UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · utilização terapêutica, mas vários problemas...
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i UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE EMULSÕES DE ÓLEO DE COPAÍBA: DETERMINAÇÃO DO EQUILÍBRIO HIDRÓFILO-LIPÓFILO crítico (EHLc), PROPRIEDADES E ESTABILIDADE FÍSICO-QUÍMICAS FRANCISCO HUMBERTO XAVIER JÚNIOR Natal/RN 2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EMULSÕES DE ÓLEO DE COPAÍBA: DETERMINAÇÃO DO EQUILÍBRIO
HIDRÓFILO-LIPÓFILO crítico (EHLc), PROPRIEDADES E ESTABILIDADE
FÍSICO-QUÍMICAS
FRANCISCO HUMBERTO XAVIER JÚNIOR
Natal/RN
2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EMULSÕES DE ÓLEO DE COPAÍBA: DETERMINAÇÃO DO
EQUILÍBRIO HIDRÓFILO-LIPÓFILO crítico (EHLc),
PROPRIEDADES E ESTABILIDADE FÍSICO-QUIMICAS
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS DA SAÚDE, COMO PARTE
DOS REQUESITOS PARA OBTENÇÃO
DO TÍTULO DE MESTRE
Francisco Humberto Xavier Júnior
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
Natal/RN
2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora: Profa. Dra. Técia de Oliveira Maranhão
Natal/RN
2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EMULSÕES DE ÓLEO DE COPAÍBA: DETERMINAÇÃO DO
EQUILÍBRIO HIDRÓFILO-LIPÓFILO crítico (EHLc),
PROPRIEDADES E ESTABILIDADE FÍSICO-QUIMICAS
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
Membros da Banca
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
Prof. Dr. Ruy Carlos Ruver Beck
Prof. Dr. Marcio Ferrari
Natal
2011
v
DEDICATÓRIA
“A Deus por me guiar, concedendo-me
persistência, força e, sobretudo, sabedoria
para compreensão do que quero, do que
posso, do que sou capaz e do que
consigo. Pois somente a Ele cabe o
presente como melhor parte no tempo de
nossas vidas...”
vi
Aos meus pais Francisca e Humberto Xavier
Há 24 anos foi me dado o maior presente que qualquer pessoa pode receber: A
vida. Hoje, eu sou grato aos meus pais por partilharem comigo cada conquista
recebida neste tempo.
Painho...Mainha... Meu coração arde em gratidão a Deus por ter me dado a
cada um de vocês, por terem ensinado o valor da dignidade e retidão humana,
vocês são pessoas tão belas que não medem esforços pela felicidade de seus
filhos. Por vocês terem muitas vezes esquecido de vocês mesmos para poder
se alegrar com minhas conquistas e sonhos. Obrigado por, junto comigo, viver
a felicidade, as vitórias, as tristezas, as dúvidas, os acertos e erros durante
todo este período.
Neste momento não bastam apenas palavras para expressar meus sinceros
agradecimentos e hoje ofereço aquilo que é mais caro:
Ofereço-lhes a alegria deste momento!
Amo vocês!
vii
AGRADECIMENTOS
Uma das partes mais emocionantes da dissertação é escrever os
agradecimentos. Emocionante por lembrar-se de todas as pessoas que me
acompanharam durante esse trabalho e poder enxergar que não posso vencer
sozinho, mas com a colaboração direta ou indireta de muitos.
Antes de tudo, agradeço ao autor da vida: Deus, por ter me dado força,
coragem e sentido para viver e buscar os sonhos que Ele sonhou para mim.
Obrigado! Senhor, por ter me dado obstáculos para que eu pudesse superar e
crescer, obrigado pela minha família e amigos, obrigado por seu infinito amor.
À Maria Santíssima, mãe, serva e escrava do amor, que intercede por
cada missão e plano de Deus em minha vida, Ela que me ensina a linguagem
do amor, da humildade e da simplicidade de coração.
À minha família, pelo apoio, carinho, paciência e força nestes últimos
tempos de ausência na convivência domiciliar. A TODOS vocês sou
eternamente grato por acreditaram que meu sonho era possível e por estarem
sempre ao meu lado.
Aos meus irmãos, Maxwell e Annice, esta conquista também é de vocês,
mesmo passando estes anos distantes, saibam que eu amo a cada um de
forma especial e vocês sempre estiveram e estarão presentes em minha vida.
Agradeço a meu orientador, Prof. Dr. Sócrates Egito, por ter me aceito
como aluno desde a graduação e possibilitado meu ingresso nesta jornada.
Obrigado pela paciência e transmissão de seu conhecimento.
A minha co-orientadora, Prof. Dra. Ivonete Batista, por ter participado
deste trabalho. Por sua competência, boa vontade e pelas cobranças, que
contribuíram muito para o meu crescimento pessoal e profissional.
viii
A Gyselle Holanda, orientadora, professora, companheira e amiga.
Gysa, muito obrigado pela paciência e dedicação em me ajudar neste caminho
em busca de meus sonhos pessoais, sou grato por você me abrir os olhos
perante a vida acadêmica e por você nunca ter desistido de estar ao meu lado.
Aos amigos do LASID, companheiros para todas as horas. Obrigado a
cada um por estarem presente na construção deste trabalho. De forma
especial, agradeço aos membros da Equipe PenGB: Gyselle, Iury, Karolyne,
Rosilene, Cybelle, Alexandre, Alexandrino, Everton e Andreza.
A sub-equipe ME-Cop, de forma muito especial, agradeço a Everton
Alencar e Andreza Rochelle, por vocês terem sido os meus braços durante este
mestrado, por compartilharem comigo a vida de vocês e por me ajudar nesta
caminhada... Muito Obrigado... E se lembrem que tudo na vida vale a pena!
A Pryscila Araújo e Família, pela paciência, companheirismo, torcida e fé
depositada sobre meus sonhos durante este tempo, vocês fizeram uma
diferença muito grande nesta conquista. Obrigado por entender cada ausência.
A minha família de Natal, Alexandre, Jane, Léa Martins, e a André e
Adriele Lins, pelas orações, momentos de descontração e por dividirem comigo
a felicidade de ser jovem, saibam que vocês fizeram de nossa casa um lar.
Aos todos os meus grandes amigos, a vocês meus sinceros
agradecimentos, pela paciência, por me ouvir em todos os momentos e por me
ajudarem nesta caminhada através das nossas conversas e partilhas de vida.
A todos os funcionários do Programa de Pós Graduação em Ciências da
Saúde e do Departamento de Farmácia da UFRN que estiveram nos bastidores
desta conquista.
À CAPES, pela apoio financeiro da bolsa de mestrado.
ix
SUMÁRIO
Dedicatória ........................................................................................................ v
Agradecimentos .............................................................................................. vii
Resumo ............................................................................................................. x
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 3
3. ANEXAÇÃO DO ARTIGO .............................................................................. 8
4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ............................................. 44
5. APÊNDICE ................................................................................................... 48
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 53
7. ABSTRACT .................................................................................................. 57
x
RESUMO
Durante as últimas décadas, as indústrias farmacêuticas têm despertado
grande interesse em óleos vegetais e vários extratos de planta por causa da
sua baixa toxicidade e alta biodegrabilidade. O óleo de copaíba (Cop) é usado
in natura na medicina popular como anti-inflamatório e antimicrobiano para
tratar várias doenças, tais como inflamação da garganta, úlceras e infecções
urinárias e pulmonares. Emulsões são sistemas dispersos termodinamicamente
instáveis que consistem em dispersões de gotículas microscópicas em outro
líquido imiscível. O objetivo deste trabalho foi preparar diferentes emulsões de
Cop, determinar o EHL crítico deste óleo e avaliar a sua estabilidade, além de
realizar estudos comparativos entre diferentes métodos de construção de
diagramas de fases. As emulsões foram preparadas pelo método de inversão
de fases variando as proporções de EHL de 4,7 a 16,7. A estabilidade foi
determinada por vários métodos e os diagramas de fases foram produzidos
pelo método de titulação usando diferentes procedimentos de agitação. As
emulsões a base de Cop com EHL entre 12,7 e 15,7 foram as mais estáveis.
