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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE TECNOLOGIA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO- SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI) JOSIANE MARÍLIA DO CARMO Rio de Janeiro 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE TECNOLOGIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI)
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO
Rio de Janeiro
2015
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI)
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do
Programa de Pós-graduação em Ciência de
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em
Ciência de Alimentos
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin
Co-orientador: Ana Carolina da S. Carvalho
Rio de Janeiro
2015
C287 Carmo, Josiane Marília do. Avaliação da contaminação por Staphylococcus aureus através de
técnicas moleculares e correlação com os aspectos higiênico-sanitários em
preparações de pescado cru (sushi e sashimi) / Josiane Marília do Carmo.
– Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2015.
87f. Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos, 2015.
1. Sushi e sahimi. 2. Reação em cadeia da polimerase. 3.
Staphylococcus aureus. I. Paschoalin, Vânia Margaret Flosi. (Orient.). II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa
de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos III. Título.
CDD: 664.001
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI)
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do
Programa de Pós-graduação em Ciência de
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em
Ciência de Alimentos
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin
Co-orientador: Ana Carolina Carvalho
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin
Instituto de Química - UFRJ
_____________________________________________
Prof. Dra. Daniela Sales Alviano
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes- UFRJ
_____________________________________________
Dra. Patrícia Ribeiro Pereira
Instituto de Química - UFRJ
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por me conceder consciência e discernimento ao desenvolver o
meu trabalho e por ser meu auxílio nos momentos difíceis.
Em especial ao meu noivo Ivan Lima, por sua compreensão pelo tempo ausente, por
tolerar meus estresses em determinados momentos desta pesquisa e principalmente por me
ensinar o que é uma verdadeira relação de parceria. Meu agradecimento com imenso carinho!
A todos os meus familiares e amigos pelas orações e apoio em todos os momentos.
Ao Instituto de Química e ao Programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos pela
oportunidade e suporte para minha formação profissional.
A equipe do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Profº Rafael Duarte, Karen
Machado, Rayane Charmon e Marlei Gomes, pela troca de experiências e toda colaboração para
o desenvolvimento dos experimentos deste estudo.
A Professora Vânia Paschoalin pela orientação e todos os recursos.
Aos amigos pesquisadores do projeto de pesquisa em segurança e higiene do pescado,
Claudius Cabral, Claudio Capella, e a minha Co-orientadora Ana Carolina Carvalho pelos
inúmeros “brainstorms”.
Aos demais integrantes do laboratório 545, em especial o professor Eduardo Mere e
Raquel Casaes, pelas dúvidas esclarecidas e contribuição com esse estudo.
A equipe de nutrição institucional do Hospital Universitário da UERJ, Samyra Kede,
Jacqueline Carvalho, Cinthia Souza, Vânia Magalhães e Débora de Jesus, pela colaboração e
coberturas na escala de trabalho.
A Roberta Cândido, minha “filha”, pela solidariedade e importante ajuda com as minhas
dificuldades de informática.
E as demais pessoas que por ventura eu não tenha citado aqui, mas que participaram com
igual importância deste período de minha formação, o meu muito obrigada!
Dedico este estudo a uma pessoa muito especial que chegou como um
presente divino e fez uma transformação em minha vida.
Ivan Lima, apesar da minha determinação, sem o seu apoio
não sei se esse objetivo seria concretizado.
"Você não pode mudar o vento, mas pode ajustar as velas do
barco para chegar onde quer."
Confúcio
RESUMO
Carmo, Josiane Marília do. Avaliação da contaminação por Staphylococcus aureus através de técnicas
moleculares e correlação com os aspectos higiênico-sanitários em preparações de pescado cru (sushi e
sashimi). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015.
A globalização tem contribuído para incorporação da culinária tradicional de diferentes culturas
no cotidiano da população brasileira, o que aliado aos benefícios nutricionais do pescado e a busca por
alimentos mais saudáveis tem contribuído com a popularização do hábito de ingerir pescado cru no país,
sobretudo na forma de sushi e sashimi. O pescado sem prévio tratamento térmico pode estar associado a
veiculação de microrganismo patogênicos, e comprometer a saúde do consumidor. O objetivo do presente
estudo foi avaliar a qualidade de preparações de sushi e sashimi quanto a presença de Staphylococcus
coagulase positiva comercializados em três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em
culinária nipônica. As condições higiênico-sanitárias destes estabelecimentos foram avaliadas, assim
como se os manipuladores eram portadores assintomáticos dos microrganismos. Foram utilizadas técnicas
de microbiologia convencional e ferramentas moleculares como a PCR, sequenciamento do gene 16S
rDNA e PFGE (eletroforese em campo pulsado). Também foi determinada a resistência antimicrobiana
dos isolados de S. aureus para pesquisar cepas resistentes à meticilina (MRSA). Um total de 31 amostras
de pescado e 06 amostras de manipuladores (cavidades nasofaringeana e orofaringeana e mãos) foi
coletado. 29% das amostras de alimentos apresentaram contagem elevada de Staphylococcus coagulase
positiva (SCP) em meio seletivo. Quinze isolados foram identificados como S. aureus, sendo 12 deles pelo
teste de PCR e 03 pelo sequenciamento do gene 16SrDNA. A relação clonal entre os isolados de pescado
e dos manipuladores foi analisada por PFGE, demonstrando que um dos manipuladores avaliados foi a
fonte de contaminação de preparações de pescado cru servidos naquele restaurante. Quanto aos demais
grupos bacterianos que foram isolados a partir das amostras de sushi e sashimi, houve prevalência de
membros da família Enterobacteriaceae (88%). Em relação às boas práticas de fabricação, apenas um dos
estabelecimentos apresentou percentual de conformidades superior a 76%. No presente estudo, foi
demonstrado que a qualidade microbiológica das preparações a base de pescado cru apresentaram
contaminação que parece estar relacionada à condições higiênico-sanitárias não satisfatórias.
Palavra-chave: Staphylococcus aureus, Sushi e sashimi, PCR, PFGE, Sequenciamento do gene 16SrDNA,
Boas Práticas de Fabricação.
ABSTRACT
Carmo, Josiane Marília do. Identificação de Staphylococcus aureus por técnicas moleculares e correlação
com os aspectos higiênico-sanitários em preparações a base de pescado cru (sushi e sashimi). Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015.
Globalization has contributed to the incorporation of traditional cuisine of different cultures in
everyday life of the population, combining the nutritional benefits of fish and the search for healthier
foods has contributed to the popularity of the habit of eating raw fish in the country, such as sushi and
sashimi. The raw fish consumption has been associated with transmission of pathogenic microorganisms
that can jeopardize consumers health. The aim of this study was to evaluate the quality of sushi and
sashimi preparations for the presence of coagulase positive Staphylococcus (SCP) marketed in three units
of restaurants form the same chain, do not specialize in Japanese food. The sanitary conditions of these
restaurants were evaluated including the evaluation of handlers as asymptomatic carriers of SCP. Raw fish
microbiota was studied by conventional microbiology and molecular tools as PCR, 16S rDNA partial
sequencing and pulse-field gel electrophoresis (PFGE). It was also determined the antimicrobial resistance
of S. aureus strains to methicillin (MRSA). A total of 31 samples from raw fish and 06 samples from
handlers (nasopharyngeal and oropharyngeal cavities and hands) were collected. 29% of food samples
showed high counts of Staphylococcus coagulase positive (SCP) in selective medium. Fifteen isolates
were identified as S. aureus, 12 of them by PCR and 03, by 16S rDNA sequencing. The relationship
between clonal isolates of fish and handlers was evaluated by PFGE, showing that one of the handlers was
the source of raw fish contamination served at the restaurant. Other bacteria species were isolated from
sushi and sashimi, with high prevalence (88%) of Enterobacteriaceae members. A compliance of 76% to
good manufacturing practices was reached by a single restaurant. A single restaurant showed compliance
superior to 76% to good manufacturing practices. In the present study, it was shown that the
microbiological quality of the raw fish contamination may be related to unsatisfactory sanitary conditions.
Keywords: Staphylococcus aureus, Sushi and Sashimi, PCR, PFGE, 16S rDNA sequencing,
Good Manufacturing Practices
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores mínimos e máximos em UFC/g, de Staphylococcus
coagulase positiva (SCP) encontradas em amostras de peixes, filés e
preparados (sushi e sashimi) de salmão, atum e namorado, coletados em três
restaurantes (R1, R2, R3) dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no
período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
42
Tabela 2. Análises microbiológicas (UFC/g), de Staphylococcus coagulase
positiva em amostras de filé e preparados (sushi e sashimi) de atum
(Thunnus sp.), coletados em três restaurantes dos municípios do Rio de
Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
43
Tabela 3. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de
Staphylococcus coagulase positiva em amostras de matéria-prima, filé e
preparados (sushi e sashimi) de namorado (Pseudopercis numda), coletados
em três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período
de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
43
Tabela 4. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de
Staphylococcus coagulase positiva em amostras de matéria-prima, filé e
preparados (sushi e sashimi) de salmão (Salmo salar), coletados em três
restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de
setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
44
Tabela 5. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores
quanto a presença de Staphylococcus coagulase positiva por estabelecimento
estudado, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014 (nos
municípios do Rio de Janeiro e Niterói).
45
Tabela 6. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores
quanto a presença de Staphylococcus coagulase positiva de nasofaringe,
orofaringe e mãos dos manipuladores de três restaurantes dos municípios do
Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de
2014.
45
Tabela 7. Identificação de isolados bacterianos por sequenciamento parcial
do 16S rDNA.
48
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Staphylococcus aureus - www.hivwebstudy.org
30
Figura 2. Identificação de S. aureus em amostras de preparados de peixe cru
e manipuladores de três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e
Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
46
Figura 3. Dendograma de distribuição dos perfis clonais e resistência a
antimicrobianos observados entre S. aureus isolados de preparações a base
de peixe cru (sashimi e shushi) e manipuladores em restaurantes (R1, R2 e
R3) dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de
2013 a fevereiro de 2014.
