UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · um tijolinho para consolidar minha esperança e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MANOELA TORRES DO RÊGO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO

AQUOSO, FRAÇÕES E COMPOSTOS IDENTIFICADOS NOS FRUTOS DE

Hancornia speciosa Gomes (APOCYNACEAE)

NATAL/RN

2015

MANOELA TORRES DO RÊGO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO

AQUOSO, FRAÇÕES E COMPOSTOS IDENTIFICADOS NOS FRUTOS DE

Hancornia speciosa Gomes (APOCYNACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas (Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos).

Orientador:

Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa

Co-orientadora:

Profa. Dra. Mariana Angélica Oliveira Bitencourt

NATAL/RN

2015

AGRADECIMENTOS

À Deus, ser de infinita sabedoria, por dar-me força e saúde para

superar e enfrentar tantos obstáculos ao longo desses dois anos, fazendo-me

acreditar que tudo é possível, basta ter persistência, fé e vontade de vencer.

Ao meu orientador Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa,

meu pai científico, pela confiança, pelas oportunidades, por todos os desafios

lançados e por acreditar que eu seria capaz. Pode ter certeza cada palavra foi

um tijolinho para consolidar minha esperança e acreditar que no final daria tudo

certo. Saiba que lhe admiro, respeito e acima de tudo me orgulho de ser sua

aluna, um orientador humano e com o coração enorme.

À minha co-orientadora, a Profª. Dra. Mariana Angélica Oliveira

Bitencourt, minha mãe científica, pela oportunidade, atenção, paciência,

ensinamentos, confiança e amizade, o que seria de mim sem você? Pois é,

sem você tudo seria mais difícil. Agora serei Mestra, mas nunca deixarei de ser

‘sua menina’, obrigada por sempre segurar a minha mão, que Deus te abençoe

infinitamente!

À minha amiga e companheira Allanny Furtado pela parceria na vida

pessoal e acadêmica, você foi essencial para o desenvolvimento deste

trabalho. Acredite, não sei como minha caminhada seria sem você! Duas

pessoas com personalidades tão diferentes, mas que se complementam como

enzima e substrato. Minha amiga torço muito pelo seu sucesso, assim como

você torce pelo meu, e se Deus permitir, trilharemos juntas por muito tempo.

Aos alunos de Iniciação Científica que acompanharam o

desenvolvimento deste trabalho: Rafael Castro e Nayara Souza. Muito

obrigada pela disposição e dedicação às longas horas de experimento, aprendi

muito com vocês.

Ao meu pai (Vamberto Torres) meu espelho, minha maior referência e

meu maior incentivador, tudo o que eu sou e tudo que tenho devo a você, pode

ter certeza ESSA CONQUISTA É SUA, obrigada por ser o melhor pai do

mundo. À minha mãe (Gina Lopes), minha melhor amiga, quem sempre me

amparou e confortou com seu amor, orações e paciência, todas as palavras de

incentivos foram essenciais para chegar aonde eu cheguei, e se Deus me der

essa graça, ainda realizarei seu sonho. A meu irmão (João Pedro) pelo

companheirismo, pelo consolo em momentos de estresse, por me incentivar e

acreditar que sempre eu seria capaz. Tenho com vocês o mais belo exemplo

de união, amor e o verdadeiro significado da família. Vocês foram essenciais

para que eu perseverasse diante das dificuldades. Obrigado por sonharem

juntos comigo. Amo vocês!

Ao meu namorado (João Luiz) pela paciência, compreensão e

incentivo, sem você tudo seria mais difícil, muito obrigada meu amor.

Todos os colegas e professores do Laboratório de Tecnologia e

Biotecnologia Farmacêutica (Tecbiofar) pelas contribuições científicas e

amizade. Em especial gostaria de agradecer a Maíra Lima, Alaine Maria,

Philippe Castro, Gabriel Azevedo, Karla Samara, Alessandra Daniele,

Ilanna Tainá, Menilla Alves, Richele Machado, Juliana Félix, Yamara

Menezes, Fiamma Gláucia, Andréia Estrela, Jacyra Antunes e Jairo Sotero

(amigo e professor).

À Dona Ana e Washington, pela paciência e auxílio nos cuidados com

os animais no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN.

Agradeço aos animais, vítimas solicitadas pela ciência para o benefício

da humanidade, o meu respeito e eterna gratidão.

Agradeço a todos os familiares e amigos que sempre me apoiaram e

incentivaram, seja por orações ou mensagens motivacionais e me desculpo

pelos momentos de ausência.

Àqueles que por ventura deixei de mencionar e que contribuíram

direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.

Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O sonho

é o que temos de realmente nosso, de impenetravelmente e

inexpugnavelmente nosso.

(Fernando Pessoa)

RESUMO

Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae), conhecida popularmente

por ‘mangabeira’, é usada na medicina popular para o tratamento de desordens

inflamatórias, hipertensão, dermatites, diabetes, doenças hepáticas e

desordens estomacais. No que diz respeito aos frutos de H. speciosa, a

etnobotânica indica o uso principalmente para o tratamento de inflamação e

tuberculose, entretanto não há relatos de estudos que comprovem sua possível

atividade biológica. O estudo tem como objetivo avaliar a atividade anti-

inflamatória do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa Gomes. O extrato

aquoso foi preparado por decocção, posteriormente submetido a um

fracionamento por meio de partição líquido-líquido e os metabolitos

secundários identificados por Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada

ao detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) e Cromatografia líquida

acoplada ao detector de arranjo de diodo e ao espectrômetro de massa (CL-

DAD-EM). As propriedades anti-inflamatórias do extrato aquoso, frações

diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH), bem

como a rutina e o ácido clorogênico foram investigadas usando modelos in vivo

e in vitro. Testes in vivo compreenderam edema de orelha induzido por xilol,

onde foi mensurado a formação do edema; peritonite induzida por carragenina

onde foi avaliado os leucócitos totais em 4h e bolsa de ar induzida por zimosam

que foi mensurado a contagem total de leucócitos e contagem diferencial em 6,

24 e 48 horas. Os testes in vitro avaliaram os níveis de citocinas IL-1β, IL-6, IL-

12 e TNF-α usando ELISA a partir do modelo de peritonite induzido por

carragenina. Os resultados demonstraram a presença de rutina e ácido

clorogênico no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa por CLAE-DAD e CL-

DAD-EM. O extrato aquoso e frações, bem como a rutina e ácido clorogênico

inibiram significativamente o edema de orelha induzido por xilol e reduziram a

migração celular em modelos animais, tanto na peritonite induzida por

carragenina como na bolsa de ar induzida por zimosam. Além disso, foi

observada a redução dos níveis de expressão de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e

TNF-α. Este é o primeiro estudo que demonstra o efeito anti-inflamatório do

extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa contra diferentes agentes

inflamatórios em modelos animais, sugerindo que suas moléculas bioativas,

especialmente rutina e ácido clorogênico contribuem, em parte, para o efeito

anti-inflamatório do extrato aquoso. Estes resultados suportam a utilização de

H. speciosa na medicina popular e revelam que o extrato aquoso apresenta um

potencial terapêutico para o desenvolvimento de uma droga herbal com

propriedades anti-inflamatórias.

Palavras-chave: Hancornia speciosa, rutina, ácido clorogênico, anti-inflamatório, Apocynaceae.

ABSTRACT

Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae), popularly known as

‘mangabeira’, has been used in folk medicine to treat inflammatory disorders,

hypertension, dermatitis, diabetes, liver diseases and stomach disorders.

Regarding the Hancornia speciosa fruits, the ethnobotany indicates its use

especially for treating inflammation and tuberculosis. However, no study has

been done so far to prove such biological activities. The objective was

evaluation anti-inflammatory activity from the fruits of Hancornia speciosa

Gomes (mangabeira). Aqueous extract was prepared by decoction,

subsequently submitted the liquid-liquid fractionation. The secondary

metabolites were identified by high performance liquid chromatography coupled

with detector diode array (HPLC-DAD) and liquid chromatography diode array

detector coupled with mass spectrometry (LC-DAD-MS). The anti-inflammatory

properties of the aqueous extract, dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetate

(EtOAc) and n-butanol (n-BuOH) fractions of the fruits from H. speciosa, as well

as rutin and chlorogenic acid were investigated using in vitro and in vivo

models. In vivo tests comprised the xylene-induced ear edema that was

measured the formation of edema, carrageenan-induced peritonitis was

evaluated the total leukocytes at 4h and zymosan-induced air pouch was

measured the total leukocytes and differential cell count at 6, 24 and 48 hours,

whereas in vitro tests were evaluated levels of cytokines IL-1β, IL-6, IL-12 and

TNF-α using ELISA obtained of carrageenan-induced peritonitis model. The

results showed the presence of rutin and chlorogenic acid were detected in the

aqueous extract from H. speciosa fruits by HPLC-DAD and LC-DAD-ME.

Furthermore, the aqueous extracts and fractions, as well as rutin and

chlorogenic acid significantly inhibited the xilol-induced ear edema and reduced

cell migration in the animal models such as carrageenan-induced peritonitis and

zymosan-induced air pouch. In addition, reduced levels of cytokines IL-1β, IL-6,

IL-12 and TNF-α were observed. This is the first study that demonstrated the

anti-inflammatory effect of aqueous extract from Hancornia speciosa fruits

against different inflammatory agents in animal models, suggesting that their

bioactive molecules, especially rutin and chlorogenic acid contributing, at least

in part, to the anti-inflammatory effect of aqueous extract. These findings

support the widespread use of Hancornia speciosa in popular medicine and

demonstrate that this aqueous extract has therapeutic potential for the

development of a herbal drugs with anti-inflammatory properties.

Keywords: Hancornia speciosa, rutin, chlorogenic acid, Anti-inflammatory, Apocynaceae.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Cascata do ácido araquidônico ................................................... 23

Figura 2 - Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios não esteroidais (A) e

anti-inflamatórios esteroidais (B) ................................................. 25

Figura 3 - Frutos de Hancornia speciosa Gomes ........................................ 29

Figura 4 - Esquema representativo do processo de fracionamento por

meio de partição líquido-líquido do extrato aquoso dos frutos de

Hancornia speciosa. ...................................................................... 38

Figura 5 - Cromatogramas obtidos por Cromatografia em Camada Delgada

do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa

........................................................................................................ 51

Figura 6 - Cromatogramas obtidos por co-Cromatografia em Camada

Delgada do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia

speciosa com padrões .................................................................. 52

Figura 7 - Cromatograma obtido por CLAE do extrato aquoso dos frutos

de Hancornia speciosa e seus respectivos espectros de UV

gerados pelo detector DAD. ......................................................... 54

Figura 8 - Estrutura química da rutina (A) e do ácido clorogênico (B) ...... 55

Figura 9 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na

migração leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido

por carragenina ............................................................................. 57

Figura 10 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa

sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e

TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos

submetidos à peritonite induzido por carragenina .................... 58

Figura 11 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila

(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa na

migração leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido

por carragenina ............................................................................. 59

Figura 12 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila

(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa sobre a

produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a

partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à

peritonite induzido por carragenina ............................................ 60

Figura 13 - Efeito da rutina na migração leucocitária a partir do modelo de

peritonite induzido por carragenina ............................................ 61

Figura 14 - Efeito da rutina sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6

(B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de

camundongos submetidos à peritonite induzido por carragenina

........................................................................................................ 62

Figura 15 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir

do modelo de peritonite induzido por carragenina .................... 63

Figura 16 - Efeito do ácido clorogênico sobre a produção de citocinas IL-

1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato

peritoneal de camundongos submetidos à peritonite induzido

por carragenina ............................................................................. 64

Figura 17 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na

migração leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido

por zimosam .................................................................................. 71


sobre cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa de

ar induzida por zimosam .............................................................. 73


sobre cinética de migração de polimorfonucleares (A) e

mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por

zimosam ......................................................................................... 74

Figura 20 - Efeito rutina na migração leucocitária a partir do modelo de

bolsa de ar induzido por zimosam ............................................... 75

Figura 21 - Efeito da rutina sobre cinética de migração leucocitária em

modelo de bolsa de ar induzida por zimosam ............................ 76

Figura 22 - Efeito da rutina sobre cinética de migração de

polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de

bolsa de ar induzida por zimosam ............................................... 77

Figura 23 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir

do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ....................... 78

Figura 24 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração

leucocitária em modelo de bolsa de ar induzida por zimosam . 79

Figura 25 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração de

polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de

bolsa de ar induzida por zimosam ............................................... 80

LISTA DE TABELA

Tabela 1 - Partes da planta e uso popular da espécie Hancornia speciosa

........................................................................................................ 30

Tabela 2 - Partes da planta, preparação e atividade biológica comprovada

experimentalmente da espécie Hancornia speciosa .................. 31

Tabela 3 - Principais metabólitos encontrados no extrato aquoso dos

frutos de Hancornia speciosa e seus respectivos métodos

químicos de identificação. ............................................................ 49

Tabela 4 – Percentagem de inibição do extrato aquoso e frações dos

frutos de Hancornia speciosa, bem como rutina e ácido

clorogênico em modelo de peritonite induzida por carragenina

........................................................................................................ 67

Tabela 5 - Atividade anti-edematogênica do extrato aquoso dos frutos de

Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico em modelo de

edema de orelha induzido por xilol .............................................. 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AC Ácido clorogênico

AcOEt Acetato de etila

AIEs Anti-inflamatórios esteroidais

AINEs Anti-inflamatórios não-esteroidais

Anova Analysis of variance (análise de variância)

BuOH n-butanol

CCD Cromatografia em camada delgada

CCS Centro de Ciências da Saúde

CD4 Cluster of differentiation of type 4 (Cluster de diferenciação

do tipo 4)

CH2Cl2 Diclorometano

CLAE-DAD Cromatografia a líquido de alta eficiência acoplada a

arranjos diodo

CL-DAD-EM Cromatrografia líquida acoplada ao detector de arranjo de

diodo e ao espectrômetro de massa

Co-CCD Co-cromatografia em camada delgada

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

COX-1 Cicloxigenase 1

COX-2 Cicloxigenase 2

DAD Detector de arranjo de diodos

EA Extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa

ECA Enzima conversora de angiotensina

ELISA Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ensaio de

imunoabsorbância ligada à enzima)

EM Espectrofotômetro de massas

ESI-MS Electrospray ionization mass spectrometry (espectrometria

de massas com ionização electrospray)

FR1 Fração diclorometano

FR2 Fração acetato de etila

FR3 Fração n-butanol

i.p. Intraperitoneal

i.v. Intravenoso

HCl Ácido clorídrico

H2SO4 Ácido Sulfúrico

IL-1β Interleucina 1β

IL-6 Interleucina 6

IL-12 Interleucina 12

iNOS Inducible nitric oxide synthase (óxido nítrico sintetase

induzida)

MN Mononucleares

MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 (gene de

resposta primária de diferenciação mielóide 88)

m/z relação massa carga

NF-κB Nuclear factor kappa B (fator nuclear kappa B)

NK Natural Killer cell (células exterminadoras naturais)

ON Óxido nítrico

p p-valor

PBS Phosphate buffered saline (tampão salina-fosfato)

PG Prostaglandinas

PGE2 Prontaglandinas E2

PI3-K Phosphoinositide 3-kinase (Fosfatidilinositol 3-quinase)

PMN Polimorfornucleares

PGI2 Prostaciclina

Rf Retention factor (fator de retenção)

