UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE ... · por ter propiciado coisas em minha...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

LUIZ EDUARDO RODRIGUES JULIASSE

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS MMP-9,

MMP-13 E TIMP-1 EM AMELOBLASTOMAS E TUMORES ODONTOGÊNICOS

CERATOCÍSTICOS

Natal/RN

2014

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LUIZ EDUARDO RODRIGUES JULIASSE

Orientadora: Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas

Natal/RN

2014

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Patologia Oral da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como parte dos requisitos para

obtenção do Título de Mestre em

Patologia Oral.

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS MMP-9,

MMP-13 E TIMP-1 EM AMELOBLASTOMAS E TUMORES ODONTOGÊNICOS

CERATOCÍSTICOS

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Catalogação na Fonte. UFRN/Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Prof. Alberto Moreira Campos”.

Juliasse, Luiz Eduardo Rodrigues. Estudo da expressão imuno-histoquímica das proteínas MMP-9, MMP-13 e TIMP-1

em ameloblastomas e tumores odontogênicos ceratocistos / Luiz Eduardo Rodrigues

Juliasse. – Natal, RN, 2014.

85 f. : il.

Orientador: Prof.ª. Dr.ª Roseana de Almeida Freitas.

Dissertação (Mestrado em Patologia) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Ameloblastoma – Dissertação. 2. Tumores Odontogênicos – Dissertação. 3.

Metaloproteinases da Matriz – Dissertação. 4. Inibidores teciduais de

metaloproteinases – Dissertação. I. Freitas, Roseana de Almeida. II. Título.

RN/UF/BSO Black D65

RN/UF/BSO Black D74

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“O dom da fala foi concedido aos homens não para que eles enganassem uns aos outros,

mas sim para que expressassem seus pensamentos uns aos outros”

Santo Agostinho

É com imensa satisfação e emoção que dedico este trabalho àqueles que

são a razão de meu viver:

Aos meus pais, Alba e Wilson, maior graça dada a mim por Deus, vocês

são tudo o que um filho poderia desejar.

À minha noiva Lucélia, minha vida.

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AGRADECIMENTOS

É chegado o grande momento.

Quando se deixa guiar pela vontade do Senhor não há dúvidas de que tudo o que

acontece é o melhor e para o melhor. Então devemos agradecer por tudo.

Foram anos imaginando (e desejando), se um dia eu conseguiria ser mestre. Há quase

dez anos ingressei na Base de Pesquisa em Patologia Oral; e este desejo foi amadurecendo em

meu coração. O tempo passou e mesmo com outras atividades sentia que algo me faltava.

Voltei!

Foi muito difícil a caminhada, mas as dificuldades só fazem o gosto da vitória ser ainda

mais saboroso. Afinal, o fracasso nunca alcançará se a vontade de vencer for suficientemente

forte...

Então eu agradeço!

Agradeço primeiramente a Deus, meu Senhor, meu Tudo! Muito obrigado Pai Santo

por ter propiciado coisas em minha vida que eu nunca imaginei que teria...e tão rápido! Que

eu consiga ter fidelidade para alcançar e realizar todos os Seus preceitos em minha vida!

Aos meus pais, Alba e Wilson, maiores presentes de Deus. Vocês são a fonte que gerou

minha essência. Sou eternamente grato por tudo o que vocês fizeram por mim. Me moldaram.

Vocês são os exemplos que procuro seguir em tudo. Tudo o que eu faço é por vocês e pra vocês.

Eu me orgulho demais por ter vocês em minha vida. Amo vocês incondicionalmente!

À minha noiva Lucélia. Mozi, você foi outro presente dado por Deus pra mim. Você me

completa de um jeito surpreendente. Sinceramente, não sei como faria sem tê-la ao meu lado.

Com certeza faria muita besteira hehehe... Muito obrigado por caminhar ao meu lado! Te amo

demais! Você não tem noção...

À minha orientadora Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas. “Somos todos anjos de

uma asa só; e só podemos voar quando abraçamos uns aos outros”. Pois é professora, a

senhora foi um anjo que Deus colocou em minha vida. Geralmente a escolha dos orientadores

é feita por sorteio, mas no nosso caso não foi, foi uma escolha. Escolha de Deus, já lá desde

muito tempo, na época de iniciação científica... sou muito grato por ter me acolhido e me

ajudado a alçar voo. Nunca esquecerei daquela conversa que tivemos um dia em sua sala,

quando conversávamos sobre meu futuro... naquela conversa pude perceber que a senhora

conseguia olhar para dentro de mim e enxergar o meu ser de uma maneira incrível, que até eu

mesmo não conseguia. Naquela ocasião a senhora foi muito mais que uma orientadora, a

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senhora foi uma mãe. Eu tenho uma admiração enorme pela senhora. Muito obrigado pela

paciência, pelos ensinamentos, pela sua dedicação em educar e, sobretudo, por ser “mãe”.

Aos demais professores e exemplos de dedicação à nobre tarefa de ensinar e formar

pessoas:

À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, Profa.

Dra. Lélia Batista de Souza, exemplo de competência e amor à profissão. Ao Prof. Dr. Leão

Pereira Pinto, exemplo de entrega e profissionalismo, sempre de bom humor e cordial; é belo

ver o amor com que o senhor carrega a base de pesquisa em Patologia Oral. O senhor foi,

através da base, o meu primeiro contato com a Patologia, quando nem tinha pago a disciplina

básica ainda. Seu fascínio pela Patologia foi (e ainda é) inspiradora. À Profa. Dra. Hébel

Cavalcanti Galvão, exemplo de alegria. Não me lembro da senhora sem um sorriso no rosto.

Sua alegria é contagiante. Muito obrigado pelas valiosas sugestões oferecidas no exame de

Qualificação deste trabalho. À Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, exemplo de

sabedoria e inteligência. Ao Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, exemplo de caráter e

simplicidade. Admiro muito o senhor. Muito obrigado pelas correções sugeridas no exame de

Qualificação deste estudo. À Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, a quem tenho

enorme admiração pela inteligência e competência. Muito obrigado professora por todas as

oportunidades dadas a mim na clínica de Estomatologia. À Profa. Dra. Ana Myriam Costa de

Medeiros e Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, as quais admiro profundamente pela

sabedoria e tranquilidade. À Profa. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, pelos conhecimentos

transmitidos num dos momentos mais valiosos para mim, a clínica.

Em especial ao Prof. Dr. Manuel Antonio Gordón-Núñez. Meu amigo, tenho enorme

admiração por você. Você é um exemplo de simplicidade e amizade. Sou muito grato por estar

sempre disposto em me ajudar.

Agradeço profundamente à Maria Luiza. Malu, meus pais sempre quiseram ter uma

filha, porém eles não tiveram. Mas por bem Deus quis que eu tivesse sim uma irmã, então me

deu sua amizade. Você é a irmã que eu nunca tive. Mal consigo lembrar de algum momento em

minha vida que não tenha compartilhado com você. Muito obrigado por estar sempre ao meu

lado, em todos os momentos. Serei eternamente grato por tudo que você já fez por mim.

Aos amigos da Patologia... mais presentes de Deus em minha vida. Meus companheiros

de mestrado: Andréia, sempre carinhosa; Luciana, sempre sorrindo; Marcelo, sempre tão

educado; Thaís, sempre meiguinha; Thâmara, sem dúvida uma das pessoas mais engraçadas

que já conheci, muito obrigado por todos os risos que você arrancou de mim; Tiago, sempre

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determinado e atencioso; e Viviane, sempre simples e interessada. Vocês são todos muito

queridos por mim, de coração.

Aos doutorandos, em especial a minha maninha patológica Melka! Não tenho palavras

o suficiente para agradecer por tudo o que você fez para me ajudar. É incrível sua prontidão

em se dispor aos outros. Você é uma pessoa admirável, sempre sorridente e de alto astral. O

mundo seria muito melhor se as pessoas fossem como você.

À amiga Clarissa, que convive comigo desde tempos de iniciação científica e que me

incentivou ao ingresso no mestrado. Muito obrigado por todo o apoio, dicas, ensinamentos e

por estar sempre disposta a me ajudar. Você é uma pessoa bastante querida.

Aos demais doutorandos, Ana Luiza, Denise, Natália, Roseane, Jadson, Stefânia,

Adriana, Edilmar, Emília, Endrigo, Fernanda, Jamile, Maiara, Nazareno, Rodrigo e Vilson,

com quem tive a graça de conviver. Às quase doutoras Keila e Cynthia. E também àqueles que

já terminaram o doutorado, Fernando, Felipe, Emeline e em especial à Joabe, pela amizade,

momentos de descontração e pela valiosa ajuda na análise estatística desse trabalho. Muito

obrigado à todos por terem compartilhado estes momentos comigo. Todos vocês tornaram o

dia a dia na patologia mais agradável.

Aos funcionários, Gracinha, Hévio, Idel, Lourdinha, Ricardo, Sandrinha e Patrícia.

Muito obrigado por sempre me tratarem tão bem e estarem sempre dispostos a me ajudar.

Vocês fazem acontecer.

Aos meu irmão Leandro, um dos maiores exemplos de minha vida. Seu amor pela

profissão e amizade são admiráveis. Obrigado por tudo! À minha sogra, D. Zeni, obrigado por

me tratar como um filho. Às minha cunhadas, Odisséia e Katarina, obrigado por completarem

minha vida. Ao meu primo Rodrigo, meu brother! Que sempre me apoia em todos os momentos;

e ao grande amigo Eimar Lopes, obrigado por todo apoio e confiança em mim, você é um

exemplo de dedicação e ética que sigo em minha vida profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo

apoio financeiro que possibilitou a realização dessa pesquisa.

À todos os meus mais sinceros agradecimentos!

Paz e bem!

“Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível, e

de repente você estará fazendo o impossível”

São Francisco de Assis

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RESUMO

Os ameloblastomas e tumores odontogênicos ceratocísticos (TOC) representam lesões

odontogênicas que, apesar de sua natureza benigna, se destacam por um comportamento

biológico distinto, caracterizado pelo crescimento localmente agressivo e episódios

recidivantes. A reabsorção dos ossos gnáticos provocada pelo crescimento dessas lesões

constitui um fator determinante à expansão das mesmas, sendo mediada tanto por células

osteoclásticas como pela ação enzimática de diversas metaloproteinases de matriz (MMPs). A

expressão de fatores estimuladores e inibidores da reabsorção óssea vem sendo correlacionada

com o desenvolvimento destas lesões, merecendo destaque algumas MMPs como as

colagenases e as gelatinases e os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs), dentre

outros. Baseados na premissa de que fatores estimuladores e inibidores de processos osteolíticos

podem ser determinantes para o ritmo de crescimento de lesões odontogênicas intraósseas, o

objetivo de estudo foi avaliar a imunoexpressão das proteínas MMP-9, -13 e TIMP-1 no epitélio

e mesênquima de espécimes de ameloblastomas e TOC. A análise estatística foi realizada

através dos testes de Mann-Whitney e Wilcoxon com nível de significância estabelecido em

5%. Através de uma análise quantitativa das células imunomarcadas, foi observada a expressão

imuno-histoquímica das MMP-9, -13 e TIMP-1 em 100% dos casos, tanto no epitélio quanto

no mesênquima tumoral. Mais de 76% das células epiteliais (escore 3) dos TOC e

ameloblastomas apresentaram imunomarcação para MMP-9 (p=0,382) e MMP-13 (p=0,069),

sendo estatisticamente significativa para o TIMP-1 (p=0,003) nos ameloblastomas. No

mesênquima, observou-se maior escore de imunomarcação da MMP-13 (p=0,031) nos

ameloblastomas em relação aos TOC, enquanto para a MMP-9 e TIMP-1 não se observou

diferença estatisticamente significativa (p=0,403; p=1,000). O cálculo da razão entre os escores

de expressão das proteínas revelou, de uma maneira geral, similaridade entre as lesões, sendo

observado predomínio significante de igualdade de expressão do TIMP-1 e da MMP-9 apenas

no epitélio dos ameloblastomas. A imunoexpressão marcante das MMP-9, MMP-13 e TIMP-1

no epitélio e mesênquima das lesões estudadas indica que estas proteínas participam na

remodelação da MEC necessária à progressão tumoral, no entanto, as diferenças pontuais

observadas na expressão de algumas destas proteínas, não são suficientes para sugerir

diferenças no comportamento biológico dos ameloblastomas e dos TOCs.