49
Figura 4. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do
estabelecimento R1 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC
216 - ANVISA.
51
Figura 5. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do
estabelecimento R2 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC
216 - ANVISA.
51
Figura 6. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do
estabelecimento R3 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC
216 - ANVISA.
52
Figura 7. Relação entre as amostras reprovadas quanto aos limites
estabelecidos pela RDC 12 – ANVISA e percentual de adequação das Boas
Práticas definidas pela RDC 216 – ANVISA.
53
LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS
DTA - Doença Transmitida por Alimento
BPF - Boas Práticas de Fabricação
APPCC - Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
MS – Ministério da Saúde
IDEC – Instituto de Defesa do Consumidor
MAPA – Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento
SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde
OMS – Organização Mundial de Saúde
ICMSF – International Commission on Microbiological Specifications for Foods
SCP – Sthaphylococcus Coagulase Positiva
PCR – Polymerase Chain Reaction
PFGE – Pulsed Field Gel Eletrophoresis
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina
TSA – Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos
CLSI - Clinical and Laboratorial Standarts Institute
UPGMA – Unweighteh Pais Group Method whith Arithmetic Mean
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
2 REVISÃO DE LITERATURA 17
2.1 Consumo de preparações a base de pescado cru – Culinária Japonesa 17
2.2 Vigilância Sanitária 17
2.3 Segurança dos Alimentos 19
2.4 Higiene do ambiente, equipamentos e utensílios 21
2.5 Manipuladores de alimentos 22
2.6 Importância do controle microbiológico nos alimentos 24
2.7 Pescado 26
2.8 Conservação do Pescado 26
2.9 Aspectos microbiológicos de pescados 27
2.10 Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP) 28
2.11 Staphylococcus aureus 30
2.12 Identificação de Staphylococcus aureus em alimentos 31
2.13 Resistência a antimicrobianos 32
3 JUSTIFICATIVA 35
4 OBJETIVOS 36
4.1 Objetivo geral 36
4.2 Objetivos específicos 36
5 MATERIAL E MÉTODO 37
5.1 Desenho experimental 37
5.2 Análise microbiológica e isolamento de SCP em preparados a base de peixe cru
(sushi e sashimi) e manipuladores 37
5.3 Testes de PCR para identificação dos isolados 37
5.4 Identificação dos isolados por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA 38
5.5 Comparação do perfil clonal de S. aureus por Pulsed Field Gel Electrophoresis
(PFGE) 39
5.6 Teste de suscetibilidade dos isolados a agentes antimicrobianos (TSA) 40
5.7 Avaliação dos restaurantes estudados quanto aos critérios de Boas Práticas na
Manipulação dos Alimentos 40
5.8 Análise de dados 40
5.9 Aspectos éticos 41
6 RESULTADOS 42
6.1 Análise microbiológica do pescado in natura, preparados a base de peixe cru
(sushi e sashimi) e manipuladores 42
6.2 Identificação dos microrganismos isolados por técnicas moleculares 46
6.2.1 Baseadas em PCR 46
6.2.2 Baseadas no sequenciamento parcial do gene 16S rDNA 45
6.3 Comparação do perfil clonal de S. aureus por PFGE 48
6.4 Teste de suscetibilidade a substâncias antimicrobianas (TSA) 50
6.5 Avaliação de critérios de Boas Práticas na Manipulação dos Alimentos 50
7 DISCUSSÃO 54
8 CONCLUSÕES 58
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59
ANEXOS
I - CHECKLIST PARA AVALIAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS EM SERVIÇOS DE
ALIMENTAÇÃO 68
II - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - 27º Congresso Brasileiro
de Microbiologia 79
III - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - CHEMRIO 2014,
Symposium
80
IV - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - 3ºI Seminário em
Inovação e Tecnologia na Área de Alimentos, SITA
81
V - APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: VII
Congresso Latino-Americano e XIII Congresso Brasileiro de Higienistas de
Alimentos.
82
15
1. INTRODUÇÃO
O perfil alimentar da população é influenciado por diversos aspectos, como a disponibilidade
dos alimentos, hábitos regionais e aspectos econômicos. No caso do Brasil, o hábito alimentar é
um reflexo dos padrões socioculturais introduzidos pela migração maciça de diferentes grupos
étnicos, resultando em diferenças em áreas ou regiões do país (DUTRA DE OLIVEIRA et al,
2002). No que tange à imigração, destaca-se a japonesa que tem promovido um enraizamento
muito crescente de seus costumes alimentares no cotidiano brasileiro, tanto considerando o
aumento do número de restaurantes especializados na culinária japonesa, como a presença de
alguns pratos típicos servidos em restaurantes não especializados. As lojas especializadas em
alimentos típicos da culinária japonesa, anteriormente restritas a regiões onde predominavam
imigrantes asiáticos, tornaram-se comuns, estando presentes em quase todos os shopping centers
dentro da categoria fast-food, existindo, até mesmo, lojas especializadas na modalidade de
entrega em domicílio - delivery (GERMANO & GERMANO, 2008).
Denomina-se sashimi qualquer alimento marítimo consumido cru, como peixes, mariscos e
camarões (ALCÂNTRA, 2009). Segundo Sikorski, Kolakowaska e Burt (1990) o pescado
destinado à elaboração do sashimi deve ser fresco e não pode ser submetido ao congelamento,
permitindo-se apenas o resfriamento, visando o retardo do desenvolvimento microbiano. Por isso,
a captura, manipulação e conservação do pescado para a preparação deste tipo de alimento,
necessitam de cuidados especiais.
Considerando a elevação de consumo de sushi e sashimi no país, é importante a realização de
uma reflexão no contexto da Segurança Alimentar e Nutricional (SAN). Estima-se que
aproximadamente 100 milhões de indivíduos, considerando a população de todos os países
industrializados, contraem doenças de origem alimentar, convencionalmente chamadas de
doenças transmitidas por alimentos (DTA), devido ao consumo de água e/ou alimentos
contaminados (FIGUEIREDO, 2004).
As enfermidades de origem alimentar são devido à ingestão de alimentos contaminados com
micro-organismos ou toxinas indesejáveis (MARTINS, 2006). Muitos casos de enfermidades
causados por alimentos não são notificados aos órgãos de inspeção ou agências de saúde, pois
seus sintomas são geralmente brandos e a vítima não busca atendimento médico (FORSYTHE,
2002). Além disso, certas sociedades não associam a diarreia a um sintoma de doença, mas a
ocorrências naturais, não relacionadas com a contaminação do alimento, tais como: indigestão,
16
excesso de condimentos e superstições (MOTARJEMI & KÄFERSTEIN, 1997). Esse
desconhecimento sobre a origem das DTAS faz com que muitos consumidores subestimem a
frequência das sérias consequências de se ingerir um alimento contaminado com micro-
organismos patogênicos (HANASHIRO, 2002).
O número de casos de doenças transmitidas por alimentos (DTAs) tendo como veículo os
pescados é geralmente baixo quando comparado ao dos causados por carnes de maneira geral e
frango em particular, ovos, leite e derivados. A importância do pescado como veiculador de
patógenos depende de fatores como a dieta e a forma de preparo. No Japão, onde o peixe é
importante parte da dieta, sendo muitas vezes consumido cru, a proporção de DTAs oriunda de
pescados é maior que nos países ocidentais (HUSS; REILLY; EMBAREK, 2000). Moluscos
filtradores e peixes consumidos crus são produtos de alto risco, já que não há como fazer o
controle completo de agentes patogênicos destes produtos. O consumo de pescados que sofreram
cocção é mais seguro do ponto de vista microbiológico (HUSS; REILLY; EMBAREK, 2000).
No caso de iguarias como sushi e sashimi, preparadas manualmente, além da contaminação
do pescado, o contato direto do alimento com as mãos dos manipuladores pode levar ao aumento
da incidência de patógenos como Staphylococcus aureus (JAY, 2005). Segundo Silva Jr. (2001),
preparações muito manipuladas são consideradas de alto risco, especialmente quando elaboradas
por pessoas que não possuem treinamento adequado. Deste modo, aspectos higiênico-sanitários
devem ser controlados para um consumo seguro desses alimentos.
O presente trabalho teve como objetivo identificar e enumerar a presença de Staphylococcus
coagulase positiva em preparações a base de pescado cru (sushi e sashimi) comercializados em
três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em culinária nipônica, dos
municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ, investigando sua procedência através de uma análise
das condições higiênico-sanitárias a que esses alimentos foram submetidos, e correlacionar a
presença destes micro-organismos nos manipuladores, denominados sushimen.
17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Consumo de preparações a base de pescado cru – Culinária Japonesa
Dentre os fatores que influenciam no consumo alimentar de uma população, podemos
citar aspectos nutricionais, sociais, históricos, simbólicos, políticos e até ideológicos. Os
pescados em geral têm alcançado popularidade na mesa dos brasileiros. Atualmente a influência
da culinária japonesa tem se difundido muito, principalmente pelo consumo de sushi e sashimi
(ALCÂNTRA, 2009).
O sushi é constituído à base de arroz temperado com vinagre, açúcar e sal combinado com
pescado cru ou ainda vegetal e frutas. Já o sashimi corresponde ao peixe cru filetado em pequenas
porções. Entre os peixes mais utilizados estão o atum, o salmão e o namorado (MATTÉ et al.,
2006).
A comida japonesa está em alta no Brasil. Nos últimos quinze anos o consumo de comida
japonesa nas cidades brasileiras aumentou 400%. Este movimento tem recebido auxílio até das
churrascarias, que ultimamente, oferecem essas iguarias em seu bufê de saladas. O número de
restaurantes especializados também tem aumentado. Um dos motivos associados está a culinária
saudável com baixo teor de gorduras saturadas (CARNEIRO, 2012).