RT Tempo de retenção

Sal Solução salina estéril (0,9 mg/mL)

s.c. Subcutâneo

Sisbio Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

TMB Tetrametilbenzidina

TNF-α Tumor necrosis factor α (fator de necrose tumoral α)

TXA2 Tromboxanos A2

UV Ultravioleta

Zim Zimosam

http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 16

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................... 19

2.1 Inflamação ................................................................................................. 19

2.1.1 Aspectos gerais da inflamação ..................................................... 19

2.1.2 Eventos vasculares e celulares .................................................... 20

2.1.3 Principais mediadores inflamatórios ............................................ 21

2.1.4 Terapia anti-inflamatória ................................................................ 24

2.2 Plantas Medicinais como alternativa terapêutica .................................. 26

2.2.1 Hancornia speciosa Gomes .......................................................... 28

3 OBJETIVOS .................................................................................................. 34

3.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 34

3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 34

4 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 35

5 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 37

5.1 Material vegetal ........................................................................................ 37

5.2 Preparação do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa ..... 37

5.3 Fracionamento do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa 37

5.4 Análises fitoquímicas do extrato aquoso de Hancornia speciosa ....... 38

5.4.1 Triagem fitoquímica ....................................................................... 38

5.4.1.1 Pesquisa de Taninos – Reação de precipitação em gelatina

.............................................................................................................. 39

5.4.1.2 Pesquisa de Alcalóides – Reação de precipitação em

reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand ....................... 39

5.4.1.3 Pesquisa de Saponinas – Reação de formação de espuma 39

5.4.1.4 Pesquisa de Compostos fenólicos – Reação com cloreto

férrico ................................................................................................... 40

5.4.1.5 Pesquisa de Flavonóides – Reação de Cianidina ou Shinoda

.............................................................................................................. 40

5.4.2 Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................... 40

5.4.3 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao detector de

arranjo de diodo (CLAE- DAD) ............................................................... 41

5.4.4 Cromatografia líquida acoplada com detector de arranjos de

diodo e ao espectrômetro de massas (CL-DAD-EM) ........................... 42

5.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato aquoso dos frutos

de Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico. ................................... 43

5.5.1 Animais de experimentação .......................................................... 43

5.5.2 Modelo de peritonite induzido por carragenina........................... 43

5.5.2.1 Dosagem de citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α

do lavado peritoneal ............................................................................ 44

5.5.3 Modelo de edema de orelha induzido por xilol ............................ 45

5.5.4 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ............................. 46

5.5.4.1 Cinética de migração leucocitária total e diferencial a partir

do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ............................. 47

5.6 Análise estatística .................................................................................... 48

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 49

6.1 Análise Fitoquímica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia

speciosa .......................................................................................................... 49

6.1.1 Triagem fitoquímica e Cromatografia em camada delgada (CCD)

.................................................................................................................. 49

6.1.2 CLAE-DAD e LC-DAD-EM confirmam a presença de rutina e

ácido clorogênico no extrato aquoso dos frutos Hancornia speciosa

.................................................................................................................. 53

6.2 Efeito do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa,

rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzido por

carragenina ..................................................................................................... 55

6.3 Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, rutina e

ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol ...... 68


ácido clorogênico em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ....... 70

7 CONCLUSÂO ............................................................................................... 83

REFERENCIAS ................................................................................................ 85

PRODUÇÕES CIENTÍFICAS ........................................................................... 96

Artigo de Mestrado submetido como autora ............................................... 96

Artigo Publicado como co-autora ................................................................. 97

Artigo Submetido como co-autora ............................................................... 98

16

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais é uma prática comum na medicina popular

brasileira e baseia-se no acúmulo de conhecimentos empíricos por vários

grupos étnicos sobre a eficácia destes produtos naturais (LUIZ-FERREIRA et

al., 2008). No Brasil existem 120.000 espécies vegetais, onde cerca de 20%

são conhecidas por ter caráter medicinal. Elas são amplamente utilizadas em

pesquisas para o desenvolvimento de novos medicamentos, pois representam

uma fonte rica de compostos com atividades farmacológicas (YASEEN et al.,

2015). Estas plantas são encontradas em abundância e representam uma fonte

natural de fácil acesso a população com um custo relativamente baixo

(CALIXTO, 2005).

A Hancornia speciosa Gomes, pertence à família Apocynaceae,

conhecida popularmente como ‘mangabeira’ é uma árvore frutífera encontrada

em regiões do cerrado e caatinga do Brasil (RODRIGUES; CARVALHO, 2001).

Na medicina popular o suco leitoso dos frutos é usado no tratamento de

úlceras, processos inflamatórios e tuberculose (SAMPAIO, 2008), enquanto

que o infuso das cascas é utilizado no tratamento de hipertensão, úlceras

gástricas, distúrbios estomacais e processos inflamatórios (ALMEIDA et al.,

1998). Suas raízes e folhas são usadas como adstringente e no tratamento de

hipertensão e reumatismo (GRANDI et al., 1982; HIRSCHMANN; ARIAS,

1990). Alguns estudos reportados na literatura comprovam várias atividades

biológicas, como por exemplo, o extrato etanólico das folhas exibiu efeitos anti-

hipertensivos (FERREIRA et al., 2007a, 2007b), anti-carcinogênico

(ENDRINGER et al., 2009, 2010) e anti-diabético (PEREIRA et al., 2015).

Moraes et al. (2008) e Rodrigues et al. (2007) demonstraram que o extrato

hidroalcóolico e o infuso das cascas apresentaram efeito gastroprotetor, bem

como atividade antibacteriana contra Helicobacter pylori. Outros estudos

mostraram que o látex possui atividade angiogênica (ALMEIDA et al., 2014),

antimicrobiana, antifúngica (SILVA et al., 2011) e anti-inflamatória (MARINHO

et al., 2011). Porém no que diz respeito aos frutos não há estudos científicos

que evidenciem sua atividade biológica, apenas o uso popular, especialmente

no tratamento de desordens inflamatórias.

17

A inflamação é a resposta do sistema imune frente a diferentes

estímulos, podendo ser desencadeada por substâncias químicas, luz

ultravioleta, calor, substâncias inócuas externas, isquemia, interações

antígeno-anticorpo ou contra os próprios tecidos do corpo (CARVALHO;

LEMÔNICA, 1998). O reconhecimento de um estímulo ou agente lesivo

desencadeia ativação e amplificação da resposta imunológica, induzindo a

ativação de células e liberação de mediadores envolvidos com a resposta

inflamatória (NATHAN, 2002; SCHMID-SCHONBEIN, 2006). Dentre esses

mediadores as citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) merecem

atenção, pois elas são responsáveis pela modulação da resposta inflamatória

induzindo a expressão de moléculas de adesão e por induzir recrutamento

leucocitário da corrente sanguínea para o local da inflamação (TAYAL; KALRA,

2008).

Para inibir ou controlar o processo inflamatório, medicamentos anti-

inflamatórios não esteroidais (AINEs) e anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) são

comumente utilizados. Entretanto, o uso prolongado ou abusivo de AINEs pode

causar sérios efeitos adversos, tais como complicações cardiovasculares e

gastrointestinais (SOSTRES et al., 2010), enquanto que os AIEs causam

imunossupressão reduzindo a resistência à infecção, agravamento de úlceras

estomacais e osteoporose (WHITEHOUSE, 2011).

Alternativamente, a população vem utilizando as plantas como opção

para o tratamento de desordens inflamatórias. Estudos tem mostrado que

substâncias derivadas de plantas são capazes de alterar a função do sistema

imune através de vários efeitos imunomoduladores. Por exemplo, alguns

extratos vegetais são capazes de inibir a migração leucocitária, secreção de

citocinas, liberação de histamina, proliferação e diferenciação de linfócitos

(PLAEGER, 2003; SAKLANI; KUTTY, 2008). Dando importância a estas

propriedades biológicas, o conhecimento popular unido ao conhecimento

científico tem mostrado ser uma ótima ferramenta para a descoberta de novos

fitoterápicos a partir de plantas medicinais (ITOKAWA et al., 2008; SAKLANI;

KUTTY, 2008; KOLEWE; GAURAV; ROBERTS, 2008).

Com base nas propriedades biológicas de H. speciosa e na importância

das plantas medicinais como fonte para descoberta de novos medicamentos, o

estudo teve como objetivo avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato aquosos

18

dos frutos de H. speciosa em modelos experimentais de inflamação em

camundongos. In vivo foram avaliados os modelos de (i) peritonite induzida por

carragenina, (ii) edema de orelha induzido por xilol e (iii) bolsa de ar induzida

por zimosam, enquanto que in vitro foram analisadas (iv) a produção de

citocinas inflamatórias (IL β1, IL-6, IL-12 e TNF-α) obtidas a partir do modelo de

peritonite induzida por carragenina. Além disso, foi possível realizar análises

fitoquímicas para identificação dos constituintes presentes no extrato aquoso.

Este é o primeiro estudo que investigou o efeito anti-inflamatório do extrato

aquoso dos frutos de H. speciosa em modelos experimentais de inflamação.

19

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Inflamação

2.1.1 Aspectos gerais da inflamação

A palavra inflamação, do grego phlogosis e do latim flamma, significa

fogo, área em chama. Trata-se de um dos mecanismos mais primitivos de

defesa natural do organismo a invasão por microrganismos patogênicos

(BITENCOURT et al., 2011). Os primeiros sinais clínicos da inflamação foram

datados a aproximadamente 3000 a.C., porém no século I d.C., Aulus C.

Celsus documentou os quatro sinais da inflamação: calor, rubor, edema e dor.

No século XIX, Rudolf Virchow adicionou o quinto sinal, a perda de função

(BENAROYO, 1994; SCOTT; KHAN; DURONIO, 2004).

A inflamação é uma resposta do sistema imune a diferentes estímulos

causados por agentes químicos, físicos ou biológicos e tem por função

erradicar os agentes microbianos ou irritantes e potencializar o reparo tecidual

(BAUTISTA, 2003). No momento da injúria ocorre aumento no fluxo sanguíneo

e dilatação dos pequenos vasos (rubor), seguido do aumento da

permeabilidade vascular (edema), induzindo o aumento da temperatura local

(calor) e a passagem de leucócitos do vaso para o local da inflamação (dor)

(BENAROYO, 1994). O processo inflamatório termina quando o estímulo é

eliminado e os mediadores secretados são destruídos ou dispersos. Além

disso, o nosso organismo é capaz de autorregular a resposta imune e assim

impedir uma resposta inflamatória exacerbada (GRUNDY, 2003), porém

quando o processo inflamatório é desregulado e a resposta inflamatória passa

a ser exacerbada pode ocorrer injúria tecidual, com consequente perda de

função no órgão injuriado ou até mesmo morte (SHERWOOD; TOLIVER-

KINSKY, 2004).

A resposta inflamatória pode ocorre de duas formas: aguda e crônica,

divisão essa baseada na duração e características patológicas. Normalmente a

forma aguda é de curta duração (de minutos, horas ou poucos dias), cuja

característica principal está relacionada com o extravasamento de plasma e

proteínas plasmáticas para o interstício, o que induz formação de edema e

20

migração leucocitária (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004), enquanto que

a forma crônica é caracterizada por inflamações mais prolongadas (semanas,

meses ou anos), podendo ser precedida pela forma aguda, estando associada

à presença de linfócitos, macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibrose

e necrose tecidual (DRAY, 1995).

2.1.2 Eventos vasculares e celulares

O processo inflamatório é um mecanismo complexo e consiste de dois

eventos principais que ocorrem simultaneamente, os eventos vasculares e

celulares, com a presença de uma diversidade de substâncias solúveis.

O evento vascular inicia com a lesão e envolve basicamente a

microcirculação. Em condições normais as células e proteínas plasmáticas

migram livremente no sentido do fluxo sanguíneo, porém ao sofrer algum

estímulo lesivo os vasos alteram sua permeabilidade para facilitar a passagem

de leucócitos para o local da inflamação (BAUTISTA, 2003). No primeiro

momento ocorre uma vasoconstricção, com duração de segundo, seguida de

uma vasodilatação produzida por histaminas, serotoninas, bradicininas e

prostaglandinas, que medeiam à contração das células endoteliais favorecendo

o aumento da permeabilidade vascular (SERHAN et al., 2009). O aumento da

permeabilidade vascular induz a formação de edema, caracterizado pelo

extravasamento de fluido rico em proteínas, do compartimento intravascular

para o interstício (ALLER et al., 2007).

A vasodilatação e a exsudação plasmática são acompanhadas por uma

sequência de eventos celulares que resulta na passagem dos leucócitos

intravascular para os tecidos (SUNDERKOTTER et al., 2003). Esses eventos

ocorrem nos vasos e são divididos em três etapas: a primeira etapa ocorre a

marginação, rolagem e adesão; segunda transmigração através do endotélio

(diapedese) e a terceira está relacionado com a migração nos tecidos em

direção a estímulos quimiotáticos (TRAVIS, 1993).

Para iniciar a marginalização é necessário haver mudanças nas

condições hemodinâmicas da circulação sanguínea, com isso os leucócitos

passam a assumir uma posição periférica ao longo da superfície endotelial

(TRAVIS, 1993). Depois ocorre rolamento das células nas paredes dos vasos

21

com interações fracas entre as moléculas de adesão, como as E, P e L-

selectinas, presentes no endotélio e seu respectivo ligante, o fragmento de

carboidrato sialil-Lewis, presente nos leucócitos (MIDDLETOM et al.,1997;

POBER; SESSA, 2007), posteriormente uma interação mais forte permite a

adesão das células às paredes dos vasos. Essa adesão firme ocorre pela

interação entre as moléculas de adesão celular do tipo 1 (ICAM-1) endotelial

com proteínas heterodiméricas da família das integrinas dos leucócitos. A

interação com ICAM-1funcionam como estimuladores da transmigração dos

leucócitos pelo endotélio para os tecidos (diapedese) (KELLY et al., 2007;

LEHMANN et al., 2003). A diapedese envolve desmontagem transitória de

junções endoteliais e penetração dos leucócitos através da membrana basal

subjacente, uma vez no espaço extravascular, a migração de células usa

diferentes integrinas para ganhar aderência em fibras de colágeno e chegarem

ao local da inflamação (ZARBOCK; LEY, 2009). Chegando ao local da

inflamação, os leucócitos fagocitam os patógenos e posteriormente são

ativados para liberação de mediadores inflamatórios, como citocinas, proteases

e espécies reativas de oxigênio que têm como função, combater os agentes

infecciosos (NATHAN, 2006; MALLECH; GALLIN, 1987). Os neutrófilos são os

principais leucócitos que participam na defesa do organismo durante o

processo inflamatório. Sua participação é multifuncional no processo de

inflamação e envolvem respostas apropriadas por meio de locomoção,

reconhecimento seletivo do agente agressor, fagocitose e sua posterior

destruição, além de induzir o recrutamento de outras células leucocitárias

(CASSATELLA, 1995). Os neutrófilos predominam nos tecidos inflamados

durante as primeiras horas, em seguida são substituídos por mononucleares,

em especial os monócitos, que surgem após 24 horas (SIQUEIRA, 2000).

2.1.3 Principais mediadores inflamatórios

Os eventos vasculares e celulares ocorrem graças à presença de

diversos mediadores químicos inflamatórios, os principais envolvidos na

inflamação incluem histamina, serotonina, bradicinina, metabolitos do ácido

araquidônico, citocinas, dentre outros (CASTELLHEIM et al., 2009).

