR tem sido relacionado com o aumento da resistência a esses
antimicrobianos 101. A resistência concomitante às essas duas drogas, consideradas
últimas linhas para o tratamento de infecções Gram-negativos multirresistentes, traz
grande preocupação e aponta para a necessidade da detecção rápida dessas amostras
visando implementação de medidas de controle de infecção, bem como a otimização do
uso desses antimicrobianos no ambiente hospitalar investigado.
Entre as amostras KPC positivas, uma foi sensível aos carbapenêmicos pelo
sistema BD Phoenix, entretanto essa amostra mostrou-se resistente a essas drogas pelo
teste de difusão em ágar, realizado posteriormente, para confirmação do perfil de
sensibilidade aos carbapenêmicos. Esse resultado indica um erro muito grave no sistema
automatizado para essa amostra e a importância de se verificar o perfil de sensibilidade
a drogas consideradas como últimas opções, por mais de um método.
Ainda, uma amostra CarbR foi negativa para todos os três genes pesquisados,
indicando a presença de outro mecanismo de resistência a essas drogas ou a de outra
carbapenemase, não investigada, como por exemplo, a GES 5 e a GES-16, já isoladas
no Rio de Janeiro em Serratia marcescens 102.
Apesar de já haver vários relatos no Brasil da OXA-370, uma variante da OXA-
48, nenhuma das amostras testadas foi positiva para esse gene 103. Apenas uma amostra
resistente aos carbapenêmicos apresentou o gene blaNDM, entretanto os testes fenotípicos
THM e eCIM não detectaram essa amostra, apresentando resultado falsos negativos. Em
adição outras duas amostras, identificadas pelo teste eCIM como produtoras de ML,
foram blaKPC positivas. Em conjunto, esses resultados mostraram que o teste eCIM,
recomendado para detecção de ML, não apresentou boa sensibilidade, nem
especificidade. Como o número de isolados testados foi pequeno (n = 13), faz-se
necessário outros estudos, com número maior de amostras para uma melhor
compreensão do desempenho do eCIM. A detecção da amostra NDM positiva indica a
circulação desse determinante genético no hospital investigado. Em adição, essa
amostra além da resistência aos carbapenêmicos, apresentou resistência a polimixina e a
todos os outros antimicrobianos testados, com exceção da tigeciclina, limitando bastante
as opções terapêuticas. Cabe ressaltar que, infecções causadas por cepas produtoras de
NDM não são eficazmente tratadas pela Ceftazidima-Avibactam, um novo
53
antimicrobiano, com ação contra cepas produtoras de KPC, reforçando a necessidade do
monitoramento desse mecanismo de resistência, no hospital investigado 104.
O método padrão-ouro para determinar a susceptibilidade à polimixinas é a
microdiluição em caldo, que requer muita atenção, além de ser uma técnica fastidiosa e
de período de 16-18 horas para leitura e interpretação dos resultados. Sendo assim,
testes alternativos são necessários.
Em relação às faixas de valores das CMIs encontradas, de uma forma geral, o
Policimbac mostrou uma tendência a apresentar CMIs mais elevadas que as CMIs
observadas no padrão-ouro e o Etest, uma tendência a apresentar CMIs mais baixas. A
utilização do método de Etest para verificação da resistência a colistina tem sido não
recomendada, pela fraca difusão das polimixinas em ágar84, além desse método
apresentar taxas altas de erros e CMIs menores, quando comparadas ao padrão-ouro 80.
Os nossos resultados mostraram valores de CMIs mais baixos em comparação com os
valores observados nos testes de microdiluição em caldo, estando de acordo com a
literatura. Essa fraca correlação do Etest com o método padrão ouro pode ser explicada
pela fraca difusão da polimixina em ágar84. Esses resultados reforçam que os testes
epsilométricos não são adequados para determinação de CMIs frente à polimixina.
Valores de CMIs mais elevadas ou mais baixas que o valor verdadeiro podem ocasionar
falhas na escolha da dosagem e posologia da droga, podendo interferir negativamente
no prognóstico do paciente 101.
O sistema BD Phoenix, apresentou menor faixa de CMIs, uma vez que, por
limitação dos sistemas automatizados em geral, a faixa de concentrações dos
antimicrobianos são restritas e próximas dos pontos de corte para os valores de
sensibilidade e resistência 105.