2.2 Vigilância Sanitária
Segundo a Lei n° 8.080 de 19 de setembro de 1990 (artigo 6°, § 1°) a Vigilância Sanitária
é definida por “um conjunto de ações capaz de eliminar, diminuir ou prevenir riscos à saúde e de
intervir nos problemas sanitários decorrentes do meio ambiente; da produção e circulação de
bens; e da prestação de serviços de interesse da saúde, abrangendo o controle de bens de consumo
que, direta ou indiretamente, se relacionam com a saúde, compreendidas todas as etapas e
processo, da produção ao consumo; e o controle da prestação de serviços que se relacionam direta
ou indiretamente com a saúde” (BRASIL, 1990).
A eficiência do órgão fiscalizador está diretamente ligada às políticas de saúde adotadas
pelos Governos Federal, Estadual e Municipal, onde as ações de vigilância sanitária têm
predominantemente caráter fiscal, e são exclusivas do Estado (VALENTE, 2001). Como um pré-
requisito para a saúde, a alimentação pode sofrer intervenção de políticas públicas com objetivo
18
de assegurar o acesso da população a alimentos de qualidade (SOUZA; PELICIONI; PEREIRA,
2003).
Em 26 de novembro de 1993, o Ministério da Saúde (MS) publicou a Portaria Federal n°
1.428 que estabeleceu diretrizes para as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e a utilização do
Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle - APPCC, visando à prevenção e
controle higiênico dos alimentos (GERMANO et al, 2000).
Diante do crescimento de estabelecimentos comerciais que prestam serviços de
alimentação, o Ministério da Saúde, por meio de seu órgão regulador, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), juntamente com representantes dos diversos setores e
profissionais de estabelecimentos que prestam este tipo de serviço, definiram o conteúdo de uma
resolução aplicável em âmbito nacional, à padronização os processos envolvidos na produção de
alimentos e à fiscalização exercida pelas ações de vigilância sanitária. Assim, em 16 de setembro
de 2004 foi publicada no Diário Oficial da União a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº
216 (BRASIL, 2004) que dispõe sobre o “Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços
de Alimentação” cujo objetivo foi estabelecer procedimentos de Boas Práticas de Fabricação para
serviços de alimentação a fim de garantir as condições higiênico-sanitárias do alimento
preparado. Cabe à Vigilância Sanitária, a fiscalização deste tipo de estabelecimento no
cumprimento das legislações, garantindo a segurança do alimento comercializado.
De acordo com Silva Júnior (2014), as BPF são normas de procedimentos que tem como
objetivo, atingir um determinado Padrão de Identidade e Qualidade de um produto e/ou um
serviço na área de alimentos, cuja eficácia e efetividade deverão ser avaliadas através de inspeção
e/ou investigação. São práticas preventivas que incluem aspectos que vão desde a produção no
campo até a mesa do consumidor final, passando pela industrialização, distribuição e
comercialização (PAS, 2004).
A aplicação das BPF é de extrema importância, pois a partir destas ocorreram grandes
mudanças, tanto estruturais como comportamentais nos estabelecimentos comerciais e industriais,
entre outros seguimentos que manipulam alimentos, para promover a qualidade higiênico-
sanitária e a conformidade da produção de alimentos de acordo com a legislação vigente (RÊGO
et al, 2001).
Os itens para a elaboração do manual de boas práticas e para as diretrizes da inspeção
sanitária são: responsabilidade técnica, controle de saúde dos funcionários, controle de água para
19
o consumo, controle das matérias primas, controle integrado de pragas, visitantes, estrutura dos
estabelecimentos, higiene, manipulação e transporte (SILVA JÚNIOR, 2014).
A garantia de um alimento seguro para o consumidor pode ser avaliada através de uma
lista de verificação, também chamada de checklist após a implantação de programas de qualidade.
Este é um formulário que analisa requisitos relativos aos funcionários, instalações, saneamento,
sanitização, equipamentos, produção e controle de qualidade. A partir desta análise pode ser
realizado um levantamento dos pontos críticos e planejar ações corretivas visando à adequação de
todo o processo conforme a legislação vigente (SEIXAS et al, 2008).
2.3 Segurança dos Alimentos
Entende-se por segurança dos alimentos a aquisição, pelo consumidor, de alimentos de
boa qualidade, livre de contaminantes, ou perigos, de natureza química, biológica, física ou
quaisquer substâncias que possam causar danos à saúde (CALAÇA, 2003).
Os principais órgãos responsáveis pelo controle de qualidade dos alimentos no Brasil são:
o Ministério da Saúde (MS), Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e o
Instituto Brasileiro de Defesa do Consumidor (IDEC) (CAVALLI, 2001).
Vários fatores podem contribuir para que um alimento deixe de ser seguro e torne-se um
fator de risco para a saúde humana, entre eles podemos citar matérias primas contaminadas,
instalações inadequadas, manipuladores portadores de micro-organismos patogênicos, alimentos
preparados com muita antecedência, falta de higiene de manipuladores, procedimentos de
higienização de equipamentos e utensílios deficientes, cozimento insuficiente, contaminação por
pragas e vetores e estocagem de alimentos em temperaturas inseguras. Essas situações
contribuem para que ocorram alterações nos alimentos que muitas vezes não está diretamente
relacionado com sua aparência, e sim com suas características físicas, químicas e
microbiológicas, ou seja, um alimento aparentemente bom pode estar alterado ou deteriorado.
Existem várias doenças que podem ser veiculadas pelos alimentos; muitas podem causar
problemas graves de saúde, inclusive levar ao óbito do consumidor (FERREIRA, 2006).
As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) representam um problema de grande
importância na Saúde Pública, pois ocasionam a redução da produtividade, perdas econômicas e
afetam a confiança do consumidor. Países em desenvolvimento, como o Brasil possuem uma taxa
mais alta de incidência de DTAs quando comparados com países desenvolvidos. A gravidade da
20
doença depende da quantidade do alimento contaminado ingerido, do tipo de micro-organismo
e/ou toxina envolvida, e do estado de saúde do indivíduo acometido (BENEVIDES; LOVATTI,
2004).
No Brasil, somente alguns estados e/ou municípios dispõem de estatísticas e dados sobre a
ocorrência de surtos de DTA, agentes etiológicos mais comuns, alimentos mais frequentemente
implicados, população de maior risco e outros fatores. Porém, a maioria dos casos de DTA não
são notificados como explicado anteriormente (SANTOS, 2010). O Ministério da Saúde, por
meio das secretarias municipais de saúde, é o órgão responsável pelos registros de surtos de DTA
no país.
Dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS, apud SANTOS, 2010) indicam que
foram notificados 6602 surtos de DTA no Brasil com 117300 indivíduos doentes e 64 óbitos no
período de 1999-2008. Segundo a SVS estes números estariam subestimados. Os dados
disponíveis indicam que o agente etiológico era ignorado em 51% dos surtos e o veículo
(alimento) era desconhecido em 34,3% dos surtos. De acordo com as informações disponíveis, a
maior parte dos surtos de DTA (84%) é causada por bactérias patogênicas e/ou suas toxinas,
predominando Salmonella spp. (42,9%), Staphylococcus spp. (20,2%), Bacillus cereus (6,9%),
Clostridium perfringens (4,9%), Salmonella enteritidis (4,0%), Shigella sp. (2,7%), e outros
(18,4%), seguidas por vírus (13,6%), contaminantes químicos (1,2%) e parasitos (1%).
A diarreia é um dos sintomas mais comuns da DTA, juntamente com a dor de estômago,
náusea, vômitos e febre (FORYSTHE, 2002). Cerca de 70% dos casos de doença diarreica aguda
são causados por consumo de água e/ou alimentos contaminados, segundo estimativas da
Organização Mundial de Saúde (OMS) (REUNIÃO INTERAMERICANA DE SAÚDE E
AGRICULTURA, 2003).
Registros epidemiológicos mostram que os serviços de alimentação contribuem para o
alto índice de DTA, sendo responsáveis por mais de 50% da ocorrência de surtos. (FERREIRA,
2006). Garantir a segurança dos alimentos exige a aplicação de sistemas que monitorem a
qualidade dos produtos nas etapas operacionais que vão desde a recepção e armazenamento dos
produtos até a manipulação e distribuição do alimento preparado (CALAÇA, 2003).
2.4 Higiene do ambiente, equipamentos e utensílios
As superfícies utilizadas para preparação de alimentos, como os equipamentos e
21
utensílios, podem ser focos de contaminação, principalmente se não forem higienizados
corretamente. Às superfícies como aço, vidro, polipropileno, plástico, borracha, fórmicas e ferro,
podem ocorrer agregação de resíduos orgânicos, como restos de alimentos decorrentes desta má
higienização. Esses resíduos são fonte de energia para que micro-organismos, bactérias e fungos,
permitindo a adesão e multiplicação de micróbios (ABERC, 2000).
A contaminação, multiplicação e sobrevivência microbiana no ambiente e equipamentos
devem ser controladas. A comprovação e/ou monitorização devem determinar se o nível de
higiene é aceitável para que as correções sejam realizadas em tempo necessário a fim de manter o
controle do processo. A comprovação das condições de higiene dos equipamentos deve ser
atestada após inspeção do processo de limpeza (SILVA JÚNIOR, 2014).
A limpeza aparente pode induzir ao erro e dar uma falsa sensação de segurança. É
desejável confirmar o nível de limpeza e desinfecção mediante análise microbiológica de
amostras provenientes do equipamento e do meio ambiente (SILVA JÚNIOR, 2014).
Como descrito na RDC nº 216 (BRASIL, 2004), as instalações, os equipamentos e
utensílios devem ser mantidos em condições higiênico-sanitárias apropriadas. As operações
devem ser realizadas por funcionários capacitados e com frequência de maneira a garantir
condições de higiene e minimizar o risco de contaminação do alimento. Os funcionários devem
utilizar uniformes apropriados e diferenciados dos manipuladores de alimentos.
