UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO

EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE

PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS

Natal / RN

2014

1

TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO

EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE

PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS

Orientadora: Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz

Natal / RN

2014

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em

Patologia Oral.

2

Silva Filho, Thiago João da. Expressão imunoistoquímica de GLUT-1 e marcadores de proliferação e

apoptose em anomalias vasculares orais / Tiago João da Silva Filho. – Natal, RN,

2014.

119 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz.

Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.

Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Hemangioma – Dissertação. 2. Diagnóstico diferencial – Dissertação. 3.

Proteínas facilitadoras de transporte de glucose – Dissertação. 4. Proliferação de

células – Dissertação. 5. Granuloma piogênico – Dissertação. I. Queiroz, Lélia

Maria Guedes. II. Título.

RN/UF/BSO Black D65

RN/UF/BSO Black D74

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

3

4

“Eu vejo a vida melhor no futuro Eu vejo isso por cima de um muro de hipocrisia

Que insiste em nos rodear

Eu vejo a vida mais clara e farta Repleta de toda satisfação

Que se tem direito Do firmamento ao chão

Eu quero crer no amor numa boa

Que isto valha pra qualquer pessoa Que realizar a força que tem uma paixão

Eu vejo um novo começo de era

De gente fina, elegante e sincera Com habilidade

Pra dizer mais sim do que não

Hoje o tempo voa, amor Escorre pelas mãos

Mesmo sem se sentir

Não há tempo que volte, amor Vamos viver tudo o que há pra viver

Vamos nos permitir.” (Tempos modernos – LULU SANTOS)

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DEDICATÓRIA

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Dedico este trabalho a meus pais, João da Silva e Josilene Pereira da Silva, às

minhas irmãs, Mara Priscila, Maiara Kézia e Mayane Jéssica e às minhas

sobrinhas, Maria Eduarda e Maria Clara.

“…I have loved you for a thousand years I'll love you for a thousand more…”

(A Thousand Years -CHRISTINA PERRI)

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AGRADECIMENTOS

8

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À minha companheira de pesquisa, Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira.

Muito se fala a respeito da importância de se ter um braço direito no desempenho de

algumas tarefas. Na minha “irmã patológica” tive o privilégio de encontrar um braço

direito, esquerdo, cabeça pensante e coração gigante. Sou eternamente grato por

todos os ensinamentos e companheirismo. Sua participação em cada etapa foi de

suma importância na transformação do que era um projeto em, agora, algo concreto.

Com ela aprendi valores que levarei comigo para sempre. É uma pessoa que

definitivamente luta por seus objetivos com garra e graça.

Tenho certeza do seu sucesso e espero estar presente em sua vida para juntos

comemoramos cada uma das suas grandes conquistas.

“Que o Senhor galardoe o seu feito! Que seja ricamente recompensada pelo Senhor, sob cujas asas você veio buscar refúgio!"

(Rute 2:12)

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AGRADECIMENTOS

A Deus, que considero o maior responsável por este feito.

“E sabemos que todas as coisas contribuem juntamente para o bem daqueles que amam a Deus...” (Romanos 8:28)

Aos meus pais, Seu Joca (o deuso) e Dona Lena(a deusa), que sempre me

ensinaram a importância do conhecimento e me apoiaram nas minhas escolhas. São

meus grandes mestres nos ensinamentos da vida. Por toda a compreensão, pela

forma que guiaram seus conselhos sobre o eu achava que era melhor para mim,

fazendo com que a decisão fosse minha, mas sempre dando um toque de sabedoria

de vida. Aos meus grandes referenciais,minha eterna gratidão.

“...Nunca se esqueçam nem um segundo Que eu tenho o amor maior do mundo

Como é grande o meu amor por vocês...” (Como égrande o meu amor por você - ROBERTO CARLOS)

Às minhas irmãs Mara, Maiara e Mayane pelo apoio e companheirismo durante toda

a vida, por tornarem minha família tão linda.

“…Hey sister, know the water's sweet But blood is thicker

Oh, if the sky comes falling down, for you There's nothing in this world I wouldn't do…”

(Hey Brother – AVICII)

Às minhas sobrinhas, Duda e Clarinha, que desde os seus nascimentos me

fizeram viver o verdadeiro sentido da palavra amor. Difícil é entender como duas

crianças conseguem me ensinar tanto. Um dos seus principais ensinamentos é o

sentido da palavra “literalmente”. Eu literalmente as amo, pelo bom uso do termo.

“…Those three words, They are said too much,

And they're not enough...” (Chasing Cars - SNOW PATROL)

10

À minha irmã dada pela vida, Dacy, uma pessoa queconsegue melhorar qualquer

ambiente com sua espontaneidade e humor. Os laços de amizade se prenderam tão

forte que já simulam laços de sangue. Uma amiga que sei que posso contar. Por ti

tenho uma amizade que nem o tempo pode abalar.

“Em todo o tempo ama o amigo e para a hora da adversidade, nasce o irmão.” (Provérbios 17:17)

Àsminhas amigasda graduação Alice Helena e Veruska Lima:

Alice, a quem foi dada a missão de me trazer para Natal. Jamais me esquecerei da

sua insistência em me fazer vir parar nesta cidade. Uma insistência a que eu cedi,

pelo seu intenso poder de persuasão. A isso tenho imensa gratidão. Ademais, tê-la

como amiga é uma dádiva!

Veruska, o meu grande espelho. É aquele tipo de pessoa que eu penso “é assim

que quero ser quando crescer”. A fortaleza em pessoa, um gênio que Deus tratou de

colocar no meu caminho. Mesmo distante cuida de mim, me conhece como

ninguém, sabe dos meus pensamentos antes mesmo que me venham à cabeça.

Não existe unidade de medida que dimensione o tamanho do meu carinho.

If you need me, call me No matter where you are

No matter how far (don't worry, baby) Just call my name

I'll be there in a hurry You don't have to worry

'Cause, baby, there Ain't no mountain high enough

Ain't no valley low enough Ain't no river wide enough

To keep me from getting to you, baby (Ain't No Mountain High Enough - MARVIN GAYE)

O “tripé” jamais poderá ser desfeito. Nem o tempo, nem a distância, nem qualquer

outra adversidade será capaz de desfazer o que nos uniu. Continuaremos para

sempre na filosofia do “um ri, todos riem”, “um chora, todos choram”, porque vossa

tristeza é a minha e a minha felicidade compartilho com vocês.

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Àminha orientadora e “mãe patológica”Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz,

que se mostrou uma excelente orientadoranesses dois anos de convívio. A missão

de dividir a relação orientador/orientando nos foi dada por sorteio quando eu mesmo

não poderia ter feito escolha melhor. Uma orientadora sempre presente quando

solicitada, que me deu a liberdade de expor e defender minhas opiniões gerando

discussões saudáveis e produtivas. A mim foi dada a oportunidade de ter uma

grande tutora, a quem sou muito grato.

À Profa Dra Éricka Janine Dantas da Silveira, uma sumidade quando se fala em

Patologia Oral. Uma pessoa que emana conhecimento por onde passa. De todos os

mestres que já passaram pela minha vida, alcança um lugar de destaque.

Ao Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonakapor sua grande contribuição na

análise estatística do presente estudo.

Aos demais professores do Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da

UFRN que contribuíram de forma direta e/ou indireta na minha formação como

mestre.

Ao Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN por ter me aceito como

aluno e ter me dado a oportunidade de absorver uma infinidade de conhecimentos,

transcendendo os limites da Patologia Oral.

Aos membros da banca examinadora. Agradeço pelas colaborações dadas para o

enriquecimento da pesquisa.

Ao corpo de funcionários da Patologia Oral, agradeço pelo auxílio e disponibilidade.

Cada um tem um nível de importância em fazer a Patologia Oral funcionar.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

auxílio financeiro que subsidiou minha estadia em Natal e permitiu a realização

desta pesquisa.

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Aos meus colegas de classe Thâmara Manoela, Thaís Aline, Andréia do Carmo,

Marcelo Nascimento, Viviane Alves, Luciana de Castro, Maria Luiza e Luiz

Juliasse.

Thamis, um gênio que nos ensina tanto enquanto nos deixa cuidar dela. E como é

bom cuidar de uma pessoa assim tão especial. Uma das pessoas mais solícitas que

conheci e por quem criei um carinho instantâneo, aliás, não há esse que não o crie.

“…And when you smile The whole world stops and stares for a while

'Cause girl you're amazing Just the way you are…”

(Just The Way You Are - BRUNO MARS)

Thaizinha, bela pela própria natureza e de opiniões fortes. Uma amizade criada de

forma sólida, com muitos risos, conversas e companheirismo servindo como

alicerce.

Andréia, a pessoa boa em tudo o que faz (tenho dito isso diversas vezes). Tão

jovem e com tanta coisa para ensinar. Uma professora inata que serve de exemplo

para nós outros. Seu carisma, forma de pensamento, inteligência e dedicação são

admiráveis.

Ela é forte, ela é filha do Norte!

Marcelo, o que me acolheu na minha estadia em Natal. Sou muito grato pelo

acolhimento e pela divisão de espaço, de estudos e, por que não, de vida? Com

tantas coisas diferentes entre nós, conseguimos ser ótimos “roomates”. Nossos

papos de cozinha e nossa comum visão de vida (quase sempre) jamais serão

esquecidos. O apartamento que dividimos por dois anos guarda estórias

memoráveis e sempre que passar por ele haverá um momento de nostalgia. Muito

obrigado por tudo.

Vivi,uma das pessoas que mais conquistou minha admiração. Linda, de fala doce e

opiniões seguras. Consegue fazer mil coisas, sendo cada uma delas feitas com

perfeição. Feliz é quem tem alguém como ela por perto.

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Lu, um exemplo de dedicação. Estudiosa, sempre com seu caderno cheio de

considerações. Uma pessoa por quem criei um carinho imenso e fez esses dois

anos de convivência serem mais leves. Dela gostei de graça e vai custar muito para

que seja tirado de mim esse sentimento.

Malu, uma pessoa singular, muito diferente de mim em tantas maneiras. O seu jeito

de ser me deu grandes lições de como ser e de como não ser como pessoa. Com

ela aprendi coisas que ela não sabia que estava me ensinando. Sou muito grato por

sua solicitude, palavras de afago e por me contrariar quando não achava que eu

estava certo. Ela é o tipo de pessoa que apresenta fortaleza em suas fragilidades e

minha admiração por sua dedicação é enorme.

Luiz,um homem inteligente pela própria natureza. Sempre solícito e que sabe

escolher bem as palavras certas a serem aplicadas a qualquer momento. Uma

pessoa que admiro como profissional Cirurgião-Dentista. Sou grato pelo

compartilhamento de conhecimentos odontológicos e pelos momentos de

descontração.

Com vocês, meus amigos, não dividi apenas uma sala de aula, dividi dois anos da

minha vida e vocês foram responsáveis por tornar tudo isso melhor.

“Now I've had the time of my life No, I've never felt like this before

Yes I swear it's the truth And I owe it all to you…”

(The Time Of My Life - DIRTY DANCING)

Aos doutorandos do programa, agradeço por tornarem o ambiente de trabalho mais

amigável e descontraído e por todos os conhecimentos repassados.

“Cedo ou tarde A gente vai se encontrar,

Tenho certeza, numa bem melhor...” (Cedo Ou Tarde - DIEGO FERRERO e LEANDRO ROCHA)

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Às “gatas do mestrado” ou à “família de Natal”, como a gente se considera.

Belle, uma das pessoas mais espontâneas que conheci. A gata guiada pelo

coração, que se joga em busca do que acha certo (até quando não é). Tivemos

tantos momentos de diversão, viagens e conversas únicas que foram de suma

importância para a minha estadia em Natal. Nossa necessidade comum de “fuga”

fez com que tivéssemos os melhores momentos de “escapismo”. Agradeço por sua

amizade e confidencialidade.

(They are not you – PEYTON, OTH)

Ivana, a gata com quem dividi moradia por um ano. Ela consegue executar tarefas

de forma rápida e com perfeição, sua dedicação é admirável. Ao mesmo tempo

consegue festejar com intensidade. O convívio me ensinou que a gente deve dar

duro pelo que quer e sempre nos recompensar com aquilo que nos faz feliz.

“..Hey, said a hustler's work is never through We're making it cos we make it move

The only thing we know how to do Said it's the only thing we know how to do

Work hard, play hard, work hard, play harder!” (Play Hard - DAVID GUETTA)

Clara, a gata que ilumina o ambiente. O seu senso de humor único e a divisão de

dramas e experiências fez com que nos tornássemos grandes amigos. Ela é uma

pessoa especial que emana brilho pelos olhos, pela sua alma e pelo seu sorriso

branco A1. Aprendemos juntos que devemos apenas deixar brilhar e isso registrou

nossa união eterna. É a gata que se fez forte, mas que faz com que a gente tenha

prazer em cuidar. E eu digo calma alma minha, Clarinha, você tem muito que

aprender!

Let it be, Let it go,

Let it shine!

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Karyna, a gata que é gata!Sua dedicação ao trabalho, aos esportes e a uma vida

saudável é invejável. É linda e se garante no que faz. Um exemplo de mulher que

tem a cara de menina. Foi uma pessoa com quem eu pude contar sempre que

precisei, me ajudou tantas vezes e de tantas maneiras diferentes. Com ela aprendi

que devemos dar duro pelo que desejamos e sempre procurar o nosso lugar ao sol.

“She is only happy on the sun”

Larissa, agata que não é mestranda (ainda), mas que não poderia estar alocada

melhor do que aqui. A que chegou por último para constituir a “família de Natal”, mas

que não se fez menos importante. O carinho foi imediato diante dessa beleza que

encanta. A vida nos guarda tantas coisas e pessoas, e nós, por muitas vezes, nos

sentimos agraciados quando percebemos que acabamos de receber um presente da

vida.

“Um tesouro eu encontrei, eu encontrei...”

Às minhas queridas “gatas o mestrado” meu muito obrigado por tornarem a minha

estadia em Natal um dos melhores espaços de tempo da minha vida. No futuro,

quando nos reunirmos, nenhum assunto será mais relevante do que esse tempo que

passamos juntos, que com certeza teremos boas risadas ao relembrar.

Ao meu amigo Roger, uma das pessoas mais sábias que já conheci. Dele recebi os

melhores conselhos sobre quaisquer aspectos da vida. Um amigo de coração

gigante que me acolheu e que me faz sentir estar sendo cuidado. Sua honestidade,

seus pontos de vista diretos, sua objetividade em passar a mensagem que quer são

coisas que têm minha admiração. É um amor de amigo, é um amigo por quem tenho

amor.

“Você, meu amigo, é no mínimo, o máximo!”

16

Aos meus eternos amigos do colégio Vanessa Lacerda, Priscila Sampaio e Hilton

Jameson.

VNS, a minha amiga para todas as horas. Não importa a distância ou a hora, sei que

posso contar com ela. Uma das pessoas mais inteligentes que conheci. Ao mesmo

tempo frágil e resiliente, me admira o seu jeito de ser. Uma amiga que eu amo

simplesmente por amar.

Pri e Hiltin, meus compadres. Estive com vocês desde o começo de tudo e a data

13/06/2006 será sempre lembrada com carinho por mim. O casal que tenho o maior

carinho e que não consigo desvincular, vocês para mim já são como um só e os amo

de forma igual.

I miss that town I miss the faces You can't erase

You can't replace it I miss it now

I can't believe it So hard to stay

Too hard to leave it If I could relive those days

I know the one thing that would never change (Photograph – NICKELBACK)

Vocês, meus amigos, até hoje me acompanham me dando força. Sou muito feliz por

cada vitória alcançada por vocês. Como nesta conquista, em todas as futuras, quero

que vocês estejam sempre presentes comigo.

Aos meus queridíssimos amigos de João Pessoa “Portito”, “Marcellindo”,

“Jozito”, “Thaizão” e “Pats”. Quão bom é ter para onde voltar. Com eles me sinto

em casa. Os amo sem desejar nada em troca. Quando estou com eles não há

espaço para tristeza. Nenhum deles consegue imaginar o tamanho do meu amor,

mesmo que eu já tenha externado tantas vezes.

“I love you more than those ones before.”

Com vocês compartilho esta conquista e toda minha gratidão.

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“... Nada pode o olvido contra o sem sentido

apelo do Não.

As coisas tangíveis tornam-se insensíveis

à palma da mão

Mas as coisas findas, muito mais que lindas,

essas ficarão.”