As emulsões apresentaram boa estabilidade em curto e longo prazo, aspecto
leitoso e baixos valores de índice de cremagem. Diferentes sistemas coloidais
foram produzidos a partir dos diagramas de fases dependendo do processo de
agitação. Baseado nesses métodos, o valor determinado de EHL do Cop foi
14,8, as emulsões permaneceram estáveis por mais de um ano e estes
resultados indicam que o estudo das emulsões de Cop pode ser um promissor
veículo de liberação tópica de fármacos e ativos cosméticos.
Palavras chaves: emulsões, óleo de copaíba, Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo,
diagrama de fases pseudoternário., estabilidade.
1
1. INTRODUÇÃO
Os óleos vegetais naturais apresentam inúmeras vantagens para uso
terapêutico, como baixa toxicidade, elevada biodegradabilidade e são
renováveis quanto à disponibilidade em relação aos derivados de petróleo que
são finitos (1, 2).
O óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) tem sido bastante
utilizado na medicina tradicional, principalmente, pela sua atividade anti-
inflamatória, antitumoral, antitetânica e antimicrobiana (3-5). Estas, entre outras
propriedades presentes no óleo, são decorrentes da composição fitoquímica
que revela a presença de cerca de 72 hidrocarbonetos de sesquiterpenos e
uma mistura diterpênica (6, 7).
O desenvolvimento de sistemas terapêuticos lipídicos torna-se
necessário com o objetivo de se obter uma forma farmacêutica tecnicamente
mais elaborada e com maior segurança em relação à utilização do óleo de
copaíba puro como é feito na medicina popular. Neste contexto, surgem as
emulsões que são sistemas termodinamicamente instáveis formados por
gotículas microscópicas, dispersas dentro de outro líquido com polaridades
diferente entre si, estabilizado por um ou mais tensoativo (8-10). O estudo das
condições ótimas de equilíbrio da proporção de tensoativo usado no sistema
para estabilizar a fase interna dentro de um sistema emulsionado corresponde
ao Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico (EHL) (11, 12).
Este estudo torna-se viável devido à existência de uma enorme
variedade de princípios ativos lipofílicos e insolúveis disponíveis para a
utilização terapêutica, mas vários problemas de ordem farmacotécnica
2
impedem a veiculação dos mesmos em sistemas bifásicos (13). A grande
diversidade de agentes emulsionantes disponíveis no mercado também
dificulta a seleção dos tensoativos ideais para a produção de emulsões
estáveis. Entretanto, geralmente, o processo de obtenção de tais sistemas é
feito empiricamente, que leva a diversas manipulações em busca do resultado
ideal, resultando em uma enorme perda de tempo e matéria-prima (13, 14).
A indústria farmacêutica encontra desafios para carrear fármacos
lipofílicos em sistemas não miscíveis, onde os sistemas tradicionais, como
soluções ou suspensões, não podem ser usados. Muitos fármacos
caracterizados como moléculas insolúveis, porém eficientes, estão sendo
proscritos da prática clínica por causa do incomodo terapêutico relativo às vias
e as técnicas de administração, além do aparecimento de efeitos indesejados.
Os diversos estudos da literatura no tocante ao desenvolvimento de
sistemas bifásicos demonstraram que a determinação do EHL crítico de
frações lipídicas e a determinação de diagramas ternários são fundamentais
para se obter emulsões estáveis e com um custo de fabricação reduzido.
O desenvolvimento deste projeto permitirá o domínio do uso do sistema
de EHL e do sistema de diagramas ternários para a obtenção de emulsões a
partir de óleos vegetais, como é o caso do óleo de copaíba. As emulsões
apresentam uma grande utilidade no domínio farmacêutico por permitir o uso
racional de moléculas insolúveis na terapêutica clínica. Os resultados obtidos
pela metodologia proposta neste trabalho permitiram empregar os sistemas
emulsionados com um largo intervalo de fração lipídica, o que permitiu a
obtenção de diferentes formulações com concentrações variadas do princípio
ativo.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
Os óleos vegetais apresentam um maior número de vantagens em
relação aos de origem mineral. Eles apresentam baixa toxicidade,
biodegradabilidade superior, contém substâncias com diversas propriedades
farmacológicas e cosméticas e são renováveis, enquanto que a disponibilidade
na natureza de produtos químicos do petróleo é finita (1, 2).
O óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) é extraído de árvores
nativas da região tropical da América Latina e da África Ocidental, este tem
sido bastante utilizado, como componente de produtos (pomadas e xaropes); in
natura, por administração oral ou aplicação tópica; utilizado para a indústria de
cosméticos por suas propriedades emolientes, bactericida e anti-inflamatório;
na manufatura de sabonetes, cremes e espumas de banho, xampus, cremes
condicionadores loções hidratantes e capilares, para condicionar o cabelo e
ainda na indústria de perfumes, onde é uma matéria-prima importante por ser
um excelente fixador, com notas frescas e acres (3-5).
Na medicina tradicional, ao óleo de copaíba, é atribuída a atividade anti-
inflamatória, antitumoral, antitetânica, antihemorágica; é utilizado como anti-
séptico urinário, no tratamento de bronquite, sífilis, doenças de pele e úlcera.
Vários estudos científicos com o óleo de copaíba vêm sendo realizados no
meio científico para melhor conhecimento das suas propriedades anti-
inflamatórias, anti-tumoral contra sarcoma de Walker e melanoma,
antiulcerogênica, antioxidante, e anti-lipoperoxidativa, cercaricida e anti-
helmíntica, repelente para insetos e antimicrobiana (9, 15, 16).
4
Tais propriedades são decorrentes da sua composição fitoquímica que
revela a presença de cerca de 72 hidrocarbonetos de sesquiterpenos entre os
quais, os de maiores importâncias são: β-cariofileno, óxido de cariofileno,
humuleno, α-cis-bergamoteno, ar-curcumeno, e α-trans-bergamoteno; e uma
mistura diterpênica, representando 70%, cujo compostos de destaque são os
cauranos e ácidos poliálticos; mas há diferenças significativas entre as diversas
espécies desta planta (6, 7).
Os óleos apresentam características de possuírem odor desagradáveis,
serem intragáveis, de difícil espalhabilidade, apresentam menor absorção e
podem causar embolia quando administrado por via intravenosa. Substâncias
farmacológicas, quando veiculadas em formas farmacêuticas convencionais,
geralmente não conseguem atingir concentração apreciável no tecido alvo do
organismo e expõem os tecidos normais do organismo aos efeitos
potencialmente tóxicos dos componentes presentes em sua constituição (17-
19).
Desta forma, o desenvolvimento de um sistema terapêutico eficaz, capaz
de carrear o óleo de copaíba e conferir um aumento na sua biodisponibilidade,
torna-se vantajoso para melhoria da terapêutica. Assim, neste contexto,
surgem as emulsões que são sistemas líquidos termodinâmicos instáveis
formados por gotículas microscópicas, em torno de 0,5 a 100μM, dispersas
dentro de outro líquido com polaridades diferentes entre si estabilizadas por um
ou mais tensoativos (8).
Tradicionalmente, as emulsões são usadas para dispersar óleos em uma
forma aceitável pelo paciente. A administração de um medicamento líquido sob
a forma de glóbulos diminutos pode acelerar sua absorção e torná-lo mais
5
eficaz (20). Há um crescente interesse na investigação do potencial das
emulsões em prolongar o efeito farmacológico de princípios ativos com tempos
de meia-vida curtos ou biodisponibilidade limitada por via oral (21, 22). Estudos
demonstraram que a incorporação de um fármaco em emulsão O/A aumentou
significativamente a absorção quando comparada com soluções aquosas
equivalentes do fármaco administradas oralmente, embora este aumento na
absorção após administração oral seja dependente do tipo de óleo utilizado
para compor a fase interna da emulsão (23).
A aceitação pelo paciente é a razão mais importante do uso terapêutico
de emulsões para veiculação de fármacos e justifica seu emprego como formas
farmacêuticas orais, tópicas e parenterais. Sistemas emulsionados podem ser
administrados sob forma líquida sem a necessidade de reconstituição pelo
usuário (24).
Uma emulsão é formada quando dois líquidos imiscíveis (normalmente,
um de natureza lipofílica e o outro hidrofílico) são mecanicamente agitados (9,
10). Geralmente, as emulsões se comportam como dispersões nas quais a fase
dispersa é conhecida como fase interna ou descontínua e a fase dispersante
como fase externa ou contínua. Na terminologia das emulsões, quando a fase
interna é lipofílica e a fase externa é hidrofílica, os sistemas são designados
como O/A – óleo em água. Em contraste, as emulsões que possuem fase
interna aquosa e fase externa oleosa são designadas A/O – água em óleo.