A área de preparo dos alimentos, assim como os equipamentos e utensílios utilizados,
deve ser higienizada quantas vezes forem necessárias e imediatamente após o término do
trabalho. Os produtos sanitizantes utilizados deverão estar regularizados pelo Ministério da
Saúde. A diluição, o tempo de contato e modo de uso e/ou aplicação destes produtos, deverão
obedecer às instruções recomendadas pelo fabricante. Após utilizados, deverão ser identificados e
guardados em locais próprios (BRASIL, 2004).
Andrade, Silva e Brabes (2003) ao fazerem uma avaliação microbiológica das condições
higiênico-sanitárias dos equipamentos e utensílios de 12 restaurantes industriais localizados nas
regiões da Zona da Mata e Metalúrgica de Minas Gerais, com capacidade para produção de 1.000
a 4.000 refeições/dia, verificaram que apenas 18,6% apresentavam resultado microbiológico
condizente com higienização eficiente.
2.5 Manipuladores de alimentos
22
Para efeito da inspeção sanitária de alimentos, qualquer pessoa que entra direta ou
indiretamente em contato com substâncias alimentícias é considerado manipulador, ou seja, todas
as pessoas que estão relacionadas com o preparo, conservação e a comercialização dos alimentos
(RIEDEL, 1992).
Segundo Corrêa (2004) o manipulador é responsável por grande parte das enfermidades
transmitidas por alimentos, uma vez que seu estado de saúde e suas práticas de higiene pessoal
influenciam nas operações realizadas.
Existem várias fontes de contaminação de alimentos e vários fatores que contribuem para
aumentar a probabilidade dessa contaminação. A higiene do manipulador e de todo material que
o alimento entra em contato deve ser muito rígida e é de extrema importância para a produção
segura do produto final (TEDESCO et al, 2004).
Segundo Silva Júnior (2001), preparações muito manipuladas são consideradas de alto
risco, especialmente quando elaboradas por pessoas que não possuam treinamento adequado.
Os manipuladores de alimentos são responsáveis por até 26% dos surtos de DTA de
origem bacteriana, de acordo com dados da Organização Mundial de Saúde - OMS (ANDRADE;
SILVA; BRABES, 2003; COELHO et al, 2010). Em sua maioria, não possuem ou praticam
inadequadamente a higiene pessoal, e os micro-organismos se multiplicam quando ocorre
qualquer falha sanitária. Mesmo que assintomáticos, estes manipuladores podem eliminar micro-
organismos patogênicos. Aqueles com sinais de febre, diarreia, faringite ou sinusite devem ser
afastados do trabalho imediatamente para não comprometerem a segurança dos alimentos (GÓES
et al, 2001).
A saúde do manipulador é um fator muito importante, porque é pelos exames médicos e
laboratoriais realizados na contratação, que se verifica se o funcionário possui ou não alguma
patologia ou micro-organismo que pode ser transmitido pela contaminação de alimentos ao ser
humano. O exame médico de um manipulador de alimentos deve ser feito sempre que houver
uma indicação clínica ou epidemiológica. A legislação exige exames médicos periódicos, estes
incluem exame físico, de sangue e de fezes para fazer a verificação de patógenos. Outros exames
podem ser realizados como o de cultura de secreção orofaríngea e a cultura do material dos dedos
(SILVA JÚNIOR, 2014).
Com a realização destes exames, o médico poderá averiguar se o funcionário está em
condições ótimas para desenvolver a função a que foi destinado, não sofrendo os riscos de um
23
acidente de trabalho causado por uma parasitose, por uma infecção subclínica ou por qualquer
alteração que passaria despercebida sem os exames laboratoriais e a consequente avaliação
clínica do médico do trabalho (BRASIL, 2004).
Ferreira (2006) realizou uma pesquisa bibliográfica sobre a contaminação dos alimentos
ocasionada pelos manipuladores, onde foram enfocados os principais micro-organismos
envolvidos nestes episódios. Dentre estes, Staphylococcus aureus esteve envolvido com maior
frequência nos casos de contaminação dos alimentos provocada por falhas na manipulação, pois
na maioria das vezes essa contaminação ocorre por meio de ferimento nas mãos, outras lesões
purulentas ou secreções que contaminam os alimentos durante sua manipulação. Cerca de 25%
das pessoas são portadores deste micro-organismo alocado nas fossas nasais e muitas vezes os
manipuladores não têm conhecimento sobre este fato.
De acordo com a RDC nº 216 (BRASIL, 2004), os manipuladores devem lavar
cuidadosamente as mãos ao chegar ao trabalho, antes e após manipular alimentos, após qualquer
interrupção do serviço, após trocar materiais contaminados, após usar os sanitários e sempre que
se fizer necessário. Devem ser afixados cartazes de orientação aos manipuladores sobre a correta
lavagem e sepsia das mãos e demais hábitos de higiene, em locais de fácil visualização, incluindo
as instalações sanitárias e lavatórios. Não devem fumar, falar desnecessariamente, cantar,
assobiar, espirrar, cuspir, tossir, comer, manipular dinheiro ou praticar outros atos que possam
contaminar o alimento, durante o desempenho das atividades. Devem usar cabelos presos e
protegidos por redes, toucas ou outro acessório apropriado para esse fim, não sendo permitido o
uso de barba. As unhas devem estar curtas e sem esmalte ou base e durante a manipulação,
devem ser retirados todos os objetos de adorno pessoal e maquiagem.
Os manipuladores devem ter asseio pessoal, apresentando-se com uniformes compatíveis
à atividade, conservados e limpos. Os uniformes devem ser trocados, no mínimo diariamente e
usados exclusivamente nas dependências internas do estabelecimento, devem ser de cor clara;
sem bolsos na altura da cintura; sem botões ou estes devem estar protegidos; as calças devem ser
feitas com cintos fixos ou com elástico e devem ser mantidos em bom estado e limpos. Os
sapatos devem ser de borracha ou outro material impermeável, tipo bota ou calçado semelhante,
sem aberturas. As roupas e objetos pessoais devem ser guardados em um local específico e
reservado para esse fim (BRASIL, 2004).
24
2.6 Importância do controle microbiológico nos alimentos
Os micro-organismos patogênicos estão presentes no solo, trato intestinal de animais,
entre outros ambientes, portanto é provável que as matérias-primas de origem animal e vegetal
veiculem micro-organismos patogênicos. Estes patógenos devem ser identificados e controlados a
fim de evitar surtos de DTA (FRANCO; LANDGRAF, 2002).
Dentre os micro-organismos patogênicos mais importantes estão os grupos produtores de
toxinas, como, por exemplo, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium
botulinum, Vibrio cholerae, Bacillus cereus e fungos filamentosos; e aqueles que causam
infecções como a Salmonella sp., Escherichia coli, Shigella sp., Vibrio parahaemoliticus,
Campilobacter sp., Listeria monocytogenes e Yersinia sp. (FRANCO; LANDGRAF, 2002).
Quando os alimentos apresentam modificações das suas características organolépticas,
podendo apresentar sabor e odor desagradáveis, são classificados como alimentos deteriorados.
Essa deterioração é resultado da multiplicação indesejável de micro-organismos capazes de
produzir compostos voláteis durante seu metabolismo, os quais são detectados pelo olfato e
paladar humanos. Apesar de não causarem obrigatoriamente distúrbios gastrointestinais, essas
características são indesejadas pelo consumidor, sendo este um problema de qualidade e não de
segurança dos alimentos (FORSYTHE, 2013).
É importante estimar a carga microbiana na superfície das mãos de manipuladores e
alimentos, e avaliar também os efeitos dos métodos de sanitização realizados (LAGAGGIO;
FLORES; SEGABINAZI, 2002).
O controle microbiológico dos alimentos tem crescido muito, principalmente, para atender
às exigências do mercado em relação à importação e exportação, exigência de consumidores e
dos órgãos de fiscalização (RIBEIRO et al, 2005).
As bactérias patogênicas de origem alimentar são na grande maioria aeróbias mesófilas,
portanto, a análise deste grupo é indicativa da qualidade sanitária do alimento. Estes micro-
organismos crescem em condições de temperaturas de 37ºC, semelhantes a do corpo humano, os
quais encontram ambiente propício para seu crescimento nas mãos dos manipuladores e nos
alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 2002).
Segundo a ICMSF - International Commission on Microbiological Specifications for
Foods (1984) - o número de micro-organismos aeróbios mesófilos (contagem em placa)
encontrados em alimentos, é um dos indicadores microbiológicos de qualidade mais comumente
25
utilizados, indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante o processo
de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta
determinação permite também obter informações referentes às alterações incipientes dos ali-
mentos, sua provável vida de prateleira, e a falta de controle no descongelamento ou desvios na
temperatura de refrigeração adequada.
A análise microbiológica deve ser realizada criteriosamente para garantir um resultado
confiável, permitindo desta forma uma avaliação da conformidade do produto com o seu Padrão
de Identidade e Qualidade. Os produtos que não estiverem de acordo com o critério
microbiológico deverão ser reprovados e descartados (FRANCO; LANDGRAF, 2002).
26
2.7 Pescado
Pescado engloba todos os animais aquáticos, marinhos ou de água doce, que são
utilizados como alimento do homem, os quais podem ser consumidos diretamente ou
aproveitados para a industrialização (PHILIPPI, 2003).
De acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal do Ministério da Agricultura (RIISPOA) em seu Artigo 439, o pescado, in natura, pode
ser classificado como fresco, resfriado, ou congelado. Entende-se por "fresco" o pescado dado ao
consumo sem ter sofrido qualquer processo de conservação, a não ser a ação do gelo. O pescado
classificado como "resfriado" deve ser devidamente acondicionado em gelo e mantido em
temperatura entre -0,5ºC e -2ºC. O pescado congelado é aquele tratado por processos adequados
de congelação, em temperatura não superior a -25ºC (BRASIL, 1952).