Palavras-chave: Ameloblastoma. Tumores Odontogênicos. Metaloproteinases da

Matriz. Inibidores Teciduais de Metaloproteinases.

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ABSTRACT

Ameloblastomas and keratocystic odontogenic tumors (KOT) represent odontogenic

lesions that, despite their benign nature, are distinguished by a distinct biological behavior,

characterized by locally aggressive growth and recurrent episodes. The gnathic bone

resorption caused by the growth of these lesions is a key to the expansion of the same, both

being mediated by osteoclastic cells like enzymatic activity of various matrix

metalloproteinases (MMPs) factor. The expression of stimulatory factors and inhibitors of bone

resorption has been correlated with the development of these lesions, with emphasis to some

MMPs such as collagenases and gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases

(TIMPs), among others. Based on the premise that stimulatory and inhibitory factors of

osteolytic processes can be decisive for the growth rate of intraosseous odontogenic lesions,

this experiment evaluated the immunoreactivity of MMP-9, -13 and TIMP-1 protein in the

epithelium and mesenchyme of ameloblastoma and the KOT specimens, by a quantitative

analysis of the immunoreactivity cells. Statistical analysis was performed using the Mann-

Whitney and Wilcoxon tests with a significance level set at 5 %. Immunohistochemical

expression of MMP-9, -13 and TIMP-1 was observed in 100% of cases both in the epithelium

and in mesenchyme. The immunoreactivity in the epithelium of KOT and ameloblastomas

revealed a predominance of score 3 for MMP-9 (p=0.382) and MMP-13 (p=0.069) and no

statistically significance for TIMP-1, the latter being significantly higher immunoreactivity in

ameloblastomas. In the mesenchyme, there was a higher score immunoreactivity of MMP-13

(p=0.031) in ameloblastomas in relation to KOT, whereas for MMP-9 and TIMP-1 no

statistically significant difference (p=0.403 was observed, p=1.000). The calculation of the

ratio of scores revealed expression of proteins in general, similarity of the lesions, a significant

predominance of equal expression of TIMP-1 and MMP-9 was observed only in the epithelium

of ameloblastoma. The marked immunostaining of MMP-9 , MMP-13 and TIMP-1 in epithelium

and mesenchyme of the lesion indicate that these proteins involved in ECM remodeling required

for tumor progression, however, specific differences in the expression of some of these proteins,

are not sufficient to suggest differences in the biological behavior of ameloblastomas and

KOTs.

Key-words: Ameloblastoma. Odontogenic Tumors. Matrix Metalloproteinases. Tissue Inhibitor

of Metalloproteinases.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Quadro 1. Especificações dos anticorpos utilizados na pesquisa. Natal-RN,

2014..................................................................................................... 46

Figura 1. Estrutura das famílias das MMPs......................................................... 34

Figura 2. Estrutura tridimensional dos TIMP-1 e -2............................................ 39

Figura 3. Distribuição dos escores de imunomarcação para MMP-9, MMP-13

e TIMP-1 no epitélio dos TOC e Ameloblastomas. Natal – RN, 2014. 52

Figura 4. Distribuição dos escores de imunomarcação para MMP-9, MMP-13

e TIMP-1 no mesênquima dos TOC e Ameloblastomas. Natal/RN-

2014..................................................................................................... 53

Figura 5. Tumor odontogênico ceratocístico – Imunoexpressão da MMP-9

localizada em epitélio e mesênquima. (STUHRP; 400X)..................... 56

Figura 6. Ameloblastoma – Imunoexpressão da MMP-9 em epitélio e

mesênquima. (STUHRP; 400X)........................................................... 56

Figura 7. Tumor odontogênico ceratocístico – Imunoexpressão da MMP-13

localizada em epitélio e mesênquima. (ADVANCE; 400X)................. 57

Figura 8. Ameloblastoma – Imunoexpressão da MMP-13 em epitélio e

mesênquima. (ADVANCE; 400X)...................................................... 57

Figura 9. Tumor odontogênico ceratocístico – Imunoexpressão da TIMP-1

localizada em epitélio e mesênquima. (ENVISION; 400X)................. 58

Figura 10. Ameloblastoma – Imunoexpressão do TIMP-1 em epitélio e

mesênquima. (ENVISION; 400X)....................................................... 58

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LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Sistema de escore para a imunoexpressão da MMP-9, MMP-13 e

TIMP-1................................................................................................. 49

Tabela 2. Grupo de tumor, tamanho da amostra, mediana, quartis, média dos

postos e significância estatística para os escores de imunoexpressão

de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no epitélio. Natal, RN – 2014.............. 53

Tabela 3. Grupo de tumor, tamanho da amostra, mediana, quartis, média dos

postos e significância estatística para os escores de imunoexpressão

de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no mesênquima dos TOC e

Ameloblastomas. Natal, RN – 2014...................................................... 54

Tabela 4. Distribuição dos casos em relação aos postos de escores de

imunomarcação para o TIMP-1 e MMP-9 no epitélio e no

mesênquima dos TOC e Ameloblastomas. Natal, RN – 2014............... 54

Tabela 5. Distribuição dos casos em relação aos postos de escores de

imunomarcação para o TIMP-1 e MMP-13 no epitélio e no

mesênquima dos TOC e Ameloblastomas. Natal, RN – 2014............... 55

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

BFGF Fator de crescimento básico de fibroblastos (do inglês “Basic fibroblast

growth factor”)

CD Cisto dentígero

CR Cisto radicular

CEP Comitê de ética em pesquisa

CONEP Comissão nacional de ética em pesquisa

Da Dalton (unidade de massa atômica)

EGF Fator de crescimento epidérmico (do inglês “Epidermal growth factor”)

EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico (do inglês “Epidermal

growth factor receptor”)

HE Hematoxilina e eosina

Hpx Domínio hemopexina

IL-1α Interleucina-1α

IL-1β Interleucina-1β

IL-6 Interleucina-6

kDa Kilodalton (1000 x Da)

MEC Matriz extracelular

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro (do inglês “messenger RNA”)

MMP Metaloproteinase de matriz

MMP-2 Metaloproteinase de matriz-2




MT1-MMP Metaloproteinase de matriz transmembranar-1



OMS Organização mundial de saúde

OPG Osteoprotegerina

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês “Platelet-derived

growth factor”)

RANK Receptor ativador do fator nuclear kappa B

RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa B

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SCNCB Síndrome do carcinoma nevóide de células basais

TGF-α Fator de crescimento transformador (do inglês “Transforming growth

factor alpha”)

TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinase

TIMP-1 Inibidor tecidual de metaloproteinase-1




TNF-α Fator de necrose tumoral α (do inglês “Tumor necrosis factor”)

TOA Tumor odontogênico adenomatoide

TOC Tumor odontogênico ceratocístico

TOCC Tumor odontogênico cístico calcificante

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................25

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................28

2.1 AMELOBLASTOMA .................................................................................... ....................29

2.2 TUMOR ODONTOGÊNICO CERATOCÍSTICO .............................................................31

2.3 MMPs ................................................................................................................................. 33

2.3.1 Metaloproteinase de matriz – 9 (MMP-9) ................................................................... 36

2.3.2 Metaloproteinase de matriz – 13 (MMP-13) ............................................................... 37

2.4 TIMP ................................................................................................................................... 38

2.4.1 Inibidor tecidual de metaloproteinase – 1 (TIMP-1) .................................................. 40

3 PROPOSIÇÃO .................................................................................................................... 42

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 44

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ............................................................................................ 45

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ................................................................................ 45

4.3 POPULAÇÃO .................................................................................................................... 45

4.4 AMOSTRA ......................................................................................................................... 45

4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA....................................................................45

4.5.1 Critérios de inclusão ...................................................................................................... 45

4.5.2 Critérios de exclusão ..................................................................................................... 46

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO .............................................................................................. 46

4.7 MÉTODO IMUNO-HISTOQUÍMICO .............................................................................. 46

4.7.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico ............................................................... 46

4.7.2 Análise imuno-histoquímica ......................................................................................... 48

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 49

5 RESULTADOS .....................................................................................................................50

5.1 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS....................................................................51

5.1.1 Análise descritiva da expressão de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1.................................51

5.1.2 Resultados estatísticos....................................................................................................53

6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 59

7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 67

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 69

APÊNDICE A ......................................................................................................................... 80

APÊNDICE B .......................................................................................................................... 81

24

APÊNDICE C ......................................................................................................................... 82

ANEXO .................................................................................................................................... 83

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1 INTRODUÇÃO

Os tumores odontogênicos constituem lesões de frequência relativamente comum nos

ossos gnáticos, com histogênese associada a remanescentes epiteliais e/ou ectomesenquimais

relacionados à odontogênese. A Organização Mundial de Saúde (OMS) define os tumores

odontogênicos e as lesões semelhantes a tumores como um grupo de doenças heterogêneas que

variam desde proliferação hamartomatosa benigna não neoplásica a crescimentos neoplásico

benignos e malignos. Os tumores odontogênicos são raros, alguns até mesmo extremamente

raros, fato que pode criar desafios diagnósticos e terapêuticos significativos (BARNES et al.,

2005).

Dentre os tumores odontogênicos, duas lesões que merecem destaque são os

ameloblastomas e os tumores odontogênicos ceratocísticos. O primeiro, embora seja um tumor

benigno dos maxilares, se destaca pelo comportamento localmente agressivo e de alto potencial

invasivo, o que resulta em um elevado índice de recidiva após enucleação e curetagem (QIAN;

HUANG, 2010; HENRIQUES et al., 2011); e ainda que raro, o subtipo sólido é o segundo

tumor odontogênico mais comum, sendo menos comum apenas que os odontomas (NEVILLE

et al., 2009). O segundo, antes chamado de ceratocisto odontogênico, se caracteriza pelo

comportamento diferenciado quando comparado a outros cistos odontogênicos, de tal modo

que, devido às suas peculiaridades, como a recorrência e suas características histopatológicas

(SCHUSSEL et al., 2011) foi recategorizado, em 2005, pela OMS, como um neoplasma

odontogênico benigno, sendo sugerida a denominação de tumor odontogênico ceratocístico, por

ser uma lesão de natureza localmente agressiva e com alta taxa de recorrência (LEONARDI et

al. 2010; SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

A matriz extracelular é um componente essencial do microambiente estromal, que além

de servir como arcabouço para os elementos celulares, exerce profunda influência sobre o

comportamento celular, afetando o crescimento, a diferenciação, mobilidade e viabilidade. A

homeostase tecidual é garantida pelo equilíbrio entre as células e o microambiente do estroma

circundante. Tal microambiente pode ser perturbado por condições patológicas, onde a

alteração celular se estabelece junto com a superexpressão de proteases que modificam a

composição da matriz extracelular (MARASTONI et al., 2008). A invasão tumoral é um

processo onde as células neoplásicas destroem e infiltram o tecido normal adjacente à massa

tumoral principal (ZHANG et al., 2004). De acordo com Amălinei et al. (2010), esse processo

de invasão tumoral compreende “3 passos”: (1) adesão das células tumorais à MEC; (2)

27

degradação proteolítica da MEC; e por fim, (3) migração das células através da área lesada. No

caso dos tumores odontogênicos, a reabsorção óssea promovida pela degradação da MEC

circundante seria a responsável pela progressão e expansão tumoral.

Nesse sentido, muitos estudos apontam que a interação entre as MMPs e TIMPs é

considerada um possível fator regulador determinante na proliferação das células tumorais,

estabilização e agressividade dos diferentes cistos e tumores odontogênicos (SIQUEIRA et al.,

2010; HENRIQUES et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

Diante disto, o presente estudo objetiva avaliar a expressão imuno-histoquímica das

proteínas MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 em ameloblastomas e tumores odontogênicos

ceratocísticos a fim contribuir para uma melhor compreensão da participação dessas proteínas

no comportamento biológico das lesões estudadas.