Estes sistemas ainda podem ser múltiplos do tipo A/O/A ou O/A/O (13, 25).
Os tensoativos são substâncias anfifílicas adicionadas nestes sistemas
objetivando proporcionar a estabilidade das fases, interagindo tanto com a fase
dispersa quanto com a fase dispersante da emulsão estabilizando a interface
6
óleo e água do sistema. Esse estudo das condições ótimas de equilíbrio da
proporção de tensoativo usado no sistema, corresponde ao equilíbrio
hidrofílico-lipofílico (EHL) da emulsão (11, 12).
Provavelmente, a consideração mais importante a respeito de emulsões
cosméticas e/ou farmacêuticas é a estabilidade do produto final, que deve ser
caracterizada pela baixa coalescência da fase interna, ausência de separação
de fases e manutenção constante das características como a aparência, odor,
cor e outras propriedades físicas (26). Uma emulsão estável é aquela cujas
gotículas dispersas mantêm suas características iniciais e permanecem
uniformemente distribuídas por toda a fase contínua. Entretanto, podem ocorrer
vários tipos de desvios desse comportamento ideal, como conseqüência dos
processos de instabilidade que comprometem o sistema (27).
A instabilidade de uma emulsão apresenta-se sob a forma de separação
de fases devido à cremagem (diferença de densidade), floculação
(aproximação entre as gotículas internas da emulsão) e coalescência (fusão
das gotículas). O processo de coalescência ocorre nas emulsões,
principalmente ao passar do tempo, o tamanho médio das partículas tendem a
aumentar com o armazenamento. Há outro mecanismo que causa a
instabilidade das emulsões, as pontes de Ostwald, onde as gotículas da fase
interna são pequenas e tem solubilidade finita na fase continua, neste caso
estas gotículas pequenas vão se unido as maiores (1, 28).
Alguns dos processos de instabilidade dos sistemas emulsionados
podem ser justificados segundo a lei de Stokes. Onde se observa uma direta
correlação entre o raio das gotículas dispersas, a gravidade e a diferença de
densidade entre as fases dispersas e dispersante. (26, 29, 30).
7
Os diagramas de fases permitem identificar várias regiões geradas,
assim como aquela que representa a melhor combinação dos componentes da
fórmula, em suas respectivas quantidades, e que produz o sistema de maior
estabilidade. O diagrama de fases descreve em qual condição experimental é
possível se obter emulsões e as regiões limites de transição entre
microemulsões, separação de fases e nanoemulsões. A representação gráfica
destas informações, através do emprego das propriedades do triângulo
eqüilátero, permite a identificação de diferentes sistemas dispersos obtidos
pela combinação de um único diagrama de três ou mais componentes (31).
A miscibilidade da fase oleosa, aquosa e anfifílica depende totalmente
da composição de cada componente específico da formulação. Os diagramas
de fases podem descrever a relação entre o comportamento de fases de uma
série de composições possíveis em uma mistura de componentes, estes são
essenciais para o estudo de sistemas coloidais, tais métodos vêm sendo
amplamente utilizados no campo farmacêutico e cosmético, devido à
importância de se determinar os estados de equilíbrio obtido (32-34).
A partir do emprego das propriedades do triângulo eqüilátero, em que a
soma dos lados perpendiculares de um determinado ponto equivale à sua
altura, pode-se estipular as diferentes combinações possíveis entre as três
fases propostas (água-óleo-tensoativo). Desta forma, cada vértice do triângulo
representa 100% de determinado componente, ao mesmo tempo em que a
base oposta ao mesmo representa 0% deste componente. A composição de
um determinado sistema inserido no triângulo é fornecida medindo-se as
distâncias perpendiculares a partir do ponto em relação aos três lados.
8
3. ANEXAÇÃO DO ARTIGO
Título do artigo: Prospective study for development of emulsion systems
containing natural oil products
Revista: Drug Development and Industrial Pharmacy
9
Prospective study for development of emulsion systems containing
natural oil products
Francisco Humberto Xavier-Júnior a, Kattya Gyselle de Holanda Silva a, Iury
Einstein Gomes Farias b, Andreza Rochelle do Vale Morais b, Everton do
Nascimento Alencar b, Ivonete Batista Araújo a, b, Anselmo Gomes de Oliveira c,
Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito a, b *
a Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) – Centro de Ciências
da Saúde (CCS) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
(PPGCSa) – Laboratório de Sistemas Dispersos (LaSiD), Av. Gal. Gustavo
Cordeiro de Farias, S/N, Petrópolis, 59010-180, Natal-RN-Brazil.
b UFRN, Departamento de Farmácia, LaSiD, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de
Farias, S/N, Petrópolis, 59010-180, Natal-RN - Brazil.
c UNESP – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Grupo de Sistemas
Biomiméticos – Fármacos, Rodovia Araraquara-Jau, km 01, 14801-902,
Araraquara-SP-Brasil.
* Author for correspondence:
Prof. E. S. T. Egito,
Rua Praia de Areia Branca, 8948,
59094-450 Natal/RN - Brazil.
Fax: +55 (84) 3342-9808. E-mail: [email protected] or [email protected]
10
Abstract
Background: Copaiba oil (Copaifera langsdorffii Desf.), a natural product widely
used “in natura” as an anti-inflammatory and anti-infective agent, presents two
major problems: (i) low absorption and bioavailability and (ii) an unpleasant
taste. The aim of this study was to develop copaiba oil emulsion systems. The
critical hydrophilic-lipophilic balance (HLBc) of copaiba oil was determined for
oil-in-water emulsion. The system was characterized in a pseudo-ternary phase
diagram (PTPD). A study on the physicochemical stability and the preparation
methods was carried out. Methods: Once an appropriate emulsion was
achieved, the samples were prepared employing the phase inversion
temperature method using different surfactant binary mixtures to obtain a range
of HLB values between 4.5 and 16.5. Therefore, the HLBc of copaiba oil for
O/W emulsion was calculated. The PTPDs were produced by the titration
method. The stability study was conducted up to one year, to evaluate the
efficiency of the preparation methods of the systems. Results: The HLB value of
copaiba oil for O/W emulsion was 14.8. The PTPDs were useful to describe the
component proportions to form several colloidal systems. The rheological
studies revealed that the formulations presented a non-Newtonian flux with
pseudoplastic and thixotropic characteristics. The proposed carrier emulsion
system remained pharmaceutically stable for more than one year. The stability
data revealed that no significant physicochemical instability occurred in the
samples in the experimental conditions. In conclusion, these results indicated
that the copaiba oil emulsion might be a promising vehicle for topical delivery of
drugs and active cosmetic ingredients.
11
Keywords: Emulsion, Copaiba oil, Hydrophilic-Lipophilic Balance, pseudo-
ternary phase diagram, stability analysis.
12
1.0 Introduction
Oils extracted from plant species have a number of potential advantages
compared to their mineral counterparts. They are less toxic, biodegradable, and
renewable, while petroleum chemicals are finite (Dossat, 2002). Vegetable oils,
which have become more attractive recently because of their economic benefits
and renewability, are used as components in many manufactured products
(Aluyor, 2009). Essential oils are used primarily as natural preservatives,
flavorings, and fragrances in cosmetic products (Orafidiya, 2002). The oils are
also used in the flavor and cosmetic industries (Veiga Jr, 2002) and as diesel-
like fuels (Monti et al., 1986).
Copaifera langsdorffii Desf. (Leguminosae), popularly known as „copaiba‟, is a
large tree that grows abundantly in the Brazilian States of Amazonas, Pará, and
Ceará (Paiva, 2004). Phytochemical studies conducted with Copaifera
langsdorffii oleo resin revealed the presence of essential oils (8%
sesquiterpens; β-caryophylline, caryophylline oxide, β-elemane, α-cis-
bergamotene, ar-curcumene, and α-trans-bergamotene) and a mixture of
diterpenes (70%; kaurenoic and polyalthic acids) (Paiva, 2004). However,
significant differences in its chemical composition were found among the
species (Santos, 2007). The benefits attributed to copaiba oil in popular
medicine are its anti-inflammatory, antitumor, and antitetanus properties.
Moreover, copaiba oil has been used as a urinary anti-septic, and also in the
treatment of bronchitis, syphilis, skin diseases, ulcers, and wounds (Gomes,
2007).