(CARLOS DRUMMOND DE ANDRADE)

18

RESUMO

19

RESUMO

As anomalias vasculares constituem um grupo de lesões distintas, mas que podem apresentar características clínicas e histopatológicas semelhantes, que podem levar a equívocos diagnósticos.Este estudo objetivou por meio da histopatologia e da expressão imuno-histoquímica daproteína humana transportadora de glicose (GLUT-1), identificar e classificar corretamente as anomalias vasculares orais, além de analisar a imunoexpressão de marcadores de proliferação e apoptose (Ki-67 e Bcl-2).Todos os casos diagnosticados como “hemangiomas orais” pertencentes aos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia (DOD) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) foram revisados, totalizando 77 casos. A análise imuno-histoquímica para GLUT-1 revelou que apenas 26 (33,8%) dos espécimes tratavam-se de hemangiomas da infância (HIs) verdadeiros. Os 51 (66,2%%)espécimes GLUT-1 negativos foram então reclassificados em granulomas piogênicos (GPs) e malformações vasculares (MVs) a partir de suas características histopatológicas, totalizando 26 (33,8%) casos de HIs, 20 (26,0%) de GPs e 31 (40,2) casos de MVs orais. Os casos submetidos à análise do marcador Ki-67 apresentaram medianas diferentes HI (13,85), GP (33,70) e MV (4,55) com diferenças estatisticamente significantes entre elas (p<0,001). Em relação à proteína Bcl-2, os grupos também apresentaram diferentes medianas dos escores estabelecidos HI (1,00), GP (1,50), MVs (0,0), demonstrando diferenças estatisticamente significantes entre elas (p<0,001). Não foi observada correlação estatisticamente significante entre os índices de positividade para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2 em nenhum grupo.Dessa maneira, podemos concluir que se faz necessário uma revisão criteriosa e parametrizada dos casos de anomalias vasculares utilizando ferramentas auxiliares, como a GLUT-1, uma vez que os achados histopatológicos sozinhos, às vezes, não são suficientes para diferenciar algumas anomalias. Além disso, a análise das expressões de marcadores envolvidos nos níveis de proliferação das lesões é um aspecto importante para o melhor entendimento do seu comportamento biológico. Palavras-chave: Hemangioma. Diagnóstico Diferencial. Proteínas Facilitadoras de

Transporte de Glicose. Proliferação de células.Granuloma Piogênico.

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ABSTRACT

21

ABSTRACT

Vascular anomalies constitute a distinct group of lesions, but they may present similar clinical and histopatological characteristics, which can lead to diagnostic mistakes. This study aimed by histopathology and immunohistochemical expression of human glucose transporter protein (GLUT-1), correctly identify and classify oral vascular anomalies, besides analyzing the immunoexpression of markers proliferation and apoptosis (Ki-67 and Bcl-2). All cases diagnosed as "oral hemangiomas" belonging to the archives of the Service of Pathological Anatomy from the subject of Oral Pathology of the Department of Dentistry (DOD), of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN) were reviewed, totalizing 77 cases. Immunohistochemical analysis for GLUT-1 showed that only 26 (33.8%) of the specimens were true infantile hemangiomas (IHs). The 51 (66.2%%) GLUT-1 negative specimens were then reclassified as pyogenic granulomas (PGs) and vascular malformations (VMs) from their histopathologic characteristics,totalizing 26 (33.8%) cases of IHs, 20 (26.0%) of PGs and 31 (40.2) cases of oral VMs. The cases analyzed by the marker Ki-67 showed different median IH (13,85), PG (33,70) and VM (4.55) with statistically significant differences between them (p <0.001). In relation to the protein Bcl-2, the groups also showed different median of the established scores IH (1.00), PG (1.50), VMs (0.0) demonstrating statistically significant differences between them (p<0,001). No statistically significant correlation between the indexes of positivity for Ki-67 and the scores of immunoexpression of Bcl-2 were observed in any group. Thus, we can conclude that it is necessary a careful and parameterized review of cases of vascular anomalies making use of auxiliary tools such as GLUT-1, since the histopathological findings alone, sometimes, are not sufficient to differentiate some anomalies. Furthermore, analysis of the expressions of markers involved in the levels of proliferation of lesions is important for a better understanding of its biological behavior aspect. Key words: Hemangoma. Diagnosis, Differential.Glucose Transporte Proteins,

Facilitative. Cell Proliferation. Pyogenic, Granuloma.

22

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1- Estrutura molecular bidimensional da GLUT.................................................. 49

Figura 2- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1 em GP (A),

HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,

Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)...................................... 79

Figura 3- Fotomicrografia demonstrando as características histopatológicas (H/E) do

GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-

33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)................................ 80

Figura 4- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deKi-67 em GP (A), HI

(B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,

Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)...................................... 81

Figura 5- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deBcl-2 em GP (A), HI

(B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,

Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)...................................... 82

Quadro1-

Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de

incubação do anticorpo primário anti-GLUT-1................................................ 64

Quadro 2- Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares............. 68

Quadro 3- Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de

incubação dos anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2............................ 69

Gráfico 1- Box-plot relativo aos índices de positividade para o Ki-67 de acordo com os

grupos. Natal – RN, 2014............................................................................... 76

Gráfico 2- Box-plot relativo aos escores de imunopositividade para o Bcl-2 de acordo

com os grupos. Natal – RN, 2014................................................................... 77

24

LISTA DE TABELAS

25

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de

acordo com a imunoexpressão de GLUT-1. Natal – RN, 2014......................... 74

Tabela 2- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de

acordo com os diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de

GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014.................................. 74

Tabela 3- Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com o diagnóstico

histopatológico inicial e os diagnósticos obtidos após as análises da

imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014.. 75

Tabela 4- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma

dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os índices de

positividade para o Ki-67 em relação ao grupos. Natal – RN, 2014................. 76

Tabela 5- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma

dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os escores de

imunopositividade para o Bcl-2 em relação aos grupos. Natal – RN, 2014...... 77

Tabela 6- Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de

Spearman (r) e significância estatística (p) para os índices de positividade

para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2, de acordo com os

grupos. Natal, RN – 2014.................................................................................. 78

26

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µm Micras de metro;

A1 Proteína anexina 1

ATP Do inglês adenosine triphosphate, traduzido como adesosina

trifosfato;

Bad Refere-se à proteína antiapoptótica Bad;

Bak Refere-se à proteína pró apoptótica Bak;

Bax Do inglês Bcl-2-associated X protein, refere-se à proteína Bax;

Bcl-2 Do inglês B-cell/lymphoma 2, refere-se à proteína Bcl-2;

Bcl-w Do inglês B-cell lymphoma-w, refere-se à proteína Bcl-w;

Bcl-x Do inglês B-cell lymphoma-extra, refere-se à proteína Bcl-x;

Bcl-Xl Do inglês B-cell lymphoma-extra large, refere-se à proteína Bcl-

xL;

Bcl-xS Do inglês B-cell lymphoma-extra small, refere-se à proteína Bcl-

xS;

BH1 Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;

BH2 Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;

BH3 Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;

Bim Refere-se à proteína antiapoptótica Bim;

BSA Do inglês bovin serun albumin,traduzido como albumina de soro

bovino;

CD31 Também conhecida como PECAM-1, do ingês platelet

endothelial cell adhesion molecule-1;

CD34 Do inglês Cluster of Differentiation 34, traduzido como

grupamento de diferenciação 31;

CEP Comitê de Ética em Pesquisa;

CNS Conselho Nacional de Saúde;

COOH Refere-se à extremidade carbóxi-terminal;

DNA Do inglês deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido

desoxirribonucleico;

DOD Departamento de Odontologia;

Fcγ receptor ΙΙ Receptor para imunoglobulina G-2;

28

G Gramas;

GLUT Do ingês glucose transporter, traduzido como transportador de

glicose;

GLUT-1 Do ingês glucose transporter protein type 1, traduzido como

proteína humana transportadora de glicose tipo 1;

GP Granuloma piogênico;

HCNI Hemangioma congênito não involutivo;

HCRI Hemangioma congênito rapidamente involutivo;

HI Hemangioma da infância ou hemangioma infantil;

HMIT Do inglês H+/myo-inositol co-transporter, traduzido como

transportador H+/ligado ao mio-inositol;

ISSVA Do inglês International Society for the Study of Vascular

Anomalies, traduzido como Sociedade Internacional para o

Estudo de Anomalias Vasculares;

kDa Quilodaltons;

Ki-67 Refere-se ao antígeno celular Ki-67 ou anticorpo anti-Ki-67;

KW Teste estatístico não-paramétrico de Kruskal-Wallis;

Lewis Y Refere-se ao antígeno celular Lewis Y ou anticorpo anti-Lewis-Y;

LYVE-1 Do ingles cell surface receptor on lymphatic endothelial cells,

traduzido como receptor endotelial de vaso linfático;

mAb Anticorpo monoclonal;

Mcl-1 Do inglês pilha mielóide leukemia-1, refere-se à proteína Mcl-1;

MIB-1 Anticorpo monoclonal para identificação do antígeno Ki-67 ou

anticorpo anti-Ki-67;

Mm Milímetros;

MV Malformações vasculares;

N Quantidade;

NADPH Do inglês nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, traduzido

como nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato;

Nd:Yag Do inglês neodymium-doped yttrium aluminum garnet laser,

traduzido como Laser Nd:Yag;

NH2 Refere-se à extremidade amino terminal;

p53 Do inglês protein 53, refere-se à proteína p53;

29

Prox-1 proteína homeobox linfático-específica;

R Valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman;

SGLT Do inglês sodium-dependent glucose transport, traduzido como

transportador de glicose ligado ao íon sódio;

SNC Sistema nervoso central;

TA Temperatura ambiente;

TM10 Refere-se ao domínio transmembrana 10;

UFRN Universidade Federal do rio Grande do Norte;

USA Do inglês United States of América, traduzido como Estados

Unidos da América;

VEGFR-3 Do ingês vascular endothelial growth factor-C receptor, traduzido

como Receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular tipo

3.

30

SUMÁRIO

31

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 34

2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................... 37

2.1 ANOMALIAS VASCULARES .................................................................. 37

2.2 TUMORES VASCULARES ..................................................................... 40

2.2.1 Hemangioma da infância ...................................................................... 40

2.2.2 Granuloma piogênico ........................................................................... 45

2.5 Ki-67 e Bcl-2 ........................................................................................... 55

3 OBJETIVOS .............................................................................................. 62

3.1 OBJETIVOS GERAIS: ............................................................................ 62

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .................................................................. 62

4 METODOLOGIA........................................................................................ 64

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................... 64

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO: ........................................................ 64

4.3 POPULAÇÃO .......................................................................................... 64

4.4 AMOSTRA .............................................................................................. 65

4.4.1 Caracterização da amostra .................................................................. 65

4.4.2 Critérios de inclusão............................................................................. 65

4.4.3 Critérios de exclusão ............................................................................ 65

4.5 COLETA DE DADOS .............................................................................. 65

4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1) ............................................ 65

4.7 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1) ........................ 68

4.8 ESTUDO MORFOLÓGICO ..................................................................... 68

4.9 ANÁLISE DO PERFIL MORFOLÓGICO ................................................. 69

4.10 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (Ki-67 e Bcl-2) ................................. 71

4.11 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO(Ki-67 e Bcl-2) .............. 72

4.11.1 Ki-67 .................................................................................................... 72

4.11.2 Bcl-2 .................................................................................................... 73

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 74

5 RESULTADOS .......................................................................................... 76

5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA E DA IMUNOEXPRESSÃO DA GLUT-1 ..... 76

5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO KI-67 ........................................ 77

5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA Bcl-2 ......................................... 78

32

5.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DE Ki-67 E Bcl-2 ............. 79

6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 86

7 CONCLUSÕES ......................................................................................... 97

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 99

APÊNDICE1 ................................................................................................... 109

ANEXO1 ......................................................................................................... 118

33

INTRODUÇÃO

34

1 INTRODUÇÃO

Anomalias vasculares são lesões de natureza congênita ou adquirida cujos

componentes que predominam são estruturas vasculares. São incluídos neste grupo

os tumores vasculares benignos, como o hemangioma da infância ou hemangioma

infantil (HI) e granuloma piogênico (GP), os tumores vasculares malignos e todas as

malformações congênitas do sistema vascular (MULLIKEN; GLOWACKI, 1982;

ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;METRY; HEBERT, 2000; ENJORAS; WASSEF;

CHAPOT, 2013).

O HI é a anomalia vascular mais comum da infância e apresenta formação de

vasos sanguíneos de arquitetura incompleta que se apresentam circundados por

células endoteliais hiperplásicas, estando presente ao nascimento ou não, e

exibindo um padrão característico de proliferação seguido de eventual involução

espontânea (MULLIKEN; GLOWACKI, 1982; TUCCI et al., 2009; DROLET;

ESTERLY; FRIEDEN, 1999; MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; TUCCI et al.,

2009). Em contraste, malformações vasculares (MVs) não contêm célulasendoteliais

hiperplásicas, mas consistem na ampliação progressiva e formação de vasos

aberrantes e ectásicos, compostos de uma arquitetura vascular particular, como

veias, vasos linfáticos, vênulas, capilares, artérias ou uma mistura de padrões

vasculares (KOHOUT et al., 1998).

O GP é um tumor comum, de natureza não neoplásica, que surge geralmente

como resultado de um trauma constante e de baixo grau, má higiene oral e, em

alguns casos, por desequilíbrios hormonais (SHAIKH et al., 2012). Histologicamente,

GPs são massas exofíticas normalmente cobertas por uma membrana

fibrinopurulenta. As lesões mostram um tecido conjuntivo com arranjo lobular

distinto, com vasos centrais de maior calibre e agregados de capilares bem

formados vistos na periferia. É observado um tecido de granulação com leucócitos

polimorfonucleares especialmente em áreas adjacentes à superfície necrótica ou

ulcerada (PARIKH; SHAH; SHAH, 2011; VAIYAPURI et al., 2012).

Uma investigação precisa e uso de terminologia adequada se faz importante

para as decisões do cirurgião-dentista ao acompanhar o desenvolvimento de uma

anomalia vascular. Em muitos casos, uma anamnese detalhada e exame clínico

podem guiar o diagnóstico, porém outros métodos devem ser considerados em

casos de dúvida a partir dos dados clínicos existentes e quando a diferença no

35

diagnóstico pode influenciar no tratamento proposto. A proteína humana

transportadora de glicose (GLUT-1), identificada por North et al. (2000), tem se

mostrado útil como ferramenta auxiliar para a avaliação do prognóstico de alguns

tumores e diagnóstico diferencial entre anomalias vasculares, uma vez que se trata

de um marcador sensível e específico para a identificação de HIs de quaisquer

órgãos.

O comportamento biológico de entidade patológica é altamente dependente

da sua atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010; RANJBARI; RAHIM, 2013).

Existem alguns marcadores para a avaliação da atividade de proliferação celular,

dentre eles o Ki-67, que se apresenta expresso nas fases G1, S e G2 do ciclo celular

e durante a mitose, mas não em repouso, indicando este ser um bom marcador para

células em proliferação (FOLTYN et al., 2012; RANJBARI; RAHIM, 2013).

A taxa de crescimento de tumores depende não só da atividade proliferativa

das células tumorais, mas também da taxa de morte celular (NAKAMURA, 2000). A

apoptose é uma via de morte celular onde a célula destinada a morrer ativa enzimas

que degradam seu próprio DNA e as proteínas nucleares e citoplasmáticas (KERR;

WYLLIE; CURRIE, 1972).

Os mais importantes reguladores da apoptose, através da via mitocondrial,

são os participantes da família das proteínas Bcl-2 (COLLITI, 2012). Essa família

inclui proteínas pró- apoptóticas, como Bax, Bcl-x, e Bcl-w e antiapoptóticas, como

Bcl-2, Bad e Bim. A redução das taxas de apoptose pode favorecer o crescimento

tumoral e permitir a permanência de células neoplásicas, estimulado a progressão

tumoral (WU et al., 1999).

Diante da necessidade de obtenção de mais conhecimento acerca do

comportamento biológico dessas anomalias, este estudo busca identificar e

reclassificar os diferentes tipos de anomalias vasculares através de recursos

histopatológicos e da imunoexpressão da GLUT-1, além de comparar a expressão

de marcadores de proliferação celular e apoptose. Com os resultados obtidos,

pretende-se contribuir na compreensão das particularidades de cada lesão.

36

REVISÃO DA LITERATURA

37

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 ANOMALIAS VASCULARES

Por um longo período de tempo, as lesões de origem vascular que apareciam

ao nascimento foram denominadas nevus maternus, refletindo a crença popular da

participação da mãe nas lesões de seus filhos. Acreditava-se que emoções e

desejos da mãe durante a gestação poderiam imprimir uma marca nos recém-

nascidos e, dependendo da cultura de cada população, as mães eram culpadas por

ingerir ou não determinadas frutas vermelhas ou outros tipos de alimento durante a

gravidez, advindo daí os termos que adjetivavam as lesões como morango,

framboesa, vinho do Porto e salmão (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000;

FEVURLY; FISHMAN, 2012).

Conceitua-se anomalia vascular a lesão de etiologia congênita ou adquirida

cujos componentes em predomínio são estruturas vasculares. São incluídas neste

grupo todas as malformações congênitas do sistema vascular, tais como as

malformações arteriais, venosas, linfáticas, capilares e suas combinações, os

tumores vasculares benignos, como os HIs, hemangioendoteliomas, angiomas em

tufos, glomangiomas, GPs e também os tumores vasculares malignos, como os

hemangioendoteliossarcomas e os angiossarcomas (JACKSON et al., 1993;

DROLET; ESTERLY; FRIEDEN, 1999; METRY; HEBERT, 2000).

Durante muito tempo não houve consenso em relação à terminologia e

classificação destas lesões, gerando impacto negativo nas indicações terapêuticas,

muitas vezes aplicadas de forma heterogênea e não parametrizada, elevando a

possibilidade de condutas iatrogênicas (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010). As

primeiras classificações adotadas para a categorização das anomalias vasculares

apresentavam características puramente descritivas. Sucessivamente, foram

substituídas pelas classificações baseadas em achados anatomopatológicos,

embriológicos e pelas baseadas no comportamento biológico das lesões

(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997; ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2013).