É considerado um alimento de alta digestibilidade, mas também um dos mais perecíveis.
Desde o momento em que é retirado da água, inicia-se uma série de modificações e alterações
que podem impedir sua comercialização, tanto como alimento para ser consumido de modo
direto, quanto como matéria prima para ser industrializada (MEDEIROS, 2014).
2.8 Conservação do Pescado
Os peixes deverão ser acondicionados sob refrigeração a bordo, o mais rápido possível,
sendo aplicadas também as boas práticas de higiene para uma operação mais segura (SENAI,
2000). O processo de refrigeração, em temperaturas entre -1ºC e 10ºC, não apresenta ação
esterilizante, apenas retarda as atividades microbianas já existentes e impede o surgimento de
novos agentes deteriorantes (CORDEIRO et al, 2007).
No congelamento são utilizadas temperaturas mais baixas do que na refrigeração, assim,
inibindo o crescimento microbiano por desaceleração do processo metabólico. O pescado
conservado sob condições estéreis e a temperaturas de congelamento não se deteriora mesmo
após várias semanas de estocagem (VIEIRA, 2003).
É usual a conservação com a utilização de gelo picado misturado intimamente com o
pescado. O ideal é que este alcance temperatura de 0ºC, até sua comercialização ou que sejam
adotadas medidas destinadas a preservá-lo. Uma delas é a eliminação da cabeça, cauda,
barbatanas e a extração das vísceras para efetuar um congelamento a – 20 ºC, forma em que pode
ser comercializado (SALINAS, 2002).
27
A vida útil do pescado é determinada pelas reações enzimáticas e pelo número de espécies
de micro-organismos presentes, fatores estes dependentes de sua microbiota natural e pelo modo
de manuseio desde sua captura até a estocagem, fatores estes relacionados com as boas práticas
de manipulação. Outro fator determinante da vida útil do pescado é a temperatura de estocagem
(NEIVA, 2008).
Estudos sobre a microbiota presente na superfície de peixes mostraram que os micro-
organismos deteriorantes mais frequentes são Pseudomonas sp. (32 - 60%), Alteromonas sp. (32
a 60%), Moraxella sp. (18 a 37%) e Acinetobacter sp. (18 a 37%) (JAY, 2005; VIEIRA, 2003).
Hoffmann e colaboradores (1999), realizaram um estudo em São José do Rio Preto, SP,
onde foram coletadas 11 amostras de pescados comercializados na região, realizadas análises
microbiológicas e por fim, os resultados foram correlacionados com os padrões existentes na
legislação. Os resultados evidenciaram que 99% das amostras dos produtos foram
comercializados em condições higiênico-sanitárias insatisfatórias e potencialmente capazes de
causar DTA. De acordo com os autores a maioria das amostras apresentou contagem de
Staphylococcus aureus acima do padrão estabelecido pela legislação brasileira.
2.9 Aspectos microbiológicos de pescados
Os pescados, em geral, apresentam musculatura, órgãos e liquido corporal livres de
contaminação. No entanto, as regiões de contato direto, como pele, guelras e vísceras podem
apresentar contaminação, principalmente por bactérias. A multiplicação de micro-organismo é
favorecida, principalmente pelo aumento de temperatura do ambiente marinho (OGAWA, 1999).
O pescado é um dos alimentos mais suscetíveis à degradação, principalmente pela
atividade microbiana. As alterações de sabor, odor, textura e cor indicam o nível de frescor ou
decomposição causado, principalmente, pela atividade microbiana. A velocidade de
decomposição será influenciada diretamente pelo nível de contaminação inicial e condições de
armazenamento como umidade, temperatura e atmosfera. Este último pode ser considerado ponto
crítico de controle no processo de produção de pescados (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
A deterioração do pescado ocorre pela autólise, oxidação, atividade bacteriana ou pela
combinação destes processos. O processo de autólise ocorre devido à ação de sucos digestivos, de
natureza ácida, carregados de enzimas proteolíticas, que migram para os tecidos musculares, após
a morte. Essas enzimas atuam sobre os tecidos, provocando sua decomposição e facilitando a
28
disseminação de micro-organismos, elas ainda perfuram as vísceras, extravasando material
contaminado. A oxidação das gorduras produz alterações de aroma e/ou coloração do produto
(Jay, 2005).
O pescado possui uma microbiota natural composta por Pseudomonas, Aeromonas,
Moraxella, Shewanella, Flavobacterium, Vibrio e Micrococcus. Dentre estas, as mais importantes
na deterioração do pescado são Pseudomonas, Aeromonas, e Shewanella. Esses gêneros são
importantes não só pela sua natureza psicrotrófica, mas principalmente pela capacidade que têm
de utilizar, para o seu desenvolvimento, substâncias nitrogenadas não-proteicas. Estes compostos
são obtidos a partir das reações enzimáticas que ocorrem após a morte do pescado (Franco &
Landgraf, 2008).
Uma vez esgotados os substratos não-protéicos as bactérias metabolizam as proteínas
ocasionando alterações mais profundas, como o amolecimento dos tecidos, aumento da
concentração de compostos de odor nauseante (Franco & Landgraf, 2008).
Um dos principais pontos críticos de controle para a produção de pescados a ser
considerado, são os procedimentos adotados a bordo após a pesca, já que o número de bactérias
pós-captura pode aumentar na ordem de 105 a 10
6 bactérias/cm
2.
Dentro da cadeia produtiva do pescado existem muitas fontes de contaminação, que
modificam a microbiota original. As fontes de contaminação a se considerar são: evisceração
realizada de qualquer maneira, não resfriamento do produto imediatamente após a pesca, lavagem
inadequada, uso de equipamentos sem assepsia, transporte inadequado, manipulação humana em
mercados, peixaria (Ogawa, 1999).
Além disso, conforme mencionado anteriormente, o pescado fresco pode ser influenciado
por hábitos não higiênicos dos manipuladores, podendo comprometer a qualidade higiênico-
sanitária do alimento. O consumo de pescado in natura representa um grande risco à saúde
coletiva, por não haver as barreiras térmicas (cocção) para eliminação de micro-organismos do
alimento e assim garantir sua inocuidade. Os manipuladores precisam estar atentos às práticas de
manipulação para evitar que a contaminação externa deste produto atinja a carne (Martins, 2006;
Lima, 2010).
2.10 Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP)
Dentro do gênero Staphylococcus são descritas 32 espécies, sendo que somente 5 delas
29
são capazes de produzir a coagulase, uma enzima extracelular que coagula o plasma sanguíneo,
sendo assim denominadas como Staphylococcus coagulase positiva (SCP) (SILVA; GANDRA,
2004).
Durante muitos anos, Staphylococcus aureus foi considerada a única espécie de seu
gênero capaz de produzir enterotoxinas e a enzima coagulase. Posteriormente as espécies
Staphylococcus hyicus e Staphylococcus intermedius também foram consideradas produtoras
sendo inclusive incriminadas em surtos de intoxicação alimentar. Devido a grande semelhança
fenotípica, a legislação brasileira foi modificada, passando a estabelecer a pesquisa e enumeração
de SCP, ao invés da enumeração de S. aureus (SILVA; GANDRA, 2004).
Os alimentos envolvidos em surtos de DTA devem, na investigação epidemiológica, ser
coletados e examinados para Staphylococcus spp. O diagnóstico deve ser feito com base em
levantamento do quadro clínico e histórico de ingestão de alimentos suspeitos, entrevistando-se
vítimas e demais pessoas envolvidas que possam deter informações relevantes, além da utilização
de técnicas laboratoriais de isolamento e identificação do micro-organismo. Resultados positivos
em doentes e no alimento confirmam o diagnóstico (FERREIRA, 2006).
De acordo com a Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003 (BRASIL, 2003) do
MAPA, a identificação de Staphylococcus coagulase positiva em alimentos consiste basicamente
em etapas de cultura em ágar Baird-Parker, seleção de colônias suspeitas e identificação destas
mediante provas bioquímicas.
A produção de coagulase é uma importante característica utilizada na identificação do S.
aureus, portanto a legislação brasileira preconiza a pesquisa de Staphylococcus coagulase
positiva (SCP) como indicativo de S. aureus. Intoxicação alimentar por estafilococos é uma
doença causada pela ingestão de alimentos contaminados com enterotoxina produzida por
bactérias deste gênero. A bactéria é considerada, para fins de análise microbiológica, com
potencial para produção de enterotoxinas em alimentos quando é considerado coagulase positiva
(BRASIL, 2001; MARTINS, 2006).
Existem testes sorológicos e moleculares para determinar a enterotoxigenicidade do S.
aureus isolado de alimentos. Métodos para separação e detecção de toxinas em alimentos têm
sido desenvolvidos e utilizados para melhorar o diagnóstico da doença. A fagotipagem pode ser
útil quando o micro-organismo viável pode ser isolado de um alimento incriminado, de vítimas e
de portadores suspeitos tais como manipuladores de alimentos. O isolamento de micro-
30
organismos de um mesmo fagotipo de fezes ou vômito de duas ou mais pessoas confirmam o
diagnóstico (FERREIRA, 2006).
Segundo Neto e colaboradores (2002) uma incidência apreciável destes micro-organismos
tem sido detectada, principalmente em produtos de origem animal submetidos à intensa
manipulação.
2.11 Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica (cocos) que aparece aos pares no exame
microscópico, em cadeias curtas ou em cachos similares aos de uva. É Gram positiva, anaeróbia
facultativa ou aeróbia, com faixa de crescimento de 7ºC a 48ºC e crescimento ótimo em
temperatura entre 35ºC a 37ºC, caracterizando um micro-organismo mesófilo (FORSYTHE,
2002; SANTOS, 2006).
