UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

JONALSON NOGUEIRA ARAÚJO

ATIVIDADE CITOTÓXICA, BACTERIOSTÁTICA E AGLUTINANTE PARA LEISHMANIA DE ConM: UMA LECTINA ISOLADA DAS SEMENTES DO FEIJÃO DE PRAIA - Canavalia

maritima (Aubl.) Thou. (1813).

NATAL 2015

JONALSON NOGUEIRA ARAÚJO

ATIVIDADE CITOTÓXICA, BACTERIOSTÁTICA E AGLUTINANTE PARA LEISHMANIA DE ConM: UMA LECTINA ISOLADA DAS SEMENTES DO FEIJÃO DE PRAIA - Canavalia

maritima (Aubl.) Thou. (1813).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Adriana Ferreira Uchôa.

Co-orientador: Elizeu Antunes dos Santos

NATAL 2015

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do

Centro de Biociências

Araújo, Jonalson Nogueira.

Atividade citotóxica, bacteriostática e aglutinante para leishmania de

ConM: uma lectina isolada das sementes do feijão de praia – Canavalia

marítima (Aubl.) Thou. (1813) / Jonalson Nogueira Araújo. – Natal, RN,

2015.

96 f.: il.

Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa.

Coorientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica.

1. Leishmaniose. – Dissertação. 2. Aglutinina. – Dissertação. 3.

Citotoxicidade. – Dissertação. I. Uchôa, Adriana Ferreira. II. Santos,

Elizeu Antunes dos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 577

Ao senhor nosso Deus.

À minha querida esposa Emanuella pelos empurrões e por ter me estendido a mão

em todas as horas que tropecei.

Aos meus filhos, Bianca e Ian, que sem ainda nem saber foram meus grandes

incentivadores.

À outra parte da minha família, meu sogro Josa, minha sogra Fátima, minha

cunhada Kyzis e minha tia/mãe Isaura, que me deram todo o suporte que precisei e

ainda minha mãe Socorro e minha irmã Gabi pelo apoio e compreensão.

Ao meu pai, João (in memoriam) pelo caloroso abraço que ainda sinto até hoje.

AGRADECIMENTOS

Ao senhor nosso Deus, por ter me proporcionado todas as condições para que eu conseguisse chegar até este momento.

À minha família, por todo o apoio que me deram durante todo este tempo.

À minha graciosa e amada esposa Emanuella e aos meus amados filhos Bianca e

Ian, que tanto me ajudam e me inspiram a seguir em frente.

Ao meu grande amigo Anderson Felipe (Negão), pela ajuda, pelas brincadeiras, pela honestidade e acima de tudo por ser uma pessoa que pude conversar e contar em

todos os momentos deste mestrado.

À minha querida amiga Luciana Rabêlo, que muitas vezes me deu uma direção quando me senti perdido, pela companhia e conversas matinais.

À querida Paula, pelos aperreios compartilhados em vários momentos e pela

valorosa amizade.

À grande amiga Ticiana, pelo convívio e paciência no laboratório

Aos grandes amigos Antônio e Raphael, que além da amizade, me ajudaram muito na realização dos experimentos.

Aos novos amigos e colegas de laboratório Leandro e John que me deram uma

grande força na reta final do meu trabalho

À minha grande amiga Isabela, que me ajudou muito durante este trabalho

Às amigas de laboratório Iana e Iane, Samily, Jacilene, Virgínia pela companhia e ajuda.

Aos amigos de laboratório Raphael Russi, Igor, pela companhia e ajuda.

À Vanessa, Fabiana e Amanda, da nutrição, pela disposição e amizade.

À Adeliana, que sempre me deu muita força e é uma pessoa que respeito muito.

Ao colega Norberto, pelos ensinamentos na iniciação cientifica que serviram muito

no meu mestrado.

À minha fabulosa turma de mestrado e aos amigos que fiz neste período e que perduram até hoje: Demétrios, Paula, Diego, Sinara, Kahena, Romulo, Marina,

Evellyn, Mayara.

Ao grande amigo João Paulo (JP), pelas conversas e compartilhamento mutuo de aperreios.

Aos amigos Ricardo, Rausito, Juliana, Dafiny, Diego (Rosa) Flávio e Everton pelas brincadeiras e ajuda.

Aos todos os colegas do Biopol (São muitos).

Aos colegas do IMT.

À Professora Adriana Ferreira Uchôa, por ter me aceito como seu aluno, por ser

sempre gentil e acolhedora e por todo o apoio e incentivo durante a minha formação na graduação e na pós-graduação.

Ao Professor Elizeu Antunes dos Santos, pela disponibilidade e pela sensibilidade, a qual é marca registrada de seu caráter, e por ter me adotado na co-oritentação deste

trabalho.

Ao professor Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela amizade, por ter me acolhido e ter se preocupado em momentos essenciais em que necessitei.

Ao professor João Paulo Matos Santos Lima, pelos conselhos, explendorosas aulas

e por ter me dado a honra de tê-lo em minha banca de defesa.

À Dra. Jailma Almeida de Lima, pelo carinho e atenção e por ter me dado o privilegio de tê-la em minha banca de defesa.

Aos professores da banca de qualificação Giulianna Paiva Viana De Andrade Souza,

Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin e Alexandre Flavio Silva De Queiroz, pelas

valiosas contribuições e disponibilidade.

Ao Professor Ermeton Duarte, pelo apoio e conversas nos intervalos dos experimentos.

A todos os outros professores do departamentos de bioquímica e de outros

departamentos da UFRN

À Sra. Margarita e Sr. Márcio (In memoriam), da secretaria da pós-graduação e ao Sr. Rogério e Sr. Ricardo, da secretaria do departamento, por todo o apoio.

Aos funcionários do Departamento de Bioquimica da UFRN.

Aos professores Marcello Porto Bemquerer (Embrapa), Guilherme Chaves (CCS –

UFRN) e Márcia Rosa de Oliveira (UFPB), pelo apoio na realização de experimentos.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPQ), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Coordenação de Aperfeiçoamento

de pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro.

Vivemos o nosso quotidiano sem entendermos quase nada do mundo. Reflectimos pouco sobre o mecanismo que gera a luz solar e que torna a vida possível, sobre a gravidade que nos cola a uma Terra que, de outro modo, nos projectaria girando para o espaço, ou sobre os átomos de que somos feitos e de cuja estabilidade dependemos fundamentalmente. Exceptuando as crianças (que não sabem o suficiente para não fazerem as perguntas importantes), poucos de nós dedicamos algum tempo a indagar por que é que a natureza é assim; de onde veio o cosmos ou se sempre aqui esteve; se um dia o tempo fluirá ao contrário e se os efeitos irão preceder as causas; ou se haverá limites definidos para o conhecimento humano. Há crianças, e conheci algumas, que querem saber qual é o aspecto dos "buracos negros"; qual é o mais pequeno pedaço de matéria; por que é que nos lembramos` do passado e não do futuro; como é que, se inicialmente havia o caos, hoje existe aparentemente a ordem; e por que *há* um Universo.

Carl Sagan (Introduzindo o livro Breve História do Tempo de Stephen W. Hawking)

RESUMO

Sementes de plantas são reservatórios de moléculas com grande potencial

para elaboração de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido

direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e propriedades

farmacológicas. As lectinas de plantas são proteínas com atividades biológicas

relacionadas a defesa, mas que podem ser utilizadas, heterologamente, como

interferentes no metabolismo de outros organismos. Uma lectina das sementes de

Canavalia maritima (CML) foi purificada em dois passos, pelo fracionamento com

sulfato de amônio seguido pela cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-

50. CML foi analisada por SDS-PAGE e parte de sua sequência de aminoácidos

determinada por espectrometria de massas. Os 20 resíduos identificados

apresentaram 100% de identidade com ConM. ConM foi testada contra eritrócitos do

sangue periférico humano e foi constatado a ausência de toxicidade quando

incubados com até 1000 µg/mL da proteína. Já contra células mononucleares, a

lectina não foi significativamente tóxica nas concentrações de 1, 2,5 e 5 µg/mL, mas

o foi a partir da concentração 7 µg/mL e contra a linhagem RAEC a proteína não

apresentou toxicidade significante com 25 µg/ml da proteína. Outros ensaios de

citotoxicidade revelaram que a ConM é tóxica para as linhagens tumorais A549, 786-

0, HT-29 e HeLa no intervalo entre 24 e 72 horas, principalmente nas concentrações

de 5, 7 e 10 µg/ml. ConM foi capaz de aglutinar as formas promastigotas de

Leishmania spp na concentração de 6,25 µg/ml. Quanto a ação contra Candida spp,

nenhuma das concentrações testadas (1 a 500 µg/ml) foi capaz de interferir no

crescimento. Quando avaliada a atividade bacteriostática, a ConM nas concentrações

variando de 0,39 a 400 µg/ml não inibiu o crescimento de Escherichia coli, já para

Staphylococcus aureus a concentração de 25 µg/ml se mostrou ativa, reduzindo o

crescimento em 75 %. Com base nos dados obtidos, a lectina isolada corresponde a

uma isolectina do tipo ConA, e suas propriedades anti-tumoral, bacteriostático e

aglutinante para Leishmania precisam ser melhor investigados para que seu potencial

biotecnológico seja explorado.

Palavras-chave: Aglutinina, Citotoxicidade, Leishmaniose, Escherichia

coli, Staphylococcus aureus.

ABSTRACT

Plant seeds are reservoirs of molecules with great potential for development of

bioproducts and for this reason special attention has been directed in the search of

bioactive proteins with antimetabolic and pharmacological properties action. Plant

lectins are proteins with biological activities related to defense, but that can be used,

heterologously as interfering with the metabolism of other organisms. A Canavalia

marítima seeds lectin (CML) was purified in two steps by ammonium sulfate

fractionation followed by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. CML was

analyzed by SDS-PAGE and part of its amino acid sequence determined by mass

spectrometry. The 20 resulting residues identified showed 100% identity with conm.

ConM was tested against erythrocytes of human peripheral blood and it was observed

absence of toxicity when incubated with up to 1000 µg/mL of protein. Since against

mononuclear cells, the lectin was not significantly toxic at concentrations of 1, 2.5 and

5 µg/mL, but it was from concentration 7 µg/mL. Against RAEC lineage protein showed

no significant toxicity with 25 µg/mL of protein. Other cytotoxicity assays revealed that

CONM is toxic for the tumor cell lines A549, 786-0, HT-29 and HeLa in the range

between 24 and 72 hours, particularly at concentrations of 5, 7 and 10 µg/mL. ConM

was still able to agglutinate promastigotes of Leishmania spp at concentrations of 6.25

µg/mL. About action against Candida spp any of the tested concentrations (1 to 500

µg/ml) was able to interfere with growth. When evaluated bacteriostatic activity, ConM

in concentrations ranging from 0.39 to 400 µg/mL did not inhibit the growth of

Escherichia coli, but the concentration of 25 µg/mL proved active aganist

Staphylococcus aureus, reducing its growth by 75%. Based on these data, the lectin

corresponds to a isolectin ConA-like, and its anti-tumor properties, bacteriostatic and

binder for Leishmania need to be further investigated for its biotechnological potential

exploited.

Keywords: Agglutinin, Cytotoxicity, leishmaniasis, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Canavalia maritima em seu local de coleta, fruto e

sementes............................................................................................................19

Figura 2. Representação esquemática de merolectinas, hololectinas,

quimerolectinas e superlectinas.........................................................................22

Figura 3. Contato entre os dímeros canônicos de ConM...................................30

Figura 4. O duplo sítio de ligação iônica na ConM nativa (A) e o potencial

eletrostático na superfície do dímero canônico de ConM..................................31

Figura 5. Amostra de C. maritima......................................................................42

Figura 6. Esquema dos passos purificação e identificação da ConM................46

Figura 7. Atividade específica das frações proteicas de C. marítima................54

Figura 8. Perfil cromatográfico da F 60-90 em coluna Sephadex G50..............55

Figura 9. Eletroforese (SDS-PAGE) da CML, em presença do agente redutor

DTT....................................................................................................................56

Figura 10. Alinhamento comparativo do sequenciamento da lectina de

Canavalia maritima (CML)..................................................................................57

Figura 11. Avaliação do efeito hemolítico de ConM sobre hemácias humanas.58

Figura 12.Efeito da ConM sobre a viabilidade das células mononucleares do

sangue periférico humano..................................................................................59

Figura 13. Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular RAEC........60

Figura 14. Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular A549..........62

Figura 15. Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular 786-0.........63

Figura 16. Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HT29.........64

Figura 17. Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HeLa.........65

Figura 18. Fotomicrografias em microscópio óptico da aglutinação das

promastigotas de L. amazonensis tratadas com ConM.....................................66

Figura 19. Fotomicrografias em microscópio óptico da aglutinação das

promastigotas de L. (Viannia) braziliensis tratadas com ConM.........................67

Figura 20. Efeito da ConM sob o crescimento da cepa bacteriana E. coli.........68

Figura 21. Efeito da ConM sob o crescimento da cepa bacteriana S. aureus...69

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Resultados da purificação da lectina da leguminosa Canavalia maritima

(CML) em diferentes etapas................................................................................55

Tabela 2. Efeito da ConM sobre a viabilidade das linhagens celular A549, 786-0,

HT29 e HeLa.......................................................................................................61

LISTA DE ABREVIAÇÕES/SIGLAS

786-0 - Adenocarcinoma renal humano

A375 - Melanoma

A549 - Carcinoma epitelial de pulmão humano

ATCC - American Type Culture Collection – Desenvolvedora e distribuidora de

microrganismos e linhagens celulares

Bax - Promotor de apoptose

Bcl-2 - Inibidor de apoptose

BIOPOL - Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais

BSA - Albumina sérica bovina

CaCl2+ - Cloreto de Cálcio

CBM - Concentração bactericida mínima

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CMN - Células mononucleares

ConA - Lectina isolada das sementes de Canavalia ensiformis

ConBR - Lectina de Canavalia brasiliensis

ConM - Lectina isolada da semente de Canavalia maritima

CR3 - Receptor do complemento do tipo 3

DGL - Lectina de Diocleia grandiflora

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - Meio para cultura celular

DNA - Ácido Desoxirribonucleico

DRC - Domínio reconhecedor de carboidratos

DTT - Ditiotreitol

G1 - Fases ciclo celular de crescimento 1

G2 - Fases ciclo celular de crescimento 2

gp63 - Glicoproteína 63

GPI - fosfatidil-inositol

HeLa - Adenocarcinoma de cólon uterino humano

Hepes - Ácido 1-piperazinoetanossulfónico-4-(2 hidroxietil)

HL60 – Leucemia promielocítica

HT29 - Adenocarcinoma coloretal humano

IAA - Ácido acético 3 idoleico

INCA - Instituto Nacional do Câncer

LCH - Leishmaniose cutânea humana

LCL - Leishmaniose cutânea localizada

LMC - Leishmaniose mucocutânea

LPG - lipofosfoglicano

LPS - lipopolissacarídeos

M - Fase M do ciclo celular (mitose)

MALDI-TOF/TOF - Ionização e dessorção a laser assistida por matriz – Tempo

de voo

MCF7 - Câncer de mama

MDA MB 231 -

MHC - Caldo Mueller Hinton

MnCl2+ - Cloreto de Manganês

MOLT-4 - Leucemia

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio

Na2HPO4 - Fosfato de Sódio

NaH2PO4 - Di-hidrógeno fosfato de sódio

NF-Ƙb - Fator nuclear kappa B

NO - Óxido nítrico (NO)

NOS - Óxido nítrico sintase

PPG - Proteofosfoglicanos

RAEC - Célula epitelial de aorta de coelho

RCA I - Aglutinina de Ricinus communis

RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute – 1640 - Meio para cultura celular

SBA - Aglutinina de soja

SDS - Dodecilsulfato de Sódio

SFB - Soro Fetal Bovino

SLC - Sítio de ligação a carboidratos (SLC)

TEMED - N’, N’, N’, N’-Tetrametil-1-2-diaminometano

TNF-α - Fator de Necrose Tumoral - α

UFC - Unidades de formação de colônia

UH - Unidades de Hemaglutinação

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA .............................................. 17

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................................... 17

1.2 FEIJÃO DE PRAIA - Canavalia maritima (Aubl.) Thou. (1813) ................ 17

1.3 LECTINAS ............................................................................................... 19

1.3.1 CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS ................................................... 20

1.3.2 LECTINAS E SUAS FUNÇÕES ........................................................ 23

1.4 LECTINAS E PLANTAS........................................................................... 24

1.4.1 LECTINAS E LEGUMINOSAE .......................................................... 25

1.4.2 LECTINAS E DIOCLEINAE ............................................................... 26

1.4.3 LECTINA E CANAVALIA ................................................................... 26

1.4.4 LECTINAS E Canavalia maritima ...................................................... 27

1.5 LECTINAS E CÂNCER ............................................................................ 32

1.6 LECTINA E LEISHMANIA ........................................................................ 33

1.7 LECTINAS E CANDIDA ........................................................................... 35

1.8 LECTINA E BACTÉRIAS ......................................................................... 36

1.9 JUSTIFICATIVA ....................................................................................... 37

2 OBJETIVOS ................................................................................................... 38

2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................. 38

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 38

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 39

3.1 MATERIAIS ............................................................................................. 39

3.1.1 EQUIPAMENTOS ............................................................................. 39

3.1.2 REAGENTES .................................................................................... 39

3.1.3 MATERIAIS BIOLÓGICOS ............................................................... 39

3.2 MÉTODOS ............................................................................................... 41

3.2.1 PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA LECTINA DO TIPO ConA DAS

SEMENTES DE C. Maritima (CML - ConM). ...................................................... 41

3.2.2 TESTES DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS ......................................... 47

3.2.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .............................................................. 53

4 RESULTADOS ............................................................................................... 53

4.1 PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA LECTINA DO TIPO ConA DAS

SEMENTES DE C. maritima. ................................................................................. 53

4.2 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ConM ................ 57

4.2.1 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE SOBRE CÉLULAS DO SANGUE

PERIFÉRICO HUMANO .................................................................................... 57

4.2.2 EFEITOS DE ConM SOBRE A VIABILIDADE EM LINHAGEM NÃO

TUMORAL .......................................................................................................... 59

4.2.3 EFEITOS DE ConM SOBRE A VIABILIDADE EM CÉLULAS

TUMORAIS ........................................................................................................ 60

4.2.4 A AGLUTINAÇÃO DE PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA PELA

ConM.................................................................................................................. 65

4.2.5 A ATIVIDADE FUNGISTÁTICA DA ConM CONTRA CANDIDA ....... 67

4.2.6 AS ATIVIDADES BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE ConM 68

5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 70

6 SÍNTESE DOS RESULTADOS E CONCLUSÃO ........................................... 79

7 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 81

17

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS

As lectinas estão envolvidas em diversos eventos celulares (CAVALCANTE et

al., 2011) e suas especificidades com relação aos diferentes carboidratos possibilitam

a sua utilização em diversas pesquisas biológicas e médicas, pois as tornam

poderosas ferramentas nos processos de purificação e caracterização de

polissacarídeo ou glicoconjugados, caracterização de grupos sanguíneos,

identificação de células malignas, diferenciação de células patogênicas e

caracterização dos estágios de desenvolvimento de microrganismos (AKAHANI et al.,

1997; DANGUY et al., 2002; SALES et al., 2000).

