UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · PDF fileimunoistoquímica para VIP (A,...
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · PDF fileimunoistoquímica para VIP (A,...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
CINTHYA MONTENEGRO DE VASCONCELOS SILVA
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SONO/VIGILIA EM UM MODELO CRÔNICO DE
PARKINSONISMO EM RATOS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
Natal
2016
CINTHYA MONTENEGRO DE VASCONCELOS SILVA
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SONO/VIGILIA EM UM MODELO CRÔNICO DE
PARKINSONISMO EM RATOS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
Orientadora: Profª Drª Rovena Clara
Engelberth
Natal
2016
Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Sistema de
Bibliotecas Biblioteca Central Zila Mamede / Setor de Informação e Referência
Silva, Cinthya Montenegro de Vasconcelos. Avaliação do perfil de sono/vigilia em um modelo crônico de parkinsonismo em ratos / Cinthya Montenegro de Vasconcelos Silva. - Natal, RN, 2016.
86 f. : il. Orientador: Rovena Clara Galvão Januário Engelberth. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Doença de Parkinson - Dissertação. 2. Sintomas não-
motores - Dissertação. 3. Sistema de temporização circadiano - Dissertação. 4. Ritmos biológicos - Dissertação. 5. Imunoistoquímica - Dissertação. I. Engelberth, Rovena Clara Galvão Januário. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 616.858
Título: Avaliação do perfil de sono/vigilia em um modelo crônico de parkinsonismo em
ratos
Autora: Cinthya Montenegro de Vasconcelos Silva
Data da defesa: 13/05/2016
Banca Examinadora:
___________________________________
Prof. Dr. José Ronaldo dos Santos
Universidade Federal de Sergipe, SE
___________________________________
Profa. Dra. Rovena Clara Engelberth
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
___________________________________
Prof. Dr. Mario André Leocadio Miguel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais por sempre terem apoiado todas as decisões que tomei ao longo da
vida, possibilitando que eu chegasse até aqui.
Aos colegas de laboratório por proporcionar um convívio agradável durante todo o
período de mestrado, em especial a Thiago, Marília, Carlos, Diego e Kayo, por toda a
ajuda na construção deste trabalho, pelo apoio nos momentos de dificuldade e pelo
ótimo convívio que sempre mantivemos.
À minha orientadora, prof. Dra. Rovena Engelberth, que sempre me motivou, e com
muita paciência e atenção, dedicou seu valioso tempo para me orientar em cada passo
deste trabalho, compartilhando comigo suas idéias, conhecimentos e experiências.
A todos os amigos que direta ou indiretamente me incentivaram na conclusão deste
trabalho, em especial aos meus amigos desde a graduação: Anthony, Arthur, Bárbara,
Edilaine, Laíse, Nelson, Sabina e Tainá, por compartilhar comigo tantos momentos de
diversão e cumplicidade nos últimos 7 anos.
Ao laboratório de farmacologia da UFRN pelo fornecimento dos animais e
equipamentos de vídeo.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1- Sistema de Temporização Circadiano..................................................................3
1.1.1- O Núcleo Supraquiasmático (NSQ)...................................................................8
1.2- STC e Parkinson..................................................................................................9
1.3- Modelos animais de DP.....................................................................................16
2- JUSTIFICATIVA.....................................................................................................22
3- OBJETIVOS...........................................................................................................23
4- HIPÓTESES E PREDIÇÕES.................................................................................24
5- METODOLOGIA....................................................................................................25
5.1- Sujeitos e design experimental...........................................................................25
5.2- Procedimentos Experimentais.............................................................................26
5.2.1- Teste de catalepsia..........................................................................................26
5.2.2- Registros cronobiológicos................................................................................26
5.2.3- Perfusões e microtomia....................................................................................28
5.2.4- Processamentos do material............................................................................29
5.3- Captação dos dados...........................................................................................30
5.4- Análise estatística...............................................................................................31
6- RESULTADOS.......................................................................................................32
6.1- Comportamento de catalepsia............................................................................32
6.2- Avaliação da distribuição temporal do sono........................................................33
6.3- Avaliação da fragmentação do sono...................................................................41
6.4- Avaliação neuroquímica do NSQ........................................................................41
7- DISCUSSÃO.........................................................................................................43
7.1- Efeitos motores do tratamento crônico com reserpina........................................43
7.2- Sintomas não-motores precedem o aparecimento dos sinais motores na
DP.............................................................................................................................46
7.2.1- Sono................................................................................................................50
7.4- Avaliação neuroquímica do NSQ........................................................................57
8- CONCLUSÕES.....................................................................................................61
REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO...........................................................................62
ANEXO
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação simplificada dos mecanismos intracelulares responsáveis
pela geração dos ritmos circadianos em mamíferos. 5
Figura 2: Esquema ilustrando os componentes básicos do sistema de temporização
circadiano. 8
Figura 3: Principais mecanismos gerados por alterações no sistema circadiano e
implicados com o agravamento da DP. 11
Figura 4: Representação esquemática do procedimento experimental. 31
Figura 5: Efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg (grupo RES6M - n=9 e grupo
RES10M - n=4) ou veículo (grupo CTR6M - n=8 e grupo CTR10M - n=4) no
comportamento de catalepsia. 32
Figura 6: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o
tempo de sono (em minutos) no intervalo 1 (ZT0-ZT6). 35
Figura 7: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o
tempo de sono (em minutos) no intervalo 2 (ZT6-ZT12). 36
Figura 8: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o
tempo de sono (em minutos) no intervalo 3 (ZT12-ZT18). 37
Figura 9: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o
tempo de sono (em minutos) no intervalo 4 (ZT18-ZT24). 38
Figura 10: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o
tempo de sono entre os dias 6-8 (início às 0h do dia 6). 39/40
ii
Figura 11: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre a
quantidade de despertares por dia. 41
Figura 12. Fotomicrografia em campo claro de secções coronais do encéfalo de ratos
CTR6M (A, C e E) e RES6M (B, D e F), em nível médio, mostrando a
imunoistoquímica para VIP (A, B), VP (C, D) e NPY (E, F). 42
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Listagem de anticorpos 30
iv
ABREVIATURAS
5-HT Serotonina
6-OHDA 6-hidroxidopamina
CTR6M Controle 6 meses
CTR10M Controle 10 meses
DA Dopamina
DP Doença de Parkinson
EEG Eletroencefalograma
FIG Folheto intergeniculado
GABA Ácido gama-aminobutírico
GSH Glutationa reduzida
L-dopa Levodopa
LPS Lipopolissacarídeo
MPTP 1-metil-4-fenil-1-2-3-6-tetraidropiridina
NPY Neuropeptídeo Y
NSQ Núcleo Supraquiasmático
QSN Qualidade Do Sono Noturno
RD-1 Composto derivado da rodanina
RES6M Reserpina 6 meses
RES10M Reserpina 10 meses
v
SARA Sistema Ativador Reticular Ascendente
SDE Sonolência Diurna Excessiva
SNpc Substância Negra parte compacta
STC Sistema de Temporização circadiano
TGH Trato geniculohipotalâmico
TH Tirosina Hidroxilase
TRH Trato retinohipotalâmico
VIP Polipeptídeo Intestinal Vasoativo
VLPO Núcleo pré-óptico ventrolateral
VMAT1 Transportadores vesiculares de monoaminas tipo 1
VMAT2 Transportadores vesiculares de monoaminas tipo 2
VP Vasopressina
VPAC1 Receptor de VIP tipo 1
vi
RESUMO
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa e progressiva com
espectro clínico variado. Além dos sintomas motores clássicos, também podem surgir
complicações não-motoras, destacando-se problemas cognitivos, psiquiátricos e
autonômicos. Evidências demonstram que tais sintomas não-motores
frequentemente precedem o aparecimento dos sinais motores e são extremamente
relevantes, dado o impacto negativo que causam na qualidade de vida dos indivíduos.
Os sintomas não-motores podem apresentar múltiplas causas, dentre as quais, uma
possível disfunção do sistema circadiano. Dessa forma, diversos processos
fisiológicos influenciados pelo sistema de temporização circadiano (STC), como o
ciclo sono/vigília, podem se mostrar alterados em pacientes acometidos pela DP.
Nesse estudo, buscou-se avaliar o perfil do comportamento de sono/vigília em um
modelo crônico de DP em ratos, comparando com possíveis alterações
neuroquímicas no núcleo supraquiasmático (NSQ), o principal marcapasso do STC.
Para isto, ratos Wistar jovens (6 meses) e de meia idade (10 meses) foram
submetidos a um tratamento com administração repetida de reserpina (0,1mg/kg)
durante 20 dias. Ao longo do tratamento foram realizadas análises comportamentais
do sono, bem como a avaliação motora dos indivíduos. Após o fim do tratamento,
foram realizadas análises imunoistoquímicas no NSQ dos animais. Nossos
resultados mostraram que o tratamento crônico com reserpina promoveu
comprometimento motor progressivo tanto nos animais jovens quanto nos de meia
idade, sendo notados prejuízos significativos a partir do 12º dia de tratamento. Além
disso, as análises comportamentais revelaram perturbações no ciclo sono/vigília dos
animais tratados em comparação aos indivíduos controle, incluindo avanço na fase
de sono e aumento na fragmentação do sono. Tais alterações foram observadas a
vii
partir do 6º dia de tratamento, ou seja, anteriormente ao aparecimento dos sintomas
motores. As análises imunistoquímicas não permitiram observar efeitos significativos
do tratamento com reserpina sobre a composição neuroquímica do NSQ. Assim,
nossos dados reiteram a observação de que os sintomas não-motores precedem o
surgimento dos sintomas motores na DP e são extremamente importantes para o
diagnóstico clínico precoce da doença.
Palavras chave: Doença de Parkinson, Sintomas não-motores, Sistema de
Temporização Circadiano, Ritmos Biológicos, imunoistoquímica.
viii
ABSTRACT
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative and progressive disorder with varied
clinical spectrum. In addition to the classic motor symptoms may also emerge non-
motor complications, highlighting cognitive, psychiatric and autonomic problems.
Evidence shows that such non-motor symptoms often precede the onset of motor signs
and are extremely relevant given the negative impact they have on the quality of life of
the individuals. Non-motor symptoms may present multiple causes, among which a
possible dysfunction of the circadian system. Therefore, many physiological processes
influenced by the circadian timing system (CTS) as the sleep / wake cycle can show
alterations in PD patients. In this study we sought to evaluate the profile of sleep/wake
behavior in a chronic model of PD in rats compared with possible neurochemical
changes in the suprachiasmatic nucleus(SCN), the main pacemaker of the CTS. To
this end, young (6 months) and middle-age (10 months) wistar rats were subjected to
a treatment with repeated administration of reserpine (0.1 mg / kg) for 20 days. During
treatment sleep behavioral analysis were performed as well as the motor assessment
of the individuals. After the end of treatment, immunohistochemical analyzes were
performed in the SCN of the animals. Our results showed that chronic treatment with
reserpine promoted progressive motor impairment both in young as in middle-age
animals. It is noticed significant losses from the 12th day of treatment. Furthermore,
the behavioral analyzes revealed disturbances in sleep / wake cycle of the treated
animals compared to control subjects, including advanced sleep phase and increased
sleep fragmentation. Such changes were observed from the 6th day of treatment, prior
to the onset of motor symptoms. The immunohistochemical analysis not allowed to
observe significant effects of treatment with reserpine on the neurochemical
composition of the SCN. Thus, our data support the observation that non-motor
ix
symptoms precede the onset of motor symptoms in PD and are extremely important
for early clinical diagnosis of the disease.
Keywords: Parkinson's disease, non-motor symptoms, circadian timing system,
biological rhythms, immunohistochemistry.
1
1. INTRODUÇÃO
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa que afeta
cerca de 1 a 2% das pessoas acima de 65 anos de idade, sendo prevalente no sexo
masculino (Stokes, 2000; Aminoff, 2002). Esta enfermidade é caracterizada
clinicamente pelo início insidioso de sintomas motores como tremor, rigidez
muscular, bradicinesia e anormalidades posturais. Histopatologicamente, se
caracteriza, principalmente, por uma progressiva diminuição de neurônios
dopaminérgicos na substância negra parte compacta (SNpc), com a consequente
redução da inervação dopaminérgica no estriado (Bury e Pienaar, 2013). De maneira
adicional, a formação de agregados protéicos no interior do citoplasma dos
neurônios, denominados corpos de Lewy, constituem outra característica de
diagnóstico histopatológico da DP (Spillantini et al., 1997; Dauer e Przedborski,
2003).
Estudos sugerem que neurônios não-dopaminérgicos localizados em áreas
mais dispersas como tronco cerebral e sistema olfatório são também afetados na
DP, resultando na deficiência de outros neurotransmissores monoaminérgicos,
incluindo serotonina e noradrenalina (Braak et al., 2004). Concomitantemente com a
carência de dopamina, a depleção destes outros neurotransmissores termina por
ocasionar também a manifestação de sintomas não-motores na doença, que
compreendem alterações autonômicas, sensoriais e neuropsiquiátricas, como por
exemplo, depressão, ansiedade, apatia, alterações de personalidade, distúrbios do
sono e disfunções cognitivas, as quais progridem à demência em aproximadamente
30-40% dos casos (Cummings e Mega, 2003; Blonder e Slevin, 2011). Os sinais não-
motores podem preceder o aparecimento dos sintomas motores e são extremamente
relevantes, visto a frequência com que se apresentam e o impacto negativo que
2
causam na qualidade de vida dos pacientes, e, portanto, possibilitam um diagnóstico
mais cedo de DP (Chaudhuri et al., 2005; Chaudhuri e Naidu, 2008).
Atualmente, os tratamentos para DP são extremamente limitados, com terapias
que fornecem um mero alívio sintomático, mas falham em retardar o processo de
neurodegeneração (Cranwell-Bruce, 2010). Uma abordagem terapêutica comum
envolve estratégias de substituição da dopamina, utlizando principalmente o
precursor de dopamina Levodopa (L-dopa) em combinação com um inibidor
periférico de dopa descarboxilase (Benserazida ou Carbidopa). Embora bem-
sucedido no início, este tratamento medicamentoso de longo prazo leva à perda de
eficácia e efeitos secundários graves, incluindo discinesia (Bury e Pienaar, 2013).
Por outro lado, como o estresse oxidativo também desempenha um papel
importante na patogênese da DP, o tratamento neuroprotetor com antioxidantes
farmacológicos ou naturais pode ser útil para retardar ou prevenir o aparecimento de
sintomas da doença (Yacoubian e Standaert, 2009). Siddique et al. (2013)
demonstraram o potencial de extratos vegetais para melhorar disfunções motoras
em moscas transgênicas expressando forma de tipo selvagem do gene alfa-
sinucleína humano, cuja mutação está associada a casos de parkinsonismo familiar.
Além disso, estudos têm demonstrado potencial neuroprotetor de extrato de raiz de
Decalepis hamiltonii no rato albino e Drosophila (Jahromi et al., 2013; Haddadi et al.,
2013, 2014). Em estudo mais recente, foi observado que o RD-1 (composto derivado
da rodanina) atenuou o prejuízo na síntese de ATP e consequentemente nos
processos celulares dependentes de ATP, protegendo células neuronais contra
injúrias neurotóxicas ocasionadas pelo MPTP (1-metil4-fenil-1-2-3-6-
tetraidropiridina), uma neurotoxina usada em modelos animais da DP que provoca
3
sintomas da doença de forma permanente ao destruir neurônios dopaminérgicos
presentes na substância negra (Ren et al., 2015).
Inúmeros processos fisiológicos influenciados pelo sistema circadiano podem
sofrer alterações em pacientes acometidos pela DP. Por exemplo, o sistema nervoso
autônomo está sujeito à regulação circadiana: o equilíbrio entre os tônus simpático e
parassimpático varia em sincronia com o ciclo circadiano (Jain e Goldstein, 2012).
Em indivíduos saudáveis, o tônus parassimpático predomina durante o período
noturno / sono e age para reduzir a frequência cardíaca e a pressão. Estudos
demonstram que a regulação circadiana do sistema nervoso autônomo é
interrompida em pacientes com DP e esta perturbação provoca mudanças na
pressão arterial e frequência cardíaca, acarretando problemas como a hipotensão
ortostática (Kallio et al., 2000; Jain, 2011).
De maneira importante, distúrbios do sono também são frequentemente
exibidos pelos pacientes da DP, os quais relatam insônia primária, síndrome das
pernas inquietas e hipersônia em cerca de 90% dos casos (Stevens et al., 2004;
Thorpy e Adler, 2005; Ferreira et al., 2006; Matsui et al., 2006). Tais desordens
podem apresentar múltiplas causas, dentre as quais uma possível disfunção
circadiana, que apesar de pouco explorada na literatura, apresenta potencial papel
na patogênese dos sintomas não motores na DP (Videnovic e Golombek, 2013;
Willison et al., 2013).
Dessa forma, o sistema circadiano representa um alvo atraente como
potencial modulador de progressão da DP e da qualidade de vida dos pacientes.
1.1 Sistema de Temporização Circadiano
4
O movimento de rotação da Terra sobre seu eixo combinado ao movimento
de translação do planeta ao redor Sol, ocasiona tanto flutuações diárias quanto
sazonais no fotoperíodo, intensidade de luz, temperatura e disponibilidade de
alimento (Coomans et al., 2015) Assim, a maioria dos organismos vivos, desde
cianobactérias até os seres humanos, desenvolveu dispositivos endógenos capazes
de medir o tempo (relógios internos) que lhes permitem antecipar o horário do dia de
forma proativa e, dessa forma, organizar padrões periódicos de comportamento,
fisiologia e atividade bioquímica, os chamados ritmos biológicos. A presença destes
relógios internos permite uma melhor adaptação do organismo às mudanças que
ocorrem no ambiente e, dessa maneira, elevam a probabilidade de sobrevivência do
indivíduo (DeCoursey e Krulas, 1998). Outra importante característica dos ritmos
biológicos é que, apesar de serem influenciados por pistas ambientais - como por
exemplo variações de temperatura, ciclos de marés e estações da lua - eles
persistem, mesmo na ausência destas, confirmando assim, que são gerados por um
mecanismo endógeno.