Virchow (1863) classificou pela primeira vez as anomalias vasculares, levando

em consideração seu quadro microscópico, em angioma simples, cavernoso e

racemoso. De acordo com sua classificação, acreditava-se que cada um desses

38

tipos poderia transformar-se em outro por proliferação celular ou dilatação dos

vasos.

O termo “hemangioma” foi empregado durante anos, de forma ampla e

indiscriminada, para designar anomalias vasculares totalmente distintas quanto à

sua gênese, características clínicas e histopatológicas, evolução e prognóstico

(GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003). Assim sendo, os termos “hemangioma capilar”

ou “hemangioma em morango” eram utilizados para designar o que atualmente se

conhece como a forma superficial do HI, um tumor propriamente dito, onde se

observa a multiplicação das células endoteliais, presente ou não ao nascimento,

com fases consecutivas de crescimento, paralisação e regressão, geralmente

desprovidas de maior significado clínico e de consequências, na maioria das vezes,

apenas cosméticas (GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003; DROLET; ESTERLY;

FRIEDEN, 1999; MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).

Ao mesmo tempo, “hemangioma plano” era a denominação do que hoje é

classificado como mancha em vinho do Porto, uma MV, na quase totalidade dos

casos presente ao nascimento, com crescimento proporcional ao desenvolvimento

da criança, de caráter permanente, podendo associar-se a síndromes diversas,

como a Síndrome de Bean e a Síndrome de Mafucci. Além disso, adjetivos como

cavernoso, um termo descritivo histológico e que deve ser preservado com esse fim,

referiam-se a características clínicas como a cor azulada sugestiva de lesões

profundas (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; HIRAKI et al., 2010).

Dessa forma, lesões de naturezas diferentes, como a forma profunda do HI

(que regride espontaneamente) e as MV subcutâneas (permanentes), que

apresentam em comum apenas a coloração azulada, eram igualmente

caracterizadas como cavernosas. A nomenclatura confusa e a ausência de uma

classificação adequada foram os principais responsáveis pelas dificuldades

diagnósticas e terapêuticas das anomalias vasculares (GONTIJO; SILVA; PEREIRA,

2003).

Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma nova classificação das lesões

vasculares baseada nas manifestações clínicas, quadro histopatológico e história

natural, distinguindo-as em “hemangiomas” e “malformações vasculares”.

A falta de classificação diagnóstica aceita internacionalmente não permitia,

até recentemente, a padronização terapêutica adequada, dificultando a criação de

39

condutas protocoladas, além de comprometer a comparação entre diferentes opções

de tratamento (HIRAKI e GOLDENBERG, 2010).

Em função disso, em 1996, a classificação de Mulliken e Glowacki foi revista,

e criada uma nova classificação, adotada como oficial pela Sociedade Internacional

para o Estudo de Anomalias Vasculares – ISSVA, que divide as lesões vasculares

em dois grupos: “tumores” e “malformações” vasculares (ENJOLRAS; MULLIKEN,

1997).

Os tumores vasculares são caracterizados pela proliferação de células

endoteliais e incluem HI, hemangioma congênito rapidamente involutivo (HCRI),

hemangioma congênito não involutivo (HCNI), angioma em tufos, GPe

hemangioendotelioma kaposiforme. As MVs consistem em erros da morfogênese

vascular e são classificadas de acordo com o tipo de vaso predominante

(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997; HAND; FRIEDEN, 2002; BRUCKNER, FRIEDEN,

2003; HASSENEIN, et al., 2011).

Na atualidade, a classificação baseada no aspecto biológico é adotada

internacionalmente. Baseia-se na correlação entre comportamento biológico celular

e evolução clínica, com impacto direto no tipo de tratamento a ser definido (HIRAKI e

GOLDENBERG, 2010). No entanto, o uso de nomenclaturas antigas persiste

causando diagnósticos e, consequentemente, tratamentos incorretos (HASSENEIN,

et al., 2011; LOWE et al., 2012).

Hassenein et al. (2011) verificaram no banco de dados PubMed todas as

publicações que continham o termo “hemangioma” no título/resumo durante o ano

de 2009, excluindo os estudos com temática veterinária. Levando em consideração

a classificação proposta pelo ISSVA, os autores constataram que o termo

“hemangioma” foi utilizado de maneira incorreta em 71,3% das publicações. Os

pacientes cujas lesões eram erroneamente classificadas eram mais propensos a

receber tratamento incorreto (20,6%), enquanto os que tiveram suas lesões

classificadas de acordo com o proposto pelo ISSVA apresentaram 0,0% de conduta

incorreta durante o tratamento. Além disso, os indivíduos eram mais jovens nos

estudos que utilizavam tal classificação (4,1 meses) do que nos estudos que não

utilizavam (36,1 anos).

Assim como todas as classificações, essa não é absoluta. Porém, sua

simplicidade e relevância clínica possibilitaram um avanço importante na abordagem

das anomalias vasculares (GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003).

40

2.2 TUMORES VASCULARES

2.2.1 Hemangioma da infância

“Hemangioma da infância” ou “hemangioma infantil” é o tumor vascular mais

comum, afetando cerca de 10% de todos os infantes com um ano de idade.

(DROLET; ESTERLY; FRIEDEN, 1999; CORNISH; REDDY, 2011). Entretanto,

outros tumores vasculares mais raros têm sido descritos (GONTIJO; SILVA;

PEREIRA, 2003).

Ocorre mais frequentemente em bebês prematuros, caucasianos, do sexo

feminino, com baixo peso ao nascimento, chegando a 30% em neonatos com menos

de 1000g (GAMPER; MORGAN, 2002). Fatores de risco maternos incluem idade

avançada, pré-eclampsia e anormalidades placentárias (FRIEDEN et al., 2005). O

aumento do risco de HIs em populações submetidas a procedimentos que podem

causar embolização trofoblástica e ruptura da placenta dão suporte à teoria de

origem placentária dos hemangiomas (KAPLAN et al., 1990).

Tipicamente surgem entre duas semanas e dois meses de vida, podendo ser

simples ou múltiplos, envolver um ou vários sistemas, e pode ser focal ou regional

(CHILLER; PASSARO; FRIEDEN, 2002). Aproximadamente 80% dos pacientes

apresentam lesões únicas, sendo rara a presença de quatro ou mais lesões. A pele

é o órgão mais comumente acometido, e as regiões da cabeça e do pescoço (60%),

e o tronco (25%) são as mais afetadas. O tamanho pode variar de poucos milímetros

até vários centímetros (WERNER et al., 2001; FEVURLY; FISHMAN, 2012).

O tumor apresenta proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal, crescimento

por hiperplasia e hipertrofia celular, com características microscópicas e

ultramicroscópicas de tecido neoplásico.Apesar da sua elevada incidência, a origem

dos HIs ainda é incerta, porém teorias propostas incluem alterações intrínsecas do

feto, resposta inadequada das células endoteliais aos fatores estimuladores e

inibidores da angiogênese, incluindo também a modulação hormonal materna e

defeitos clonais nos precursores das células endoteliais (BAULAND et al., 2006;

BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009; FEVURLY; FISHMAN, 2012).Evidências acerca da

sua patogênese apontam para a expansão clonal de células progenitoras endoteliais

sujeitas a sinais celulares anormais locais ou a mutações somáticas iniciais que

favorecem a rápida proliferação (BISCHOFF, 2009; BOYE et al., 2001). No entanto,

41

a fonte dessas células progenitoras endoteliais permanece desconhecida

(FEVURLY; FISHMAN, 2012). Duas principais teorias sobre a origem dos HIs foram

postuladas.

A primeira foi proposta por North et al. (2001a). Em seu estudo foi objetivado

investigar as possíveis similaridades entre os vasos sanguíneos presentes nos HIs e

na placenta. Para esta investigação fizeram uso de marcadores vasculares que

apresentam imunopositividade em placenta, dentre eles, GLUT-1, Lewis Y, merosina

e Fcγ receptor ΙΙ (receptor para imunoglobulina G-2). Foram então avaliados 66

casos de “hemangiomas”, 26 de MVs, 13 de GPs, 6 angiomas em tufo, 7

hemangioendoteliomas epitelióides, 1 hemangioendotelioma Kaposiforme infantil, 14

angiossarcomas e de placenta.Foi então observado a coexpressão dos quatro

marcadores entre HIs e placenta, não sendo observados níveis de expressão nas

outras lesões,o que, segundo os autores, implica em uma relação íntima entre essas

duas entidades, sugerindo uma associação na origem do tumor.

Uma segunda teoria foi proposta por Dadras et al. (2004). Em seu estudo,

verificaram a expressão do receptor endotelial de vaso linfático (LYVE-1), proteína

homeobox linfático-específica (Prox-1), CD31 e CD34. Foi demonstrado que LYVE-1

é particularmente expresso em células endoteliais de HIs durante a fase proliferativa

e que essa expressão diminui com a involução da lesão. Além disso, tais células

também apresentam positividade para VEGRF-3, CD31 e CD34 e negatividade para

Prox-1.

LYVE-1 é um marcador específico para vasos linfáticos normais e associados

a tumores, que neste estudo, demonstrou estar fortemente expresso em células de

HIs, porém não expresso em outros tumores vasculares (DADRAS et al., 2004).

Este imunofenótipo das células endoteliais dos HIs se assemelha ao

encontrado na veia cardinal durante as fases iniciais da embriogênese, antes de os

vasos se tornarem maduros e/ou adquirirem características linfáticas.O estudo

sugeriu que uma população de angioblastos residentes, presos em um estágio inicial

do desenvolvimento vascular, dá origem às células endoteliais dos HIs de quaisquer

órgãos. Depois das fases iniciais de formação do sistema vascular, uma

subpopulação de células endoteliais passa a expressar Prox-1, um marcador

específico para vasos linfáticos (DADRAS et al., 2004).

Diversos fatores causais do desenvolvimento de HIs estão sendo estudados

na tentativa de compreender a sua fisiopatologia. O foco dos estudos é o

42

microambiente (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). Evidências sugerem que os tumores

vasoproliferativos são resultantes da vasculogênese (formação de vasos sanguíneos

primitivos a partir de angioblastos) em vez de angiogênese (o crescimento de vasos

a partir de vasos preexistentes) (COHEN, 2002; NGUYEN et al., 2004), como se

pensava anteriormente (CARMELIET; JAIN, 2000).

Clinicamente, a história natural do HI é dividida em três fases: a inicial, de

crescimento ou fase proliferativa, seguida da regressão espontânea ou fase

involutiva e uma terceira fase de equilíbrio final ou fase involuída (MULLIKEN;

GLOWACKI, 1982; BRUCKNER; FRIEDEN, 2003; TUCCI et al., 2009; BALLAH et

al., 2011).

Durante a proliferação, o tumor se caracteriza como lesão sólida,

compressível, que apresenta aumento de temperatura, bem delimitada e com sinais

de hiperfluxo. Eventualmente, pode se observar aumento da vascularização

peritumoral, o que explica o aumento de volume aos esforços e ao chorar (FRIEDEN

et al., 1997; BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009).

As biópsias de lesões superficiais e profundas apresentam quadros

histopatológicos semelhantes. Na fase de crescimento, observam-se agregados de

células endoteliais proliferativas constituindo cordões sólidos e massas, por vezes

com formação de pequenos lumens. Essas células tendem a se agrupar formando

lóbulos separados por finos feixes de tecido conjuntivo. Nenhum dos lóbulos é

encapsulado ou fibrótico e muitos contêm tecido normal e uma artéria alimentadora.

Podem ser evidenciados ainda trombose e depósitos de hemossiderina, que se

apresentam limitados às áreas de ulceração ou inflamação aguda. Pericitos,

fibroblastos e particularmente mastócitos são numerosos na fase tardia da

proliferação (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).

Nesta fase, o tumor cresce de maneira rápida, podendo assumir dimensões

consideráveis em proporção ao tamanho da criança. Dependendo de sua

localização, pode causar comprometimento funcional, estético e psíquico. O

crescimento neoplásico pode causar necrose da lesão por insuficiência vascular,

principalmente em suas porções centrais, levando a ulcerações de repetição e a

sangramentos e processos infecciosos locais, fatores que não exibem relação com o

potencial de regressão da lesão. A fase proliferativa é mais pronunciada nos

primeiros 3 a 6 meses de vida e alcança, na maior parte dos casos, suas dimensões

43

máximas por volta de 9 a 12 meses de vida, podendo estender-se até o segundo

ano de vida (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009; TUCCI et al., 2009).

A fase de involução é caracterizada pela diferenciação das células

mesenquimais em adipócitos e as células endoteliais que circundam os pequenos

lumens vasculares sofrem apoptose, levando à mudança de coloração (do vermelho

vivo ao pálido ou cinza) e consequente resolução da lesão (YU et al., 2006). O

processo tipicamente se inicia do centro para a periferia da lesão (FRIEDEN et al.,

1997; BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009).

Estima-se que o ritmo de involução seja de 10% ao ano e que cerca de 70%

das lesões já estejam involuídas aos sete anos de idade. Uma vez estabilizada esta

fase, considera-se o hemangioma involuído (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). A fase

involuída do hemangioma não implica obrigatoriamente em retorno à normalidade,

uma vez que no local da lesão podem permanecer sequelas, como tumor residual,

atrofia cutânea, áreas cicatriciais, telangectasia (pequenos vasos dilatados próximo

à superfície de pele ou mucosa), hipo ou hipercromia cutânea, alopécia (redução

parcial ou total de pelos ou cabelos em uma determinada área de pele) e

irregularidades de contorno (BRUCKNER; FRIEDEN, 2003).

Embora classicamente diagnosticados por seu histórico, exame físico e curso

clínico previsível, HIs biopsiados são as únicas lesões vasculares que apresentam

marcação positiva para a isoforma 1 da proteína transportadora de glicose (GLUT-1)

e demonstram maior volume de células endoteliais (MULLIKEN; ENJOLRAS, 2004).

Estima-se que apenas de 10 a 20% dos HI precisam realmente ser tratados

(BRUCKNER; FRIEDEN, 2003).Para a maioria dos casos não é necessária qualquer

intervenção e as lesões regridem espontaneamente. A pele ou mucosa que recobre

a lesão pode apresentar atrofia leve, palidez e finalmente resolução da

telangiectasia vascular (TUCCI et al., 2009).

Eventualmente, a histórial natural dos HIs demonstra complicações, e, por

vezes, apenas a conduta proservativa, se torna impossível. Durante a fase

proliferativa, a ulceração é a complicação mais comum. A localização anatômica é

muito importante, além disso, muitas complicações estão relacionadas a este

parâmetro, como por exemplo, a compressão pelo crescimento tumoral de estruturas

importantes como na região parotídea, comprometimento da via respiratória, e

tumores localizados em área orbital e de pálpebra (TUCCI et al., 2009). O

tratamento deve considerar a idade do paciente, tamanho, número e localização das

44

lesões, estágio evolutivo e presença de outros sintomas associados (FRIEDEN,

1997).

Doses elevadas de corticosteróides podem ser a base do tratamento para HIs

que comprometem funções normais do paciente. A utilização de Prednisolona e

Propanolol de forma separada ou combinada pode controlar a proliferação. A dose

pode ser diminuída gradualmente durante as semanas subsequentes (MALIK et al.,

2013). Outra opção de tratamento é a injeção de corticóide intralesional, que tem

sido aplicada com sucesso: até 40mg de Triancinolona pode ser injetado, a

depender do peso corporal do paciente, podendo ser utilizadas várias injeções com

4 a 6 semanas de intervalo (TUCCI et al., 2009).

Dentre as opções de tratamento, a escleroterapia vem sendo utilizada com

grande sucesso em lesões pequenas, sem a necessidade de intervenção cirúrgica,

alcançando resultados satisfatórios clinica e esteticamente, sendo uma opção viável

e de baixo custo para os casos de HIs orais (PALACIOS; HERRERA; LUGO, 2000).

Os hemangiomas também podem se apresentar na forma congênita, diferindo

do HI por se apresentarem completamente formados ao nascimento. Os

hemangiomas congênitos são classificados em hemangiomas congênitos

rapidamente involutivos (HCRI) ou hemangiomas congênitos não involutivos (HCNI)

(BALLAH et al., 2011).

Por muito tempo estas entidades foram consideradas variantes dos HIs, no

entanto, alguns estudos têm demonstrado diferenças histopatológicas e do

imunofenótipo entre esses dois grupos, fazendo com que pouco provavelmente eles

façam parte do mesmo espectro de lesões (NORTH et al., 2000; BALLAH et al.,

2011). North et al. (2001b) demonstraram em seu estudo que há expressão positiva

de GLUT-1 nos HI, porém esta positividade não é demonstrada nos casos de formas

congênitas, categorizando-as então como lesões distintas.

HCRI parecem ser lesões incomuns, porém não raras, pois com sua rápida

involução, podem facilmente passar despercebidas. Apresentam-se geralmente

como lesões únicas de cinza a violáceas, podendo ser planas ou elevadas e estão

associadas à telangiectasia. Geralmente se apresentam associados a alguma

condição sistêmica e regridem antes de o indivíduo completar um ano de vida

(KROL; MACARTHUR, 2005).