Nas duas últimas décadas os conhecimentos sobre lectinas têm contribuído

para sua aplicação como um aparato essencial na análise de glicoconjugados

presentes na superfície dos mais diferentes tipos celulares. O reconhecimento, por

parte destas proteínas, das alterações dos padrões de glicosilação durante o

desenvolvimento e diferenciação celular culminou em um grande número de modelos

experimentais, permitindo assim a investigação de proteínas de superfície e sua

relação com a perda ou comprometimento das funções celulares. (CAVADA et al.,

2001).

Avanços significativos de novos fármacos, que intencionam o tratamento de

doenças, se tornaram evidentes. E somando a isto os produtos naturais vêm se

mostrando eficazes em condições terapêuticas. (REDDY et al., 2003). Estes

compostos naturais, depois de provada sua eficácia, podem servir como um modelo

para o desenvolvimento de outras gerações de agentes com características

melhoradas. A obtenção de análogos é um processo comumente utilizado para

descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica. E dentro desta perspectiva

muito são os relatos que sugerem as lectinas vegetais como sendo eficazes quanto a

suas propriedades terapêuticas (FAHEINA-MARTINS et al., 2012).

1.2 FEIJÃO DE PRAIA - Canavalia maritima (Aubl.) Thou. (1813)

Em inglês a espécie Canavalia maritima é conhecida como bay bean, seaside

jackbean, costal jackbean e beach bean. É chamado de “feijão de praia” no Brasil,

“frijol de la playa” na Costa Rica e México, “mateblanco” ou “mate de la costa” em

18

Cuba e “Noumahlanga” em várias partes da África. Taxonomicamente possui a

seguinte sinônimia botânica: Canavalia rosea, Canavalia apiculata, Canavalia

arenicola, Canavalia obtusifolia, Dolichos emarginatus, Dolichos roseus e Dolichos

maritimus (MENDOZA-GONZÁLEZ; MARTÍNEZ; LITHGOW, 2014). Abaixo segue a

descrição taxonômica:

Reino: Plantae

Subreino: Tracheophytas

Super filo: Espermatóphyta

Filo: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Subclasse: Rosidae

Ordem: Fabales

Família: Fabaceae

Subfamília: Faboideae (Papilionoideae)

Subtribo: Diocleinae

Gênero: Canavalia

Subgênero: Canavalia

Espécie: Canavalia rosea (Sw.) DC. / maritima

Trata-se de uma planta rasteira e perene que cresce nos 5 continentes e

também são encontradas em ilhas. As folhas são compostas, trifoliadas alternadas, e

possuem formas circulares e pecíolos curtos. As flores são pequenas, róseas,

zigomorfas, exibindo uma pétala mais larga que as outras dispostas em cachos,

abrangendo de 1 a 3 centímetros em diâmetro. A florescência é evidente entre Maio

e Setembro, entretanto cachos esporádicos podem ser encontrados durante todo o

ano (figura 1). Os frutos são vargens robustas que variam entre 7 e 12 centímetros,

deiscentes, que possuem de três a sete sementes dormentes de cor marrom

marmorizado (figura 1) (MENDOZA-GONZÁLEZ; MARTÍNEZ; LITHGOW, 2014).

19

Figura 1 – Canavalia maritima em seu local de coleta, fruto e sementes. Visualiza-se a flor característica e as folhas arredondadas. Os frutos são vargens robustas, deiscentes, que possuem de três a sete sementes dormentes de cor marrom marmorizado. Fonte: autor e stuartxchange.org.

A espécie é encontrada nas linhas costeiras tropicais devido a dispersão de

suas sementes pelas correntes oceânicas e a sua alta resistência a salinidade, ao

enterro pela areia, aos poucos nutrientes e altas temperaturas. A planta é uma

importante colonizadora de solos arenosos e desempenha um importante papel na

geomorfologia de praias e dunas frontais. As folhas, caules e sementes possuem

aplicações nutricionais e na medicina popular devido ao seu alto conteúdo proteico e

outros ingredientes bioativos. (KITAJIMA et al., 2008; MENDOZA-GONZÁLEZ;

MARTÍNEZ; LITHGOW, 2014).

1.3 LECTINAS

A característica que define todas as lectinas é sua capacidade de ligação a

carboidratos e a preservação desta interação durante a evolução sugere que esta

atividade é essencial para o papel funcional destas proteínas (GADELHA et al., 2004,

2005). O termo lectina é amplamente empregado para designar todas as proteínas,

que não imunoglobulinas, que possuem pelo menos um domínio não catalítico,

chamado de domínio reconhecedor de carboidratos (DRC) ou sítio de ligação a

carboidratos (SLC).

São amplamente distribuídas na natureza e capazes de reconhecer e se ligar

especificamente e reversivelmente a monossacarídeos ou oligossacarídeos, sem

alterar as estruturas covalentes de qualquer ligante glicosídico (ASSREUY et al.,

2009; DELATORRE et al., 2013; MOREIRA et al., 1993; PINTO et al., 2013; THAYS

et al., 2013). Seus efeitos biológicos são normalmente bloqueados pela presença de

carboidratos (BEZERRA et al., 2007 DELATORRE et al., 2006; MARQUES &

BARRACO, 2000). Ao interagirem com glicoconjugados de superfície celular, as

20

lectinas podem promover a formação de ligações cruzadas entre células adjacentes,

desencadeando o processo denominado aglutinação (ALONSO, et al., 2001;

PEUMANS & VAN DAMME, 1995).

No decorrer dos anos as lectinas têm se firmado como proteínas bastante

atrativas devido seu uso extensivo como sondas para caracterização e isolamento de

açúcares simples e complexos (RAMOS et al., 1996a, 1996b). A distribuição espacial

dos sítios de ligação a carboidratos em proteínas oligoméricas determina suas

habilidades de distinguir e de cruzar ligantes sacarídicos multivalentes ou arranjos de

glicoconjugados específicos da superfície celular (DELATORRE et al., 2006). Estas

interações celulares mediadas por lectinas podem ocorrer de duas maneiras: Quando

lectinas da superfície celular transduzem um sinal depois da interação com um

sacarídeo ligante ou quando lectinas solúveis se ligam a carboidratos de glicolipídios

ou glicoproteínas na superfície da célula (BREWER et al., 2002).

Algumas famílias de lectinas apresentam sítios de ligação altamente

conservados, mas exibem diferentes atividades biológicas assim como diferentes

níveis de potência. A mutagênese, um processo evolucionário que causa alterações

pontuais nos genes, que pode modificar a sequência de aminoácidos das proteínas e

a interações existentes entre essas cadeias de aminoácidos podem aumentar ou

reduzir a potência dos efeitos biológicos, até para aquelas proteínas que possuem

estruturas muito similares (DELATORRE et al., 2006).

Sabendo dos efeitos biológicos das lectinas contra os mais diversos tipos de

organismos, cientistas de todo o mundo estão investindo em pesquisas que possam,

de alguma forma, utilizar estas proteínas como precursores na produção de novos

medicamentos, na vetorização de fármacos de difícil absorção a sítios específicos no

organismo ou até como marcadores na detecção de doenças e microrganismos;

apresentando grande potencial para o diagnóstico e tratamento de doenças (GOMES-

FILHO, 2014; THAYS et al., 2013).

1.3.1 CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS

Baseado na arquitetura dos DRC das lectinas, quatro grupos principais podem

ser distinguidos: merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e superlectinas (figura 2).

Merolectinas são proteínas que contém um único domínio reconhecedor de

carboidrato. Devido à natureza monovalente do DRC, este grupo não possui a

21

capacidade de aglutinar células. Hololectinas são compostas por dois ou mais DRC

idênticos ou bastante homólogos, sendo capazes de aglutinar células e/ou precipitar

carboidratos. A maior parte das lectinas vegetais, que corriqueiramente são isoladas

e caracterizadas, pertencem ao grupo das hololectinas. Superlectinas são compostas

de pelo menos dois DRC com especificidade para açucares diferentes. O grupo das

quimerolectinas compreende todas as lectinas que são compostas de um ou mais

DRC fusionados a domínios que exercem atividades biológicas independentes,

catalíticos, por exemplo. Multilectinas possuem DRCs idênticos, mas são capazes

de ligarem-se a açucares diferentes (MONTEIRO-MOREIRA, 2002; VAN DAMME et

al., 2008).

22

Figura 2 – Representação esquemática de merolectinas, hololectinas, quimerolectinas, superlectinas e multilectinas. As merolectinas são formadas de um único domínio de ligação a carboidratos (A – Heveína). Hololectinas contém pelo menos dois domínios que são idênticos ou bastante homólogos que ligam-se a mesma estrutura de açucares ou a estruturas similares (B – ConA). Quimerolectinas são proteínas fusionadas que consistem de um ou mais domínio de ligação a carboidratos paralelamente ligado a outro domínio não relacionado (C – Ricina). Superlectinas consistem exclusivamente de pelo menos dois domínios de ligação a carboidratos (D – TxCL-I). Multilectinas possuem DRCs idênticos, mas são capazes de ligarem-se a açucares diferentes (E – Jacalina). Adaptado de Liu et al. (2009), Lima et al. (2013) e Helton C. da Silva, UFC (2013).

Merolectina

Superlectina Quimerolectina

Hololectina

TxLC-I Ricina

ConA Heveína

A

D C

B

E Multilectina

Jacalina

23

1.3.2 LECTINAS E SUAS FUNÇÕES

As lectinas estão presentes em quase todos os organismos, ou seja,

microrganismos, plantas e animais. Entretanto essas proteínas são encontradas em

maior quantidade em leguminosas e gramíneas (IORDACHE et al., 2015; PUSZTAI,

1989). O fato das lectinas terem larga distribuição em plantas sugere alguma

importância fisiológica para estas moléculas (DIAS et al., 2015; ETZLER et al., 1985;

LIENER et al., 1976). As funções das lectinas em vegetais podem ser variadas e

parecem ter relação com os estágios de maturação e germinação das sementes

(HAMID et al., 2013; HOWARD et al., 1972), assim como parecem estar relacionadas

com os mecanismos de defesa da planta (DIAS et al., 2015; LIENER et al., 1976). As

proteínas em plantas podem exercer papeis autólogos como reserva, na regulação de

fitohormônios que controlam seu crescimento e desenvolvimento (DELATORRE et al.,

2013), no armazenamento e transporte de carboidrato em sementes e na associação

do vegetal a simbiontes (FERNANDES, 2008).

As plantas são excelentes fontes nutritivas para os organismos. Como tal, elas

são constantemente desafiadas por herbívoros, vírus, bactérias, fungos, nematoides

fitófagos e insetos que diretamente as utilizam como fontes de micro e

macronutrientes (ARAÚJO-FILHO et al., 2010a; DELATORRE et al., 2013). Muitas

lectinas de plantas mostraram-se específicas para glicoconjugados presentes em

organismos fora deste reino, enquanto que estes glicoconjugados são pouco

abundantes ou ausentes em vegetais (HOPKINS; HARPER, 2001; RIPOLL et al.,

2003; WONG et al., 2010). Peumans e Van Damme (1995) propuseram que as

lectinas de plantas desempenham um papel fundamental nas defesas gerais contra

um grande número de fitoagressores.

Foi avaliado que quando ingeridas, as lectinas não são degradadas durante sua

passagem pelo trato digestório e podem reconhecer resíduos de carboidratos

presentes nas células intestinais, ligando-se a eles. Essa ligação às células das

microvilosidades intestinais provoca interferência na absorção e utilização de

nutrientes, levando a uma rápida perda de peso e inibição do crescimento de

organismos experimentais. Além dos efeitos degenerativos nas membranas celulares,

as lectinas mostraram a capacidade de inibir várias enzimas intestinais

(VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004).

24

Devido a habilidade das lectinas em decifrar glicocódigos, integrais de

membrana ou solúveis, elas participam em inúmeros processos biológicos, que vão

desde comunicação celular, reconhecimento de célula-alvo, adesão celular, interação

célula-matriz, defesa dos hospedeiros, fertilização, na caracterização de grupos

sanguíneos (DIAS et al., 2015; LIS; SHARON, 1998); na estimulação da mitogênese

de linfócitos; e outros a infecções virais, bacteriana, micoplasmal e parasitaria,

metástases, crescimento e diferenciação em cânceres (ASSREUY et al., 2009;

BEZERRA et al., 2007; IORDACHE et al., 2015; JIANG et al. 2015; SHARON; LIS,

2004).

As lectinas ainda podem ser utilizadas na investigação de estrutura de proteína

e carboidratos em células (SILVA; SILVA, 2000); na utilização em matrizes comerciais

de afinidade, empregadas na purificação e caracterização de polissacarídeos e

glicoconjugados (HAMID et al. 2013; LIMA et al., 1997); e como agentes defensivos

na agricultura, em função de sua ação fungicida, bactericida e inseticida

(GAIDAMASHVILI; VAN STADEN, 2002; HAMID et al., 2013; PEUMANS et al., 2000.).

1.4 LECTINAS E PLANTAS

Um grupo particular e heterogêneo, dentre o grande acervo destes tipos

proteicos, é chamado de lectinas de plantas ou aglutininas de plantas. Análises

genômicas e transcriptômicas mostram que as sequências de lectinas são ubíquas no

reino das plantas e centenas de lectinas já foram purificadas de várias espécies

(GADELHA et al., 2005a; VAN DAMME et al., 2008).

A classificação racional das lectinas é baseada nas suas especificidades de

ligação a carboidrato. Entretanto mesmo em um grupo em particular as lectinas

demonstram algumas diferenças nas ligações aos carboidratos e nas propriedades

fisiológicas. Estas diferenças são menos pronunciadas quando as lectinas são

extraídas a partir de plantas botanicamente relacionadas, refletindo relações

evolucionarias entre espécies ou tribos da mesma família (DIAS et al., 2015;

MOREIRA et al., 1983, 1990).

Um recente sistema de classificação para lectinas de plantas foi elaborado

levando em consideração todos os dados de sequências que foram avaliados na

última década. A análise de genoma/transcriptoma revelou que lectinas de plantas

podem ser classificadas dentro de doze famílias distintas de domínios lectínicos

25

relacionados evolutivamente e estruturalmente (DIAS et al., 2015; VAN DAMME et al.,

2008). Estes diferentes domínios de ligação a carboidratos foram nomeados:

homólogos da aglutinina de Agaricus bisporus, amarantininas, homólogos da quitinase

classe V, família das cianovirinas, família das aglutininas de Euonymus europaeus,

Família das aglutininas de Galanthus nivalis, proteínas com domínios heveína,

jacalinas, proteínas com domínios lectínicos de leguminosas, domínios LysM, família

das aglutininas de Nicotiana tabacum e família da ricina-B. Cada domínio lectínico tem

suas próprias características interagindo com um ou mais sítios de ligação a

carboidratos (DIAS et al., 2015; IORDACHE et al., 2015; VAN DAMME et al., 2008,

1998).