13
Emulsions are mixtures of two (or more) immiscible liquids dispersed one within
the other in the droplet form. They are thermodynamically unstable dispersion
with droplets diameter ranging from 0.5 to 100 µm (Lieberman, 1988). In
general, emulsions are used as delivery systems for water insoluble drugs and
have the potential for sustained release and drug targeting delivery by binding
ligands for various cell surface receptors (Cui, 2006).
The hydrophile-lipophile balance (HLB), first described by Griffin (Griffin, 1949),
has been used to describe the simultaneous attraction of surfactants or
surfactant blends and their ability to form stable emulsions, whose value is
close to that required of the oil phase (Kantaria, 2003). On the other hand,
pseudo-ternary phase diagrams provide the boundaries of the different
structures as a function of the component composition. Because of the
presence of more than three components, one of the axes is frequently a fixed
ratio of the other two (usually the mixture of the surfactant and co-surfactant),
while the other axes represent the oil and water components (Santos, 2008).
The border regions can be classified as emulsion, phase separation, and
microemulsion, among others. The pseudo-ternary phase diagram is
constructed to determine the composition of polar, non-polar, and surfactant
phases that will yield an emulsion (Tenjarla, 1999).
The aim of this study was the development and characterization of copaiba oil
emulsion systems. First, the critical hydrophilic-lipophilic balance (HLBc) of
copaiba oil was determined. Then, a pseudo-ternary phase diagram study was
developed. In addition, a study of the stability and the production methods for
such systems was carried out.
14
2.0 Materials and methods
2.1 Materials
Copaiba oil was obtained from Flores & Ervas (Piracicaba, SP, Brazil), Span
80® (sorbitan 80 monooleate) was purchased from Sigma Aldrich Inc (St Louis,
MO, USA), and Tween 20® (polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate) was
from VETEC (Rio de Janeiro, RJ, Brazil). Distilled water was used throughout
the experiments. All chemicals were of pharmaceutical grade and were used as
received without further purification.
2.2 Methods
2.2.1 Hydrophilic-Lipophilic Balance Design
The final HLB value of each system varied according to the individual
percentage of each surfactant. A series of 13 emulsions with HLB values
ranging from 4.5 to 16.5 (variation among total HLB values comprising one unit)
was first prepared by blending the emulsifiers at different ratios, according to
Equation 1(Griffin, 1949).
HLB = (WTwHLBTw +WSpHLBSp)/ (WTw +WSp) (Eq 1)
Where: WTw= the amount (weight) of Tween 20® used, and WSp= the amount
(weight) of Span 80® used at the “optimum ratio.” HLBTw and HLBSp= the
assigned HLB values for Tween 20® and Span 80®, respectively. HLB= the
“final HLB” value of the system for the type of emulsion being studied.
15
A second step involved emulsion preparation using smaller ratio intervals
between the two most stable emulsions from the first step.
2.2.2 Emulsion preparation
The oil-in-water emulsion-based formulation containing 5% (w/w) copaiba oil,
93% (w/w) water, and 2% (w/w) surfactant blends was prepared using the phase
inversion technique (PIT) (Yu, 1993). The required amount of Span 80® was
dispersed in the oil phase. Tween 20® was then dispersed in the aqueous
phase. Both phases were heated separately at 70°C. Final emulsions were
obtained after homogenization of oil and aqueous phases at 70ºC using an
Ultra-Turrax® T 25 homogenizer (IKA, Staufen, Germany) at 13,000 rpm for 10
minutes.
2.2.3. Emulsion characterization
2.2.3.1 Morphological analysis
Morphological examination of the emulsions was performed using an optical
microscope (Olympus, Center Valley, PA, USA) following blue staining with a 2
% (w/w) methylene blue solution. The preparation was observed under 4×, 10×,
and 40× lenses (Macedo, 2006).
2.2.3.2. Macroscopic aspect and creaming analysis
16
The color of the emulsions, as well as their stability variation (presence of
creaming, coalescence, or phase separation), was determined visually. The
creaming stability of emulsions, assessed by transferring 10 mL of emulsion into
a test tube and storing it at ambient temperature (approximately 25 ± 2°C), was
observed for one year. During this time, the volume of emulsion creamed at the
top was recorded and the creaming percentage calculated as follows (Equation
2)(Onunkwo, 1997):
%CI= (Cl/Ct) x 100 (Eq 2)
Where %CI is creaming index, Cl is the height of the cream layer, and Ct is the
total height of the emulsion tube.
2.2.3.3 pH Evaluation
Emulsion pH was measured by using a pre-calibrated pHmeter PG-2000
(GEHAKA, São Paulo, SP, Brazil) at 25 ± 2°C.
2.2.3.4. Conductivity analysis
The electrical conductivity of the samples was measured using a DM-32
conductivimeter (Digicrom Analytical, Campo Grande, SP, Brazil) with a cell
constant of 0.11 cm−1. The measurements were performed at 25 ± 2°C.
2.2.3.5 Droplet size analysis
For the series of formulations made in the second step, the droplet size of the
emulsion was determined by laser diffraction. The formulation (0.1 mL) was
freshly dispersed in 50 mL of water in a volumetric flask and gently mixed by
17
inverting the flask. Measurement was done instantaneously after the dilution
process using a Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Worcestershire, United
Kingdom). Light scattering was monitored at 25°C at a 90° angle.
2.2.3.6. Rheological measurements
For the series of formulations made in the second step, sample rheology was
evaluated using a Haake Rheostress 600 rheometer (Thermo Electron,
Takkebijsters, BL, Germany) fitted with a stainless steel cone/plate measuring
35 mm in diameter, screw angle of 2°, and a 105 µm hole. The jacketed sample
cup was connected to a circulating water bath operating at 25°C. A sample
volume of 1 mL was used. The measurements were performed in triplicate.
Steady flow measurements were carried out using a single sample for the whole
curve in the range of shear stresses corresponding to shear rates from 0 to 200
per second for 300 s, and the rheological parameters, such as shear stress,
shear rate, and apparent viscosity, were obtained from the software. The
apparent viscosity (ηapp) was determined at a shear rate of 60 s−1.
2.2.4. Stability studies
2.2.4.1. Micro-emultocrit technique (short-term stability)
The micro-emultocrit technique was used in this study to evaluate the creaming
index (Macedo, 2006). The technique was performed by filling 75% of a
heparin-free capillary tube with each formulation and placing it in a
microcentrifuge (Fanen, São Paulo, SP, Brazil) at 11 500g for 10 minutes.
18
2.2.4.2. Stability under centrifugation
Centrifugation tubes filled with 10 ml of emulsion underwent a centrifugal
acceleration of 500, 1500, 2000 and 3500 g for 15 minutes at 25°C. To avoid
changes induced by possible heating, the temperature, which should not
exceed 30°C, was measured in one tube at the end of the experiment.
2.2.4.3. Freeze/thaw cycles
Hermetically-sealed test tubes filled with the emulsion were stored vertically for
16 h in a freezer at −21°C and then for 8 h at room temperature (25 ± 2°C). The
emulsion was observed and any change was recorded. This cycle was repeated
six times (Roland, 2003).
2.2.4.4. Intrinsic stability
For the series of formulations made in the second step, test tubes were filled
with 10 ml of the emulsion and then hermetically sealed. They were then stored
vertically at room temperature (25 ± 2°C). Weekly macroscopic aspects were
evaluated for one year. Any change such as phase separation or creaming rate
was recorded (Roland, 2003).
2.2.4.5. Stability under storage (long-term stability)
For the series of formulations made in the second step, test tubes were filled as
described in section 2.2.4.2. The tubes were stored vertically in a hot air oven at
45 ± 2°C, at 25 ± 2°C, and at 4 ± 2°C, following the International Conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals
19
for Human Use (ICH). Weekly macroscopic aspects were evaluated for one
year.