Figura 1. Staphylococcus aureus - www.hivwebstudy.org
Pode ser encontrado frequentemente em fômites ou colonizando humanos e animais, onde
pode ser encontrado na pele, narina, períneo, axilas, vagina, entre outras regiões do corpo.
Estima-se que esteja presente nas fossas nasais de 20% a 40% de humanos saudáveis,
classificando-se assim como portadores assintomáticos (KONEMAM et al, 2001). Os
manipuladores de alimentos, se portadores assintomáticos, se não seguirem corretamente as BPF,
poderão disseminar este micro-organismo durante o processo de preparo dos mesmos (SILVA;
GANDRA, 2004).
A doença não ocorre pela ingestão da bactéria em si, e sim pela ingestão de toxinas pré-
formadas no alimento, as enterotoxinas. O período de incubação é muito rápido, de 30min a 8h
após a ingestão do alimento contaminado. Os sinais clínicos são caracterizados por vômitos,
31
náuseas, diarreias brandas a intensas, salivação, sudorese e desidratação, variando com o grau de
sensibilidade do indivíduo, da concentração de enterotoxinas e da quantidade de alimento
contaminado ingerido (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Não é uma doença fatal e a recuperação dos pacientes pode ocorrer em um ou dois dias
após o início dos sintomas. Seu diagnóstico é dificultado devido à semelhança com outras
intoxicações e toxinfecções (GERMANO; GERMANO, 2008).
Os alimentos mais envolvidos na contaminação pelo S. aureus são aqueles com elevado
teor de umidade e alta concentração de proteínas. (NASCIMENTO, 2013).
2.12 Identificação de Staphylococcus aureus em alimentos
Entre as espécies produtoras da enzima coagulase, Staphylococcus aureus é a espécie que
mais prevalece em surtos de DTA. Devido ao risco que sua presença em alimentos oferece à
saúde pública, diversos países estabeleceram como parte das ações de fiscalização sanitária de
órgãos governamentais, a obrigatoriedade de sua pesquisa (SILVA; GANDRA, 2004).
A RDC n°12 da ANVISA (BRASIL, 2001) estabelece o limite máximo de 103UFC/g de
produto para SCP em pescado fresco e para pratos prontos para o consumo a base de pescados e
similares crus, como o sushi e o sashimi o limite é de 5x10³ UFC/g.
As técnicas tradicionais de microbiologia de alimentos fundamentam-se na utilização de
testes morfológicos e bioquímicos para a identificação de gêneros e espécies. As técnicas
microbiológicas rotineiramente utilizadas são realizadas por crescimento em meios de cultura
seletivos complementadas por testes bioquímicos diferenciais, baseados em sua maioria, na
expressão de enzimas específicas, usados em conjunto com testes sorológicos (GANDRA et al,
2008).
De acordo com a Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003, do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a identificação de S. aureus em alimentos
consiste basicamente de etapas de cultivo em agar Baird-Parker, seleção de colônias suspeitas e
identificação destas mediante provas bioquímicas. No entanto, a técnica apresenta algumas
desvantagens: ser demorada e trabalhosa, pois necessita de muitos reagentes e vidrarias;
geralmente é necessário o processamento de um grande número de amostras, conforme exigência
na indústria de alimentos; além do risco de interpretações errôneas dos resultados.
Nas últimas décadas, foram desenvolvidos testes moleculares para a detecção,
32
identificação e caracterização de bactérias patogênicas em alimentos. Dentre essas, técnicas
baseadas na reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) (BOER E BEUMER,1999;
MALORNY et al, 2003) que amplificam sequencias específicas do genoma do patógeno ou
organismo alvo. Pequenas quantidades de sequências de DNA específicas são enzimaticamente
amplificadas até que sejam obtidas milhões de cópias da sequência alvo (KONEMAM et al,
2001). O teste de PCR é rápido, sensível e inequívoco.
A rapidez na identificação de agentes etiológicos pela detecção do seu DNA, em
comparação ao método preconizado pela microbiologia convencional, torna a PCR uma
alternativa prática, além de sua alta sensibilidade e especificidade, dentre os métodos de
diagnósticos disponíveis para Staphylococcus aureus em alimentos.
Em conjunto, também podemos citar a técnica de eletroforese, pulsed field gel
eletrophoresis - PFGE, que é apropriada para separar grandes fragmentos de DNA, por meio da
reorientação do DNA em gel pela ação de campos elétricos alternados (MAGALHÃES et al,
2005). Esta técnica é reconhecida como padrão ouro para identificação de linhagens bacterianas,
como S. aureus, possibilitando uma comparação do perfil clonal das cepas isoladas de alimentos
e manipuladores, por exemplo (SHIMAMURA E MURATA, 2011).
Nos últimos anos as técnicas de biologia molecular auxiliaram muito na elucidação da
taxonomia do gênero Staphylococcus, permitindo relacionar ou comparar os resultados dos testes
fenotípicos e genotípicos. Entre esses métodos, a análise comparativa da sequência de
determinados genes de macromoléculas conservadas tem sido empregada para a classificação de
micro-organismos. Um exemplo dessas macromoléculas é o RNA ribossomal, essencial para a
sobrevivência dos organismos, e altamente conservado entre as bactérias. O sequenciamento do
gene do RNA ribossomal 16S tem sido extensivamente usado com finalidade taxonômica e
filogenética (BECKER et al, 2004) e é considerado o método de referência para a identificação
bacteriana (NOLTE & CALIENDO 2003). As sequências encontradas são comparadas com
aquelas depositadas em bancos de dados, como o do National Center for Biotechnology
Information - NCBI (BECKER et al, 2004).
2.13 Resistência a antimicrobianos
Segundo Jay (2005), os agentes antimicrobianos são substâncias de origem biológicas
e/ou sintéticas que produzem toxicidade seletiva sobre micro-organismos.
33
Os antibióticos e drogas afins, em conjunto denominados agentes antimicrobianos, são
utilizados no tratamento de doentes que sofrem de doenças infecciosas. Desde a década de 1940,
essas doenças e as mortes causadas por elas reduziram significativamente. No entanto, essas
drogas têm sido usadas tão amplamente e por tanto tempo que os organismos infecciosos estão
desenvolvendo mecanismos de adaptação a eles, tornando as drogas menos eficazes. (CDC,
2014)
A resistência aos antibióticos é a capacidade que, micro-organismos como bactérias,
vírus, fungos e parasitas, desenvolvem para resistir aos efeitos das drogas. Isso significa que esses
germes não morrem e o seu crescimento não é parado com a administração desses fármacos
(CDC, 2014).
As bactérias resistentes são mais comuns em ambientes onde os antibióticos são usados
com muita frequência, como por exemplo, em serviços de saúde, na comunidade, e na produção
de alimentos de origem animal.
Tavares (2000) descreveu que a resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético,
relacionado à existência de genes contidos no micro-organismo que codificam diferentes
mecanismos bioquímicos que impedem a ação das drogas. A resistência pode ser originada em
mutações que ocorrem no germe durante seu processo reprodutivo e resultam de erros de cópia na
sequencia de bases que formam o DNA cromossômico, responsáveis pelo código genético. A
outra origem da resistência é a importação dos genes causadores do fenômeno, consistindo na
resistência transferível. Esta resistência faz-se através dos mecanismos de transdução,
transformação e conjugação e, frequentemente, envolve genes situados em plasmídeos e
transposons.
O gênero Staphylococcus é de grande importância devido a sua alta prevalência em
infecções hospitalares e por apresentar taxas elevadas de resistência a oxacilina e a outros
antimicrobianos (KAISER et al, 2010).
No Brasil, S. aureus mostram-se resistentes à penicilina G, ampicilina e amoxicilina em
mais de 70% das cepas isoladas, seja em ambiente hospitalar ou na comunidade, não sendo mais
indicado o uso destes antimicrobianos para o tratamento de infecções estafilocóccicas, mesmo
que benignas e mesmo que procedam do ambiente extra-hospitalar (FARIAS et al, 1997; JAY,
2005; TAVARES, 2000).
Os esforços para prevenir infecções resistentes incluem imunização, controle de infecção,
34
uso controlado de antibióticos, ou seja, boas práticas na prescrição, reduzir a disseminação de
uma pessoa para outra, e proteger o abastecimento de alimentos.
Micro-organismos resistentes a antimicrobianos são motivo de preocupação para
autoridades sanitárias e pesquisadores em todo o mundo, principalmente no que tange a elevada
ocorrência de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) A presença destes patógenos em
alimentos possui impacto direto sobre a clínica médica humana, especificamente nas medidas
terapêuticas adotadas em pacientes vítimas de doenças transmitidas por alimentos.
Uma vez que manipuladores de alimentos podem atuar como reservatório desse micro-
organismo, torna-se importante avaliar o risco de transmissão de cepas com o perfil genético de
resistência para os alimentos (CERQUEIRA, 2013). Deve ser considerado ainda, que patógenos
multirresistentes podem agir como disseminadores de genes de resistência a antimicrobianos para
outros micro-organismos susceptíveis, e assim ajudar na transferência de genes para bactérias de
microbiotas humanas e de outros animais (PRICE, 2007).
35
3. JUSTIFICATIVA
O conhecimento de que o consumo de alimentos ricos em ácidos graxos poli-insaturados e
com baixos níveis de colesterol reduz o risco de doenças cardíacas está alterando os hábitos
alimentares da população, fazendo com que os consumidores prefiram as carnes brancas, magras,
e assim contribuindo para aumentar o consumo de peixes e derivados. Aliado a isto, nas últimas
décadas, o mundo tem presenciado um acelerado processo de globalização dos costumes e
hábitos alimentares. Houve uma rápida difusão e aceitação de alimentos como o sushi e o
sashimi, no qual esses pratos à base de pescado cru, que em pouco tempo tornaram-se sinônimo
de “comida saudável”.