1.4.1 LECTINAS E LEGUMINOSAE

As lectinas de leguminosas têm sido consideradas um sistema modelo para a

investigação das interações proteína-carboidrato (ASSREUY et al., 2009) e

constituem uma larga família de proteínas homólogas, estruturalmente similares e

com distintas especificidades. Elas pertencem ao grupo das lectinas de plantas mais

estudadas e melhor caracterizadas. Além disso, as lectinas de leguminosas possuem

estruturas tridimensionais bastante similares e uma alta correspondência na

sequência de aminoácidos e ainda apresentam uma considerável diversidade de

oligomerização monomérica. Alterações na orientação relativa dos sítios de ligação a

carboidratos na estrutura quaternária de lectinas homólogas têm sido especuladas

como contribuinte nas diferenças das atividades biológicas e potência destas lectinas

(CAVALCANTE et al., 2011; DELATORRE et al., 2006, 2013).

As lectinas de sementes de leguminosas mostram uma notável conservação em

suas estruturas primárias, secundárias e terciárias. De fato, aproximadamente 85%

de cada sequência de lectina de leguminosa é dedicada estruturalmente a regiões

conservadas. Comparações destas sequências e estruturas estabeleceram que

diferenças na especificidade por carboidratos parecem ser primariamente devido a

diferenças nos resíduos de aminoácidos onde existem loops adjacentes ao sítio de

ligação de carboidratos. A conformação destes loops é determinado pela presença de

cálcio e íons metálicos de transição na estrutura da proteína, na qual a ausência

resulta em um desdobramento local e perda da capacidade de ligação a carboidratos

(GADELHA et al., 2004, 2005).

26

1.4.2 LECTINAS E DIOCLEINAE

As lectinas presentes nas sementes da subtribo Diocleinae são glicose/manose

específicas e assim podem ser isoladas por cromatografia de afinidade em coluna

Sephadex G-50 (ASSREUY et al., 2009; GADELHA et al., 2004; MOREIRA et al.,

1993). Uma comparação nas sequências primárias de lectinas de Diocleinae revelam

pequenas diferenças em seus resíduos de aminoácidos, na qual pode levar a

mudanças na conformação das estruturas quaternárias e nas atividades biológicas.

Diversos fatores contribuem para estas diferenças: por exemplo, a oligomerização pH

dependente que algumas destas lectinas apresentam e a posição relativa do sítio de

ligação ao carboidrato (ASSREUY et al., 2009; BEZERRA et al., 2007; PINTO et al.,

2013).

Observa-se, em lectinas de algumas espécies desta subtribo, uma permutação

circular nas sequências de aminoácidos quando comparado com outras lectinas de

sementes pertencentes a outras tribos de Leguminosae, onde especula-se ser devido

a um evento de transpeptidação durante o processamento pós-traducional de um

precursor (PEREZ et al., 1991).

Foi demonstrado que lectinas desta subtribo agem como indutoras da

proliferação de linfócitos e produção de interferon gama, estimulador de macrófagos,

e migração de leucócitos e além disso, está claro que a interação de monossacarídeos

com proteínas de Diocleinae estão envolvidas nas atividades biológicas do sistema

imunológico (BEZERRA et al., 2007; PINTO et al., 2013; RAMOS et al., 1996a).

1.4.3 LECTINA E CANAVALIA

As plantas pertencentes ao gênero Canavalia são largamente distribuídas na

região tropical. Estudos mostraram que as sementes de plantas do gênero Canavalia

possuem uma considerável quantidade de proteína, carboidrato, lipídeos, fibras,

componentes bioativos e fatores antinutricionais. Este gênero está relacionado com a

família Leguminosae, Sub-família Papilionoideae, Tribo Phaseoleae, Sub-tribo

Diocleinae. A tribo Phaseoleae compreende oito sub-tribos: Cajaninae, Phaseoleae,

Clitoriinae, Ophrestiinae, Kennediinae, Erythrininae, Glycininae e Diocleinae. A

subtribo Diocleinae está dividido em treze gêneros: Canavalia, Cleobulia, Pachyrhizus,

27

Collaea, Camptosema, Dioclea, Cratylia, Galactia, Cymbosena, Herpiza,

Calopogonium, Macropsichanthus e Luzonia. O gênero Canavalia é dividido em quatro

sub-gêneros: Catadonia, Wenderothia, Maunaloa e Canavalia. (MOREIRA et al.,

1993; NIVEDITHA; VENKATRAMANA; SRIDHAR, 2013; SEENA; SRIDHAR;

RAMESH, 2005).

As lectinas que ocorrem em Canavalia são resultado do processamento de um

precursor glicosilado complexo durante a maturação das sementes. Observa-se que

além da subunidade alfa principal, que corresponde a 237 resíduos de aminoácidos,

duas outras subunidades chamadas beta e gama, que são fragmentos naturais da

subunidade alfa e considerados moléculas incompetentes, ocorrem na estrutura

quaternária destas lectinas (RAMOS et al., 1996a).

Lectinas dos gêneros Canavalia, Dioclea e Cratylia demonstram um alto grau de

similaridades estruturais. Elas são estruturas diméricas ou tetraméricas construídas a

partir de monômeros em forma de cúpula que consiste em motivos beta

interconectado por voltas e loops (GADELHA et al., 2005a, 2005b).

A ConA, isolada das sementes de Canavalia ensiformis é uma lectina bastante

estudada em termos da especificidade de ligação a carboidratos, propriedades ion-

metálica e estrutura tridimensional (GADELHA et al., 2005a, 2005b). A ConA foi a

primeira lectina a ser isolada, sequenciada e a ter sua estrutura tridimensional

determinada por cristalografia de raios-x. Os muitos estudos bioquímico, biofísicos e

estruturais realizados em ConA fazem desta proteína a lectina melhor compreendida

até agora. Esta lectina possui uma estrutura multimérica na qual apresenta uma

interconversão dímero-tetramero dependente de pH. Desde que ela foi isolada,

diversas outras lectinas, com propriedades físicas semelhantes, foram purificadas e

caracterizadas do mesmo táxon ao nível de gênero. Todas possuem estruturas

multiméricas constituídas de monômeros de aproximadamente 25.5 kDa, são

metaloproteínas na qual em cada subunidade existe um sítio de ligação a metal para

os íons Ca2+ e Mn2+ e uma cavidade hidrofóbica na qual ligantes hidrofóbicos

interagem (CAVADA et al., 2001).

1.4.4 LECTINAS E Canavalia maritima

A Concanavalina M (ConM) é uma lectina isolada da semente da leguminosa

28

comumente conhecida como feijão de praia ou pela nomenclatura binária Canavalia

maritima (DELATORRE et al., 2013). É uma hemaglutinina de aproximadamente 25.5

kDa por monomêro, classificada como hololectina. O tetrâmero que forma a proteína

consiste de dois dímeros canônicos de lectinas de leguminosa, sendo cada monômero

formado por uma cadeia polipeptídica de 237 resíduos de aminoácidos (DELATORRE

et al., 2013; MOREIRA E CAVADA, 1984).

A especificidade de ligação a carboidratos da ConM foi avaliada pela inibição

dos haptenos na hemaglutinação, utilizando vários monossacarídeos e seus

derivados como inibidores (RAMOS et al., 1996a). ConM é uma lectina do tipo ConA

e apoiando este fato, foi relatado que esta proteína possui uma afinidade por diversos

monossacarídeos que são comuns as lectinas de Diocleinae, inclusive glicose e

manose, entretanto trealose e maltose inibem fortemente a atividade hemaglutinante

da lectina (DELATORRE et al., 2006, 2013; GADELHA et al., 2005b).

Ao longo de vários anos diversos autores se propuseram a caracterizar esta

lectina. A existência de isoformas menores foi confirmada pelos resultados de

eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) sobre condições acidas e alcalinas e

focalização isoelétrica, e é típica de muitas outras lectinas de leguminosa (PEREZ et

al., 1991). A sequência da ConM foi alinhada com as de outras lectinas de sementes

de Dioclea grandiflora e Canavalia ensiformis. A análise deste alinhamento revelou

um alto nível de similaridade uma com as outras, com 71% dos resíduos sendo

conservados (PEREZ et al., 1991).

Moreira e Cavada (1993) analisaram a influência do pH na solubilidade das

proteínas e na atividade hemaglutinante e concluíram que a máxima atividade

hemaglutinante em relação com a solubilidade ocorria em pH 8,0. Toda a estrutura

nativa da ConM foi analisada e considerada tetramérica do tipo ConA e foi depositada

no banco de dados de proteínas (PDB) com o código PDB 2CWM (GADELHA et al.,

2005a, 2005b).

A estrutura cristalizada preliminar de ConM foi determinada por métodos de

realocação molecular (GADELHA et al., 2005b). O alinhamento da sequência primária

de lectinas da subtribo Diocleinae mostrou que ConM apresenta um alto grau de

similaridade. A sequência sugerida por Perez et al. (1991) mostrou 90% de

29

similaridade com ConA, entretanto, alguns resíduos foram corrigidos por Gadelha et

al. (2005), resultando em um aumento na similaridade para 98%. Assim, apenas cinco

resíduos de aminoácidos diferem a ConA (D58, A70, M129, E192 e P202) da ConM

(G58, G70, S129, D192 e S202). O principal alvo dos estudos de afinidade das lectinas

é como diferenças estruturais podem alterar a atividade biológica e melhorar a

especificidade por glicanos na superfície celular. Em ConM, uma única modificação

na sequência de aminoácidos observada em comparação com outras lectinas do tipo

ConA amplifica suas propriedades. (DELATORRE et al., 2006).

A ConM difere da ConA também no sentido de formarem mais interações de Van

der Waals e ligações de hidrogênio criando um grande superfície de contato e

promovendo uma alta afinidade por dimanosídeos. Adicionalmente, o realocamento

da prolina 202 (P202) pela serina202 (S202) na lectina de C. maritima é único dentre

as lectinas do tipo ConA já sequenciadas (GADELHA et al., 2004, 2005; PINTO et al.,

2013). Delatorre et al. (2006) relatou que a estrutura cristalizada da ConM complexada

com trealose e maltose revelou mutações pontuais relevantes, que explica a alta

afinidade desta por dissacarídeos quando comparado com monossacarídeos. Esta

análise estrutural comparativa entre ConM e outras lectinas de diocleinae,

complexadas com diferentes dimanosídeos, criou novas perspectivas no

entendimento do relacionamento da estrutura com a atividade biológica em lectinas

de leguminosas (BEZERRA et al., 2007).

A análise da estrutura da ConM indica um dímero na unidade assimétrica, dois

sítios de ligação a metais por monômero e loops envolvidos na oligomerização

molecular (GADELHA et al., 2004, 2005). Os dois dímeros canônicos são associados

por folhas beta, e estas são mantidas por pontes de hidrogênio. Mas os dímeros

podem ser associados por interações salinas cruzadas, formando a estrutura

quarternária da ConM. Os contatos da interface beta-beta e as ligações de hidrogênio

estabilizam estes dímeros. Cada resíduo nos sítios C1 e C2 interconecta os dímeros

(figura 3 - A) e as interações que estabilizam a estrutura estão na mesma linha (figura

3 - B) (GADELHA et al., 2005).

30

Figura 3 – Contato entre os dímeros canônicos de ConM. Cada resíduo nos sítios C1 e C2 interconecta os dímeros (A) e as interações que estabilizam a estrutura estão na mesma linha (B). Adaptado de Gadelha et al. (2005b).

Na ConM, os aminoácidos envolvidos nas ligações metálicas são conservados,

e as estruturas do sítio de ligação de Mn2+ e Ca2+ mostram similaridades com as

determinadas para outras lectinas de leguminosas. Monômeros de ConM contem íons

Mn2+ e Ca2+ na proximidade do sitio de ligação ao carboidrato (figura 4 - A) (GADELHA

et al., 2005b). Como notado em estruturas do tipo ConA, o sítio de ligação ao açúcar

em ConM exibe um potencial eletrostático negativo. Após a ligação do sacarídeo, esta

superfície eletrostática negativa se torna coberta por uma carga neutra (figura 4 - B)

(GADELHA et al., 2005b).

B A

31

Figura 4 – O duplo sítio de ligação iônica na ConM nativa (A) e o potencial eletrostático na superfície do dímero canônico de ConM. Neste último o círculo amarelo aponta o potencial eletrostático negativo dos DRC. Adaptado de Gadelha et al. (2005b).

A ConM é amplamente estudada quanto a sua atividade anti-inflamatória,

principalmente em eventos celulares mediados pela prostaglandina E2, óxido nítrico

e TNF-α em ratos não sensibilizados e sensibilizados (PINTO et al., 2013). Foi

mostrado que esta lectina relaxa aorta de ratos via ativação da enzima Oxido nítrico

sintase (NOS) responsável pela formação de óxido nítrico (NO) e induzem também

edema de pata (ASSREUY et al., 2009; GADELHA et al., 2005). A propriedade de

liberação de histamina pela ConM, induzidas em mastócitos peritoneais de ratos, foi

comparada com a da ConA e com outras lectinas purificadas a partir de sementes

pertencentes à mesma família. Menor potência e eficácia foi observado para ConM

(GOMES et al., 1993).

Uma outra atividade descrita para ConM está relacionada a sua interação com

diferentes formas de Ácido acético 3 idoleico (IAA) é uma estratégia para tornar o este

fitohormônio indisponível para a célula. Assim este papel fisiológico proposto para as

lectinas de plantas pode ser um novo mecanismo pela qual os níveis de IAA são

diminuídos além da destruição e formação de novos complexos em determinados

estágio da germinação de sementes (DELATORRE et al., 2013).

Também foi observado por microscopia de fluorescência que ConM liga-se aos

A B

32

conídios não germinados do fungo Colletotrichum gloeosporioides que causa doenças

em plantas (ARAÚJO-FILHO et al., 2010a, 2010b). ConM também é capaz de inibir o

crescimento planctônico e a formação de biofilmes por Streptococcus mutans,

interferindo na expressão de genes que codificam enzimas relacionadas com a

adesão formação e regulação dos biofilmes (CAVALCANTE et al., 2011; THAYS et

al., 2013).

1.5 LECTINAS E CÂNCER

O câncer pode ser definido como uma proliferação anormal de células que são

capazes de invadir e colonizar os mais diversos tecidos do organismo. Estas

disfunções podem ser ocasionadas por mutações somáticas que modificam a

expressão gênica estimulando a proliferação celular, alterando o balanço natural entre

as células mutantes e não mutantes (FAHEINA-MARTINS et al., 2012; TEIXEIRA,

2012).

A carcinogênese corresponde a uma condição multicausal, entretanto, o

estágio final de transformação maligna da célula envolve sempre um desequilíbrio em

prol do processo de proliferação celular, em detrimento dos processos de

diferenciação celular e apoptose. Para uma melhor compreensão do câncer se faz

necessário compreender a importância de uma gama de fatores que contribui para o

seu desencadeamento. Um destes fatores e o sistema imunológico, mediando

processos fundamentais da resposta contra células neoplásicas. Outro fator, a

oncogênese, envolve situações genéticas como lesão e reparo de DNA, mediados por

três grupos de genes: os oncogenes, os genes supressores de tumor e os genes de

estabilidade (PINTO et al., 2012)

As alterações fenotípicas que interessam em uma célula para o estudo com

câncer são aquelas da superfície da membrana e mais especificamente alterações

nos padrões glicídicos de células malignas quando comparado a um padrão normal.

As alterações nos padrões de glicosilação são frequentemente resultado de

alterações na atividade de glicosiltransferases e glicosidases. Estas modificações são

observadas em glicolipídios, glicoesfingolipidios e glicoproteínas da membrana

(GHAZARIAN; IDONI; OPPENHEIMER, 2011; TEIXEIRA, 2012).

33

As interações entre lectinas e carboidratos promove uma mudança na fisiologia

da célula. As expressões gênicas são alteradas e como resultado pode-se observar,

alterações metabólicas (FAHEINA-MARTINS et al., 2011). A alta especificidade de

interação com carboidratos faz das lectinas potentes marcadores moleculares para

glicoconjugados específicos de células tumorais. Além disso, estas proteínas podem

ser conjugadas com uma série de agentes carreadores agindo pontualmente em

células malignas (RABELO et al., 2012).