2.2.5. Construction of Pseudo-ternary Phase Diagrams
In order to determine the range of component concentration for the existing
emulsion range, pseudo-ternary phase diagrams were constructed using the
water titration method at ambient temperature and three different stirring
processes (Tai, 2001, Yan, 1994). One phase diagram was built for each
production method. Tween 20®: Span 80® were mixed at a weight ratio of the
copaiba oil HLBc value to obtain the surfactant mixture (Smix). Copaiba oil and
Smix were then mixed at a weight ratio of 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2,
and 9:1, respectively. These concentration variation allowed the creation of 90
formulations. The mixtures of oil, surfactant, and co-surfactant at a certain
weight ratio were diluted with water dropwise, using three stirring processes: (i)
vortex stirring (IKA, Staufen, Germany), (ii) magnetic stirring (IKA, Staufen,
Germany), and (iii) sonic probe (Heat Systems, Farmingdale, NY, USA)
followed by ultrasonic bath cleaner (Unique, Indaiatuba, SP, Brazil). After
equilibrium, the mixtures and their microscopic appearance were assessed
visually, using cross-polarized light microscopy (Olympus BX 41, Shinjuku-ku,
TOY, Japan). The first method, mechanical stirring, was generated by using
Vortex. The second method involved using a magnetic stirrer. In the last
method, sonic probe, a sonicator was used, followed by the use of an ultrasonic
bath cleaner. All the stirring processes, performed in duplicate, were carried out
for 3 minutes for each sample. All the samples were then analyzed overnight.
20
The pseudo-ternary phase diagrams were determined to classify the systems
as microemulsions, crude emulsions, nanoemulsions, gels, or phase
separation. No attempt was made to distinguish between oil-in-water, water-in-
oil, or bicontinuous-type microemulsions and/or emulsions. Gels were selected
for clear and highly viscous mixtures that did not show a change in meniscus
after tilted to an angle of 90°.
3.0 Results and discussion
Determination of HLB
The first HLB interval of the emulsions was evaluated macroscopically and
microscopically for 60 days. The more stable preparations pointed out the HLB
interval that was used to construct the second step of formulations. Then, for
the second set of preparation, stability studies were conducted to determine the
most stable formulation over the time. Finally, the HLBc of the copaiba oil was
defined.
Microscopic images showed that copaiba oil emulsions stabilized with the
Tween 20® and Span 80® admixtures showed individual droplets, which were
homogeneously distributed with no sign of flocculation (Figure 1). However,
formulations with low HLB values (11.5) showed wide variations in droplet size,
suggesting coalescence.
Figure 1
Despite the wide range of HLB values (4.5 to 16.5), the PIT produced stable
emulsions until the eighth day of analysis, with milky and white aspects and a
21
lower percentage of creaming. In this study, the emulsions stored at 25°C
showed increasing layers of cream, leading to phase separation, because the
increase in temperature accelerates the onset of instability. The kinetic energy
of the system likely increases, as does the motility of water molecules, which, in
most cases, is the solvent responsible for chemically-unstable reactions (Saito,
1970) (Table 1).
Table 1
Macroscopic aspect showed that the formulations with HLB values of 16.5,
15.5, 14.5, and 12.5 maintained constant characteristics over the two months of
the study. These formulations showed lower creaming index values during this
period. Inversely, emulsions with lower HLB values showed phase separation or
higher creaming percentage.
Creaming is an important parameter to evaluate the stability of emulsion
systems against different HLB values, since the occurrence of surface creaming
is a precursor of coalescence, allowing phase separation and total loss of
stability (Le Hir, 2001, Lieberman, 1988). In the Table 1 can be observed that all
formulations presented cream during the 60-day period. However, HLB
formulations of 16.5, 15.5, 14.5, and 13.5 can be considered the most stable
ones, since the creaming phenomenon was not as marked as that of the others.
Because the previously described methods were unable to find a narrow HLB
interval, which could express the most stable emulsions. Then, in this study,
auxiliary tests were used to obtain a more reliable HLB interval for copaiba oil.
Among the parameters, the pH value is a simple tool that suggests the onset of
22
instability, since a significant decrease in this parameter indicates possible
surfactant chain degradation that will cause emulsion phase instability between
the internal and external phase of the emulsion (van Ruth, 1999). The results of
pH analysis (Table 2) show significant pH variation in the formulations, but the
HLB samples of 15.5 and 14.5 values had lower standard deviation of pH
values, which remained constant in the analysis. Formulations with the lowest
HLB had the highest pH oscillation due to emulsion instability .
Table 2
Conductivity is one of the parameters used to study emulsion stability as a
function of time because this method is sensitive to minimal changes in the
structure of the emulsified system. The electric current is conducted by the ions
present in the external phase of O/W emulsions, while the W/O emulsion
behaves as an electrical insulator (Latreille, 1990, Masmoudi, 2005, Le Hir,
2001, Lieberman, 1988).
The systematic variation of the electrical conductivity profile in the systems
(Table 2) demonstrates that all emulsions underwent significant variations in
conductivity values over time, suggesting the onset of the instability
characteristic of emulsion systems. The emulsions with the lowest HLB values
showed low conductivity values due to the instability process. This finding
corroborates the pH results, creaming rate at 25ºC, and macroscopic aspects.
Emulsions with an HLB range between 15.5 and 14.5 (F2.0 and F3.0) showed
the best conductivity values, since the standard deviation during analysis was
the lowest, showing better stability throughout storage.
23
The full set of results indicated that systems with HLB values between 15.5 and
14.5 were the more stable ones. Therefore, in order to obtain the most reliable
HLBc value of copaiba oil, the second set of emulsion formulations was
performed within this HLB range.
From the second set of formulations, the emulsions stored at 25°C
demonstrated good characteristics, such as macroscopic appearance, white
and milky aspect, and low cream values. Over the two months, the creaming
index showed that the emulsions presented about 4% cream. The standard
deviation (SD) in each sample represents the variation in cream percentage
throughout the study, suggesting instability during the process. The formulations
with HLB values between 15.1 and 14.6 showed smaller SD variations in the
creaming index.
The pH values (around 5.1) were smaller from samples F2.4 (HLB 15.1) to F2.7
(HLB 14.8). Conductivity analysis shows that the conductivity values of samples
F2.3, F2.5, and F2.7 did not oscillate significantly, presenting a mean of 41
µS/cm, characteristic of an emulsion with an external aqueous phase (Boonme,
2006, Hathout, 2010).
Viscosity is an important measurement, as Stokes‟ law states that the rate of
phase separation between two immiscible liquids is directly dependent on the
droplet square radius and inversely proportional to system viscosity. Therefore,
this measurement is useful in determining appropriate consistency or fluidity as
well as indicating the product performance over time. As revealed by the flow
curves, the emulsion systems showed a nonlinear relationship between shear
stress and shear rate, characteristic of a non-Newtonian flux material (Figure 2).
24
In this case, viscosity can be termed “apparent viscosity” and is dependent on
the shear rate, pressure, temperature, and time (Atkinson, 2005) (Table 3).
Furthermore, the rheological analysis showed that the systems behaved like a
pseudoplastic and power-law model, which can be used to describe the flow
characteristics of the emulsion. Owing to the external character of the emulsion,
the viscosity found here was very near that of water, which is completely
different from the pure copaiba oil, which exhibited Newtonian behavior and had
a viscosity of 15.53 mPa.
Figure 2
Mean emulsion droplet diameters are shown in Table 3. Low Span factor rates,
low polydispersity, and a narrow size distribution define a good system (Mondal,
2008). The sample with an HLB value of 14.8 (F2.7) showed the lowest
polydispersity rate, with 90% of the droplets smaller than 1.25 μm, median
droplet size of 0.62 µm, and mean diameter of 0.80 µm. The Stokes‟ law
equation states that the velocity at which a droplet will rise or fall in a liquid
varies with the square of its diameter. Therefore, sedimentation velocity of the
droplets in a liquid medium arises from the difference in droplet density and in
the liquid medium. According to the Stokes‟ law equation, the smaller the
diameters of oil droplets present in the emulsion, the lower their settling velocity,
providing more stability to the emulsion (Robins, 2000). Based on all previously
experimental results, the HLB value of copaiba oil was found to be 14.8. A deep
stability study of this formulation was carried out to confirm such assumption.
Table 3
25
Emulsion stability
In the present study, emulsion stability was evaluated through the creaming
phenomena, which is the measure of the amount of cream phase separated on
the top layer of the O/W emulsion. All copaiba oil emulsions with an HLB value
of 14.8 (F2.7) were stable at 25°C throughout the 1-year study period.
According to the creaming rate, the emulsions stored at 25°C contained 4%
cream, on average. However, among the emulsions stored at 45°C, the
samples with an HLB value of 14.8 were the most resistant to temperature,
maintaining complete stability up to 60 days of analysis. After this time, the
instability likely occurs because the non-ionic surfactants are sensitive to
temperature changes. On the other hand, the formulation stored at 4°C was
more stable for over one year, due to the low temperature and consequent low
collision energy among the droplets.