22

A histamina e serotonina, aminas vasoativas, são mediadores pré-

formados (RINGVALL et al., 2008) responsáveis, juntamente com outros

mediadores, pela vasodilatação e subsequente aumento da permeabilidade

vascular (ALLER et al., 2007). A histamina exerce seu efeito biológico ao se

ligar a receptores histamínicos presentes em células endoteliais e na

musculatura lisa vascular e quando ativados provocam vasodilatação pela

produção de óxido nítrico (JANSEN-OLESEN et al., 1997). Semelhante à

histamina, a serotonina exerce o mesmo efeito biológico e está relacionada

com a sensação de dor na inflamação, através de sua ação sobre neurônios

sensoriais (DRAY, 1995). A bradicinina, um peptídeo vasoativo, afeta o calibre

dos vasos sanguíneos através de estimulação de neurônios pós-ganglionares

simpáticos liberando histamina, causando a vasodilatação (CARVALHO;

LEMÔNICA, 1998).

O ácido araquidônico é formado a partir de fosfolipídios de membrana

pela ação da fosfolipase A2, e a partir dele serão formados precursores de

vários eicosanoides (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). As prostaglandinas,

prostaciclinas, lipoxinas, leucotrienos e os tromboxanos são exemplos de

eicosanoides formados (DRAY, 1995; TANIKAWA et al., 2002) (Figura 1). O

ácido araquidônico pode ser metabolizado pelas enzimas cicloxigenase e

lipoxigenases. As cicloxigenases são responsáveis em produzir

prostaglandinas (D2, E2 e F2), prostaciclinas (PGI2) e troboxanos, enquanto

que as lipoxigenases são responsáveis em produzir leucotrienos e lipoxinas. As

prostaciclinas e prostaglandinas atuam na quimiotaxia de neutrófilos e

macrófago e são potentes vasodilatadores, aumentando a permeabilidade

vascular e promovendo o extravasamento plasmático. Os troboxanos A2 são

potentes agregadores plaquetários e os leucotrienos, em especial o LTB4,

ativam as respostas dos neutrófilos, como agregação e adesão ao endotélio

venular, geração de espécies reativas de oxigênio e liberação de enzimas,

além da potente atividade quimiotática (LEE et al., 2003; NATHAN, 2002;

SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

23

Figura 1 - Cascata do ácido araquidônico

Fonte: Autoria própria

Dentre todos os mediadores envolvidos na inflamação, as citocinas são

as que merecem mais atenção. Trata-se de polipeptídeos que exercem seus

efeitos em baixas concentrações modulando a função de outras células ou da

própria célula que as liberaram. Normalmente são liberadas durante as reações

imunes e inflamatórias, com a função de regular a ação das células destes

sistemas (OPAL; DEPOLO, 2000). As principais citocinas envolvidas em

processos inflamatórios são o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), a

interleucina 1β (IL-1β) e a interleucina 6 (IL-6) (ALWANI, et al., 2006).

Macrófagos ativados estão entre as células que mais produzem essas citocinas

pró-inflamatórias, juntamente com a IL-12. (BITENCOURT, 2011).

A IL-1β é uma citocina produzida principalmente por monócitos e

macrófagos, que induz inflamação sistêmica através da ativação da

cicloxigenase-2 (COX-2) com a formação de prostaglandinas E2. O TNF-α

produzido principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos-T, é um dos

mediadores mais potentes e precoces da resposta inflamatória. Juntos, a IL-1β

e o TNF-α, ativam IL-6 que induz a síntese e liberação de proteínas de fase

aguda pelos hepatócitos durante estímulos dolorosos, como trauma, infecção,

24

operação e queimadura (OLIVEIRA, et al., 2011). Já a IL-12 desempenha um

papel importante porque ativa as células NK e favorece a diferenciação dos

linfócitos T CD4 em TH1 (ações pro-inflamatórias) durante a resposta

imunidade adaptativa (BITENCOURT, 2011).

2.1.4 Terapia anti-inflamatória

A homeostasia é restabelecida quando a inflamação é limitada por

respostas anti-inflamatórias desenvolvidas por nosso organismo (NATHAN;

LIDDLE, 2002). Porém quando nosso organismo não é capaz de restabelecer

essa homeostase é necessário o uso de substâncias que quando

administradas possuam ação anti-inflamatória e atuem na recuperação da

homeostasia corpórea.

Dentre as principais terapias anti-inflamatórias, os anti-inflamatórios

não esteroidais (AINEs) são os mais utilizados. Sua ação ocorre principalmente

pela inibição da enzima cicloxigenase (COX), que é responsável pela produção

de prostaglandinas, prostaciclinas e troboxanos (BURIAN; GEISSLINGER,

2005) (Figura 2A). A COX se apresenta com 3 isoformas: COX-1, COX-2 e

COX-3.

A COX-1 é de caráter constitutivo, atuando como protetor de mucosa,

além de mantém a reperfusão hepática e renal, enquanto que a COX-2 é

ativada principalmente em processos inflamatórios. A grande limitação dos

AINEs está em seu efeito farmacológico ocorrer à base de efeitos colaterais

graves, principalmente sobre o trato gastrointestinal, isso porque esses

medicamentos inibem tanto a COX-1 como a COX-2 (ALWANI, EL et al., 2006).

Os efeitos adversos gastrointestinais estão associados à supressão da

expressão da COX-1, resultando em lesões gástricas, hemorragias e

ulcerações, além de alterações cardiovasculares, falência renal e asma

(RANG, 2007; SOSTRES et al., 2010).

Além de inibir a produção de prostaglandinas, os anti-inflamatórios não

esteroidais são capazes de impedir que as células leucocitárias possam aderir

e migrar no endotélio vascular em determinados processos inflamatórios.

Assim, um dos melhores efeitos farmacológicos exercidos pelos AINEs e outros

25

anti-inflamatórios, como glicocorticoides, é limitar a ativação e recrutamento de

leucócitos (WAGNER; ROTH, 2000).

Os glicocorticoides, ou anti-inflamatórios esteroidais (AIEs), atuam no

início da cascata da produção de eicosanoides. São medicamentos que inibem

a fosfolipase A2, promovendo a redução da oferta de ácido araquidônico,

consequentemente impedindo a formação de leucotrienos, lipoxinas,

prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos (DOLAN-O’KEEFE; NICK, 1999)

(Figura 2B).

Figura 2 - Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios não esteroidais (A) e anti-

inflamatórios esteroidais (B)


Um glicocorticoide que é bastante usado na terapêutica é a

dexametasona. Trata-se de um anti-inflamatório esteroidal de ação prolongada,

que possui atividade farmacológica 30 vezes maior que a hidrocortisona. Este

medicamento atua inibindo a produção de citocinas inflamatórias, suprimindo a

exsudação do plasma e inibindo a ativação, migração, adesão e

recrutamento celular, além de impedir o acúmulo de leucócitos no local da

inflamação (KAWAMURA et al., 2000; RANG, 2007). Como é esperado, os

AIEs também inibem a formação dos leucotrienos, eicosanoide responsável

pela quimiotaxia de neutrófilos e aumento da permeabilidade vascular. Sua

ação anti-inflamatória é superior ao AINEs por ter a capacidade de impedir a

ação tanto das lipoxigenases como das cicloxigenases (HIGGS et al. 1980).

Apesar de ter uma ação superior aos AINEs, os glicocorticoides

também podem causar inúmeros efeitos adversos, principalmente quando

A B

26

utilizado em altas doses, por longos períodos de tempo ou repetidamente.

Entre os principais efeitos estão à imunossupressão, osteoporose, retenção de

líquidos, predisposição ao desenvolvimento de úlceras gástricas, entre outras

complicações (WHITEHOUSE, 2011).

Os medicamentos anti-inflamatórios são usados para alívio dos

sintomas, particularmente dor e inflamação, porém causam sérios e inúmeros

efeitos adversos. Dependendo da patologia ou condição clínica do paciente,

estes medicamentos não apresentam vantagens quanto ao tratamento, uma

vez que os efeitos adversos podem sobrepor os efeitos terapêuticos. Desta

forma, a busca por novas alternativas terapêuticas, e/ou tratamentos anti-

inflamatórios com menos efeitos adversos são alvos de pesquisas. Neste

contexto as plantas medicinais vêm ganhando espaço e importância na

indústria farmacêutica, já que são amplamente utilizadas na pesquisa de novos

fármacos, pois representam uma fonte rica de compostos com atividade

farmacológica.

2.2 Plantas Medicinais como alternativa terapêutica

Os primeiros registros do uso de plantas medicinais datam 3.000 anos

a.C. As primeiras civilizações perceberam que algumas plantas tinham a

capacidade de combater doenças, baseado no conhecimento empírico

acumulado pelos povos primitivos e indígenas (VIEGAS; BOLZANI;

BARREIRO, 2006).

As plantas medicinais são usadas em todo mundo, porém nas regiões

rurais de países desenvolvidos a fitoterapia é bastante evidente, já que muitas

pessoas vivem em condições de pobreza e não tem acesso a medicina

moderna, dependendo somente de praticantes da medicina tradicional e do uso

de plantas medicinais como atenção primária a saúde (GOLENIOWSKI et al.,

2006). Através do uso popular que as pesquisas se iniciam, já que fornece

informações primárias para o aprofundamento técnico-cientifico sobre

determinada espécie.

A biodiversidade da flora brasileira aliada ao seu vasto potencial

terapêutico tem levado inúmeros pesquisadores a investigarem as

27

propriedades químicas e biológicas de uma grande variedade de plantas

utilizadas na medicina popular, bem como no sentindo de dar uma base

científica ao uso popular (BOLDI, 2004; SZELENYI; BRUME, 2002).

Nos últimos anos houve um grande avanço científico envolvendo

estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais. A descoberta de

substâncias, que em estado natural ou após sofrerem processos de

transformação química, possuem atividade farmacológica, muitas vezes já

confirmada pelo uso popular e comprovada cientificamente, gera interesses

institucionais e governamentais. No Brasil, estima-se que 25% dos 10 bilhões

do faturamento da indústria farmacêutica nacional sejam originados de

medicamentos derivados do reino vegetal. (AGRA et al., 2008; GUERRA;

NODARI, 2001).

Dentro deste contexto, o Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o

primeiro lugar dentre os 17 países mais ricos do mundo em biodiversidade,

possuindo cerca de 20 % do total de espécies existentes no planeta

(BANDEIRA-MELO et al., 2000). O bioma da caatinga brasileiro, por exemplo,

apresenta uma grande diversidade na sua flora, com arsenal de plantas que

possui moléculas com potencial terapêutico que precisam ser estudadas suas

propriedades curativas, especialmente para o tratamento e/ou controle de

doenças anti-inflamatórias (CALIXTO et al., 2004). Existem estudos que

demonstram que fármacos derivados de plantas são capazes de alterar a

função do sistema imunológico com uma gama de efeitos imunomoduladores,

podendo afetar a secreção de citocinas, liberação de histamina e a proliferação

de linfócitos (PLAEGER, 2003; SAKLANI; KUTTY, 2008).

Considerando que a terapia anti-inflamatória apresenta uma série de

efeitos adversos e que muitas vezes os efeitos colaterais podem sobrepor os

efeitos terapêuticos, existe uma necessidade de pesquisar novos fármacos que

possuam atividade anti-inflamatória, porém com o mínimo de efeitos colaterais.

Neste contexto, as plantas medicinais vêm ganhando espaço, e os frutos de

Hancornia speciosa vêm sendo bastante utilizado na medicina popular para o

tratamento de desordens inflamatórias (SAMPAIO, 2008).

28

2.2.1 Hancornia speciosa Gomes

A Hancornia speciosa Gomes conhecida popularmente como

mangabiba, mangaíba, mangaíba-uva, mangabeira de minas, fruta de doente,

mangabeira e mangaba, palavra de origem indígena que significa “coisa boa de

comer”, pertence ao grupo das Eudicotiledoneas, classe Magnoliopdida, ordem

Gentianales, família Apocynaceae e espécie Hancornia speciosa Gomes

(SOARES et al., 2001). É uma árvore frutífera nativa do Brasil de clima tropical

e largamente encontrada em vários estados brasileiros, desde os tabuleiros

costeiros e baixadas litorâneas do Nordeste, onde são mais abundantes, até

cerrados das regiões Centro-Oeste, Norte e Sudeste (SILVA et al., 2006).

Trata-se de uma árvore de grande porte, podendo atingir até 15 metros

de altura. Possui um tronco tortuoso com ramos lisos e avermelhados, suas

cascas apresentam um látex branco com aspecto leitoso, cor branca e pH em

torno de 3-4 (LIMA, 2014). As folhas são opostas, simples e pecioladas

(ALMEIDA et al., 1998), as flores brancas e aromáticas (GANGA, CHAVES;

NAVES, 2009). O fruto (Figura 3) apresenta casca amarelada com manchas ou

estrias avermelhadas, normalmente de forma elipsóide ou esférica, medindo de

2,5 a 6 centímetros de comprimento, contendo geralmente, de 2 a 15, ou até 30

sementes discóides, de 7 a 8 milímetros de diâmetro. Apresenta uma polpa

branca, doce, ácida, macia e viscosa com grande valor nutritivo que é

consumida fresca ou como suco, além de poder ser consumida como gelados,

geleias, confeitos e bebidas (LORENZI, 1998; VIEIRA NETO et al., 2002;

SANTOS et al., 2007).

29

Figura 3 - Frutos de Hancornia speciosa Gomes

Fonte: seresvivosdorn.blogspot.com.br

Na medicina popular o suco leitoso dos frutos e o látex são utilizados

como medicamento caseiro no tratamento de tuberculose, úlceras, dermatoses,

verrugas, hematomas, inflamações diversas, diarreia e herpes (SAMPAIO,

2008). O látex também é usado para o tratamento de doenças relacionadas a

fungos (SANTOS et al., 2007), luxação, estimulante hepático, agente

emagrecedor e hipoglicemiante (POTT; POTT, 1994). O infuso das cascas no

tratamento de hipertensão, úlceras gástricas, distúrbios estomacais e

processos inflamatórios, as cascas também são usadas no tratamento de

afecções pulmonares, câimbras e luxações (ALMEIDA et al., 1998; SILVA

JÚNIOR, 2005). As folhas são utilizadas o tratamento de dismenorreia,

diabetes, obesidade e verrugas (ALMEIDA et al., 1998), outros relatos indicam

o infuso das folhas para amenizar cólicas menstruais (SILVA JUNIOR, 2004).

Suas folhas e raízes são usadas também como adstringente e no tratamento

de hipertensão e reumatismo (GRANDI et al., 1982; HIRSCHMANN; ARIAS,

1990). A tabela 1 resume o uso popular de Hancornia speciosa.

30

Tabela 1 - Partes da planta e uso popular da espécie Hancornia speciosa

Parte da planta Uso popular Referências

Frutos

tuberculose, úlceras,

dermatoses, verrugas,

hematomas, inflamações

diversas, diarreia e herpes

SAMPAIO, 2008

Látex

tuberculose, úlceras,

dermatoses, verrugas,

hematomas, inflamações

diversas, diarreia, herpes,

doenças fúngicas, luxação,

diabetes e obesidade

SAMPAIO, 2008;

SANTOS et al., 2007;

POTT; POTT, 1994

Cascas

hipertensão, úlceras gástricas,

distúrbios estomacais,

processos inflamatórios,

afecções pulmonares, câimbras

e luxações

ALMEIDA et al., 1998;

SILVA JÚNIOR, 2005

Folhas

dismenorréia, diabetes,

obesidade, verrugas e cólicas

menstruais, hipertensão,

reumatismo

ALMEIDA et al., 1998;

SILVA JÚNIOR, 2005;

GRANDI et al., 1982;

HIRSCHMANN; ARIAS,

1990

Raízes

Hipertensão e reumatismo

GRANDI et al., 1982;

HIRSCHMANN; ARIAS,

1990

Existem alguns estudos evidenciando o uso popular de Hancornia

speciosa, sintetizados na Tabela 2, como o realizado por Moraes et al. (2008)

que demonstraram que extrato hidroalcoólico das cascas pode ser utilizado no

combate, cura de úlceras gástricas e no tratamento de Helicobacter pylori.