As lectinas de plantas representam um bem definido e não tradicional recurso

acerca de componentes anticâncer, entretanto seu papel na morte celular programada

ainda é pouco conhecido. Nos dias atuais existe um grande interesse em Lectinas de

leguminosas, principalmente pela sua potencial aplicação como um agente

antitumoral. Tem sido demonstrado que lectinas de plantas desencadeiam

importantes processos celulares, além de atuarem como adjuvantes na quimioterapia

e radioterapia (HAMID et al., 2013; JIANG et al., 2015; ZAROGOULIDIS et al., 2015)

Estas proteínas têm atraído o interesse de pesquisadores devido as suas

vastas atividades biológicas, da qual incluem a habilidade de parar o ciclo celular nas

fases G1 e G2/M, alterar a expressão de caspases pró-apoptótica e aumentar a taxa

de Bax/Bcl-2 em células neoplásicas (KLAFKE et al., 2013). Neste contexto, as

lectinas de leguminosas têm sido amplamente destacadas por possuírem efeitos

inibitórios específicos ou citotoxicidade e por induzir apoptose em uma ampla

variedade de células tumorais (SILVA et al., 2014).

1.6 LECTINA E LEISHMANIA

Os parasitos do gênero Leishmania são organismos unicelulares que

apresentam um ciclo heteroxênico, caracterizado por duas principais formas

morfológicas: as formas promastigotas, encontradas no intestino do inseto vetor,

apresentando um formato alongado e flagelo livre e as formas amastigotas,

encontradas no interior dos macrófagos, que se apresentam ovaladas e possuem o

flagelo incluso não exposto. Para que haja a infecção, este protozoário precisa

contornar o sistema imunológico desde o início de sua inoculação (GOMES-FILHO,

2014).

As células dendríticas são os primeiros alvos na infecção, normalmente

internalizando os parasitos. No caso dos macrófagos, diversos receptores de

34

membrana vem sendo identificados como mediadores da ligação parasito-célula,

dentre estas moléculas destacam-se dois glicoconjugados: a protease gp63 (uma

glicoproteína) e o lipofosfoglicano (LPG) que ligam-se ao receptor do complemento do

tipo 3 (CR3), manose-fucose e fibronectina. A superfície celular dos

tripanosomatídeos é revestida ricamente por moléculas glicosiladas, a maioria

ancorada à membrana celular. Estes glicoconjugados formam uma densa camada

superficial protetora, cobrindo por inteiro a superfície da célula, intermediando as

interações do parasito com seus hospedeiros. (BARBOSA, 2012). Leishmania

apresenta em sua superfície glicoconjugados ricos em manose que são críticos para

virulência parasitária (GOMES-FILHO, 2014). Além disso, outros glicoconjugados

estão presentes na superfifie celular deste protozoário, como os glicosil-fosfatidil-

inositol (GPI), os proteofosfoglicanos (PPG) e outras glicoproteínas contendo âncoras

GPI.

Leishmania (Viannia) brasiliensis é o princicipal agente etiológico da

leishmaniose cutânea nas américas sendo responsável por causar duas diferentes

formas clínicas: a leishmaniose cutânea localizada (LCL) e a leishmaniose

mucocutânea (LMC) (FARIAS et al., 2012).

Leishmania amazonensis é o agente causador da leishmaniose cutânea

humana (LCH) no novo mundo, na qual a maioria dos casos envolve uma severa

leishmaniose cutânea difusa e anérgica (CHAVES et al., 2003).

Lectinas são frequentemente utilizadas para sondar os carboidratos de

membrana de diferentes cepas de leishmania para discriminar entre cepas

patogênicas e não patogênicas deste parasita e ainda distinguir entre diferentes

estágios morfológicos (BARBOSA et al., 2012). Lectinas também tem sido utilizadas

em purificação por afinidade de diferentes glicoconjugados de leishmania (ANDRADE;

SARAIVA, 1999), identificação de cepas e espécies e composição do glicocálix

(IORDACHE et al., 2015; MEDEIROS et al., 2010). Em algumas espécies de

Leishmania, promastigotas metacíclicas são purificadas por seleção negativa. Relatos

apontam que é possível purificar formas metacíclicas a partir de culturas axênicas com

lectinas (DA-SILVA et al., 2002).

35

1.7 LECTINAS E CANDIDA

Os fungos do gênero Candida são patógeno comuns em humanos, sendo

componentes da microflora endógena da pele, mucosas, e trato digestório de

hospedeiros sadios. Entretanto, quando as defesas imunológicas são comprometidas

ou o balanço da microflora normal é perturbado, Candida transforma-se em um

patógeno oportunista potencialmente letal. De fato, a disseminação de Candida lidera

as causas de doenças fúngicas invasivas em diabéticos, nascidos prematuros,

pacientes cirurgiados ou com doenças orofarígeas bem como pacientes com AIDS

(WANG et al., 2013). Candida está classificada como a quarta entre os patógenos

nosocomial e a infecção por cândida tem um importante impacto na medicina e na

economia ligado as dificuldades no diagnóstico clínico e biológico (DAMIENS et al.,

2012). Nos últimos anos, a procura por novas moléculas antifúngicas tem recebido

uma atenção especial tendo em vista o surgimento de casos de fungos oportunistas e

de difícil tratamento. (CHARUNGCHITRAK et al., 2011; COELHO, 2011; ISLAM;

KHAN, 2011).

Lectinas de plantas não são bem exploradas nas suas habilidades de inibir a

atividade de fungos patogênicos em humanos. A respeito do grande número de

lectinas e hemaglutininas que já foram purificados, apenas poucas manifestaram uma

atividade antifúngica, o que é contraditório se levarmos em consideração o papel

destas proteínas no mecanismo de defesa de plantas. (CHARUNGCHITRAK et al.,

2011; ISLAM; KHAN, 2011; KLAFKE et al., 2013).

A inibição do crescimento fúngico pode ocorrer através das ligações das lectinas

com as hifas, resultando em uma pobre absorção de nutrientes, assim como pela

interferência no processo de germinação dos esporos. Relatos apontam lectinas que

se ligam a quitina mostram um maior índice de interferência contra fungos,

prejudicando na síntese e ou na deposição de quitina na parede celular (KLAFKE et

al., 2013).

As lectinas provavelmente não inibem o crescimento de fungos por modificações

nas estruturas ou na permeabilidade em suas membranas. Assim, deve existir efeitos

indiretos produzidos pela ligação de lectinas a carboidratos na parede celular das

células dos fungos (HAMID et al., 2013; ISLAM; KHAN, 2011; REGENTE et al., 2014).

Por exemplo, a síntese e deposição de quitina nos fungos são atenuados por algumas

lectinas, que são livres de quitinases e inibidores que se ligam a quitina na síntese da

36

parede celular; outras lectinas de plantas também suprimem o crescimento fúngico,

mas não causam a sua morte (ANG et al., 2014; COELHO, 2011).

1.8 LECTINA E BACTÉRIAS

Relatos apontam que as interações entre lectinas e membranas de

microrganismos possibilitam a distinção entre espécies bem como demonstram a

presença de um resíduo de açúcar em particular. Entre as bactérias que reagem com

lectinas destacam-se além das Gram-negativas e positivas algumas espécies de

micobacterias e actinomicetos (PISTOLE, 1981). Muitos patógenos humanos utilizam

estes açúcares da superfície celular como receptores ou ligantes para iniciar a adesão

e a infecção. Algumas bactérias por exemplo ligam-se aos manosídeos do hospedeiro,

outras cepas demonstraram especificidades contra uma variedade de carboidratos da

superfície da célula hospedeira, tais como galabiose. Cada interação hospedeiro-

patógeno é multivalente e portanto estes eventos de ligação possuem uma alta

afinidade e se tornam adequadas para a infeção. (AWOYINKA et al., 2013; HAMID et

al., 2013; IORDACHE et al., 2015).

A atividade das lectinas contra bactérias Gram positivas e Gram negativas

ocorrem por meio das interações entre a proteína e os componentes da parede celular,

tais como peptídioglicanos e lipopolissacarídeos (LPS) (HAMID et al., 2013). Bactérias

podem distinguir entre dois carboidratos praticamente idênticos, onde a única

diferença está em apenas um grupo hidroxila, e baseado neste tipo de especificidade

entre patógeno e hospedeiro, estratégias podem ser desenvolvidas para prevenir a

adesão bacteriana (IORDACHE et al., 2015).

A habilidade dos microrganismos patogênicos em formar agregados é uma

realidade preocupante. As indústrias farmacêuticas associadas com grupos de

pesquisas trabalham para desenvolver novas opções para o tratamento de infecções

causadas por bactérias organizadas em biofilmes. Moléculas capazes de se ligarem

especificamente e seletivamente a carboidratos tem uma grande importância no

desenvolvimento da pesquisa relacionada com biofilmes microbianos. Assim lectinas

vêm se mostrando uma poderosa ferramenta para análise de estruturas glicídicas

destes agregados de origem microbiana. Lectinas podem ser um agente antiaderente

adequado para Streptococci, desde que mecanismos dependentes de lectinas

estejam envolvidos nesta adesão. Entretanto, a aplicação de lectinas para o estudo

37

nas interferências contra biofilmes ainda são pouco explorados (TEIXEIRA, 2012). Um

outro interessante mecanismo de ação é o bloqueio dos movimentos das bactérias,

causando perda de motilidade e prevenindo a invasão pelos patógenos (DE SOUZA

CANDIDO et al., 2011).

1.9 JUSTIFICATIVA

Tendo em vista as grandes dificuldades encontradas no tratamento de

doenças, sejam estas negligenciadas ou não, ou os desconfortáveis e até graves

efeitos adversos provocados pelas fortes drogas administradas na terapia, a procura

por produtos que interajam com o organismo sem provocar grandes modificações

prejudiciais é de grande interesse para nossa sociedade se torna promissora

considerando a diversidade de nossa fauna e flora, ainda mais a nossa flora. Produtos

de cunho natural, obtidos principalmente de espécies vegetais, se tornaram atrativos

para extração de proteínas e consequentemente tem apresentado eficientes

atividades nas áreas envolvidas com a parasitologia, imunologia, oncologia e outras.

A atuação das lectinas em mecanismos e mediadores envolvidos em diversos

processos orgânicos vem sendo alvo de pesquisas ao longo dos últimos anos e

certamente continuará a ser exploradas ainda por muitos anos mais. Nestas

perspectivas o presente trabalho propõe o aproveitamento da abundância vegetal do

nosso território para o estudo de lectinas como interferentes específicos em células

tumorais e em estudos de virulência em protozoários e algumas espécies de bactérias.

38

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o potencial bioativo de uma lectina (ConM) purificada de sementes

da leguminosa Canavalia maritima (feijão de praia).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Purificar e Identificar uma lectina do tipo ConA das sementes de Canavalia

maritima (feijão de praia) conhecida como ConM.

Analisar a ação tóxica da ConM contra células do sangue periférico humano.

Avaliar a ação da ConM frente a viabilidade de linhagens celulares não tumoral,

e tumoral.

Averiguar a capacidade aglutinante de ConM contra Leishmania sp.

Testar a capacidade fungistática de ConM contra Candida spp.

Investigar o potencial bactericida e bacteriostático de ConM contra espécies

Gram-negativas e Gram-positivas.

39

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 EQUIPAMENTOS

Além dos aparelhos usuais do laboratório, pode-se destacar:

Banho Maria (Tecnal – Te 056)

Balança analítica eletrônica - BEL Engineering

Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200)

Centrífuga refrigerada HITACHI CR G

Cuba de eletroforese BIORAD

Espectrofotômetro Pharmacia Biotec (mod, ultrospec 2100 – pro)

Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.)

Bancada de Fluxo Laminar (PACHANE Pa300)

Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model

3110

Liofilizador TERRONI FAUVEL – LB 1500 TT

Microcentrífuga para eppendorf 5410

Microcentrífuga para hematócrito (Modelo spin 1000)

Microscópio invertido NIKON Eclipse TE300

Peagâmetro Analyser (pH 300)

3.1.2 REAGENTES

Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico,

adquiridos comercialmente, sendo manuseados segundo recomendação do

fabricante, quando especificado.

3.1.3 MATERIAIS BIOLÓGICOS

40

3.1.3.1 Canavalia maritima (FEIJÃO DE PRAIA)

As sementes da leguminosa Canavalia maritima foram coletadas na praia do

Forte, localizada no litoral sul da região metropolitana de Natal, estado do Rio Grande

do Norte (coordenadas: lat: -5.766228, long: -35.196658 WGS84). A exsicata da

planta foi identificada e catalogada no herbário da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN) sob o número de registro 16787 e pode ser visualizado no

site do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Herbário Virtual da Flora e dos

Fungos (INCT-HVFF) em inct.florabrasil.net ou splink.org.br.

As vagens coletadas foram armazenadas em sacos plásticos, sendo em

seguida transportadas para o Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas

(LQFPB) da UFRN, onde foram deixadas a temperatura ambiente e com humidade

reduzida, até que as vagens estivessem completamente secas e as sementes

atingissem uma coloração marrom e homogênea. Posteriormente as sementes foram

separadas de suas vagens e armazenadas a temperatura de 20ºC.

3.1.3.2 ERITRÓCITOS HUMANOS

Os eritrócitos humanos foram obtidos através de doações de bolsas de sangue

pelo HEMOCENTRO – RN. As bolsas fornecidas encontravam-se fora do prazo de

validade para transfusões.

3.1.3.3 LINHAGENS CELULARES

As seguintes linhagens celulares foram utilizadas neste trabalho: A549,

carcinoma epitelial de pulmão humano (ATCC® número CRM-CCL-185), 786-0,

adenocarcinoma renal humano (ATCC® número CRL-1932), HT29, adenocarcinoma

coloretal humano (ATCC® número HTB-38), HeLa, adenocarcinoma de cólon uterino

humano (ATCC® número CCL-2) e RAEC, célula epitelial de aorta de coelho

(produzidas e estabelecidas pelo Departamento de Biologia Molecular da

Universidade Federal de São Paulo). Os ensaios com células tumorais foram

realizados graças a colaboração do prof. Dr. Hugo de Oliveira Rocha, do Laboratório

de Biotecnologia de Polímeros Naturais – BIOPOL, Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

41

3.1.3.4 MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS

Os testes realizados com Leishmania spp contaram com a parceria da profa.

Dra. Márcia Rosa de Oliveira, do laboratório de Leishmaniose, Departamento de

Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraíba. Foram utilizados formas

promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/2011/AF) e

Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8).

Os ensaios feitos com Candida spp só foram possíveis com a colaboração do

Professor Dr. Guilherme Chaves do Laboratório de Micologia Clínica, Departamento

de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Foram utilizadas as seguintes espécies de importância médica: Candida albicans

(ATCC® número 90028), Candida dubliniensis (CBS® número 7987), Candida

tropicalis (ATCC® número 13803), Candida parapsilosis (ATCC® número 22019),

Candida glabrata (ATCC® número 2001), Candida rugosae (ATCC® número 10571) e

Candida krusei (ATCC® número 6258).

As atividades bactericidas e bacteriostáticas foram realizadas em parceria com

o prof. Ermeton Duarte do Nascimento do LaBMed - Laboratório de Bacteriologia

Médica, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Foram testadas cepas de Escherichia coli (ATCC® número 25922 )

e Staphylococcus aureus (ATCC® número 25932 ).

3.2 MÉTODOS

3.2.1 PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA LECTINA DO TIPO ConA DAS

SEMENTES DE C. Maritima (CML - ConM).

O método utilizado neste trabalho para purificação da lectina do tipo ConA

(CML – ConM) foi adaptado de Moreira et al. (1983), realizado conforme os passos

relatados a seguir (figura 6).

3.2.1.1 PREPARO DA FARINHA DAS SEMENTES DE C. maritima

Os cotilédones de C. maritima livres de seus tegumentos foram triturados em

moinho elétrico e peneirados para a obtenção de uma farinha de granulação fina. O

material resultante foi utilizado para o procedimento de extração (figura 5).

42

Figura 5 – Amostra de sementes de C. Maritima. Da esquerda para direita: semente ao natural, cotilédones livres de seus tegumentos e farinha de C. maritima. Elaborada pelo autor.

3.2.1.2 PREPARO DO EXTRATO BRUTO

A farinha fina de C. maritima foi homogeneizada com tampão acetato de sódio

0,1 M, pH 5,0 na proporção 1:40 (p/v) sob agitação branda e constante por 4 horas a

temperatura ambiente (25°C). O homogeneizado resultante foi centrifugado a 8000 x

g, por 30 minutos, a 4 °C. O sedimentado foi descartado e o sobrenadante, límpido e

translúcido de coloração amarelada, foi denominado extrato bruto e utilizado nos

passos seguintes.

3.2.1.3 FRACIONAMENTO COM SULFATO DE AMÔNIO

O extrato bruto foi fracionado com três faixas de concentração de sulfato de

amônio: 0-30%, 30-60% e 60-90% de saturação. Após cada etapa de fracionamento,

a amostra foi mantida a uma temperatura de 4°C, por aproximadamente 16 horas e

posteriormente centrifugada a 8000 x g durante 30 minutos, a 4°C. As frações foram

ressuspendidas e dialisadas em membrana, sob agitação, por aproximadamente 20

horas, contra água destilada. Após a diálise as frações foram denominadas de acordo

com o grau de saturação (F0-30, F30-60 e F60-90), liofilizadas e armazenadas a

temperatura ambiente para testes posteriores.