Diversos organismos exibem um padrão rítmico claro, que oscila em uma
duração de aproximadamente 24 horas em uma enorme variedade de processos
bioquímicos, fisiológicos e comportamentais, os denominados ritmos circadianos
(Dibner et al., 2010). O mecanismo molecular subjacente à geração dos ritmos
circadianos é baseado em alças de feedback negativo e positivo, que atuam de forma
interconectada para regular a transcrição de genes do relógio (genes clock) e o
funcionamento de suas respectivas proteínas. O processo se inicia quando os
fatores de transcrição CLOCK e Bmal1 formam dímeros e promovem a transcrição
de famílias de genes-alvo: Period (Per1, Per2, Per3) e Cryptochrome (Cry1, Cry2),
levando ao aumento nos níveis das proteínas Per e Cry no citoplasma da
5
célula.Quando os níveis de Per e Cry atingem um limiar, elas então formam
heterodímeros e retornam ao nucleo celular, onde inibem a transcrição promovida
por CLOCK/Bmal1 (Kriegsfeld e Silver, 2006). Este ciclo de feedback dura
aproximadamente 24h, levando assim à geração de variações rítmicas de funções
celulares em diferentes tecidos e, consequentemente, à orquestração circadiana de
diversos processos regulatórios responsáveis por manter a homeostase corporal
(Bozek et al.,2009; Mazzoccoli et al., 2012; Figura 1). De forma adicional a este
circuito, outro ciclo de feedback negativo atua sobre receptores nucleares ROR (α,
ᵦ,ᵧ) para inibir a transcrição de Bmal1, contribuindo também para a precisão e
robustez do relógio (Welsh et al., 2010).
Figura 1. Representação simplificada dos mecanismos intracelulares responsáveis pela
geração dos ritmos circadianos em mamíferos (Adaptado de Kriegsfeld e Silver, 2006).
Em mamíferos, os ritmos circadianos são gerados e mantidos por um
sistema complexo e organizado: o sistema de temporização circadiano (STC), o qual
6
é constituído por um marcapasso central, vias de entrada que permitem a chegada
das informações ambientais e vias de saída que dão acesso aos eferentes fisiológicos
e comportamentais (Golombek e Rosestein, 2010; Figura 2). De forma mais
abrangente, o STC compreende ainda um número de osciladores periféricos ao longo
do corpo, orquestrados pelo marcapasso central, tanto por meio de vias neuronais,
através do sistema nervoso autônomo, quanto através de pistas humorais rítmicas
(como a oscilação circadiana de cortisol e os níveis de melatonina no sangue), e
ainda por meio de sinais sistêmicos, tais como os ciclos de temperatura (Barclay et
al., 2012).
O chamado marcapasso central do STC é representado pelo núcleo
supraquiasmático (NSQ), um par de aglomerados de pequenos neurônios situados
no hipotálamo anterior, imediatamente dorsal ao quiasma óptico e de cada lado do
terceiro ventrículo (Cassone et al., 1988). Essa estrutura foi descrita como
marcapasso ainda na década de 70, sendo confirmado definitivamente na década
seguinte, onde estudos verificaram que transplantes de NSQ fetal permitiam
recuperar a ritmicidade circadiana de animais tornados arrítmicos em consequência
da lesão bilateral do NSQ (Drucker-Colin, 1984; Ralph et al., 1990), ratificando-o
assim, como estrutura responsável por gerar e modular ritmos biológicos.
Com relação ao aspecto neuroquímico, o NSQ apresenta algumas variações
entre espécies, já tendo sido descritas inúmeras substâncias que atuam como
neurotransmissores ou neuromoduladores, sendo elas: vasopressina (VP),
polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), neuropeptideo Y (NPY), ácido gama-
aminobutírico (GABA), serotonina (5-HT), glutamato, colecistoquinina, encefalina,
somatostatina, bombesina, peptídeo liberador de gastrina, peptídeo relacionado ao
7
gene da calcitonina, substância P, angiotensina II, hormônio liberador de tireotropina,
tirosina hidroxilase, ubiquitina e óxido nítrico (Reuss, 2003).
Dentre as vias de entrada, destaca-se o trato retinohipotalâmico (TRH),
constituído por fibras originárias de células ganglionares da retina que percorrem o
nervo óptico e carreiam informações fóticas até o NSQ (Hendrickson et al., 1972;
Moore e Lenn, 1972). Trata-se da principal via sincronizadora dos ritmos circadianos
ao ciclo claro-escuro, sendo que na ausência de todas as outras vias visuais, o TRH
é suficiente para manter a sincronização comportamental ao ciclo claro-escuro (Klein
e Moore, 1979). Uma segunda via de aferência é representada pelo trato
geniculohipotalâmico (TGH), que transmite informações do folheto intergeniculado
do tálamo (FIG) até a porção ventrolateral do NSQ. Essa via tem como principal
mediador o NPY. Existe ainda uma terceira via de entrada para o NSQ, representada
pela projeção serotoninérgica proveniente dos núcleos da rafe, em especial o núcleo
mediano, que modula o NSQ em resposta a estímulos não-fóticos e indiretamente a
estímulos fóticos (Morin e Blanchard, 1999).
Além do NSQ, outro importante componente do STC é o FIG do tálamo, um
homólogo do núcleo pré-geniculado em primatas. Trata-se de uma fina lâmina celular
localizada entre os núcleos ventral e dorsal do complexo geniculado lateral do tálamo
de roedores (Hickey e Spear, 1976). O FIG recebe entrada retiniana das mesmas
células ganglionares que se projetam para o NSQ (Pickard, 1989). Contudo, não tem
um efeito direto na sincronização do ciclo claroescuro e sim na modulação da
transmissão da informação não-fótica ao NSQ, participando assim, no processo de
integração entre estímulos fóticos e não-fóticos.
Devido às suas conexões anatômicas, é possível que o FIG também esteja
associado com os sistemas visomotor e de sono/excitação (Horowitz et al., 2004;
8
Morin e Blanchard, 2005). Ademais, evidências morfológicas demonstram que o FIG
participa na via de sinalização da retina para as células neuroendócrinas
hipotalâmicas (Horvath, 1998).
Figura 2. Esquema ilustrando os componentes básicos do sistema de temporização
circadiano. (Cavalcante et al, 2006).
1.1.1 O Núcleo Supraquiasmático (NSQ)
O NSQ apresenta variações quanto à forma tridimensional, volume,
densidade e tamanho das células entre as espécies estudadas. Morfologicamente
cada NSQ, em camundongo, possui cerca de 10.000 neurônios (Abrahamson e
Moore, 2001); em ratos os valores são de aproximadamente 8.000 (Van den Pol,
1980) à 10.971 ± 1.179 (Moore et al., 2002). Estruturalmente, esses neurônios
estão divididos em duas subpopulações, os que recebem projeções do TRH e TGH
são produtores de VIP e estão localizados na porção ventrolateral do núcleo,
também chamada de “core”. A outra subpopulação é caracterizada por produzir VP
9
e está localizada na região dorsomedial do núcleo, ou “shell” (Abrahamson e
Moore, 2001; Morin, 2007; Mammen e Jagota, 2011).
O NSQ despontou como um importante elemento na sincronização circadiana
a partir de estudos realizados no início dos anos 70, quando trabalhos envolvendo
lesões nessa estrutura mostraram uma perda na função circadiana (Moore; Eichler,
1972) e estudos de projeções retinianas mostraram aferências diretas da retina,
que terminam na porção ventrolateral do NSQ, constituindo o TRH (Hendrickson et
al, 1972; Moore; Lenn, 1972). Estudos subsequentes confirmaram-no como
estrutura responsável por gerar e modular ritmos biológicos, sendo ele, muitas
vezes referido como o marcapasso central do STC. Dentre estes, podem-se
ressaltar estudos eletrofisiológicos que mostraram que células do NSQ
apresentavam ritmicidade circadiana na sua frequência de disparo de potenciais
de ação (Gillette, 1991), bem como na atividade metabólica (Schwartz, 1991;
Newman, 1991).
Várias evidências têm confirmado o NSQ como um marcapasso mestre,
devido sua necessidade para a marcação temporal e subsequente alocação
temporal da execução de comportamentos. Foi demonstrado que o transplante de
tecidos contendo NSQ para o cérebro de animais arrítmicos promove a restauração
do ritmo no animal receptor (Ralph et al., 1990). Além disso, os ritmos são
restaurados com o período do doador e o disparo neural do ritmo nas células do
NSQ persiste em preparações de tecido no qual o NSQ é isolado do restante do
cérebro (Green e Gillette, 1982).
1.2 STC e Parkinson
10
A ruptura do sistema de temporização circadiano é capaz de afetar
negativamente a qualidade do sono, o estado de alerta, o desempenho cognitivo,
o controle motor, a saúde mental e o metabolismo (Mohawk et al., 2012). Muitas
destas funções tornam-se prejudicadas em doenças neurodegenerativas, como a
doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington, nas quais
várias áreas do cérebro, incluindo os núcleos envolvidos na regulação dos ritmos
circadianos, são afetadas por processos neurodegenerativos (Bonaconsa et al.,
2013; Hastings e Goedert, 2013). Logo, não é de se admirar que esses distúrbios
relacionem-se frequentemente com a alteração progressiva dos ciclos normais de
repouso-atividade, do sono e do estado de alerta. Tal perturbação dos ritmos
circadianos não só contribui para a morbidade e má qualidade de vida, mas também
pode estar envolvido na progressão do processo patogênico em si (Videnovick et
al., 2014).
Os mecanismos moleculares subjacentes à perda neuronal no Parkinson
não são totalmente conhecidos, mas sabe-se que a disfunção mitocondrial,
incluindo alterações na bioenergética, homeostase do cálcio e geração de espécies
reativas de oxigênio, representam críticos processos envolvidos na morte celular
que caracteriza a DP (Schapira et al., 1989, 1990; Pienaar e Chinnery, 2013). Neste
sentido, estudos mostraram que alterações circadianas como a deleção de um
importante gene do relógio - o Bmal1 - leva à disfunção mitocondrial, com
consequente aumento do nível de espécies reativas de oxigênio em órgãos
periféricos (Kondratov et al., 2006; Khapre et al., 2011; Lee et al., 2011). Além disso,
foi observado que a alteração mitocondrial pode ser um defeito que ocorre
precocemente na patogênese da DP e parece estar fortemente relacionado com a
11
progressão de seus sintomas. (Park et al., 2009; Morais et al., 2010; Xie et al.,
2010).
Da mesma forma, perturbações no sistema imune também parecem estar
relacionadas com a evolução da DP. Sabe-se que o relógio molecular é encontrado
em muitas das células-chave envolvidas na resposta imune, e assim, muitos
parâmetros imunes apresentam variações circadianas, incluindo os níveis de
citocinas e contagens de células imunocompetentes. Dados recentes
demonstraram que as proteínas relógio podem regular diretamente a expressão de
citocinas pró-inflamatórias através da via de sinalização de NF-kB (Cermakian et
al., 2013). Logo, alterações no sistema circadiano podem acarretar modificações
na resposta imune, ocasionando o aparecimento de altos níveis de citocinas
próinfalamórias e inflamação crônica pelo corpo. Em conjunto, esses dados
sugerem que diversos mecanismos desencadeados pelo comprometimento do
sistema circadiano estão envolvidos com a progressão da DP (Figura 3).
Figura 3. Principais mecanismos gerados por alterações no sistema circadiano e
implicados com o agravamento da DP. (Adaptado de Willison et al, 2013).
Distúrbios em vários ritmos fisiológicos são consistentemente documentados
em pacientes com DP (Videnovic e Golombek, 2013). Inúmeros estudos relataram
12
flutuações diárias de fatores clínicos e biológicos na DP, incluindo a atividade
motora diária suprimida (Van Hilten et al., 1993; Bonuccelli et al., 2000), perda do
ritmo circadiano normal da pressão arterial e da frequência cardíaca (Pursiainen et
al., 2002; Ejaz et al., 2006) , sono prejudicado e alerta durante o dia (Comella, 2007;
Verbaan et al., 2008), bem como flutuações das catecolaminas (Sowers e
Vlachakis, 1984), cortisol (Hakamäki et al., 1998) e os níveis de melatonina (Fertl
et al., 1993; Bordet et al., 2003), sugerindo modificações do sistema circadiano na
DP.
Pacientes com DP frequentemente sofrem de mais de um sintoma causado
por disfunção do sistema nervoso autônomo (Goldstein, 2003), sendo que a maior
parte destes apresenta pelo menos um sintoma cardiovascular (Stuebner et al.,
2013). Estudos envolvendo 24h de monitorização ambulatorial da pressão arterial
em pacientes com DP demonstrou uma reversão do ritmo circadiano normal da
pressão arterial, aumento da variabilidade da pressão arterial diurna, hipotensão
pós-prandial, e pressão arterial noturna elevada (Senard et al., 1992; Kallio et al.,
2000). Ademais, exames eletrocardiográficos revelaram uma diminuição da
atividade simpática durante o dia, combinada com a perda de variabilidade da
frequência cardíaca circadiana e desaparecimento do pico simpático da manhã
(~08:00–10:00 h) (Devos et al., 2003).
No contexto das variações dos níveis de melatonina na DP, muitas
evidências já foram obtidas. Em estudo com 26 pacientes de DP, com ou sem
complicações motoras, que foram tratados com agentes dopaminérgicos, foi
observada uma diminuição da amplitude da flutuação de melatonina por parte
desses indivíduos, como também um avanço de fase de secreção nessas pessoas,
em comparação com os pacientes recém-diagnosticados que ainda não estavam
13
recebendo tratamento (Bordet et al., 2003). Estes achados sugerem uma tendência
para uma mudança de fase e uma redução da amplitude da secreção de melatonina
durante a evolução da DP e enfatizam a necessidade de investigar os efeitos da
medicação dopaminérgica na função circadiana. Da mesma forma, em outro estudo
realizado utilizando 20 pacientes com DP, uma amplitude reduzida do ritmo de
melatonina foi observada (Videnovic et al., 2014).
Com relação às variações de cortisol no Parkinson, um estudo com 12
pacientes de DP mostrou que a taxa média da produção de cortisol durante 24h foi
maior e a curva média de secreção de cortisol mostrou-se mais linear (indicando
uma variação diurna reduzida) no grupo DP (Hartmann et al., 1997). Ainda com
relação às alterações em ritmos fisiológicos verificadas na doença parkinsoniana,
já foi ressaltado que o ritmo de temperatura corporal está preservado na DP
(Pierangeli et al., 2001), entretanto, a temperatura corporal basal encontra-se
diminuída em pacientes com sintomas da doença (Cagnacci et al., 1990). Além
disso, pacientes de DP em comorbidade com depressão exibem ritmos circadianos
de temperatura retal alterados e reduzidas amplitudes de temperatural corporal
(Suzuki et al., 2007).
Flutuações circadianas no desempenho visual, medidas através da
sensibilidade ao contraste, são também modificadas na DP (Struck et al., 1990),
sendo que tais alterações se devem provavelmente à regulação prejudicada de
dopamina da retina, que exibe um ritmo circadiano endógeno independente dos
ciclos claro-escuro (Wirz-Justice et al., 1984). Como as alterações circadianas na
sensibilidade ao contraste pode ocorrer independentemente das oscilações
circadianas em sintomas motores, é possível que a retina e outras estruturas
14
anatômicas envolvidas no processamento visual tenham diferentes limiares de
resposta à sinalização circadiana de dopamina (Dearry e Burnside, 1986).
Alterações nos padrões normais de sono são descritas na DP, chegando a
afetar até 90% dos pacientes (Raggi et al., 2013). A etiologia desses distúrbios
deve-se, provavelmente, a múltiplos fatores, incluindo a influência de
características motoras associadas à DP no sono, efeitos adversos de
medicamentos antiparkinsonianos e neurodegeneração de áreas centrais que
regulam o sono, como o núcleo da rafe e locus coeruleus.
Em estudo recente, Setthawatcharawanich et al. (2014) analisaram a
prevalência de sonolência diurna excessiva (SDE) e a qualidade do sono noturno
(QSN) em pacientes de DP idosos. SDE foi relatada por 15,1% dos pacientes
enquanto que QSN deficiente foi descrita por 37% dos pacientes, havendo
diferenças significativas entre os doentes e o grupo controle. A análise também
mostrou que distúrbios de sono e necessidade de medicamentos para dormir
apresentaram escores significativamente mais elevados para os indivíduos
doentes. Além disso, 20,5% dos pacientes de DP vivenciaram ataques súbitos de
sono enquanto estavam dirigindo, se alimentando ou trabalhando.
No que concerne às flutuações dos sintomas motores no Parkinson, vários
estudos de actigrafia revelaram nível mais baixo no pico de atividade e menor
amplitude do ciclo de atividade-repouso em pacientes idosos com DP em
comparação a idosos saudáveis (Porter et al., 2008; Verbaan et al., 2008). Também
foi visto que pacientes com DP têm um padrão mais fragmentado de atividade,
apresentando transições de períodos com atividade elevada para períodos de baixa
atividade, levando assim, a ritmos menos previsíveis de atividade-repouso em
relação aos que são vistos em pessoas idosas saudáveis (Whitehead et al., 2008).
15
Este padrão diário observado parece ser independente do sincronismo de
medicações dopaminérgicas e, desta forma, pode estar relacionado com a
regulação circadiana dos sistemas dopaminérgicos. Em apoio a esta hipótese,
verifica-se que a capacidade de resposta dos sintomas motores da PD a
tratamentos dopaminérgicos diminui ao longo do dia, apesar da ausência de
alterações significativas na farmacocinética da L-dopa (Bonuccelli et al., 2000).
Estudos mostram que a dopamina (DA) está intimamente relacionada com
a função do relógio circadiano: a DA pode modular a expressão de genes relógio
tanto in vivo quanto in vitro (Gravotta et al., 2011, Imbesi et al., 2009; McClung et
al., 2005) e ainda, foi demonstrado que a lesão do sistema nigroestriatal perturba
os ritmos diários e circadianos de repouso/atividade e expressão de genes relógio
no estriado (Gravotta et al., 2011). Na retina, a dopamina é responsável por modular
a expressão rítmica de melanopsina, um fotopigmento encontrado em células
ganglionares da retina, que tem sido implicado na regulação circadiana (Sakamoto
et al., 2005).
Uma evidência adicional para o papel da DA no sistema de temporização
circadiana vem de lesões neuroquímicas com injeção de 6-hidroxidopamina (6-
OHDA), as quais rompem padrões circadianos normais de comportamento e
expressão do gene relógio Per2 (Hood et al., 2010). Além disso, existem trabalhos
que demonstram os fortes efeitos circadianos de drogas dopaminérgicas, como a
cocaína e a metamfetamina alterando os ritmos circadianos em roedores (Ironside
et al., 2010; Glass et al., 2012). Resultados obtidos em camundongos mostraram
que o tratamento com metamfetamina pode restaurar o ritmo circadiano de atividade
locomotora, em animais que tiveram o seu NSQ lesionado eletronicamente (Honma
16
et al., 1987), indicando assim que drogas dopaminérgicas podem modular o sistema
circadiano mesmo na ausência do relógio circadiano central.