No entanto, já existe uma preocupação dos órgãos reguladores e fiscalizadores ligados à
saúde pública com o crescente consumo desse tipo de alimento, principalmente, pelo fato de ser
um produto altamente perecível, ser consumido “in natura” e, principalmente, por necessitar de
maior rigor na implementação e manutenção de condições higiênico-sanitárias adequadas para
sua preparação e conservação (VIEIRA et al, 2007).
A segurança alimentar, no que concerne à qualidade do alimento ingerido, precisa ser
garantida nas preparações de peixe cru, como sushi e sashimi, como preconiza a legislação
brasileira vigente. Além disso, resultados de análises, com rigor científico e metodológico,
poderão alertar os responsáveis pela vigilância em saúde. Da mesma maneira, os consumidores
devem ser avisados sobre os riscos de DTAs associados ao consumo desses alimentos quando
não preparados de forma adequada.
Os resultados e conclusões deste estudo poderão contribuir para a criação de normas
específicas para o preparo adequado destas iguarias, possibilitando assim, melhor norteamento
para estabelecimentos comercializadores e consumidores.
36
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
A proposta deste estudo visou avaliar a qualidade microbiológica quanto à presença de
Staphylococcus aureus em preparações à base de pescado cru, sushi e sashimi, comercializados
em três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em culinária nipônica dos
municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ. Os estabelecimentos comerciais também foram
avaliados quanto às condições higiênico-sanitárias a que esses alimentos foram submetidos,
desde a aquisição da matéria-prima até a sua disponibilização para consumo.
4.2 Objetivos específicos
- Analisar e enumerar Staphylococcus coagulase positiva em amostras de sushi e sashimi
coletadas em três estabelecimentos comerciais do tipo self-service, não especializados na
culinária nipônica, nos municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ.
- Identificar as cepas de S. aureus entre as colônias típicas e não-tipicas coagulase
positivas isoladas a partir do pescado cru isoladas por técnicas microbiológicas convencionais,
por testes de PCR.
- Pesquisar a presença de cepas de S. aureus em manipuladores de alimentos (sushimen)
naqueles restaurantes onde forem encontradas amostras contaminadas.
- Identificar as colônias por sequenciamento parcial do gene rDNA 16S.
- Analisar a influencia dos manipuladores de alimento (sushimen) na qualidade
microbiológica das preparações de sushi e sashimi, através da avaliação do perfil clonal de
linhagens de S. aureus presentes no pescado em comparação às linhagens presentes na mão e
fossas nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores, por eletroforese em campo pulsado
(Pulsed-field gel electrophoresis – PFGE).
- Avaliar as condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos durante as diferentes
etapas do processamento do alimento - desde a aquisição da matéria-prima, armazenamento, pré-
preparo, preparo, manutenção e distribuição para consumo – através da aplicação de uma lista de
verificação das Boas Práticas de Fabricação (checklist) elaborada de acordo com os itens da RDC
nº 216 de 15 de setembro de 2004 - ANVISA.
37
5. MATERIAL E MÉTODO
5.1 Desenho experimental
Para esse estudo foram coletas amostras de pescado no período de setembro de 2013 a
fevereiro de 2014, em três restaurantes do tipo self-service, localizados nos municípios do Rio de
Janeiro e Niterói. Foram coletadas, de forma asséptica, 31 amostras no total, sendo 11 amostras do
restaurante 1 (R1), 10 amostras dos restaurantes 2 e 3 respectivamente (R2) e (R3). Essas amostras
foram provenientes de 3 tipos de peixe: salmão (Salmo salar), atum (Thunnus sp.) e namorado
(Pseudopercis numida); e divididas em dois grupos: a) produto final - sushi e sashimi antes de sua
exposição à venda; b) pescado adquirido inteiro (matéria-prima) ou na forma de filé. Também foram
coletadas amostras provenientes das mãos e fossas nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores
deste alimento, com auxílio de swabs estéreis que posteriormente foram incluídas em meio de
transporte Stuart. Todas as amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento das análises
microbiológicas.
5.2 Análise microbiológica e isolamento de SCP em preparados a base de peixe cru (sushi e
sashimi) e manipuladores
As análises microbiológicas foram realizadas segundo a Instrução Normativa nº 62, de 26 de
agosto de 2003 (BRASIL, 2003) do MAPA. Para isso, 25 g de cada amostra foram adicionadas a 225
mL de solução salina peptonada 0,1% e levadas ao homogeneizador de alimentos Stomacher®
(Seward Stomacher® 400 circulator, West Sussex, Reino Unido), a 220 rpm durante 2 min. Foram
efetuadas cinco diluições seriadas a partir desta primeira e 0,1 ml de cada diluição inoculada em ágar
Baird-Parker. As placas foram incubadas a 36 ± 1ºC por 30 a 48h. Para cada amostra, uma placa
contendo entre 20-200 colônias foi selecionada e as contagens de colônias típicas e atípicas foram
registradas separadamente. Em seguida foram selecionadas de três a cinco colônias de cada tipo:
típicas (T) e atípicas (A), e semeadas em tubos contendo caldo cérebro-coração (BHI), para
confirmação, e incubadas a 36 ± 1ºC por 24h. A partir da cultura pura em BHI foram realizadas as
seguintes provas complementares e confirmativas:
- Prova da coagulase: foi transferido 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis
contendo 0,3 ml de plasma de coelho e incubados a 36 ± 1ºC por 6h, onde foi observada a presença ou
não de coágulos.
- Coloração de Gram: foram preparados os esfregaços das colônias e em seguida corados pelo
38
método de Gram. A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus
aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes
complementares.
- Prova da catalase: com o auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou
pipeta de Pasteur, estéreis, foi retirado uma alíquota do cultivo em ágar-estoque e transferido para
uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%, misturando o
inoculo ao peróxido. A não formação de borbulhas foi considerada prova negativa para catalase,
sendo que Staphylococcus aureus é catalase positiva.
Os mesmos testes foram efetuados para as amostras provenientes de swabs de mãos e fossas
nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores.
5.3 Testes de PCR para identificação dos isolados
Testes de PCR foram utilizados para identificação das cepas de S. aureus. A liberação do
DNA foi realizada por lise térmica, no qual foi utilizado 100µL de TE (Tris 15 mM e EDTA 0,1 mM)
conforme descrito por Dias e colaboradores (2008).
A presença do gene femA foi usada como critério de classificação, no qual foi utilizado o
seguinte par de primer: femAf (5’ AAA AAA GCA CAT AAC AAG CG 3’) e femAr (5’ GAT AAA
GAA GAA ACC AGC AG 3’), de acordo com Mehrotra e colaboradores (2000).
Foram gerados amplicons de 132 pb com desnaturação inicial a 94ºC/5min, seguido de 35
ciclos (desnaturação a 94°C/2min, anelamento a 55ºC/30s e extensão a 72ºC/1min) e extensão final de
72ºC/7min. As amplificações foram realizadas em termociclador MyCycler Thermal Cycler (Bio Rad,
Hercules, CA, USA).
A visualização desses amplicons foi realizada em fotodocumentador Mini Lumi® (TelAvive,
Israel CA) após corrida eletroforética em gel de agarose a 2% (100V, 200 mA por 80min) corado com
GelRed (Biotium®, Califórnia, USA).
5.4 Identificação dos isolados por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA
Cepas de SCP que não foram amplificadas pelo gene femA foram submetidas ao
sequenciamento da região V5 do gene 16SrDNA. As condições da PCR foram realizadas conforme
descrito por Lee e colaboradores (2007) que amplificavam um fragmento de 240 pb. Os pares de
primer utilizados foram: 16SrDNAf (5'- CCG CCT GGG GAG TAC G 3') e 16SrDNAr (5'- AAG
39
GGT TGC GCT CGT TGC -3'), desnaturação inicial a 94ºC/3min, seguido de 35 ciclos (desnaturação
a 94°C/1min, anelamento a 55ºC/1min e extensão a 72ºC/1min) e extensão final de 72ºC/5min.
Os produtos obtidos foram purificados com kit de purificação (illustra™ GFX™ PCR DNA
and Gel Band Purification Kit) (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Os produtos de
PCR foram sequenciados utilizando 20ng de DNA purificado e 13µl dos pares de primer, num
volume final de 20µl (Applied Biosystems, CA, EUA). Após a amplificação, os produtos foram
purificados de acordo com o protocolo do kit BigDye Terminator Purificação X™ (Applied
Biosystems, CA, EUA) e sequenciados num sequenciador de 3130 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, CA, EUA). Sequências produzidas foram editadas com o software Bio Edit v.7.2.5
(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html).
Posteriormente as sequências resultantes foram comparadas com sequências bacterianas
depositadas na base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI/BLAST).
5.5 Comparação do perfil clonal de S. aureus por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Colônias de S. aureus cultivadas em ágar Baird-Parker e identificadas pelas provas bioquímicas e
pela PCR do gene femA foram embebidas em agarose de baixo ponto de fusão. A parede celular
bacteriana foi lisada com lisostafina e, após tratamento com proteinase K, submetida a lavagens com
tampão Tris-EDTA. Posteriormente o DNA foi digerido com endonuclease de restrição SmaI como
previamente descrito por Vivoni e colaboradores (2005). Os fragmentos foram separados por
eletroforese em campo pulsado, em gel de agarose a 1,2% em TBE 0,5x, no equipamento CHEF
DRIII system (Bio-Rad Laboratories, CA, USA), utilizando as seguintes condições: tempo inicial de
1s, tempo final de 35s por 21h, a 6V/cm. Após a corrida, os géis foram corados em solução 0,5 μg/mL
de brometo de etídio e documentados em transluminador MiniLumi Bio-Imaging (BioAmerica®
Califórnia, USA) e analisados com o software BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk , Bélgica). O
padrão de referência S. aureus NCTC 8325 foi incluído na primeira e na última raia de cada gel. A
semelhança de padrões de bandas foi avaliada por meio do coeficiente de Dice e o dendograma foi
construído com base nos percentuais de similaridade que foi gerado pelo método UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Os isolados que apresentaram coeficiente de
similaridade ≥ 80% foram considerados do mesmo genótipo e a interpretação visual foi realizada
usando o critério de Van Belkum e colaboradores (2007).