3.2.1.4 CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Após os ensaios que determinaram a atividade hemaglutinante específica das

frações, aquela com melhor resultado foi escolhida e utilizada no procedimento

43

cromatográfico. A fração de interesse, F60-90, foi redissolvida em NaCl 1 M, contendo

5 mM de CaCl2+ e 5 mM de MnCl2+ (chamada de solução de equilíbrio) e aplicado em

uma coluna Sephadex G-50, equilibrada com a mesma solução. A coluna foi

primeiramente eluída com a solução de equilíbrio seguido da solução de Glicina-HCl,

0,1M, pH 3, contendo 1M NaCl e 5 mM de CaCl2+ e 5 mM de MnCl2+ (Chamada de

solução de eluição). Foi utilizado um coletor automático (Frac-920, Amersham

Biosciences), ajustado para um fluxo de 45 mL/hora em frações de 3 mL por tubo. A

análise do eluído foi feita em espectrofotômetro (Utrospec-2100 pro, Amersham

Biosciences), no comprimento de onda de 280 nm e utilizando uma cubeta de quartzo.

O nível de proteína nas eluições foi considerado zerado quando as absorbâncias das

frações atingiram um platô de 0,05.

3.2.1.5 DOSAGEM PROTÉICA

A determinação da concentração de proteínas das amostras foi realizada pelo

método colorimétrico de BRADFORD (1976), utilizando albumina sérica bovina (BSA)

como padrão. O ensaio foi feito em microplacas de 96 poços, à temperatura ambiente

(25 ºC). Após a mistura do reagente com as amostras proteica, a placa foi incubada

em ambiente escuro por no mínimo por 10 minutos e a leitura das amostras foi

realizada em um leitor de microplaca (Epoch – Bio Tek) à absorbância de 595 nm.

3.2.1.6 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DESCONTÍNUO E

DESNATURANTE (SDS-PAGE)

Com o intuito de avaliar a purificação da amostra proteica, a mesma foi

submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em presença de SDS, de

acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970) em um sistema miniVE

(sistema de eletroforese vertical - Amersham Biosciences). O gel de separação foi

preparado com 1,25mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 mL de tampão Tris-HCl

1,5 M pH 8,8; 2,425mL de água destilada; 50 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED

concentrado e 25 µL de persulfato de amônio 30%. O gel de concentração conteve

0,33mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 625 µL de tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8;

1,5mL de água destilada; 25 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED e 12,5 µL de persulfato

de amônio. O tampão de corrida foi feito com Tris 25 mM; glicina 192 mM e SDS 10%.

44

Uma vez diluída em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10%

v/v, 0,01% de azul de bromofenol e 1mM de DTT) num volume de 10 µL, a alíquota

foi aplicada no gel (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75 mm), o qual foi submetido

a uma amperagem constante de 30 mA por aproximadamente 2 h. O gel foi corado

em solução de Coomassie Blue R. Para determinar a massa molecular da proteína

isolada, foram utilizados marcadores padrão de proteína.

3.2.1.7 SEQUENCIAMENTO DE ConM

Para obtenção da sequência da lectina, a banda proteica do gel após processo

de coloração com azul de coomassie foi excisada e transferida para tubo de

microcentrifuga (BioRad). O corante foi retirado do gel após três lavagens com solução

de etanol a 30% até descorar completamente, seguida de mais uma lavagem com

solução de acetonitrila 50% e 25 mM de bicarbonato de amônio por 15 minutos, sendo

retirados e acetonitrila foi adicionada e o gel foi incubado por 10 min sob agitação

vigorosa.

Após esta etapa o gel foi seco em concentrador a vácuo por 20 min, sendo, em

seguida, adicionada solução de tripsina (33 ng/μL) em volume suficiente para cobrir o

gel e foi mantido em banho de gelo por 30 min. Um volume de 40μL de solução de

bicarbonato de amônio a 50 mM foi adicionado e depois o material foi incubado por

19 horas a 37 ºC.

Os peptídeos gerados por hidrólise enzimática foram liofilizados e misturados

com uma solução de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (5 mg em 250 μL de

acetonitrila, 200 μL de água ultrapura e 50 μL de solução aquosa de ácido

trifluoroacético a 3%) em proporção de 1/3 (v/v), depositadas em uma placa do tipo

Anchorchip (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA) e cristalizadas à temperatura ambiente.

Os fragmentos foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa

do tipo MALDI-TOF/TOF em espectrômetro Ultraflex III (Bruker Daltonics, Billerica,

EUA). A estrutura primária dos peptídeos foi interpretada por sequenciamento de novo

dos espectros obtidos nas análises de MS/MS, com fragmentação conduzida pela

metodologia LIFT-TM (SUCKAU et al., 2003).

As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com sequências de

45

lectinas depositadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology

Information, disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov), usando BLASTp (ALTSCHUL et

al., 1997) e formatadas utilizando a ferramenta Jalview 2.8.2.

46

Figura 6 - Esquema dos passos purificação e identificação da ConM.

Precipitação protéica com sulfato de amônio

60-90%

Reservados sob refrigeração a 8 °C

Centrifugação: 8000 x g - 4ºC por 30 min

Resuspensas em água destilada

Diálise contra água destilada

Precipitação protéica com sulfato de amônio 30-60%

Reservados sob refrigeração a 8 °C

Centrifugação: 8000 x g - 4ºC por 30 min

Resuspensas em água destilada

Diálise contra água destilada

Precipitação protéica com sulfato de amônio 0-30%

Reservados sob refrigeração a 8 °C

Centrifugação: 8000 x g - 4ºC por 30 min

Resuspensas em água destilada

Diálise contra água destilada

F 30-60

F 0-30

F 60-90

Precipitado Extrato bruto (EB)

Sobrenadante

Sobrenadante

Sobrenadante

Extração: tampão Acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0 – 4

horas.

(1:40, p/v).

Centrifugação: 8000 x g – 30 min, 4ºC.

Farinha de sementes de Canavalia maritima

Cromatografia G50

Eletroforese

Sequenciamento

47

3.2.2 TESTES DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.2.2.1 ENSAIO DE HEMAGLUTINAÇÃO

A atividade hemaglutinante foi testada em placas de microtitulação de fundo em

V de 96 poços, por meio de diluição seriada das amostras testes (DEBRAY, et al.,

1981). Foram testados eritrócitos, lavados com solução de NaCl 0,15 M, sem

tratamento e tratados enzimaticamente com tripsina e papaína (BENEVIDES et al.,

1998). Em volume final de 50 µL foram adicionados 25 µL de uma suspensão de 4%

de eritrócitos humanos dos tipos A, B e O e 25 µL de solução contendo proteínas. A

reação foi incubada a temperatura ambiente (25 ºC). Após uma hora a aglutinação foi

observada, e o título expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido

como o inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação

(MOREIRA & PERRONE, 1997). A atividade hemaglutinante específica foi obtida pela

razão entre UH e a quantidade de proteína (mg) existente na alíquota de 25 µL

testada.

3.2.2.2 TESTE DE CITOTOXICIDADE SOBRE CÉLULAS DO SANGUE

PERIFÉRICO HUMANO

3.2.2.2.1 ATIVIDADE HEMOLÍTICA

A atividade hemolítica da lectina foi avaliada sobre células do sangue periférico

humano. Hemácias humanas foram separadas do plasma por sedimentação e lavadas

três vezes com solução salina (NaCl 0,9%). A mesma solução foi utilizada para

preparar uma suspensão 1% (v/v) de hemácias e solubilizar as amostras. Em tubos

de 1,5 mL, 100 µL da suspensão de hemácias foram incubados com 100 µL da

amostra por 60 minutos, à temperatura ambiente. As referências de 100% e de 0% de

hemólise foram feitas incubando-se 100 µL da suspensão de hemácias com 100 µL

Triton X-100 1% (v/v) ou com 100 µL da solução salina , respectivamente. Após a

incubação, os tubos foram centrifugados a 3000 x g por 2 minutos e alíquotas de 100

µL dos sobrenadantes foram transferidas para microplacas de 96 poços e analisadas

em leitura de 405 nm.

48

3.2.2.2.2 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES (CMN) DE SANGUE

PERIFÉRICO HUMANO

Para a obtenção de CMN, 10 mL de sangue venoso foi utilizado. Em tubos

Vacutainer heparinizados, realizou-se a diluição de 20µL de sangue em 400µL de

líquido de Turck para a contagem de leucócitos totais. Foi realizada distensão celular

a partir do sangue total para contagem do diferencial de leucócitos.

O sangue total heparinizado foi centrifugado durante 20 minutos a 2000 x g sob

temperatura de 18 ºC para obtenção do anel leucocitário. O anel leucocitário foi

extraído, transferido para um tubo Falcon e adicionada Solução Salina Tamponada

(PBS) a fim de completar 10 mL. Posteriormente, para obtenção das CMN, o

homogeneizado foi aplicado sobre o meio de gradiente de densidade (Ficoll-Paque,

densidade = 1, 077 g/L, Amersham). Esta solução foi centrifugada por 20 minutos a

3000 x g sob temperatura de 18ºC para obtenção da nuvem leucocitária. As células

da interfase foram extraídas com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e lavadas por 3

vezes em PBS (10 minutos, 2000 x g, 18ºC). Após a última lavagem, as células foram

mantidas em meio RPMI 1640 com 20 mM de HEPES (Gilco-BRLTM, Grand Island,

NY, EUA) acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 2mM de L-glutamina (Gibco-

BRLTM).

3.2.2.2.3 GRAU DE RECUPERAÇÃO

A avaliação do grau de recuperação ocorreu por meio da correlação entre o

número de CMN presentes na distensão celular realizada com o sangue total, com o

número de CMN presentes após a separação celular contadas na câmara de

Neubauer. O grau de recuperação foi determinado pela relação entre a porcentagem

de CMN antes e após a separação.

3.2.2.2.4 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR (VC)

Para a realização do teste de viabilidade celular foi utilizado o corante de

exclusão Trypan Blue que apresenta afinidade maior por proteínas do soro do que por

proteínas celulares e onde as células não viáveis ficam coradas de azul. Para tanto,

se utilizou 10 µL da suspensão de CMN diluída em 20 µL do corante, sendo a leitura

realizada na câmara de Neubauer.

49

Foram utilizadas no experimento as suspensões celulares que apresentaram o

grau de viabilidade ≥95%.

3.2.2.2.5 GRAU DE PUREZA

O grau de pureza foi determinado a partir da porcentagem de CMN da

suspensão após a separação em relação à presença de polimorfonucleares. Para

tanto, foi realizada uma distensão celular corada pelo Giemsa e realizada leitura em

microscopia ótica comum. Foram contadas 100 células para quantificação percentual

de CMN. A porcentagem aceitável para a realização do experimento foi ≥ 90%.

3.2.2.2.6 CULTIVO DE CÉLULAS MONONUCLEARES

A partir da padronização do cultivo celular, 2x105 células/mL foram distribuídas

em cada poço da placa de cultivo em meio RPMI, acrescido de 10% de SFB. O cultivo

foi realizado em triplicada com e sem a utilização da lectina.

3.2.2.2.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE

O ensaio de citotoxicidade foi realizado utilizando o corante Trypan Blue nas

soluções. A concentração celular utilizada foi 2x105 células/mL em cada poço da placa

de cultivo celular, juntamente com 20 µL das diferentes concentrações da lectina: 1

µg/mL – 20 µg/mL em triplicata. As CMN expostas ou não a lectina foram incubadas

e visualizadas em diferentes períodos: 24, 48 e 72 horas. Realizou-se a

homogeneização das células de cada poço antes da retirada de uma alíquota de 10

µL, sendo esta posteriormente homogeneizada com 20 µL de Trypan Blue para

contagem em câmara de Neubauer. A visualização da viabilidade celular foi

determinada uma vez que as CMN vivas possuem a membrana celular intacta, não

permitindo que as mesmas sejam coradas. Assim, as células coradas indicaram morte

celular.

3.2.2.3 CULTURA DE CÉLULAS TUMORAIS E NÃO TUMORAIS

As linhagens celulares foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified

Eagle’s Medium), suplementadas com 10% de soro fetal bovino. Ao meio DMEM foram

adicionados Estreptomicina (5000 µg/mL) / Penicilina (5000 UI) ou cultivadas em meio

RPMI-1640, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e tratadas com

50

Estreptomicina (5000 µg/mL) / Penicilina (5000 UI). As células foram mantidas em

ambiente estéril com 5% de CO2.

3.2.2.4 TESTE DE CITOTOXICIDADE EM LINHAGENS NÃO TUMORAIS

O ensaio de azul de Alamar® foi utilizado para avaliar a citotoxicidade da

linhagem celular não tumoral RAEC. Foi permitido a linhagem celular crescer até sua

confluência utilizando meio RPMI-1640. O meio foi então removido dos frascos

contendo as células e realocado em novo meio com e sem as concentrações da lectina

em microplacas de 96 poços. O PBS foi utilizado como controle negativo a toxicidade

e o meio sem células também serviu como controle. Todas as placas foram incubadas

a 37º C, 5% CO2 por 4 horas. Ao término do tempo de incubação, o azul de Alamar foi

adicionado em cada frasco e deixado em contato com a camada celular e incubado

por 1 hora a 37º C e avaliado quanto a mudança de coloração de um azul

característico para um rosa vibrante, indicando a redução do azul de Alamar pelo

metabolismo mitocondrial das células testadas. A fluorescência foi medida por

espectrofotometria a 590 nm e os resultados foram calculados utilizando o controle

positivo (PBS) como padrão de viabilidade.

3.2.2.5 TESTE DE CITOTOXICIDADE EM LINHAGENS TUMORAIS

A viabilidade das células tumorais A549, 786-0, HeLa e HT29 foi determinada

pelo teste de redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

(MTT) (MOSMANN, 1983). O teste de MTT avalia a integridade da membrana

mitocondrial das células testadas baseada na redução enzimática do corante até o

produto chamado formazan, pela ação das desidrogenases mitocondriais em células

viáveis. Após os períodos de tratamento de 24, 48 e 72 horas com as diferentes

concentrações da lectina, as células foram incubadas em meio de cultura sem soro

fetal bovino contendo 1 mg/mL de MTT por 4 horas. Posteriormente, o meio foi

aspirado, adicionando 100 µL de etanol P.A. para a dissolução dos cristais de

formazan formados e precipitados, mantendo as células sob agitação moderada por

10 minutos e a placa teste protegida da incidência da luz. A quantificação em

absorbância foi realizada em leitor de microplacas, em comprimento de onda de 570

51

nm. O ensaio foi realizado em triplicata. A análise da viabilidade celular foi realizada

em comparação com o controle contendo células não tratadas com a lectina isolada.

3.2.2.6 TESTE DE AGLUTINAÇÃO DE PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA

Formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis

(MHOM/BR/2011/AF) e Leishmania amazonenses (IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas

in vitro em meio de cultura ágar-sangue "Novy-MacNeal & Nicolle" (NNN) e meio

Schneider (Sigma-Aldrich™, St. Louis, USA), suplementado com 20% de soro fetal

bovino (SFB), streptomicina (100 µg/ml) e penicilina (100 U.I/mL) (Cultilab, São Paulo,

Brasil), a uma temperatura de 25±1 ºC (AMORIM et al., 2013).

Para o ensaio de aglutinação, o método adaptado de Saraiva et al. (1986) foi

utilizado. Formas promastigotas em fase logarítmica de crescimento foram lavadas

três vezes em tampão fosfato salino gelado (PBS: NaCl 145 mM, Na2HPO4 9 mM

NaH2PO4 1 mM, pH 7,4), e quantificadas em câmara de Neubauer. Em microplacas

de 96 poços foi adicionada a lectina (100 µg/ml) solubilizada em PBS, e realizado o

procedimento de diluição seriada também em PBS. Em seguida, foram adicionadas

as formas promastigotas dos parasitos (3 x 107 células/poço), incubadas por 10

minutos a 25°C e analisadas em microscópio óptico comum e fotografados. As

amostras foram analisadas comparando os seguintes controles: formas promastigotas

em PBS (ausência da lectina), formas promastigotas na presença da lectina mais

solução de D-glicose (100mM) e formas promastigotas na presença da ConA.

3.2.2.7 TESTE DE ATIVIDADE FUNGISTÁTICA CONTRA CANDIDA

O teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da lectina

contra Candida spp foi realizado de acordo com Fischer e Cook (2001). Inicialmente

as culturas de leveduras (Candida spp.) foram reativadas através de 2 repiques

sucessivos em Agar Sabouraud Dextrose (SDA - Difco) por um período de 48 horas.

Para o inóculo, foi preparada uma suspensão das células em solução salina estéril

0,9%, agitando-a em vórtex, e ajustada de acordo com 0,5 da escala de McFarland,

que equivale à concentração de 1 x106 UFC/mL. Subsequentemente, foram realizadas

duas diluições: 1:50 em solução salina estéril e uma nova diluição de 1:20 em meio

de cultura.