Apesar da vasta demonstração das alterações circadianas durante a
evolução da DP, na literatura, as alterações neuroquímicas e morfológicas nas
estruturas do sistema de temporização dos ritmos circadianos ainda são
negligenciadas (Videnovic e Golombek, 2013).
1.3 Modelos animais de DP
A etiologia da DP é desconhecida em grande parte dos pacientes, porém,
acredita-se que o distúrbio decorra de uma combinação multifatorial,
compreendendo tanto elementos genéticos, quanto ambientais (Kandel et al., 2014).
Nesse sentido, os modelos animais de DP têm se mostrado altamente eficazes na
busca de pistas sobre a causa subjacente da doença, bem como no desenvolvimento
de novas estratégias terapêuticas e na compreensão da natureza dos processos
patogênicos envolvidos na perda neuronal (Duty e Jenner, 2011).
Muito embora o parkinsonismo para o qual uma clara etiologia genética
possa ser atribuída represente apenas 8-10 % de todos os casos diagnosticados de
DP, significantes achados a respeito do conhecimento e da classificação da
patologia vêm sendo obtidos nas pesquisas com modelos genéticos. Neste contexto,
incluem-se novas descobertas relacionadas a casos de parkinsonismo familiar, como
por exemplo, formas hereditárias da doença causadas pela mutação de genes que
seguem um modo autossômico dominante de transmissão - incluindo alfa-sinucleína
e Quinase rica em repetição de leucina 2 - e genes autossômicos recessivos como
17
Parkin, identificado como principal causador de Parkinsonismo de início precoce
(Wider et al., 2010a,b; Bury e Pienaar, 2013).
Atualmente, existem modelos animais genéticos de DP em diferentes
organismos-modelo, incluindo roedores, Drosophila melanogaster e Caenorhabditis
elegans (Moore et al., 2005). Tais modelos oferecem a vantagem de analisar
minuciosamente a atuação de genes e proteínas implicados na DP, fornecendo
assim, robustas evidências moleculares e bioquímicas sobre a patologia em questão.
As técnicas empregadas nos modelos genéticos baseiam-se, sobretudo, na
superexpressão gênica autossômica dominante ligada ao parkinsonismo e no
desenvolvimento de linhagens de animais transgênicos knock-in/knock-out para
determinados genes autossômicos recessivos, relacionados às formas hereditárias
recessivas da doença (Dawson et al., 2010; Kurz et al., 2010; Li et al., 2010). Os
animais knock-out transportam um gene que foi funcionalmente inativado para criar
uma diminuição na expressão e perda da função, enquanto que os knock-in são
produzidos através da inserção de um gene em um locus exato onde fica
superexpresso. Ambos os mecanimos decorrem da introdução artificial de uma
mutação especificamente relacionada à DP no DNA de células germinativas, por
meio de recombinação homóloga, utilizando células-tronco embrionárias injetadas
em blastocistos. Esta é então repassada às gerações seguintes através da
reprodução dos animais (Bury e Pienaar, 2013).
Por outro lado, uma ampla gama de modelos animais farmacológicos
encontra-se também disponível para o estudo da DP. Estes permitem que várias
características fenotípicas da doença humana possam ser mimetizadas em animais,
especialmente roedores, e envolvem, na sua grande maioria, a administração aguda
18
de substâncias neurotóxicas, tais como reserpina, haloperidol, rotenona, paraquat,
6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP).
No modelo do haloperidol, esta substância é administrada de forma aguda
e após 60 minutos os animais passam a manifestar sintomas como rigidez muscular
e catalepsia (Sanberg, 1980). O haloperidol age ao antagonizar receptores
dopaminérgicos do tipo D2 e em menor extensão os do tipo D1 nos neurônios
espinhosos médios que compõem as vias indireta e direta do circuito motor,
respectivamente, levando ao aparecimento dos déficits motores observados nos
animais. Outro estudo demonstrou ainda que a administração aguda de haloperidol
reduz o teor de dopamina, noradrenalina e serotonina no estriado (Kulkarni et al.,
2009). Nesse modelo, a eficácia de novos agentes anti-parkinsonianos é avaliada
através da inversão da rigidez e/ou da catalepsia.
No modelo da 6-OHDA, a caracterização do análogo hidroxilado da
dopamina (6-OHDA) como uma toxina indutora de degeneração de neurônios
dopaminérgicos no trato nigro-estriatal, o tornou um modelo largamente utilizado na
indução do parkinsonismo em roedores (Ungerstedt, 1968). Neste modelo, a 6-
OHDA é injetada diretamente no trato nigro-estriatal, onde no interior dos neurônios
dopaminérgicos inicia o processo de degeneração através da combinação de
estresse oxidativo e disfunção respiratória mitocondrial. O modelo 6-OHDA também
imita muitas das propriedades bioquímicas características da DP, incluindo redução
dos níveis de dopamina e tirosina hidroxilase no estriado (enzima limitante no
processo de biossíntese da dopamina). Dados obtidos permitem sugerir a existência
de uma ligação entre a patogênese da 6-OHDA e da DP, pois após a detecção de 6-
OHDA no estriado e na urina de pacientes de Parkinson tratados com L-dopa
(Andrew et al., 1993), foi constatado que a 6-OHDA pode representar um
19
componente endógeno da DP ou ainda, que pode desempenhar um importante papel
no processo de estresse oxidativo aumentado e na degeneração acelerada de
células da substância negra residual em pacientes que receberam L-dopa (Müller et
al., 2004).
MPTP (1-metil-4-fenil-1-2-3-6-tetraidropiridina) é uma neurotoxina potente
usada para mimetizar a DP em uma ampla gama de organismos, incluindo primatas
não-humanos , porcos-da-índia , ratos , e gatos ( Chiueh et al , 1984; Schneider et al.,
1986; Meredith et al., 2008) . Por ser lipofílico, o MPTP atravessa rapidamente a
barreira hematoencefálica e é convertido no metabólito tóxico MPP+. Uma vez
acumulado em neurónios dopaminérgicos , o MPP + induz a neurotoxicidade,
principalmente através da inibição do complexo I da cadeia de transporte de elétrons
mitocondrial, resultando na depleção de ATP e aumento do estresse oxidativo (Nicklas
et al., 1985; Mizuno et al., 1987).
Roedores tratados com reserpina constituíram um dos primeiros modelos
animais utilizados na pesquisa da DP, sendo este modelo fundamental na primeira
demonstração da eficácia terapêutica do que ainda continua a ser o tratamento
padrão-ouro para DP, a L-dopa (Carlsson et al., 1957). Do ponto de vista da doença,
o modelo da reserpina também fez contribuições importantes para a nossa
compreensão da relação entre a depleção de monoaminas e os sintomas
parkinsonianos.
A reserpina age inibindo os transportadores vesiculares de monoaminas,
VMAT1 e 2. Isto leva à perda de capacidade de armazenamento e, por conseguinte,
o esgotamento de monoaminas cerebrais e periféricas, incluindo noradrenalina,
serotonina e dopamina, já tendo sido observado que a reserpina produz cerca de
85% de perda dopaminérgica na SNpc e mais de 95% de depleção de dopamina no
20
corpo estriado 2h após a injeção (Heeringa e Abercrombie, 1995). Do ponto de vista
comportamental, a reserpina induz características de acinesia e rigidez dos membros
posteriores em ratos que são representativos dos sintomas associados à DP.
Estudos sobre a DP fazem uso da administração aguda de reserpina para
induzir o parkinsonismo farmacológico temporário, obtendo sintomas como
catalepsia, tremores e rigidez muscular (Kaur e Starr, 1995; Nakagawa et al., 1997).
Em tais trabalhos, a dose de reserpina empregada, geralmente, promove
comprometimento motor grave, excluindo a possibilidade de outras análises
comportamentais, incluindo tarefas cognitivas. No entanto, alguns estudos
demonstraram comprometimento da memória, na ausência de alterações motoras
após a administração de doses únicas mais baixas de reserpina (Carvalho et al.,
2006; Fernandes et al., 2008).
Estudo realizado por Fernandes et al. (2012) mostrou que a administração
repetida de uma dose baixa (0,1 mg/kg) de reserpina induz um aparecimento gradual
de sinais motores de parkinsonismo farmacológico em ratos. Em um trabalho
posterior, Santos et al. (2013) demonstraram que o tratamento repetido com
reserpina (0,1 mg/kg) induziu uma perda de memória antes do aparecimento gradual
dos sinais motores, como também causou o aumento da ansiedade nos animais
tratados, uma característica observada em pacientes com DP. Portanto, o modelo
de administração repetida de reserpina apresenta uma validade de face estendida
quando comparado a outros modelos animais da doença, sendo capaz de imitar a
natureza progressiva dos sintomas na DP, de tal forma que pode ser utilizado para
os estudos da plasticidade e dos mecanismos subjacentes à doença. Assim sendo,
o presente trabalho usará como modelo de parkinsonismo farmacológico o
tratamento com reserpina em baixa dose (0,1mg/kg) para avaliação da
21
patogenicidade subjacente aos sintomas não-motores da doença, mais
especificamente sobre o perfil de sono/vigília, utilizando para tanto um modelo em
caráter crônico, que ainda é pouco explorado na literatura.
22
2. JUSTIFICATIVA
Os sintomas não-motores são exibidos com alta frequência na DP, afetando
negativamente a qualidade de vida dos pacientes e seus cuidadores. Inúmeros
estudos têm mostrado que o aparecimento de tais sintomas pode preceder o
surgimento dos sintomas motores clássicos, utilizados para diagnóstico na clínica e,
desta forma, o reconhecimento aliado a um maior entendimento sobre os sintomas
não-motores teria implicações importantes para a melhoria do diagnóstico e
tratamento precoce da DP. Uma possível disfunção circadiana subjacente tem sido
apontada como uma das múltiplas causas de muitas dessas desordens não-motoras,
tais como os distúrbios do sono e alterações autonômicas. Contudo, apesar da
possível importância do sistema -circadiano na patogênese dos sintomas não-
motores da DP, pouco tem sido explorado a respeito desse tema na literatura,
principalmente quando se trata da utilização de modelos crônicos para o estudo
dessa patologia.
De forma adicional, levando-se em consideração ainda o envelhecimento do
sistema circadiano, torna-se interessante o estudo do aparecimento dos sintomas
parkinsonianos – tanto motores quanto não-motores – entre indivíduos mais velhos.
Assim, no presente trabalho, utilizamos um modelo animal crônico para a
Doença de Parkinson (Modelo da Reserpina). Realizamos a análise comportamental
do perfil de sono/vigília apresentado pelos animais nesse modelo, bem como, uma
análise neuroquímica dos principais componentes do NSQ, comparando animais
jovens (6 meses) e de meia idade (10 meses) para avaliar também o possível efeito
da idade sobre os parâmetros analisados.
23
3. OBJETIVOS
- Objetivo Geral
O presente estudo visa promover a avaliação comportamental do perfil de
sono/vigília em um modelo animal crônico para a doença de Parkinson, comparando
com possíveis alterações neuroquímicas no núcleo supraquiasmático.
- Objetivos Específicos
• Avaliar o padrão de sono/vigília apresentado pelos animais ao longo da
progressão da doença;
• Fazer uma correlação entre os comportamentos observados durante o
estabelecimento do modelo animal de Parkinson com os resultados obtidos
através das análises imunoistoquímicas no NSQ desses animais.
• Analisar o conteúdo neuroquímico dos neurotransmissores VIP, VP, e NPY
no NSQ através da técnica de imunoistoquímica, comparando animais
tratados com controles.
24
4. HIPÓTESES E PREDIÇÕES
Hipótese 1: O tratamento crônico com reserpina promove perturbações nos padrões
normais de sono e vigília.
Predição 1: Devido a depleção de monoaminas ocasionada pela reserpina, os
processos regulados pelo sistema ativador reticular ascendente (SARA) -
responsável por promover a vigília - dependentes da participação de sistemas
monoaminérgicos, são alterados.
Hipótese 2: O NSQ apresenta alterações neuroquímicas decorrentes do tratamento
crônico com reserpina.
Predição 2: Com o estabelecimento do processo patogênico ocorre uma diminuição
dos componentes neuroquímicos no núcleo supraquiasmático, que podem alterar o
papel funcional dessa estrutura na geração e manutenção dos ritmos biológicos.
Hipótese 3: Mudanças no comportamento de sono/vigília correlacionam-se a
alterações no NSQ decorrentes da exposição ao tratamento crônico com reserpina.
Predição 3: Devido a interferência no NSQ, diversos ritmos biológicos regulados por
essa estrutura podem se mostrar alterados, dentre eles, os ritmos de atividade
locomotora e ciclo sono/vigília.
25
5. METODOLOGIA
5.1.Sujeitos e design experimental
Foram utilizados, no total, 25 ratos Wistar machos (320-480g), com idades de
6 (n=17) e 10 (n=8) meses, acomodados em gaiolas plásticas equipadas com
bebedouro, tampa de grade com suporte para a ração e cama de maravalha. Os
animais foram expostos a ciclo claro/escuro 12h:12h, com luzes acesas às 06h30 e
tiveram acesso ad libitum a água e ração (Labina- Purina®). Todas as gaiolas foram
colocadas dentro de uma sala livre de interferências externas, local em que foram
mantidas durante todo o período experimental e onde foram realizados os testes. Os
procedimentos experimentais usados nesse estudo foram aprovados pelo Comitê de
Ética para Uso Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob o
protocolo nº 017/2015.
A droga utilizada foi a reserpina (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO),
dissolvida em ácido acético glacial e água destilada. O Veículo consistiu na mesma
quantidade de ácido acético e água destilada como na solução de reserpina. Estas
soluções foram injetadas por via subcutânea (sc). Os animais foram submetidos a
um período de habituação no qual foram manuseados durante 10 min por 5 dias,
antes do início dos procedimentos experimentais. Posteriormente, os ratos foram
divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo de animais controle com 6 meses
de idade (CTR6M: n =8), grupo de animais tratados com reserpina com 6 meses de
idade (RES6M: n =9), grupo de animais controle com 10 meses de idade (CTR10M:
n=4) e grupo de animais tratados com reserpina com 10 meses de idade (RES10M:
n=4). Os animais receberam injeções subcutâneas de veículo (CTR6M/ CTR10M) ou
0,1 mg / kg de reserpina (RES6M/RES10M), em um volume de 1 ml / kg de peso
26
corporal, a cada dois dias (10 injeções). Os ratos de todos os grupos foram
sacrificados 48 h após a 10ª injeção. O procedimento experimental está
esquematizado na figura 4.
5.2. Procedimentos experimentais
5.2.1. Teste de catalepsia
Todos os animais foram submetidos ao teste antes da 1ª injeção e, posteriormente,
a cada dois dias, uma hora antes de cada injeção. O comportamento de catalepsia
foi avaliado colocando-se o animal com ambas as patas dianteiras sobre uma barra
horizontal de vidro elevada 9,0cm da superfície de apoio das patas traseiras. O tempo
que cada animal permaneceu nessa posição foi quantificado em segundos, até um
limite de 180 s. Foi utilizado o valor da média de três exposições realizadas
consecutivamente.
5.2.2.Registros Cronobiológicos
Coleta de dados comportamentais de sono
Nesta etapa do delineamento experimental todos os animais foram filmados por um
sistema de câmera de vídeo (Webcam HD 720P C270 Logitech). O estado de sono
foi identificado por comportamentos facilmente observados e bem descritos na
literatura, que incluem a adoção de uma postura de sono espécie específica com os
olhos fechados (Campbell e Tobler, 1984; Nicolau et al., 2000). Dessa forma,
identificamos os animais em estado de sono somente quando exibiram
27
simultaneamente os seguintes comportamentos: estavam posicionados de lado ou
curvados com a cabeça voltada para seu ventre, seus olhos estavam fechados e se
não fizeram nenhum movimento além de breves alterações transitórias na postura
por pelo menos 40s (Schwatz e Smale, 2005; Loh et al., 2010; Kudo et al., 2011). O
comportamento de sono/vigília foi gravado diariamente durante todo o período de
tratamento e analisado visualmente em janelas de 5min. Para fins de análise, cada
dia foi dividido em quatro intervalos iguais: intervalo 1(ZT0-ZT6), intervalo 2 (ZT6-
ZT12), intervalo 3(ZT12-ZT18) e intervalo 4(ZT18-ZT24), sendo ZT0 o momento em
que as luzes eram acesas (06h30). As janelas em que os animais apresentaram
comportamento de sono foram somadas e utilizadas para determinar a quantidade
total de tempo de sono em cada intervalo.
Análise da distribuição temporal de sono 12-12h (Dias 6-8)
Além do registro do comportamento de sono nos 4 intervalos diários, foi realizada
uma análise acerca do tempo total de sono a cada 12h, iniciando às 0h do 6º dia de
tratamento até as 23h59 do 8º dia. Foram utilizados os mesmos parâmetros
comportamentais considerados na etapa anterior para fim de avaliação do estado de
sono. O comportamento de sono/vigília foi analisado visualmente em janelas de
5min. As janelas em que os animais apresentaram comportamento de sono foram
somadas e utilizadas para determinar a quantidade total de tempo de sono a cada
12h.
28
Avaliação da fragmentação do sono
Através da análise dos vídeos também procuramos observar o aspecto de
fragmentação do sono, tanto dos animais tratados com reserpina quanto dos animais
dos grupos controle. Para tanto, foi realizada a contagem da quantidade de
despertares que cada animal apresentou por dia. Ao final de cada dia, as médias de
cada grupo experimental foram calculadas, servindo de base para o cálculo das
médias gerais exibidas por cada grupo no fim do período experimental.
5.2.3. Perfusões e Microtomia
Após a finalização dos testes comportamentais, todos os ratos foram anestesiados
por via intraperitoneal (i.p.) utilizando tiopental na dose de 90 mg/kg de peso do
animal. Em seguida foram perfundidos transcardicamente com a impulsão de
solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Liquemine,
Lilly, 2 ml/1000ml de solução salina) com o objetivo de lavar o sistema circulatório do
animal prevenindo a formação de coágulos e possibilitando a melhor penetração do
fixador nos tecidos. Em seguida foi introduzida solução fixadora (paraformaldeído a
4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, acrescido de ácido pícrico a 0,2% e
glutaraldeido a 0,2%) através de uma bomba peristáltica. Os encéfalos foram
retirados da cavidade craniana, por fratura dos ossos da calota craniana, em seguida
pós-fixados na mesma solução fixadora, acrescida de sacarose a 30% por 4 horas e
então colocados em outra solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH
7,4, até serem cortados no criostato. Foram obtidas secções frontais de 30 µm, as
quais foram distribuídas sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido
contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada um desses compartimentos recebeu 1
29
de 6 secções, de maneira que a distância entre uma secção e a seguinte seja de
aproximadamente 180 µm. Estes cortes foram armazenados em uma solução
anticongelante a base de etileno-glicol e tampão fosfato, e, posteriormente,
conservados a 4ºC até as reações de imunoistoquímica ou de coloração.