The micro-emultocrit technique is a useful tool to efficiently and rapidly
determine the critical HLB of emulsion systems, and reveal possible instabilities
not detectable after preparation (Macedo, 2006). The micro-emultocrit showed a
creaming index of 2% for the preparation with an HLB value of 14.8. However,
this value was not significantly different when compared to the other
formulations with different HLB values. Moreover, this creaming index could be
explained by the high gravitational force applied to the system.
Centrifuge tests showed that all emulsions from the second set of formulations
had good physical stability. In order to observe the presence of cream or
emulsion phase separation when subjected to gravitational stress, the
26
resistance to centrifugation test was performed. This test submits the sample to
a mechanical stress to determine whether there is a tendency toward
sedimentation or flotation of phases, inducing phase separation. Centrifugation
resistance of an emulsion depends on the difference in density between the oil
and aqueous phases and also the interfacial film resistance.
With similar formulations exhibiting small density differences, stability under
centrifugation reflects the strength of the interfacial film. It was observed that for
the sample with an HLB of 14.8 no phase separation occurred when the
samples were submitted to high gravitational forces.
The study‟s freeze-thaw cycle assesses the stability of emulsion systems under
different storage conditions in regular time intervals. However, the F2.7 (HLB
value of 14.8) submitted to a freeze-thaw cycle was stable until the 6th cycle.
Later, the instability led to phase separation.
The global results from the stability study confirm that the copaiba oil presents
an HLBc value of 14.8 for O/W emulsion. This data is important for the further
studies concerning the pseudo-ternary phase diagrams, which will indicate the
boundaries of copaiba oil, surfactant, and water that produce emulsified
systems.
Construction of Pseudo-ternary Phase Diagrams
The progressive change in the composition of a mixture of immiscible solvents
can produce significant variations in the thermodynamic properties of its
compounds (Oliveira, 2004). The pseudo-ternary phase diagram is an efficient
27
scanning method to obtain different formulations such as emulsion and other
systems that can be used for effective therapy (Shafiq-Un-Nabi, 2007, Oliveira,
2001). These systems are of great interest to the pharmaceutical industry not
only for their extensive use worldwide, but also for their easy preparation, low-
cost, drug delivery system and improved bioavailability (Shafiq-Un-Nabi, 2007).
The Tween 20®: Span 80 ® ratio of the surfactant mixture was previously
established at 85:15(w/w), which generates an HLB value of 14.8. The phase
diagrams related to the HLBc of copaiba oil were investigated based on a water/
Tween 20®/ Span 80®/ quaternary system of copaiba oil (Figures 3, 4, and 5).
Colloidal system formation was observed at room temperature using three
different stirring methods. In vortex shaking an internal cyclone is formed that,
irrespective of system viscosity, provides not only good homogenization, but
also offers more advantages, such as the use of a small amount of sample at
room temperature (Figure 3). The magnetic stirring process also allows the use
of a small amount of sample at room temperature. However, this process is not
suitable for larger amounts of sample or for high viscosity (Figure 4). The main
effect of ultrasound is the acoustical effect, where the collapse between
microbubbles increases until they implode, producing both high pressure and
temperatures during the final collapse stages (Figure 5).
Figure 3, 4, and 5
In this study, all the phase diagrams were based on the proposed model of
colloidal system formation designed by Winsor. In fact, the mixtures of several
compounds with different physicochemical properties generate four types of
monophasic Winsor IV systems. Few differences in phase diagram regions
28
were found in the microemulsion system for the three production processes.
This likely occurs due to the spontaneous formation of such systems, in which
the potential energy involved in the production process does not determine the
structural formation. There was few differences between the numbers of
emulsion regions (30%) produced by the three methods, but there were
differences between the percentages of the formulation components that
formed the emulsion areas. This same trend was observed for the formation of
other colloidal systems, compared to the composition of the formed regions, but
the values of the area showed no few variations. The sonic probe method
generates a larger nanoemulsion region (10%) than the others, probably due to
the high energy input involved in the production process that forms small
droplets (Leong, 2009). Other studies have found similar results.
Formariz et al (Formariz, 2007) found a microemulsion region of 40%, besides
other colloidal structures, using the ultra-sound stirring process and cholesterol
as oil phase. Additionally, Podlogar et al (Podlogar,2004) using the magnetic
stirring process and isopropyl myristate as lipophilic phase, found an emulsion
region of approximately 30%. However, according to the literature, there is a
wide difference among chemical composition, concentration of surfactants, and
the stirring process for production of phase diagrams.
4.0 Conclusions
The results of this study show that it is possible to obtain oil-in-water emulsions
of copaiba oil stabilized by a surfactant admixture of Tween 20®/Span 80® with
29
an HLB value of 14.8. A rheological study of the system revealed a
pseudoplastic shear-thinning fluid behavior with thixotropic characteristic. The
emulsion with that HLB value remained stable for over a year, withstanding
physicochemical stress tests as well.
Pseudo-ternary phase diagrams make it easier to determine the proportion of
the triphasic component system. Furthermore, the various dispersed systems
may have different apparent viscosity over a particular region. The formation of
colloidal structures also depends on the production method, and the behavior of
pseudo-ternary phase diagrams is dependent on the energy supplied to the
system. In fact, the stirring process induces the formation of different structures,
according to the stirring intensity, which improves the degree of inter-
component interaction. It can be inferred, however, that the microemulsion
regions produced in the phase diagrams were not dependent on the level of
energy supplied to the system, probably due to the thermodynamic stability of
such systems (Santos, 2008). Moreover, due to the inherent instability of these
systems, each stirring process showed considerable percentage variations in
the different regions. It was also possible to conclude that the copaiba oil
emulsion system investigated here may be a promising vehicle for drugs and/or
active cosmetics.
This work also demonstrates the feasibility of production of emulsion systems
using natural oil products. As all the mandatory steps on the physicochemical
characterization of both the oil and the emulsion system are described in detail,
this work could serve as a simple manual for production of emulsion systems
from natural products.
30
Acknowledgements
The authors wish to thank CAPES and CNPQ for the financial support. The
authors also thank Glenn Hawes, from the University of Georgia – American
Language Program, for editing this manuscript.
31
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35
Table 1- Macroscopic aspect and creaming index of the emulsion formulations
based on copaiba oil stored at 25ºC for 60 days (first step). D indicates day; the
white gap represents a milky aspect; the light gray gap represents a yellowish
aspect and coalescence; the dark gray gap represents phase separation
Formulations HLB
Value
D1 D3 D5 D8 D15 D30 D60
F1.0 16.5 0.00 0.00 1.43 1.43 1.45 1.45 1.52
F2.0 15.5 0.00 0.00 0.00 1.43 1.45 1.45 1.52
F3.0 14.5 0.00 0.00 1.45 1.47 1.47 1.47 1.47
F4.0 13.5 0.00 0.00 1.39 2.86 2.94 2.94 3.03
F5.0 12.5 0.00 0.00 1.43 1.47 2.94 2.94 3.17
F6.0 11.5 0.00 0.00 1.56 3.33 3.39 3.39 10.71
F7.0 10.5 0.00 0.00 2.86 2.99 3.03 3.03 3.17
F8.0 9.5 0.00 2.82 2.82 2.94 4.41 4.41 4.55
F9.0 8.5 1.43 2.86 2.86 2.99 4.31 4.41 4.76
F10.0 7.5 4.29 5.80 7.14 7.46 7.58 10.61 10.77
F11.0 6.5 5.71 7.14 8.82 10.29 10.45 11.76 14.06
F12.0 5.5 7.04 8.57 10.29 10.29 11.76 14.49 12.31
F13.0 4.5 7.04 8.45 8.82 11.76 11.94 16.42 18.75
36
Table 2- pH and conductivity of copaiba oil emulsions with HLB between 16.5
and 4.5
Formulations HLB
Value
pH Conductivity
F1.0 16.5 5.13±0.30 35.2± 2.65
F2.0 15.5 4.95±0.23 33.9±1.82
F3.0 14.5 4.89±0.23 36.5±2.00
F4.0 13.5 4.88±0.23 38.4±2.37
F5.0 12.5 5.00±0.25 41.1±2.28
F6.0 11.5 4.94±0.21 42.3±2.04
F7.0 10.5 4.88±0.26 46.5±2.49
F8.0 9.5 4.93±0.27 47.9±1.58
F9.0 8.5 4.87±0.21 48.2±2.30
F10.0 7.5 4.82±0.24 46.3±2.17
F11.0 6.5 4.89±0.19 44.3±10.30
F12.0 5.5 4.83±0.22 36.8±3.68
F13.0 4.5 4.92±0.33 37.3± 8.25
37
Table 3- Droplet diameter and apparent viscosity value of copaiba oil
emulsions.