O HCNI é um tumor raro, que se apresenta completamente formado ao

nascimento, com crescimento proporcional ao crescimento geral da criança, sem

45

regressão e, menos comumente, ulceração central, cicatriz ou nodularidade. (KROL;

MACARTHUR, 2005; SHAM; SULTANA, 2012). Seu padrão de crescimento o

distingue dos HI verdadeiros. As características histopatológicas incluem

organização vascular lobular, com células endoteliais apresentando núcleo

achatado, presença de veias dilatadas e, por vezes, artérias permeando os lóbulos.

Fístula arteriovenosa dérmica, um grande vaso no centro dos lóbulos e áreas de

calcificação também são comumente encontrados. Os HCNI devem ser

diferenciados dos HI devido às diferenças na sua evolução e necessidade de

diferentes condutas pelo clínico. Devem ser observados por 18 meses e em caso de

não involução da lesão, deve ser considerada a realização de análise

imunoistoquímica, uma vez que o HCNI é GLUT-1 negativo (SHAM; SULTANA,

2012).

2.2.2 Granuloma piogênico

O GP é um tipo de proliferação não neoplásica. O termo “hiperplasia

inflamatória” é usado para descrever uma grande variedade de crescimentos

nodulares na mucosa oral, como os GPs, e, histologicamente, inflamação e tecido

de granulação (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).

O “hemangioma lobular capilar”, como era antigamente denominado o GP, é

uma lesão vascular adquirida, clinica e histologicamente semelhante ao HI, porém,

em geral, de dimensões menores (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).

O GP é uma das lesões tumorais mais comuns da cavidade oral. Mostra uma

proliferação altamente vascular, por vezes organizada em agregados lobulares.

Devido a alguns tipos de comportamento, como crescimento rápido, ocorrência

múltipla e frequente recorrência, alguns pesquisadores o consideram como uma

neoplasia benigna, porém, é, sobretudo, considerada uma lesão tumoral reacional,

como resposta a vários estímulos, tais como fatores traumáticos, hormonais

(aumento dos níveis de estrógeno e/ou progesterona) ou certos tipos de drogas

(NAKAMURA, 2000; JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; VERMA et

al., 2012).

Apesar de originalmente acreditar-se que o GP era causado por

microorganismos piogênicos, atualmente é sabido que a lesão não está relacionada

com infecção. Dessa maneira, o termo “granuloma piogênico” é um termo impróprio

46

porque a lesão não contém pus nem é um granuloma propriamente dito

(JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; REGEZZI; SCIUBBA; JORDAN,

2008).

Alguns fatores como tais como o indutor da proteína óxidonítrico sintase, fator

de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento fibroblástico básico e fator

de crescimento do tecido conjuntivo estão envolvidos na sua angiogênese e rápido

crescimento (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006). No entanto, deve

ser enfatizado que o rápido crescimento dos GPs não é dependente apenas de

fatores proliferativos, mas também de sua taxa de morte celular, como sugerido por

Nakamura et al. (2000), que a baixa taxa apoptótica está intimamente relacionada

com o rápido crescimento do tumor e que esse aspecto é dependente das proteínas

da família Bcl-2, que regulam funções pró e antiapoptóticas.

Aproximadamente um terço das lesões ocorre após trauma e a pobre higiene

oral pode ser um fator precipitante para muitos dos pacientes. Adicionalmente,

algumas drogas, como a ciclosporina mostram um importante papel na patogênese

dessas lesões (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; TOLENTINO;

TOLENTINO, 2009).

Embora possa acometer pacientes de qualquer idade, acomete

predominantemente adultos jovens do sexo feminino, possivelmente devido à

influência dos hormônios femininos sobre a proliferação vascular (JAFARZADEH;

SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).

O GP oral é, na verdade, o tumor gengival mais comum, demonstrando uma

forte predileção pela gengiva, atingindo 75% de todos os casos, onde ele é

possivelmente causado por cálculo gengival ou material externo dentro da gengiva

cervical. Seguem como lugares de mais comum acometimento o lábio, língua e

mucosa jugal (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).

As lesões são discretamente mais comuns na gengiva maxilar do que na

mandibular. A região anterior é mais frequentemente acometida que a posterior e a

vestibular mais que a lingual ou palatina, alguns alcançando maiores dimensões e

atingindo tanto a região vestibular quanto lingual ou palatina (JAFARZADEH;

SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).

Gordón-Núñezet al. (2010) em seu estudo realizaram um levantamento

epidemiológico acerca desses tumores em uma população brasileira. Com uma

amostra constituída de 293 casos de GPs, verificaram que havia uma predileção

47

pelo sexo feminino, com relação feminino/masculino de 2,38:1. A idade média dos

pacientes era de 27 anos e um elevado grau de ocorrência foi observado na

segunda década de vida. Pacientes brancos foram mais comumente afetados

(44,7%) do que aqueles com outra cor de pele. O local maior acometimento foi a

gengiva (83%), com maior prevalência na maxila. A maioria dos casos era

sintomática e com sangramento.As lesões foram descritas como nódulos (71,9%) de

consistência mole (62,3%), superfície eritematosa (73,2%), pediculadas em 61,1%

dos casos, e o tamanho médio foi de 1,3 cm. Diante dos dados obtidos, os autores

concluíram que as características clínicas, demográficas e patológicas do GP na

população brasileira foram semelhantes aos estudos de populações de outros

países.

Clinicamente se apresenta como uma lesão de crescimento exofítico, de

superfície lisa ou lobulada, eritematosa, de base séssil ou pediculada e comumente

sangrante (AL-KHATEEB; ABABNEB, 2003; MARTINS-FILHO et al., 2011).

O tamanho pode variar de poucos milímetros até alguns centímetros, no

entanto, raramente os 25mm são excedidos. Pode apresentar crescimento lento e

assintomático ou aumentar de tamanho rapidamente. A superfície é

caracteristicamente ulcerada e friável, podendo ser sobreposta por uma membrana

fibrinosa amarelada (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; MARTINS-

FILHO et al., 2011).

Lesões recentes se apresentam com aparência altamente vascular porque

são compostas basicamente por tecido de granulação hiperplásico onde o grande

número de capilares é proeminente. O menor trauma na lesão pode levar ao

sangramento devido sua evidente vascularidade. Lesões maduras se tornam mais

colagenizadas e róseas (GOODMAN-TOPPER; BIMSTEIN, 1994).

Ao exame microscópico, o GP demonstra alta proliferação vascular e infiltrado

inflamatório, semelhante a um tecido de granulação. Observam-se numerosos

pequenos vasos, muitos deles congestos por hemácias, limitados por células

endoteliais variando, em sua morfologia, de fusiformes a ovoides, podendo

apresentar atividade mitótica. Os numerosos vasos se dispõem em aglomerados

lobulares vasculares separados por septos de tecido conjuntivo fibrovascular. Um ou

mais vasos centrais desenvolvem um lúmen maior com uma camada muscular

espessa (PATIL; MAHIMA; LAHARI, 2006; JAFARZADEH; SANATKHANI;

MOTASHAM, 2006). O estroma é constituído de fibroblastos de morfologia

48

arredondada a fusiforme e é evidente a presença de um moderado a intenso

infiltrado inflamatório misto. A superfície da lesão é frequentemente ulcerada e

substituída por uma membrana fibrinopurulenta, sendo a população de células

inflamatórias polimorfonucleares predominante nessas áreas (REGEZI; SCIUBBA,

JORDAN, 2008).

O GP faz diagnóstico diferencial com outras anomalias vasculares, como os

HI, podendo ser completamente indistinguíveis clínica e histologicamente. O estudo

imunoistoquímicoatravés do anticorpo anti-GLUT-1 tem mostrado ser uma poderosa

ferramenta para a diferenciação dessas lesões (LEON-

VILLAPALOS; WOLFE; KANGESU, 2005).

O tratamento indicado para a lesão é a biópsia excisional, exceto quando o

procedimento possa produzir marcante deformidade local. Nesses casos, a biópsia

incisional é mandatória. O manejo da lesão depende da severidade dos sintomas.

Embora a excisão cirúrgica conservadora e a remoção dos agentes irritantes sejam

o tratamento usual, para lesões em gengiva, a excisão cirúrgica deve ser estendida

até o periósteo e o dente adjacente criteriosamente raspado para a eliminação da

origem da irritação constante (ESMELI; LOZADA-NUR; EPSTEIN, 2005).

Adicionalmente, algumas abordagens alternativas como a criocirurgia, excisão por

laser Nd:YAG, laser de corante pulsado, injeção de corticosteróide ou etanol, e

escleroterapia com sulfato de sódio tetradecil tem sido relatadas como eficazes no

tratamento dos GPs orais (ESMELI; LOZADA-NUR; EPSTEIN, 2005; JAFARZADEH;

SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).

2.3 MALFORMAÇÕES VASCULARES

As MVs são resultantes de erros na formação vascular durante a vida

embrionária, que não exibem atividade proliferativa ou tumoral. Na verdade, os

vasos sanguíneos que se acumulam nessas lesões vão gradualmente aumentando

de diâmetro sem proliferação do endotélio vascular. Podem ser classificadas com

base no seu tipo de fluxo de sangue em lesões de fluxo lento (as de origem venosa,

capilar e linfática) e lesões de alto fluxo (arteriovenosa). Combinações de diferentes

tipos de malformações também podem ser observadas mais raramente. (KANG;

SONG, 2008; FEVURLY; FISHMAN, 2012; CANDAMOURTY et al., 2012).

49

Estão sempre presentes ao nascimento (congênitas) e não proliferam ou

involuem. Apresentam crescimento proporcional ao crescimento geral do indivíduo e

não demonstram regressão espontânea e microscopicamente apresentam vasos

dilatados, limitados por fino endotélio. As MVs são ocasionalmente propensas à

expansão devido a diversos estímulos, como trauma, alterações endócrinas

(puberdade, gravidez) ou infecção (KANG; SONG, 2008).

MVs congênitas estão presentes em cerca de 1 a 1,5% da população. A

maioria é esporádica, ou seja, não familiar, mas alguns casos exibem clássica

herança mendeliana. Embora a patogênese das malformações do sistema vascular

permaneça desconhecida, avanços recentes foram feitos na compreensão do

desenvolvimento vascular sanguíneo e linfático, que abrem as portas para um maior

conhecimento sobre as aberrações observadas (FEVURLY; FISHMAN, 2012).

Essa anomalia pode causar graves alterações estéticas e complicações locais

(destruição de estruturas anatômicas, infecção, obstrução, dor, trombose,

ulceração), podendo também levar à coagulação intravascular disseminada, embolia

pulmonar, trombocitopenia e insuficiência cardíaca congestiva (ABRAMOWICZ;

PADWA, 2012). Ressecções geralmente são requeridas, especialmente para

malformações arteriovenosas (KANG; SONG, 2008).

No passado, a utilização de um único termo para designar uma variedade de

anomalias vasculares, muitas vezes conduzia ao pensamento equívoco de que

essas lesões supostamente iriam desaparecer nos primeiros anos de vida dos

infantes acometidos. Como consequência, MVs congênitas eram muitas vezes

erroneamente mal diagnosticadas e não tratada, e a abordagem para o diagnóstico

correto não era homogênea (TUCCI et al., 2009; HASSENEIN et al., 2011).

MVs assintomáticas não necessitam de nenhum tratamento, porém em caso

de complicações, como ulcerações e/ou sangramento, o tratamento cirúrgico é

mandatório. Durante o estágio pré-operatório, a realização de ressonância

magnética e angiografia se fazem essencial. Uma terapia alternativa é a

escleroterapia por meio de inoculação direta de substâncias esclerosantes

culminando na oclusão dos vasos. Para as MVs capilares, o tratamento de escolha

pode ser a laserterapia com laser de corante pulsado (TUCCI et al., 2009).

50

2.4 ISOFORMA 1 DA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE GLICOSE

(GLUT-1)

A glicose éa principal fontede energia eé umsubstratoimportante paraa

síntese deproteínas elipídeosem células de mamíferos. Ela forneceenergia na

formade ATPatravés da glicólise e do ciclo de ácidocítrico (ciclo de Krebs) e na

forma de NADPHpela via da pentose fosfato. Também é utilizada na síntese de

glicerol e para a produção de triglicérideos e proporciona intermediários para a

síntese de aminoácidos não essenciais (ZHAO; KEATING, 2007).

Nos mamíferos, uma vez que os níveis de glicose no sangue estejam

mantidos dentro de uma estreita gama de mecanismos de homeostase, a maioria

das células recebe glicose a partir do fluido intersticial por um processo de

transporte passivo, a difusão facilitada, impulsionada pelo gradiente de concentração

para o interior celular através da membrana plasmática (WIDDAS, 1988).

Apenas em células epiteliais com bordas em escova do intestino delgado e

dos túbulos contorcidos proximais dos rins, a glicose é absorvida, ou reabsorvida,

contra o seu gradiente eletroquímico por um mecanismo de transporte ativo

secundário, a bomba de sódio e potássio (ZHAO; KEATING, 2007).

Os processos de transporte de glicose são mediados por duas famílias

distintas de transportadores de glicose estruturalmente relacionados. O processo de

transporte passivo facilitado é mediado pela família das proteínas facilitadoras do

transporte de glicose (GLUTs) e o transporte ativo é mediado pela família de

proteínas co-transportadoras dependentes de sódio (SGLTs), que apresenta seis

membros, porém apenas SLGT1 e SLGT2 já são bem caracterizadas (JOOST et al.,

2002; WRIGHT; TURK, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).

As GLUTs apresentam peso molecular entre 50 e 60 kDa e são denominadas

GLUT-1 a 12, HMIT-H+- ligado ao mio-inositol e GLUT14 de acordo com a ordem

cronológica de caracterização (WU; FREEZE, 2002; SCHEEPERS; JOOST;

SCHURMANN, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006;). A GLUT-1 se

apresenta, em humanos, com 492 aminoácidos e peso molecular de

aproximadamente 54kDa (ZHAO; KEATING, 2007).

Uma ampla pesquisa do genoma no GenBank indicou que as GLUT1-12 e

HMIT podem representar todos os membros de facilitadores do transporte passivo

de glicose em humanos (JOOST; THORENS, 2001).

51

Estas proteínas são estruturalmente semelhantes e relacionadas. A análise

destas proteínas indica que esta família de transportadores apresenta uma estrutura

terciária de 12 domínios transmembranares hidrofóbicos. Esses domínios são

conectados por segmentos hidrofílicos intra e extracelulares e possuem porções

terminais NH2 e COOH citoplasmáticas (Figura 1) (THORENS; CHARRON; LODISH

1990; JOOST; THORENS, 2001; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).

Figura 1- Estrutura molecular bidimensional da GLUT.

Fonte: Adaptado de Machado, Schaan e Seraphim, 2006.

Comparações de sequência de todos os membros da família mostram que as

sequências são mais conservadoras nas regiões transmembranares, sugerindo que

esses domínios são responsáveis pela característica comum a todas as GLUTs, que

é a capacidade de transportar a glicose, e mais divergente nas regiões de loops e

regiões C e N-terminais (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).

Estes dados sugerem que os aminoácidos conservados desempenham

papéis importantes na ligação ao substrato e/ou na alteração de conformação

durante o processo de transporte. Ademais, a presença de áreas comuns sugere

que esta família pode ter origem a partir de um gene ancestral comum (ZHAO;

KEATING, 2007).

As regiões mais divergentes são os loops 1 e 9 e as duas regiões terminais,

seugerindo que esses domínios sejam responsáveis pela especificidade de cada

isoforma, tais como localização celular, características cinéticas, regulação hormonal

e imunogenicidade. (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).

52

Além disso, há 18 resíduos de glicina conservados, 11 dos quais são

adjacentes a um ou mais aminoácidos conservados. Experimentalmente, um

triptofano do domínio transmembrana (TM10) tem sido demonstrado ser essencial

para a ligação da GLUT-1 aos ligantes da citocalasina B e forscolina. E o triptofano

conservado em todas as GLUTs no domínio transmembrana 11 é essencial para o

transporte de glicose pela GLUT-1 através da membrana plasmática (GARCIA et al.,

1992; SCHURMANN et al., 1993). Além da glicose, a GLUT1 também transporta

galactose, manose e glicosaminas (ULDRY et al., 2002).

A troca da arginina conservada no loop 2, duas argininas em loop 8,

glutamato em loop 8, prolina no domínio transmembrana 10, glutamato ou arginina

no loop 10 reduz ou suprime a atividade de transporte de glicose da GLUT-1 (MORI

et al., 1994; SCHURMANN et al., 1997). Os últimos 24 aminoácidos na região C-

terminal da GLUT-1 demonstraram ser desnecessários para a atividade de

transporte (MURAOKA, 1995).

A GLUT-1 é altamente expressa em endotélio microvascular de tecidos de

barreira, onde o fluxo seletivo de glicose do sangue para os tecidos é de extrema

importância, tais como sistema nervoso central (SNC), retina, íris, músculo ciliar,

endoneuro de nervos periféricos e placenta (TAKATA et al., 1990; YOUNES et al.,

1997; NORTH et al., 2000; WOOD; TRAYHURN, 2003). A GLUT-1 pode

desempenhar um papel vital para a entrada de glicose nesses tecidos firmemente

protegidos (TAKATA et al., 1990).

Também é observada expressão em eritrócitos, correspondendo a cerca de

5% das proteínas de membrana deste tipo celular, centros germinativos dos tecidos

linfoides e túbulos renais, além de tecido adiposo e algumas células hepáticas

(TAKATA et al., 1990; YOUNES et al., 1997; WOOD; TRAYHURN, 2003; ZHAO;

KEATING, 2007).