5.2.4. Processamentos do material
Processamento Imunoistoquímico
Séries diferentes foram submetidas à análise imunoistoquímica, empregando o
protocolo ABC (avidina-biotina-complexo peroxidase). Nesta análise, anticorpos
específicos foram usados para identificar a expressão de neurotransmissores (ver
tabela 1). As secções de um compartimento de cada vez foram lavadas (5 vezes de
8 minutos) com tampão fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4, sob agitação automática, e pré-
tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PB por 20 minutos para inativação
da peroxidase endógena. Os cortes foram então colocados em contato com um
anticorpo específico (primário) diluído em PB contendo Triton-X 100 (ICN
Biomedicals) a 0,4% e albumina bovina a 2% durante, aproximadamente, 18 a 20
horas (25ºC). Em seguida, as secções foram colocadas em contato com o anticorpo
secundário biotinilado, diluído em Triton X 100 a 0,4%, por 2 horas. Após esta etapa,
os cortes foram incubados numa solução contendo avidina e biotina (0,5%)
previamente diluída (30 minutos antes) em Triton-X 100, por 2 horas. Para visualizar
a reação, os cortes foram colocados num recipiente em contato com um cromógeno,
uma solução de diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St Louis, MO, USA) a 2,5% diluída
30
em PB (0,1M / pH 7,4). A reação final foi revelada adicionando-se uma solução
contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,03% como substrato.
Tabela 1: Listagem de anticorpos. Ticorpos
5.3. Captação dos dados
Os cortes foram montados em lâminas de vidro previamente gelatinizadas com
gelatina-alúmem-cromo. Após secarem à temperatura ambiente, as lâminas foram
mergulhadas em uma solução de tetróxido de ósmio a 0,05%, por 30 segundos, para
intensificação da reação. Posteriormente, passaram pelos processos de
desidratação em álcoois de concentrações gradativamente maiores e
deslipidificação com xilol, e, em seguida, foram cobertas com lamínulas usando-se
DPX. A avaliação dos resultados imunoistoquímicos foi realizada com o auxílio de
um microscópio óptico (Olympus, BX-41) utilizando campo claro ou escuro conforme
a necessidade. As imagens foram digitalizadas usando uma câmera (Nikon, DXM-
1200) acoplada ao microscópio e conectada a um computador, sendo
Antígeno Anticorpo
Primário
Anticorpo
Secundário
NPY Coelho
[1:1000]
Cabra [1:1000]
VIP Coelho
[1:1000]
Cabra [ 1:1000]
Jackson
VP Coelho
[1 : 1000]
Cabra [1:1000]
Jackson
31
subsequentemente operacionalizadas para ajuste de brilho e contraste com o
programa Adobe Photoshop 7.0.
5.4. Análise estatística
Significâncias estatísticas entre os quatro grupos experimentais para o
comportamento de catalepsia e avaliação da distribuição temporal de sono foram
determinadas por meio de ANOVA para medidas repetidas seguida por post hoc com
teste de Tukey. Para avaliação da fragmentação do sono foi realizada ANOVA de
uma via seguida por post hoc com teste de Tukey. Para todos os testes, os valores
foram considerados significativamente diferentes se p<0,05. As análises foram
realizadas através do IBM SPSS Statistics for Windows (versão 20.0. Armonk, NY).
Valores expressos como média ± desvio padrão da média (D.P.).
Figura 4. Representação esquemática do procedimento experimental.
32
6.RESULTADOS
6.1. Comportamento de Catalepsia
ANOVA para medidas repetidas revelou efeitos significativos do tratamento
(p<0,001), tempo - representado pelos dias de tratamento - (p<0,001) e a interação
tratamento x tempo (p<0,001) sobre o comportamento de catalepsia. A
administração repetida de reserpina promoveu um aumento progressivo no tempo
de catalepsia apresentado pelos grupos RES6M e RES10M, que apresentaram
diferenças significativas com relação aos grupos CTR6M e CTR10M,
respectivamente, desde o 12º dia de tratamento (48h após a 6ª injeção) até o 20º dia
de tratamento (48h após a 10ª injeção). Ademais, o grupo RES10M exibiu duração
do tempo de catalepsia significativamente superior ao grupo RES6M, a partir do 16º
dia de tratamento, isto é, 48h após a 8ª injeção (fig. 5).
Figura 5. Efeito (Média±DP) do tratamento com reserpina 0,1mg/kg (grupo RES6M - n=9 e
grupo RES10M - n=4) ou veículo (grupo CTR6M - n=8 e grupo CTR10M - n=4) no
comportamento de catalepsia. Setas indicam injeção de reserpina ou veículo. As diferenças
significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas
seguida por post hoc com teste de Tukey. *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com
relação a CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
33
6.2. Avaliação da distribuição temporal do sono
ANOVA para medidas repetidas mostrou que houve efeito do tratamento, tempo
(representado pelos dias de tratamento) e interação tratamento x tempo sobre o
tempo total de sono em cada um dos intervalos analisados. Intervalo 1 (ZT0-ZT6):
tratamento (p<0,001), tempo (p<0,001), tratamento x tempo (p<0,001); intervalo
2(ZT6-ZT12): tratamento (p=0,003), tempo (p<0,001), tratamento x tempo (p=0,001);
intervalo 3 (ZT12-ZT18): tratamento (p<0,001), tempo (p<0,013), tratamento x tempo
(p<0,001); intervalo 4 (ZT18-ZT24): tratamento (p=0,001), tempo (p<0,001),
tratamento x tempo (p=0,001).
Os resultados revelam que no início da fase de sono (ZT0-ZT6, fig. 6), os
animais do grupo RES6M apresentam maior tempo de sono em comparação ao seu
controle, conforme mostra a figura 6B. Contudo, no ZT6-ZT12 (fig.7), vemos que a
situação se inverte, tendo os animais do grupo CTR6M maior tempo de sono do que
os indivíduos tratados de mesma idade, como pode ser melhor visualizado na figura
10C. No início da fase de atividade dos animais (ZT12-ZT18, fig. 8), percebemos que
não existe diferença significativa no tempo de sono entre os indivíduos dos grupos
CTR6M e RES6M. Porém, no ZT18-ZT24(fig.9), os indivíduos RES6M passam a
exibir maior tempo de sono em comparação ao seu controle, sendo possível
perceber que há um avanço na fase de sono desses animais (fig. 9B).
Adicionalmente, podemos observar que no início da fase de atividade dos animais
(ZT12-ZT18, fig. 8), os grupos CTR10M e RES10M exibem perfis de sono
semelhantes aos grupos CTR6M e RES6M, respectivamente conforme pode ser
visto nas figuras 10C e 10D.
34
Ao comparar os grupos controle, vemos que no início da fase de sono (ZT0-
ZT6, fig.6), os animais de ambos os grupos apresentam menor tempo de sono em
comparação ao final dessa fase (ZT6-ZT12, fig.7. Média do tempo de sono no ZT0-
ZT6 - CTR6M:141±3,8min, CTR10M: 150±4,5min; média do tempo de sono no ZT6-
ZT12 – CTR6M: 218,5±4,5min, CTR10M:187,5±4,2min). Contudo, também podemos
observar que no ZT6-ZT12 o grupo CTR10M apresenta menor tempo de sono em
comparação ao grupo CTR6M. Já durante a fase de atividade (ZT12-ZT18, fig.8), os
animais do grupo CTR10M exibem maior tempo de sono em comparação ao CTR6M.
No que se refere aos grupos tratados com reserpina, foi visto que no início da
fase de sono (ZT0-ZT6, fig.6) ambos os grupos apresentam uma maior
desestabilização no perfil de sono e o grupo RES10M mostra uma queda progressiva
no tempo total de sono com o decorrer do tratamento, conforme pode ser visto na
figura 6C. No final da fase de sono (ZT6-ZT12, fig.7), ambos os grupos tratados com
reserpina mostram sono mais estabilizado ao longo do tratamento, com o grupo
RES10M exibindo tempo de sono significativamente inferior ao grupo ao grupo
RES6M, como demonstrado na figura 7B. Durante a fase de atividade dos animais
(ZT12-ZT18 e ZT18-ZT24, figuras 8 e 9 respectivamente), vemos que o grupo
RES10M apresenta maior tempo de sono em comparação aos animais do grupo
RES6M.
35
INTERVALO 1 (ZT0-ZT6/ 06h30-12h30)
Figura 6. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de sono
(em minutos) no intervalo 1 (ZT0-ZT6). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9; grupo
CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As diferenças
significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas seguida
por post hoc com teste de Tukey *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com relação a
CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
A C
B D
36
INTERVALO 2 (ZT6-ZT12/ 12h30-18:30)
Figura 7. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de sono
(em minutos) no intervalo 2 (ZT6-ZT12). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9; grupo
CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As diferenças
significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas seguida
por post hoc com teste de Tukey *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com relação a
CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
A
B
C
D
37
INTERVALO 3 (ZT12-ZT18/ 18:30-0h30)
Figura 8. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de sono
(em minutos) no intervalo 3 (ZT12-ZT18). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9; grupo
CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As diferenças
significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas seguida
por post hoc com teste de Tukey *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com relação a
CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
A
B
C
D
38
INTERVALO 4 (ZT18-ZT24/ 0h30-06h30)
Figura 9. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de sono
(em minutos) no intervalo 4 (ZT18-ZT24). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9; grupo
CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As diferenças
significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas seguida
por post hoc com teste de Tukey *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com relação a
CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
A
B
C
D
39
Análise da distribuição temporal de sono 12-12h (Dias 6-8)
ANOVA para medidas repetidas revelou efeito significativo do tratamento [F(3,24)
=43,48; p=0,001], tempo - representado pelas horas - [F(5,105) = 57,40; p<0,001] e
interação tratamento x tempo [F(15,105) =58,41; p<0,001].
200
250
300
350
400
450
12h 24h 36h 48h 60h 72h
Tem
po
de
son
o (
min
)
CTR6M CTR10M
*
200
250
300
350
400
450
12h 24h 36h 48h 60h 72h
Tem
po
de
son
o (
min
)
RES6M RES10M
Δ
Δ
A
B
40
Figura 10. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de
sono entre os dias 6-8 (início às 0h do dia 6). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9;
grupo CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As
diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas
repetidas seguida por post hoc com teste de Tukey. *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05
com relação a CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.
200
250
300
350
400
450
12h 24h 36h 48h 60h 72h
Tem
po
de
son
o (
min
)
CTR6M RES6M
* *
**
*
200
250
300
350
400
450
12h 24h 36h 48h 60h 72h
Tem
po
de
son
o (
min
)
CTR10M RES10M
# #
##
D
C
41
6.3. Avaliação da fragmentação do sono
A análise da quantidade de despertares durante o estado de sono por dia, realizada
através de ANOVA de uma via, revelou diferenças significativas entre os grupos
[F(3,24) = 6,49; p=0,003]. Post hoc de Tukey mostrou que o grupo RES6M exibiu
maior número de despertares quando comparado ao grupo CTR6M.
Figura 11. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre a quantidade
de despertares por dia. Grupo CTR6M - n=8, grupo RES6M - n=9, grupo CTR10M - n=4,
grupo RES10M - n=4. As diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por
ANOVA de uma via (post hoc com teste de Tukey). Dados expressos como média±DP.
*p<0,05 com relação a CTR6M.
6.4. Avaliação neuroquímica do NSQ
Ao se comparar qualitativamente as fotomicrografias do NSQ dos animais CTR6M
com os animais RES6M não é possível observar qualquer alteração na expressão
dos componentes avaliados, VIP (fig. 12 A e B); VP (fig. 12 C e D); NPY (fig. 12 E e
F).
42
CTR6M RES6M
CTR6M RES6M
Figura 12. Fotomicrografia em campo claro de secções coronais do encéfalo de ratos CTR6M
(A, C e E) e RES6M (B, D e F), em nível médio, mostrando a imunoistoquímica para VIP (A,
B), VP (C, D) e NPY (E, F). Abreviações: 3v: terceiro ventrículo; qo: quiasma óptico. Barra:
100um.
VP
NPY
qo
A B
C D
F E
VIP
43
7. DISCUSSÃO
7.1. Efeitos motores do tratamento crônico com reserpina
No presente estudo, investigamos os efeitos da administração crônica de
uma baixa dose de reserpina (0,1mg/kg) sobre o ciclo sono/vigília de ratos e sobre
alguns principais componentes neuroquímicos do NSQ.Os dados obtidos com a
avaliação do tempo de catalepsia, 48h após cada injeção, revelaram que o tratamento
foi capaz de induzir um prejuízo motor, de forma gradual, tanto no grupo de animais
tratados com seis meses de idade, quanto nos animais tratados com dez meses.
Estes resultados corroboram com estudos anteriores, nos quais ratos nas idades de
seis e sete meses, submetidos ao mesmo protocolo experimental, também exibiram
déficit motor gradual ao serem avaliados no teste de catalepsia (Fernandes et al.,
2012; Santos et al., 2013).
De maneira adicional, vimos que os animais de ambos os grupos, tratados
com reserpina, começaram a exibir prejuízo motor significativo, com relação ao seu
respectivo controle, no dia 12 (48h após a 6ª injeção), enquanto que em estudos
prévios (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013) essa diferença se deu a partir do
dia 14, isto é, 48h após a 7ª injeção. Visto que o procedimento experimental e forma
de análise utilizados foram similares e, os animais do grupo RES6M possuíam idade
igual ou bastante aproximada à idade dos indivíduos abordados nesses outros
trabalhos, hipotetizamos que esta diferença pode ser justificada pelas próprias
variações individuais naturalmente existentes entre os sujeitos experimentais e tendo
seu comportamento avaliado em dias e ambientes diferentes. Já com relação aos
animais do grupo RES10M, a própria idade dos indivíduos pode ter contribuído para
44
o aparecimento dos efeitos motores mais precocemente. Ademais, notamos que a
partir do dia 16 o grupo RES10M exibiu tempo de catalepsia significativamente
superior ao grupo RES6M, indicando assim que além do dano causado pela
reserpina, a idade também pode ter atuado como um agravante para o maior
comprometimento motor nos animais de 10 meses de idade (Rasmussen et al., 1999;
Rex Et al., 2005).
A reserpina inibe os transportadores vesiculares de monoaminas, VMAT1 e
2, impedindo a captação dessas moléculas para as vesículas de armazenamento, o
que resulta na depleção de monoaminas nos terminais axônicos, tanto centrais
quanto periféricos. Esta redução está intimamente relacionada ao desenvolvimento
dos sintomas motores observados neste estudo, assim como ocorre na clínica da DP,
onde a depleção da dopamina estriatal provoca o desenvolvimento de características
motoras como bradicinesia e rigidez (Decressac e Barker, 2012).
Estudo realizado por Patil et al.(2012), no qual ratos Wistar foram tratados
com reserpina (1mg/kg) a cada dois dias durante cinco dias, demonstrou que o
fármaco foi capaz de induzir catalepsia nos animais de forma tempo-dependente.
Neste trabalho, observou-se que o pré-tratamento com vitamina E (10mg/kg), um
potente antioxidante, inibiu significativamente a catalepsia induzida pelo tratamento
com reserpina. Além disso, nesse mesmo estudo foi visto que animais tratados com
reserpina exibiram aumento nos níveis de peroxidação lipídica e níveis reduzidos de
enzimas antioxidantes, como catalase e superóxido dismutase, sugerindo assim a
geração de radicais livres e consequente aumento do estresse oxidativo. De fato,
diversos estudos já demonstraram que o tratamento com reserpina eleva os níveis
de estresse oxidativo no cérebro (Abílio et al., 2003; Teixeira et al., 2008),
notadamente em virtude do metabolismo de dopamina no citoplasma celular,
45
sugerindo-se que esse mecanismo pode estar relacionado ao dano neuronal
envolvido com o efeito prejudicial da reserpina sobre a função motora.
É sabido que com o envelhecimento do cérebro, há um aumento na formação
e liberação de espécies reativas de oxigênio, com consequentes alterações estruturais
e funcionais na membrana celular, aumento da oxidação de proteínas e danos ao
DNA. Tendo isso em vista, inúmeros estudos foram realizados no intuito de avaliar se
o avançar da idade também afeta a resposta do sistema de defesa antioxidante
enzimático celular contra o estresse oxidativo exógeno (Benzi et al., 1989; Benzi et
al., 1990; Ochi, 1993). Foi verificado que o estresse oxidativo induzido em animais de
diferentes idades, pode ocasionar diferentes efeitos em diferentes regiões cerebrais,
dependendo do tipo de agente oxidante utilizado. Ao analisar os efeitos da
administração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e do cicloexano, observou-se que
ambos reduzem a concentração de glutationa reduzida (GSH) no prosencéfalo de
ratos Wistar adultos em comparação a jovens (H202: -23% e cicloexano: -38%). Além
disso, foi observado que outro agente indutor de estresse oxidatico, o terc-butil-
hidroperóxido, promoveu uma depleção considerável nos níveis de GSH em diversas
regiões cerebrais de ratos adultos em comparação a jovens, tendo efeito mais
marcante no corpo estriado (Adams et al., 1993; Benzi e Moretti, 1995). Assim, o
aumento dos níveis de estresse oxidativo ocasionado pela reserpina associado aos
danos oxidativos resultantes do próprio envelhecimento cerebral, podem justificar o
prejuízo motor mais pronunciado que foi observado entre os animais do grupo
RES10M.
46
7.2 Sintomas não-motores precedem o aparecimento dos sinais motores na DP
Apesar dos indícios motores serem tradicionalmente tratados como foco clínico na
DP, evidências crescentes têm demonstrado que o espectro clínico da doença é mais
amplo, abrangendo também sintomas não-motores que incluem depressão, déficits
cognitivos, desordens autonômicas e distúrbios do sono (Riedel et al., 2010; Erro et
al., 2012). Os sintomas não-motores podem estar presentes em qualquer estágio da
patologia, já tendo sido demonstrado inclusive, que o aparecimento desses sintomas
pode preceder a emergência dos sintomas motores em anos e até décadas, afetando
negativamente a qualidade de vida dos pacientes e, sendo em muitos casos, motivo
de hospitalização (Chaudhuri et al., 2006; Tolosa et al., 2007).