Formulations HLB Value D(4.3) (µm) D(0.5) (µm) D(0.9) (µm) Span
Factor
Viscosity
(mPa.s) F2.0 15.5 0.77 0.56 1.30 1.80 2.269
F2.1 15.4 1.18 0.82 2.23 2.35 2.306
F2.2 15.3 1.36 0.78 2.62 2.97 2.323
F2.3 15.2 0.97 0.49 1.77 3.07 2.252
F2.4 15.1 1.20 0.66 2.28 3.03 2.276
F2.5 15.0 0.99 0.60 2.00 2.85 2.282
F2.6 14.9 1.05 0.70 2.13 2.63 2.290
F2.7 14.8 0.80 0.62 1.25 1.50 2.238
F2.8 14.7 1.06 0.70 2.04 2.50 2.274
F2.9 14.6 1.56 0.68 2.16 2.73 2.251
F3.0 14.5 0.89 0.46 1.84 3.45 2.252
38
Figure Legends
Figure 1- Microscopic droplets of the emulsified systems with HLB value of 14.8
(40X20µm)
Figure 2- Rheological analysis of formulation 2.7 (HLB of 14.8) (A) and copaiba
oil (B)
Figure 3- Phase diagram of copaiba oil produced from vortex stirring at the
required HLBc value. Black: Microemulsion; Dark grey: gel (emulsion
or Microemulsion?); Medium grey: Phase separation; Light grey:
Nanoemulsion; White: Emulsion
Figure 4- Phase diagram of copaiba oil produced from magnetic stirring at the
required HLBc value. Black: Microemulsion; Medium grey: Phase
separation; Light grey: Nanoemulsion; White: Emulsion
Figure 5- Phase diagram of copaiba oil produced from sonic probe stirring at the
required HLBc value. Black: Microemulsion; Medium grey: Phase
separation; Light grey: Nanoemulsion; White: Emulsion.
39
40
41
42
43
44
4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES
O trabalho desenvolvido para a elaboração desta dissertação permitiu a
determinação do EHLc do óleo de copaíba a partir de sistemas emulsionados
formado por tensoativos não-ionicos (Tween 20® e Span 80®). O protocolo
experimental também permitiu fazer a comparação de sistemas coloidais
obtidos a partir do estudo de diagrama de fases utilizando três diferentes
métodos de produção. Outro ponto importante no desenvolvimento desta
dissertação foi a determinação da estabilidade da emulsão no referido EHLc.
Neste estudo foram necessários inúmeros testes piloto até a obtenção
adequada de uma série de amostras que possibilitasse a realização das
caracterizações pretendidas. A emulsão com característica ideal obtida é fruto
de intensos estudos os quais permitiram a abertura de grandes perspectivas
em estudos na área, sendo apresentada a comunidade científica através do
artigo componente desta dissertação.
Estudos posteriores serão desenvolvidos com o intuito de verificar a
influencia da adição de adjuvantes farmacotécnicos a formulação, no sentido
de potencializar as propriedades farmacológicas e cosméticas intrínsecas ao
óleo de copaíba e observar a influência dos mesmos sobre o sistema EHL das
emulsões. Posteriormente, serão conduzidos estudos a fim de se verificar a
atividade anti-inflamatória e antimicrobiana do óleo de copaíba em um sistema
coloidal. Estudos de determinação da carcinogenicidade, mutagenicidade,
citotoxicidade e teratogenicidade dos sistemas serão desenvolvidas no
decorrer do projeto no curso de Doutorado no Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia (RENORBIO).
45
Finalmente, é importante ressaltar que os estudos aqui apresentados
são conclusivos apenas para determinação do EHLc do óleo de copaíba, a
estabilidade de sistemas emulsionados e sobre a técnica de produção de
diagramas de fases para o óleo de copaíba. Assim, o valor de EHLc torna-se
importante na determinação de conjunto de tensoativos importantes na
estabilidade de formulações farmacêuticas e/ou cosméticas.
O cronograma de execução, anteriormente determinado na elaboração
do projeto de mestrado, foi cumprido parcialmente, visto que estudos iniciais
com microemulsões apresentaram grandes dificuldades na realização de
algumas analises de caracterização dos sistemas. Já para emulsões este
problema não ocorreu e devido ao curto tempo do mestrado foi dada seqüência
ao estudo com estas, visto que já se havia iniciados as pesquisas ainda no
período da graduação com emulsões de óleo de copaíba.
A realização do projeto de mestrado também incluiu o surgimento de
algumas dificuldades como obtenção de reagentes, implementação de
metodologias e acesso a equipamentos para caracterização das amostras.
Contudo, ao longo do percurso, os obstáculos foram sendo superados,
permitindo o alcance dos objetivos e o estabelecimento de conclusões.
Em 2005, ainda como estudante de terceiro período do curso de
Farmácia desta universidade, tive a feliz oportunidade de ingressar no grupo de
pesquisa liderado pelo Prof. Dr. Sócrates Egito, na equipe de Penicilina G
Benzatina (PenGB), liderada por Gyselle Holanda no projeto “Sistemas de
liberação controlada para a profilaxia da febre reumática”. Como iniciação
científica, participei a fundo do desenvolvimento de projetos, rotinas do
laboratório, congressos, eventos científicos entre outros, que futuramente
46
deram suporte no desenvolvimento de um projeto na veiculação do óleo de
copaíba. Tal estudo iniciou-se devido o forte uso na medicina popular, todos os
casos relatados apresentando sucesso no uso do óleo, mas quando
pesquisado em literatura cientifica havia poucos respaldos científicos. Todos os
estudos a priori utilizavam o óleo de copaíba bruto, portanto a fim de se
viabilizar a disponibilidade dos componentes terapêuticos, a proposta inicial, foi
desenvolver um produto tecnologicamente elaborado a partir de uma planta
brasileira, que pudesse produzir um forte impacto na área de medicamentos
e/ou cosméticos, utilizando como ativo o óleo de copaíba.
No fim da minha graduação realizei a defesa do trabalho de conclusão
de curso realizando o controle de qualidade de varias amostras de óleo de
copaíba oriundas de diversos locais do Brasil, além da apresentação, inicial, de
alguns resultados no desenvolvimento de emulsões com este óleo. Este
trabalho deu suporte no estudo de concretizar o desenvolvimento de uma
emulsão ideal, assim como, outras formulações de sistemas coloidais, a
exemplo de microemulsões e nanoemulsões.
Paralelamente às atividades de pesquisa, conclui os créditos exigidos
pelo PPGCSA ao participar de varias disciplinas e atividades deste programa
de pós- graduação, além de estagio de iniciação a docência. Tenho a certeza
que todas estas experiências deram sua contribuição a minha formação de
mestre, incrementando conhecimentos aplicáveis ao meu projeto de pesquisa e
minha conduta como profissional de saúde. De fato, fazer parte do PPGCSA e
ter a oportunidade de fazer ciência na UFRN rendeu um incremento
considerável ao meu modesto currículo de jovem pesquisador.
47
Também devo ressaltar a minha participação em outros inúmeros
projetos durante o desenvolvimento do meu mestrado que contribuíram
conjuntamente a minha formação pessoal e profissional, a exemplo do projeto
“Trilhando o Saber cientifico em sala de aula: A aplicação do método cientifico
na dinâmica escolar”, ligado a Rede Nacional de Educação e Ciência: Novos
Talentos da Rede Pública.
48
5. APÊNDICE
Artigos completos publicados em periódicos
1. SILVA, K. G. H., XAVIER JUNIOR, F. H., FARIAS, I. E. G., SILVA, A. K. A.,
SOUZA, L. C. A., CALDAS NETO, J. A., SANTIAGO, R. R., ALEXANDRINO
JUNIOR, F., NAGASHIMA JUNIOR, T., Soares, L. A. L., MAGALHÃES, N. S.
S., EGITO, E. S. T. Stationary Cuvette: A New Approach to Obtaining Analytical
Curves by UV-VIS Spectrophotometry. Phytochemical Analysis. , v.20, p.265-
271, 2009.
Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo)
1. XAVIER JUNIOR, F. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E. N., SILVA, K. G.
H., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T.. Incorporação de cloranfenicol em
microemulsão de óleo de copaíba In: XXI Simpósio de Plantas Medicinais do
Brasil, 2010, João Pessoa.
2. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E.
N., SANTOS, E. C. G., EGITO, E. S. T. Estudo da concentração inibitória
mínima do óleo de copaíba em cepas bacterianas do gênero staphylococcus In:
62ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência, 2010,
Natal.
3. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., SANTOS, E. C. G., MORAIS, A. R.
V., ALENCAR, E. N., ALEXANDRINO JUNIOR, F., ARAÚJO, I. B., EGITO, E.
S. T.. Evaluation of antibacterial activity of copaiba oil colloidal systems In: 70th
FIP World Congress of Pharmacy/Pharmaceutical Sciences, 2010, Lisboa.
49
4. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R.
V., SANTOS, E. C. G., EGITO, E. S. T.. Controle de qualidade microbiológico e
estudo da atividade antibacteriana de sistemas microemulsionados e do óleo
de copaíba contra staphylococcus epidermidis In: 62ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência, 2010, Natal.
5. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., ALEXANDRINO JUNIOR, F.,
SILVA, A. K. A., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R. V., ARAÚJO, I. B., EGITO,
E. S. T.. Introducing the scientific method in the high school classroom:
Pharmaceutical Sciences as a background In: 70th FIP World Congress of
Pharmacy/Pharmaceutical Sciences, 2010, Lisboa.
6. XAVIER JUNIOR, F. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E. N., SILVA, K. G.
H., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T.. O ensino de praticas em saúde por meio
de instrumentos pedagógicos In: II Congresso Multiprofissional da Saúde,
2010, Natal.
7. XAVIER JUNIOR, F. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R. V., SILVA, K. G.
H., SANTOS, E. C. G., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T.. Óleo de Copaíba como
antifúngico natural: estudo pela técnica de difusão em ágar In: XXI Simpósio de
Plantas Medicinais do Brasil, 2010, João Pessoa.
8. SILVA, K. G. H., XAVIER JUNIOR, F. H., FARIAS, I. E. G., SANTIAGO, R.
R., ALEXANDRINO JUNIOR, F., EGITO, E. S. T. A new tool to obtaining
analytical curves by UV-Vis spectrophotometry In: 21 st International
50
Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, Orlando, USA.
9. XAVIER JUNIOR, F. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R. V., SILVA, K. G.
H., SANTOS, E. C. G., EGITO, E. S. T. Avaliação da atividade antimicrobiana
do óleo de copaíba In: I Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas Básicas
e Aplicadas : Fronteiras do Conhecimento e Políticas de Inovação, 2009, Natal.
10. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R.
V., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Avaliação do Perfil dos Alunos de Escolas
Públicas Participantes dos Cursos de Férias de Farmácia In: XI Congresso
Científico: Educação, Inclusão e Sustentabilidade: Grandes Desafios da
Ciência, 2009, Natal.
11. ALENCAR, E. N., XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., MORAIS, A. R.
V., EGITO, E. S. T. Controle de Qualidade do Óleo de Copaíba: Estudo de Pré-
Formulação para o Desenvolvimento de Sistemas Emulsionados In: XX
Congresso de Iniciação Científica da UFRN, 2009, Natal.
12. MORAIS, A. R. V., XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., ALENCAR, E.
N., EGITO, E. S. T. Desenvolvimento de Diagramas de Fases Pseudoternário
de Óleo de Copaíba/Tween 20/ Phospholipon 100H e Água In: XX Congresso
de Iniciação Científica da UFRN, 2009, Natal.
13. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., FARIAS, I. E. G., ALENCAR, E.
N., MORAIS, A. R. V., ARAÚJO, I. B., NAGASHIMA JUNIOR, T., EGITO, E. S.
51
T. Development of Based Microemulsion System of Copaiba Oil In: 7th
International Congress of Pharmaceutical Sciences CIFARP, 2009, Ribeirão
Preto.
14. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E.
N., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Diagrama de Fases de Óleo de Copaíba:
Estudo Comparativo para a Produção de Microemulsão In: XI Congresso
Científico: Educação, Inclusão e Sustentabilidade: Grandes Desafios Da
Ciência, 2009, Natal.
15. XAVIER JUNIOR, F. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R. V., SILVA, K. G.
H., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Diagramas de Fases Pseudoternário do
Óleo de Copaíba: Estudo de Regiões de Emulsões In: XI Congresso Científico:
Educação, Inclusão E Sustentabilidade: Grandes Desafios Da Ciência, 2009,
Natal.
16. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E.
N., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Freeze-Dried Microemulsion Copaiba Oil:
Preliminary Studies In: 7th International Congress of Pharmaceutical Sciences
CIFARP, 2009, Ribeirão Preto.
17. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E.
N., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Perfil dos Professores Participantes dos
Cursos de Férias de Farmácia In: XI Congresso Científico: Educação, Inclusão
e Sustentabilidade: Grandes Desafios da Ciência, 2009, Natal.
52
18. MARTINS, A. S., XAVIER JUNIOR, F. H., GUARDA, L. T. A., LOUSADO, E.
S. Judicialização do direito a saúde: uma abordagem crítica In: XI Congresso
Científico e X Mostra de Extensão da Universidade, 2009, Natal.
19. XAVIER JUNIOR, F. H., FARIAS, I. E. G., SILVA, K. G. H., VERISSIMO, L.
M., MARTINS, A. S., SILVA, A. L. Critical Hydrophilic-Lipophilic Balance of
Copaiba Oil In: I International Symposium in Pharmaceutical Sciences of
Northeast Brazil, 2008, NATAL.
20. SILVA, K. S, GODEIRO, M. S. S., SILVA, P. M. P., MARTINS, A. S., SILVA,
A. L., XAVIER JUNIOR, F. H., BEZERRA, F.A., VERISSIMO, L. M., SILVA, K.
G. H. Quality Control of magistral capsules containing propranolol chloride
commercialized in Natal-RN, Brazil In: International Symposium in
Pharmaceutical Sciences of Northeast Brazil, 2008, Natal/RN.
Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido)
1. XAVIER JUNIOR, F. H., SILVA, K. G. H., ALENCAR, E. N., MORAIS, A. R.
V., ARAÚJO, I. B., EGITO, E. S. T. Phase diagrams of copaiba oil: comparative
study on their production process In: XVIII International Conference on
Bioencapsulation, 2010, Porto.
2. SILVA, K. G. H., XAVIER JUNIOR, F. H., MORAIS, A. R. V., ALENCAR, E.
N., EGITO, E. S. T. Copaiba oil microemulsions: A new system for future use in
inflammatory diseases In: XVIIth International Conference on Bioencapsulation,
2009, Groningen, Netherlands.
53
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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57
7. ABSTRACT
During the last decades, it has been a huge interest from the pharmaceutical
industries on essential oils and various plant extracts because of their low
toxicity and high biodegrability. Copaiba oil (Cop) is a popular medicine in
natural form as an anti-inflammatory and anti-infective agent to treat various
conditions such as sore throat, ulcers, urinary and pulmonary afflictions.
Emulsions are defined as a thermodynamic instable dispersed systems
consisting of microscopic dispersions of liquid droplets within another liquid. The
aim of this work was to prepare different Cop emulsions and evaluate their
stability in order to determine the critical HLB of oil, beyond, to perform a
comparative study among different methods from the construction of phase
diagrams. The emulsions were prepared by the phase inversion method at
different ratios varying the HLB from 4.7 to 16.7. The stability was determined
by various methods and phase diagrams were produced by titration method
using different stirring procedures. Concerning the Cop-containing emulsions,
the ones that presented HLB range from 12.7 to 15.7 were the most stable. The
emulsions were presented good short and long-term stability, milky aspect and
low creaming index values. Different colloidal structures were produced in
phase diagrams, depending on the stirring process. Based on these methods,
the required HLB values of Cop were determined as 14.8, the emulsion
remained stable for a period exceeding one year and these results indicate that
the studied emulsion based on Cop may be a promising vehicle for topical
delivery of drug and cosmetic active.
Key words: emulsion, copaiba oil, Hydrophilic-lipophilic balance, pseudoternary
phase diagram, stability.