Hogan, Gjedde e Hakim (1991) em seu estudo, coletaram embriões de ratos

antes da implantação do zigoto, entres os estágios de ovócito e blastocitso, e

identificaram a presença da isoforma 1 da GLUT em quase todos os tecidos

examinados, incluindo cérebro e eritrócitos.

Essa proteína não é expressa na vasculatura de qualquer outro tecido normal

ou tumor vascular. Não apresenta relação com atividade mitótica e é considerado

um marcador sensível e específico para diagnóstico do HI mostrando-se presente

em todas as suas diferentes fases evolutivas (ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;

53

ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2013). Células da placenta e de HIs parecem ter o

mesmo ciclo de vida, o que sugere que os HI podem resultar de células placentárias

embolizadas (NORTH et al., 2001a). Células progenitoras que podem ter origem a

partir da placenta são encontradas dentro da anomalia (LO; MIHM; FAY, 2009;

NORTH et al., 2001a).

North et al. (2000) realizaram um estudo sobre a marcação imunoistoquímica

de GLUT-1 em diferentes anomalias vasculares. Eles encontraram intensa

imunorreatividade para GLUT-1 nos HIs, demonstrando mais de 50% de marcação

nas células endoteliais dos microvasos lesionais em 97% dos casos. Além disso,

não foi observada imunorreatividade para GLUT-1 em nenhum caso de MVs, GPs e

hamangioendoteliomas. Esses achados estabeleceram a GLUT-1 como um

marcador altamente sensível e específico para a identificação de HIs de qualquer

órgão.

Em seu estudo, North et al. (2001b) objetivaram comparar as características

histológicas e imunoistoquímicas dos HIs e HCNIs. Foram utilizados no estudo 43

lesões obtidas a partir de 36 pacientes, incluindo 25 casos de HIs, 10 GPs, 1

angioma em tufo, 1 hemangioendotelioma kaposiforme infantil e 6 casos de HCNIs

de pacientes com até 4 meses de idade. Foi então realizada a análise

imunoistoquímica fazendo-se uso dos antígenos GLUT-1 e LeY e foi verificado que

100% dos HIs demonstravam imunpositividade para ambos os marcadores e, de

maneira adversa, nenhum dos outros casos demonstrou tal positividade. Foram

observadas também diferenças histopatológicas entre os HIs e os HCNIs. Os

autores concluíram que os HCNIs são histologicamente e imunofenotipicamente

diferentes dos HIs e que esses dois tipos de tumores representam entidades

diferentes, apesar de algumas similaridades clínicas.

MO et al. (2004) verificaram que havia deficiência de uma terminologia

adequada para as anomalias vasculares hepáticas. Diante disso realizaram um

estudo com 19 casos utilizando diversos marcadores vasculares, incluindo a GLUT-

1. Seus resultados indicaram que há dois distintos grupos de lesões vasculares

hepáticas em neonatos e crianças, o HI hepático, que apresenta positividade para

GLUT-1, e as MV hepáticas que são GLUT-1 negativas. Desta maneira os autores

concluíram que a GLUT-1 se apresenta como uma eficiente ferramenta na distinção

entre HIs e MVs hepáticos.

54

Nguyen et al. (2004), observaram em seu estudo, uma intensa marcação para

GLUT-1, em células endoteliais de todos os casos de HIs localizados em tronco,

genitália e na cabeça, incluindo 4 casos em boca (2 casos no lábio e 2 em mucosa

jugal).

Johann et al. (2007), objetivando verificar a acurácia do diagnóstico

histológico de “hemangiomas”, MVs e GPs orais, investigaram a imunoexpressão da

GLUT-1 nessas anomalias. Foram utilizados 19 casos de hemangiomas, 48 GPs e

17 MVs orais. Foi observado que nenhum dos casos de lesões vasculares benignas

orais apresentou imunopositividade para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados

inicialmente como hemangiomas orais mostraram negatividade para GLUT-1, sendo

então reclassificados como GPs ou MVs, através de uma análise mais detalhada

dos casos. A análise histológica não foi suficiente para concluir o diagnóstico dos

HIs pelo fato de nenhum desses se tratar HI verdadeiro. Além disso, todos os casos

que foram inicialmente classificados como GPs e MVs foram imunonegativos para

esta proteína, o que demonstrou a eficácia da análise histológica para estas lesões.

Dessa maneira, os autores concluíram que a GLUT-1 se trata um marcador efetivo

no auxílio para a definição do diagnóstico das lesões vasculares benignas orais.

Browning et al. (2009) diante do fato de que GPs em infantes são comumente

confundidos com HIs, realizaram uma análise imunoistoquímica fazendo-se uso do

marcador GLUT-1. Em ambos os casos não foi observada a imunopositividade para

o marcador, dando suporte à manutenção do GP como diagnóstico apropriado.

Song et al. (2011) realizaram um estudo na tentativa de distinguir HCNIs de

HIs através de estruturas histopatológicas e da imunoexpressão de GLUT-1. Foram

incluídos no estudo 13 casos de HCNI, 13 casos de HI em proliferação e 13 casos

de HI em involução coletados através de biópsias. Nos casos de HCNI, os lóbulos

de capilares se mostravam bem definidos, cercados por tecido fibroso abundante,

com os vasos capilares íntegros, por vezes, de calibres aumentados. Figuras de

mitose e corpos apoptóticos eram vistos eventualmente em células endoteliais e

estromais. Os achados patológicos dos HIs, segundo ou autores, eram totalmente

diferentes. A análise muno-histoquímica revelou que a GLUT-1 foi expressa nas

células endoteliais dos HIs, mas nos casos de HCNI essa expressão não foi

observada.

Osaki et al. (2013) realizaram um estudo com anomalias vasculares orbitais.

Foram utilizados no estudo 10 casos de HIs e 10 casos de “lesão venosa

55

encapsulada cavernosa” ou MVs orbitais. Foi observado que todos os casos de HIs

apresentaram positividade para GLUT-1, enquanto que nenhum dos casos de MVs

apresentou tal positividade. De acordo com os autores, a imunopositividade para

GLUT-1 observada apenas nos HIs destacou uma diferença essencial, uma vez que,

este marcador melhorou a precisão diagnóstica, principalmente quando as áreas

sólidas dos HIs, em fase tardia, sofrem transformação em canais vasculares

ectásicos, mas ainda assim apresentam-se GLUT-1 positivas.

Oliveira et al. (2014) em seu estudo analisaram a expressão imunoistoquímica

de 30 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas” e 30 casos

diagnosticados como GP orais. A partir do teste imunoistoqúimico foi verificado que

apenas 7 dos casos de “hemangiomas” tratavam-se de HIs verdadeiros, enquanto

que os outros 23 casos não apresentaram positividade para GLUT-1. Os espécimes

GLUT-1 negativos foram então reclassificados em GP (10) e MV(13) orais. Nenhum

dos casos de GP apresentou positividade para GLUT-1, sendo então mantido o seu

diagnóstico histológico inicial. Dessa maneira, os autores concluíram que apenas as

características histopatológicas não são suficientes para o correto diagnóstico dos

HIs orais.

2.5 Ki-67 e Bcl-2

A proliferação celular é um processo biológico de fundamental importância

para todos os seres vivos por seu importante papel na homeostase tecidual e é

controlada por mecanismos altamente coordenados. Progressos substanciais na

compreensão dos mecanismos e da regulação do ciclo celular foram feitos nos

últimos anos e verificou-se que numerosas moléculas são associadas ao ciclo

celular e suas modulações (SCHLÜTER et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al.,

2012).

O ciclo celular é constituído por uma série de fases, durante a qual ocorrem

alterações que conduzem a divisão celular. Genes de células reguladoras modulam

o ciclo celular de uma forma altamente sofisticada através de uma variada

quantidade de proteínas (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000).

Marcadores de proliferação referem-se a proteínas específicas ou outros

fatores cuja presença em células em divisão serve como um indicador de

crescimento ativo para tais células. Hoje em dia, o método mais comum para a

56

determinação da atividade proliferativa é a utilização de técnicas imunoistoquímicas,

que são cada vez mais aplicadas na rotina patológica. (BOLOGNA-MOLINA et al.,

2012).

Em 1983, um anticorpo monoclonal (mAb), designado Ki-67, que reage

seletivamente com os núcleos das células em proliferação em todos os tecidos

humanos testados foi descrito (GERDES et al., 1983). Trata-se de um marcador

clássico de proliferação celular, que tem sido amplamente aplicado nos campos de

pesquisa de diagnóstico. O anticorpo padrão para a detecção de Ki-67 é o MIB-1

(BOLOGNA-MOLINA et al., 2012).

Análises detalhadas do ciclo celular revelaram que este antígeno associado à

proliferação é expresso em todas as partes ativas do ciclo celular (G1, S, G2, e

mitose), mas está ausente na fase de repouso (G0), indicando que o antígeno Ki-67

pode ser utilizado como um marcador para as células em proliferação (GERDES et

al., 1984; KIM et al., 2012).

O controle deste importante processo é completamente desregulado em

alguns tipos de neoplasias. Em consequência, a determinação da fase de

crescimento com o antígeno Ki-67 tem sido largamente utilizada na histopatologia,

particularmente em numerosos estudos sobre o valor prognóstico da avaliação da

proliferação de células em amostras clínicas de neoplasmas humanos (SCHLÜTER

et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al., 2012)

Na fase G1, o antígeno Ki-67 é predominantemente localizado na região

perinucleolar e, nas últimas fases do ciclo celular, é detectado também em todo o

interior nuclear, sendo predominantemente localizado na matriz nuclear. Na mitose,

está presente em todos os cromossomos e aparece em uma estrutura reticulada que

envolve os cromossomos metafásicos (VERHEYEN et al., 1989; GERDES et al,

1984; SCHLÜTER et al., 1993;).

Em contraste com muitas outras proteínas celulares associadas ao ciclo

celular, o antígeno Ki-67 é ausente em células quiescentes e não é detectável

durante os processos de reparação do DNA. Assim, a presença do antígeno Ki-67 é

estritamente associada com o ciclo celular e confinada ao núcleo, sugerindo um

papel importante desta estrutura para a manutenção e/ou regulação do ciclo de

divisão celular (SCHLÜTER et al., 1993; KIM et al., 2012;).

North et al. (2000) em seu estudo analisaram a possibilidade de haver alguma

analogia entre o marcador GLUT-1 e a atividade proliferativa medida pela

57

imunomarcação para KI-67. Os autores encontraram em seus resultados que a

expressão de GLUT-1 não apresenta ligação direta com o marcador de proliferação

Ki-67, uma vez que HIs GLUT-1 positivos, em fase tardia, apresentavam pouca, ou

nenhuma, imunorreatividade para KI-67 ou figuras de mitose aparentes, no entanto

demonstravam intensa marcação para GLUT-1. Em contraste, células endoteliais de

amostras de GP e tecido de granulação apresentavam intensa imunorreatividade

para Ki-67, mesmo sendo observada completa ausência de marcação para GLUT-1

nessas lesões.

Em seu estudo, Nakurama (2000) comparou a imunoexpressão de Ki-67 em

GPs, “hemangiomas capilares” e amostras de tecido de granulação, onde

apresentou marcação com intensidade variável sem diferença estatisticamente

significativa entre as lesões.

Dyduch et al. (2004) também tentaram estabelecer uma ligação entre GLUT-1

e Ki-67. Em seu estudo foram utilizados 26 casos de “hemangioma capilar infantil”

(HI), 15 de “hemangioma capilar lobular” (GP) e 9 de “hemangiomas epitelióides” da

pele. Os autores encontraram uma relação inversamente proporcional da expressão

desses marcadores, no entanto, tal relação não apresentava significância estatística.

Dessa maneira, os autores concluíram que a expressão da GLUT-1 nas anomalias

vasculares não era dependente do seu potencial proliferativo.

Apesar de as MVs serem consideradas um tipo de anomalia vascular sem a

presença de proliferação endotelial, Meijer-Jorna et al. (2012) demonstraram que

áreas de vasos imaturos dentro das malformações vasculares podem apresentar

imunopositividade para o Ki-67, sugerindo que essas áreas podem apresentar o

mesmo padrão de proliferação celular e maturação que é observado em outras

lesões vasculares de pele e mucosa, como o GP e o HI de quaisquer órgãos.

O comportamento biológico de qualquer lesão é altamente dependente da sua

atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010; RANJBARI; RAHIM, 2013). No entanto,

a taxa de crescimento das lesões depende não apenas do nível de proliferação das

células tumorais, mas também das taxas de morte celular (NAKAMURA, 2000).

A apoptose é a via de morte celular que é induzida por um programa

intracelular altamente regulado, onde as células que estão destinadas a morrer

ativam enzimas que degradam seu material nuclear e as proteínas citoplasmáticas

(KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

58

Ela é caracterizada morfologicamente por encolhimento da célula,

condensação e marginação da cromatina nuclear, brotamento da membrana celular,

fragmentação celular formando corpos apoptóticos e ausência de uma reação

inflamatória (IWATA et al., 1996). A membrana plasmática da célula permanece

intacta, mas sua estrutura é alterada de forma que a célula apoptótica se torna um

alvo primário da fagocitose. A célula morta é eliminada rapidamente, antes que seu

conteúdo possa extravasar e, dessa forma, não desencadeia uma reação

inflamatória pelo hospedeiro (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

Bioquimicamente, o DNA de células apoptóticas é clivado devido à ativação

de endonucleases. A apoptose desempenha um papel importante na morfogênese

fetal e em várias condições fisiológicas e patológicas. Vários fatores têm sido

propostos como reguladores deste fenômeno. O antígeno Fas, e a proteína p53

estimulam a apoptose, enquanto que a proteína Bcl-2 a inibe (IWATA et al., 1996).

A apoptose é uma forma de morte celular com características diferentes das

da necrose, que é caracterizada pela perda da integridade das membranas, digestão

enzimática das células e ocorre reação inflamatória do hospedeiro. (IWATA et al.,

1996; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

A proliferação e regressão das células endoteliais são rigidamente

controladas por mecanismos fisiopatológicos sob várias condições. No entanto, em

células neoplásicas, que se caracterizam pelo crescimento excessivo descontrolado,

o equilíbrio entre a proliferação e morte celular é interrompido (NÖR et al., 2001).

A família Bcl-2, um grupo de proteínas reguladoras, controla a via central

apoptótica e protege as células, através da via mitocondrial, de uma variedade de

estímulos apoptóticos (MURAKAMI et al., 2008). Esta família inclui proteínas

antiapoptóticas, tais como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B e A1 e pró-apoptóticas,

como Bax, Bcl-xS, Bad e Bim. A apoptose é regulada por estas proteínas através de

mecanismos que envolvem alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial

externa (COLITTI, 2012).

A sequência de aminoácidos homólogos de ambos os membros

antiapoptóticos e pró-apoptóticas é confinada a quatro regiões específicas

chamadas de domínios homólogos Bcl-2 (BH1-4). Estes domínios são essenciais

para a função destas proteínas, incluindo o seu impacto sobre a sobrevivência das

células e a sua capacidade de interagir com outros membros da família e proteínas

reguladoras, de modo a formar homo ou heterocomplexos (HIROTANI et al., 1999)

59

As proteínas também contêm um domínio C-terminal hidrofóbico, que

acredita-se estar envolvido na orientação das proteínas de membranas

intracelulares (COLITTI, 2012)

As proteínas multidomínios antiapoptóticas residem principalmente na

mitocôndria e possuem quatro ou dois domínios BH. Os domínios BH1 e BH2 são

necessários para a proteína Bcl-2 e Bcl-xL interagir com Bax e para suprimir a

apoptose. Nas proteínas pró-apoptóticas, o domínio BH3 foi demonstrado ser

necessário para a sua atividade de morte. Como especialmente demonstrado por

uma abordagem genética, o BH3 não só neutraliza os membros da família Bcl-2

antiapoptóticos, mas também pode ativar diretamente Bax ou Bak, que são

componentes essenciais da via de apoptose mitocondrial (COLITTI, 2012; MERINO

et al., 2009; WEI et al., 2001).

A proteína Bcl-2 prolonga a sobrevida celular, no entanto, não dispõe de

vantagens proliferativas. Num contexto adverso, as células que expressam Bcl-2,

consequentemente demonstram um potencial de resistência à apoptose, podendo

apresentar a supressão da morte celular programada, adquirir mutações e culminar

com a progressão tumoral (FARIAS; SOUZA; AARESTRUP, 2005).

Itawa et al. (1996) em seu estudo comparando taxa de proliferação e

apoptose em “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP)

verificaram marcação positiva para o antígeno de proliferação Ki-67 sem diferenças

significativas entre os grupos. E, ao mesmo tempo, encontraram nenhuma ou muito

pouca expressão de Bcl-2 em ambos os grupos. Por outro lado, fazendo uso do

antígeno Lewisy, um marcador pró-apoptótico, foi observado marcação positiva para

HI e negativa para GP, sugerindo a apoptose como a causa da involução

espontânea dos HIs observados.

Nakamura (2000) em seu estudo, analisaram a expressão de proteínas

reguladoras da apoptose em GP, “hemagiomas capilares” e tecido de granulação.