No presente trabalho, observamos que a reserpina promoveu efeitos sobre o
comportamento de sono dos animais por volta do 6º dia de tratamento, enquanto que
os efeitos motores somente foram notados a partir do 12º dia, sendo o primeiro
trabalho a demonstrar esse resultado em um modelo progressivo, visto que os demais
utilizam modelos agudos ou mutantes. Esses resultados corroboram com os achados
obtidos em estudos clínicos da DP (Abbott et al., 2001; O’Sullivan et al., 2008). Em
trabalho realizado por Takahashi, 2013, 469 pacientes japoneses de DP foram
investigados através de questionários de triagem para desordem do sono REM, a qual
é caracterizada por uma perda da atonia muscular esquelética normal, permitindo aos
pacientes executar fisicamente sonhos muito vívidos ou desagradáveis (Olson et al.,
2000). Como resultado, viu-se que o transtorno foi detectado em 146 pacientes (31%),
e em 53 destes, os sintomas de desordem do sono REM precederam o início dos
sintomas motores (Takahashi, 2013). Da mesma forma, outros estudos já sugeriram
que sintomas de desordem do sono REM podem preceder o desenvolvimento dos
47
sinais motores na DP em mais de 40% dos pacientes (Schenck et al., 1996; Chaudhuri
et al., 2006).
De maneira interessante, estudos de imagem realizados em pacientes com
desordem do sono REM, indicaram uma pequena, mas significativa redução na
captação estriatal de dopamina, o que pode ser sugestivo de DP pré-clínica
(Eisensehr et al., 2000). Além disso, Uchiyama et al.(1995) relataram um caso de
autópsia em que se observou a presença de eventuais corpos de Lewy estriatais no
cérebro de um paciente que sofreu com desordem do sono REM durante 20 anos,
mas não exibia nenhuma evidência clínica de DP.
Em estudo realizado por O’Sullivan et al. (2008) buscou-se correlacionar a
apresentação de sintomas não-motores na DP retrospectivamente à confirmação do
diagnóstico clínico-patológico. Usando informações armazenadas em banco de dados
para doenças neurológicas, provenientes de 433 pacientes que posteriormente foram
diagnosticados com DP, viu-se que 21% deles apresentavam algum tipo de sintoma
não-motor, sendo os mais comuns a dor (15%), disfunção urinária (3,9%) , ansiedade
ou depressão (2,5%). Foi observado ainda que a exibição de sintomas não-motores
foi associada a um atraso no diagnóstico da doença, visto que os pacientes que
mostravam esses sintomas foram mais propensos a terem um diagnóstico errôneo
inicialmente e serem encaminhados a médicos de outras especialidades, que não a
neurologia, em comparação aos pacientes que já demonstravam sintomas motores.
Sintomas gastrointestinais são também comuns na DP e podem anteceder o
desenvolvimento da doença . Estudo prospectivo relatado por Abbott et al. (2001),
seguiu os hábitos intestinais de 7000 homens por 24 anos e mostrou que aqueles com
constipação inicial ( < 1 movimento intestinal/ dia ) tiveram um risco três vezes maior
de desenvolver DP após um intervalo médio de 10 anos, em comparação aos
48
individuos que não apresentaram tal sintoma inicialmente. Cersosimo e Benarroch
(2008), revisando o controle neural do sistema gastrointestinal na DP, propuseram
que há um envolvimento precoce do núcleo dorsal vagal e também dos neurônios
intrínsecos do sistema nervoso entérico na DP, o que poderia estar relacionado ao
aparecimento pré-motor da constipação.
A depressão é outro sintoma não-motor associado à DP (Burn, 2002; Remy
et al., 2005). Estima-se que 10-45% dos pacientes com DP sejam afetados por esse
distúrbio, que pode surgir pelo menos em parte, como resultado de dano a
neurotransmissão serotonérgica, bem como, por mecanismos noradrenérgicos e
dopaminérgicos no sistema límbico (Burn, 2002; Remy et al., 2005). Diversos
trabalhos demonstraram que os sintomas de depressão podem anteceder o
desenvolvimento da DP (Nilsson et al., 2001; Schurmann et al., 2002; Lauterbach et
al., 2004). Em estudo comparativo entre pacientes com DP ou distonia realizado por
Lauterbach et al (2004), observou-se que os pacientes com DP tiveram um
diagnóstico primário de fobia simples e uma depressão atípica secundária precedendo
a DP com mais frequência do que os pacientes com distonia.
Nagayama e Kimura (2015) revisando as características de depressão
observada durante a fase pré-clínica da DP, observaram que a maioria dos relatos
indicaram que a depressão precedendo o início da DP foi um fator de risco significativo
para o desenvolvimento da doença. Ainda nesse contexto, um estudo de coorte
retrospectivo mostrou que no momento do diagnóstico da DP, 9,2 % dos pacientes
tinham um diagnóstico de depressão em algum momento na vida, em comparação
com 4,2% dos indivíduos controle (Schurmann et al., 2002).
Disfunções autonômicas representam outro importante achado não-motor
observado precocemente na DP. Buscando avaliar a denervação simpática cardíaca
49
que ocorre na DP, Fujishoro et al.(2008) utilizaram imunoistoquímica para tirosina
hidroxilase (TH) para detectar fibras nervosas simpáticas no epicárdio de 4 controles
normais, 11 casos com corpos de Lewy eventuais e 14 casos de DP. Como resultado,
notou-se que a inervação simpática cardíaca foi significativamente menor nos casos
de DP do que nos controles normais e casos com corpos de Lewy eventuais. Também
foi visto que as fibras TH - imunorreativas correlacionaram com a fase da DP, sendo
que a degeneração simpática cardíaca esteve presente desde a fase pré-sintomática
da donça.
Em conjunto, esses dados reforçam a ideia de que a possibilidade de
diagnosticar a DP de forma precoce, em comparação ao que atualmente é realizado,
permitiria introduzir novas estratégias terapêuticas possivelmente capazes de modular
a evolução da doença em um estágio crucial. Além disso, a identificação dos sintomas
não-motores pode ser crítica para a definição de populações de risco para futuros
estudos de prevenção da DP (Adler e Beach, 2016).
Evidências sugerem que o desenvolvimento precoce dos sintomas não-
motores da DP envolve vários sistemas neuronais e relaciona-se, inclusive, com a
manifestação de sinucleinopatias em estruturas extra nigrais (Wolters e Braak, 2006;
Dickson et al., 2008). Em importante estudo imunoistoquímico realizado por Braak et
al (2003), visando avaliar a progressão dessas sinucleinopatias relacionadas com DP,
observou-se que na DP, as lesões decorrentes de sinucleinopatias (corpos de Lewy
com imunocoloração de alfa- sinucleína) começam a se desenvolver algum tempo
antes do aparecimento da disfunção motora. Através dos resultados, Braak introduziu
o conceito de processo patológico da DP classificado em seis fases cronologicamente
distintas. Por meio dessa classificação é possivel identificar que o acometimento das
sinucleinopatias na substância negra não se torna evidente até o estágio 3, quando
50
então começam a aparecer os primeiros sintomas motores da DP. Anteriormente a
esse estágio, as lesões afetam estruturas do trato olfatório anterior e do sistema
nervoso autônomo, como por exemplo, o sistema nervoso entérico , cardíaco e plexo
pélvico (Hague et al., 1997; Iwanaga et al., 1999). Em seguida, as lesões passam a
afetar os neurônios pertencentes ao sistema de formação reticular, incluindo o núcleo
dorsal da rafe e núcleo reticular do tálamo (ambas responsáveis por regular os
mecanismos de excitação e consciência), bem como o complexo noradrenérgico do
locus coeruleus, responsável pela modulação de mecanismos de atenção , controle
da dor e sono REM (Scherder et al., 2005), contribuindo para o aparecimento de
sintomas não-motores ainda nessa fase, dentre os quais se incluem as alterações no
comportamento de sono.
7.2.1. Sono
O sono é definido como um estado ativo caracterizado pela diminuição da
vigilância e capacidade de resposta que é rapidamente reversível (Arias-Carrión et al.,
2011; Murillo-Rodriguez et al., 2012). Muito se discute a respeito do seu real propósito,
sendo que várias evidências permitem inferir que o sono apresenta importancia
funcional. Dentre estas evidências, se destacam: (1) o sono tem persistido na
evolução; (2) acomodações são feitas para permitir o sono em diferentes ambientes e
estilos de vida; (3) é uma função regulada homeostaticamente (privação do sono é
seguido por compensação do sono); (4) alterações fisiológicas graves resultam da
privação de sono prolongado em animais (Rechtschaffen, 1998; Siegel, 2005).
Estudos revelaram que o sono é regulado por dois processos (Borbely, 1982;
Daan et al., 1984): um processo homeostático (processo S) dependente do sono e da
vigília - aumenta durante a vigília e diminui durante o sono, dentro de uma faixa de
51
valor média que oscila com uma periodicidade que normalmente é sincronizada ao dia
e à noite pelo marcapasso circadiano; e um processo controlado pelo marcapasso
circadiano (processo C). O sono é desencadeado quando o processo S se aproxima
do limite superior do C , e a vigília é acionada quando o processo S atinge o limiar
mais baixo. Em condições padrão (sono monofásico), esse processo ocorre duas
vezes a cada ciclo circadiano (Borbely e al., 2016).
Evidências crescentes têm demonstrado que há uma interação entre os dois
processos de regulação do sono (Achermann, 1999; Achermann e Borbely, 2003; Dijk
e Archer, 2010). Dados humanos, obtidos em modelos de protocolo de
dessincronização forçada, mostraram que a amplitude circadiana de muitas funções
neurocomportamentais foi modulada pela pressão do sono homeostático: uma menor
amplitude circadiana foi encontrada quando a pressão do sono foi alta e a amplitude
aumentada quando a pressão do sono foi reduzida (Boivin et al., 1997; Wyatt et al.,
1999). Outras evidências indicam que o sono homeostático e a regulação circadiana
também interagem a nível molegular/genético (Deboer, 2007; Franken, 2013).
Modelos com animais knockout para os principais genes relógio (Per, Clock, Bmal1,
Cry1, Npas2) mostrou não somente alteração no relógio circadiano, mas também
modificação em marcadores do sono homeostático. Porém, em animais tornados
arrítmicos por lesão do NSQ, o sono homeostático não é interrompido, indicando
assim que os dois processos são regulados separadamente (Tobler et al., 1983;
Trachsel et al., 1992).
No presente trabalho, verificamos os efeitos do tratamento prolongado com
reserpina sobre o comportamento de sono em roedores. Em um primeiro momento,
avaliamos diariamente a distribuição temporal do sono total exibido pelos animais ao
longo do tratamento, dividindo as 24 horas do dia em quatro intervalos: intervalo 1
52
(ZT0-ZT6), intervalo 2 (ZT6-ZT12) , intervalo 3 (ZT12-ZT18) e intervalo 4 (ZT18-ZT24).
Os resultados mostraram que o tratamento com reserpina alterou o tempo total de
sono exibido pelos animais tratados em comparação aos indivíduos controle. No inicio
da fase de sono (ZT0-ZT6), os individuos tratados com reserpina apresentaram maior
tempo de sono em comparação ao controle. Já no final da fase de sono (ZT6-ZT12),
esse comportamento se inverte, tendo os animais controles maior tempo de sono.
Durante a fase de atividade, vimos que no início (ZT12-ZT18) não existem diferenças
no tempo total de sono exibido pelos grupos tratados ou não tratados, porém no final
desta fase (ZT18-ZT24), os animais tratados com reserpina passam a apresentar
tempo de sono mais elevado em comparação ao controle.
Com relação a esse aspecto, nossos resultados divergem de dados obtidos
em trabalhos anteriores. Em estudo realizado por Kudo et al.(2011), avaliou-se a
distribuição temporal de sono em uma linhagem transgênica de ratos com
superexpressão de alfa-sinucleína (ASO), uma molécula cuja mutação é
extensivamente implicada em casos familiares da DP, em comparação a ratos
controle. O tempo total de sono por dia foi determinado pela análise dos mesmos
parâmetros comportamentais utilizados no presente estudo. Os resultados revelaram
uma interação significativa entre o genótipo e o intervalo de tempo considerado, porém
naquele estudo os animais mutantes apresentaram maior tempo de sono ao final do
dia (ZT6-ZT12) quando comparados aos controles e menor tempo de sono ao final da
noite (ZT18-ZT24) em comparação ao controle, sendo contrário ao que foi observado
no estudo atual. Contudo, tanto naquele estudo quanto no atual, foi visto que no início
da fase de atividade (ZT12-ZT18) não existem diferenças no tempo de sono entre os
animais controle e os tratados ou com mutação.
53
Além disso, os dados obtidos com a análise da distribuição temporal do sono
nos permitem observar que no final da fase de atividade (ZT18-ZT24), os animais
tratados com reserpina exibem maior tempo de sono em comparação ao controle.
Este resultado é semelhante ao que frequentemente se observa no aspecto clínico da
doença, no qual os pacientes de DP muitas vezes apresentam sono excessivo durante
o dia, prejudicando suas atividades e o convívio social. Estudos relatam que o sono
diurno excessivo chega a afetar cerca de 50% dos pacientes de DP, atuando como
um marcador pré-motor da doença que pode estar relacionado ao risco aumentado
de desenvolver a patologia (Abbott et al., 2005; Dhawan et al., 2006).
Como discutido anteriormente, o sistema circadiano apresenta influência
sobre o mecanismo de sono e vigília. O núcleo supraquiasmático, principal
marcapasso do sistema de temporização circadiano, apresenta projeções para alguns
sistemas responsáveis pela regulação do sono, como por exemplo, a zona
subparaventricular ventral, cujos neurônios recebem informações necessárias para a
organização de ciclos diários de sono/ vigília, e o núcleo dorsomedial do hipotálamo
(Lu et al., 2001; Saper et al., 2005). Projeções eferentes da zona subparaventricular
são integradas no núcleo dorsomedial do hipotálamo e os neurônios dessa região
conduzem os ciclos circadianos de sono, atividade, alimentação e secreção de
corticosteroides (Lu et al., 2001; Saper et al., 2005). O núcleo dorsomedial do
hipotálamo, por sua vez, é a origem das projeções para o núcleo pré-óptico
ventrolateral (VLPO), uma importante região responsável por promover o sono ao
inibir grupos celulares integrantes do sistema ativador reticular ascendente (SARA),
que desencadeia a vigília, bem como para a área hipotalâmica lateral, cujos neurônios
produtores de orexina contribuem para estabilizar o sistema de ativação e manter a
vigília (Saper et al., 2005). Dessa forma, sugere-se que a degeneração neuronal
54
dentro dessas áreas, ainda nos estágios 1 e 2 de Braak, podem explicar o
aparecimento precoce da sonolência diurna excessiva (Chaudhuri e Naidu, 2008).
Através da análise da distribuição temporal do sono, os resultados também
evidenciam que no ZT18-ZT24 (final da fase de atividade) há um avanço na fase de
sono dos animais do grupo RES6M (fig. 9B), corroborando com dados obtidos em
trabalhos anteriores, nos quais outros ritmos circadianos foram também analisados
em modelos animais para DP. Utilizando o modelo com injeção estriatal bilateral de 6-
OHDA, Ben e Bruguerolle (2000) avaliaram possíveis modificações nos ritmos
circadianos de temperatura, atividade locomotora e frequência cardíaca, por
telemetria. Os resultados obtidos demonstraram que a lesão pela 6-OHDA promoveu
modificações nos três ritmos circadianos avaliados, incluindo uma redução
significativa na amplitude do ritmo de frequência cardíaca e avanço de fase nos três
ritmos. Esses dados indicam que tanto em nosso estudo quanto no estudo anterior, a
perturbação da ritmicidade circadiana pode estar relacionada com a depleção de DA,
visto que inúmeros trabalhos demonstram que a DA é capaz de modular o relógio
circadiano em diversos níveis (Witkovsky, 2004; Sakamoto et al., 2005; Dorenbos et
al., 2007; Ruan et al., 2008).
Ainda nesse contexto, em outro estudo realizado com o modelo animal de
DP com 6-OHDA (Boulamery et al., 2010), a influência de L-dopa nos ritmos
circadianos de temperatura, frequência cardíaca e atividade locomotora em ratos foi
avaliada após lesão estereotáxica com 6-OHDA. Notou-se que quando a ritmicidade
circadiana foi abolida, o tratamento com L- dopa melhorou ou acelerou a recuperação
dos ritmos, sendo o efeito mais pronunciado para o ritmo de frequência cardíaca. Já
quando os ritmos circadianos não foram abolidos, mas perturbados, o tratamento
com L- dopa não melhorou as mudanças induzidas por 6-OHDA nos ritmos de
55
temperatura e atividade locomotora, porém um efeito significativo foi observado para
o ritmo de frequência cardíaca. Esses resultados indicam que a administração de L-
dopa não é capaz de equilibrar totalmente a depleção de DA, contudo mostram que
alterações nos ritmos podem ser parcialmente revertidas pela infusão de L-dopa.
Os resultados revelam que no início da fase de sono (ZT0-ZT6, fig. 6), os
animais do grupo RES6M apresentam maior tempo de sono em comparação ao seu
controle (fig. 6B). Contudo, no ZT6-ZT12 (fig.7), vemos que a situação se inverte,
tendo os animais do grupo CTR6M maior tempo de sono do que os indivíduos
tratados de mesma idade (fig. 10C). Sabendo-se que o sono promove claramente
um efeito revigorador sobre o cérebro (Saper et al., 2005), nossos dados sugerem
que os indivíduos RES6M possuem sono revigorador logo no início da fase de sono,
enquanto que os CTR6M mais tardiamente. Isso pode ser modulado pelo
componente homeostático de regulação do sono, o qual busca uma recuperação até
um determinado ponto de ajuste quando é perturbado. Logo, os animais RES6M ao
serem privados de sono no final da fase de atividade, irão buscar a restauração da
homeostase do sistema, exibindo um tempo maior de sono precocemente. Estudos
com eletroencefalograma (EEG) demonstraram que após um período de privação de
sono, o sono NREM é tipicamente exibido primeiro, sendo a atividade de ondas
lentas exibida no EEG de sono NREM o principal marcador do processo
homeostático durante o sono (Dijk et al., 1990; Borbely et al., 2016).