52

O meio de cultura utilizado, Caldo Mueller Hinton (MHC - Difco), foi preparado

de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, foram adicionados 100 μL de

MHC em placas de microtitulação nos poços das colunas de 2 à 11 e 200 μL na coluna

12. Em seguida, foram adicionados 100 μL da fração protéica solubilizada em meio,

em uma concentração inicial de 10 mg/mL, nos poços das colunas 1 e 2. Foi realizada

uma diluição seriada partindo da coluna 2 até a coluna 10, desprezando os 100 μL

restantes. Após a montagem das placas, foram adicionados 100 μL da suspensão de

células de leveduras em cada poço, exceto na coluna 12 (Controle Negativo). As

placas foram incubadas sob 37 °C por 48 horas. As leituras foram realizadas após o

período de incubação, observando-se o crescimento nas respectivas diluições através

de comparação visual. A CIM foi considerada como a menor concentração da capaz

de inibir 100% do crescimento de cada espécies, tomando como referência o controle

negativo à inibição, onde o PBS foi utilizado.

3.2.2.8 TESTE DE ATIVIDADE BACTERIOSTÁTICA E BACTERICIDA

A CIM (concentração inibitória mínima) foi determinada a partir dos métodos

modificados de Cavalcante et al (2011), em cabine de segurança biológica utilizando-

se microplaca estéreis com 96 poços. O meio de cultura empregado foi o caldo

Mueller-Hinton (Mueller-Hinton Broth, Hi-media), suplementado com glicose, para que

ficasse numa concentração de 1% p/v.

Inicialmente as culturas de bactérias (ATCC) foram reativadas através repiques

em Agar Nutriente (Himedia) por um período de 24 horas. Para o inóculo bacteriano,

foi preparada uma suspensão das células em solução salina estéril 0,9%, e ajustada

de acordo com a escala de McFarland 0,5, que equivale à concentração de 1 x 10⁸

UFC/mL.

Após o preparo do inóculo, as duas cepas bacterianas foram testadas quanto

a sua viabilidade após incubação por até 1hora a 37 ºC. Após estes períodos, repiques

foram feitos em placas de petri contendo agar nutriente e a viabilidade das cepas

foram analisadas em 3 tempos, 30, 45 e 60 minutos. Um controle, sem incubação

prévia foi feito, e serviu como referência para a análise da viabilidade.

Para o teste da atividade bacteriostática, foram adicionados 50 μL de solução

salina mais 50 μL da lectina no primeiro poço da coluna 1 da placa de microtitulação.

Nos poços das colunas de 2 à 11 foram feitos diluições seriadas e a coluna 12 foi

53

utilizado para descarte. Em seguida, foram adicionados 100 μL do inoculo bacteriano.

As bactérias e a lectina foram incubadas juntas a 37 ºC por 1 hora. Após este tempo

foram adicionados 50 μL de MHC concentrado 3X. As placas foram incubadas a 37

°C por 24 horas. As análises de turvação foram realizadas em espectrofotômetro após

o período de incubação, na qual a absorbância a 570 nm dos testes foi comparada

com as dos controles negativos à inibição, onde, ao invés das lectinas uma solução

de PBS 150 mM foi utilizada. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram

feitos em triplicata. A CIM foi considerada como a menor concentração capaz de inibir

100% do crescimento de cada cepa, tomando como referência o respectivo controle

negativo.

Para a determinação da concentração bactericida mínima (CBM), aliquotas das

diluições do ensaio para determinação da CIM foram utilizadas em repiques em placas

de petri contendo Agar nutriente. As placas foram incubadas a 37 ºC durante 24horas.

A CBM foi definida como a menor concentração da lectina capaz de inibir 100% do

crescimento das cepas testadas.

3.2.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes e

foram expressos com média ±DP (Desvio Padrão). Quando identificado uma diferença

nos tratamentos pela análise de variância (ANOVA), análises complementares de

comparações múltiplas, como o teste Mann-Whitney ou teste Dunnett, foram

realizados. Foram consideradas diferenças significativas quando o valor de p foi

inferior a 0,05. Os dados estatísticos foram analisados pelo software GraphPad Prism

5.0

4 RESULTADOS

4.1 PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA LECTINA DO TIPO ConA DAS

SEMENTES DE C. maritima.

A extração de biomoléculas das sementes da leguminosa Canavalia maritima foi

realizada em tampão acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0 por 4 horas (tampão de

extração). Testes de atividade hemaglutinante específica, com eritrócitos humanos

54

sem tratamento e tratados enzimaticamente (proteases: papaína e tripsina), realizado

com amostras de extrato bruto (EB), resultante de extrações com várias soluções

tampão, em diferentes pH, indicaram que o tampão de extração utilizado proporcionou

uma melhor solubilidade das proteínas que promovem hemaglutinação em sangue do

tipo A papainizado (tabela 1).

Posteriormente o extrato bruto escolhido foi fracionado pela adição de sulfato de

Amônio em concentrações crescentes. O procedimento resultou na obtenção de três

frações proteicas, F 0-30, F 30-60 e F 60-90, na qual também foram testadas quanto

a sua capacidade de aglutinação de eritrócitos. Dentre as frações, a F 60-90 se

destacou por apresentar maior atividade hemaglutinante específica contra hemácias

humanas do tipo A papainizado (figura 7).

EB

F 0-3

0

F 30-

60

F 60-

90

0

5.0×105

1.0×106

1.5×106

2.0×106

2.5×106

3.0×106

3.5×106

4.0×106

4.5×106

Ati

vid

ad

e e

sp

ecíf

ica (

UH

/mg

)

Figura 7 – Atividade específica das frações proteicas de C. marítima. O extrato bruto (EB) em tampão acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0 foi obtido pela extração sob agitação branda por 4 horas e posteriormente fracionado pela adição de sulfato de Amônio em concentrações crescentes (F 0-30, F 30-60 e F 60-90). A atividade específica é dada pela razão entre as unidades de hemaglutinação (UH) e a quantidade de proteína (mg) em 25 µL da fração.

A fração escolhida foi submetida a uma cromatografia de afinidade em coluna

Sephadex G-50 (Figura 8). A atividade hemaglutinante coincidiu com único pico retido

obtido no perfil cromatográfico (CML). A lectina apresentou atividade específica de

aproximadamente 19621557 UH/mg e foi purificada 20 vezes, conforme mostra a

tabela de purificação (Tabela 1).

55

0 20 40 60 80 1000

1

2

3

Glicina-HCl,0,1 M, pH 3

CMLP1

Frações (3mL/tubo)

DO

280n

m (

UA

)

Figura 8 - Perfil cromatográfico da F 60-90 em coluna Sephadex G50. A coluna foi previamente equilibrada com uma solução de NaCl, 1 M, contendo 5 mM de ambos CaCl2 e MnCl2 e a F 60-90, reconstituída na mesma solução, foi aplicada. As frações (3 mL/tubo) foram eluídas primeiramente com a solução de equilíbrio seguido da solução de Glicina-HCl, 0,1M, pH3, contendo 1M NaCl e 5 mM de CaCl2 e 5 mM de MnCl2 (CML) e monitoradas em espectrofotômetro a 280 nm. A atividade hemaglutinante foi detectada fortemente na presença de 4% de eritrócitos humanos do tipo A tratado com papaína.

Fração Proteínas totais (mg)

UH Atividade específica (UH/mg)

Recuperado %

Purificação (vezes)

EB 583,08 8192 966608 100 1

F 0-30 97,45 1024 35280 16,72 0,04

F 30-60 163,19 4096 317519 27,99 0,3

F 60-90 5,24 16384 4398389 0,9 4,6

CML 1,5 32768 19621557 0,26 20,3

Tabela 1 – Resultados da purificação da lectina da leguminosa Canavalia maritima (CML) em diferentes

etapas. UH: unidades de hemaglutinação.

O isolamento da lectina foi confirmado em eletroforese SDS-PAGE, em presença

de agente redutor DTT, onde pode se observar uma banda majoritária bem como

outros 4 fragmentos de menor intensidade e menor massa molecular, indicando a

natureza tetramérica da proteína (Figura 9).

56

Figura 9 - Eletroforese (SDS-PAGE) da CML, em presença do agente redutor DTT. (1) – Marcador; (2) – Extrato Bruto; (3) – F 60-90; (4) – CML;. As proteínas foram visualizadas com o corante Coomassie Blue.

Em relação ao sequenciamento, 20 resíduos de aminoácidos foram

identificados, sendo estes: DLILQGDATTGTDGNLELTR, destacados na figura 10. O

alinhamento realizado com a ferramenta BLASTp resultou em uma identidade de

100% com a Concanavalina M (ConM) e com a Concanavalina A (ConA) (figura 10).

(1) (2) (3) (4) kDa

180

130

95

72

55

43

34

26

17

10

57

Figura 10 – Alinhamento comparativo do sequenciamento da lectina de Canavalia maritima (CML). Análise do sequenciamento de CML comparando com a sequência da ConM - pdb 2CWM e com a sequência da ConA - pdb CVJB. A procura foi realizada pelo BLASTp, utilizando bases de dados de sequência de proteínas não redundantes e a formatação do alinhamento realizada pela ferramenta Jalview 2.8.2.

Os resultados analíticos da purificação obtidos apontam o isolamento de uma

lectina, onde os resíduos sequenciados foram alinhados e resultou em 100% de

identidade com a ConM

4.2 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ConM

4.2.1 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE SOBRE CÉLULAS DO SANGUE

PERIFÉRICO HUMANO

4.2.1.1 ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE ConM

A toxicidade da lectina purificada ConM foi avaliada contra células do sangue

periférico humano, na concentração de 1 mg/mL. ConM não apresentou citotoxicidade

contra eritrócitos do sangue periférico humano quando avaliadas em atividade

58

hemolítica. Além de não interferir nestas células, a ConM, quando comparada com

perfil do controle negativo, apresentou um resultado ainda menor (Figura 11).

Trito

n-X10

0PBS

ConM

0

50

100

***

Ati

vid

ad

e h

em

olíti

ca

(%

)

Figura 11 - Avaliação do efeito hemolítico de ConM sobre hemácias humanas. Como controle negativo e positivo foram utilizados tampão fosfato salino (PBS) e Triton X-100 1%, respectivamente. ***p<0,001 em relação ao controle positivo.

4.2.1.2 CITOTOXICIDADE DA ConM FRENTE A CÉLULAS

MONONUCLEARES

Para este ensaio, foram utilizadas diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL

a 20 µg/mL) para avaliação da ação contra linfócitos e monócitos do sangue periférico

humano utilizando a técnica de exclusão por azul de Trypan, após 24, 48 e 72 horas.

Os resultados indicam que as concentrações 1, 2,5 e 5 µg/mL não reduziram

significativamente a viabilidade dessas células nos três tempos (figura 12). As

concentrações 7, 10 µg/mL se mostraram tóxicas diminuindo a viabilidade em cerca

de 30% em todos os tempos testados. Já a concentração de 20 µg/mL se mostrou

extremamente tóxica para esta linhagem celular, causando um decréscimo na

viabilidade para 40% no tempo de 24 horas chegando a 28 e 18% nos tempos de 48

e 72 horas respectivamente (figura 12). A IC50 foi estimada, para os tempos 24, 48 e

72 horas, sendo respectivamente 19,21 µg/mL, 10,44 µg/mL e 5,62 µg/mL..

*

**

59

24h

48h

72h

0

50

100

1 g/mL

2,5 g/mL

5 g/mL

7 g/mL

10 g/mL

20 g/mL

PBS

** **

***

**

**

***

**

***

***

Via

bil

idad

e c

elu

lar

(%)

Figura 12 – Efeito da ConM sobre a viabilidade das células mononucleares do sangue periférico humano. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre células mononucleares foi feita pelo ensaio de exclusão por azul de Trypan. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 20 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

4.2.2 EFEITOS DE ConM SOBRE A VIABILIDADE EM LINHAGEM NÃO TUMORAL

A ConM, quando testada sobre a linhagem celular RAEC (células endoteliais

de aorta de coelho) não foi capaz de diminuir significativamente a viabilidade celular

em nenhum dos tempos testados na concentração de 25 µg/mL. Na concentração de

50 µg/mL no tempo de 24 horas não houve redução da viabilidade, já nos tempos de

48 e 72 horas foi evidente a citotoxicidade dessa concentração, diminuindo a

viabilidade para 33% (figura 13).

60

24h

48h

72h

0

50

100PBS

*

***

25 g/mL***

***

*** 50 g/mL

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 13 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular RAEC. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre a linhagem RAEC foi feita pelo ensaio de Alamar Blue. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (25 µg/mL – 50 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

4.2.3 EFEITOS DE ConM SOBRE A VIABILIDADE EM CÉLULAS TUMORAIS

A análise da viabilidade celular das linhagens A549, 786-0, HT29, HeLa, foram

realizadas após a incubação de concentrações crescentes de ConM (1 µg/mL a 10

µg/mL) no tempo de 24 horas, perdurando por 48 e 72 horas. O comportamento das

linhagens utilizadas foi individualmente peculiar, sendo que todas apresentaram

redução no percentual de viabilidade, quando comparado ao controle, em pelo menos

um dos tempos testados (tabela 2).

61

Viabilidade (%)

A549 786-0 HT29 HeLa

ConM (µg/mL) 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h

1 91 ±2,1 91 ±3,4 105 ±4,8 99 ±4,2 93 ±0,4 110 ±3,3 55 ±2,1 114 ±0,5 117 ±4,3 97 ±0,5 97 ±1,8 83 ±7,8

2,5 87 ±3,2 91 ±0,8 87 ±4,2 96 ±0,7 89 ±3,2 105 ±2,9 56 ±2,8 114 ±0,4 106 ±1,9 100 ±6,1 96 ±0,6 75 ±6,6

5 84 ±2,3 85 ±0,84 63 ±2,4 90 ±6,4 82 ±1,4 81 ±1 51 ±2,9 106 ±7,1 101 ±0,8 98 ±6,2 101 ±8,3 75 ±0,9

7 70 ±2,2 42 ±2,5 59 ±5,8 65 ±3,2 38 ±4,7 32 ±1,8 53 ±1,6 113 ±2 99 ±2,3 102 ±2,4 102 ±0,4 58 ±1,9

10 42 ±6,1 21 ±2,4 47 ±2,3 70 ±3,2 37 ±6,5 30 ±2,5 47 ±0,7 105 ±5 98 ±0,8 105 ±6,1 100 ±2,6 48 ±2,1

Tabela 2 – Efeito da ConM sobre a viabilidade das linhagens celular A549, 786-0, HT29 e HeLa. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre as linhagens tumorais foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. O resultado das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. O desvio padrão é apresentado individualmente.

62

Os resultados indicam que para linhagem A549 a lectina é citotóxica em todas

as concentrações em 24 horas e nas quatros maiores concentrações com 48 horas e

72 horas. Destacaram-se as reduções da viabilidade nas concentrações de 7 e 10

µg/mL, sendo que em 48 horas observou-se uma redução para 42 e 21%,

respectivamente. Foram observadas também reduções na viabilidade nas

concentrações de 2,5 e 5 µg/mL, principalmente nos tempos 48 horas e 72 horas,

sendo que neste último tempo as viabilidades caíram para 87 e 63 %, respectivamente

(figura 14 e tabela 2). A IC50 foi estimada para 24 horas, 8,47 µg/mL, para 48 horas,

6,41 µg/mL e para 72 horas, 4,17 µg/mL.

24h

48h

72h

0

50

100 PBS**

***

***

****

***

*

***

***

1 g/mL

2,5 g/mL

5 g/mL

7 g/mL

10 g/mL

***

***

***

*****

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 14 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular A549. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre a linhagem tumoral A549 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

Para a linhagem 786-0 é evidente a citotoxicidade da proteína nas

concentrações mais altas, nos três tempos testados. Foi observada atividades

principalmente nas concentrações 7 e 10 µg/mL, reduzindo a viabilidade para 38% e

37%, respectivamente, no tempo de 48 horas e a 32% e 30% no tempo de 72 horas.

Nota-se também uma discreta redução nas concentrações 1, 2,5 e 5 µg/mL para 93,

89 e 82%, respectivamente no tempo de 48 horas, sendo que em 72 horas a

63

concentração de 5 µg/mL persiste nesta redução sendo viável em aproximadamente

80% (figura 15 e tabela 2). A IC50 foi estimada para 48 horas, 5,67 µg/mL e para 72

horas, 5,24 µg/mL.

24h

48h

72h

0

50

100 PBS

*

***

***

***

***

*

******

1 g/mL

2,5 g/mL

5 g/mL

7 g/mL

10 g/mL

***

*** ***

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 15 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular 786-0. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre a linhagem tumoral 786-0 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

A linhagem HT29 mostrou-se suscetível em todas as concentrações testadas

no tempo de 24 horas, reduzindo a viabilidade a uma média de 52 % para todas as

concentrações. A concentração de 10 µg/mL conseguiu diminuir a viabilidade para

47%. Nos outros tempos não foi possível observar uma citotoxicidade considerável

para esta linhagem celular (figura 16 e tabela 2). A IC50 foi estimada para o tempo de

24 horas resultando em 10 µg/mL.