Foi observado maior expressão de Bcl-2/Bax em GP do que em tecidos de

granulação sugerindo que o baixo índice apoptótico em GP está estreitamente

relacionado com a sua característica de crescimento rápido e é regulado por

proteínas da família Bcl-2. Mostrou também que não havia diferenças no padrão de

marcação destas proteínas entre GPs e “hemangiomas capilares”.

Dyduch et al. (2004) em seu estudo também compararam a expressão

imunoistoquímica da proteína Bcl-2 em casos de “hemangioma capilar infantil”,

60

“hemangioma capilar lobular” e “hemangiomas epitelióides” da pele, No entanto, os

resultados acerca deste marcador não apresentaram significância estatística. Os

autores observaram que a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 nas células

endoteliais lesionais dos HIs vai alterando de forma inversamente proporcional à

evolução da lesão e seus níves se apresentam diminutos na fase involuída. Dessa

maneira, os autores sugerem que esta proteína está relacionada tanto na

proliferação quanto na morte celular programada dos casos de HI de pele.

O estudo de marcadores que estão envolvidos na variação das taxas de

proliferação celular se faz importante para auxiliar na elucidação de questões

pertinentes ao comportamento biológico das anomalias vasculares.

61

OBJETIVOS

62

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS:

Investigar a expressão imunoistoquímica de GLUT-1 e marcadores de

proliferação e apoptose em amostras de anomalias vasculares orais.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Verificar a expressão imunoistoquímica da GLUT-1 em todos os casos

diagnosticados histopatologicamente como “hemangiomas orais” no Serviço

de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de

Odontologia (DOD) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Reclassificar as anomalias vasculares orais como HIs orais a partir da

positividade para GLUT-1;

Reclassificar as anomalias vasculares orais imunonegativas para GLUT-1 em

GP, MV, HCRI ou HCNI, a partir de características clínicas e histopatológicas;

Correlacionar a variedade de diagnósticos histopatológicos dados

(hemangioma celular, capilar, lobular, capilar lobular e cavernoso) com a

nomenclatura estabelecida após a análise imunoistoquímica para GLUT-1 e

dados clínicos e histopatológicos;

Analisar a expressão imunoistoquímica de Ki-67nas amostras reclassificadas

como HI, GP e MV orais;

Analisar a expressão imunoistoquímica de Bcl-2 reclassificadas como HI, GP

e MV orais;

Verificar se há diferenças nos níveis de expressão do Ki-67 de acordo com a

positividade ou negatividade para GLUT-1 nas amostras analisadas;

Verificar se há diferenças nos níveis de expressão do Bcl-2 de acordo com a

positividade ou negatividade para GLUT-1 nas amostras analisadas;

Verificar se há correlações entre os índices de positividade para o Ki-67Bcl-2

nas amostras de HIs, GPs e MVs orais.

63

METODOLOGIA

64

4 METODOLOGIA

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Antes da coleta de dados para a realização da pesquisa, este projeto foi

enviado para a apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UFRN, de

acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS). Após a

aprovação, com emissão de parecer nº 309.526 (Anexo 1), os dados começaram a

ser coletados. O presente trabalho foi executado a partir de espécimes teciduais,

emblocados em parafina, pertencentes ao arquivo do Serviço de Anatomia

Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da

UFRN.

Diante disso, não houve, portanto, exposição dos pacientes portadores das

lesões que foram removidas com intuito terapêutico e não para fins da pesquisa.

Tentamos contato para em um segundo momento obtermos o termo de

consentimento livre e esclarecido dos pacientes (Apêndice 1).

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO:

Este experimento caracteriza-se como um estudo descritivo, constituído pela

observação, análise, quantificação e registro da marcação imunoistoquímica das

células pelos anticorpos anti-GLUT-1, anti-Ki-67 e anti-Bcl-2 em uma série de casos

de anomalias vasculares previamente selecionadas. Constitui-se também de uma

avaliação comparativa entre HI, GP e MV a partir da imunomarcação por esses

anticorpos.

4.3 POPULAÇÃO

O banco de registro de espécimes diagnosticados no Serviço de Anatomia

Patológica da disciplina de Patologia Oral do DOD da UFRN no período de 1970 a

2013 foi revisado. Dentro dos 12300 casos registrados, foi retirada a população

objeto deste estudo, constituída por todos os 109 casos diagnosticados como

“hemangiomas orais”.

65

4.4 AMOSTRA

4.4.1 Caracterização da amostra

A amostra envolvida na pesquisa foi composta pelos 77 casos diagnosticados

histologicamente como “hemangiomas orais” no período determinado e que

obedeciam aos critérios de inclusão. Foram coletados dados referentes às

informações clínicas desses pacientes (sexo, idade, raça, localização e tempo de

evolução da lesão) e anotados em elaboradas para esta pesquisa (Apêndice 2).

4.4.2 Critérios de inclusão

Espécimes diagnosticados como hemangiomas orais e suas respectivas

classificações (capilar, lobular, celular, infantil, da infância, juvenil, cavernoso);

Espécimes cujos blocos parafinados apresentavam condições de corte em

micrótomo e com material biológico suficiente e significativo para estudo

imunoistoquímico.

4.4.3 Critérios de exclusão

Espécimes que foram diagnosticados apresentando, além do “hemangioma”,

outra lesão associada (por exemplo, “hemangioma associado a linfangioma”);

Espécimes que foram submetidos previamente à terapia esclerosante.

4.5 COLETA DE DADOS

Foi realizada a análise da expressão imunoistoquímica de GLUT-1, em

seguida feita uma nova análise morfológica para fins diagnósticos e, finalmente, a

análise do perfil imunoistoquímico do Ki-67 e Bcl-2.

4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1)

A partir dos blocos parafinados, cortes histológicos de 3µm de espessura

foram obtidos para o estudo. Em seguida, estendidos em lâminas de vidro

66

previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminipropiltrietoxy-

silano, utilizando o anticorpo primário anti-GLUT-1, de acordo com as especificações

do quadro:

Quadro 1-Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do

anticorpo primário anti-GLUT-1.

A técnica de coloração pela imunoistoquímica procedeu-se da seguinte

maneira:

Desparafinização em dois banhos de xilol:

- Xilol 1 (10 minutos) – temperatura ambiente (TA);

- Xilol 2 (10 minutos) – temperatura ambiente (TA);

Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

- Etanol I absoluto (5 minutos) – TA;

- Etanol II (5 minutos) – TA;

- Etanol III (5 minutos) – TA;

- Etanol 95° (5 minutos) – TA;

- Etanol 80° (5 minutos) – TA;

Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em Etanol

95° (10 minutos) – TA;

Lavagem do material em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Recuperação antigênica de acordo com as especificações sugeridas pelo

fabricante de cada anticorpo;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de

peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio

da peroxidase endógena tecidual;

Especificidade Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

GLUT-1 (SLC2A1) Gene Tex 1:400 Citrato pH 6,0, Pascal, 3' 60min

67

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Incubação em solução de TRIS-HCL – pH 7,4 – (tris-hidroxi-metil-

aminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada);

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Incubação dos cortes com os anticorpos primários diluídos, em preparado

com albumina bovina (BSA) a 1%;

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCL pH 7,4 por 5

minutos cada;

Lavagem e incubação em TRIS-HCL pH 7,4, duas trocas (5 minutos cada);

Incubação do anticorpo secundário (diluição 1:200) durante 30 minutos – TA;

Lavagem em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 – duas trocas (5 minutos

cada);

Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina HRP (DAKO, A/S,

Glostrup, Dinamarca) durante 30 minutos, à temperatura ambiente;

Lavagem com TRIS-HCL – duas trocas (5 minutos cada);

Revelação da solução cromógena de diaminobenzidina a 0,03% (3,3-

diaminobenzidina, Sigma Chemical CO. USA), diluída em 100 mL de TRIS-

HCL e acrescida de 1,2 mL de peróxido de hidrogênio 10 volumes, aplicada

por um período de 3 minutos, em câmara escura;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem em água destilada;

Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

- Etanol 80° (2 minutos) – TA;

- Etanol 95° (2 minutos) – TA;

- Etanol I absoluto (5 minutos) – TA;

- Etanol II absoluto (5 minutos) – TA;

- Etanol III absoluto (5 minutos) – TA;

Diafanização em dois banhos de xilol:

68

- Xilol 1 (2 minutos);

- Xilol 2 (2 minutos);

Montagem da lamínula em resina permount® (Fischer Scientific, USA) para a

observação em microscopia de luz.

4.7 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1)

Foi realizada uma análise, por dois observadores, previamente calibrados, em

momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus

Japan Co., Tokyo, Japão)em um aumento final de 400x. Os achados foram anotados

em uma ficha para posterior análise dos resultados (Apêndice 3). Em casos de

discordância entre os avaliadores, o espécime foi revisto até que houvesse o

consenso.

Foi utilizado como controle positivo interno eritrócitos evidentes no interior de

vasos, além de eritrócitos extravasados e epineuro, e como controle negativo o

anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum

albumin).

Levando em consideração que o GLUT-1 é um marcador sensível e

específico para HI, alterações na classificação, tendo em base o proposto pelo

ISSVA em 1996, foram feitas.

Foram consideradas como HI verdadeiros as lesões em que as células

endoteliais limitantes dos vasos sanguíneos apresentaram imunomarcação positiva

para GLUT-1, mostrando coloração amarronzada dessas células, independente da

sua intensidade de marcação.

As amostras GLUT-1 negativas foram então reclassificadas como HCRI,

HCNI, GP ou MV de acordo com seu padrão morfológico através de critérios pré-

estabelecidos.

4.8 ESTUDO MORFOLÓGICO

A partir dos fragmentos das amostras GLUT-1 negativas incluídos em

parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5µm de espessura que foram

submetidos à coloração pela técnica de rotina da Hematoxilina e Eosina (HE),

descrita a seguir:

69

Xilol I (15 minutos);

Xilol II (15 minutos);

Álcool absoluto (3 minutos);

Álcool 95º GL (3minutos);

Álcool 70º GL (3minutos);

Água corrente (5 minutos);

Hematoxilina de Harris (5minutos);

Água corrente (5 minutos);

Rápida raspagem em solução de álcool – ácido a 1%;

Água corrente (5 minutos);

Eosina de Lison (2 minutos);

Álcool 70º GL (3minutos);

Álcool 95º GL (3minutos);

Álcool absoluto (3 minutos);

Xilol I (3 minutos);

Xilol II (3 minutos);

Xilol III (3 minutos);

Montagem da lamínula contra a lâmina com Permount.

4.9 ANÁLISE DO PERFIL MORFOLÓGICO

Após a obtenção das lâminas coradas em HE, realizou-se a análise

morfológica dos tecidos, por dois observadores, previamente calibrados, em

momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus

Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 400x.Tendo como base a

literatura vigente, as lesões foram então reclassificadas obedecendo a alguns

critérios(Quadro 2) e os dados então anotados em fichas apropriadas (Apêndice 4).

70

Quadro 2- Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares.

Tipo de anomalia Características morfológicas

*Hemangioma congênito

rapidamente involutivo

Grandes lóbulos de pequenos vasos

sanguíneos limitados por tecido fibroso;

Células endoteliais achatadas;

Grande vaso estrelado no centro dos lóbulos;

Áreas de fibrose;

Calcificações focais;

*Hemangioma congênito não

involutivo

Lóbulos de tamanho variável constituídos de

pequenos vasos;

Grandes vasos extralobulares;

Células endoteliais com formato ovoide;

Granuloma piogênico

Agregados lobulares de células endoteliais;

Células endoteliais em proliferação;

Numerosos vasos sanguíneos capilares;

Presença de infiltrado inflamatório misto de

moderado a intenso;

Membrana fibinopurulenta;

Áreas de ulceração e necrose.

Malformação vascular

Vasos sanguíneos tortuosos limitados por

endotélio maduro e achatado;

Ectasia vascular;

Infiltrado inflamatório escasso ou inexistente;

Agregados de células endoteliais jovens e em

proliferação escasso ou ausente.

Fonte: Enjolras e Mulliken (1997), North et al. (2000), North et al. (2001a e b), Mo et al. (2004), Leon-

Villapalos et al. (2005),Mulliken eEnjolras(2004), Nguyen et al. (2004) e Enjolras, Wassef e Chapot,

(2013).

*Necessidade de recorrer à ficha clínica para verificar idade do paciente e tempo de evolução da

lesão.

Após a reclassificação das lesões em HI, GP e MV, pelos dois avaliadores, foi

verificado o nível de concordância intraexaminadores através do cálculo do

coeficiente Kappa. Além disso, foi realizada a comparação desses novos

71

diagnósticos com os diagnósticos histológicos dados inicialmente (hemangioma

capilar, lobular, celular, cavernoso, etc) na tentativa de avaliar se algum dos subtipos

antes utilizados correspondia a algum diagnóstico definitivo a partir da

imunoexpressão do GLUT-1 e das características histopatológicas (Apêndice 5).

4.10 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (Ki-67 e Bcl-2)

Seguiram para uma nova etapa imunoistoquímica os espécimes

reclassificados em HI, GP ou MV seguindo a proporção 1:1:1 de acordo com o tipo

de lesão que apresentou menor quantidade de exemplares. A determinação foi feita

de forma intencional sendo selecionadas as lesões que, segundo os avaliadores,

demonstraram mais características inerentes ao tipo de anomalia.

A partir dos blocos de parafina, cortes histológicos de 3µm de espessura

foram obtidos para esta etapa do estudo. Em seguida, estendidos em lâminas de

vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminipropiltrietoxy-

silano, usando os anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2, de acordo com as

especificações do quadro 3:

Quadro 3-Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos

anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2.

Especificidade Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

Ki-67 (MIB-1) Dako 1:200 Tris/EDTA pH 9,0, Pascal, 3' 18h

(overnight)

Bcl-2 (124) Dako 1:50 Citrato pH 6,0, Pascal, 3' 18h (overnight)

72

4.11 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO(Ki-67 e Bcl-2)

4.11.1 Ki-67

Os espécimes foram escaneados pelo Scanner Panoramic MIDI

(3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121) e as

imagens obtidas foram observadas através do programa de visualização Panoramic

Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary,

H-1121). Com o auxílio desse programa foi possível observar toda a extensão do

espécime, onde identificamos a região da lâmina que apresentava maior número de

células endoteliais com imunomarcação para este marcador. Uma vez encontrada

essa área, a imagem foi aumentada em 40x, de acordo com as especificações do

programa, onde foram fotografados dez campos consecutivos de cada caso com o

auxílio do mesmo programa de visualização anteriormente citado. Em lesões

ulceradas, estas áreas foram evitadas.

Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®,

National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) foi realizada então

uma análise quantitativa da imunomarcação para o Ki-67. O estudo foi do tipo duplo-

cego onde o examinador não tinha acesso aos diagnósticos dados previamente. A

contagem das células positivas e negativas foi feita por um único avaliador

previamente calibrado até que fosse atingida a quantidade de 1000 células

endoteliais, fazendo-se uso de uma adaptação do método de contagem utilizado por

Sarmento et al. (2013), com isso possibilitou-se uma comparação entre os dados

das lesões com maior fidedignidade, uma vez que, independente da lesão avaliada,

o valor das células total era o mesmo.

Diante da dificuldade de obter, ao término da contagem, o número exato de

1000 células, optou-se por fazer a contagem das células até o último campo em que

a contagem total fornecesse um número de células contadas inferior a 1000. Então,

era realizada uma proporção das células positivas e negativas encontradas em

relação às células requeridas para obtenção do total final de 1000 células. Para a

obtenção do número requerido de células positivas para completar o número total de

células contadas foi realizada a seguinte equação:

73

A= B x C D

A = número de células positivas requeridas

B = número de células positivas do último campo contado

C = 1000 – número total de células contadas até o último campo

D = número total de células do último campo

Para a obtenção do número requerido de células negativas (E) para completar

o número total de células contadas foi realizada a seguinte equação:

E= C – A

A partir deste montante, foi retirada a porcentagem de células positivas e

negativas os dados anotados em fichas apropriadas (Apêndice 6).Foi utilizada, como

controle interno positivo, a camada basal do epitélio que revestia as lesões e como

controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA

- bovine serum albumin).

4.11.2 Bcl-2

Toda a área do espécime foi verificada por dois examinadores previamente

calibrados, em momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus

CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 100x, que

realizaram uma análise semiquantitava atribuindo os seguintes escores, fazendo-se

uso de uma adaptação do que foi utilizado no estudo de Meijer-Jorna et al. (2012):

0 a 5% - escore 0;

6 a 50% - escore 1;

51 a 100% - escore 2.

O estudo foi do tipo duplo-cego onde os examinadores não tinham acesso

aos diagnósticos dados previamente. Os escores obtidos por cada avaliador para

cada caso foram anotados em fichas apropriadas (Apêndice 7) e, em seguida

comparados. Em eventuais desacordos, o espécime foi revisto e os critérios foram

discutidos até que os avaliadores chegassem ao consenso.

74

Foram utilizados como controle positivo externo, casos de hiperplasia linfoide

e como controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a

1% (BSA - bovine serum albumin).

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos com a análise imunoistoquímica foram digitados em

planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2007®) e posteriormente exportados para

o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 17.0; SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA), no qual foram realizadas as análises estatísticas.