29

2 REVISÃO DA LITERATURA

A OMS define os tumores odontogênicos e as lesões semelhantes a tumores, como um

grupo de doenças heterogêneas, cujos limites compreendem desde proliferação de tecido

hamartomatoso benigno não neoplásico, até tumores malignos com potencial de metástases.

Tais tumores são derivados de elementos formadores de dente e aparelho de suporte, epiteliais,

ectomesenquimáticos e/ou mesenquimáticos. Os tumores odontogênicos são raros, alguns até

mesmo extremamente raros, fato que pode criar desafios diagnósticos e terapêuticos

significativos (BARNES et al., 2005). Dentre estes tumores, destacam-se pela frequência e pelo

comportamento biológico, dois representantes de natureza benigna, originados a partir de

epitélio odontogênico com estroma fibroso maduro, sem participação do ectomesênquima

odontogênico, que são o ameloblastoma sólido/multicístico ou convencional e o tumor

odontogênico ceratocístico (PHILIPSEN et al., 2005).

2.1 AMELOBLASTOMA

O ameloblastoma é um tumor odontogênico benigno dos maxilares, porém localmente

agressivo e de alto potencial invasivo, o que resulta em um elevado índice de recidiva após

enucleação e curetagem (variando de 20% a 90% dos casos) (MEER et al., 2003; QIAN;

HUANG, 2010; HENRIQUES et al., 2011) e representa 1% de todas as neoplasias da cavidade

oral (SADDY et al., 2005; BARNES et al., 2005). Teoricamente podem se originar de

remanescentes da lâmina dentária, do órgão do esmalte em desenvolvimento, do revestimento

epitelial de um cisto odontogênico ou das células da camada basal do epitélio de mucosa bucal

(ADEBIYI et al., 2006; NEVILLE et al., 2009).

Na classificação da OMS (2005), os ameloblastomas ocorrem em quatro situações

clínico-radiográficas distintas: (1) tipo sólido/multicístico – que representam cerca de 80% dos

casos; (2) tipo periférico/extra-ósseo – compreende de 1,3% a 10% de todos os ameloblastomas;

(3) tipo desmoplásico – variando de 1,28% a 5,19% dos casos; e (4) tipo unicístico, que

correspondem de 5% a 15% dos ameloblastomas (BARNES et al., 2005; DHANUTHAI et al.,

2012).

Segundo Neville et al. (2009), embora raro, o ameloblastoma sólido é o segundo tumor

odontogênico mais comum, sendo menos comum apenas que os odontomas. Não apresenta

predileção por sexo e é encontrado em uma ampla faixa. Da Costa et al. (2012), em um estudo

30

retrospectivo, encontraram uma incidência de 201 tumores odontogênicos, sendo o

ameloblastoma o segundo tumor de maior frequência, representando 29,8% dos tumores.

Clinicamente, os ameloblastomas do tipo sólido apresentam evolução lenta e geralmente

assintomática. Mais comumente, exibem expansão da cortical óssea, o que pode provocar

tumefação gengival, mobilidade dentária e até mesmo perda espontânea de dentes. Raramente

apresenta dor ou parestesia e, quando não tratado, pode assumir proporção grotesca. A

localização mais frequente é em mandíbula posterior.

Ao exame radiográfico observa-se uma lesão radiolúcida multilocular, com aspectos

semelhantes a “bolhas de sabão” e expansão das corticais ósseas vestibular e lingual. Por vezes

observa-se reabsorção ou deslocamento das raízes dentais ou um dente incluso envolvido

(BACHMANN; LINFESTY, 2009).

De acordo com a OMS (2005), histologicamente os ameloblastomas apresentam cinco

padrões distintos: folicular, plexiforme, acantomatoso, de células granulares e de células basais;

sendo os padrões folicular e o plexiforme os mais comuns (BARNES et al., 2005). O padrão

folicular caracteriza-se por ilhas de epitélio circundadas por células colunares ou cuboidais com

polaridade invertida em um estroma de tecido conjuntivo fibroso. As células centrais estão

arranjadas frouxamente lembrando o retículo estrelado do órgão do esmalte. O padrão

plexiforme é caracterizado pela presença de cordões de epitélio odontogênico anastomosados,

delimitados por células cuboidais, colunares, semelhantes a ameloblastos circundando células

epiteliais arranjadas frouxamente. No padrão acantomatoso observa-se extensa metaplasia

escamosa, frequentemente associada a formação de ceratina, na região central de um

ameloblastoma folicular. A presença de células cuboidais, colunares ou arredondadas, contendo

grânulos eosinofílicos com citoplasma abundante caracterizam o padrão de células granulares,

enquanto a presença de células basalóides se proliferando em ninhos ou cordões com células

periféricas cúbicas, sem a presença de retículo estrelado no centro, caracteriza o ameloblastoma

sólido com padrão de células basais (BARNES et al., 2005; BACHMANN; LINFESTY, 2009;

FULCO et al., 2010).

O tratamento para os ameloblastomas, em geral, é cirúrgico conservador, com curetagem

e enucleação, ou radical com ressecção em bloco com margem de segurança podendo ser

complementado com marsupialização, descompressão, crioterapia ou solução de Carnoy

(HERTOG et al., 2011). O prognóstico depende da localização anatômica, do grau de infiltração

e destruição local. Os ameloblastomas apresentam altas taxas de recidiva, em que 17,7% a

27,3% dos ameloblastomas sólidos/multicísticos recorrem após ressecção cirúrgica radical, e

31

20% a 90% recidivam após abordagem cirúrgica conservadora (enucleação seguida de

curetagem) (MEER et al., 2003).

2.2 TUMOR ODONTOGÊNICO CERATOCÍSTICO

Antes denominado ceratocisto odontogênico, era definido como um cisto de

desenvolvimento, sendo reclassificado em 2005, pela OMS, como um neoplasma cístico

odontogênico benigno, onde foi sugerida a denominação de tumor odontogênico ceratocístico

(TOC), por ser uma lesão de natureza localmente agressiva e com alta taxa de recorrência

(LEONARDI et al., 2010; SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

Em detrimento de seu comportamento biológico distinto, muitos estudos têm se dedicado

a compreender os mecanismos envolvidos que justifiquem a progressão deste tumor e sua alta

agressividade. Desta maneira, estudos têm demonstrado, através da técnica de imuno-

histoquímica, que essa lesão diferentemente das outras lesões císticas de origem odontogênica,

apresenta maior índice de proliferação celular (KICHI et al., 2005; KOLÁŘ et al., 2006;

TSUNEKI et al., 2008), maior expressão de fatores de crescimento (LI; BROWNE;

MATTHEWS, 1997; KOLÁŘ et al., 2006; SUYAMA et al., 2008), de proteínas anti-

apoptóticas (KICHI et al., 2005; KOLÁŘ et al., 2006; VERED et al., 2009), além de proteínas

supressoras tumorais (SHEAR, 2002; KICHI et al., 2005).

Os TOCs podem aparecer como lesões solitárias ou múltiplas, sendo a multiplicidade de

lesões bem reconhecida na síndrome do carcinoma nevóide de células basais (SCNCB),

também chamada síndrome de Gorlin-Goltz (EVANS et al., 1993; KICHI et al., 2005;

LEONARDI et al., 2010). Os tumores sindrômicos tendem a ser maiores, mais agressivos e

com maior potencial recidivante (HENRIQUES et al., 2011).

A origem dos TOCs é incerta, mas acredita-se ser proveniente de remanescentes da

lâmina dental localizados dentro dos maxilares, onde esses remanescentes epiteliais

odontogênicos seriam estimulados por fatores ainda desconhecidos (SHEAR, SPEIGTH,

2007).

Alguns estudos têm sugerido a influência genética na etiologia dessa lesão. O gene

PTCH1 codifica uma proteína transmembrana controlando os destinos da célula, padronização

e crescimento de diversos tecidos. Acredita-se que mutações no gene PTCH1 são encontradas

em 85% dos TOCs relacionados à Síndrome de Gorlin-Goltz, e em apenas 30% dos TOCs

esporádicos. Este gene é o homólogo humano do gene Drosophila e tem sido confirmado como

32

o gene causador da doença na síndrome de Gorlin-Goltz (HAHN et al.,1996; JOHNSON et al.,

1996).

Segundo Domingues e Gil (2007) e Li (2011), esses achados indicam que defeitos do

PTCH1 estão envolvidos tanto na patogênese da síndrome quanto na dos casos esporádicos. Os

autores afirmam, ainda, que as alterações desses genes estão associadas aos TOCs mostrando

um aumento da atividade proliferativa da camada epitelial, demonstrando, assim, um fenótipo

de alta tendência à recorrência, o que poderia explicar a agressividade da lesão e suportar sua

característica neoplásica.

Mesmo passando a ser considerado como um tumor odontogênico pela OMS, em 2005,

alguns autores ainda o enquadram dentre as lesões císticas e relatam que os mesmos

correspondem de 3% a 11% de todos os cistos odontogênicos (VICENTE et al., 2010). Souza

et al. (2010) determinaram a distribuição de cistos odontogênicos na população brasileira

durante um período de 38 anos, de acordo com idade, gênero e sítio afetado. Dos 1019 casos

entre os anos de 1970 e 2007, 65 casos (6,4%) foram diagnosticados como ceratocisto

odontogênico, sendo a terceira lesão cística mais comum.

O pico de ocorrência dos TOCs corresponde à segunda e terceira décadas de vida, porém

podem surgir desde primeira até a nona década de vida, acometendo mais pacientes do gênero

masculino. A mandíbula é afetada em 60 a 80% dos casos, com maior tendência de envolver a

região posterior do corpo mandibular e ramo ascendente (BARNES et al., 2005; SHEAR;

SPEIGHT, 2007; NEVILLE et al., 2009).

Comumente são assintomáticos, no entanto as lesões maiores podem estar associadas a

dor, tumefação ou drenagem. Entretanto, há relatos de alguns tumores extremamente grandes e

assintomáticos (NEVILLE et al., 2009; COTTOM et al., 2012).

Radiograficamente, os TOCs podem se apresentar como radiolucência bem definida,

circular ou ovóide, pequena e uni ou multilocular (CHIRAPATHOMSAKUL;

SASTRAVAHA; JANSISYANONT, 2006; KUMAMOTO, 2006; SHEAR; SPEIGHT, 2007).

Lesões maiores, particularmente acometem a região posterior da mandíbula envolvendo o

ângulo e ramo ascendente e podem deslocar o nervo alveolar inferior (SHEAR, 2002;

MENDES; CARVALHO; VAN DER WAAL, 2010).

O quadro histopatológico do TOC revela um revestimento cístico composto por epitélio

pavimentoso estratificado paraceratinizado, com 4-8 camadas de células e de superfície

corrugada. A camada basal é composta por células cúbicas hipercromáticas dispostas em

paliçada, semelhantes a ameloblastos e com polaridade invertida com interface epitélio-

conjuntivo plana. A cápsula fibrosa é fina e friável contendo escasso infiltrado inflamatório em

33

permeio. Ilhas, cordões e cistos satélites no interior da cápsula também podem ser observadas.

Displasia epitelial ocasional pode estar presente, no entanto a transformação maligna é rara

(BARNES et al. 2005; GOMES et al., 2009; LI, 2011).

O principal tratamento de escolha é a enucleação cirúrgica. A completa remoção da

lesão é, muitas vezes, difícil devido à natureza friável e à espessura fina da cápsula (NEVILLE

et al., 2009). Pogrel (2013) propôs um esquema de tratamento que consiste em biópsia

incisional com instalação de dreno. Após o diagnóstico de TOC o dreno é mantido, com

irrigações duas vezes ao dia e controle radiográfico. Após a redução da lesão é feita a

enucleação juntamente com crioterapia e a remoção do dente adjacente, caso exista. A atual

literatura reporta uma ampla taxa de recorrência para as diferentes opções de tratamento

cirúrgico (0% a 62%), com a maioria dos casos recorrendo dentro dos primeiros cinco anos

pós-tratamento (NEVILLE et al., 2009; KINARD et al., 2013).