Estas atividades foram atribuídas ao alto teor de proantrocianidinas poliméricas

contidas na fitopreparação. No extrato etanólico das cascas foram identificadas

a presença de saponinas, triterpenos, esteróides, taninos, compostos fenólicos,

catequinas e ácido clorogênico (ANDRADE et al., 2002; HONDA, 2000) e

comprovado o efeito antimicrobiano contra bactérias gram-positivas

(Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis), gram-negativa

(Pseudomonas aeruginosa) e antifúngico (Aspergillus flavus, Candida

guilliermondii, Rhodotorula rubra, Cephalosporium spp. e Trichosporon spp)

31

(COSTA et al., 2008) . Rodrigues et al. (2006,2007) fracionou o infuso das

cascas com acetato de etila e foi possível isolar ácido gálico, ácido clorogênico

e ácido siríngico.

Tabela 2 - Partes da planta, preparação e atividade biológica comprovada experimentalmente da espécie Hancornia speciosa

Parte da planta

Preparação Atividade Comprovada

Referências

Cascas

Extrato

hidroalcoólico

Antiulceroso

Anti Helicobacter-pylori

MORAES et al.,2008

Cascas

Extrato

etanólico

Antibacteriano

Antifúngico

COSTA et al., 2008;

HONDA, 2000

Folhas

Fração acetato

etila-metanol

Anti-hipertensivo

SILVA et al., 2011;

FERREIRA et al.,2007a, 2007b

Folhas

Extrato

etanólico e fração acetato

de etila:metanol

Quimiopreventiva

ENDRINGER et al., 2009, 2010

Folhas

Extrato

etanólico e fração

diclorometano

Antidiabético

PEREIRA et al., 2015

Látex

Látex

Anti-inflamatório

MARINHO et al.,

2011

Látex

Látex

Antifúngico

SILVA et al., 2011

Látex

Látex

Angiogênico

ALMEIDA et al.,

2014

32

No estudo de Silva et al. (2011) a fração acetato etila-metanol (1:1) do

extrato etanólico das folhas da mangabeira foi capaz de inibir a enzima

angiotensina I (ECA), levando a reduzir os níveis plasmáticos de angiotensina II

e aumentando os níveis de óxido nítrico (ON), consequentemente gerando um

efeito hipotensor. Ferreira et al. (2007a, 2007b) verificaram por Análise de

Cromatografia líquida de alta performance (CLAE) que o extrato etanólico das

folhas tinha como substância majoritária a rutina e que este flavonóide era o

responsável por promover o efeito vasodilatador em artérias mesentéricas de

ratos, não só pela produção de óxido nitríco, mas também pela ativação da via

fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K). Ainda sobre as folhas como farmacógenos

Endringer e colaboradores (2009, 2010) mostraram que o extrato etanólico e

fração acetato de etila:metanol (45:55) apresentavam uma atividade

quimiopreventiva por ter a capacidade de inibir o fator nuclear kappa B (NF-κB)

que está envolvido nos processos de proliferação, antiapoptose e

quimiorresistência de células neoplásicas. A função de quimioprevenção foi

atribuída ao sinergismo do L-(+)-bornesitol, ácido quínico e rutina. Outro estudo

realizado por Honda (1990) detectou a presença de esteróides, triterpenos e

taninos. Santos et al. (2007) detectou a presença de óleos voláteis

apresentando um teor variado de monoterpenos oxigenados e como

compostos majoritários o geraniol, α- terpenol e linalol. O estudo mais recente

da espécie demonstrou que o extrato etanólico e a fração diclorometano das

folhas são um potente anti-diabético, por ter a capacidade de inibir a enzima α-

glicosidase e aumentar a captação de glicose. No mesmo estudo foi

identificado no extrato etanólico a presença de bornesitol, ácido quínico, ácido

clorogênico e flavonoides glicosilados, enquanto que na fração diclorometano

foi detectado a presença de ésteres de lupeol e α e β-amirina (PEREIRA et al.,

2015).

No que diz respeito ao látex, Marinho e colaboradores (2011)

demonstraram a redução dos sinais inflamatórios através do bloqueio da via

das prostaglandinas E2 (PGE2), por reduzir a produção de citocinas pro-

inflamatórias no modelo de inflamação de bolsa de ar induzida por carragenina.

Esses dados corroboraram com o modelo de inflamação induzido por formalina

(segunda fase da inflamação), edema de pata induzido por carragenina, (todos

os intevalos de tempo) e contorções induzidas por ácido acético, demonstrando

33

que o látex de Hancornia speciosa pode ser uma terapia promissora ou

complementar no tratamento de desordens inflamatórias. No estudo realizado

por Santos et al. (2007) nas condições de análises e diante das linhagens

testadas (Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Neisseria

meningitidis, Streptococcus spp., Cryptococcus neoformans e Candida spp) o

látex da mangabeira não apresentou atividade antimicrobiana, entretanto no

estudo de Silva et al. (2011) mostraram um efeito do látex bastante significativo

contra o fungo Candida albicans. O látex também mostrou eficiência na

indução da angiogênese, favorecendo o processo de cicatrização, além de não

possuir atividade genotóxica e citotóxica (ALMEIDA et al., 2014). A Tabela 2

resume atividade biológica comprovada experimentalmente de Hancornia

speciosa.

No que diz respeito aos frutos foi realizado um estudo envolvendo

composição química, em que foram identificadas e quantificadas substâncias

voláteis em diferentes estágios de maturação (frutos verdes, médios e

maduros). Nos frutos verdes foram identificados 33 substâncias, sendo as

principais: monoterpenos oxigenados (linalol, α-terpineol e geraniol), ésteres,

cetonas, aldeidos e alcoois. Os frutos no seu estagio de maturação médio e

maduros apresentaram a mesma constituição, porém com proporções

diferentes (SAMPAIO; L. NOGUEIRA, 2006). A Tabela 2 resume atividade

biológica comprovada experimentalmente de Hancornia speciosa.

34

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato aquoso, frações e

compostos identificados dos frutos de Hancornia speciosa em modelos

experimentais de inflamação in vivo e in vitro.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar o estudo fitoquímico do extrato aquoso dos frutos de

Hancornia speciosa;

Avaliar o efeito do extrato aquoso, frações e compostos identificados

no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de peritonite

induzido por carragenina em camundongos albinos BALB/c;

Avaliar o efeito do extrato aquoso, frações e compostos identificados

no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na produção de citocinas

inflamatórias através do método de ELISA;

Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados no extrato

aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de edema de orelha

induzido por xilol em camundongos albinos BALB/c;

Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados no extrato

aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de bolsa de ar induzido

por zimosam em camundongos albinos Swiss;

Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados nos frutos

de Hancornia speciosa na cinética de migração celular total e diferencial em

diferentes intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas) partindo do modelo de bolsa

de ar induzido por zimosam em camundongos albinos Swiss.

35

4 JUSTIFICATIVA

A inflamação é uma resposta do sistema imune a diferentes estímulos

causados por agentes químicos, físicos ou biológicos e tem por função

erradicar os agentes microbianos ou irritantes, além de potencializar o reparo

tecidual (BAUTISTA, 2003). É mediada por eventos vasculares e celulares que

ocorrem graças à presença de diversos mediadores químicos inflamatórios. O

processo inflamatório termina quando o estímulo é eliminado e os mediadores

secretados são destruídos ou dispersos, além disso, nosso organismo possui

mecanismos anti-inflamatórios ativos que modulam a resposta e evitam que ela

seja exacerbada (GRUNDY, 2003). Porém, quando a inflamação não é

controlada e passa a ser excessiva é necessário o uso de substâncias que

possuam ação anti-inflamatória e atuam na recuperação da homeostasia

corpórea.

Para inibir ou controlar o processo inflamatório, medicamentos anti-

inflamatórios não esteroidais (AINEs) e anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) são

comumente utilizados. Entretanto, o uso prolongado ou abusivo de AINEs pode

causar sérios efeitos adversos, tais como complicações cardiovasculares e

gastrointestinais (SOSTRES et al., 2010), enquanto que os AIEs podem induzir

a redução da resistência à infecção, agravamento de úlceras estomacais e

osteoporose (WHITEHOUSE, 2011).

Tendo em vista que, em determinadas patologias ou condições clínicas

do paciente, os anti-inflamatórios não apresentam vantagens quanto ao

tratamento, uma vez que os efeitos adversos podem sobrepor o efeito

terapêutico se faz necessário à busca de novas alternativas terapêuticas para o

tratamento de desordens inflamatórias. As plantas medicinais são uma ótima

alternativa, uma vez que dispõem de um arsenal de moléculas bioativas que

podem ser usadas na terapia anti-inflamatória, além de que são encontradas

em abundância e representam uma fonte natural de fácil acesso a população

com um custo relativamente baixo (CALIXTO, 2005).

No nosso bioma, a Hancornia speciosa Gomes merece destaque,

conhecida popularmente como mangabeira, trata-se de uma planta frutífera

bastante utilizada na medicina popular para o controle de desordens

inflamatórias. Existem estudos que comprovem o efeito anti-inflamatório da

36

espécie, realizado por Marinho et al. (2011), utilizando o látex como

farmacógenos, porém nada existe descrito sobre o possível efeito biológico que

os frutos podem exercer. Assim, o estudo propõe, de modo inédito, comprovar

o uso popular dos frutos de Hancornia speciosa, identificando os principais

metabólitos secundários envolvidos no processo anti-inflamatório e dar suporte

a uma possível droga herbal que pode vir ser utilizado no tratamento de

desordens inflamatórias.

37

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Material vegetal

Os frutos maduros da Hanconia speciosa foram coletados na região de

Barra do Punaú (lat: -5,34527 long: -35,41666), cidade de Rio do Fogo, Rio

Grande do Norte, nordeste brasileiro em março de 2011. A coleta foi realizada

mediante autorização do Sistema de Autorização e Informação em

Biodiversidade (Sisbio) (número 35017) e Autorização de Acesso e de

Remessa de Componente do Patrimônio Genético (Processo 010844/2013-9).

A exsicata contendo folhas, flores e frutos de H. speciosa foi depositada no

Herbário Parque das Dunas do Centro de Biociências da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, Brasil, sob o número de registro UFRN 16880.

5.2 Preparação do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa

Os frutos da ‘mangabeira’ (500 g) foram cortados em pedaços

menores e submetidos à extração por decocção. O material vegetal foi deixado

em água fervente por 15 minutos, na proporção de 1: 10 (fruto : água m/v).

Após 15 minutos, o decocto foi filtrado utilizando um papel filtro Whatman N° 1.

Parte do decocto foi utilizado para as análises fitoquímicas e a outra parte foi

liofilizado para o fracionamento por meio de partição líquido-líquido e

experimentos in vivo e in vitro.

Para o processo de liofilização o decocto foi congelado a -80 °C e em

seguida submetido ao liofilizador da marca Liotop, modelo L 202.

5.3 Fracionamento do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa

O extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa (EA), 500 mL, foi

submetido a um fracionamento por meio de partição líquido-líquido utilizando

solventes de polaridades crescentes: diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila

38

(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH). A partir do fracionamento foram obtidas as

frações diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) (Figura

4). As frações foram secas em um evaporador rotatório e estocadas em

geladeira até o momento do uso. Para os experimentos in vivo as frações

foram ressuspendidas em PBS.

Figura 4 - Esquema representativo do processo de fracionamento por meio de partição

líquido-líquido do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa.


5.4 Análises fitoquímicas do extrato aquoso de Hancornia speciosa

5.4.1 Triagem fitoquímica

Para evidenciar as principais classes de substâncias químicas

presentes no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, o decocto foi submetido

a testes qualitativos que se baseiam em reações químicas que resultam na

formação de precipitados ou formas, desenvolvimento ou mudança de

coloração (MATOS, 2009; ZUCOLOTTO; VARGAS, 2010). Foram pesquisados

39

a presença de taninos, alcaloides, saponinas, compostos fenólicos e

flavonóides.

5.4.1.1 Pesquisa de Taninos – Reação de precipitação em

gelatina

Para a detecção de taninos 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.

speciosa foram colocados em um tubo de ensaio e sobre a amostra gotejada

uma solução aquosa de gelatina a 2,5%. A formação de precipitado reversível

ou irreversível confirma a presença de taninos no extrato (ZUCOLOTTO;

GIORDANI, 2013).

5.4.1.2 Pesquisa de Alcalóides – Reação de precipitação em

reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand

Para a detecção de alcalóides 2 ml do extrato aquoso dos frutos de H.

speciosa foram colocados em um béquer e adicionado 20 mL de ácido sulfúrico

(H2SO4) à 10%. A amostra foi aquecida e deixada sob fervura por 5 minutos,

em seguida filtrada. Em uma placa de vidro 2 gotas da amostra foi colocada em

contato com reagentes, entre eles: reagente de Dragendorff, Wagner, Mayer e

Bertrand. A formação de um precipitado amarelo-alaranjado (reagente de

Dragendorff) ou marrom escuro (reagente de Wagner) ou branco leitoso

(reagente de Mayer) ou branco amarelado (reagente de Bertrand) indica a

presença de alcalóides no extrato (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).

5.4.1.3 Pesquisa de Saponinas – Reação de formação de

espuma

Para a detecção de saponinas 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.

speciosa foram colocados em um tubo de ensaio grande e sobre a amostra

acrescentada 4 mL de água destilada. O tubo foi agitado verticalmente e

40

vigorosamente por 1 minuto. A formação de espuma persistente confirma a

presença de saponinas no extrato, porém o desaparecimento da espuma em

poucos instantes torna a amostra ausente (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).

5.4.1.4 Pesquisa de Compostos fenólicos – Reação com cloreto

férrico

Para detecção de compostos fenólicos 2 mL do extrato aquoso dos

frutos de H. speciosa foram colocados em um tubo de ensaio e sobre a

amostra adicionado 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. A

formação de coloração verde-escuro, violeta e azul positiva a amostra quanto a

presença de compostos fenólicos (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).

5.4.1.5 Pesquisa de Flavonóides – Reação de Cianidina ou

Shinoda

Para detecção de flavonóides 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.

speciosa foram colocados em uma cápsula de porcelana e levada ao banho-

maria a 50 °C para retirar toda água. Posteriormente foram adicionados 0,2 mL

de clorofórmio no resíduo da cápsula, em seguida o clorofórmio foi desprezado

e o resíduo da capsula redissolvido com 1 mL de etanol a 70%. A amostra foi

transferida para um tubo de ensaio e sobre ela adicionada, pelas paredes do

tudo, 1 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado e 200 mg de magnésio em pó.

A formação de coloração amarela a vermelho, ou vermelho a vermelho-sangue,

ou vermelho a violeta ou vermelho a rosa confirma a presença de flavonóides

no extrato (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).