Nossos resultados também permitem notar que durante a fase de atividade
(ZT12-ZT18 e ZT18-ZT24, figuras 8 e 9 respectivamente), o grupo RES10M apresenta
maior tempo de sono em comparação aos animais do grupo RES6M, evidenciando
não só o efeito do tratamento com reserpina sobre o perfil normal de sono dos
indivíduos, como também o efeito da idade sobre este aspecto. De fato, com o
56
envelhecimento, muitos aspectos do sistema de regulação circadiana sofrem
modificações, podendo contribuir para a maior incidência de perturbações do sono -
como por exemplo a sonolência diurna excessiva - em indivíduos idosos,
principalmente naqueles que apresentam doenças neurodegenerativas como
agravante (Van Someren, 2000).
Analisando-se a fragmentação do sono, observamos que o grupo RES6M
apresentou maior quantidade de despertares em comparação ao seu controle, fato
não observado entre os animais do grupo RES10M e CTR10M. Hipotetizamos que o
baixo número de sujeitos nestes grupos tenha contribuído para a ausência de
diferença significativa. O aumento na fragmentação do sono constitui outro importante
achado clínico frequentemente visto entre os pacientes de DP (Bjornara et al., 2014).
Estudos mostram que a sonolência diurna excessiva com cochilos frequentes e os
chamados “ataques de sono”' têm sido relatados em 15-50 % dos pacientes
(Hobson et al., 2002; Brodsky et al., 2003, além de já ter sido evidenciada a presença
de distúrbios noturnos na DP, como o sono noturno fragmentado (Arnulf et al., 2002;
Rye et al., 2004). Em trabalho realizado por Prudon et al., 2014, buscou-se avaliar a
prevalência de distúrbios do sono em pacientes recentemente diagnosticados com DP
em comparação a indivíduos saudáveis, e como resultado, foi visto que houve
aumento na quantidade de cochilos diurnos apresentados pelos pacientes com DP,
reafirmando assim a alta prevalência desse sinal clínico no Parkinson.
Tais distúrbios do sono evidenciados na DP assemelham-se aos principais
sintomas da narcolepsia (Arnulf et al., 2000; Overeem et al., 2001), uma doença
crônica caracterizada por sonolência diurna excessiva e “súbitos episódios de sono”,
causada pela perda de neurônios produtores de hipocretina/orexina (Peyron et
al.,2000; Saper et al., 2005). Dessa forma, é possível que o aparecimento da
57
fragmentação do sono na DP esteja relacionado à neurodegeneração no sistema
hipocretina/orexina. Os neuônios produtores de orexina estão localizados na área
hipotalâmica lateral e possuem projeções ascendentes para o córtex cerebral, bem
como projeções descendentes para todos os grupos celulares monoaminérgicos e
colinérgicos integrantes do SARA, responsáveis por promover e manter a vigília
(Saper et al., 2005). Neste sentido, trabalhos já relataram perda significativa de
neurônios produtores de hipocretina no hipotálamo de pacientes com DP em
comparação a indivíduos saudáveis (Fronczek et al.,2007; Thannickal et al., 2007),
com um deles mostrando uma associação significativa entre a perda de células
produtoras de hipocretina e a gravidade da doença (Fronczek et al., 2007).
7.3. Avaliação neuroquímica do NSQ
Neste trabalho, buscamos investigar a ocorrência de possíveis alterações
na composição neuroquímica do NSQ após o tratamento crônico com reserpina.
Avaliamos qualitativamente a presença de NPY, VIP e VP no NSQ de ratos tratados
com 6 meses em comparação com animais controle de mesma idade. Nossos
resultados não evidenciaram diferenças significativas entre os animais tratados e os
não-tratados com relação à nenhuma das substâncias pesquisadas. Contudo, dados
presentes na literatura revelam o envolvimento de tais substâncias em mecanismos
implicados na patogênese da DP em outras estruturas cerebrais (Sundquist et al.,
1983; Stoddard et al., 1991; Delgado e Ganea, 2003).
O NPY é amplamente expresso em todo o sistema nervoso central, onde
exerce importantes funções fisiológicas, bem como participa de processos implicados
58
em condições patológicas como nas doenças neurodegenerativas (Decressac e
Barker, 2012). Estudos anatômicos e funcionais revelaram que o NPY interage com o
sistema dopaminérgico: Vuillet et al.(1989) examinando a relação estrutural entre as
projeções nigroestriatais e nerônios NPY no estriado de ratos observaram contatos
sinápticos diretos, corroborando os achados obtidos em estudos anteriores, nos quais
após denervação dopaminérgica no estriado, usando 6-OHDA houve um aumento
significativo no número de neurónios NPY no estriado e no núcleo accumbens
(Kerkerian et al., 1986; Salin et al., 1990). Utilizando outro modelo neurotóxico de DP
com MPTP, foi observado um aumento semelhante no número de neurónios NPY no
estriado de camundongos (Obuchowicz et al., 2003). Estes estudos demonstraram
que a via dopaminérgica nigroestriatal regula neurônios NPY do estriado, enquanto
outros estudos farmacológicos demonstraram que o mecanismo inverso também
ocorre. Kerkerian-Le Goff et al.(1992) demonstraram que a injeção
intracérebroventricular de NPY induz um aumento dose-dependente na liberação de
dopamina no estriado, assim como Adewale e colaboradores (2005, 2007) mostraram
que a administração de NPY diretamente no estriado promove a síntese e liberação
de dopamina. Em consonância com as observações feitas nos modelos animais, foi
visto que cérebros de pacientes de DP também apresentam um aumento no número
de células que expressam o NPY , especialmente no núcleo caudado e putâmen
(Cannizzaro et al., 2003). Estudos visando avaliar os efeitos do NPY em culturas de
células e modelos animais de DP revelaram que o NPY foi capaz de proteger
neurônios dopaminérgicos contra a toxicidade induzida pela 6-OHDA tanto in vitro
quanto in vivo (Decressac et al., 2011), indicando assim uma possível ação
neuroprotetora do NPY na DP.
59
Evidências têm demonstrado as propriedades neuroprotetoras de VIP
(Brenneman e Eiden, 1986; Gozes et al., 1987; Festoff et al., 1996). Delgado e Ganea
(2003a) mostraram que VIP pode proteger contra inflamações induzidas pela
endotoxina bacteriana lipopolissacarídeo (LPS) em neurônios embrionários de rato. O
tratamento com LPS normalmente resulta em profunda perda de células neuronais, o
que pensa-se ser mediado pelo aumento da ativação da microglia. Logo, VIP
provavelmente impede a neurodegeneração pela desativação da microglia e da
produção de mediadores pró-inflamatórios pela ligação ao receptor de VIP tipo 1
(VPAC1) (Delgado e Ganea, 2003a). Isso tem importantes implicações terapêuticas,
já que a perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é uma causa primária
da PD. Em um estudo utilizando um modelo animal de DP, a administração sistêmica
de VIP foi bem-sucedida na reversão dos déficts motores, mas não impediu o declínio
nos níveis de dopamina do estriado. Além disso , foi observado que o VIP foi capaz
de preservar os neurônios possivelmente por induzir a secreção de agentes
neuroprotetores pelos mastócitos cerebrais, tais como o fator de crescimento do nervo
(Tunçel et al., 2005; Korkmaz et al., 2009). Em um estudo similar usando nodelo
animal de DP, o tratamento com VIP diminuiu significativamente a perda neuronal
dopaminérgica na substãntia negra (Delgado e Ganea, 2003b). Mais uma vez ,
verificou-se que as capacidades terapêuticas do VIP foram conduzidas através da
desativação da microglia mediada por VPAC1 e a subsequente produção de
mediadores citotóxicos, tal como interleucina 1β e fator de necrose tumoral α.
VP afeta o metabolismo de catecolaminas em núcleos específicos do cérebro
(Tanaka et al. 1977). Neste sentido, estudos realizados com o fator inibidor da
liberação do hormônio estimulante de melanócito, um composto com a mesma
estrutura química de VP, evidenciaram que o referido composto foi capaz de aumentar
60
a síntese de DA no sitema dopaminérgico nigroestriatal e potencializar alterações
comportamentais induzidas por L-dopa em animais (Van Ree et al., 1978). Além
disso, em ensaios clínicos o fator inibidor da liberação do hormônio estimulante de
melanócito demonstrou atividade antiparkinsoniana e melhorou o desempenho
psicomotor e funções cognitivas em combinação com o tratamento com L-dopa
(Gerstenbrand et al., 1978; Schneider 1978), sugerindo assim que o tratamento com
VP também possa exibir efeitos antiparkinsonianos.
Quando focamos especialmente no NSQ e na DP, não há trabalhos na
literatura que demonstrem ou que correlacionem os aspectos neuroquímicos do NSQ
e a DP. Por isso, novos estudos fazem-se necessários para entender o que ocorre no
NSQ para que ele interceda, possivelmente, amplificando os sinais não-motores da
DP (Willison et al., 2013) quando está com algum déficit funcional.
61
8.CONCLUSÕES
- Os resultados demonstram que o tratamento repetido com baixa dose de reserpina
(0,1mg/kg) foi capaz de promover um déficit motor nos animais cronicamente tratados
quando comparados aos indivíduos controle;
- Os achados obtidos nos registros comportamentais de sono mostram que houve um
efeito significativo do tratamento com reserpina sobre o ciclo sono/vigília, incluindo
avanço na fase de sono e aumento na fragmentação do sono;
- Os dados obtidos no presente estudo reiteram a observação de que os sintomas
não-motores precedem o surgimento dos sintomas motores na DP, sendo de extrema
importância o seu reconhecimento para o diagnóstico precoce na clínica;
- Os resultados mostram a eficiência do tratamento com reserpina no estabelecimento
de um modelo progressivo para a DP, reafirmando a importância deste tipo de estudo
para a avaliação do aparecimento gradual de sinais motores do Parkinson induzido
em animais, tal como acontece em humanos.
LIMITAÇÕES DO TRABALHO
Neste estudo, a avaliação neuroquímica foi limitada devido à degeneração dos cortes
durante o processo de imunoistoquímica, em especial devido à fragilidade da
estrutura de interesse (NSQ). Dessa forma, não foi possível realizar a análise
quantitativa de células no NSQ e a medição por densidade óptica dos níveis de
expressão das substâncias estudadas, bem como a análise qualitativa do NSQ dos
animais com 10 meses de idade. Dada à ausência das informações neuroquímicas
quantitativas, não foi realizada a correlação entre os comportamentos motores e de
sono/vigília observados durante o estabelecimento do modelo animal de DP, com os
resultados obtidos através das análises imunoistoquímicas no NSQ dos animais.
62
REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO
Abílio, V.C.; Araujo, C.C.S.; Bergamo, M.; Calvente, P.R.V.; D’Almeida, V.;
Ribeiro, R.A.; Frussa-Filho, R. 2003. Vitamin E attenuates reserpine-induced oral
dyskinesia and striatal oxidized glutathione/reduced glutathione ratio (GSSG/GSH)
enhancement in rats. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological
Psychiatry, 27,109–14.
Abbott, R.D.; Petrovitch, H.; White, L.R. 2001. Frequency of bowel movements and
the future risk of Parkinson’s disease. Neurology, 57,456–462.
Abbott, R.D.; Ross, G.W.; White, L.R.; Tanner, C.M.; Nelson, J.S.; Petrovicth H.
2005. Excessive daytime sleepiness and the future risk of Parkinson’s disease. Mov
Disord 20(Suppl 10), 341.
Achermann, P. 1999. Technical note. A problem with identifying nonlinear interactions
of circadian and homeostatic processes. J. Biol. Rhythms, 14, 602–603.
Achermann, P.; Borbely, A.A. 2003. Mathematical models of sleep regulation. Front.
Biosci. (Landmark edn.), 8, S683–S693.
Adewale, A.S.; Macarthur, H.; Westfall, T.C. 2005. Neuropeptide Y induced
modulation of dopamine synthesis in the striatum. Regul. Pept., 129, 73–78.
Adewale, A.S.; Macarthur, H.; Westfall, T.C. 2007. Neuropeptide Y-induced
enhancement of the evoked release of newly synthesized dopamine in rat striatum:
mediation by Y2 receptors. Neuropharmacology, 52, 1396–1402.
Adler, C.H.; Beach, T.G. 2016. Neuropathological Basis of Nonmotor manifestations
of Parkinson’s Disease. Movement Disorders.
Aminoff, M.J. 2002. Doença de Parkinson e outros distúrbios extrapiramidais. In:
braunwald, E.; Fauci, A.S.; Kasper, D.L.; Hauser, S.L.; Longo, D.L.; Jameson, J.L.
Harrison Medicina Interna. Rio de Janeiro: Mc Graw Hill, p. 2548–56.
63
Andrew, D.G.; Best, S.A.; Midgley, J.M.; Wenlong, H.; Petty, R.K. 1993. The
determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of
parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Research, 18, 1175 – 1177.
Arias-Carrión, O.; Huitrón-Reséndiz, S.; Arankowsky-Sandoval, G.; Murillo-
Rodríguez, E. 2011. Biochemical modulation of the sleep-wake cycle: endogenous
sleep-inducing factors. Journal of Neuroscience Research.,89, 1143–1149.
Arnulf, I; Konofal, E; Merino-Andreu, M; Houeto, J.L.; Mesnage, V; Welter, M.L.
2002. Parkinson’s disease and sleepiness: na integral part of PD. Neurology, 58,
1019-24.
Barclay, J.L.; Tsang, A.H.; Oster, H. 2012. Interaction of central and peripheral
clocks in physiological regulation. Progr Brain Res, 199, 163–81.
Benzi, G.; Pastoris, O.; Marzatico, F.; Villa, R.F. 1989. Age-related effect induced
by oxidative stress on the cerebral glutathione system. Neurochem. Res., 14, 473-
481.
Benzi, G.; Marzatico, F.; Pastoris, O.; Villa, R.F. 1990. Influence of oxidative stress
on the age-linked alterations of the cerebral glutathione system. J. Neurosci.
Res.,26,120-128.
Blonder, L.X.; Slevin, J.T. 2011. Emotional dysfunction in Parkinson's disease.
Behav. Neurol., 24, 201–217.
Bem, V.; Bruguerolle, B. 2000. Effects of bilateral striatal 6-OHDA lesions on
circadian rhythms in the rat: A radiotelemetric study. Life Sciences, 67, 1549-1558.
Bjornara, K.A.; Dietrichs, E.; Toft, M. 2014. Clinical features associated with sleep
disturbances in Parkinson’s disease. Clin Neurol Neurosurg.,124, 37-43.
64
Boivin, D. B.; Czeisler, C. A.; Dijk, D. J. 1997. Complex interaction of the sleep–
wake cycle and circadian phase modulates mood in healthy subjects. Arch. Gen.
Psychiatry,54, 145–152.
Bonaconsa, M.; Colavito, V.; Pifferi, F.; Aujard, F. 2013. Cell clocks and neuronal
networks: neuron ticking and synchronization in aging and aging-related
neurodegenerative disease. Curr Alzheimer Res., 6, 597-608.
Bonuccelli, U.; Del Dotto, P.; Lucetti, C.; Petrozzi, L.; Bernardini, S.;
Gambaccini, G.; Rossi, G.; Piccini, P. 2000. Clin Neuropharmacol., 23(1), 28-33.
Borbely, A.A.; Daan, S.; Wirz-justice, A.; Deboer, T. 2016. The two-process model
of sleep regulation: a reappraisal. J Sleep Res.
Borbely, A.A.; Wirz-Justice, A. 1982. Sleep, sleep deprivation and depression. A
hypothesis derived from a model of sleep regulation. Hum. Neurobiol.,1, 205–210.
Bordet, R.; et al. 2003. Study of circadian melatonin secretion pattern at different
stages of Parkinson’s disease. Clin Neuropharmacol., 26, 65–72.
Boulamery, A.; Simon, N.; Vidal, J.; Bruguerolle, B. 2010. Effects of L-Dopa on
circadian rhythms of 6-OHDA striatal lesioned rats: a radiotelemetric study.
Chronobiol. Int., 27, 251–264.
Bozek, K.; Relogio, A.; Kielbasa, S.M. 2009. Regulation of clockcontrolled genes in
mammals. PLoS ONE, 4, 4882.
Braak, H.; Del Tredici, K.; Rueb, U.; de Vos, R.A.I.; Jansen Steur, E.N.H.; Braak,
E. 2003. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease.
Neurobiol Aging, 24, 197–211.
65
Braak, H.; Ghebremedhi, E.; Rub, U.; Bratzke, H.; Del Tredici, K. 2004. Stages in
the development of Parkinson’s disease-related pathology. Cell Tissue Res., 318,
121–134.
Brenneman, D.E.; Eiden, L.E. 1986. Vasoactive intestinal peptide and electrical
activity influence neuronal survival, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1159–1162.
Brodsky, M.A.; Godbold, J.; Roth, T.; Olanow, C.W. 2003. Sleepiness in
Parkinson’s disease: a controlled study. Mov Disord, 18, 668-72.
Burn D.J. 2002. Beyond the iron mask; towards better recognition and treatment of
depression associated with Parkinson’s disease. Mov Disord, 17, 445–454.
Bury, A.; Pienaar, I.S. 2013. Behavioral testing regimens in genetic-based animal
models of Parkinson’s disease: Cogencies and caveats. Neuroscience and
Biobehavioral Reviews, 37, 846–859.
Cagnacci, A.; et al. 1990. Effect of naloxone on body temperature in
postmenopausal women with Parkinson’s disease. Life Sci., 46,1241–1247.
Cannizzaro, C.; Tel, B.C.; Rose, S.; Zeng, B.Y.; Jenner, P. 2003. Increased
neuropeptide YmRNA -expression in striatum in Parkinson's disease. Brain Res. Mol.
Bain Res., 110, 169–176.
Carlsson, A.; Lindqvist, M.; Magnusson, T. 1957. 3,4-Dihydroxyphenylalanine and
5-hydroxytryptophan as reserpine antagonists. Nature, 180, 1200.
Carvalho, R.C.; Patti, C.C.; Takatsu-Coleman, A.L.; Kameda, S.R.; Souza, C.F.;
Garcezdo-Carmo, L. 2006. Effects of reserpine on the plus-maze discriminative
avoidancetask: dissociation between memory and motor impairments. Brain
Research, 1122, 176–83.
Cassone, V.M.; Speh, J.C.; Card, J.P.; Moore, R.Y. 1988. Comparative anatomy of
the mammalian hypothalamic suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms, 3, 71-91.
66
Cermakian, N.; Lange, T.; Golombek, D.; Sarkar, D.; Nakao, A.; Shibata, S.;
Mazzoccoli, G. 2013. Crosstalk between the circadian clock circuitry and the imune
system. Chronobiology International, 30(7), 870-888.