2.3 METALOPROTEINASE DE MATRIZ (MMP)

As MMPs são classificadas como uma subfamília de proteinases da família de

metaloproteinases zinco-dependentes M10, especializadas na clivagem das proteínas

extracelulares (ANDERSEN et al., 2004; NAGASE et al., 2006; HANNAS et al., 2007;

KRANE, INADA, 2008). A família de MMPs inclui pelo menos 24 membros bem

caracterizados, que podem ser classificados em subgrupos de acordo com sua especificidade

para determinados substratos e por sua homologia de subsequências em 5 subfamílias:

colagenases (MMP-1, -8 e -13); gelatinases/colagenase IV (MMP-2 e -9); estromelisina (MMP-

3 e -10); MMPs tipo membrana (MT-MMPs, MMP-14, -15, -16 e -17) e outras MMPs (MMP-

7, -11, -12, -19, -20 e outras) (KUMAMOTO et al., 2003; ZHANG et al., 2005; GEORGES et

al., 2009).

Uma MMP típica consiste em um pro-peptídeo com cerca de 80 aminoácidos, um

domínio catalítico com cerca de 170 aminoácidos, um peptídeo ligante de variados tamanhos,

também chamado de “hinge region”, e um domínio hemopexina (Hpx), com aproximadamente

200 aminoácidos (NAGASE et al., 2006) (figura 1). Segundo Thomas, Lewis e Speight (1999)

as MMPs tipo membrana constituem moléculas transmembrana, enquanto as outras são

secretadas pelas células.

34

Figura 1. Estrutura das famílias das MMPs.

Fonte: Adaptado de Nagase, Visse e Murphy, 2006.

Legenda: sp, sinal de sequência; pro, pró-domínio; cat, domínio catalítico; FNII, fibronectina tipo II; L1, ligante

1; CysR, rico em cisteína; Ig, domínio imunoglobulina; L2, ligante 2; Mb, membrana plasmática; TM, domínio

transmembrana; GPI, ancora glicosilfosfatidilinositol.

A atividade funcional das MMPs é regulada por 4 mecanismos: (1) por controle

transcricional positivo e negativo dos genes de MMP; (2) pela ativação de estado latente; (3)

pelas diferenças entre substratos específicos; ou (4) por modulação através dos inibidores

teciduais de metaloproteinases (TIMPs) (DEW et al., 2000; HANNAS et al., 2007). A

degradação da matriz extracelular (MEC), mediada por MMPs, é uma característica importante

do desenvolvimento, morfogênese, reparo tecidual e remodelagem. É precisamente regulada

sob condições fisiológicas normais, mas quando se encontra desregulada pode causar diversas

doenças tais como artrite, nefrite, câncer, encefalomielite, úlceras crônicas, fibrose, entre outras

(NAGASE; VISSE; MURPHY, 2006).

Segundo Georges et al. (2009), as MMPs também atuam no processo de reabsorção óssea,

por participarem na remodelação da MEC, migração e invasão celular e na liberação de fatores

de crescimento modificadores. Existem fortes evidências de que as MMPs têm um importante

papel durante a osteogênese e remodelação óssea. Sua síntese pelos osteoblastos tem sido

demonstrada durante a degradação de osteóide antes da reabsorção da matriz mineralizada pelos

osteoclastos (DEW et al., 2000). Desta forma, a expressão alterada de proteínas específicas da

MEC, associada à presença exuberante de MMPs e à ausência de expressão dos TIMPs, podem

influenciar o comportamento destas lesões, contribuindo para o crescimento e alta

agressividade, no caso de alguns tumores (ROSENTHAL; MATRISIAN, 2006).

35

Além das MMPs e seus inibidores teciduais, a expressão de outros biomarcadores está

envolvida no processo de reabsorção óssea e no desenvolvimento de lesões odontogênicas,

como RANK/RANKL/OPG (KUMAMOTO; OOYA, 2004; SILVA et al., 2008), IL-1α

(KUBOTA, SHIRASUNA, 2007; SUYAMA et al., 2008) e TNF-α (KUMAMOTO, OOYA,

2006).

Acredita-se que, células tumorais no microambiente de um tecido ósseo, iniciam uma

resposta inflamatória que leva ao recrutamento de osteoclastos ativados e então, à reabsorção

óssea, criando um meio favorável ao seu próprio crescimento, contribuindo para o

desenvolvimento do tumor (STEEVE et al., 2004). Silva et al. (2008) afirmam que o

desequilíbrio na ação de fatores sinalizadores de processos de diferenciação e ativação

osteoclásticas pode contribuir para a reabsorção óssea envolvida no crescimento de

ameloblastomas, TOCs e cistos dentígeros.

Assim, a participação das MMPs na progressão tumoral tem sido amplamente estudada.

De acordo com Ribeiro et al. (2012), os tumores são tipicamente circundados por MEC. A

invasão tumoral é um processo neoplásico em que as células neoplásicas destroem e infiltram

o tecido normal ao redor da massa tumoral principal. Segundo esses autores, este processo pode

ser analisado em três estágios, que se inicia pela adesão da célula tumoral à MEC, seguida pela

degradação proteolítica da MEC, e finalmente, migração das células neoplásicas pela área

lesada, sendo essa degradação da MEC realizada pelas MMPs.

Embora alguns autores discordem de que as MMPs atuem como as principais proteínas

envolvidas no processo de degradação da MEC e consequente reabsorção óssea e progressão

tumoral (FULLER; KIRSTEN; CHAMBERS, 2007), diversos estudos apontam que as MMPs

podem modular outras funções no microambiente tumoral em adição à sua atividade

proteolítica, interagindo com a MEC liberando e ativando diferentes fatores de crescimento;

assim, as MMPs são reguladoras das funções celulares tanto em condições fisiológicas quanto

patológicas (SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

Segundo Lynch e Matrisian (2002), a expressão de MMPs por células tumorais ou

estromais em resposta ao crescimento neoplásico foi inicialmente associada apenas a estágios

finais do desenvolvimento tumoral, isto é, com invasão e metástase. No entanto, diversos

estudos sugerem que as MMPs influenciam também os mecanismos de crescimento dos cistos

odontogênicos, bem como o potencial invasivo e destrutivo dos tumores odontogênicos

(LEONARDI et al., 2010; QIAN, HUANG, 2010; SIQUEIRA et al., 2010; HENRIQUES et al.,

2011; SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

36

2.3.1 Metaloproteinase de matriz – 9 (MMP-9)

A MMP-9 é uma colagenase que possui 92 kDa em sua forma latente e 83 kDa em sua

forma ativa (KUBOTA et al., 2000). É também chamada de gelatinase B (ANNE et al., 2013),

sendo assim denominada em função de sua capacidade de degradar colágeno desnaturado

(gelatina) (THOMAS; LEWIS; SPEIGHT, 1999).

Segundo Pinheiro et al. (2004), a MMP-9 não apenas contribui para a degradação óssea,

mas também atua como uma reguladora no processo de reabsorção óssea inicial. É considerada

a proteinase mais importante envolvida na reabsorção óssea devido os osteoclastos expressarem

essa enzima em níveis extremamente elevados (ANNE et al., 2013).

Segundo Santos et al. (2011), o papel da MMP-9 no desenvolvimento dos TOCs, cistos

dentígeros e cistos radiculares está associado à regulação de fatores ligados à proliferação e

migração celular, apoptose e respostas imune e inflamatória.

Henriques et al. (2011) sugeriram que a interação entre a produção de MMP-9 e TIMP-

2 e a degradação dos componentes da membrana basal contribuem para os distintos

comportamentos dos ameloblastomas e TOCs quando comparados com cistos dentígeros e

radiculares.

Juntamente com a MMP-2, possui um papel importante na tumorigênese pela habilidade

de degradar colágeno tipo IV, que constitui o maior componente da membrana basal e

representa o primeiro obstáculo para invasão e metástase das células tumorais (HONG et al.,

2000; ROBINSON et al., 2003; RIBEIRO et al., 2012). Muitos cistos dentígeros têm

apresentado uma contínua positividade para colágeno tipo IV na membrana basal do epitélio,

enquanto nos TOCs e ameloblastomas uma presença mais marcante e difusa tem sido

identificada tanto nas células epiteliais quanto nas mesenquimais (ANNE et al., 2013).

O estudo de Kumamoto et al. (2003) avaliou a expressão imuno-histoquímica de

algumas MMPs, dentre elas a MMP-9, e seus inibidores teciduais (TIMPs) em casos de

ameloblastomas e germes dentários. Os resultados deste estudo apontaram que a expressão

estromal da MMP-9 nos ameloblastomas foi significantemente maior que no componente

mesenquimal dos germes dentários, sugerindo que uma produção aumentada desta MMP

poderia estar relacionada com a alteração neoplásica dos tecidos odontogênicos.

Os experimentos de Qian e Huang (2010) buscaram analisar a expressão da MMP-9 e

TIMP-1 em culturas de células de ameloblastoma quanto à reabsorção óssea. Esses autores

utilizaram sistemas de cocultura de células de ameloblastomas e células da medula óssea de

camundongos neonatais e observaram que a expressão de MMP-9 juntamente com RANKL,

37

permitiu a indução da diferenciação osteoclástica com consequente atividade de reabsorção

óssea pelas células de ameloblastomas. Porém, ao incluir o TIMP-1 ao sistema, a atividade

inibitória desta proteína sobre a MMP-9 não mostrou um efeito inibitório significativo no

processo de reabsorção óssea. Portanto, esses autores sugeriram que a MMP-9 poderia

participar na degradação da matriz óssea, entretanto não seria a principal protease envolvida.

Contudo, a expressão de MMP-9 tem sido demonstrada como um importante fator para

o estabelecimento das diferenças entre o comportamento biológico de lesões odontogênicas

mais indolentes, tais como os cistos dentígeros, cistos radiculares e tumores odontogênicos

adenomatóides (TOAs), e as mais agressivas, como os TOCs e ameloblastomas (RIBEIRO et

al, 2009; HENRIQUES et al., 2011; FINKELSTEIN et al., 2013).

Uma expressão elevada dessa protease tanto em células neoplásicas quanto estromais,

também foi encontrada por Siqueira et al. (2010), quando compararam o comportamento

biológico de ameloblastomas e tumores odontogênicos císticos calcificantes (TOCCs). Esses

autores sugerem que mecanismos independentes envolvendo a síntese dessas MMPs e a

atividade proliferativa contribuem para a invasão local dos ameloblastomas, influenciando seu

comportamento biológico agressivo.

Ribeiro et al. (2012) avaliaram a expressão das MMPs em relação à agressividade e

atividade proliferativa de TOCs e encontraram uma expressão significativamente mais

abundante de MMP-9 nesses tumores quando comparados ao TOCCs, que são caracterizados

como tumores minimamente invasivos, isto é, não agressivos.

2.3.2 Metaloproteinase de matriz – 13 (MMP-13)

A MMP-13, ou colagenase-3, foi originalmente relacionada ao câncer de mama

(FREIJE, DÍEZ-ITZA, BALBIN, 1994), sendo produzida tanto por fibroblastos e células do

epitélio escamoso maligno, como por células plasmáticas associadas à lesão óssea destrutiva

(WAHLGREN et al., 2001, 2003).

Estudos têm apontado os miofibroblastos como secretores da MMP-13 (LEDERLE et

al., 2010), e sendo responsáveis em transformá-la na sua forma ativa (NIELSEN et al., 2001;

NIELSEN et al., 2008; SHI, WANG, TARBELL, 2011). De Aquino et al. (2009) indicam que

outros tipos celulares, tais como células endoteliais, fibroblastos, osteoblastos e condrócitos

possam induzir a expressão da MMP-13.

38

Juntamente com as MMP-1 e MMP-8, constituem as principais proteinases capazes de

iniciar a degradação de vários colágenos fibrilares nativos, incluindo os colágenos I, II, III e IV

(STAMENKOVIC, 2000).

O colágeno é considerado o principal componente orgânico do tecido ósseo normal e a

proteína mais abundante da matriz extracelular intersticial. Sendo que em mamíferos, o

colágeno tipo I representa cerca de 90% do total dessas proteínas fibrosas (BRASILEIRO

FILHO, 2004; COWAN et al., 2009).