5.4.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)

O extrato aquoso e frações foram analisados por Cromatografia em

camada delgada de fase normal usando as seguintes condições:

41

cromatoplacas de alumínio em gel de sílica com indicador de fluorescência (F-

254) (Macherey-Nagel ®) como adsorvente, e acetato de etila : ácido fórmico :

ácido acético : água (8,0 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v:v:v:v) como fase móvel. As

cromatoplacas foram secas e as manchas foram observadas na luz ultravioleta

(UV) no comprimento de onda de 254 e 365 nm. Em seguida as placas foram

reveladas com agentes cromogênicos: vanilina sulfúrica (vanilina 2 % e ácido

sulfúrico 10 % em etanol) seguida de aquecimento; cloreto férrico (5 % em

metanol) e reagente Natural A (1 % em metanol) com visualização na luz UV

365 nm. Os valores do fator de retenção (Rf), cor e comportamento das

manchas foram analisados e registrados para serem comparados com dados

da literatura (WAGNER; BLADT, 2001). Subsequentemente, co-cromatografias

em camada delgada (co-CCDs) foram realizadas utilizando diferentes padrões,

tais como: ácido clorogênico (Sigma 95%), ácido caféico (Sigma 98%), rutina

(Sigma 94%), quercetina (Sigma 95%), canferol (Sigma 97%), ácido elágico

(Sigma 95%), isoquercetina (Sigma 90%), vitexina (Fluka 98%). Após a

identificação dos possíveis metabolitos secundários, eles foram confirmados

qualitativamente por Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada arranjo

diodo (CLAE-DAD) e Cromatrografia líquida com arranjos diodos acoplados

espectrofotômetro de massa (CL-DAD-EM).

5.4.3 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao detector

de arranjo de diodo (CLAE- DAD)

As amostras do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e soluções

padrão de referência foram solubilizadas em metanol e água na proporção de

1:1, obtendo uma solução final na concentração de 5 mg/ml e 50 μg/mL,

respectivamente. Todas as amostras foram filtradas através de uma membrana

de 0,45 μm (MILEX®) e uma alíquota de 20 μL foi injetada para analise por

CLAE. A identificação dos principais compostos presentes no extrato aquoso

foi realizada por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando um

cromatógrafo Varian® equipado com bomba quaternária (ProStar-240), injetor

automático (ProStar-410) e detector de arranjo de diodos (DAD) (ProStar-335).

42

Todos os dados foram processados utilizando o software GalaxieTM

Chromatography. O método cromatográfico foi realizado utilizando uma coluna

de fase reversa (Phenomenex®) C18 (250 x 4.6 mm x 5μm). A fase móvel

composta de acetonitrila (A) e ácido acético 1% (B) foi usada com o seguinte

gradiente: 0-5 minutos 13: 87% (A) em (B), 5-25 minutos 18: 82% (A) em (B),

25-30 minutos 20: 80% (A) em (B) e 30-35 minutos 21: 79% (A) em (B), com

uma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto e comprimento de onda UV de 270 e 340

nm. Todos os solventes utilizados para análise foram filtrados em membranas

de 0,45 μm e desgaseificados por meio de ultrassom. Os picos foram

identificados por comparação com tempo de retenção (TR) dos padrões de

referência, com espectros de UV e por co-injeção (padrões de referência +

extrato aquoso). Os padrões de rutina e ácido clorogênico foram obtidos da

Sigma-Aldrich®, USA.

5.4.4 Cromatografia líquida acoplada com detector de arranjos de

diodo e ao espectrômetro de massas (CL-DAD-EM)

Análises de alta resolução por Cromatografia líquida acoplada com

detector de arranjo de diodo e ao espectrômetro de massa (CL-DAD-EM) foi

realizada em um aparelho Shimadzu LC-20AD, equipado com injetor

automático (SIL-20A, Shimadzu), um detector de diodos (SPD-M20AV,

Shimadzu) e acoplado a um micrOTOFII (Bruker Daltonics) ESI -qTOF

espectrômetro de massa. Baixa resolução aplicada no mesmo aparelho HPLC

acoplado a amaZon (Bruker Daltonics) ESI-ion trap espectrômetro de massa.

Para análise cromatográfica utilizou uma coluna cromatográfica

analítica de fase reversa (Phenomenex®) C18 (250 x 4.6 mm x 5μm). A fase

móvel composta de acetonitrila (A) e ácido acético 1% (B) foi usada com o

seguinte gradiente de eluição: 0-5 minutos 13:87% (A) em (B), 5-25 minutos

18:82% (A) em (B), 25-30 minutos 20: 80% (A) em (B) e 30-35 minutos 21: 79%

(A) em (B), com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto. O eluente da coluna foi

dividido na proporção de 7:3, o fluxo maior foi para o detector DAD e a inferior

para o espectrômetro de massa.

43

5.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato aquoso dos frutos

de Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico.

5.5.1 Animais de experimentação

Camundongos Swiss e BALB/c machos e fêmeas, com 6 a 8 semanas

de vida, pesando entre 25 a 35 gramas, provenientes do Biotério do Centro de

Ciências da Saúde (CSS) da UFRN, foram utilizados para os estudos. Os

animais foram mantidos, de 5-6 por gaiola, a uma temperatura de 22 + 2 °C,

em um ciclo claro/escuro (12:12 horas), com livre acesso a água e comida.

Cada grupo experimental era constituído de 5 animais (n= 5) e o grupo salina

(controle negativo) recebeu apenas solução salina estéril (0,9 mg/mL). O

protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em

Experimentação Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob o

protocolo Nº 008/2011 e está em conformidade com as diretrizes do Conselho

Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

5.5.2 Modelo de peritonite induzido por carragenina

A atividade biológica do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa,

bem como da rutina e ácido clorogênico foi avaliada através do modelo de

peritonite induzido por carragenina em camundongos albinos BALB/c. Os

animais foram divididos em grupos e tratados por via intravenosa (i.v.) com 100

μL de solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato aquoso (20, 30 ou 40 mg/kg),

rutina (2, 2,5, 5 mg/kg) e ácido clorogênico (2, 2,5, 5 mg/kg), enquanto que a

dexametasona na dose de 0,5 mg/kg, medicamento anti-inflamatório de

referência, foi aplicado via intraperitoneal (i.p.). Após 30 minutos, os animais

foram desafiados por via intraperitoneal com um 1 mL de solução de

carragenina (1 mg/mL) ou 1 mL de solução salina estéril (grupo Sal). O grupo

carragenina (controle positivo) foi tratado com solução salina estéril (i.v.) e foi

desafiado com a carragenina. Passadas 4 horas, os animais foram

eutanasiados por via intraperitoneal com overdose de xilazina e cetamina (10

44

mg/kg - 100 mg/kg), realizado o deslocamento cervical e o exsudato peritoneal

foi coletado, com 2 mL de solução salina estéril (0,9 mg/mL). As amostras

foram centrifugadas numa rotação de 1500 rpm por 10 minutos a 4° C. O

sobrenadante foi coletado para determinar os níveis de citocinas inflamatórias

IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α, estes foram estocados no freezer – 80°C até o

momento do uso, enquanto que o pellet celular foi utilizado para contagem total

de leucócitos. A contagem celular foi determinada em câmara de Neubauer,

diluindo a amostra na solução de Turk, para isso foram utilizados 10 µL do

pellet celular em 90 μL de solução de Turk. Os resultados foram expressos

como número total de leucócitos (106/mL) (CUNHA et al., 1989; MAGALHÃES

et al., 2011).

5.5.2.1 Dosagem de citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6, IL-12 e

TNF-α do lavado peritoneal

Os sobrenadantes dos exsudatos peritoneais coletados no modelo de

peritonite induzido por carragenina foram usados para mensurar os níveis de

IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α. As análises foram realizadas através do ensaio de

imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA), utilizado o kit Ebioscience (San

Diego, CA, USA). As placas foram previamente sensibilizadas com 4 mg/mL do

anticorpo de captura específico para cada uma das citocinas. Para isto, 50

μL/poço de anticorpo monoclonal de captura (1: 250 anticorpo/diluente) foi

adicionados as placas, posteriormente as placas foram incubadas overnight a 4

°C. No dia seguinte as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-0,05% de

Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionados 200

μL/poço da solução de bloqueio, as placas foram seladas e deixadas em

temperatura ambiente por 1 hora. A solução de bloqueio foi preparada diluindo

o diluente em água destilada (1:5). Após 1 hora as placas foram lavadas 5

vezes com PBS-0,05% de Tween 20, retirado o excesso de solução de

lavagem, adicionado 50 μL/poço da curva padrão e das amostras (ambos em

duplicata) e em seguida seladas e deixadas em temperatura ambiente por 2

horas. Para preparar a curva padrão, cada citocina recombinante foi preparada

45

na concentração de 500 pg/mL (2µL da citocina recombinante em 4 mL

diluente), essa concentração foi o segundo ponto da curva. Partindo da

primeira diluição foram realizadas diluições de base 2 para os demais pontos

(250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,81; 3,90; 1,95; 0,97 e 0,48 pg/mL). O primeiro

ponto da curva foi o branco e a ele foi adicionado 50 μL/poço de diluente. É

importante deixar as primeiras filas de cada placa (fila A e B) para a curva

padrão. Após 2 horas as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-0,05% de

Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionado o 4 mg/mL

do anticorpo secundário ou de detecção (biotinalado) para cada citocina. Para

isto, 50 μL/poço de anticorpo monoclonal de captura (1: 250) foi adicionados às

placas, posteriormente as placas foram seladas e incubadas a temperatura

ambiente por 1 hora. Após 1 horas as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-

0,05% de Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionado 4

mg/mL avidina conjugada a peroxidase. Para isto, 50 μL/poço avidina

conjugada a peroxidase (1: 250) foi adicionadas as placas, em seguida seladas

e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. Após os 30 minutos as

placas foram lavadas 7 vezes com PBS-0,05% de Tween 20, retirado o

excesso de solução de lavagem e adicionado 4 mg/mL do substrato

tetrametilbenzidina (TMB). Para isto, 50 μL/poço do substrato

tetrametilbenzidina (1: 250) foi adicionados as placas, depois foram seladas e

incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos e foi acompanhado o

aparecimento de cor. Por fim, foram adicionados 50 μL/poço de uma solução

H2SO4 a 1N e as placas lidas numa leitora de microplacas (Epoch Biotek) em

um comprimento de onda de 450 nm. Os valores das absorbâncias foram

convertidos em pg/mL utilizando uma equação polinomial gerada a partir da

curva padrão construída com diferentes concentrações de citocinas

recombinantes, através do software estatístico GraphPad versão 3.0.

5.5.3 Modelo de edema de orelha induzido por xilol

O efeito do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e compostos

rutina e ácido clorogênico na inflamação aguda tópica em camundongos

albinos BALB/c foi avaliada de acordo com procedimentos previamente

46

descritos por Parveen et al. (2007). Os animais foram tratados por via

intraperitoneal com 100 µL de solução salina estéril (0,9 mg/mL),

dexametasona (0,5 mg/kg), extrato aquoso (40, 50 ou 60 mg/kg), rutina (2,5, 5

ou 10 mg/kg) ou ácido clorogênico (10, 12,5 ou 15 mg/kg). Após 30 minutos do

tratamento, o edema de orelha foi induzido com 20 µL de xilol na superfície

anterior e 20 µL de xilol na superfície posterior da orelha direita. A orelha

esquerda foi usada como controle e aplicada apenas solução salina estéril (0,9

mg/mL). Após 15 minutos da aplicação do xilol, os animais foram eutanasiados

com overdose de xilazina e cetamina (10mg/kg – 100 mg/kg), realizado o

descolamento cervical e ambas orelhas cortadas com secções de 7 mm

usando punch de biopsia, em seguida pesadas. A resposta edematogênica foi

mensurada através da diferença entre o peso da orelha direita e esquerda e o

nível de inibição (em percentagem) foi calculado de acordo com a seguinte

equação.

Inibição de edema (%) = 1 – [ Mdt – Met ] / [ nMdt – nMet] x 100, sendo

- Mdt: Média aritmética do peso das orelhas direitas dos animais tratados com

dexametasona ou extrato aquoso ou rutina ou ácido clorogênico.

- Met: Média aritmética do peso das orelhas esquerdas dos animais tratados

com dexametasona ou extrato aquoso ou rutina ou ácido clorogênico.

- nMdt: Média aritmética do peso das orelhas direitas dos animais não tratados.

- nMet: Média aritmética do peso das orelhas esquerdas dos animais não

tratados.

5.5.4 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam

O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e compostos rutina e ácido

clorogênico foram avaliados em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam

https://www.google.com.br/search?biw=1252&bih=581&q=punch+de+biopsia&spell=1&sa=X&ei=2BYzVbfoPIqVNv6sgPAL&ved=0CBkQvwUoAA

47

em camundongos albinos Swiss. Todos os grupos receberam 5 mL de ar estéril

no dorso pela via subcutânea, para a formação da bolsa, após 3 dias 2,5 mL de

ar estéril foi injetado no mesmo local para reforço da bolsa de ar. O ar estéril foi

coleta no fluxo laminar em condições assépticas. Seis dias após a formação da

bolsa inicial, os animais foram tratados por via intraperitoneal com 100 µL de

solução salina estéril (0,9 mg/mL), dexametasona (2,0 mg/kg), extrato aquoso

(40, 50 ou 60 mg/kg), rutina (2,5, 5 ou 10 mg/kg) ou ácido clorogênico (10, 12,5

ou 15 mg/kg). Após 30 minutos uma solução de zimosam (1 mg/mL) foi injetada

dentro da bolsa de ar. O grupo zimosam foi tratado com solução salina estéril

(i.v.) e foi desafiado com a zimosam. Passadas 6 horas, os animais foram

eutanasiados por via intraperitoneal com overdose de xilazina e cetamina (10

mg/kg - 100 mg/kg), realizado o deslocamento cervical e o exsudato da bolsa

foi coletado, por aspiração, com 2 mL de solução salina estéril (0,9 mg/mL). As

amostras foram centrifugadas numa rotação de 1500 rpm por 10 minutos a 4°

C. O pellet celular foi utilizado para contagem total de leucócitos utilizando

câmara de Neubauer, diluindo a amostra na solução de Turk. Para isso foram

utilizados 10 µL do pellet celular em 90 μL de solução de Turk (Vigil et al.,

2008; Yoon et al., 2005). Os resultados foram expressos como número total de

leucócitos (106/mL).

5.5.4.1 Cinética de migração leucocitária total e diferencial a

partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam

Para realizar o experimento de cinética de migração leucocitária total e

diferencial, a dose de 50mg/kg do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, 2,5

mg/kg de rutina e 10mg/kg do ácido clorogênico foram escolhidas. Os animais

foram tratados conforme descrito (metodologia 5.5.4) e o exsudato da bolsa de

ar colhido em diferentes intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas) após o desafio

com zimosam. O pellet celular foi utilizado tanto para contagem total de

leucócitos como para a contagem diferencial. Para contagem diferencial, a

amostra foi diluída em 500 μL de PBS, em seguida as lâminas foram

preparadas por citocentrifugação a partir de uma alíquota (20 μL) do pellet

48

celular e coradas com corante panótico rápido (LaborClin; Brasil). As análises

das lâminas foram realizadas em microscópio óptico através da objetiva de

imersão em óleo (aumento de 100x) e foram contadas 100 células

diferenciando-as em subpopulações celulares: mononucleares e

polimorfonucleares (SILVA, 2011).