Cersosimo, M.G.; Benarroch, E.E. 2008. Neural control of the gastrointestinal
system: Implications for Parkinson’s disease. Mov Disord, 23,1065–175.
Chaudhuri, K.R.; Yates, L.; Martinez-Martin, P. 2005. The non-motor symptom
complex of Parkinson’s disease: a comprehensive assessment is essential. Curr
Neurol Neurosci Rep, 5(4), 275–283.
Chaudhuri, K.R.; Healy, D.G.; Schapira, A.H. 2006. Non-motor symptons of
Parkinson’s disease: diagnosis and management. Lancet Neurol., 5, 235-245.
Chaudhuri, K.R.; Naidu, Y. 2008. Early Parkinson’s disease and nonmotor issues.
J Neurol, 255(Suppl 5), 33–38.
Chaudhuri, K.R.; Odin, P. 2010. The challenge of nonmotor symptoms in
Parkinson’s disease. Prog. Brain Res., 184, 325-341.
Chiueh, S.P.; Markey, R.S.; Burns, J.N.; Johannessen, D.M.; Jacobowitz, I.J.
1984. Neurochemical and behavioral effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine (MPTP) in rat, guinea pig, and monkey. Psychopharmacology
Bulletin, 20, 548 – 553.
Comella, C.L. 2007. Mov Disord., 22,367-73.
Coomans, C.P.; Ramkisoensing, A.; Meijer, J.H. 2015. The suprachiasmatic nuclei
as a seasonal clock. Frontiers in Neuroendocrinology, 37, 29-42.
Cranwell-Bruce, L.A. 2010. Drugs for Parkinson’s disease. Medsurg Nurs, 19,347-
349.
67
Cummings, J.L.; Mega, M.S. 2003. Neuropsychiatry and Behavioral Neuroscience.
New York, Oxford University Press.
Daan, S.; Beersma, D. G. M.; Borbely, A. A. 1984. Timing of human sleep: recovery
process gated by a circadian Pacemaker. Am. J. Physiol., 246, R161–R178.
Dauer, W.; Przedborski, S. 2003. Parkinson’s disease: mechanisms and models.
Neuron, 39, 889–909.
Dawson, T.M.; Ko, H.S.; Dawson, V.L. 2010. Genetic Animal Models of Parkinson’s
Disease. Neuron, 66.
Dearry, A.; Burnside, B. 1986. Dopaminergic regulation of cone retinomotor
movement in isolated teleost retinas: I. Induction of cone contraction is mediated by
D2 receptors. J Neurochem., 46, 1006–1021.
Deboer, T. 2007. Technologies of sleep research. Cell. Mol. Life Sci., 64, 1227–1235.
DeCoursey, P.J.; Krulas, J.R. 1998. Behavior of SCN-lesioned chipmunks in natural
habitat: a pilot study. J. Biol. Rhythms, 13, 229-244.
Decressac, M.; Wright, B.; David, B.; Tyers, P.; Jaber, M.; Barker, R.A.; Gaillard,
A. 2011. Exogenous neuropeptide Y promotes in vivo hippocampal neurogenesis.
Hippocampus, 21, 233–238.
Decressac, M.; Barker, R.A. 2012. Neuropeptide Y and its role in CNS disease and
repair. Experimental Neurology, 238, 265–272.
Delgado, M.; Ganea, D. 2003. Neuroprotective effect of vasoactive intestinal peptide
(VIP) in a mouse model of Parkinson.s disease by blocking microglial activation. The
FASEB Journal express article 10.1096/fj.02-0799fje. Published online.
68
Delgado, M.; Ganea, D. 2003a. Vasoactive intestinal peptide prevents activated
microglia-induced neurodegeneration under inflammatory conditions: potential
therapeutic role in brain trauma. FASEB J, 17(13), 1922–1924.
Delgado, M.; Ganea, D. 2003b. Neuroprotective effect of vasoactive intestinal peptide
(VIP) in a mouse model of Parkinson’s disease by blocking microglial activation.
FASEB J, 17(8), 944–946.
Devos, D.; et al. 2003. Heart rate variability and Parkinson’s disease severity. J
Neural Transm., 110, 997–1011.
Dhawan, V.; Williams, A.; Pal, S.; DiMarco, A.; Martinez-Martin, P.; Tobias, A.;
Chaudhuri, K.R. 2006. Sleep dysfunction in untreated Parkison’s disease. J Neurol
Sci, 248, 158–162.
Dibner, C.; Schibler, U.; Albrecht, U. 2010. The Mammalian Circadian Timing
System: organization and Coordination of Central and Peripheral Clocks. Annu. Rev.
Physiol., 72, 517–549.
Dickson, D.W.; Fujshiro, H.; Delledonna, A.; Menke, J.; Ahmed, Z.; Klos, K.J.
2008. Evidence that incidental Lewy body disease is pre-symptomatic Parkinson’s
disease. Acta Neuropathol, 116, 125–8.
Dijk, D.J.; Archer, S.N. 2010. PERIOD3, circadian phenotypes, and sleep
homeostasis. Sleep Med. Rev.,14, 151–160.
Dijk, D.J.; Brunner, D.P.; Borbely, A.A. 1990. Time course of EEG power density
during long sleep in humans. Am. J. Physiol., 258, R650–R661.
Drucker-Colin, R.; Aguilar-Roblero, R.; Garcia-Hernandez, F.; Fernandez-
Cancino, F.; Bermudez-Rattoni, F. 1984. Fetal suprachiasmatic nucleus
transplants: Diurnal rhythm recovery of lesioned rats. Brain Res, 311, 353-7.
69
Duty, S.; Jenner, P. 2011. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel
treatments and clues to the cause of the disease. Br J Pharmacol., 164(4),1357-91.
Eisensehr, I.; Linke, R.; Noachtar, S.; Schwarz, J.; Gildehaus, F.J.; Tatsch, K.
2000. Reduced striatal dopamine transporters in idiopathic rapid eye movement sleep
behaviour disorder. Comparison with Parkinson’s disease and controls. Brain,
123,1155–1160.
Ejaz, A.A.; Sekhon, I.S.; Munjal, S. 2006. Characteristic findings on 24-h ambulatory
blood pressure monitoring in a series of patients with Parkinson's disease. Eur J Intern
Med., 17(6), 417-20.
Erro, R.; Santangelo, G.; Picillo, M. 2012. Link between non-motor symptoms and
cognitive dysfunctions in de novo, drug naive PD patients. J Neurol. Published
Online.
Fernandes, V.S.; Ribeiro, A.M.; Melo, T.G.; Godinho, M.; Barbosa, F.F.;
Medeiros, D.S.; Munguba, H.; Silva, R.H. 2008. Memory impairment induced by low
doses of reserpinein rats: possible relationship with emotional processing deficits in
Parkinsondisease. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological
Psychiatry, 32, 1479–83.
Fernandes, V.S.; Santos, J.R.; Leão, A.H.; Medeiros, A.M.; Melo, T.G.; Izídio,
G.S.; Cabral, A.; Ribeiro, R.A.; Abílio, V.C.; Ribeiro, A.M.; Silva, R.H. 2012.
Repeated treatment with a low dose of reserpine as a progressive model of
Parkinson’s disease. Behavioural Brain Research, 231,154–63.
Ferreira, J.J.; Desboeuf, K.; Galitzky, M.; Thalamas, C.; Brefel-Courbon, C.;
Fabre, N.; Senard, J.M.; Montastruc, J.L.; Sampaio, C.; Rascol, O. 2006. Sleep
70
disruption, daytime somnolence and ‘sleep attacks’ in Parkinson's disease, a clinical
survey in PD patients and age-matched healthy volunteers. Eur. J. Neurol., 13, 209–
214.
Fertl, E.; Auff, E.; Doppelbauer, A.; Waldhauser, F. 1993. J Neural Transm Park
Dis Dement Sect., 5(3), 227-34.
Festoff, B.W.; Nelson, J.B.; Brenneman, D.E. 1996. Prevention of activity
dependente neuronal death: vasoactive intestinal polypeptide stimulates astrocytes to
secrete the thrombin-inhibiting neurotrophic serpin, protease nexin-1, J. Neurobiol., 30,
255–266.
Fronczec, R.; Overeem, S.; Lee, S.Y.; Hegeman, I.M.; Van Pelt, J.; Van Duinen,
S.G. 2007. Hypocretin (orexin) loss in Parkinson’s disease. Brain, 130, 1577-85.
Fujishiro, H.; Frigerio, R.; Burnett, M.; Klos, K.J.; Josephs, K.A.; DelleDonne, A.;
Parisi, J.E.; Ahlskog, J.E.; Dickson, D.W. 2008. Cardiac sympathetic denervation
correlates with clinical and pathologic stages of Parkinson’s disease. Mov Disord,
23,1085–1092.
Franken, P. 2013. A role for clock genes in sleep homeostasis. Curr. Opin. Neurobiol.,
23, 864–872.
Gerstenbrand, F.; Aichner, C; Kozma & W. Poewe. 1978. Clinical utilization of MIF-
1. Int. symposium “Central Nervous System. Effects of hypothalamic hormones and
other peptides”, Montreal.
Glass, J.D.; Brager, A.J.; Stowie, A.C.; Prosser, R.A. 2012. Cocaine modulates
pathways for photic and nonphotic entrainment of the mammalian SCN circadian clock.
Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 302, 740–750.
Golombek, D.A.; Rosestein, R.E. 2010. Physiology of circadian entrainment.
Physiol Rev., 90(3), 1063-102.
71
Gozes, I.; Shani, Y.; Rostene, W.H. 1987. Developmental expression of the VIP-gene
in brain and intestine, Mol. Brain Res., 2, 137–148.
Gravotta, L.; Gavrila, A.M.; Hood, S.; Amir, S. 2011. Global depletion of dopamine
using intracerebroventricular 6-hydroxydopamine injection disrupts normal circadian
wheel-running patterns and PERIOD2 expression in the rat forebrain. J. Mol.
Neurosci., 45, 162–171.
Hague, K.; Lento, P.; Morgello, S.; Caro, S.; Kaufmann, H. 1997. The distribution
of Lewy bodies in pure autonomic failure: autopsy findings and review of the literature.
Acta Neuropathol (Berl), 94, 192–6.
Hakamäki, T.; Rajala, T.; Lehtonen, A. 1998. Ambulatory 24-hour blood pressure
recordings in patients with Parkinson's disease with or without fludrocortisone. Int J
Clin Pharmacol Ther., 36(7), 367-9.
Hartmann, A.; Veldhuis, J.D.; Deuschle, M.; Standhardt, H.; Heuser I. 1997.
Twenty-four hour cortisol release profiles in patients with Alzheimer’s and Parkinson’s
disease compared to normal controls: ultradian secretory pulsatility and diurnal
variation. Neurobiol Aging., 18, 285–289.
Hastings, M.H.; Goedert, M. 2013. Circadian clocks and neurodegenerative
diseases: time to aggregate?. Curr Opin Neurobiol., 5, 880-7.
Heeringa, M. J.; Abercrombie, E. D. 1995. Biochemistry of somatodendritic
dopamine release in substantia nigra: an in vivo comparison with striatal dopamine
release. J. Neurochem., 65, 192– 200.
72
Hendrickson, A.E.; Wagoner, N.; Cowan, W.M. 1972. An autoradiographic and
electron microscope study of retino-hypothalamic connections. Z Zellforsch, 135,1-
26.
Hickey, T.L.; Spear, P.D. 1976. Retinogeniculate projections in hooded and albino
rats. Exp Brain Res, 24, 523-529.
Hobson, D.E.; Lang, A.E.; Martin, W.R.; Razmy, A.; Rivest, J.; Fleming, J. 2002.
Excessive daytime sleepiness and sudden-onset sleep in Parkinson disease: a survey
by the Canadian Movement Disorders Group. Jama, 287, 455-63.
Hood, S.; Cassidy, P.; Cossette, M.P.; Weigl, Y.; Vermey, M.; Robinson, B.;
Stewart, J.; Amir, S. 2010. Endogeneous dopamine regulates the rhythm of
expression. Of the clock protein PER2 in the rat dorsal striatum via daily activation of
D2 dopamine receptors. J Neurosci., 30(42), 14046-58.
Horowitz, S.S.; Blanchard, J.H.; Morin, L.P. 2004. Intergeniculate leaflet and
ventral lateral geniculate nucleus afferent connections: An anatomical substrate for
functional input from the vestibulo-visuomotor system. J Comp Neurol, 474, 227-245.
Horvath, L. 1998. An alternate pathway for visual signal integration into the
hypothalamo-pituitary axis: Retinorecipient intergeniculate neurons project to various
regions of the hypothalamus and innervate neuroendocrine cells including those
producing dopamine. J Neurosci,18, 1546-1558.
Honma, K.; Honma, S.; Hiroshige, T. 1987. Activity rhythms in the circadian domain
appear in suprachiasmatic nuclei lesioned rats given methamphetamine. Physiol.
Behav., 40, 767–774.
73
Imbesi, M.; Yildiz, S.; Dirim Arslan, A.; Sharma, R.; Manev, H.; Uz, T. 2009.
Dopamine receptor-mediated regulation of neuronal “clock” gene expression.
Neuroscience, 158, 537–544.
Ironside, S.; Davidson, F.; Corkum, P. 2010. Circadian motor activity affected by
stimulant medication in children with attention-deficit/hyperactivity disorder. J. Sleep
Res., 19, 546–551.
Iwanaga, K.; Wakabayashi, K.; Yoshimoto, M.; Tomita, I.; Satoh, H.; Takashima,
H. 1999. Lewy body-type degeneration in cardiac plexus in Parkinson’s and incidental
Lewy body diseases. Neurology, 52, 1269–71.
Jain, S. 2011. Multi-organ autonomic dysfunction in Parkinson disease. Parkinsonism
Relat. Disord., 17, 77–83.
Jain, S.; Goldstein, D.S. 2012. Cardiovascular dysautonomia in Parkinson disease:
from pathophysiology to pathogenesis. Neurobiol. Dis., 46, 572–580.
Kallio, M.; Haapaniemi, T.; Turkka, J.; Suominen, K.; Tolonen, U.; Sotaniemi, K.;
Heikkila, V.P.; Myllyla, V. 2000. Heart rate variability in patients with untreated
Parkinson's disease. Eur. J. Neurol., 7, 667–672.
Kandel, E.R.; Schwartz, J.H.; Jessell, T.M.; Siegelbaum, S.; Hudspeth, A.J. 2014.
Livro Princípios de Neurociências, 5ªed. Edit. MCGRAW-HILL BRASIL.
Kaur, S.; Starr, M.S. 1995. Antiparkinsonian action of dextromethorphan in
the reserpine-treated mouse. Eur J Pharmacol., 280(2), 159-66.
Kerkerian, L.; Bosler, O.; Pelletier, G.; Nieoullon, A. 1986. Striatal neuropeptide Y
neurones are under the influence of the nigrostriatal dopaminergic pathway:
immunohistochemical evidence. Neurosci. Lett., 66, 106–112.
74
Kerkerian-Le Goff, L.; Forni, C.; Samuel, D.; Bloc, A.; Dusticier, N.; Nieoullon,
A. 1992. Intracerebroventricular administration of neuropeptide Y affects parameters
of dopamine, glutamate and GABA activities in the rat striatum. Brain Res. Bull., 28,
187–193.
Klein, D.C.; Moore, R.Y. 1979. Pineal N-acetyltransferase and hydroxyindole-
Omethyltransferase: control by retinohypothalamic tract and the suprachiasmatic
nucleus. Brain Res, 174, 245-62.
Korkmaz, O.T.; Tunçel, N.; Tunçel, M.; Oncü, E.M.; Sahintürk, V.; Celik, M. 2009.
Vasoactive intestinal peptide (VIP) treatment of Parkinsonian rats increases thalamic
gamma-aminobutyric acid (GABA) levels and alters the release of nerve growth factor
(NGF) by mast cells. J. Mol. Neurosci.
Kriegsfeld, L.J.; Silver, R. 2006. The regulation of neuroendocrine function: Timing
is everything. Hormones and Behavior, 49, 557–574.
Kudo, T.; Loh, D.H.; Truong, D.; Wu, Y.; Colwell, C.S. 2011. Circadian dysfunction
in a mouse model of Parkinson’s disease. Experimental neurology, 232, 66-75.
Kulkarni, S.K.; Bishnoi, M.; Chopra, K. 2009. In vivo microdialysis studies of striatal
level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian
J Exp Biol, 47, 91–97.
Kurz, A.; Double, K.L.; Lastres-Becker, I.; Tozzi, A., Tantucci, M.; Bockhart, V.
2010. A53T-alpha-synuclein overexpression impairs dopamine signaling and striatal
synaptic plasticity in old mice. PLoS ONE 5.
Lauterbach, E.C.; Freeman, A.; Vogel, R.L. 2004. Differential DSM-III psychiatric
disorder prevalence profiles in dystonia and Parkinson‘s disease. J Neuropsychiatry
Clin Neurosci, 16, 29–36.
75
Li, X.; Patel, J.C.; Wang, J.; Avshalumov, M.V.; Nicholson, C.; Buxbaum, J.D.
2010. Enhanced striatal dopamine transmission and motor performance with LRRK2
overexpression in mice is eliminated by familial Parkinson’s disease mutation
G2019S. J. Neurosci., 30, 1788–1797.
Lu, J.; Zhang, Y.H., Chou, T.C.; Gaus, S.E.; Elmquist, J.K.; Shiromani, P.;
Saper, C.B. 2001. Contrasting effects of ibotenate lesions of the paraventricular
nucleus and subparaventricular zone on sleep-wake cycle and temperature
regulation. J. Neurosci., 21, 4864–4874.
Maetzler, W.; Liepelt, I.; Berg, D. 2009. Progression of Parkinson's disease in the
clinical phase: potential markers. Lancet Neurol., 12,1158-71.
Matsui, H.; Nishinaka, K.; Oda, M.; Hara, N.; Komatsu, K.; Kubori, T.; Udaka, F.
2006. Excessive daytime sleepiness in Parkinson disease: a SPECT study. Sleep,
29, 917–920.
Mazzoccoli, G.; Pazienza, V.; Vinciguerra, M. 2012. Clock genes and clock-
controlled genes in the regulation of metabolic rhythms. Chronobiol Int, 29, 227–51.
Meredith, G.E.; Totterdell, S.; Potashkin, J.A.; Surmeier, D.J. 2008. Modeling PD
pathogenesis in mice: Advantages of a chronic MPTP protocol Parkinsonism & Related
Disorders, 14, S112 - S115.