A MMP-13 exerce um papel essencial na cascata de ativação de MMPs, tanto ativando

como sendo ativada por outras MMPs (LEEMAN et al., 2002) e tem seu efeito biológico

marcadamente relacionado com a ativação de células osteoclásticas (HANNAS et al., 2007).

Desde a descoberta de seu envolvimento com tumores em humanos em 1994, a expressão

elevada de MMP-13 tem sido encontrada em diferentes malignidades, sendo relacionada tanto

com o comportamento do tumor quanto com o prognóstico do paciente (FREIJE et al., 1994;

JOHANSSON et al., 1997; NIELSEN et al., 2001).

Escassos trabalhos são relatados na literatura quanto a expressão da MMP-13 em lesões

odontogênicas, porém, seu papel na progressão de outros tumores tem sido bastante

demonstrado, tais como em câncer de cabeça e pescoço, de laringe, de mama, gástrico,

condrossarcoma, coloretal, carcinomas vulvares e linfomas epiteliais malignos (FREIJE et al.,

1994; JOHANSSON et al., 1997; JOHANSSON et al., 1999; PENDÁS et al., 2000; DEL

CASAR LIZCANO et al., 2003; KRECICKI et al., 2003; CULHACI et al., 2004; ROEB et al.,

2004; CORTE et al., 2005; LUUKKAA et al., 2006; KUDO et al., 2012).

Leonardi et al. (2010) sugeriram que a MMP-13 pode induzir a migração epitelial e o

potencial de crescimento dos TOCs, quando comparados a outros cistos odontogênicos, tais

como os cistos dentígeros e radiculares. Estes autores encontraram uma expressão mais

proeminente desta MMP no estroma da lesão, principalmente quando associadas à SCNCB, o

que pode justificar a maior agressividade dos ceratocistos odontogênicos sindrômicos quando

comparados aos casos esporádicos.

2.4 INIBIDOR TECIDUAL DE METALOPROTEINASE (TIMP)

Os TIMPs constituem uma família de inibidores intrínsecos de MMPs, capazes de

bloquear especificamente as formas ativas destas enzimas (WESTERMARCK, KAHARI,

1999; KUMAMOTO et al., 2003). Além da inibição de MMPs, os TIMPs também podem

induzir alterações na morfologia celular, estimular o crescimento de vários tipos de células,

39

estão envolvidos no desenvolvimento de células germinativas e têm efeito na angiogênese e na

migração e apoptose celular (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; SIQUEIRA et al., 2010;

MATOS et al., 2012).

Os TIMPs são proteínas pequenas de aproximadamente 2500 Da, cuja estrutura se divide

em: domínio N-terminal e o subdomínio C-terminal (BORD et al., 1999; NAGASE; VISSE;

MURPHY, 2006; KRANE, INADA, 2008) (Figura 2).

Figura 2. Estrutura tridimensional dos TIMP-1.

Fonte: Nagase, Visse e Murphy, 2006.

Há, atualmente, quatro membros conhecidos dessa família: TIMP-1, -2, -3 e -4, que

exibem 30 a 40% de homologia na cadeia de aminoácidos e possuem 12 resíduos de cisteína

conservados (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000). Thomas,

Lewis e Speight (1999) relataram em sua revisão que os TIMP-1 e -2 são expressos por muitos

tipos celulares, enquanto o TIMP-3 parece estar associado a tecidos conjuntivos. A expressão

do TIMP-1 e TIMP-3 é induzida por uma ampla variedade de agentes, enquanto a expressão do

TIMP-2 é constitutiva. O padrão de expressão do TIMP-4 parece mais restrito que os outros

TIMPs. Os TIMPs podem ser encontrados na forma de proteínas secretadas ou encontrados na

superfície celular associados à proteínas constituintes da membrana celular (GEORGES et al.,

2009).

Eles podem inibir todas as formas ativas de MMPs em um fenômeno que ocorre através

da formação de complexos bimoleculares não-covalentes, compostos pela atividade inibitória

da molécula presente no domínio N-terminal dos TIMPs e pela forma ativa, e ocasionalmente,

forma latente das MMPs, geralmente em uma estequiometria de 1:1 (BORD et al., 1999;

KUMAMOTO et al., 2003; NAGASE; VISSE; MURPHY, 2006).

40

O equilíbrio entre MMPs e TIMPs determina, em última instância, a extensão da

degradação da MEC em condições fisiológicas e patológicas (BORD et al., 1999;

KUMAMOTO et al., 2003). Assim, dentre várias condições patológicas, vem surgindo estudos

sobre essa relação na biologia do câncer oral (BIRKEDAL-HANSEN et al., 2000; TAKAOKA

et al., 2006; FULLÁR et al., 2012; SUAREZ-ROA et al., 2012) e dos cistos e tumores

odontogênicos (KUMAMOTO, 2003; SILVEIRA et al., 2007; GOMES et al., 2010;

LEONARDI et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2010; RIBEIRO et al., 2012).

Nesse sentido, muitos estudos apontam que a interação entre as MMPs e TIMPs é

considerada um possível fator regulador determinante na proliferação das células tumorais,

estabilização e agressividade dos diferentes cistos e tumores odontogênicos (SIQUEIRA et al.,

2010; HENRIQUES et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012).

2.4.1 Inibidor tecidual de metaloproteinase – 1 (TIMP-1)

O TIMP-1 é uma proteína glicosilada de 28 kDa (BORD et al., 1999). Embora os TIMPs

inibam todas as MMPs, o TIMP-1 é um pobre inibidor para MMP-19 e para MMPs ancoradas

à membrana plasmática, MT1-MMP, MT3-MMP e MT5-MMP (NAGASE; VISSE;

MURPHY, 2006).

Muitos dos fatores que estão envolvidos com a regulação e expressão do TIMP-1, também

estão implicados na regulação do crescimento celular e no funcionamento da IL-1b, IL-6, TNF-

α, EGF, BFGF, PDGF, dentre outros. De grande interesse é o fato de que muitos desses fatores

regulam a expressão de proteínas da matriz extracelular e de MMPs (THOMAS; LEWIS;

SPEIGHT, 1999).

O estudo de Bord et al. (1999) demonstrou distintos padrões de localização do TIMP-1 e

MMPs em diferentes tipos de ossos humanos in vivo. A presença de MMPs associada ao baixo

nível de TIMP-1 em osso patológico pode resultar em excessiva degradação da matriz

extracelular. Em contraste, a expressão generalizada de TIMP-1 em tecidos ósseos normais em

desenvolvimento, sugere que ele atua no controle da atividade de MMP, contribuindo para a

regulação de modelagem e remodelagem ósseas no desenvolvimento do tecido ósseo humano.

No contexto dos cistos e tumores odontogênicos, o estudo de Kumamoto et al. (2003)

mostrou uma expressão positiva de TIMP-1 em todos os casos de ameloblastomas analisados,

sendo essa expressão localizada em algumas células tumorais, bem como em componentes

estromais desses tumores. Na maioria dos ameloblastomas estudados, a expressão dos TIMPs

e das MMPs analisados foi mais proeminente no estroma circunjacente às ilhas e ninhos

41

tumorais. Esses autores sugerem, assim, que o TIMP-1 estaria atuando na regulação das MMPs

em um processo que estaria relacionado com a supressão tumoral.

Siqueira et al., (2010) avaliaram a expressão de MMPs e TIMPs na evolução do padrão

de invasão do ameloblastoma e observaram que os níveis de expressão tanto de fatores de

crescimento quanto de MMPs e TIMPs estavam significativamente aumentados quando

comparados aos dos TOCCs, concluindo que o envolvimento dessas proteínas entre si exercem

um papel importante no comportamento biológico dos ameloblastomas.

Ribeiro et al. (2012), ao analisarem as expressões de TIMP-1 e TIMP-2 em casos de TOCs

e TOCCs, encontraram diferenças de expressão entre TIMP-1 e TIMP-2 entre estas lesões,

sugerindo que diferentes lesões poderiam expressar diferentes TIMPs.

43

3 PROPOSIÇÃO

O presente estudo se propôs a avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas

MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 em uma série de casos de ameloblastomas e TOC, visando

contribuir para um melhor entendimento da participação dessas proteínas no desenvolvimento

e comportamento das lesões estudadas.

45

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este estudo constitui parte de um projeto de pesquisa cadastrado na Comissão Nacional

de Ética em Pesquisa (CONEP) e submetido à análise do seu conteúdo pelo Comitê de Ética

em Pesquisa – CEP da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sendo aprovado sob

parecer nº 175/2010.

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

O presente estudo caracterizou-se por uma pesquisa laboratorial, consistindo de uma

análise imuno-histoquímica descritiva e comparativa, da expressão da MMP-9, MMP-13 e do

TIMP-1 em espécimes de TOC e ameloblastomas.

4.3 POPULAÇÃO

A população deste estudo foi constituída por todos os casos de TOC e ameloblastomas

arquivados no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do

Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

4.4 AMOSTRA

A amostra do estudo foi intencional e constituída por 40 espécimes de tumores

odontogênicos sendo 20 espécimes de ameloblastomas sólidos/multicísticos e 20 espécimes de

TOCs, de acordo com a última classificação da OMS (BARNES et al., 2005).

4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA

4.5.1 Critérios de inclusão

Foram incluídos na amostra os espécimes de ameloblastomas e TOCs que exibiam

características histológicas bem definidas pertinentes a cada lesão e que exibissem epitélio e

mesênquima suficiente para o estudo imuno-histoquímico.

46

4.5.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos do estudo os espécimes com material insuficiente para análise imuno-

histoquímica.

Sendo assim, em nosso estudo foram excluídos dois casos de TOC corados,

respectivamente, pela MMP-13 e TIMP-1.

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO

Para o estudo morfológico, examinou-se sob microscopia de luz as lâminas

confeccionadas e arquivadas no Laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia

Oral da UFRN, previamente submetidas a cortes histológicos de 5μm de espessura e coradas

pela técnica de rotina da hematoxilina e eosina (H.E). Aspectos referentes à presença dos

componentes epiteliais e mesenquimais foram observados para seleção e composição da

amostra.

4.7 MÉTODO IMUNO-HISTOQUÍMICO

Toda a amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi

submetida a cortes histológicos de 3 µm de espessura que, foram estendidos em lâminas de

vidro previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo a base de Organosilano

(3-aminopropyltrietroxisilano, Sigma Chemical CO, USA). Esses cortes histológicos foram

corados pelo método da estreptoavidina-biotina (streptavidin-biotin complex, SABC)

utilizando-se os anticorpos anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-TIMP-1 (Quadro 1).

Quadro 1. Especificações dos anticorpos utilizados na pesquisa. Natal-RN, 2014.

*Novocastra Laboratories LTDA; ** NeoMarkers, Fremont, CA, USA; ***EMD Millipore Corp., Billerica, MA.

Especificidade e

Clone Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

MMP-9 (15W2) Novocastra* 1:80 Citrato pH 6,0 Overnight

MMP-13 (3533-100) Neo Markers** 1:250 Citrato Pascal 60’

TIMP-1 (102D1) Millipore*** 1:50 EDTA pH 8,0 em Pascal 60’

47

4.7.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico

A técnica utilizada seguiu o seguinte protocolo:

Desparafinização – realizada por meio de 2 banhos em xilol, sendo o primeiro em

temperatura de 60ºC durante 30 minutos e o segundo em temperatura ambiente durante

20 minutos;

Reidratação em banhos de etanóis com concentrações decrescentes:

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Álcool etílico 95 GL (5 minutos);

Álcool etílico 80 GL (5 minutos).