No estudo conduzido por Ozyurt e colaboradores (2019) 105, verificou-se que o
sistema BD Phoenix apresentou uma taxa muito elevada de erro muito grave, não
distinguindo de forma confiável as cepas resistentes à colistina, das suscetíveis. Em
nosso estudo, o sistema BD Phoenix foi o que apresentou a menor taxa de sensibilidade
(78%). Em adição, o maior percentual (17,6%) de erros muito graves foi observado
entre os resultados obtidos no sistema automatizado. Esses resultados estão de acordo os
resultados encontrados por Ozyurt e colaboradores 105 e reforçam a necessidade da
implementação na rotina laboratorial do método de microdiluição em caldo ou de um
54
outro método alternativo mais eficaz que o sistema automatizado para a determinação
do perfil de sensibilidade a polimixinas.
O teste de microdiluição comercial Policimbac, mesmo fornecendo resultados
após 24 horas, assim como a microdiluição em caldo in house, é um teste mais prático e
menos trabalhoso, já que os poçinhos da galeria já têm as concentrações crescentes do
antibiótico, diluídas no MH. Além disso, a solução reveladora, adicionada após o
período de incubação, auxilia na leitura, facilitando a visualização do resultado.
Por ser um método recentemente introduzido no mercado, ainda não há trabalhos
na literatura avaliando o desempenho do Policimbac. No presente estudo, o desempenho
do método Policimbac foi analisado, em comparação com o padrão-ouro, observando-se
uma boa sensibilidade (92%), mas uma especificidade baixa (66%). O baixo valor de
especificidade verificado nesse método pode ser devido à capacidade de aderência da
polimixina à parede da placa de titulação, que é explicada pela natureza catiônica das
moléculas das polimixinas, que tendem a interação com as cargas negativas da placa de
poliestireno88. Essa interação e aderência podem contribuir para a diminuição do
antibiótico no poçinho da galeria, o que resultaria em resultados falso-resistentes. As
placas utilizadas para a microdiluição em caldo in house também são de poliestireno,
porém esse problema é minimizado, uma vez que o tempo que o antibiótico permanece
no poço é muito inferior (24 horas), se comparado ao tempo do antibiótico diluído na
galeria do Policimbac, já que as mesmas apresentam um prazo de validade em torno de
1 a 4 meses.
Outras variáveis importantes que devem ser consideradas ao se realizar o teste
comercial é que a suspensão bacteriana é adicionada nos poços da galeria do teste sem
homogeneização com o antibiótico que está diluído, de forma a resultar numa
concentração incorreta do antibiótico, se este não estiver completamente
homogeneizado, podendo também levar a resultados falso-resistentes. Outro ponto
importante é o armazenamento do teste, que deve ser conservado em temperatura entre
2-8ºC; caso o armazenamento não ocorra de forma correta, o antibiótico pode ser
degradado e ter sua concentração diminuída em cada poço.
Cabe ressaltar que apesar da baixa especificidade, o Policimbac foi o método
mais sensível entre os métodos analisados, indicando que esse pode ser um bom método
55
alternativo para ser utilizado na rotina laboratorial, embora seja recomendada a
confirmação dos resultados de sensibilidade pelo método de referência.
Muitos estudos se mostram contrários à utilização do método de E-test para
verificação da resistência a colistina, pela fraca difusão das polimixinas em ágar 84, além
de apresentarem taxas altas de erros e CMIs menores, quando comparadas ao padrão-
ouro 80. Os resultados obtidos no presente trabalho nos testes episilométricos mostraram
valores de MICs mais baixos do que aqueles encontrados nos testes de microdiluição
em caldo, estando de acordo com a literatura.
Em nosso estudo, obtivemos uma sensibilidade de 85% e especificidade de
100% para este teste. Dentre os isolados resistentes segundo a microdiluição em caldo,
dois mostraram perfil de sensibilidade no teste epsilométrico.