Mizuno, Y.; Sone, N.; Saitoh, T. 1987. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in
the electron transport system in mouse brain. J Neurochem., 48(6),1787-93.
Mohawk, J.A.; Green, C.B.; Takahashi, J.S. 2012. Central and peripheral circadian
clocks in mammals. Annu Rev Neurosci., 35,445–462.
76
Moore, D.J.; West, A.B.; Dawson, V.L.; Dawson, T.M. 2005. Molecular
pathophysiology of Parkinson's disease. Annu Rev Neurosci., 28, 57-87.
Moore, R.Y.; Lenn, N.J. 1972. A retinohypothalamic projection in the rat. J Comp
Neurol, 146,1-14.
Morais, V.A.; De Strooper, B. 2010. Mitochondria dysfunction and
neurodegenerative disorders: cause or consequence. J Alzheimers Dis, 20, 255-263.
Morin, L.P.; Blanchard, J.H. 1999. Forebrain connections of the hamster
intergeniculate leaflet: Comparison with those of ventral lateral geniculate nucleus
and retina. Vis Neurosci., 16, 1037-54.
Morin, L.P.; Blanchard, J.H. 2005. Descending projections of the hamster
intergeniculate leaflet: relationship to the sleep/arousal and visuomotor systems. J
Comp Neurol, 487, 204-216.
Muller T., Hefter H., Hueber R., Jost W. H., Leenders K. L., Odin P. and Schwarz
J. 2004. Is levodopa toxic? J. Neurol., 251, VI/44–VI/46.
Murillo-Rodriguez, E.; Arias-Carrion O.; Zavala-Garcia A. 2012. Basic sleep
mechanisms: an integrative review. Central Nervous System Agents in Medicinal
Chemistry., 12(1), 38–54.
Nagayama, H.; Kimura, K. 2015. Depression Preceding Parkinson’s Disease Onset.
Austin Alzheimers J Parkinsons Dis., 2(1), 1023.
Nakagawa, T.; Ukai, K.; Ohyama, T.; Gomita, Y.; Okamura, H. 1997. Effects of
dopaminergicagents on reversal of reserpine-induced impairment in conditioned
avoidanceresponse in rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 58, 829– 36.
77
Nicklas, W.J.; Vyas, I.; Heikkila, R.E. 1985. Inhibition of NADH-linked oxidation in
brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-
methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci., 36(26), 2503-8.
Nilsson, F.M.; Kessig, L.V.; Bolwig, T.G. 2001. Increased risk of developing
Parkinson’s disease for patients with major affective disorders. Acta Psychiatr Scand,
104,380–386.
Obuchowicz, E.; Antkiewicz-Michaluk, L.; Romanska, I.; Herman, Z.S. 2003.
Increased striatal neuropeptide Y immunoreactivity and its modulation by deprenyl,
clonidine and L-dopa in MPTP-treated mice. J. Neural Transm., 110, 1375–1391.
Ochi, T. 1993. Mechanism for the changes in levels of glutathione upon
exposure of cultured mammalian cells to tertiary-butylhydroperoxide and
diamide. Arch. Toxicol. , 67, 401-410.
Olson, E.J.; Boeve, B.F.; Silber, M.H. 2000. Rapid eye movement sleep behaviour
disorder: demographic, clinical and laboratory findings in 93 cases. Brain, 123, 331–
339.
O’Sullivan, S.S.; Williams, D.R.; Gallagher, D.A.; Massey, L.A.; Silveira-
Moriyama, L.; Lees, A.J. 2008. Non motor symptoms as presenting complaints in
Parkinson’s disease: a clinicopathological study. Mov Disord, 23,101–106.
Park, J.; Kim, Y.; Chung, J. 2009. Mitochondrial dysfunction and Parkinson’s
disease genes: insights from Drosophila. Dis Model Mech, 2, :336-340.
Patil, R.A.; Hiray, Y.A.; Kasture, S.B. 2012. Reversal of reserpine-induced orofacial
dyskinesia and catalepsy by Nardostachys jatamansi. Indian J Pharmacol., 44(3),
340–344.
78
Peyron, C.; Faraco, J.; Rogers, W.; Ripley, B.; Overeem, S.; Charnay, Y.2000. A
mutation in a case of early onset narcolepsy and a generalized absence of hypocretin
peptides in human narcoleptic brains. Nat Med, 6, 991-7.
Pickard, G.E. 1989. Entrainmement of the circadian rhythm of wheel-running activity
is phase shifted by ablation of the intergeniculate leaflet. Brain Res, 494, 151-54.
Pienaar, I.S.; Chinnery, P.F. 2013. Existing and emerging mitochondrial-targeting
therapies for altering Parkinson’s disease severity and progression. Pharmacol.
Ther., 137, 181–187, 2013.
Pierangeli, G.; Provini, F.; Maltoni, P.; Barletta, G.; Contin, M.; Lugaresi, E.;
Montagna, P.; Cortelli, P. 2001. Nocturnal body core temperature falls in
Parkinson’s disease but not in multiple-system atrophy. Mov Disord., 16, 226–232.
Porter, B.; Macfarlane, R.; Walker, R. 2008. The frequency and nature of sleep
disorders in a community-based population of patients with Parkinson’s disease. Eur
J Neurol., 15, 50–54.
Pursiainen, V.; Haapaniemi, T.H.; Korpelainen, J.T.; Huikuri, H.V.; Sotaniemi,
K.A.; Myllylä, V. 2002. Circadian heart rate variability in Parkinson's disease J Neurol.
249(11), 1535-40.
Ralph MR, Foster RG, Davis FC, Menaker M. 1990. Transplanted suprachiasmatic
nucleus determines circadian period. Science, 247, 975-8.
Raggi, A.; Bella, R.; Pennisi, G.; Neri, W.; Ferri, R. 2013. Sleep disorders in
Parkinson’s disease: a narrative review of the literature. Rev Neurosci., 24, 279–291.
Rasmussen, D.; Boldt, B.M.; Wilkinson, C.W.; Yellon, S.M.; Matsumoto, A.M.
1999. Daily melatonina administration at middle -age supresses male rat visceral fat,
plasma leptina, and plasma insulin to youthful levels. The endocrine society, vol. 40.
79
Rechtschaffen, A. 1998. Current perspectives on the function of sleep. Perspectives
in Biology and Medicine., 41(3), 359–390.
Remy, P.; Doder, M.; Lees, A.; Turjanski, N.; Brooks, D. 2005. Depression in
Parkinson’s disease: loss of dopamine and noradrenaline innervation in the limbic
system. Brain, 128, 1314–1322.
Ren, B ; Zhang, Y; Zhou, H; Sun, F; Zhang, Z; Wei, Z. 2015. Tanshinone IIA
prevents the loss of nigrostriatal dopaminergic neurons by inhibiting NADPH oxidase
and iNOS in the MPTP model of Parkinson's disease. Journal of the Neurological
Sciences, 348, 142–152.
Reuss, S. 2003. The clock in the brain: anatomy of the mammalian circadian timing
system. In: Peschke E, editor. Endokrinologie. Stuttgart: Verlag p. 9-48.
Rex, C.S.; Kramar, E.; Colgin, L.L.; Lin, B.; Gall, C.M.; Lynch, G. 2005. Long-Term
Potentiation Is Impaired in Middle-Aged Rats: Regional Specificity and Reversal by
Adenosine Receptor Antagonists. The Journal of Neuroscience, 25, 5956 –5966.
Riedel, O.; Klotsche, J.; Spottke, A. 2010. Frequency of dementia, depression, and
other neuropsychiatric symptoms in 1449 outpatients with Parkinson's disease. J
Neurol , 257,1073–82.
Rye, D.B.; Jankovic, J. 2004.The two faces of Eve: dopamine's modulation of
wakefulness and leep. Neurology, 63, 2-7.
Salin, P.; Kerkerian, L.; Nieoullon, A. 1990. Expression of neuropeptide Y
immunoreactivity in the rat nucleus accumbens is under the influence of the
dopaminergic mesencephalic pathway. Exp. Brain Res., 81, 363–371.
Sanberg, P.R. 1980. Haloperidol-induced catalepsy is mediated by postsynaptic
dopamine receptors. Nature, 284(5755), 472-3.
80
Santos, J.R.; Cunha, J.A.S.; Dierschnabel, A.L.; Campêlo, C.L.C.; Leão,
A.H.F.F.; Silva, A.F.; Engelberth, R.C.G.J.; Izídio, G.S.; Cavalcante, J.S.; Abílio,
V.C.; Ribeiro, A.M.; Silva, R.H. 2013. Cognitive, motor and tyrosine hydroxylase
temporal impairment in a model of parkinsonism induced by reserpine. Behavioural
Brain Research, 253, 68– 77.
Saper, C.B.; Scammell, T.E.; Lu, J. 2005. Hypothalamic regulation of sleep and
circadian rhythms. NATURE, 437, 27.
Scherder, E.; Wolters, E.; Polman, C.; Sergeant, J.; Swaab, D. 2005. Pain in
Parkinson’s disease and multiple sclerosis: Its relation to the medial and lateral pain
systems. Neurosci Biobehav Rev, 29, 1047–56.
Schneider, von E., Fischer, P.A.; Jacobi, P.; Reh, W. 1978. Der Einfluss von MIF
(Melanozyteninhibierender Faktor) auf Psychomotorik und Stimmungsverhalten von
Parkinsonkranken. Arzneim. Forsch., 28, 1296-1297.
Schneider, J.S.; Yuwiler, A.; Markham, C.H. 1986. Production of a Parkinson-like
syndrome in the cat with N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP):
Behavior, histology, and biochemistry. Experimental Neurology, 91, 293 – 307.
Schurmann, A.G.; van den Akker, H.; Ensinck, K.T.J.L.; Metsemakers, F.H.;
Knottnerus, J.A.; Leentjens, F.G. 2002. Increased risk of Parkinson’s disease after
depression: a retrospective cohort study. Neurology, 58, 1501–1504.
Sethi, K.D. 2002. Clinical aspects of Parkinson disease. Curr Opin Neurol, 15, 457-
460.
Setthawatcharawanich, S.; Limapichat, K.; Sathirapanya, P.; Phabphal, K. 2014.
Excessive daytime sleepiness and nighttime sleep quality in Thai patients with
Parkinson's disease. J Med Assoc Thai., 97(10), 1022-7.
81
Schapira, A.H.; Cooper, J.M.; Dexter, D.; Jenner, P.; Clark, J.B.; Marsden, C.D.
1989. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson’s disease. Lancet, 1, 1269.
Schapira, A.H.; Mann, V.M.; Cooper, J.M.; Dexter, D.; Daniel, S.E.; Jenner, P.
1990. Anatomic and disease specificity of NADH CoQ1 reductase (complex I)
deficiency in Parkinson’s disease. J. Neurochem., 55, 2142–2145.
Siddique, Y.H., Naz, F., Jyoti, S. 2013. Effect of curcumin on lifespan, activity
pattern, oxidative stress, and apoptosis in the brains of transgenic Drosophila model
of Parkinson's disease. Biomed Res.
Siegel, J. M. 2005. Clues to the functions of mammalian sleep. Nature., 437(7063),
1264–1271.
Simuni, T.; Sethi, K. 2008. Nonmotor manifestations of Parkinson’s disease. Ann.
Neurol., 64(Suppl. 2), S65-S80.
Sowers, J.R.; Vlachakis, N. 1984. Circadian variation in plasma dopamine levels in
man J Endocrinol Invest., 7(4), 341-5.
Spillantini, M.G.; Schmidt, M.L.; Lee, V.M.; Trojanowski, J.Q.; Jakes, R.;
Goedert, M. 1997. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature, 388, 839–840.
Stevens, S.; Cormella, C.L.; Stepanski, E.J. Daytime sleepiness and alertness in
patients with Parkinson disease. 2004. Sleep, 27, 967–972.
Stoddard, S.; Tyce, G.M.; Ahlskog, J.E.; Zinsmeister, A.R.; Nelson, D.K.;
Carmichael, S.W. 1991. Decreased Levels of [MetlEnkephalin, Neuropeptide Y,
Substance P, Vasoactive Intestinal Peptide in Parkinsonian Adrenal Medulla.
Experimental neurology, 114, 23-27.
82
Stokes, M. 2000. Doença de Parkinson. In: Cash: neurologia para fisioterapeutas.
São Paulo: Premier.
Sundquist, J.; Forsling, M.L.; Akerlund, M. 1983. Cerebrospinal fluid arginine
vasopressin in degenerative disorders and other neurological diseases. Journal of
Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 46,14-17.
Suzuki, K.; Miyamoto, T.; Kaji, Y.; Takekkawa, H.; Hirata, K. 2007. Circadian
variation of core body temperature in Parkinson disease patients with depression: a
potential biological marker for depression in Parkinson disease. Neuropsychobiology,
56, 172–179.
Tanaka, M.; Kloet, E.R.; Wied, D.; Versteeg, D.H.G. 1977. Arginine-vasopressin
affects catecholamine metabolism in specific brain nuclei. Life Sciences, 20, 1799-
1808.
Takahashi, K. 2013. Non-motor symptons in premotor phase of Parkinson disease
Clinical neurology, 53, 974-6.
Teixeira, A.M.; Trevizol, F.; Colpo, G.; Garcia, S.C.; Charão, M.; Pereira, R.P.;
Fachinetto, R.; Rocha, J.B.; Bürger, M.E. 2008. Influence of chronic exercise on
reserpine-induced oxidative stress in rats: behavioral and antioxidant evaluations.
Pharmacology Biochemistry and Behavior, 88(4), 465–72.
Thannickal, T.C.; Lai, Y.Y.; Siegel, J.M. 2007. Hypocretin (orexin) cell loss in
Parkinson’s disease. Brain, 130, 1586-95.
Thorpy, M.J.; Adler, C.H. 2005. Parkinson's disease and sleep. Neurol. Clin., 23,
1187– 1208.
83
Tobler, I.; Borbely, A. A.; Groos, G. 1983. The effect of sleep deprivation on sleep
in rats with suprachiasmatic lesions. Neurosci. Lett., 42, 49–54.
Tolosa, E.; Compta, Y.; Gaig, C. 2007. The premotor phase of Parkinson’s disease.
Parkinsonism Relat Disord, 13, S2–S7.
Trachsel, L.; Edgar, D. M.; Seidel, W. F.; Heller, H. C.; Dement, W. C. 1992. Sleep
homeostasis in suprachiasmatic nuclei-lesioned rats – effects of sleep deprivation and
triazolam administration. Brain Res., 589, 253–261.
Tunçel, N.; Sener, E.; Cerit, C.; Karasu, U.; Gürer, F.; Sahintürk, V.; Bayçu, C.;
Ak, D.; Filiz, Z. 2005. Brain mast cells and therapeutic potential of vasoactive intestinal
peptide in a Parkinson's disease model in rats: brain microdialysis, behavior, and
microscopy. Peptides, 26(5), 827–836.
Uchiyama, M.; Isse, K.; Tanka, K. 1995. Incidental Lewy body disease in patients
with REM sleep behaviour disorder. Neurol, 45, 709–712.
Ungerstedt, U. 1968. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central
monoamine neurons. Eur J Pharmacol., 5(1), 107-10.
Van Hilten, J.J.; Kabel, J.F.; Middelkoop, H.A.; Kramer, C.G.; Kerkhof, G.A.;
Roos, R.A. 1993. Assessment of response fluctuations in Parkinson's disease by
ambulatory wrist activity monitoring. Acta Neurol Scand., 87(3), 171-7.
Van Ree, J. M.; Bohus, B.; Versteeg, D.H.G.; Wied, D. 1978. Neurohypophyseal
principles and memory processes. Biochem. Pharmacol., 27, 1793-1800.
Van Someren, E.J.W. 2000. Circadian and sleep disturbances in the elderly.
Experimental Gerontology, 35, 1229-1237.
84
Verbaan, D.; van Rooden, S.M.; Visser, M.; Marinus, J.; van Hilten, J.J. 2008.
Nighttime sleep problems and daytime sleepiness in Parkinson’s disease. Mov
Disord., 23, 35–41.
Videnovic, A.; Golombek, D. 2013. Circadian and sleep disorders in Parkinson's
disease. Exp. Neurol., 243, 45–56.
Videnovic, A.; Noble, C.; Reid, K.J.; Peng, J.; Turek, F.W. 2014. Circadian
melatonin rhythm and excessive daytime sleepiness in Parkinson disease. JAMA
Neurol., 71, 463–469.
Vuillet, J.; Kerkerian, L.; Kachidian, P.; Bosler, O.; Nieoullon, A. 1989.
Ultrastructural correlates of functional relationships between nigral dopaminergic or
cortical afferent fibers and neuropeptide Y-containing neurons in the rat striatum.
Neurosci. Lett., 100, 99–104.
Welsh, D.K.; Takahashi, J.S.; Kay, A.S. 2010. Suprachiasmatic Nucleus:Cell
Autonomy and Network Properties. Annu. Rev. Physiol., 72, 551–77.
Whitehead, D.L.; Davies, A.D.; Playfer, J.R.; Turnbull, C.J. 2008. Circadian rest–
activity rhythm is altered in Parkinson’s disease patients with hallucinations. Mov
Disord., 23, 1137–1145.
Wider, C.; Ross, O.A.; Wszolek, Z.K. 2010a. Genetics of Parkinson disease and
essential tremor. Curr. Opin. Neurol., 23, 388–393.
Wider, C.; Foroud, T.; Wszolek, Z.K. 2010b. Clinical implications of gene Discovery
in Parkinson’s disease and parkinsonism. Mov. Disord., 25, S15–S20.
Willison, A.D.; Kudo, T.; Loh, D.H.; Kuljis, D.; Colwell, C.S. 2013. Circadian
dysfunction may be a key component of the non-motor symptoms of Parkinson´s
disease: Insights from a transgenic mouse model. Exp. Neurol, 243, 57-66.
85
Wirz-Justice, A.; Da Prada, M.; Reme, C. 1984. Circadian rhythm in rat retinal
dopamine. Neurosci Lett., 45, 21–25.
Wolters, E.C.; Braak, H. 2006. Parkinson’s disease: premotor clinico-pathological
correlations. J Neural Transm, 70, 309–19.
Wyatt, J. K.; Ritz-De Cecco, A.; Czeisler, C. A.; Dijk, D. J. 1999. Circadian
temperature and melatonin rhythms, sleep, and neurobehavioral function in humans
living on a 20-h day. Am. J. Physiol., 277, R1152–R1163.
86
ANEXO