Imersão em solução de hidróxido de amônia a 10% por 10 minutos, com a finalidade de

remoção do pigmento formólico;

Lavagem do material em água corrente por 10 minutos e duas passagens por agua

destilada deionizada;

Recuperação antigênica de acordo com as especificações sugeridas pelo fabricante de

cada anticorpo;

Passagem em água corrente durante 10 minutos;

Imersão em água destilada por 2 vezes, com tempo de 5 minutos cada;

Duas incubações dos cortes, durante 15 minutos cada, em solução de peroxido de

hidrogênio a 10 volumes;

Lavagem em água corrente durante 10 minutos;

Duas imersões em água destilada, com tempo de 5 minutos cada;

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCI (pH 7,4) por 5 minutos

cada;

Incubação dos cortes com os anticorpos primários diluídos em preparado com albumina

bovina (BSA) a 1% (a diluição e o tempo de incubação serão realizados de acordo com

as especificações sugeridas pelo fabricante de cada anticorpo);

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCI (pH 7.4) por 5 minutos

cada;

Incubação como o anticorpo secundário (Biotinylated link universal – DAKO) diluído

em tampão TRIS-HCI (pH 7.4) por 5 minutos cada;

48

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCI (pH 7.4) por 5 minutos

cada;

Incubação com o complexo estreptavidina-biotina (Dakocytomation LSAB + System-

HRP, Dakocytomation, A/S, Glostrup, Dinamarca), diluído em tampão TRIS-HCI (pH

7.4), durante 30 minutos à temperatura ambiente;

Lavagem com TRIS-HCI (pH 7.4);

Incubação em duas trocas de TRIS-HCI (pH 7.4) por 5 minutos cada;

Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (DAB), durante 3 minutos, diluída

em TRIS-HCI (pH 7.4) e ativada pelo peroxido de hidrogênio a 10 volumes, em câmara

escura;

Lavagem em água corrente e água destilada durante 10 minutos cada;

Contra-coloração utilizando hematoxilina de Mayer durante 10 minutos;

Desidratação em série de etanóis com concentrações ascendentes:



Álcool etílico absoluto I (3 minutos);

Álcool etílico absoluto II (3 minutos);

Álcool etílico absoluto III (3 minutos).

Imersão em xilol I (5 minutos);

Imersão em xilol II (5 minutos);

Montagem em resina Permount para observação ao microscópio de luz.

4.7.2 Análise imuno-histoquímica

O parâmetro para análise imuno-histoquímica dos anticorpos em todos os espécimes

incluídos na amostra consistiu na positividade da marcação, sendo consideradas positivas as

células que exibiram coloração acastanhada, independentemente de sua intensidade. As células

imunorreativas foram analisadas quantitativamente por um observador previamente calibrado.

A contagem das células foi realizada sob microscopia de luz, em dez campos histológicos

representativos e consecutivos, num aumento final de 400X. Foram analisados um total de 20

campos histológicos diferentes, sendo 10 campos no componente epitelial e 10 no mesênquima.

A imagem de cada campo foi congelada através de fotografia obtida com fotomicroscópio

Olympus com câmera digital de alta resolução acoplada a um microcomputador para o qual as

imagens foram transferidas utilizando-se o sistema Olympus Master versão 1.41 EX. As células

49

imunomarcadas foram contadas com a utilização do software ImageJ (ImageJ para Windows,

versão 1.47, 64-bit Java: Wayne Rasband, National Innstitute of Health, USA) sendo calculado,

então, o número médio de células positivas e negativas por campo em cada caso. Esses números

foram utilizados para o cálculo da razão entre os diferentes fatores ativadores de osteólise ou

inibidores de osteólise, definindo, então, a expressão predominante em cada caso e em cada

grupo de tumor estudado, classificando-os em escores de acordo com o metodologia adaptada

proposta por Moraes et al. (2011) (tabela 1).

Tabela 1. Sistema de escore para a imunoexpressão das MMPs -9 e -13 e TIMP-1.

Escore Padrão de imunoexpressão Classificação

MMP-9, MMP-13 e

TIMP-1

0 <10% de células positivas 0 ou expressão ausente

1 11 – 25% de células positivas Expressão fraca

2 26 – 75% de células positivas Expressão moderada

3 >76% de células positivas Expressão forte

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Após a coleta dos dados, os mesmos foram digitados em planilha eletrônica Excel

(Microsoft Office 2013® para Windows) e, posteriormente, exportados para o programa

estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 20.0, no qual foi, à

princípio, realizada a análise descritiva dos dados e, em seguida, os testes estatísticos

pertinentes, descritos abaixo.

Para comparar os escores de imunoexpressão de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no epitélio

e mesênquima com o tipo de lesão (TOC e Ameloblastoma) foi realizado o teste não-

paramétrico de Mann-Whitney. Para análise da razão entre os escores de imunomarcação de

MMP-9 e TIMP-1, como também de MMP-13 e TIMP-1, no epitélio e mesênquima dos TOCs

e Ameloblastomas utilizou-se o Wilcoxon signed rank test.

Para todos os testes estatísticos utilizados foi estabelecido o nível de significância de

5% (p ≤ 0,05).

51

5 RESULTADOS

5.1 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

5.1.1 Análise descritiva da expressão de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1

A presente amostra foi intencional e composta por 20 casos de ameloblastomas do tipo

sólido/multicístico e 20 casos de TOC. Todos os casos estudados apresentaram

imunorreatividade para as MMP-9 e -13 e TIMP-1. A expressão dessas proteínas foi

evidenciada pela marcação citoplasmática das células epiteliais e mesenquimais (fibroblastos,

células inflamatórias e endoteliais). Verificou-se que o padrão de marcação mais evidente nos

casos de ameloblastomas se localizava na periferia das ilhas epiteliais e em células inflamatórias

e endoteliais do estroma, enquanto nos casos de TOC, observou-se maior imunoexpressão em

toda a extensão do epitélio, porém, quando não apresentou imunorreatividade, esta foi menos

evidente nas células da camada basal. No mesênquima, o padrão de marcação foi bem

distribuído entre as células (fibroblastos, inflamatórias e endoteliais).

A avaliação do percentual dos escores de células que apresentaram imunorreação aos

anticorpos anti-MMP-9 e -13 e anti-TIMP-1 no tecido epitelial mostrou uma maior expressão

da MMP-9 nos TOCs, enquanto uma maior expressão da MMP-13 foi observada nos

ameloblastomas. Em ambas as lesões o TIMP-1 se encontrou marcadamente expresso no

epitélio (Figura 3).

Especificamente para a expressão da MMP-9 no epitélio, os TOCs revelaram uma maior

frequência do escore 3 (n=18; 90%), seguido do escore 2 (n=2; 10%). Nos casos de

ameloblastomas, constatou-se também o predomínio do escore 3 (n=16; 80%), seguido do

escore 2 (n=4; 20%). Adicionalmente, a expressão da MMP-13 no epitélio nos casos de TOCs

revelou semelhanças quanto à prevalência de expressão do escore 3 (n=14; 73,68%), seguido

do escore 2 (n=5; 26,31%), fato que também foi observado nos ameloblastomas, que exibiram

na grande maioria escore 3 (n=19; 95%), seguido do escore 2 (n=1; 5%). Em relação à

imunoexpressão do TIMP-1 no epitélio das lesões, no grupo dos TOCs, a maioria dos casos foi

classificada como escore 3 (n=12; 63,16%), seguido do escore 2 (n=7; 36,84%). Os

ameloblastomas exibiram predomínio do escore 3 em todos os casos (n=20, 100%).

52

Figura 3. Distribuição dos escores de imunomarcação para MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no epitélio dos

TOC e Ameloblastomas. Natal – RN, 2014.

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.

Legenda: TOC, tumor odontogênico ceratocístico; Amelo, ameloblastoma.

A análise dos escores de expressão de MMP-9, -13 e TIMP-1 no mesênquima mostrou

uma maior expressão da MMP-9 nos TOCs quando comparados aos ameloblastomas, enquanto

uma maior expressão da MMP-13 foi observada nos ameloblastomas. Com relação ao TIMP-

1, observou-se marcada expressão em ambas as lesões (Figura 4).

Em relação à expressão da MMP-9 no mesênquima observou-se uma predominância de

escore 3 (n=17; 85%), seguido do escore 2 (n=3; 15%) nos casos de TOCs. O grupo dos

ameloblastomas exibiu uma predominância também do escore 3 (n=15; 75%), seguido dos

escores 2 (n=4; 20%) e 1 (n=1; 5%). A expressão da MMP-13 no mesênquima dos TOCs

demonstrou que a maioria dos casos foi classificada como escore 3 (n=10; 52,63), seguido do

escore 2 (n=9; 47,37%). Nos casos de ameloblastomas, constatou-se predomínio do escore 3

(n=17; 85%) seguido do escore 2 (n=3; 15%). Por fim, verificou-se escore 3 para a expressão

do TIMP-1 no mesênquima de todos os casos, tanto no grupo de TOC (100%) quanto no de

ameloblastoma (95%).

10

2026,3

5

36,8

0

90

80

73,7

95

63,2

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TOC Amelo TOC Amelo TOC Amelo

MMP-9 MMP-13 TIMP-1

Escore 0 Escore 1 Escore 2 Escore 3

53

Figura 4. Distribuição dos escores de imunomarcação para MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no mesênquima

dos TOC e Ameloblastomas. Natal/RN-2014.


Legenda: TOC, tumor odontogênico ceratocístico; Amelo, ameloblastoma

5.1.2 Resultados estatísticos

Ao comparar as medianas dos escores dos TOC e ameloblastomas para MMP-9 e -13,

não se observou diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à

imunoexpressão dessas proteínas no epitélio das lesões (p=0,382 e p=0,069, respectivamente).

Já em relação ao TIMP-1 observou-se diferença estatisticamente significativa entre os grupos

de lesões (p=0,003), onde analisou-se uma maior participação do TIMP-1 no epitélio dos

ameloblastomas (Tabela 2).

Tabela 2. Grupo de tumor, tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos

postos e significância estatística para os escores de imunoexpressão de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no

epitélio. Natal, RN – 2014.



(+): Teste Mann-Whitney.

* Diferença significante a 5,0%. ** Não foi possível a realização dos testes pois não houve variabilidade da amostra.

0 0 0 0 05

05

0 0 0 0

1520

47,37

15

0 0

85

75

52,63

85

100 95

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TOC Amelo TOC Amelo TOC Amelo

MMP-9 MMP-13 TIMP-1

Escore 0 Escore 1 Escore 2 Escore 3

Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos

postos

Soma dos

Postos U p(+)

MMP-9 TOC 20 3,00 3,00 – 3,00 21,50 430,00

180,00 0,382 Amelo 20 3,00 3,00 – 3,00 19,50 390,00

MMP-13 TOC 19 3,00 2,00 – 3,00 17,87 339,50

149,50 0,069 Amelo 20 3,00 3,00 – 3,00 22,03 440,50

TIMP-1 TOC 19 3,00 2,00 – 3,00

** Amelo 20 3,00 3,00 – 3,00

54

A análise da mediana dos escores de expressão da MMP-13 por meio do teste não-

paramétrico de Mann-Whitney, demonstrou diferença estatisticamente significativa entre os

grupos de lesões no mesênquima tumoral (p=0,031), em que a maior concentração de MMP-13

foi observada no mesênquima dos ameloblastomas. Além disso, foi observada ausência de

diferença estatisticamente significativa para os marcadores MMP-9 e TIMP-1 entre os dois

grupos de lesão (Tabela 3).

Tabela 3. Grupo de tumor, tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos

postos e significância estatística para os escores de imunoexpressão de MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no

mesênquima dos TOCs e Ameloblastomas. Natal, RN – 2014.




*Diferença significante a 5,0%.

** Não foi possível a realização dos testes pois não houve variabilidade da amostra.

Ao avaliar a razão entre os escores de imunomarcação de TIMP-1 e MMP-9 no epitélio

dos TOCs, a fim de se investigar expressão predominante de alguma dessas proteínas, não se

observou diferença significante (p=0,096). Já nos ameloblastomas constatou-se diferença

estatisticamente significativa (p=0,046), onde a maioria dos casos (80%) apresentou

similaridade de escores (Tabela 4).

Quando foi considerada a razão entre os escores de expressão de TIMP-1 e MMP-9 no

mesênquima dos TOCs e dos ameloblastomas, não demonstrou-se diferença estatística

significante (p=0,083 e p=0,408, respectivamente), uma vez que em ambas as lesões a maioria

dos casos mostrou escores iguais para TIMP-1 e MMP-9 (Tabela 4).