5.6 Análise estatística

Os dados foram expressos com médias + devios padrão. As análises

estatiticas foram realizadas por Anova seguidas por teste de Tukey utilizando o

software estatístico GraphPad Prism® versão 5.00, onde os níveis de

significância foram estabelecidos como *** ou ###p<0,001,** ou ##p<0,01 e * ou

#p<0,05. Para análises de regressão linear foi utilizado o software estatístico

GraphPad versão 3.00.

49

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Análise Fitoquímica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia

speciosa

6.1.1 Triagem fitoquímica e Cromatografia em camada delgada

(CCD)

Na triagem fitoquímica foi revelado à presença de taninos, alcalóides,

saponinas, flavonóides e ácidos fenólicos nos frutos de H. speciosa. A Tabela 3

apresenta as principais classes de metabólitos secundários encontrados com

seus respectivos métodos químicos.

Tabela 3 - Principais metabólitos encontrados no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa e seus respectivos métodos químicos de identificação.

Metabólitos

secundários

Métodos Químicos Hancornia

speciosa

Taninos Reação de precipitação em gelatina Positivo

Alcalóides

Reação de precipitação em reagente

de Dragendorff, Mayer, Wagner e

Bertrand

Positivo

Saponinas Reação de formação de espuma Positivo

Compostos

fenólicos

Reação com cloreto férrico Positivo

Flavonóides Reação de Cianidina ou Shinoda Positivo

O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa foi submetido a um

fracionamento por meio de partição líquido-líquido, utilizando solventes de

polaridade crescente: diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol

(FR3). As frações foram submetidas evaporador rotativo sob pressão reduzida

para retirar os solventes. Com as frações foram realizadas as análises

fitoquímicas e avaliação da atividade biológica.

Na tentativa de identificar os possíveis metabolitos sugeridos pelos

métodos químicos, o extrato aquoso e frações diclorometano, acetato de etila e

n-butanol foram submetidas à análise por Cromatografia em camada delgada.

50

A análise por Cromatografia em camada delgada foi realizada

utilizando diferentes reagentes reveladores, entres eles: vanilina sulfúrica

(vanilina 2% e ácido sulfúrico 10 % em etanol) seguida de aquecimento; cloreto

férrico (5 % em metanol) e reagente Natural A (1 % em metanol) com

visualização na luz UV 365 nm.

Quando a cromatoplaca foi revelada com vanilina sulfúrica após o

aquecimento, reagente universal de compostos orgânicos, foi possível

identificar no extrato aquoso três bandas de cor amarela cada uma com o fator

de renteção (Rf) de 0,08, 0,16 e 0,36, e uma banda de cor cinza com Rf de

0,68. As frações AcOEt e n-BuOH apresentaram o mesmo comportamento de

manchas, coloração e fator de retenção (Figura 5A). Outra cromatoplaca foi

revelada com cloreto férrico, reagente específico para compostos fenólicos, e

observou-se o desenvolvimento de 2 bandas de cor amarela no extrato aquoso

com Rf de 0,16 e 0,22, as mesmas bandas foram observadas nas frações

AcOEt e n-BuOH. A fração AcOEt também apresentou duas bandas de cor

cinza com Rf de 0,36 e 0,46 (Figura 5B). Estes resultados sugerem que as

bandas amarela correspondem principalmente a flavonoides e as manchas

cinza a ácidos fenólicos. Para confirmar a presença destes compostos, uma

cromatoplaca foi revelada com Reagente Natural A (Figura 5C), reagente

específico para identificação de flavonóides. Foi possível detectar no extrato

aquoso a presença de uma banda laranja (Rf= 0,16) e uma azul fluorescente

(Rf=0,36), quando observada a cromatoplacas no UV em 365 nm (figura 5D).

Estes resultados caracterizam a possível presença de flavonoides e ácidos

fenólicos (Wagner and Bladt, 1996).

Subsequentemente, uma co-cromatografia em camada delgada (co-

CCDs) foi realizada no intuito de identificar o possível flavonóide e o ácido

fenólico identificados no extrato aquoso através das CCDs. Para isso,

diferentes padrões disponíveis no laboratório foram testados juntamente com o

extrato e frações, tais como: ácido clorogênico, ácido caféico, rutina,

quercetina, canferol, ácido elágico isoquercetina, vitexina, luteolina, iso-

orientina e orientina. Através da comparação de amostras comerciais de rutina

e ácido clorogênico com o extrato aquoso e frações, é possível que a banda de

cor laranja seja rutina (Rf= 0,16) e a banda de cor azul fluorescente, quando

observada na luz UV 365 nm seja ácido clorogênico (Rf= 0,36). A similaridade

51

nos Rf, o mesmo comportamento de mancha e coloração sugere que no

extrato aquoso é possível existir a presença de rutina e ácido clorogênico

(Figura 6). Para confirmar a presença uma análise qualitativa utilizando

cromatografia liquida de alta eficiência acoplada tanto ao arranjo diodo, como

ao espectrofotômetro de massa foi realizada.

Figura 5 - Cromatogramas obtidos por Cromatografia em Camada Delgada do extrato

aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa

Fase móvel: acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água (8:0,5:0,5:0,5, v/v/v/v).

Adsorvente: cromatoplacas em gel de sílica F254. Amostras: Extrato aquoso (EA), fração

diclorometano (CH2Cl2), fração acetato de etila (AcOEt) e fração n-butanol (BuOH) Detecção:

(A) Vanilina sulfúrica com aquecimento, (B) Cloreto férrico, (C) Reagente Natural A e (D)

Reagente Natural A sob luz UV 365 nm.

Fonte: Dados obtidos e analisados

A B

C D

EA EA

EA EA

CH2Cl2 CH2Cl2

CH2Cl2 CH2Cl2 AcOEt

AcOEt AcOEt

AcOEt Bu-OH Bu-OH

Bu-OH Bu-OH

52

Figura 6 - Cromatogramas obtidos por co-Cromatografia em Camada Delgada do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa com

padrões

Fase móvel: acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água (8:0,5:0,5:0,5, v/v/v/v). Adsorvente: cromatoplacas em gel de sílica F254. Amostras: rutina (Rt),

ácido clorogênico (AC),extrato aquoso (EA), extrato aquoso e rutina (EA+Rt), extrato aquoso e ácido clorogênico (EA+AC), fração CH2Cl2 (FR1), fração

CH2Cl2 e rutina (FR1+Rt), fração CH2Cl2 e ácido clorogênico (FR1+AC), fração AcOEt (FR2), fração AcOEt e rutina (FR2+Rt), fração AcOEt e ácido

clorogênico (FR2+AC), fração BuOH (FR3), fração BuOH e rutina (FR3+Rt) e fração BuOH e ácido clorogênico (FR3+AC). Detecção: (A) Reagente Natural A

e (B) Reagente Natural A sob luz UV 365 nm.


Rt AC EA EA+Rt EA+AC FR1 FR1+Rt FR1+AC FR2 FR2+Rt FR2+AC FR3 FR3+Rt FR3+AC

Rt AC EA EA+Rt EA+AC FR1 FR1+Rt FR1+AC FR2 FR2+Rt FR2+AC FR3 FR3+Rt FR3+AC

A

B

53

6.1.2 CLAE-DAD e LC-DAD-EM confirmam a presença de rutina e

ácido clorogênico no extrato aquoso dos frutos Hancornia speciosa

A análise qualitativa do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa por

CLAE mostrou a presença de três picos majoritários em 340 nm, nomeado pico

1 com tempo de retenção (RT) de 7,9 minutos, pico 2 com 25,5 minutos e pico

3 com 28,5 minutos (Figura 7). Para confirmar a presença de rutina e ácido

clorogênico observada por CCD, as soluções padrões dos compostos foram

analisados por CLAE-DAD e mostrou tempo de retenção de 7,9 e 25,5,

minutos. Os picos 1 e 2 apresentaram tempo de retenção similar ao ácido

clorogênico e rutina (RT= 7,91 e RT= 25,5, respectivamente). Além disso, foi

realizado a análise do espectro UV dos picos 1 e 2 que apresentaram absorção

máxima de 222 e 326 nm (pico 1) e 257 e 353 nm (pico 2) similar ao espectro

do ácido clorogênico e rutina (MABRY, 1970). Análise de co-injeção dos

padrões + extrato aquoso foi observado um aumento na área do pico,

provavelmente referente a presença destes compostos no extrato aquoso dos

frutos de H. speciosa. O pico 3 não foi identificado, mas pelo espectro UV é

possível sugerir a presença de um ácido fenólico (223 e 332 nm).

A análise LC-DAD-EM foi realizada no intuito de determinar a massa

molar dos flavonoides e ácidos fenólico que estavam sendo investigados, além

de confirmar as identificações sugeridas pelo CLAE-DAD. Para isto, modos de

íon positivo e negativo foram usados na análise por espectrometria de massas

com ionização “electrospray” (ESI-MS), onde os espectros dos compostos

obtidos ESI-MS foram comparados com a base de dados MassBank

(http://www.massbank.jp).

O pico 1 mostrou tempo de retenção de 7,9 minutos, absorção máxima

no UV de 222 e 326 nm e relação massa carga (m/z)(int.) [M+H]+ m/z de

355,1035. A molécula foi identificada como ácido clorogênico, comparando com

a molécula protonada (calculou 355.1029, error 1,6 ppm). Além disso, a

molécula protonada apresentou íons padrão de fragmentação [M+H-

192]+ de m/z 163, ao qual foi atribuído a uma perda da porção do ácido quínico.

O pico 2 mostrou tempo de retenção de 25,5 minutos, absorção

máxima no UV de 257 e 353 nm e relação massa carga (m/z)(int.)

[M+H]+ m/z de 611,160 (molécula protonada) e fragmentos de 465 e 303. A

http://www.massbank.jp/

54

molécula foi identificada como rutina e a massa exata foi calculada como

611,1607, (massa teórica exata: 611,1612, error 0,8 ppm). O fragmento

apresentou um íon [M+H-146]+ de m/z 465, a qual foi atribuído a perda da

porção da ramnose e aglicona protonada [M+H-146-162]+, com a perda de

308u correspondendo a ramnose (146 u) e uma porção da glicose (162 u).

Figura 7 - Cromatograma obtido por CLAE do extrato aquoso dos frutos de Hancornia

speciosa e seus respectivos espectros de UV gerados pelo detector DAD.

A análise por CLAE acoplado arranjo de diodo (CLAE-DAD) do extrato aquoso dos frutos de

Hancornia speciosa mostrou a presença de três picos principais, sendo o pico 1 representando

pelo ácido clorogênico com tempo de retenção de 7,9 minutos (absorção de 222 a 326 nm),

pico 2 a rutina com tempo de retenção de 25,5 minutos (absorção de 257 a 353 nm) e de pico 3

um compostos fenólico não identificado com tempo de retenção de 28,5 minutos (absorção de

223 a 332 nm). A taxa de fluxo foi mantida constante a 1,0 ml/min, e os cromatogramas foram

analisados a 340 nm.


A rutina é um flavonóide pertencente à subclasse dos flavonóis que

apresenta em sua estrutura um dissacarídeo (raminose + glicose) ligados a

posição 3 do anel pirano (Figura 8A) (PEDRIALI, 2005). Já o ácido clorogênico,

um ácido fenólico, formado pela esterificação do ácido caféico com ácido

55

quínico (Figura 8B) (ZHANG et al., 2010). Além do extrato aquoso dos frutos

possuir rutina e ácido clorogênico, o extrato etanólico e fração acetato de etila

das cascas apresentaram ácido clorogênico em sua constituição química

(COSTA et al., 2008; ANDRADE et al., 2002; HONDA, 2000) e nas cascas a

função hipotensora foi atribuída principalmente a presença de rutina presente

no extrato etanólico (FERREIRA, et al., 2007a; 2007b). Dentre os flavonóides e

ácidos fenólicos estudados, a rutina e o ácido clorogênico têm se destacado

em função das suas diversas atividades farmacológicas. Ambos possuem

atividade antioxidante, anti-inflamatória, hepatoprotetora e anticarcinogênica

(LIMA et al., 2014; XU et al., 2010; ZHANG et al., 2010).

Figura 8 - Estrutura química da rutina (A) e do ácido clorogênico (B)

Fonte: ChemSketch 10.0

6.2 Efeito do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa,

rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzido por

carragenina

A atividade bilógica do extrato aquoso e frações dos frutos de H.

speciosa, bem como da rutina e ácido clorogênico, foram avaliados através do

A

B

56

modelo de peritonite induzido por carragenina, onde foram analisados a

migração total de leucócitos e produção de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α.

No trabalho foi possível observar que os animais que foram tratados

por via intravenosa (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), trinta minutos

depois desafiados com carragenina intraperitoneal (i.p) exibiu uma severa

migração leucócitária para cavidade peritoneal, bem como aumentou a níveis

de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α. Porém todos os grupos que foram

tratados (i.v) com diferentes doses (20, 30 ou 40 mg/kg) do extrato aquoso dos

frutos de H. speciosa (Figura 9) mostraram redução da migração leucocitária

para cavidade intraperitoneal, como também foram capazes de reduzir os

níveis das citocinas IL-1β (Figura 10A), IL-6 (Figura 10B), IL-12 (Figura 10C) e

TNF-α (Figura 10D), quando comparado com o grupo que recebeu solução

salina estéril (i.v.) e carragenina (i.p.).

O extrato aquoso (EA), na dose de 40 mg/kg, foi administrado como

controle por via intravenosa (sem os animais receberem inflamação por

carragenina). Observou-se que o extrato apresentou efeito antimigratório para

cavidade peritôneal, tendo um resultado diferente estatisticamente ao grupo

que foi desafiado com carragenina, demonstrando que o extrato não tem a

capacidade de induzir infamação. A dexametasona (0,5 mg/kg), medicamento

anti-inflamatório de referência, foi utilizada como grupo controle e foi capaz de

reduzir tanto a migração leucocitária para cavidade peritoneal como a produção

de citocinas inflamatórias induzida pela carragenina.

57

Figura 9 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na migração

leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido por carragenina

Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato

aquoso (20, 30 e 40 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois

foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Um grupo

recebeu apenas o extrato aquoso (EA) na dose de 40 mg/kg. Após 4 horas o exsudato

peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem

total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna representa a

média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da

média (EPM). ###

p<0,001 e ##

p<0,01 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);

***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,

dexametasona (0,5 mg/kg), EA, extrato aquoso (40 mg/kg).


58

Figura 10 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre a produção

de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de

camundongos submetidos à peritonite induzido por carragenina

Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato

aquoso (20, 30 e 40 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois

foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o

exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o

sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α

(D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa

a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da

média (EPM). ###

p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001

comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex, dexametasona (0,5

mg/kg).


59

Posteriormente cada fração foi administrada por via intravenosa (i.v.)

na dose de 20 mg/kg (Figura 11) trinta minutos antes da administração da

carragenina. Os resultados demonstram que as três frações apresentaram

efeitos semelhantes na inibição da migração leucocitária, bem como foram

capazes de inibir a produção de citocinas IL-1β (Figura 12A), IL-6 (Figura 12B),

IL-12 (Figura 12C) e TNF-α (Figura 12D).

Figura 11 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-

butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa na migração leucocitária a partir do modelo de

peritonite induzido por carragenina

Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), frações

diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) na dose de 20 mg/kg ou

dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi administrado (i.p.) 1 mL de

carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o exsudato peritoneal foi

coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de

células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna representa a média dos

valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###

p<0,001, ##

p<0,01 e #p<0,05 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);


dexametasona (0,5 mg/kg).