64

24h

48h

72h

0

50

100 PBS

****** *

*** ***

***

1 g/mL

2,5 g/mL

5 g/mL

7 g/mL

10 g/mL

***

*

******

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 16 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HT29. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre a linhagem tumoral HT29 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

Já para a linhagem HeLa, nos tempos de 24 e 48 horas não foi observada

citotoxicidade considerável em resposta aos aumentos na concentração de ConM.

Contudo, houve uma alteração na viabilidade das células no tempo de 72 horas, onde

as concentrações 7 e 10 µg/mL reduziram para 58 e 48%, respectivamente e as

concentrações 1, 2,5 e 5 µg/mL diminuíram a viabilidade para 83, 75 e 75%,

respectivamente (figura 17 e tabela 2). A IC50 foi estimada para o tempo de 72 horas

resultando em 6,47 µg/mL

65

24h

48h

72h

0

50

100 PBS**

***

1 g/mL

2,5 g/mL

5 g/mL

7 g/mL

10 g/mL

***

***

***

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 17 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HeLa. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre a linhagem tumoral HeLa foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.

Desta forma, a lectina ConM apresentou atividade citotóxica contra células

tumorais, alterando, de uma forma geral, suas viabilidades em função dos tempos

testados e das concentrações utilizadas. Não obstante, ConM não apresentou

atividade tóxica contra células sanguíneas ou contra células não transformadas.

4.2.4 A AGLUTINAÇÃO DE PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA PELA ConM

ConM foi testada quanto ao seu potencial aglutinante contra duas espécies de

Leishmania, a saber: L. amazonensis (MHOM/BR/2011/AF) e L. (Viannia) braziliensis

(IFLA/BR/67/PH8). A capacidade aglutinante da lectina em promastigotas vivas foi

avaliada na fase logarítmica de crescimento, utilizando diferentes concentrações de

proteína (0,09 µg/mL a 100 µg/mL). A atividade da lectina se mostrou evidente para

as duas espécies de Leishmania aglutinando-as na concentração mínima de 6,25

µg/mL (figuras 18 e 19 - A).

O teste de reversibilidade da aglutinação mediada pelo carboidrato específico

da ConM (D-Glicose, 100 mM) foi realizado contra as duas espécies de Leishmania.

66

Quando a lectina, competitivamente, foi bloqueada pelo carboidrato observou-se uma

brusca reversibilidade da aglutinação (figuras 18 e 19 - B).

A integridade do experimento foi avaliado utilizando a ConA (50 µg/mL) como

controle positivo, na qual, conforme o esperado, aglutinou fortemente as células das

duas cepas do parasito (figuras 18 e 19 - C). O controle negativo foi estabelecido com

PBS e não apresentou aglutinação das células (figuras 18 e 19 - D).

Figura 18 – Fotomicrografias em microscópio óptico da aglutinação das promastigotas de L. amazonensis tratadas com ConM. A - L. amazonensis + ConM (6,25 µg/mL), B – L. amazonensis + ConM + D-Glicose (100 mM), C – L. amazonensis + ConA, D – L amazonensis + PBS (150 mM). Ampliação de 400 vezes.

A

D C

B

67

Figura 19 – Fotomicrografias em microscópio óptico da aglutinação das promastigotas de L. (Viannia) braziliensis tratadas com ConM. A - L. brasiliensis + ConM (6,25 µg/mL), B – L. brasiliensis + ConM + D-Glicose (100 mM), C – L. brasiliensis + ConA, D – L brasiliensis + PBS (150 mM). Ampliação de 400 vezes.

4.2.5 A ATIVIDADE FUNGISTÁTICA DA ConM CONTRA CANDIDA

O ensaio para determinação da concentração inibitória mínima contra Candida

spp foi realizado em placas de 96 poços, utilizando a ConM em sua concentração

original (500 µg/mL) e diluições seriadas, abrangendo várias faixas (500 µg/mL – 0,5

µg/mL). Foi utilizado como controle negativo o PBS (150 mM), substituindo em volume

a ConM e um controle foi realizado sem a presença das leveduras.

ConM não inibiu o crescimento das espécies testadas: C. albicans, C.

dubliniensis, C.tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C.rugosae e C. krusei, em

nenhuma das concentrações analisadas sob perspectiva visual.

A

D C

B

68

4.2.6 AS ATIVIDADES BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE ConM

Previamente a realização dos ensaios bacteriostáticos e bactericidas, os

inóculos foram testados quando a sua viabilidade após 30, 45 e 60 minutos de

incubação a 37 ºC somente com a solução salina (NaCl 0,9%). Após este tempo,

repiques foram feitos em placa de petri com ágar nutriente e incubado por 24h a 37

ºC. Tanto a cepa E. coli quanto S. aureus cresceram sem diferenças significativas

quanto comparado ao controle, onde o inóculo foi repicado sem a incubação prévia.

O teste indicou que a incubação por até 1 hora sem meio de cultura não altera a

viabilidade das cepas bacterianas utilizadas. A mensuração do crescimento das cepas

de E. coli e S. aureus foi realizado com concentrações variadas da ConM (0,39 µg/mL

a 400 µg/mL), utilizando como parâmetro de comparação o controle PBS 150 mM.

Para E. coli, não foi observado inibição do crescimento, não obstante, todas as

concentrações foram capazes de causar um aumento deste crescimento em

praticamente igual teor percentual (figura 20).

Ctrl -

Ctrl +

0,39

0,78

1,56

3,12

6,25

12,5 25 50 10

020

040

0

0

50

100

*** ******

****** *** *** ************

ConM (g/mL)

Cre

scim

en

to (

%)

Figura 20 – Efeito da ConM sob o crescimento da cepa bacteriana E. coli. A avaliação bacteriostática de ConM sobre a cepa E. coli foi feita pelo ensaio de determinação da concentração inibitória mínima (MIC). A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de ConM (0,39 µg/mL a 400 µg/mL) por 24 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle negativo. O crescimento das células tratadas com ConM foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle (teste t - pareado).

69

Já em relação a cepa S aureus, observou-se uma inibição dependente de

concentração, onde os valores medianos causaram uma maior atividade de inibição.

A concentração 25 µg/mL destacou-se frente as outras por apresentar uma inibição

do crescimento de 71 % quando comparado ao controle. As concentrações mais altas,

chegando a 400 µg/mL apresentaram uma redução menor do crescimento,

alcançando nesta concentração o patamar de 65% quando comparado ao controle

(figura 21).

Ctrl -

Ctrl +

0,39

0,78

1,56

3,12

6,25

12,5 25 50 10

020

040

0

0

50

100

***

***

******

***

*** ******

***

***

***

ConM (g/mL)

Cre

scim

en

to (

%)

Figura 21 – Efeito da ConM sob o crescimento da cepa bacteriana S. aureus. A avaliação bacteriostática de ConM sobre a cepa S. aureus foi feita pelo ensaio de determinação da concentração inibitória mínima (MIC). A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de ConM (400 µg/mL – 0,39 µg/mL) por 24 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo. O crescimento das células tratadas com ConM foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle (teste t - pareado).

Quanto a atividade bactericida, o teste realizado a partir de repiques de todas

as concentrações testadas no ensaio bacteriostático em placa de petri contendo ágar

nutriente, não indicou atividade bactericida da ConM contra as duas cepas testadas.

Todos os repiques testados continuaram viáveis e cresceram sem diferenças

significativas quando comparados ao controle sem a presença da ConM.

70

5 DISCUSSÃO

A purificação e a caracterização de macromoléculas bioativas advindas de

matéria prima de cunho natural prende a atenção de pesquisadores de todo o mundo

há vários anos e os produtos resultantes são direcionados para as mais diferentes

áreas de atuação. A busca por análogos a medicamentos que proporcionem o mínimo

de reações adversas aos pacientes é o principal objetivo destas pesquisas. Sendo

assim nosso trabalho buscou atribuir aplicabilidades a uma lectina vegetal, na qual

sua estrutura é bastante conhecida mas suas atribuições biológicas ainda são pouco

exploradas. A Concanavalina M foi o nosso alvo de pesquisa, onde foi evidenciada a

potencialidade citotóxica em células humanas transformadas e a capacidade

aglutinante e citostática contra microrganismos dessa proteína.

A lectina das sementes de C. maritima (CML) foi separada através de dois

procedimentos, pelo fracionamento com sulfato de amônio, onde a fração 60-90

apresentou uma extraordinária atividade hemaglutinante especifica contra eritrócitos

do tipo A tratados com papaína, e pela cromatografia de afinidade em coluna

Sephadex G-50. Após a eluição do material não ligado (P1) a lectina foi recuperada

pela eluição com Glicina-HCl, 0,1M, pH3, contendo 1 M NaCl, 5 mM de CaCl2 e 5 mM

de MnCl2, fato este comprovado pelo aumento das atividades hemaglutinantes

específicas observadas após cada etapa desta purificação. A CML se apresentou em

uma banda majoritária quando analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida

(SDS-PAGE) na presença do agente redutor DTT. Esta banda observada representa

a subunidade α desta proteína, canônicas em lectinas de leguminosas. Fragmentos

da subunidade α também puderam ser observados, representados por bandeamentos

de menor intensidade e menor massa molecular, como resultado do tratamento

sofrido. Perez et al. (1991) e Ramos et al. (1996b) constataram a presença de

isoformas menores quando a mesma lectina foi submetida a PAGE. A existência de

subunidades é bem estabelecida em lectinas de Diocleinae, na qual é constituída

principalmente de uma subunidade α e outros dois fragmentos (β e γ) originados a

partir do processamento pós-traducional de um precursor durante o desenvolvimento

da semente, na qual contribui para a ocorrência de diferentes isolectinas (CAVADA et

al., 1996). Este padrão eletroforético está de acordo com o padrão apresentado para

71

própria ConM (PEREZ et al., 1991) e para outras lectinas advindas da subtribo

Diocleinae, tais como a da Canavalia ensiformes - ConA (SUMNER; HOWELL, 1936),

Diocleia grandiflora - DGL (MOREIRA et al., 1983), Canavalia brasiliensis - ConBR

(MOREIRA; CAVADA, 1984) e Diocleia guianensis (VASCONCELOS et al., 1991). O

sequenciamento realizado a partir da banda majoritária resultante da eletroforese

acusou 20 resíduos de aminoácidos, os quais foram submetidos a uma busca por

similaridades em bancos de dados de sequências biológicas e posteriormente

alinhados com as sequências primárias de duas outras lectinas da subtribo Diocleinae,

a própria concanavalina M (ConM) e a concanavalina A (ConA). Como resultado,

100% de identidade foi observado com a primeira, indicando ser a mesma proteína e

98% de identidade com a segunda. Gadelha e colaboradores (2004) analisaram a

estrutura nativa cristalizada da ConM e o trabalho mostra alinhamentos múltiplos entre

a ConM e outros representantes da subtribo Diocleinae, confirmando a identidade e a

homologia entre estas espécies de leguminosas. Sendo assim a lectina purificada das

sementes de C. maritima, outrora chamada CML, passou a ser chamada ConM.

A análise citotóxica é um dos procedimentos primários que se faz crucial para

estabelecer a ação de uma substância em detrimento a diferentes tecidos, se esta

substância tem como propósito ser candidata a estudos e aplicações como fármacos.

Testes basais de citotoxicidade auxiliam na compreensão dos mecanismos de ação

envolvidos sobre as células de um organismo. Com o intuito de investigar a atividade

citotóxica de ConM em células do sangue periférico humano os ensaios de atividade

hemolítica e de viabilidade em culturas de células mononucleares foram realizados.

Para o primeiro, suspensões de eritrócitos a 1% foram utilizadas como modelos

iniciais. Por meio deste teste foi possível constatar que ConM não apresenta

toxicidade quando incubada com até 1000 µg/mL, não obstante, foi possível notar uma

discreta diferença entre o controle negativo (PBS) e o teste, no qual a lectina não

estava presente. Em um trabalho clássico e pioneiro, Hossaini (1968) analisou

extratos salinos de sementes de 221 espécies diferentes de plantas quanto a atividade

hemaglutinante e hemolítica. Destas, apenas 20 espécies apresentaram atividade

hemolítica, ressaltando o baixo nível de toxicidade destes produtos e exaltando o

potencial das lectinas como possíveis candidatas a biofármacos. O ensaio para

avaliação da atividade citotóxica da ConM contra células mononucleares do sangue

periférico foi realizado pela exclusão com o azul de Trypan. A influência da lectina

72

sobre a viabilidade de linfócitos e monócitos foi feito por contagem em câmara de

Neubauer onde foi possível diferenciar as células integras das não integras. ConM

não foi significativamente tóxicas nas concentrações basais de 1, 2,5 e 5 µg/mL, mas

apresentou toxicidade a partir da concentração 7 µg/mL. Não foi o objetivo deste

trabalho avaliar a atividade mitogênica sobre células mononucleares, mas não se

observou nenhuma alteração significativa na proliferação destas células com as

concentrações testadas, quando comparados ao controle sem a lectina. Lectinas de

leguminosas são pouco conhecidas quanto a sua atividade citotóxica para células

sanguíneas. A ConA, por exemplo, possui atividade mitogênica para algumas células

em cultura ou pode ser tóxica para outras (CHANG et al., 2007). Foi relatado que esta

mesma lectina, dependendo da concentração utilizada, tem o poder de induzir a

ativação de linfócitos onde a sensibilidade destas células foi atribuída ao seu conteúdo

de glicose e manose na membrana. A ConA, em doses de 1 a 10 µg/mL, apresenta

atividade mitogênica, mas se torna tóxica em doses acima de 50 µg/mL (CHANG et

al., 2007).

Outra proposta deste trabalho foi avaliar a atividade de ConM, que

estruturalmente é bem relacionada com a ConA e com outras lectinas da mesma

subtribo, utilizando um modelo de células tumorais e não tumorais in vitro. Ensaios

para avaliação da viabilidade celular, redução do Azul de Alamar e MTT, foram

realizados na perspectiva da lectina se comportar como um inibidor da viabilidade em

células tumorais e em contrapartida não ter ação contra células não tumorais. Os

testes mostraram que a ConM para linhagem não tumoral RAEC não é tóxica quando

testada com o dobro da maior concentração que foi tóxica para células tumorais

utilizadas neste trabalho, causando uma discreta redução em sua viabilidade. Sendo

assim, para as linhagens tumorais A549, 786-0, HT29 e HeLa a lectina é

significativamente capaz de reduzir a viabilidade em pelo menos um dos três tempos

testados e em pelo menos três das cinco concentrações avaliadas. Destacaram–se

as concentrações 5, 7 e 10 µg/mL da ConM como concentrações que causam maiores

danos ao metabolismo destas células transformadas diminuindo a viabilidade em

média 79 %. Os resultados sugerem que a ConM possui um potencial antitumoral para

as linhagens A549, 786-0, HT29 e HeLa em detrimento ao resultado do teste realizado

com a linhagem não tumoral RAEC e aos resultados dos testes de toxicidade contra

73

células do sangue, não sendo avaliados neste tabalho os mecanismos de ação

responsáveis pelas diminuições nas viabilidades.

Agentes anticâncer têm sido extraídos das mais diversas fontes naturais,

incluindo plantas, organismos marinhos e microrganismos (CRAGG; NEWMAN,

2005). As propriedades anticâncer das lectinas tem sido demostradas in vitro e in vivo

sugerindo um importante potencial destas biomoléculas como agentes terapêuticos.

Estas proteínas já são conhecidas por interferirem em diversas células, ligando-se em

suas membranas ou receptores, inibindo suas viabilidades ou proporcionando

estimulações, intervindo em seu metabolismo e crescimento (DE MEJÍA;

PRISECARU, 2005; LIU; BIAN; BAO, 2010). É possível constatar nos bastidores de

diversos trabalhos, situações que inserem as lectinas em um papel de destaque no

protagonismo de uma série de modificações sofridas por estas células transformadas.

Atualmente a literatura nos apresenta os efeitos destas proteínas na indução de

citotoxicidade, apoptose e necrose contra células tumorais (FAHEINA-MARTINS et

al., 2012; JIANG et al., 2015; LIU; BIAN; BAO, 2010; MONTE et al., 2014; OLIVEIRA

et al., 2014; SEIFERT et al., 2008; ZAROGOULIDIS et al., 2015).

As lectinas de leguminosas podem ser consideradas uma classe de

biomoléculas com potencial atividade antitumoral. Um dos primeiros trabalhos que

relata a atividade antitumoral de C. maritima foi divulgado em 2013. A atividade

citotóxica do extrato bruto alcoólico das sementes do feijão de praia foi testada pelo

ensaio de MTT e impactos diferentes foram observado nas linhagens celulares

cancerígenas MCF-7 e HT-29, onde o extrato aquoso cozido destas sementes

apresentou atividade anticâncer quando comparado com o extrato cru (NIVEDITHA;

VENKATRAMANA; SRIDHAR, 2013). Wong; Ng (2005) e Faheina-Martins et al.