O Ágar Superpolimixina utilizado no presente estudo apresentou resultados
satisfatórios, com taxa de sensibilidade de 85% e especificidade de 100%. Meios de
cultura seletivos oferecem uma alternativa prática de detecção de bactérias resistentes às
polimixinas. O uso do Ágar Superpolimixina na rotina dos laboratórios é um método
prático para o rastreio dessa resistência, pela facilidade de execução e fácil
interpretação84. A taxa de sensibilidade mais baixa encontrada nesse método pode ter
ocorrido devido à quantidade de bactéria inoculada no meio. Segundo estudo conduzido
por Nordmann e colaboradores (2016), o menor limite de detecção para isolados
resistentes no ágar superpolimixina foi de 1x10³ UFC/mL, e a maior concentração capaz
de evitar o crescimento de isolados sensíveis foi de 1x106UFC/mL 86. Em nosso estudo,
uma alçada de colônias foi semeada diretamente no meio, o que pode ter prejudicado a
sua avaliação, influenciando o valor de sensibilidade calculado. Outros testes,
utilizando-se uma concentração fixa de UFC/mL e em um maior número de amostras se
fazem necessários para uma melhor compreensão do desempenho do ágar
SuperPolimixina.
Cabe salientar que o presente trabalho apresentou limitações na sua realização,
uma vez que o ideal seria a realização concomitante de todos os testes, utilizando-se
uma mesma suspensão de inóculo e o mesmo caldo Mueller-Hinton. Essa dificuldade
também foi relatada por Matuschek e colaboradores 84.
56
Não foram encontradas amostras produtoras de MCR, entre as amostras
resistentes a polimixina. Esse resultado sugere que o mecanismo de resistência a essas
drogas entre as amostras estudadas deve estar associado com mutações cromossômicas.
No Brasil, a mutação do gene MgrB ainda é o principal mecanismo de resistência A
polimixinas.
A detecção e o monitoramento da disseminação de bactérias resistentes à
polimixina, bem como dos mecanismos de resistência envolvidos, são de extrema
importância, já que restam poucas alternativas no tratamento infecções causadas por
microrganismos Gram-negativos multirresistentes 106.
57
6. CONCLUSÕES
✓ Nossos resultados mostraram desempenhos semelhantes entre os dois testes
fenotípicos THM e CIM e uma boa eficiência de ambos os testes para triagem de
amostras produtoras de KPC.
✓ Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) foi a carbapenemase mais
prevalente dentre as amostras (70,6%). A ocorrência de uma amostra NDM-1
positiva indica a introdução e possível circulação dessa enzima no hospital
investigado. Nenhuma amostra foi positiva para o gene blaOXA-48.
✓ A detecção de uma amostra resistente a polimixina e aos carbapenêmicos, devido à
expressão do gene blaNDM-1, traz grande preocupação, uma vez que o novo
antimicrobiano ceftazidima-avibactam, introduzido como opção para tratamento de
IRAS por bacilos Gram-negativos multirresistentes não tem atividade contra
NDM-1.
✓ Os resultados dos testes fenotípicos testados em comparação com o método de
referência mostraram boas taxas de sensibilidade e especificidade. O percentual de
concordância de categoria dos testes foram os seguintes: sistema automatizado
Policimbac (88%), Etest (88%) e BD Phoenix (82%).
✓ A confirmação dos resultados associados com resistência a polimixina dos
métodos Etest e BD Phoenix, pela técnica de referência, se faz necessária, uma vez
que a sensibilidade desses testes foi mais baixa.
✓ O método Policimbac apresentou boa sensibilidade, podendo ser uma melhor
opção para a verificação dessa resistência. Entretanto, a confirmação pelo método
de referência ainda se faz necessária, ou ainda, o aperfeiçoamento do método para
proporcionar melhor especificidade ao mesmo.
✓ O Ágar Superpolimixina mostrou-se como uma boa alternativa de método
fenotípico para triagem de amostras resistentes à polimixina, com uma
sensibilidade de 85% e especificidade elevada de 100%.
✓ Todas as amostras resistentes a polimixina foram negativas para o gene mcr e suas
variantes investigadas, sugerindo que esse gene ainda não foi introduzido no
58
hospital de estudo e que o principal mecanismo de resistência entre as amostras
analisadas é o relacionado com mutações cromossômicas, levando a alterações do
LPS.
✓ No conjunto, os resultados obtidos revelaram discrepâncias entre os métodos
alternativos em comparação com o padrão-ouro, levando à necessidade de mais
estudos e pesquisas desses métodos, com um número maior de amostras, para um
melhor entendimento dos seus desempenhos, de modo a promover avanço na
assistência hospitalar.
59
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