Os dados obtidos com a avaliação dos índices de positividade para o Ki-67,

variável quantitativa discreta, foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov,

com o intuito de observar o tipo de distribuição dos mesmos em cada um dos

grupos. Como os dados não apresentaram distribuição normal, a comparação das

medianas dos índices de positividade para o Ki-67 entre HIs, GPs e MVs foi

realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Em relação aos

escores de imunopositividade para Bcl-2, variável categórica ordinal, a comparação

das medianas entre HIs, GPs e MVs foi realizada por meio do teste não paramétrico

de Kruskal-Wallis. Em cada um dos grupos, o teste de correlação de Spearman foi

utilizado para analisar possíveis correlações entre os índices de positividade para o

Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2.

Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de

significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).

75

RESULTADOS

76

5 RESULTADOS

Dos 109 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas orais” e suas

respectivas classificações, apenas 77(70,64%) obedeciam aos critérios de inclusão

e exclusão e foram selecionados para compor a amostra do estudo.

5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA E DA IMUNOEXPRESSÃO DA GLUT-1

A análise da imunoexpressão de GLUT-1 revelou positividade em 26 (33,8%)

dos 77 casos estudados (Tabela 1). Com base na imunoexpressão dessa proteína e

após a realização das análises morfológicas, do total de casos analisados, 26

(33,8%) foram reclassificados como HIs, 20 (26,0%) como GPs e 31 (40,2%) como

MVsorais (Tabela 2)(Figura 2A, 2B e 2C) (Figura 3A, 3B e 3C).

Tabela 1- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de acordo com aimunoexpressão de GLUT-1. Natal – RN, 2014.

Grupo

Imunoexpressão de GLUT-1 Total

n (%) Positivo

n (%)

Negativo

n (%)

Hemangioma oral 26 (33,8) 51 (66,2) 77 (100,0)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Tabela 2- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de acordo com os diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014.

Grupo

Diagnóstico final Total

n (%) HI

n (%)

GP

n (%)

MV

n (%)

Hemangioma oral 26 (33,8) 20 (26,0) 31 (40,2) 77 (100,0)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.

Ao serem relacionados os diagnósticos histopatológicos iniciais com os

diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos

achados morfológicos, foi observado que a maioria dos hemangiomas cavernosos (n

= 16; 88,8%) foram reclassificados como MVs orais. Por sua vez, a maioria dos

hemangiomas capilares (n = 9; 56,2%) foram reclassificados como GPs orais. Por

outro lado, foi observada maior frequência de casos reclassificados como HIs

77

oraisno grupo das lesões diagnosticadas inicialmente como hemangiomas (n = 19;

47,5%) (Tabela 3).

Tabela 3- Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com o diagnóstico histopatológico inicial e os diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014.

Diagnóstico inicial

Diagnóstico final Total

n (%) HI

n (%)

GP

n (%)

MV

n (%)

Hemangioma 19 (47,5) 8 (20,0) 13 (32,5) 40 (100,0)

Hemangioma capilar 5 (31,3) 9 (56,2) 2 (12,5) 16 (100,0)

Hemangioma celular 1 (33,3) 2 (66,7) 0 (0,0) 3 (100,0)

Hemangioma cavernoso 1 (5,6) 1 (5,6) 16 (88,8) 18 (100,0)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Legenda: HI – Hemangioma; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.

Para avaliar o nível de concordância entre os diagnósticos estabelecidos

pelos dois examinadores (HI, GP ou MV oral), após a realização das análises da

imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos, foi calculado o coeficiente

Kappa. O valor obtido foi de 0,921, considerado excelente.

Com finalidade de analisar os dos demais marcadores, foram selecionados

casos de cada grupo na proporção 1:1:1 de acordo com o que apresentasse menor

número de casos. O grupo com o menor número de casos foi o dos GPs,

apresentando 20 casos (26%) (Tabela 2). A escolha dos casos dos grupos

remanescentes que seguiram para as etapas seguintes do estudo foi realizada de

forma intencional que, de acordo com os avaliadores, demonstravam mais

características inerentes ao tipo de anomalia.

5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO KI-67

A análise da imunoexpressão do Ki-67 revelou (Figura 4), para o grupo dos

HIs, índices de positividade que variaram de 4,00% a 68,70%, com mediana de

13,85%. No grupo dos GPs, os índices de positividade variaram de 6,60% a 90,80%,

com mediana de 33,7%. Por sua vez, para as MVs, foram observados índices de

positividade que variaram de 1,40% a 23,80%, com mediana de 4,55%. O teste não-

paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre

78

as medianas de imunopositividade para o Ki-67 entre os grupos, com as MVs

exibindo menor mediana em comparação com os GPs E HIs, respectivamente. Por

sua vez, os GPs revelaram maior mediana de imunopositividade para o Ki-67 em

relação aos HIs orais (p< 0,001) (TABELA 4) (GRÁFICO 1).

Tabela 4- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os índices de positividade para o Ki-67 em relação ao grupos. Natal – RN, 2014.

Grupos N Mediana Q25-Q75 Média dos postos KW P

HI 20 13,85 6,55 – 19,97 29,60 28,807 <0,001

GP 20 33,70 25,20 – 50,65 45,75

MV 20 4,55 2,62 – 11,02 16,15

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.

Gráfico 1- Box-plot relativo aos índices de positividade para o Ki-67 de acordo com os grupos. Natal – RN, 2014.

5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA Bcl-2

A análise da imunoexpressão daBcl-2 revelou (Figura 5), para o grupo dos

HIs, distribuição relativamente similar dos casos nos escores 0 (n = 7; 35,0%), 1 (n =

6; 30,0%) e 2 (n = 7; 35,0%). No grupo dos GPs, a maioria dos casos foi classificada

como escore 2 (n = 10; 50,0%), com frequências menores para os escores 1 (n = 7;

35,0%) e 0 (n = 3; 15,0%). No grupo das MVs, constatou-se maior frequência do

escore 0 (n = 16; 80,0%), seguido dos escores 1 (n = 3; 15,0%) e 2 (n = 1; 5,0%). O

teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente

79

significativa nos escores de imunopositividade para o Bcl-2 entre os grupos

analisados, com as MVs exibindo mediana inferior em comparação com os GPs e

HIs orais (p< 0,001) (Tabela 5) (Gráfico 2).

Tabela 5- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os escores de imunopositividade para o Bcl-2 em relação aos grupos. Natal – RN, 2014.

Grupos N Mediana Q25-Q75

Média dos

postos KW P

HI 20 1,00 0,00 – 2,00 33,10 17,803 <0,001

GP 20 1,50 1,00 – 2,00 39,85

MV 20 0,00 0,00 – 0,00 18,55

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.

Gráfico 2- Box-plot relativo aos escores de imunopositividade para o Bcl-2 de acordo com os grupos. Natal – RN, 2014.

5.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DE Ki-67 E Bcl-2

Foram analisadas possíveis correlações entre os índices de positividade para

o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2. Para todos os grupos, o teste de

correlação de Spearman revelou não existir correlação estatisticamente significativa

entre os índices de positividade e os escores de imunoexpressão das proteínas

avaliadas (Tabela 6).

80

Tabela 6- Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) para os índices de positividade para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2, de acordo com os grupos. Natal, RN – 2014.

Grupos N R P

Granuloma piogênico 20 0,245 0,298

Hemangioma 20 - 0,021 0,931

Malformação vascular 20 0,292 0,212

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

81

Figura 2- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1 em GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121).

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

82

Figura 3- Fotomicrografia demonstrando as características histopatológicas (H/E) do GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121).

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

83

Figura 4- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deKi-67 em GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121).

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

84

Figura 5- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deBcl-2 em GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121).

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

85

DISCUSSÃO

86

6 DISCUSSÃO

As anomalias vasculares são distúrbios da vasculogênese, angiogênese ou

linfangiogênese e estão entre as anormalidades pediátricas mais comuns, ocorrendo

em cerca de 1% das crianças (TASNADI, 1993). Iatrou et al. (2013) em seu estudo

realizaram um levantamento epidemiológico com lesões de crianças e adolescentes

gregos e verificaram que as anomalias vasculares eram as leões benignas de maior

prevalência, representando 22,1% dos casos. Apesar de sua elevada frequência,

uma falta de padronização permanece entre os clínicos e patologistas em relação à

sua terminologia. Uma mesma nomenclatura pode ser aplicada a diferentes

entidades e, por outro lado, a mesma lesão pode ser atribuída a diferentes

categorias por diferentes profissionais da saúde. Tal confusão terminológica pode

contribuir tanto para incoerências na gestão clínica dos pacientes portadores, quanto

para o surgimento de vieses em estudos nesta área (AL-ADNANI et al., 2006;

HASSANEIN et al., 2011;).

O entendimento e padronização das anomalias vasculares foi facilitado com a

classificação proposta por Enjolras, Wassef e Chapot, e aprovada em Roma, no XI

Workshop em Anomalias Vasculares, em 1996(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;

ENJOLRAS; WASSEF; CHAPOT, 2013). Essa nova classificação é baseada no

comportamento biológico das anomalias, através de estudos sobre achados clínicos,

história natural e características celulares das lesões, dividindo-as em dois grupos:

tumores (lesões que crescem a partir da hiperplasia endotelial, como por exemplo,

HIs e GPs) e malformações vasculares (lesões que surgem a partir de falhas na

morfogênese vascular e exibem contagem normal de células endoteliais). Esta

divisão simples é clinicamente útil para o diagnóstico e prognóstico e auxilia na

decisão terapêutica (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS; 2000; HASSANEIN et al.,

2011).

Apesar de as anomalias vasculares estarem entre o grupo de lesões mais

comuns em infantes e neonatos (TUCCI et al., 2009), com maior frequência relativa

representada pelos hemangiomas (MULLIKEN; GLOWACKI,1982; BALLAH, et al.,

2011), dos 12300 casos diagnosticados e arquivados no Serviço, apenas 109 foram

diagnosticados como “hemangiomas orais”, representando 0,88% de todos os

casos. Alguns fatos podem justificar esse número diminuto de casos, tais como: a

real involução dos HIs, dispensando a necessidade de realização de biópsias

87

(TUCCI et al., 2009); a resolução total ou parcial dos casos com terapia esclerosante

(TUCCI et al., 2009); a crença de que se trata de uma marca de nascença comum

que não necessita de tratamento, mesmo quando da não involução total da lesão

(MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; FEVURLY; FISHMAN, 2012) e o

tratamento inadequado para HCNI e MVs que são erroneamente diagnosticados

como HIs orais (TUCCI et al., 2009). Além disso, um grande número de Cirurgiões-

Dentistas continua negligenciando algumas lesões, realizando o tratamento cirúrgico

sem o posterior encaminhamento do espécime para análise laboratorial.

Historicamente, uma grande variedade de termos tem sido utilizada para

descrever esse grupo de lesões, porém, infelizmente, um mesmo termo

(hemangioma) tem sido frequentemente utilizado para uma grande variedade de

anomalias vasculares, gerando confusões na confirmação do diagnóstico e

proposição de tratamento (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS; 2000; WERNER et

al., 2001; HASSANEIN et al., 2011).

O diagnóstico diferencial histológico entre as diferentes anomalias vasculares

observadas no estudo (HIs, GPs e MVs) pode ser difícil, uma vez que, o HI em sua

fase proliferativa e apresentando inflamação se assemelha muito com os casos de

GP orais. Por outro lado, na fase de involução, semelhanças histológicas com os

casos de MVs podem ser observadas. Assim sendo, a obtenção de informações

clínicas bem descritas e uma anamnese detalhada se faz bastante importante. Além

disso, a utilização de biomarcadores com finalidade de contribuir no diagnóstico

diferencial, assim como, a reclassificação dessas lesões, quando necessário, devem

ser realizadas (NORTH et al., 2000; FREITAS et al., 2005; LEON-VILLAPALOS et

al.,2005; JOHANN et al., 2007; SEO et al., 2009; BUCKMILLER, SUEN 2010;

VASCONCELOS et al., 2011).

Diante do conhecimento de que a GLUT-1 é específica para a identificação

dos HIs, no presente estudo a análise da imunoexpressão para tal marcador foi

realizada nos 77 casos obtidos, demonstrando que apenas 26 (33,8%) tratavam-se

de HIs verdadeiros e, para os 51 (66,2%) casos que apresentaram

imunonegatividade, houve a reclassificação em GPs e MVs, baseada em

características clínicas e histopatológicas pré estabelecidas nos estudos de Enjolras

e Mulliken (1997), North et al. (2000), North et al. (2001a e b), Berenque et al.

(2003), Mulliken e Enjolras (2004) e Enjolras, Wassef e Chapot, (2013).

88

Os achados do presente estudo não corroboram com os resultados

encontrados por North et al. (2001a e b), Li et al. (2003), Mo et al. (2004), Lyons et

al. (2004), Drut e Drut (2004), Nguyen et al. (2004), Song et al. (2011), Osaki et al.

(2013) e Intiteang et al. (2013), uma vez que nestes estudos, todos os casos de HIs

apresentaram imunopositividade para o antígeno GLUT-1, não apresentando

necessidade de reclassificação das lesões.

Embora quase 20 anos tenham se passado depois do estabelecimento da

classificação proposta pelo ISSVA, erros de nomenclatura ainda são recorrentes

(HASSANEIN et al., 2011). A identificação correta do tipo de anomalia vascular é

essencial, não apenas devido as suas características clínicas, radiográficas e

patológicas e sua morbidade, mas também devido seus tratamentos apresentarem

diferenças (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010). O tratamento adequado se inicia com o

correto diagnóstico, uma vez que, um número significativo de pacientes portadores

de lesões vasculares recebe tratamento ineficaz e potencialmente lesivo em função

de diagnósticos errôneos (BURROWS et al., 1998).

Em virtude disso, no nosso estudo, fizemos uso da classificação atualmente

aceita pelo ISSVA utilizando uma série de casos diagnosticados histologicamente

como “hemangiomas orais” e verificou-se, diante da aplicação de análises

imunoistoquímica e morfológica a necessidade de reclassificação dos casos

analisados.

Dessa maneira, o nossa amostra foi redefinida como sendo composta de 26

(33,8%) casos de HI, 20 (26,0%) casos de GP e 31 (40,2%) casos de MV orais.

Essa necessidade de reclassificação das anomalias vasculares também foi

observada nos estudos de Dyduch et al. (2004), Johann et al. (2007), Srinivasan et

al. (2009), Patiño-Seijas et al. (2012) e Oliveira et al. (2014), devido ao fato de que

nem todos os espécimes diagnosticados histopatologicamente como HIs

apresentavam imunopositividade para a proteína GLUT-1.

A designação do termo “hemangioma” para uma variada gama de anomalias

vasculares não é o único problema na hora de designar um nome para essas lesões.

Uma variedade de subclassificações e neologismos não parametrizados são

observados ainda na atualidade, dificultando a padronização da terminologia e, em

consequência o diagnóstico e tratamento.

De acordo com o estudo de Hiraki e Goldenberg (2010), a aplicação da

classificação proposta pelo ISSVA fez com que se tornasse possível um melhor

89

diálogo entre os profissionais e uniformização da nomenclatura das anomalias

vasculares entre clínicos, cirurgiões e patologias. A partir de então, o termo HI

passou a significar apenas um tumor vascular benigno, com as características

peculiares descritas anteriormente. Além disso, as antigas denominações de

“hemangiomas” cavernoso, tuberoso e capilar são agora classificadas e

denominadas como MVs artério-venosas, venosas e capilares, respectivamente.

Almaraz et al. (2010) destaca em seu estudo que fica claro que depois da

padronização proposta pela classificação do ISSVA, termos como “angioma em

morango” se tratam, na verdade de HI, um “hemangioma plano” é realmente uma

malformação vascular capilar e “hemangioma cavernoso” é uma malformação

venosa. Da mesma forma, foram categorizadas novas entidades diferentes dos HIs,

como os HCNI, os HCRI e os hemangioendoteliomas kaposiformes.

No estudo realizado por Lowe et al. (2012), os autores observaram que

variadas nomenclaturas eram utilizadas de forma errônea no passado, tais como:

“hemangioma capilar” (de quaisquer órgãos), “hemangioendotelioma infantil do

fígado”, “hemangiomas cavernosos” (de quaisquer órgãos), “hemangioma hepático

do adulto”, “hemangioma vertebral do adulto” e “hemangioma cavernoso orbital do

adulto”. Quando da comparação dessas lesões assim nomeadas com o que foi

proposto pelo ISSVA em 1996, os autores observaram que: os “hemangiomas

capilares” e os “hemangioendoteliomas infantis do fígado” tratam-se, na verdade de

HIs e que as outras entidades anteriormente citadas tratam-se, na verdade, de

malformações vasculares.

No nosso estudo, também observamos uma variedade de nomenclaturas e

subclassificações para os hemangiomas orais. Do total de 77 casos analisados, 40

(51,94%) receberam o nome de “hemangioma”, 16 (20,77%) de “hamangioma

capilar”, 3 (3,89%) de “hemangioma celular” e 18 (23,37%) de “hemangioma

cavernoso”. Tal fato pode ser justificado pelo fato de que parte das amostras

coletadas foram biopsiadas e analisadas entre 1970 e 1996, antes do surgimento da

classificação do ISSVA e reforça a necessidade dos centros de estudo

anatomopatológicos reavaliarem os casos de anomalias vasculares e realizar a

reclassificação.