60

Figura 12 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-

butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6

(B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à


Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), frações

diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) na dose de 20 mg/kg ou

dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi administrado (i.p.) 1 mL de

carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o exsudato peritoneal foi

coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o sobrenadante foi

quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) utilizando o

ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa a média dos

valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###

p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com

o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex, dexametasona (0,5 mg/kg).


61

O passo seguinte foi avaliar o efeito da rutina e do ácido clorogênico

identificados por Cromatografia líquida de alta eficiência (DAD e DAD-EM),

ambos obtidos da Sigma. Observou-se que os grupos tratados com rutina

(Figura 13) e ácido clorogênico (Figura 15) por via intravenosa, nas doses de 2,

2,5 e 5 mg/kg exibiram uma inibição tanto na migração de células leucocitárias

como na produção de citocinas IL-1β (Figura 14A), IL-6 (Figura 14B), IL-12

(Figura 14C) e TNF-α (Figura 14D) para a rutina e IL-1β (Figura 16A), IL-6

(Figura 16B), IL-12 (Figura 16C) e TNF-α (Figura 16D) para o ácido

clorogênico.

Figura 13 - Efeito da rutina na migração leucocitária a partir do modelo de peritonite

induzido por carragenina

Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), rutina (2,

2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi

administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o

exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a

contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna

representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro

padrão da média (EPM). ###

p<0,001, ##

p<0,01 e #p<0,05 comparando com o grupo solução

salina estéril (Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina

estéril; Dex, dexametasona (0,5 mg/kg).


62

Figura 14 - Efeito da rutina sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e

TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à peritonite

induzido por carragenina

Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), rutina (2,

2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi

administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o

exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o

sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α

(D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa

a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da

média (EPM). ###

p<0,001 e ##





63

Figura 15 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir do modelo de


Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), ácido

clorogênico (2, 2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos

depois foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4,

o exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada

a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna



p<0,001 e ##

p<0,01 comparando com o grupo solução salina estéril

(Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,



64

Figura 16 - Efeito do ácido clorogênico sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B),

IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à


Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), ácido

clorogênico (2, 2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos

depois foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4

horas o exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado.

Com o sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e

TNF-α (D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna







65

A carragenina é um polissacarídeo de origem marinha que induz um

processo inflamatório agudo caracterizado por uma intensa liberação de

mediadores inflamatórios. Trata-se de um agente inflamatório que atua de

maneira trifásica. Na primeira fase (0 a 1,5 hora) ocorre a liberação de

histamina e serotonina, enquanto que na segunda fase (1,5 a 2,5 horas) ocorre

a liberação de cininas, o sinergismo destes mediadores induz um rápido

aumento da permeabilidade vascular seguido da formação de edema. Na

terceira fase (2,5 a 6 horas) ocorre a produção de prostaglandinas que são

responsáveis em manter a permeabilidade vascular e o edema formado

(HARADA et al., 1998; VINEGAR et al., 1969).

O aumento da permeabilidade vascular e produção de mediadores

inflamatórios resultam em um aumento gradual do extravasamento de líquido e

do número células leucocitárias que migram para cavidade peritoneal,

principalmente neutrófilos, que são capazes de produzir citocinas, associadas

com a imunopatologia da inflamação (SYAM et al., 2014), sendo as principais

as interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral α

(TNF- α) (AKIRA et al., 1990). Estas citocinas são responsáveis em modular a

resposta inflamatória, e quando produzidas em excesso podem induzir uma

instabilidade hemodinâmica ou distúrbios metabólicos, contribuindo com lesões

em órgão-alvo, podendo levar à insuficiência de múltiplos órgãos ou até mesmo

morte (LARCHE et al., 2006; ZHANG; JIANXIONG, 2007). Outra citocina que

merece atenção é a IL-12 que atua como imunoestimuladora de células NK

(GAZZINELLI et al., 1993).

A IL-1β é uma citocina produzida principalmente por monócitos e

macrófagos, induz inflamação sistêmica através da ativação da cicloxigenase-2

(COX-2) com a formação de prostaglandinas E2. Tem como atividades

biológicas primordiais a estimulação de células CD4 a secretar IL-2 e produzir

receptores para a IL-2, proliferar e ativar linfócitos B, neutrófilos,

monócitos/macrófagos, aumentando as atividades quimiotáticas e fagocitárias,

facilitando o processo de diapedese (DINARELLO, 1989). O TNF-α produzido

principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos-T, é um dos mediadores

mais potentes e precoces da resposta inflamatória. Juntos, a IL-1β e o TNF-α,

ativam IL-6 a síntese e liberação de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos

durante estímulos dolorosos, como trauma, infecção e queimadura. Já a IL-12

66

desempenha um papel importante porque ativa as células NK e favorece a

diferenciação dos linfócitos T CD4 em TH1 (ações inflamatórias) durante a

resposta imunidade adaptativa (OLIVEIRA et al., 2011).

Nosso estudo demonstrou que o extrato aquoso e frações dos frutos de

H. speciosa, bem como rutina e ácido clorogênico exerceram efeito anti-

inflamatório em todas as doses testadas, sendo capazes de inibir a migração

leucocitária para cavidade peritoneal (Tabela 4), como a produção de citocinas

(IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) em modelo de peritonite induzido por carragenina

em camundongos. Os resultados apresentados nessa dissertação corroboram

com o estudo realizado por Marinho et al. (2011), em que foi possível observar

que o látex de Hancornia speciosa exerceu efeito anti-inflamatório por ter a

capacidade de inibir a formação de edema de pata induzido por carragenina,

histamina, serotonina e bradicinina, como também inibir a migração leucocitária

para bolsa de ar quando induzida por carragenina, além de inibir as enzimas

iNOS e COX-2, bem como as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α,

moléculas chaves para o desenvolvimento da resposta inflamatória. Estes

dados comprovam que os frutos e o látex podem ser uma alternativa natural

para o tratamento de desordens inflamatórias.

No que diz respeito ao mecanismo anti-inflamatório do extrato aquoso

dos frutos de H. speciosa ainda não foi elucidado. Entretanto existem algumas

hipóteses que podem ser sugeridas. Considerando que no momento da injúria

ocorre uma contração de células e extravasamento de exsudato. Estes eventos

vasculares induzem a ativação de mediadores inflamatórios, seguido por um

recrutamento e adesão de leucócitos, principalmente neutrófilos, para o local

da inflamação. Esse mecanismo é regulado por moléculas de adesão

endoteliais e citocinas inflamatórias (HOPKINS, 2003; SCHMID-SCHÖNBEIN,

2006). É provável que o extrato aquoso ou moléculas bioativas atuem inibindo

os mediadores envolvidos na inflamação induzida por carragenina, como por

exemplo, histamina, serotonina, cininas e prostaglandinas que estão

intimamente relacionados com a vasodilatação e formação de exsudato

peritoneal e/ou inibindo receptores (integrinas) presentes nos leucócitos que se

ligam as moléculas de adesão intercelulares (ICAMs) que são expressas pelas

células endoteliais ativadas, impedindo que os leucócitos rolem com firmeza ao

longo da superfície do endotélio, e ocorra o processo de transmigração

67

(passagem dos leucócitos do vaso para o interstício). A não expressão de

ICAMs demonstrou uma redução significativa do rolamento de leucócitos,

afetando consequentemente sua entrada no local da inflamação (LEHMANN et

al., 2003). Consequentemente, se esses mediadores e eventos inflamatórios

são bloqueados ou interrompidos, a produção de citocinas inflamatórias

também será comprometida.

Tabela 4 – Percentagem de inibição do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia

speciosa, bem como rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzida por

carragenina

Grupos (tratamento i.v.)

Dose (mg/kg)

Migração celular (106/mL)

Inibição (%)

salina

dexametasona

----

0,5

23,70 + 0,751

7,500 + 0,570***

68,35

extrato aquoso 20 10,40 + 1,030*** 56,11

extrato aquoso 30 3,800 + 0,700*** 83,96

extrato aquoso 40 6,120 + 0,171*** 74,17

fração CH2Cl2 20 7,000 + 0,7583*** 70,46

fração AcOEt 20 5,400 + 1,259*** 77,21

fração n-BuOH 20 5,100 + 0,6782*** 78,48

rutina 2 7,000 + 2,133*** 70,46

rutina 2,5 11,10 + 1,470*** 53,16

rutina 5 9,000 + 0,689*** 62,02

ácido clorogênico 2 12,60 + 2,790*** 46,83

ácido clorogênico

ácido clorogênico

2,5

5

11,70 + 2,113***

8,100 + 1,251***

50,63

65,82

Valores são médias ± desvios padrão (D.P.), n = 5, ***p<0,001, grupos testados comparados com grupos salina. Fonte: Dados obtidos e analisados

68


ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol

O efeito do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido

clorogênico na formação do edema foram avaliados usando o modelo de

edema de orelha induzido por xilol. Observou-se que os grupos tratados via

intraperitoneal com as doses 40, 50 e 60 mg/kg de extrato aquoso apontaram

uma supressão na formação do edema induzido por xilol com um percentual de

inibição de 78,36, 81,07, 73,18%, respectivamente. Quando apenas o extrato

aquoso na dose de 60mg/kg foi administrado intraperitonealmente, foi

observado que o extrato aquoso não foi capaz de induzir a formação do edema

pela via intraperitoneal.

Seguindo o estudo, os grupos tratados com rutina pela via

intraperitoneal nas doses de 2,5, 5 e 10 mg/kg foram capazes de reduzir a

formação do edema em 76,94, 83,29 e 97,78%, respectivamente. Enquanto

que os grupos tratados com ácido clorogênico (i.p.) nas de doses de 10, 12,5 e

15mg/kg, mostraram uma redução no edema de 85,82, 83,17 e 79,84,

respectivamente. Todos os grupos foram estatisticamente significativos na

redução do edema, comprovando que o extrato aquoso e seus compostos

identificados foram eficazes na atividade anti-edematogênica, quando

comparados com o grupo que recebeu solução salina estéril (i.p.) como

tratamento. A dexametasona foi utilizada como grupo controle e observou-se

que os grupos tratados com extrato aquoso, rutina e ácido clorogênico

apresentaram um percentual de inibição bastante semelhante ao medicamento

já disponível no mercado (79,66%). A tabela 5 mostra o efeito anti-

edematogênico do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido

clorogênico no modelo de edema de orelha induzido por xilol.

69

Tabela 5 - Atividade anti-edematogênica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia

speciosa, rutina e ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol

Grupos Dose (mg/kg)

Diferença (mg)

Inibição (%)

salina

dexametasona

----

0,5

32,450 + 2,603

6,600 ± 2,448***

79,66

extrato aquoso 40 7,020 + 3,820*** 78,36

extrato aquoso 50 6,140 ± 2,385*** 81,07

extrato aquoso 60 8,700 ± 2,719*** 73,18

rutina 2,5 7,480 ± 2,221*** 76,94

rutina 5 5,420 ± 2,328*** 83,29

rutina 10 0,720 ± 1,253*** 97,78

ácido clorogênico 10 4,600 ± 2,795*** 85,82

ácido clorogênico

ácido clorogênico

12,5

15

5,460 ± 2,579***

6,540 ± 3,917***

83,17

79,84

Valores são médias ± desvios padrão (D.P.), n = 5, ***p<0,001, grupos testados comparados com grupos salina. Fonte: Dados obtidos e analisados

O edema de orelha foi usado como modelo primário da inflamação

aguda, e o xilol foi usado como agente flogístico. O xilol é uma substância

irritante que aumenta a permeabilidade vascular induzindo a formação do

edema, um dos sinais cardinais da inflamação. O processo de inflamação inicia

com a ativação de mediadores inflamatórios originados de neurônios

sensoriais, tais como serotonina, acetilcolina, histamina, bradicinina e

prostaglandinas. Estes mediadores inflamatórios induzem a liberação de

neuropeptídios, pela excitação dos neurônios, que ativam receptores,

causando a inflamação neurogênica (BANKI et al., 2014; RICHARDSON;

VASKO, 2002). Neurônios sensoriais são sensíveis a algumas substâncias

químicas, como a capsaicina, responsável pela despolarização e liberação

direta de mediadores e liberação de neuropeptídios, em especial a substância

P, um potente vasodilatador que atua na liberação de óxido nítrico nas células

endoteliais, o qual causa vasodilatação e extravasamento do plasma, induzindo

a formação do edema (BARRY et al., 2011; HOLZER, 1988). Os resultados

mostram claramente uma porcentagem de inibição acima de 73% em todos os

grupos testados, demonstrando que o extrato aquoso dos frutos de H.

70

speciosa, rutina e ácido clorogênico apresentaram um efeito antiflogístico

bastante promissor. Sobre o mecanismo de ação, ainda não foi estabelecido,

porém é provável que o extrato aquoso ou moléculas bioativas revelem um

efeito estabilizador de membrana reduzindo a vasodilatação, uma vez que já é

descrito na literatura que a rutina promove resistência e integridade nas

paredes dos vasos (Pathak et al., 1991). Outra possibilidade está relacionada

com a inibição dos mediadores inflamatórios que ativam os receptores que

causam a inflamação neurogênica ou bloqueio dos próprios receptores que

estão envolvidos com este processo inflamatório.


ácido clorogênico em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam

Outro modelo escolhido para avaliar a ação anti-inflamatória do extrato

aquoso dos frutos de H. speciosa e os compostos rutina e ácido clorogênico foi

o de bolsa de ar no dorso de camundongos utilizando o zimosam como

inflamógeno. Neste modelo, após os animais receberem a injeção subcutânea

(s.c.) de zimosam na bolsa de ar, ocorre à indução de uma resposta

inflamatória aguda, caracterizada pela migração de leucocitos e exsudação de

plasma para cavidade (bolsa de ar). Camundongos Swiss tratados por via

intraperitoneal (i.p.) com solução salina estéril e trinta minutos depois

desafiados com zimosam (s.c) apresentaram uma intensa migração leucocitária

para bolsa de ar. Entretanto, todos os grupos tratados por via intraperitoneal

com diferentes doses (40, 50 ou 60 mg/kg) do extrato aquoso mostraram uma

inibição significativa da migração leucocitária, quando comparados com o

grupo que recebeu apenas solução salina estéril (i.p) e zimosam (s.c.). Quando

apenas o extrato aquoso (50 mg/kg) foi administrado intraperitoneal, foi

observado uma migração celular para cavidade dorsal semelhante ao grupo

salina (Figura 17).

71

Figura 17 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na migração

leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), extrato

aquoso na dose de 40, 50 e 60 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois

zimosam (1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. Um

grupo (EA) recebeu apenas extrato aquoso na dose de 50 mg/kg. Depois de 6 horas o

exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e

realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada

coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam

o erro padrão da média (EPM). ###

p<0,001 e ##

p<0,01 comparando com o grupo solução salina

estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril; Dex,

dexametasona (2,0 mg/kg), EA, extrato aquoso (50 mg/kg).


Após avaliar o efeito dose-efeito do extrato aquoso no modelo de bolsa

de ar induzido por zimosam, foi avaliado o efeito do extrato aquoso na cinética

de migração celular e contagem diferencial nos intervalos de tempo de 6, 24 e

48 horas utilizando o mesmo modelo de inflamação. Para isto uma dose foi

escolhida para dar continuidade aos experimentos.

A administração de zimosam (s.c.) induziu um aumento na migração de

leucócitos para bolsa de ar em todos os intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas).