Tabela 4. Distribuição dos casos em relação aos postos de escores de imunomarcação para o TIMP-1 e

MMP-9 no epitélio e no mesênquima dos TOCs e Ameloblastomas. Natal, RN – 2014.

Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos

postos

Soma dos

Postos U p(+)

MMP-9 TOC 20 3,00 3,00 – 3,00 21,58 431,50

178,50 0,403 Amelo 20 3,00 2,75 – 3,00 19,43 388,50

MMP-13 TOC 19 2,00 2,00 – 3,00 16,76 318,50

128,50 0,031* Amelo 20 3,00 3,00 – 3,00 23,08 461,50

TIMP-1 TOC 19 3,00 3,00 – 3,00

** Amelo 20 3,00 3,00 – 3,00

Tecido Lesão TIMP-1<MMP-9 TIMP-1>MMP-9 TIMP-1=MMP-9 p(+)

Epitélio TOC 7 (36,84%) 2 (10,53%) 10 (52,63%) 0,096

Amelo 0 (0,00%) 4 (20,00%) 16 (80,00%) 0,046*

Mesênquima TOC 0 (0,00%) 3 (15,79%) 16 (84,21%) 0,083

Amelo 1 (5,00%) 4 (20,00%) 15 (75,00%) 0,408





55

A avaliação da razão entre os escores de imunomarcação do TIMP-1 e da MMP-13 no

epitélio dos TOCs, assim como no epitélio dos ameloblastomas, revelou não existir diferença

estatisticamente significativa (p=0,480; p=0,317), sendo observado que 57,89% dos casos de

TOC e 95,00% dos ameloblastomas apresentaram similaridade de escores (Tabela 5).

O cálculo da razão entre os escores de imunomarcação do TIMP-1 e MMP-13 no

mesênquima dos TOC, mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0,003), onde

52,63% dos TOC exibiram similaridade de escores. Com relação aos ameloblastomas, 80% dos

casos exibiram similaridade de escores para a expressão de TIMP-1=MMP-13, no entanto este

resultado não exibiu significância estatística (p=0,705) (Tabela 5).

Tabela 5. Distribuição dos casos em relação aos postos de escores de imunomarcação para o TIMP-1 e

MMP-13 no epitélio e no mesênquima dos TOC e Ameloblastomas. Natal, RN – 2014.



(+): Teste Wilcoxon.


Tecido Lesão TIMP-1<MMP-13 TIMP-1>MMP-13 TIMP-1 = MMP-13 p(+)

Epitélio TOC 5 (26,31%) 3 (15,79%) 11 (57,89%) 0,480

Amelo 0 (0,00%) 1 (5,00%) 19 (95,00%) 0,317

Mesênquima TOC 0 (0,00%) 9 (47,37%) 10 (52,63%) 0,003*

Amelo 1 (5,00%) 3 (15,00%) 16 (80,00%) 0,705

60

6 DISCUSSÃO

O ameloblastoma e o tumor odontogênico ceratocístico (TOC) são lesões que, em

virtude de seu comportamento biológico potencialmente agressivo, alto poder de destruição

local e taxas relativamente elevadas de recidiva, representam alvos de diversos estudos em torno

das possíveis razões para esse desfecho.

Nesse contexto, muitos autores investigam, através da técnica de imuno-histoquímica,

os possíveis mecanismos que justifiquem o comportamento biológico expansivo e infiltrativo

local dessas lesões, principalmente do ameloblastoma. Estudos têm demonstrado que tais lesões

apresentam maior expressão de fatores de crescimento que outras lesões de natureza

odontogênica tais como EGF e TGF-α (SIQUEIRA et al., 2010). Kubota e Shirasuna (2007)

investigaram o papel exercido pela IL-1 em favorecer o crescimento lesional. A função da

endoglina (CD105) e o aumento da angiogênese e do fator nuclear κB também foram alvos de

estudos como possíveis razões para esse distinto comportamento (SANTOS et al., 2011), bem

como o papel do RANKL no processo de reabsorção óssea (QIAN; HUANG, 2010). Outros

estudos mostraram, ainda, que estes tumores apresentam alterações na expressão de genes

supressores de tumor (p53) e de proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como a MDM2,

p14ARF e Ki-67 (SHEAR, 2002; MEER et al., 2003; KUMAMOTO et al., 2004, KICHI et al.,

2005). Proteínas anti-apoptóticas (bcl-2) e possíveis alterações nas moléculas de adesão (α2β1,

α3β1 e α5β1) presentes nesses tumores também foram objetos de estudos (KICHI et al., 2005;

ANDRADE et al., 2008).

Em adição, sugere-se que interações intermoleculares entre as células tumorais e a MEC

circundante contribuem para o comportamento biológico distinto dos tumores antes citados e

as demais lesões odontogênicas, influenciando seu crescimento, infiltração local e

agressividade. Estudos têm mostrado que a expressão das MMPs tem sido encontrada em níveis

elevados nos ameloblastomas e TOCs quando comparados a outras lesões também de origem

odontogênica, porém com curso clínico mais indolente (LEONARDI et al., 2010; QIAN;

HUANG, 2010; HENRIQUES et al., 2011; SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2012; ANNE

et al., 2013). Face ao exposto, o presente estudo se propôs a analisar a imunoexpressão das

MMP-9 e -13 e seu inibidor tecidual intrínseco, o TIMP-1, em uma série de casos de

ameloblastomas e TOC a fim de contribuir para uma maior compreensão da participação dessas

proteínas no desenvolvimento e comportamento biológico dessas lesões.

A análise da imunomarcação dessas proteínas foi realizada no componente epitelial e

mesenquimal de uma série de casos de ameloblastomas sólidos e TOCs e demonstrou níveis

61

marcadamente expressos em todos os casos. A expressão da MMP-9 no componente epitelial

dos TOCs e ameloblastomas demonstrou elevados índices de imunorreatividade, com

predominância do escore 3 em 90% e 80% dos casos, respectivamente, corroborando a ideia de

que níveis elevados destas proteinases estão presentes no parênquima de lesões consideradas

agressivas. Estudos anteriores sobre a expressão da MMP-9 no epitélio de TOCs,

ameloblastomas, cistos radiculares (CR) e cistos dentígeros (CD) (QIAN; HUANG, 2010;

HENRIQUES et al., 2011; SANTOS et al., 2011; ANNE et al., 2013), tumores odontogênicos

císticos calcificantes (TOCC) (SIQUEIRA et al., 2009; RIBEIRO et al., 2012) e tumor

odontogênico adenomatóide (TOA) (RIBEIRO et al., 2009) demonstraram percentuais médios

de células imunopositivas elevados. Estes achados sugerem que o crescimento dessas lesões é

influenciado pela alta produção de MMPs.

Resultados semelhantes aos da presente pesquisa foram observados em estudos prévios.

De acordo com o estudo de Henriques et al. (2011), uma expressão mais elevada de MMP-9 foi

encontrada no epitélio dos TOCs e ameloblastomas, quando comparados à expressão em CD e

CR. Sendo esta metaloproteinase responsável pela degradação do colágeno tipo IV, o principal

componente da membrana basal, estes autores sugerem que esse fato pode contribuir para os

comportamentos biológicos distintamente mais agressivos das duas primeiras lesões quando

comparadas ao CD e CR.

Santos et al. (2011) encontraram uma maior expressão de MMP-9 nas células epiteliais

em 90% dos casos de TOCs em relação aos casos de CD e CR, demonstrando uma maior

participação desta MMP nos TOCs do que nas outras lesões odontogênicas. Este resultado é

compatível com o nosso estudo, onde níveis elevados de MMP-9 também foram encontrados

no tecido epitelial dos casos de TOCs. Concordando com nosso estudo, Ribeiro et al. (2012)

observaram uma forte expressão da MMP-9 no epitélio dos TOCs presentes em mais de 60%

das células.

A imunomarcação marcante da MMP-9 nas lesões avaliadas sugere sua participação na

degradação da MEC circundante, favorecendo o crescimento e expansão desses tumores,

refletindo no comportamento biológico distinto dessas lesões.

No tocante à expressão de MMP-13 nos tumores odontogênicos, poucos estudos são

encontrados na literatura, porém seu papel na progressão de outros tumores tem sido bastante

relatado, tais como em câncer de cabeça e pescoço, de mama, gástrico, condrossarcoma,

coloretal e carcinomas vulvares (FREIJE et al., 1994; JOHANSSON et al., 1997; JOHANSSON

et al., 1999; PENDÁS et al., 2000; DEL CASAR LIZCANO et al., 2003; KRECICKI et al.,

62

2003; CULHACI et al., 2004; ROEB et al., 2004; CORTE et al., 2005; LUUKKAA et al., 2006;

KUDO et al., 2012).

Leonardi et al. (2010) compararam a expressão da MMP-13 nos TOCs esporádicos e

naqueles associados à síndrome do carcinoma nevóide de células basais (SCNCB) e,

encontraram uma maior expressão de MMP-13 no epitélio dos casos sindrômicos quando

comparados aos esporádicos, concluindo que a elevada expressão nos casos sindrômicos

contribui para a maior agressividade destes tumores nesse caso em específico.

No entanto, os TOCs esporádicos, embora considerados menos agressivos que os

sindrômicos, exibiram marcante imunoexpressão da MMP-13. Esses resultados são condizentes

aos casos de TOCs que utilizamos em nosso estudo (também esporádicos), onde encontramos

uma expressão elevada da MMP-13 no epitélio (escore 3) na grande maioria dos casos,

sugerindo a participação desta proteína no parênquima tumoral.

Resultados semelhantes aos encontrados em nossa amostra estão descritos no trabalho

de Wahlgren et al. (2003). Estes autores também observaram níveis elevados de expressão da

MMP-13 no epitélio dos TOCs, onde 89% de seus 20 casos mostraram positividade elevada

para esta proteína, sendo observada a presença de imunorreação também na zona de membrana

basal. Adicionalmente, através da técnica de hibridização in situ, estes autores encontraram a

presença de mRNA MMP-13 em 100% dos casos nas células epiteliais, sugerindo que a

presença da MMP-13 no epitélio participa na regulação da proliferação celular focal, maturação

e migração dessas células através do tecido conjuntivo circunjacente.

No que concerne à expressão da MMP-13 em ameloblastomas, ao avaliarmos o

percentual dos escores de células imunorreativas no epitélio, encontramos sua presença em

todos os casos da amostra analisada, com 95% dos casos demonstrando uma forte

imunoexpressão (escore 3). Resultados semelhantes foram encontrados por Santos (2013), o

qual pesquisou sobre a participação desta MMP em lesões odontogênicas epiteliais e confirmou

a presença de uma forte expressão nas células de ameloblastomas sólidos.

Acreditamos que a agressividade dessas lesões não se deve apenas ao comportamento e

proliferação do componente epitelial, mas também ao tecido conjuntivo adjacente, que

contribui para o crescimento e poder infiltrativo desses tumores, embasado em pesquisas como

as de Siqueira et al. (2009) que demonstraram a positividade para MMP-9 nas células do

estroma lesional em mais de 75% dos casos de ameloblastomas e de Henriques et al. (2011)

que encontraram um alta imunorreatividade para MMP-9 no mesênquima em 70% dos casos

de ameloblastomas.

63

Sendo assim, ao analisarmos a imunoexpressão das MMPs no mesênquima lesional, no

que diz respeito à MMP-9, a maioria dos TOCs (85%) e dos ameloblastomas (75%)

demonstraram imunorreatividade para esta proteína em mais de 76% das células (escore 3).

A presença da MMP-9 no mesênquima dos TOCs também foi reportada por Santos et

al. (2011), no entanto uma expressão elevada dessa MMP foi observada em apenas 45% dos

casos, apresentando, a maioria dos casos, uma imunorreação de fraca a moderada. Esses

resultados diferem dos encontrados em nossa pesquisa, já que foi observada escore 3 de

expressão da MMP-9 em 85% dos casos. Nos estudos supracitados, os autores consideraram

imunoexpressão forte para aqueles casos que apresentaram imunomarcação em mais de 50%

das células.