Dentre os casos diagnosticados inicialmente por meio da análise

histopatológica como “hemangiomas”, apenas 47,5% tratavam-se de HIs

verdadeiros. A maioria (56,2%) dos casos diagnosticados como “hemangioma

90

capilar” tratavam-se, na verdade de GPs, refletindo o conceito de estudos realizado

antes (ITAWA et al., 1996) e depois (MULLIKEN, FISHMAN, BURROWS, 2000) da

classificação do ISSVA de que o termo “hemangioma capilar lobular” pode ser

utilizado, para os GPs, como sinônimo. Dos 3 casos designados como “hemangioma

celular”, 2 deles tratavam-se de GPs e um de HI, isso pode ser justificado pela

intensa celularidade e proliferação endotelial dos GPs e dos HIs em sua fase

evolutiva. Ademais, a grande maioria (88,8%) dos casos designados como

“hemangiomas cavernosos” tratavam-se, na verdade, de MVs corroborando com as

informações encontradas nos estudos de Hiraki e Goldenberg (2010), Almaraz et al.

(2010), Lowe et al. (2012) e Osaki et al.(2013).

Tendo em mãos dados clínicos referentes às lesões analisadas não foi

verificada a necessidade da reclassificação de nenhum dos casos em HCNI ou

HCRI. Assim sendo, o presente estudo sugere que os achados histopatológicos

sozinhos não são suficientes para definir o correto diagnóstico de HIs e que uma

apurada investigação clínica e uso de biomarcadores, como a GLUT-1, são

essenciais no auxílio da investigação diagnóstica.

É sabido que o comportamento biológico de qualquer lesão é altamente

dependente do equilíbrio entre os níveis de proliferação e morte celular, e, que

alguns marcadores imunoistoquímicos podem auxiliar na identificação da dimensão

desses aspectos. Diante disso, o presente estudo se propôs a verificar e

correlacionar, através do teste de correlação de Spearman, a expressão

imunoistoquímica dos antígenos Ki-67 e Bcl-2 em uma parcela dos casos

reclassificados como HIs, GPs e MVs orais, na tentativa de verificar se a atividade

proliferativa e expressão de marcadores de apoptose estão relacionadas com as

diferenças no comportamento biológico destas três lesões.

O antígeno Ki-67 é utilizado em estudos imunoistoquímicos como um

marcador indicador de atividade mitótica e potencial crescimento (OSAKI et al.,

2013). No presente estudo, através de uma análise quantitativa, foi observado que,

em ordem decrescente, o grupo que apresentou maiores índices de positividade foi

o dos GPs (mediana 33,70), seguidos dos HIs (mediana 13,85) e MVs (mediana

4,55), respectivamente, demonstrando diferença estatisticamente significante (p<

0,001).

Itawa et al. (1996), em seu estudo, compararam as taxas de proliferação em

casos de “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP). Os

91

autores observaram que as taxas proliferativas de ambos os tumores eram bastante

elevadas, refletindo seu rápido crescimento, contudo, de forma adversa ao presente

estudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes.

Outro estudo (NORTH et al., 2000) verificou que não havia uma correlação

entre a positividade para o antígeno GLUT-1 e os níveis de imunopositividade para

Ki-67. Eles sugeriram, através da dupla marcação para GLUT-1/Ki-67 em casos de

HIs, GPs e tecidos de granulação, que a expressão da GLUT-1 é independente da

sua atividade mitótica, conceito posteriormente ratificado nos estudos de Dyduch et

al (2004) e Enjoras, Wassef e Chapot (2013). Esses resultados corroboram com o

presente estudo, uma vez que as amostras de GP, que não apresentam

imunopositividade para GLUT-1 exibiram níveis maiores de proliferação.

Nakamura (2000) verificaram os níveis de imunoexpressão de Ki-67 em GP,

“hemagiomas capilares”e de tecido de granulação. A expressão de KI-67 se

apresentou variável entre os casos de cada grupo e não foi observada nenhuma

diferença estatisticamente significante quando comparados os grupos, lançando-se

mão do teste tde Student e do teste t de Welch. Além disso, os autores sugeriram

que apesar de a atividade proliferativa vascular ser um importante fator no

desenvolvimento dessas lesões (GP e HI), ela pode ser diferente de acordo com o

estágio de desenvolvimento de cada lesão no momento da ressecção.

Dyduch et al. (2004) ao comparar a expressão de GLUT-1 e Ki-67 em casos

de HIs e GPs, verificaram que os níveis do segundo antígeno eram muito maiores

nos casos de GP do que de HIs, encontrando uma relação inversa da expressão

desses marcadores, mesmo esses resultados não sendo estaticamente

significantes. Esses dados corroboram com o achado do presente estudo, quando

comparados apenas HIs e GPs, e esse aumento do potencial proliferativo dos GPs

pode ser justificado pela presença de um maior infiltrado inflamatório, contendo

células e liberando citocinas que induzem a proliferação celular.

O estudo de Osaki et al. (2013) sugere que há uma relação diretamente

proporcional entre a imunopositividade para GLUT-1 e os níveis de Ki-67, o que não

foi observado no presente estudo. Isso pode ser explicado pelo fato de que no

estudo desses autores foram utilizados apenas casos de HIs e MVs, onde realmente

podem ser observadas diferenças nos níveis de expressão de Ki-67 de acordo com

a imunopositivade para GLUT-1. No presente estudo também foi observado que os

níveis de Ki-67 nos HIs eram maiores do que nas MVs, entretanto, foram incluídos

92

na amostra casos de GPs, que também são imunonegativos para GLUT-1, porém

apresentaram níveis de marcação para o antígeno Ki-67 superiores, impossibilitando

o pensamento de que as anomalias vasculares GLUT-1 positivas são mais

proliferativas que as GLUT-1 negativas.

Apesar de as MVs serem consideradas um tipo de anomalia vascular sem a

presença de proliferação endotelial(KANG; SONG, 2008; FEVURLY; FISHMAN,

2012; CANDAMOURTY et al., 2012),no estudo de Meier-Jorna et al. (2006) foi

observada a presença de proliferação microvascular em 30% dos casos de MVs de

pele e tecidos moles estudados. Corroborando com tais achados, Meijer-Jorna et al.

(2012) demonstraram que áreas de vasos imaturos dentro das malformações

vasculares podem apresentar imunoexpressão estatisticamente significativa para o

Ki-67, sugerindo que essas áreas podem demonstrar o mesmo padrão de

proliferação celular e maturação que é observado em outras lesões vasculares de

pele e mucosa, como o GP e o HI, respectivamente. Dados semelhantes foram

encontrados no presente estudo, onde observamos, apesar de em menor

quantidade (variação de 1,40% a 23,80%, com mediana de 4,55%), células

endoteliais positivas para o antígeno Ki-67. Da mesma maneira, Osaki et al. (2013)

observaram positividade em células endoteliais de alguns casos de MVs orbitais

(≤1%), apesar de que em outras lesões não ter sido observado nenhum grau de

imunopositividade.

Tendo em vista o que foi demonstrado, sugerimos que as taxas de

proliferação, principalmente dos HIs e GPs, apresentam relevâncias para a

compreensão de aspectos importantes acerca do comportamento biológico dessas

anomalias. No entanto, não podemos inferir que os níveis proliferativos dessas

lesões e a imunopositividade para o antígeno GLUT-1 apresentam algum nível de

interdependência.

A proteína Bcl-2 é amplamente conhecida como uma proteína anti apoptótica

por agir impedindo a liberação do citocromo C, que é uma estrutura importante na

ativação da via proteolítica, regulada pela família das caspases, que culminaria na

morte celular (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010). Ademais, segundo Wu et al.

(1999), a redução dos níveis de apoptose pode favorecer o crescimento tumoral. No

presente estudo, onde foi avaliada a imunoexpressão da Bcl-2 através de uma

análise semiquantitativa, foi verificado que os maiores níveis de imunopositividade

estavam nos casos pertencentes ao grupo dos GPs, seguidos dos HIs, e os

93

menores níveis nos casos pertencentes ao grupo das MVs, apresentando diferença

estatisticamente significativa (p<<0,001).

Enquanto alguns estudos descrevem uma ausente ou fraca expressão de Bcl-

2 em GPs (ITAWA et al. 1996; FOREMAN et al., 1996), no presente estudo foi

observada imunopositividade considerável deste marcador para as células

endoteliais destes tumores, quando comparado com HIs e MVs, consequentemente

sugerindo que as proteínas da família Bcl-2, pelo menos em parte, tem contribuição

na supressão da apoptose nos casos de GP orais.

Itawa et al. (1996) em seu estudo, compararam as taxas de apoptose em

casos de “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP). Os

autores fizeram uso do Kit de Detecção de Apoptose in situ (ApopTag) para medir o

índice de apoptose (AI) e observaram que o AI era estatisticamente significante

maior do nos HIs do que nos GPs (p<0,01). Em relação à proteína Bcl-2, de forma

adversa ao presente estudo, ambos os grupos se mostravam imunonegativos ou,

em apenas em um pequeno número de casos, fracamente positivos, sem diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos. Os autores não conseguiram obter

nenhuma evidência da relação entre a proteína Bcl-2 e as taxas de apoptose.

Ademais, neste mesmo estudo, através da análise da imunoexpressão do Ki-67, os

autores observaram que as taxas proliferativas de ambos os tumores eram bastante

elevadas, refletindo seu rápido crescimento, no entanto, não foram observadas

diferenças estatisticamente significantes. O estudo demonstrou que a atividade

apoptótica é muito maior nos HIs do que nos GPs, sugerindo que a apoptose seria a

causa da involução espontâneadesta neoplasia.

Dyduch et al. (2004) em seu estudo também compararam a expressão

imunoistoquímica da proteína Bcl-2 em casos de “hemangioma capilar infantil”,

“hemangioma capilar lobular” e “hemangiomas epitelióides” da pele, No entanto, os

resultados acerca deste marcador não apresentaram significância estatística, de

forma contrária ao que foi demonstrado no presente estudo. Os autores observaram

que a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 nas células endoteliais lesionais

dos HIs vai alterando de forma inversamente proporcional à evolução da lesão e que

seus níves se apresentam diminutos na fase involuída da lesão. Dessa maneira, os

autores sugerem que esta proteína está relacionada tanto na proliferação quanto na

morte celular programada dos casos de HI de pele.

94

Nakamura (2000) em seu estudo, analisaram a expressão de Bcl-2 e Bax,

duas proteínas reguladoras da apoptose, em casos de GP, “hemagiomas capilares”

e tecido de granulação. Em relação à proteína Bcl-2, não foram encontradas

diferenças estatisticamente significativas entre os grupos GP e hemangiomas

através do Teste Exato de Fisher, mas foi encontrado entre GP e tecido de

granulação. Os autores sugeriram que essa alta taxa de supressão da apoptose

demonstrada pelos altos níveis de imunoexpressão para Bcl-2 nos GPs pode estar

concatenada com o rápido crescimento desses tumores, o que pode ser reforçado

pelo conceito proposto por Wu et al. (1999), de que os baixos níveis de apoptose

podem favorecer o crescimento tumoral. Além disso, foram demonstrados resultados

inconclusivos em relação aos hemagiomas.

Em busca de possíveis correlações entre os índices de imunoexpressão do

Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2, no presente estudo realizado o

teste de correlação de Spearman, que, dentre todos os grupos, não revelou não

existir correlação estatisticamente significativa entre os índices de positividade e a

imunoexpressão das proteínas avaliadas (GP: p=0,298; HI: p=931 e MV: p=0,212).

No estudo de Itawa et al. (1996), eles utilizaram o teste não paramétrico de Mann-

Whitney utilizando como variáveis a relação taxa de apoptose/imunoexpositividade

para Ki-67 e encontraram diferenças estatisticamente significativas (p<0,01) entre os

dois grupos analisados no estudo, que pode ser justificado pelo fato de que os

autores utilizaram o mesmo método de contagem celular para ambos os

marcadores.

No nosso estudo encontramos os menores níveis de imunoexpressão para a

proteína Bcl-2 nos casos pertencentes ao grupo das MVs (mediana dos escores

0,00), no entanto, foram encontradas dificuldades em obter estudos que avaliassem

a expressão dessa proteína nesse tipo de lesão. Outrossim, reforçamos a

necessidade de testes com a proteína GLUT-1 nos estudos semelhantes, visando

uma melhor padronização entre os estudos, para que seja possível estabelecer

relações mais fidedignas quando do estudo das anomalias vasculares para outros

marcadores.

Os resultados encontrados nesse estudo reforçam que as anomalias

vasculares alocadas em cada grupo demostram, de fato, comportamentos biológicos

diferentes, uma vez que foi encontrado maiores índices de proliferação e da proteína

95

supressora de apoptose nos GPs, seguido dos HIs e os menores níveis nos casos

de MVs orais, reforçando assim, a importância da distinção dessas lesões.

96

CONCLUSÕES

97

7 CONCLUSÕES

Tendo em vista os resultados deste estudo, podemos concluir que:

Os diferentes tipos de anomalias vasculares orais são lesões que podem

apresentar características clínicas e histopatológicas semelhantes, porém são

lesões distintas que devem ser classificadas de forma criteriosa;

Dianteda suspeita de que uma lesão trata-se de um caso de HI, devem-se

considerar GP e MV como diagnóstico diferencial;

A GLUT-1 é uma importante ferramenta na identificação dos HIs orais;

Apenas características histopatológicas não são suficientes para o correto

diagnóstico de HIs, GPs, e MV orais;

Neologismos e o uso de subclassificações que remetem características

puramente histológicas devem ser evitados quando da designação dos HIs,

GPs e MVs;

Os GPs apresentam os maiores índices proliferativos e de imunopositividade

para a proteína anti apoptótica Bcl-2, e as MVs os menores, dentre os grupos

de leões estudadas.

Os níveis de proliferação e de expressão da Bcl-2 independem da

imunopositvidade para a GLUT-1;

Mecanismos de proliferação e apoptose estão relacionados ao

comportamento biológico das diferentes anomalias vasculares e auxiliam na

compreensão de questões pertinentes sobre os diferentes cursos clínicos das

lesões avaliadas.

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APÊNDICES

109

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL APÊNDICE1

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Este é um convite para você participar da pesquisa “EXPRESSÃO

IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO E

APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS”, que é coordenada pela

Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz. Sua participação é voluntária, o que significa

que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem

que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.

Esta pesquisa estudará marcadores (substâncias) presentes em anomalias

vasculares (lesões com sangue em seu interior) benignas que foram removidas da

sua boca, Caso você decida aceitar o convite, não passará por nenhum tratamento

clínico nem fará nenhuma cirurgia. Se você permitir iremos utilizar o material que já

foi retirado da sua boca quando foi feita a sua cirurgia.

Os riscos de você sofrer qualquer dano físico, psicológico ou de qualquer

outro tipo por participar da pesquisa, serão mínimos e, caso aconteçam,

providenciaremos assistência médica e/ou psicológica em serviços especializados

na UFRN, procurando, dessa forma, restaurar a sua saúde..

Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será

identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a

divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.

Sua participação é importante, pois esta pesquisa tem como benefício

contribuir com o entendimento sobre o comportamento (crescimento, tamanho,

desenvolvimento) das lesões vasculares. Caso exista mudança de diagnóstico, você

será informado e se necessitar de algum tipo de tratamento, o mesmo será realizado

no Departamento de odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa,

você será ressarcido. Se você sofrer algum dano, comprovadamente decorrente

desta pesquisa, terá direito a indenização.

110

Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a

respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para a Profª. Drª. Lélia Maria

Guedes Queiroz, no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen.

Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelos telefones (84) 3215-4138,

(84) 9907-7970. Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser

questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, localizado no Campus

Universitário da UFRN, ou pelo telefone (84)3215-3135.

Consentimento Livre e Esclarecido Eu, ___________________________________________________________ ,

declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e

benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa

“EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE

PROLIFERAÇÃO E APOPTOSEEM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS”.

_________________________________________________________

Assinatura do Participante

_______________________________________________________________

Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz

Pesquisador Responsável

Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000

Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN(Tel: 84-32153135).

111

APÊNDICE 2 Ficha para coleta de dados clínicos da amostra selecionada:

Nº do caso Sexo Idade Raça Localização da

lesão Tempo de evolução

112

APÊNDICE 3 Ficha para avaliação qualitativa da expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-GLUT-1 nas amostras selecionadas:

Nº do caso GLUT-1 (+) GLUT-1 (-) Nº do caso GLUT-1 (+) GLUT-1 (-)

113

APÊNDICE 4 Ficha para reclassificação das amostras GLUT-1(-) de acordo com seu padrão morfológico e clínico.

Nº do caso

Diagnósitico após a reclassificação

Nº do caso

Diagnósitico após a reclassificação

114

APÊNDICE 5 Ficha para comparação entre os diagnósticos histopatológicos dados anteriormente e os diagnósticos dados após a reclassificação.

Nº do caso Diagnósitico Nº do caso Diagnósitico

Antes Depois Antes Depois

115

APÊNDICE 6 Ficha para análise quantitativa da imunoexpressão do antígeno Ki-67.

Ki-67 Nº DE CÉLULAS POR CAMPO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Total %

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

Nº do caso Positiva

Negativa

116

APÊNDICE 7 Ficha para comparação entre os escores dados pelos avaliadores a partir da imunoexpressão do antígeno Bcl-2.

Nº do caso Imunoexpressão de Bcl-2

Escore 0 Escore 1 Escore 2

117

ANEXO

118

ANEXO1

119

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