Observou-se que o grupo que recebeu zimosam e foi tratado com solução

salina estéril (i.p.) apresentou um aumento no número de leucócitos com um

72

pico de 6 horas e diminuição gradativa dessas células na cavidade dorsal dos

camundongos à medida que o tempo foi passando. Entretanto os resultados

demonstram que um tratamento prévio com extrato aquoso (i.p.) na dose de 50

mg/kg (Figura 18), inibiu significativamente a migração de leucócitos em todos

os intervalos de tempo, também de forma gradativa com o passar do tempo. Os

dados apontam a eficiência do extrato aquoso no processo de inibição celular

de até 48h, levantando a possibilidade da realização de estudos de inflamação

crônica, como asma e doenças autoimunes (BITENCOURT et al., 2011).

Da mesma forma, na contagem diferencial relativa, o extrato aquoso

(50 mg/kg) foi avaliado no tempo de 6, 24 e 48 horas. Os grupos tratados com

solução salina estéril (i.p.) após trinta minutos serem desafiados com o

zimosam (i.p.) apresentaram um aumento no número de polimorfonucleares no

tempo de 6 horas, com diminuição do número de polimorfonucleares e

aumento progressivo de mononucleares no exsudato com o passar do tempo.

Com a administração do extrato aquoso na dose de 50 mg/kg ocorreu a

redução de polimorfonucleares (Figura 19A) e aumento no número de

mononucleares (Figura 19B) nos três tempos, quando comparado com o grupo

que recebeu solução salina estéril como tratamento.

73

Figura 18 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre

cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa de ar induzida por

zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), extrato

aquoso na dose de 50 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1

mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de 6,

24 e 48 horas após a aplicação do zimosam, os animais o exsudato foi coletado da bolsa de ar

com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células

leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. ###

p<0,001, ##

p<0,01 e #p<0,05 comparando

com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal,

solução salina estéril; Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), EA, extrato

aquoso (50 mg/kg).


74

Figura 19 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre cinética de

migração de polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar

induzida por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com extrato aquoso na dose de 50 mg/kg, ou

dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c)

dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam, o exsudato

foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a

contagem relativa de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). **p<0,001 e *p<0,05

comparando com o grupo zimosam. Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg),

EA, extrato aquoso (50 mg/kg).


75

O padrão de rutina foi avaliado no experimento dose-efeito e foi

verificado que entre as doses (2,5, 5 e 10 mg/kg) não houveram diferenças

estatísticas quanto ao efeito de inibição de migração celular. Os dados exibem

uma semelhança estatística entre com a dexametasona na dose de 2 mg/kg

(Figura 20).

Figura 20 - Efeito rutina na migração leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar

induzido por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), rutina na

dose de 2,5, 5 e 10 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1

mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. Depois de 6

horas o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e

realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada

coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam

o erro padrão da média (EPM). ###

p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril

(Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,



A dose de 2,5 mg/kg da rutina foi escolhida para realizar o experimento

de cinética de migração leucocitária. Ao contrário do extrato aquoso que

apresentou um perfil gradativo na redução de leucócitos total com o passar do

76

tempo, a rutina se comportou de maneira constante nos três intervalos de

tempo (Figura 21).

Figura 21 - Efeito da rutina sobre cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa

de ar induzida por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), rutina na

dose de 2,5 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1 mg/mL) ou

solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48

horas após a aplicação do zimosam, o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de

solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias

utilizando a câmara de Neubauer. ###

p<0,001 e ##

p<0,01 comparando com o grupo solução

salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril;

Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), Rt, rutina (2,5 mg/kg).


No que diz respeito à contagem diferencial relativa, a rutina induziu a

diminuição de polimorfonucleares no tempo inicial (6 horas) e manteve a

redução gradativa no tempo de 24 e 48 horas (Figura 22A). Paralelamente, os

mononucleares revelaram que à medida que avançava o tempo, esta

subpopulação aumentava (Figura 22B).

77

Figura 22 - Efeito da rutina sobre cinética de migração de polimorfonucleares (A) e

mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com rutina na dose de 2,5 mg/kg, ou dexametasona

(2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c) dentro da bolsa

de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato foi coletado da

bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem relativa de

polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex,

dexametasona (2,0 mg/kg), Rt, rutina (2,5 mg/kg). Fonte: Dados obtidos e analisados

O ácido clorogênico também foi avaliado no experimento dose-efeito foi

verificado que as doses de 10, 12,5 e 15 mg/kg foram capazes de inibir a

migração celular (Figura 23).

78

Figura 23 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir do modelo de

bolsa de ar induzido por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), ácido

clorogênico na dose de 10, 12,5 e 15 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois

zimosam (1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar.

Depois de 6 horas o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril,

centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de

Neubauer. Cada coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas

verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###

p<0,001, ##

p<0,01 e #p<0,05 comparando

com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo zimosam. Sal,

solução salina estéril; Dex, dexametasona (2,0 mg/kg).


A dose de 10 mg/kg do ácido clorogênico foi escolhida para realizar o

experimento de cinética de migração leucocitária. Semelhante ao extrato

aquoso, o ácido clorogênico apresentou um perfil gradativo na redução de

leucócitos total com o passar do tempo (6, 24 e 48 horas) (Figura 24).

No que diz respeito a contagem diferencial relativa utilizando a dose de

10 mg/kg do ácido clorogênico analisado, em três intervalos de tempo, foi

possível verificar que o efeito do composto foi semelhante a dexametasona,

diminuindo o número de polimorfonucleares (Figura 25A) e aumentando o

número de mononucleares (Figura 25B), quando comparado com o grupo que

recebeu apenas a solução salina estéril (i.p.) como tratamento.

79

Figura 24 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração leucocitária em

modelo de bolsa de ar induzida por zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), ácido

clorogênico na dose de 10 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam

(1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de

6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2

mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias

utilizando a câmara de Neubauer. ###

p<0,001 e ##

p<0,01 comparando com o grupo solução

salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril;

Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), AC, ácido clorogênico (10 mg/kg).


80

Figura 25 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração de

polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por

zimosam

Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com ácido clorogênico na dose de 10 mg/kg, ou

dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c)

dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato

foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a

contagem relativa de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). **p<0,01 e *p<0,05

comparando com o grupo zimosam. Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg),

AC, ácido clorogênico (10 mg/kg). Fonte: Dados obtidos e analisados

81

O modelo de bolsa de ar induzido por zimosam é um modelo de

inflamação semelhante à resposta inflamatória em um tecido sinovial, uma vez

que a injeção de ar estéril introduzida no dorso dos animais forma uma

cavidade que se assemelha ao ambiente da articulação (CABRERA et al.,

2001; YOON et al., 2005). O zimosam é um polissacarídeo derivado do fungo

Saccharomyces cerevisiae e sua administração promove uma intensa reação

inflamatória caracterizada pelo aumento do influxo leucocitário (MAKNI-

MAALEJ et al., 2013). Os resultados mostram que o extrato aquoso dos frutos

de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico inibiram significativamente a

migração leucocitária para bolsa de ar em camundongos em todas as doses e

tempos testados, mesmo após 48 horas da administração do zimosam. Os

resultados se assemelham ao o efeito anti-inflamatório da dexametasona,

fármaco anti-inflamatório de referência. Além disso, na contagem diferencial

relativa foi observada uma redução dos polimorfonucleares, bem como um

aumento do número de mononucleares, mostrando a capacidade do extrato

aquoso e compostos identificados em controlar a inflamação por reduzir o

número de neutrófilos no lugar da inflamação.

O mecanismo envolvido na inibição da resposta inflamatória pelo

extrato aquoso e suas moléculas bioativas ainda é desconhecido. Entretanto o

zimosam pode interagir com receptor semelhante ao ”Toll 2” (TLR-2) e

desencadear a resposta inflamatória. O zimosam é reconhecido pelo receptor

de Dectina 1 presente em macrófagos, neutrófilos, monócitos e células T. Após

o reconhecimento, é necessário a interação com o receptor semelhante ao

TLR-2. Estudos mostram que o sinergismo na ativação de Dectina 1 e o TLR-2

melhora a resposta desencadeada por cada receptor (BROWN; GORDON,

2003). A interação induz cascatas intracelulares com ativação do recrutamento

seletivo de proteínas adaptadoras do gene de resposta primária de

diferenciação mielóide 88 (MyD88), que leva a ativação do fator de transcrição

nuclear kappa B (NF-κB), o qual é responsável pela transcrição de genes pro-

inflamatórios responsáveis pela produção de citocinas inflamatórias, bem como

da expressão de moléculas co-estimulatórias (GUERRERO et al., 2011).

Estudos prévios têm revelado também que a rutina e o ácido clorogênico são

dotados de algumas atividades farmacológicas, especialmente anti-

inflamatórias (LIMA et al., 2014; ZHANG et al., 2010). Foi demonstrado que

82

tanto a rutina como o ácido clorogênico inibem a ativação do fator nuclear

kappa B (NF-κB) suprimindo a produção de prostaglandinas E2 (PGE2) por

inibir a expressão da COX-2 (CHOI et al., 2013; SHAN et al., 2009), como

também diminui a expressão de proteínas relacionada com a inflamação, como

o óxido nítrico sintase (iNOS) (RUIZ et al., 2007). Portanto, é possível que

estes metabólitos secundários atuem sinergicamente inibindo a resposta

inflamatória induzida pelo inflamógeno zimosam, uma vez que o mecanismo de

ação está diretamente relacionado com a ativação do fator nuclear kappa B.

Outra possibilidade pode estar relacionada com o extrato ou moléculas

bioativas em se ligar de maneira competitiva ou inibitória com o receptor TLR-2

e/ou receptor de Dectina 1 e inibir a cascata intracelular da inflamação.

Além disso, a inibição da migração celular para o local da inflamação

não pode ser descartada como outro mecanismo de atividade anti-inflamatória.

Sabe-se que no processo inflamatório ocorre aumento da permeabilidade

vascular, levando a migração e ativação de polimorfonucleares, especialmente

neutrófilos (PICK et al., 2013). Em geral os primeiros leucócitos que chegam ao

local da inflamação são os neutrófilos. Estes predominam nos tecidos

inflamados durante as primeiras 6 a 24 horas. Em seguida ocorre um perfil de

substituição células e os mononucleares, em especial os monócitos, que

predominam nas 24 a 48 horas seguintes (SIQUEIRA, 2000). É importante

considerar que apesar do recrutamento de neutrófilos ser uma resposta

protetora do organismo, a ocorrência de uma resposta exacerbada gera efeitos

indesejáveis, o que pode levar a um progressivo dano tecidual no local

inflamado, portanto o bloqueio do tráfego de neutrófilos durante o processo

inflamatório, vem sendo um alvo promissor na descoberta de novos fármacos

anti-inflamatórios (MALECH; GALLIN, 1987). Então, é possível que as

moléculas bioativas presentes no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa

apresentem interação com os receptores presentes nas células endoteliais,

inibindo a migração celular, bem como a ativação produção mediadores

inflamatórios envolvidos na diapedese e quimiotaxia de polimorfonucleares.

83

7 CONCLUSÂO

A análise fitoquímica realizada por Cromatografia líquida de alta

eficiência acoplado ao detector de arranjo de diódo (CLAE-DAD) e

Cromatografia líquida acoplado ao detector de arranjo de diodo acoplado ao

espectrômetro de massas (CL-DAD-EM) revelou a presença dos metabólitos

secundários rutina e o ácido clorogênico no decocto dos frutos de H. speciosa;

O extrato aquoso de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico

administrados por via intravenosa, em todas as doses testadas, inibiram a

migração celular para a cavidade peritoneal de camundongos induzida por

carragenina, bem como reduziram os níveis de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e

TNF-α;

O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico

foram capazes de inibir significantemente a formação de edema de orelha

induzido por xilol, quando administrado pela via intraperitoneal;

O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico,

administrado por via intraperitoneal, reduziram significativamente o influxo de

leucócitos para a cavidade dorsal em modelo de bolsa de ar em camundongos

induzida por zimosam, sendo essa inibição observada 6, 24 e 48 horas após o

tratamento;

Em conclusão, no presente estudo foi possível demonstrar pela

primeira vez, que o extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, bem

como rutina e ácido clorogênico foram capazes de exercer efeito anti-

inflamatório nos modelos experimentais em estudo. Com os resultados

apresentados, é possível evidenciar o uso popular dos frutos da mangabeira

para o tratamento de doenças de caráter inflamatório. Estes resultados também

sugerem que a rutina e o ácido clorogênico contribuem, em parte, para o efeito

anti-inflamatório do extrato aquoso, havendo a necessidade de estudos

adicionais para identificação de outros constituintes presentes no extrato.

Portanto é possível sugerir que o extrato aquoso dos frutos de Hancornia

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speciosa e seus constituintes identificados podem representar, em um futuro

mais próximo, uma nova opção terapêutica para o tratamento de desordens

inflamatórias.

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ZUCOLOTTO, S. M.; GIORDANI, R. B. Roteiro para aulas práticas, Disciplina

de Farmacognosia, Curso de Farmácia, Departamento de Farmácia, UFRN,

2013.

96

PRODUÇÕES CIENTÍFICAS

Artigo de Mestrado submetido como autora

ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACT, RUTIN AND

CHLOROGENIC ACID IDENTIFIED FROM THE FRUITS OF Hancornia

speciosa Gomes (APOCYNACEAE)

Manoela Torres-Rêgo1, Mariana Angélica Oliveira Bitencourt1, Allanny Alves

Furtado1, Maira Conceição Jerônimo de Souza Lima1, Rafael Caetano Lisbôa

Castro de Andrade1, Thaciane da Cunha Soares3, Eduardo Pereira de

Azevedo2, José Carlos Tomaz4, Norberto Peporine Lopes4, Arnóbio Antônio da

Silva Júnior1, Silvana Maria Zucolotto3, Matheus de Freitas Fernandes-

Pedrosa1.

1 Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 2 Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 3 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 4 Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais e Sintéticos, Departamento de Física e Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.

Correspondence

Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, Laboratório de Tecnologia e

Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, Petrópolis,

Natal, RN, Brasil. E-mail: [email protected] Phone: +55 84 3342-9820.

mailto:[email protected]

97

Artigo Publicado como co-autora

98

Artigo Submetido como co-autora

Aspidosperma pyrifolium HAS ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES: AN

EXPERIMENTAL STUDY IN MICE WITH INDUCED PERITONITIS BY Tityus

serrulatus VENOM AND CARRAGEENAN-INDUCED PERITONITIS

Maíra Conceição Jerônimo de Souza Lima1, Mariana Angélica Oliveira

Bitencourt1, Allanny Alves Furtado1, Manoela Torres do Rêgo1, Emerson

Michell da Silva Siqueira2, Hugo Alexandre Oliveira Rocha3, Ruth Medeiros

Oliveira3, Keyla Borges Ferreira Rocha4, Denise V. Tambourgi5, Arnóbio

Antônio da Silva-Júnior1, Silvana Maria Zucolotto2, Matheus de Freitas

Fernandes-Pedrosa1

1 Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de

Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

2 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

3 Laboratório de Biotecnologia de Biopolímeros Naturais, Departamento de Bioquímica,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

4 Laboratório de Patologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

5 Laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brazil.

Correspondence

Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, Laboratório de Tecnologia e

Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, Petrópolis,

Natal, RN, Brazil. E-mail: [email protected] Phone: +55 84 3342 9820

mailto:[email protected]

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