Vale destacar, ainda, que os percentuais de expressão da MMP-9 no mesênquima dos

TOCs foram bastante próximos aos constatados no epitélio. Estes achados denotam a expressão

significativa da MMP-9 no componente mesenquimal dos TOCs, confirmando o envolvimento

dessa proteína no estroma tumoral na modulação do processo de reabsorção óssea associada a

essas lesões.

No presente trabalho, a expressão da MMP-13 no mesênquima foi observada em mais

de 76% das células (escore 3), em 52,63% dos casos de TOC, tendo uma participação de maior

destaque nos ameloblastomas, já que a maioria dos casos de nossa amostra (85%) revelou

predomínio de escore 3 de expressão. Adicionalmente, quando comparamos a expressão da

MMP-13 com a da MMP-9 no mesênquima dos ameloblastomas, constatamos, igualmente, a

maior participação da MMP-13.

Em relação à expressão da MMP-13 em mesênquima dos TOCs, no estudo de Leonardi

et al. (2010) observou-se predominância da expressão dessa MMP no mesênquima dos TOCs

associados à SCNCB, enquanto nos tumores não-sindrômicos, a imunoexpressão da MMP-13

se mostrou quase ausente, diferente do que observamos no presente trabalho, em que a grande

maioria dos casos de TOCs (esporádicos) revelou expressão elevada da MMP-13 no

mesênquima. Diferenças entre as metodologias de classificação de escore de porcentagem de

imunomarcação empregadas no presente estudo com as utilizadas por estes autores, uma vez

que eles classificaram como expressão forte aqueles casos em que a imunorreação foi observada

em mais de 50% das células, podem justificar essas discrepâncias. Contudo, para estes autores,

o comportamento biológico destas lesões está relacionado não só ao tecido epitelial, mas

também ao tecido mesenquimal, afirmando que os TOCs, especialmente os sindrômicos, podem

ocorrer devido à persistência dos fatores moleculares que promovem a MMP-13, inferindo ser

64

esta proteína o principal mediador de destruição óssea nesses tumores. Wahlgren et al. (2003)

também concordam que o mesênquima da lesão pode influenciar no seu comportamento

biológico, tendo confirmada a presença significativa de expressão de MMP-13 nas células do

mesênquima adjacente (fibroblastos e células plasmáticas).

O crescimento e expansão tumoral é um processo em que as células neoplásicas

destroem e infiltram a MEC circunjacente, onde sua degradação se dá pela ação das MMPs,

que sofrem modulação pela secreção endógena de seus inibidores, os TIMPs. Segundo Qian e

Huang (2010), o processo de reabsorção óssea pode ser inibida pelo TIMP-1.

No presente trabalho, ao avaliarmos a expressão do TIMP-1, observamos uma

participação marcadamente expressa em ambas as lesões, não existindo diferenças entre a

expressão dela associada às de MMP-9 e -13. No epitélio dos TOCs observou-se escore 3 de

expressão para TIMP-1 em 63,2% dos casos, enquanto no epitélio dos ameloblastomas o escore

3 foi verificado em 100% dos casos.

Uma vez sabido que as MMPs podem ter sua ação diminuída na presença de seus

inibidores, como os TIMPs, buscamos analisar a razão entre esses marcadores, visando

identificar qual estímulo predominava, ou seja, constatar se a ação inibitória do TIMP-1

sobrepunha-se aos estímulos destrutivos das MMPs. Dessa forma, observou-se que a razão de

imunomarcação entre o TIMP-1 e a MMP-9 no epitélio, tanto dos TOCs quanto dos

ameloblastomas, revelou similaridade de expressão na maioria dos casos, isto é, em poucos

casos foi observada uma expressão superior de uma proteína em relação à outra.

Ao analisarmos o epitélio dos TOCs, expressão similar entre essas duas proteínas

(TIMP-1=MMP-9) foi observada em 52,63% dos casos, estando a expressão da MMP-9

superior ao TIMP-1 em apenas 36,8% dos casos.

Nossos resultados contrastam ao observado no estudo de Ribeiro et al. (2012) em que

foi pesquisada a expressão de MMPs e TIMPs no epitélio dos TOC e TOCC, sendo observado

que a MMP-9 se mostrou presente em mais de 60% das células epiteliais, enquanto a expressão

de TIMP-1 foi verificada em menos de 20% dessas células. Esses autores estudaram, ainda, a

expressão do TIMP-2 nessas lesões e, observaram uma participação superior desta proteína

comparado ao TIMP-1, estando o TIMP-2 presente igualmente à MMP-9. A expressão das

MMP-2, -9 e TIMP-1, -2 foi vista em menos de 40% das células de TOCC, concluindo que o

comportamento clínico dos TOC pode ser influenciado por proteínas específicas, devido à

grande participação da MMP-9 e TIMP-2 nos mecanismos moleculares e, consequentemente,

no comportamento biológico dos TOCs (RIBEIRO et al., 2012).

65

Siqueira et al. (2010), ao pesquisarem sobre o papel regulador das MMPs e TIMPs no

comportamento biológico dos ameloblastomas, observaram uma imunoexpressão de TIMP-1

em menos de 60% das células epiteliais, enquanto o TIMP-2 foi encontrado em mais de 90%

das células. Esses autores observaram que a expressão do TIMP-2 acompanhou a expressão da

MMP-9 no parênquima tumoral. Nossos resultados contrastam a estes achados, uma vez que

uma expressão similar de TIMP-1 e MMP-9 foi constatada no epitélio dos ameloblastomas

(80%).

Ao avaliarmos a expressão do TIMP-1 e MMP-9 no mesênquima tumoral das lesões

que compõem nossa amostra, similaridade de expressão foi observada na grande maioria dos

casos de TOC e ameloblastomas (TIMP-1=MMP-9 em 84,21% e 75% dos casos

respectivamente). Siqueira et al. (2010) relataram que a expressão do TIMP-1 foi observada no

mesênquima em menos de 40% dos casos de ameloblastomas, enquanto uma maior participação

do TIMP-2 foi demonstrada (>80%), sendo essa expressão similar à da MMP-9 (>80%). Estes

autores sugerem, no entanto, que o TIMP-2, associado aos fatores de crescimento EGF e TGF-

α, agem juntos na regulação da proliferação dos ameloblastomas, e assumem que um receptor

comum está envolvido nestes processos, tal como o EGFR.

De forma semelhante ao que foi observado entre as expressões do TIMP-1 e MMP-9,

constatamos, ao avaliar a razão de imunoexpressão da MMP-13 e do TIMP-1, independência

de imunoexpressão entre estas proteínas tanto no epitélio quanto no mesênquima das lesões

estudadas. A maioria dos casos apresentou similaridade entre a razão dos escores de

imunoexpressão, sugerindo forte participação destas proteínas no processo de remodelação da

MEC, reabsorção óssea e crescimento dos tumores. Esta relação nos leva a sugerir que a

expressão das MMPs ocorre por mecanismos independentes do envolvimento da produção de

TIMP-1.

Os TIMPs são originalmente caracterizados pela habilidade de inibir a atividade das

MMPs, porém evidências recentes indicam que eles possuem efeitos biológicos adicionais, tais

como regulação do crescimento celular, migração e apoptose (STETLER-STEVENSON, 2008;

SIQUEIRA et al., 2010).

No entanto, opiniões divididas em relação ao papel estabelecido das MMPs e TIMPs

enquanto principais moduladores da degradação da MEC e reabsorção óssea são encontradas

na literatura. Fuller, Kirsten e Chambers (2007) e Qian e Huang (2010) acreditam que a MMP-

9 pode não ser uma das principais proteases na atividade osteoclástica em ameloblastomas.

Qian e Huang (2010) estudaram a MMP-9 in vitro em coculturas de células de ameloblastomas

66

e osteoclastos, avaliando também a participação do RANKL e verificaram maior participação

desta última proteína, enquanto que a MMP-9 pareceu não participar da degradação da MEC

causada pelo ameloblastoma, ou pelo menos, não foi a principal protease. Além disso, o TIMP-

1 não mostrou efeito inibitório significativo na reabsorção óssea causada pelos osteoclastos.

Esse achado pode justificar, em parte, nossos resultados, que indicaram forte expressão do

TIMP-1 e das MMPs de maneira similar nos tumores estudados, mesmo sabendo-se do elevado

poder de destruição local verificado por extensas áreas de reabsorção óssea que eles apresentam

em sua evolução. Porém, é importante ressaltar que a metodologia aplicada por esses autores

foi diferente da nossa, uma vez que estudos in vitro nem sempre reproduzem as características

do microambiente tumoral no hospedeiro humano.

Nesse contexto, estudos apontam que outras células, tais como os miofibroblastos sejam

importantes na secreção da MMP-13 (LEDERLE et al., 2010) e em sua ativação (NIELSEN et

al., 2001; NIELSEN et al., 2008; SHI, WANG, TARBELL, 2011). Outras células como as

endoteliais, fibroblastos, osteoblastos e condrócitos também podem induzir a expressão da

MMP-13 (AQUINO et al., 2009). Adicionalmente, Santos (2013) confirmou a presença e

participação da produção da MMP-13 pelas células endoteliais e pelos fibroblastos no

comportamento biológico de lesões odontogênicas epiteliais, ora observadas marcadamente

expressa não só pela MMP-13, mas também pela MMP-9 e TIMP-1 nos casos estudados neste

trabalho.

Os resultados obtidos no presente estudo revelaram que as MMP-9 e -13 e os TIMPs

são proteínas que se mostram marcadamente presentes tanto no epitélio quanto no mesênquima

dos TOCs e ameloblastomas. Estes resultados, associados aos achados na literatura pertinente

em relação a outras lesões odontogênicas, suportam a ideia da importante participação dessas

proteínas nos processos de degradação da MEC, reabsorção óssea e progressão tumoral com

repercussão no comportamento biológico considerado mais agressivo e infiltrativo dessas

lesões, sobretudo dos ameloblastomas.

Diante dos achados da presente pesquisa, constatou-se a necessidade de estudos mais

aprofundados em relação à participação das MMPs, para que juntamente com este trabalho,

possamos compreender os mecanismos de degradação da MEC e sua função na expansão

tumoral, em especial a MMP-13, uma vez que escassos trabalhos são encontrados relacionando

essa MMP aos tumores odontogênicos.

68

7 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente estudo indicam que a forte imunorreatividade da

MMP-9, MMP-13 e TIMP-1, tanto no epitélio quanto no mesênquima dos ameloblastomas e

dos TOCs, reforçam a ideia do importante papel destas proteínas na remodelação da MEC

necessária à progressão tumoral, no entanto, as diferenças pontuais observadas na expressão de

algumas destas proteínas não são suficientes para sugerir diferenças no comportamento

biológico entre as lesões estudadas com base na expressão das mesmas.

70

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80

APÊNDICE A

Ficha para coleta quantitativa da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-TIMP-1 nos casos de

ameloblastomas e tumores odontogênicos ceratocísticos para células epiteliais e da cápsula/mesênquima por campo.

N° de Células por campo c1p c1n c2p c2n c3p c3n c4p c4n c5p c5n c6p c6n c7p c7n c8p c8n c9p c9n c10p c10n Percentual

N° do Caso

80

81

APÊNDICE B

Ficha para análise da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-TIMP-1 nos casos de ameloblastomas e

tumores odontogênicos ceratocísticos para células epiteliais e da cápsula/mesênquima por campo.

N° de Células por Campo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Total %

N° do Caso Positivas

Negativas


Negativas


Negativas


Negativas


Negativas


Negativas


Negativas


Negativas

81

82

APÊNDICE C

Ficha de avaliação da somatória de células com expressão imuno-histoquímica positiva para os

anticorpos anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-TIMP-1 nos casos de ameloblastomas e tumores

odontogênicos ceratocísticos nas células epiteliais e da cápsula/mesênquima e seus respectivos

escores.

Epitélio Mesênquima

N° do Caso Positivas Escore Positivas Escore

84

ANEXO

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE ... · por ter propiciado coisas em minha...

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