(2012) constataram efeitos antiproliferativos de lectinas isoladas de Lotus

corniculatus, Canavalia gladiata, Canavalia ensiformis e Canavalia brasiliensis em

linhagens tumorais tais como L1210 (Células leucêmicas) inibindo significativamente

e seletivamente a proliferação sendo a apoptose como o principal mecanismo de

morte. Oliveira et al. (2014) mostraram que a ConBr (lectina de Canavalia brasiliensis)

inibe a proliferação celular em linhagens B16F10 (melanoma murino) e destacou em

seu trabalho que as lectinas de leguminosas possuem uma estrutura oligomérica que

aparentemente é fundamental ao aumento da afinidade em suas interações com

carboidratos complexos nas membranas de células tumorais. O efeito citotóxico de

74

uma lectina de soja (SBL) foi constatado, também utilizando o ensaio de MTT, em

diferentes células tumorais in vitro. A proteína foi confrontada contra HeLa (câncer

cervical), Hep2 (câncer oral), HepG2 (câncer de fígado), MDA MB 231 (câncer de

mama) e U373 MG (glioblastoma) (KUMAR et al., 2014). Silva et al. (2014) mostraram

que uma lectina purificada apartir das sementes de Bauhinia ungulata foi capaz de

reduzir a viabilidade em adenocarcinoma de colo humano (HT-29). A lectina de

Polygonatum cyrtonema, uma leguminosa, possui um efeito antiproliferativo e foi

descrito que ela é capaz de induzir apoptose em linhagem HeLa, MCF7 (câncer de

mama) e A375 (melanoma) (ELIGAR et al., 2012).

As lectinas vegetais se mostram eficientes tanto como interferentes no

desenvolvimento de tumores quanto apresentaram propriedades mitogênicas para

linfócitos ou esplenócitos (CHAN et al., 2012). A ConA (lectina de Canavalia

ensiformes), por exemplo, reconhecida por ser mitogênica, demostrou ter um potente

efeito anti-hepatoma (LEI; CHANG, 2009). A ConA pode ser considerada,

terapeuticamente, como um agente anti-hepatoma pela sua ação autofágica e

imunomodulatória. A lectina ainda induz apoptose em linhagens humanas A375

(CHANG et al., 2007; ELIGAR et al., 2012). Faheina-Martins et al. (2012) mostrou que

ConBr e ConA são tóxicas em linhagens leucêmicas MOLT-4 e HL-60 demostrando

uma alta seletividade para estas células tumorais. Madariaga et al. (2014) relatam uma

importante aplicabilidade das lectinas vegetais como biomarcadores de células

tumorais. Em seu trabalho o mesmo apresenta lectinas com a capacidade de

reconhecer glicopeptídeos associados ao tumor. Tentar burlar qualquer tipo de morte

celular é uma característica exclusiva de células transformadas e neste aspecto a

indução de morte celular certamente será a principal estratégia no desenvolvimento

de qualquer potente droga para o tratamento do câncer (KUMAR et al., 2014) e as

lectinas certamente assumirão seu papel na vanguarda dos produtos naturais com

este propósito.

Tendo em vista que as plantas se utilizam de uma gama de compostos bioativos

que são capazes de protegê-las contra predadores e impedir infecções, testes

realizados com a ConM avaliou o grau de atividade frente a microrganismos

patogênicos, como protozoários, fungos e bactérias. Sendo assim, foi verificada a

capacidade que a ConM possui em aglutinar espécimes de duas espécies de

Leishmania e interferir no crescimento de 7 espécies de Candida e duas espécies

75

bacterianas. Embora a concanavalina A tenha sido muito utilizada como uma sonda

para estes organismos, muitas outras lectinas têm sido utilizadas para estudar as

moléculas da superfície celular, e identificação e diferenciação dos parasitos.

Em algumas instâncias, a patogenicidade de protozoários parece ser

correlacionada com suas propriedades de superfície, como revelado pelas interações

com lectinas. Assim, diversas investigações consideram a comparação de açúcares

de superfície de parasitas muito importante para o conhecimento das diferenças nas

características da virulência (IORDACHE et al., 2015). ConM na concentração mínima

de 6,25 µg/ml foi capaz de aglutinar as formas promastigotas, em fase logarítimica de

crescimento, de duas espécies testadas, L. amazonensis e L. brasiliensis. Estas

formas de leishmania são características por apresentarem em suas membranas

glicolipídeos (LPG) e estas macromoléculas estão inteiramente relacionados na

interação e desenvolvimento dos parasitos com o intestino do inseto vetor (SOARES-

COSTA et al., 2002) bem como na internalização e sobrevivência do parasito dentro

dos macrófagos no hospedeiro mamífero (TURCO; DESCOTEAUX, 1992; SACKS et

al., 1994; KAMHAWI, 2006). Os ensaios realizados com a ConM sugerem que as

promastigotas, na fase de crescimento logarítimico, apresentam estruturas ricas em

D-glicose, haja vista a reversão da aglutinação quando 100 mM de D-glicose foi

adicionado no meio celular. A atividade hemaglutinante da ConM é inibida por Glicose

e manose, mas é também inibida fortemente por trealose e maltose (DELATORRE et

al., 2006) tornando promissora a avaliação dos pardões de carboidratos de superfície

em leishimania por testes de reversibilidade da aglutinação com estes outros

carboidratos. O bloqueio destes sítios de ligação pode reduzir a interação que

naturalmente acontece com o vetor ou com o hospedeiro mamífero além de indicar a

potencialidade desta lectina como uma ferramenta molecular para o estudo de

carboidratos de superfície abordando especificidades quanto a virulência das fases

parasitárias (ANDRADE; SARAIVA, 1999; SACKS et al., 1985).

Farias et al. (2012) explorou a capacidade aglutinante de Lectinas de plantas,

ConA, RCA I (aglutinina de Ricinus communis) e SBA (aglutinina de soja) em

diferentes fases de promastigotas de L. (V.) brasiliensis cutânea e mucocutânea. O

mesmo constatou que as lectinas, a primeira com especificidade para manose, a

segunda para galactose e a terceira para N-acetil-galactosamina, aglutinavam as

promastigotas em diferentes fases de crescimento estacionário, mostrando as

76

diferenças na expressão dos carboidratos nas suas diferentes fases de crescimento.

Barbosa et al. (2012) avaliou o grau de aglutinação de lectinas de plantas com

especificidade para D-glicose/D-manose contra L. amazonensis constatando uma

maior intensidade durante a fase logarítmica de crescimento. Andrade e Saraiva

(1999) testaram outras 27 lectinas quanto a sua atividade aglutinante quando estas

eram incubadas com resíduos de carboidratos de 19 isolados de Leishmania incluindo

a L amazonensis em fase estacionária. Os autores alegam que esta espécie de

leishmania apresenta unidades repetidas de glicose no LPG e em outros fosfoglicanos

de membrana. A análise das diferenças observadas na expressão dos carboidratos

em cepas de Leishmania podem relacionar diferentes resultados a diferentes espécies

deste protozoário. Sacks et al. (1995) e McConville et al. (1992) apresentaram a

purificação de Leishmania utilizando lectina de amendoim bem como a Concanavalina

A por seleção negativa. Destaca-se também a aglutinação de formas promastigotas

pela lectina de lentilha. As reações específicas e reversíveis entre lectinas e

oligossacarídeos pode ser utilizada como base para análise de glicoproteínas e

glicolipídios da membrana do protozoa parasita (ROSSELL et al., 1990). Pinto-da-

Silva et al. (2002) mostrou que a lectina de Bauhinia purpurea facilitou a purificação

de promastigotas metacíclicas em cultura na fase estacionária por seleção negativa,

indicando mais uma aplicação na especificidade de reconhecimento de carboidratos

de lectinas. O mesmo testou e constatou a capacidade aglutinante de 12 diferentes

lectinas de plantas contra diferentes fases de Leishmania spp.

Quanto a ação da ConM contra Candida spp, nenhuma das concentrações

testadas foram capazes de interferir no crescimento destas leveduras. Lectinas de

leguminosas sem ação antifúngica, que se ligam a glicose e manose tem sido

reportado (FREIRE et al., 2002; TEIXEIRA, 2012). Ang et al. (2014) relatam que a

atividade antifúngica é rara entre as a lectinas e que diversos testes realizados com

espécies de leguminosas e outras famílias falharam na inibição do crescimento de

leveduras. Lectinas que se ligam a quitina demonstram um significante efeito

antifúngico, entretanto, a presença ou ausência deste fator é dependente da

combinação do fungo com a lectina (KLAFKE et al., 2013; SILVA et al., 2014). O

mecanismo de atividade antifúngica pelas lectinas ainda não está claro, mas é

possível relacionar esta atividade com o reconhecimento dos carboidratos da parede

celular e com outras estruturas dos fungos (KLAFKE et al., 2013). Estudos sugerem

77

que as lectinas podem formar uma barreira na superfície da parede celular sem

modificar sua estrutura ou sua permeabilidade. Algumas lectinas ainda podem

atravessar a parede celular e agir diretamente na membrana plasmática (KLAFKE et

al., 2013). Outros estudos apontam que a interferência no crescimento de alguns

fungos por lectinas pode ser devido a inibição da germinação dos esporos ou do

crescimento dos micélios (ANG et al., 2014; GOMES, 2012).

Ainda no contexto dos microrganismos, duas espécies bacterianas foram

testadas quanto a atividade bactericida e bacteriostática da ConM. O cultivo de E. coli,

quando incubada por 24 horas com a proteína, não apresentou inibição do seu

crescimento. Para S. aureus foi possível observar uma inibição significativa no

crescimento em todas as concentrações da ConM, quando comparado ao controle,

destacando-se a concentração de 25 µg/mL, onde a lectina diminuiu o crescimento da

colônia chegando ao patamar de 29%. Em relação a viabilidade das colônias após a

incubação com a ConM em meio nutritivo, ficou evidente que a lectina não possui uma

capacidade bactericida, tendo em vista que repiques das duas espécies em ágar

nutriente, resultaram em colônias vigorosas e semelhantes ao controle onde a lectina

não foi incubada com as bactérias. Já foi relatado a atividade contra bactérias da

ConM e de outras lectinas do gênero Canavalia. Cavalcante et al. (2011) constataram

a ação inibitória e antibiofilme destas proteínas em duas espécies bacterianas,

Streptococcus mutans e Streptococcus oralis, onde a ConM foi capaz de inibir o

crescimento de S. Mutans e, diferentemente, estimular o crescimento de S. oralis.

Estes mesmos autores, em trabalhos posteriores, relataram que a ConM altera a

expressão de genes relacionado à virulência e a formação de biofilmes em S. mutans.

No contrário, ConA não alterou a expressão destes genes estudados. Pelo fato das

duas lectinas possuírem um alto grau de similaridade em suas sequências de

aminoácidos, a diferença nas ações de ConM e ConA pode ser explicada pela

pequena diferença estrutural no domínio de reconhecimento de carboidratos (DRC)

das lectinas (CAVALCANTE et al., 2011; THAYS et al., 2013).

Algumas lectinas apresentam diferentes espectros de atividade antimicrobiana,

interferindo em bactérias Gram-positivas e não tendo atividade alguma contra

bactérias gram-negativas. Presume-se que este evento tenha relação com a topologia

do envelope das células Gram-negativas onde a membrana externa formada por LPS

proteja o acesso das lectinas ao peptídeoglicano da membrana interna (MIKI;

78

HOLSTS; HARDT, 2012). Dentro do grupo de lectinas de plantas que possuem

atividade bacteriana existem aquelas com capacidade inibitória ou estimulante do

crescimento. Iordache et al. (2015) relataram que a lectina isolada das sementes de

Eugenia uniflora apresenta uma extraordinária atividade antibacteriana contra

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp e com menos

intensidade E. coli, Bacillus subtilis e Streptococcus sp. Interações entre lectinas de

plantas com a parede celular das bactérias podem proporcionar a atividade

antibacteriana em células Gram-negativas e Gram-positivas ou estimular a respiração

celular, induzindo seu crescimento (DE VASCONCELOS et al., 2012; IORDACHE et

al., 2015).

As interações com os ácidos N-acetilmurâmico e N-acetilneuramínico de

algumas lectinas e em especial da ConM são de grande interesse, pois são os mais

comuns carboidratos existentes na parede celular das bactérias, ou de outros

microrganismos patogênicos, e que desempenham um papel chave na comunicação

entre o hospedeiro e o patógeno (RAMOS et al., 1996a, 1996b). Cada glicano exposto

na superfície se torna um possível sitio reativo com lectinas. A capacidade das lectinas

de formar agregados com os glicoconjugados microbianos podem bloquear os sítios

das bactérias pela interação do hospedeiro prevenindo infecções (IORDACHE et al.,

2015).

A avaliação da toxicidade pode ser um dos parâmetros utilizados para

selecionar compostos proteicos ou não proteicos de diversas origens com bioatividade

aplicada em diversos usos. Com relação aos compostos de origem vegetal, as plantas

não cultivadas, e especialmente as suas sementes, são verdadeiros reservatórios de

moléculas que podem ser investigados, identificados e utilizados como bioprodutos.

Nesse contexto, proteínas de plantas, tais como os inibidores de proteinases

cisteínicos e serínicos, inibidores de -amilases, quitinases, glucanases, mais

recentemente as vicilinas, e as lectinas fazem parte do arsenal de defesas das

sementes que podem exibir um grande potencial como biofármaco (XAVIER-FILHO

et al., 1989; MACEDO et al., 1993; SALES et al., 1996; FRANCO et al., 1999;

OLIVEIRA et al., 2002; ARAÚJO et al., 2005). Dentre todas essas proteínas as lectinas

têm se destacado, apresentado importante papel como novas biomoléculas com

excepcional potencial para aplicação no estudo molecular assim como para

79

perspectiva de utilização de seus princípios ativos na formulação de novos fármacos

(GEMEINER et al., 2009).

O investimento em pesquisas básicas no campo das lectinas de plantas está

atrelado, na maioria dos casos, a um retorno satisfatório e são grandes as

expectativas de utilização destas biomoléculas como um aparato biotecnológico.

Atualmente, com os avanços nas pesquisas relacionados com lectinas vegetais, é

possível sugerir potenciais aplicações que vão deste a síntese de produtos que agem

como bioinseticida quanto na utilização dessas proteínas como uma fármaco na

terapia contra o câncer. Algumas vertentes se enquadram de forma adequadas às

proposições de utilização dessas proteínas como um agente de diagnóstico e terapia,

tais como, diagnóstico de patologias, identificação de tumores, distinção de

patógenos, distinção de epítopos celulares com relevância funcional na adesão

celular, entrega de drogas em células alvo dentre outras aplicabilidades, e seguindo

esse raciocínio, a identificação do mecanismo de ação e a elucidação da região da

proteína que desencadeia a atividade biológica pode servir como um precursor para

o desenvolvimento de fármacos que atuem da mesma forma sem os mesmos efeitos

adversos. A utilização de lectinas na área clínica está associado a um amplo espectro

de vantagens que atribui valores às rotinas dos procedimento de diagnósticos. Slifkin

e Doyle (1990) já destacavam algumas das vantagens de se trabalhar com lectinas

de plantas: estabilidade, suas atividades em pequenas concentrações, a viabilidade

comercial e suas habilidades de sondar as diferenças nas estruturas de superfície em

vários isolados. Essas lectinas vegetais demonstram ser um material de fácil obtenção

além de serem bastante estáveis. A purificação a partir de sementes ou até mesmo a

expressão funcional dessas lectinas nos oferece novas perpectinas de utilização que

precisam ser exploradas e seus mistérios desvendados.

6 SÍNTESE DOS RESULTADOS E CONCLUSÃO

A lectina purificada de sementes de Canavalia maritima (CML) analisada por

SDS-PAGE apresentou padrão típico para as lectinas da família das leguminosas e o

sequenciamento por espectrometria de massas do peptídeo com 20 aminoácidos

80

revelou 100% de identidade com a lectina ConM. Visando excluir reações tóxicas

adversas, a citotoxicidade desta proteína foi avaliada para células sanguíneas, e não

apresentou atividade hemolítica e efeito tóxico para células mononucleares nas

concentrações analisadas. ConM também não apresentou atividade tóxica para

linhagens de células epiteliais de aorta de coelho. No entanto, a viabilidade das

linhagens tumorais A549, 786-0, HT-29 e HeLa foi afetada pelo cultivo das células na

presença da ConM no meio. Quando analisado o potencial de ConM para identificação

e estudo de leishmania, a lectina acrescida ao meio de cultivo promoveu a aglutinação

de formas promastigotas de duas espécies de Leishmania. ConM não revelou

atividade fungistática contra Candida spp. Nenhuma atividade bactericida foi

detectada nas concentrações testadas contra E. coli e S. aureus, porém a ConM

apresentou atividade bacteriostática para S. aureus. Baseado nos dados de

sequência, a lectina isolada corresponde a uma isolectina do tipo ConA, e suas

propriedades anti-tumoral, bacteriostático e aglutinante de Leishmania precisam ser

melhor investigados para que seu potencial biotecnológico seja explorado.

81

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