40
5.6 Teste de suscetibilidade dos isolados a agentes antimicrobianos (TSA)
Alíquotas de cultivo dos isolados, equivalente a 0,5 unidades McFarland, foram plaqueadas
em meio agar Muller Hinton com uso de swab estéril. Inoculou-se o cultivo líquido, em toda a
superfície do meio, em pelo menos três sentidos, girando a placa após cada espalhamento. Então,
foram colocados cuidadosa e assepticamente os discos contendo os agentes antimicrobianos sobre a
placa, com auxílio de pinça previamente esterilizada.
Os antibióticos utilizados para o teste foram clindamicina (2g), cefoxitina (30g),
rifampicina (5g), eritromicina (15g), tetraciclina (30g), vancomicina (30g), ciprofloxacina
(5g), cloranfenicol (30g), linezolida (30g) e cefepime (30g).
As placas com os polidiscos foram incubadas a 37ºC por 18h. Após este período, os halos de
inibição foram mensurados com auxílio de um halômetro. A interpretação do teste foi baseada na
tabela que determina as medidas padrões dos halos de inibição para cada agente antimicrobiano,
segundo a classificação: resistente, intermediário e sensível, de acordo com orientações do CLSI
(NCCLS, 2015).
5.7 Avaliação dos restaurantes estudados quanto aos critérios de Boas Práticas na
Manipulação dos Alimentos
Os critérios de Boas Práticas de Fabricação adotados em cada restaurante foram avaliados
através de uma lista de verificação (Anexo 1) elaborada de acordo com a RDC 216 de 15 de setembro
de 2004, da ANVISA, a qual estabelece o Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços de
Alimentação. Foram avaliados itens relacionados à edificações e instalações; higienização; controle
integrado de pragas; abastecimento de água; manejo de resíduos; manipuladores de alimentos;
matérias primas e embalagens; preparação do alimento; armazenamento e transporte; exposição ao
consumo; documentação, registros e responsabilidade técnica.
Os restaurantes foram classificados em três grupos de acordo com o percentual de adequação
obtido utilizando a metodologia adotada por Saccol e colaboradores (2013): Grupo 1 entre 76-100%
de adequação; Grupo 2 entre 51-75% de adequação e Grupo 3 entre 0- 50% de adequação.
5.8 Análise de dados
A análise dos dados foi feita por uma planilha eletrônica usando o Excel (MicrosftTM
Inc) e
Epi Info 7. Os dados obtidos pelo sequenciamento e PFGE foram analisados utilizando o software
Bionumerics 2014.
41
5.9 Aspectos éticos
Previamente ao início dos experimentos, o projeto em questão foi submetido e aprovado pelo
comitê de ética da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob n° 353.290, visto que as análises
envolvem seres humanos (manipuladores de alimentos) e dependem da aprovação e emissão de um
termo de consentimento que foi assinado pelo responsável de cada estabelecimento e por cada
manipulador participante.
42
6. RESULTADOS
6.1 Análise microbiológica do pescado in natura, preparados a base de peixe cru (sushi e
sashimi) e manipuladores
A análise da avaliação microbiológica do pescado in natura e suas preparações demonstrou
que em todas (100%) as amostras de pescado provenientes dos 03 estabelecimentos (R1, R2 e R3) foi
detectada a presença de Staphylococcus coagulase positiva (SCP). Destas, 29% (9/31) apresentaram
contagem de patógenos acima do valor estabelecido pela legislação brasileira - RDC n°12 (BRASIL,
2001), que tem como limite máximo 5x103 UFC/g, como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1. Valores mínimos e máximos em UFC/g, de Staphylococcus coagulase positiva (SCP)
encontradas em amostras de peixes, filés e preparados (sushi e sashimi) de salmão, atum e
namorado, coletados em três restaurantes (R1, R2, R3) dos municípios do Rio de Janeiro e
Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
Restaurante
Número
de
amostras
Valores mínimos e
máximos (UFC/g)
SCP
nº e % de
amostras
reprovadas
R1 11 0,3x10² - 1,1 x 104 3 (27%)
R2 10 9,0x10² - 2,2 x 10³ 0
R3 10 9,0x10² - 14,1 x 10³ 6 (60%)
Total 31 - 9 (29%)
As contagens médias de SCP nas amostras de pescado matéria prima, filé e preparado de
sushi e sashimi, de todos os estabelecimentos estudados foram, respectivamente, de: 4,22x10³
UFC/g; 2,59x10³ UFC/g; 4,62x10³ UFC/g; e 3,94x10³ UFC/g. Foi identificado em matéria-prima
(namorado in natura) contagem de SCP acima do estabelecido pela legislação para alimento
consumido cru.
Foram analisadas um total de 9 amostras de atum (Thunnus sp.), 10 amostras de namorado
(Pseudopercis numida) e 12 amostras de salmão (Salmo salar). Os seguintes percentuais de
reprovação foram observados: 66,7% (6/9) das amostras de atum, 40% (4/10) de namorado e
50% (6/12) de salmão, apresentando contagens de SCP acima do limite estabelecido pela
43
legislação. Os resultados específicos por tipo de amostra estão descritos nas tabelas 2, 3 e 4.
Tabela 2. Análises microbiológicas (UFC/g), de Staphylococcus coagulase positiva em amostras
de filé e preparados (sushi e sashimi) de atum (Thunnus sp.), coletados em três restaurantes dos
municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
Amostra e
nº de amostras (N)
Valores mínimos e
máximos (UFC/g)
nº e % de Amostras
reprovadas
Atum filé – AF (3) 1,1 x 10³ - 7,8 X 10³ 3 (100%)
Atum sushi – AS (3) 1,0 x 10³ - 14,1 x 10³ 1 (33,3%)
Atum sashimi – ASSM (3) 0,6 x 10³ - 11,4 x 10³ 2 (66,7%)
Total (9) - 6 (66,7%)
Tabela 3. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de Staphylococcus coagulase positiva
em amostras de matéria-prima, filé e preparados (sushi e sashimi) de namorado (Pseudopercis
numda), coletados em três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de
setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
Amostra e
nº de amostras (N)
Valores mínimos e
máximos (UFC/g)
nº e % de amostras
reprovadas
Namorado matéria prima – NMP (1) 8,0 x 10³ 1 (100%)
Namorado filé – NF (3) 0,3 x 10³ - 4,4 x 10³ 1 (33,3%)
Namorado sushi – NS (3) 0,5 x 10³ - 4,8 x 10³ 1 (33,3%)
Namorado sashimi – NSSM (3) 0,1 x 10³ - 6,4 x 10³ 1 (33,3%)
Total (10) - 4 (40%)
44
Tabela 4. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de Staphylococcus coagulase positiva
em amostras de matéria-prima, filé e preparados (sushi e sashimi) de salmão (Salmo salar),
coletados em três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de
setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
Amostra e
nº de amostras (N)
Valores mínimos e
máximos (UFC/g)
nº e % de Amostras
reprovadas
Salmão matéria prima – SMP (3) 0,1x 10³ - 0,9 x 10³ 0
Salmão filé – SF (3) 0,1 x 10³ - 6,5 x 10³ 1 (33,33%)
Salmão sushi – SS (3) 0,4 x 10³ - 11,1 x 10³ 2 (66,66%)
Salmão sashimi-SSSM (3) 1,3 x 10³ - 6,4 x 10³ 3 (100%)
Total (12) - 6 (50%)
Não foi observado contagem de SCP acima do estabelecido pela legislação para a matéria
prima de salmão. No entanto, todos os estabelecimentos trabalham com a matéria-prima de atum
já filetada, ou seja, previamente manipulada pelo fornecedor. Para esse pescado, foi observado
contagens de SCP acima do limite estabelecido para alimentos consumidos crus em todas as
amostras analisadas.
Quanto aos manipuladores, foram coletadas amostras de mãos, fossas nasais e
orofaringeanas de 6 manipuladores, sendo 3 funcionários do R1, 2 do R2 e 1 do R3. Foram
obtidas 30 colônias de manipuladores com características morfológicas típicas de SCP, com 17
colônias confirmadas (57%). O estabelecimento que apresentou maior percentual (77%) de
colônias de SCP confirmadas foi o R1, apresentando também contagens elevadas de SCP em
amostras de alimentos. Esses resultados podem ser observados nas tabelas 5 e 6.
45
Tabela 5. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores quanto a presença de
Staphylococcus coagulase positiva por estabelecimento estudado, no período de setembro de
2013 a fevereiro de 2014 (nos municípios do Rio de Janeiro e Niterói).
Restaurante Amostras coletadas em
manipuladores (N)
Nº de amostras onde foi
detectado presença de SCP (n)
R1 13 10 (77%)
R2 13 5 (38%)
R3 4 2 (50%)
TOTAL 30 17 (57%)
Dentre as amostras de manipuladores analisadas nos três estabelecimentos, foi detectado
maior percentual de SCP no restaurante R1, com presença em 77% (10/13) das amostras
analisadas (Tabela 5).
Quanto aos resultados de isolamento por região anatômica dos manipuladores de
alimentos, observou-se maior presença de SCP nas mãos dos manipuladores, com 92% (11/12)
das amostras confirmadas. A cavidade orofaringeana apresentou maior ocorrência (67%) do que a
cavidade nasofaringeana (17%) (Tabela 6).
Tabela 6. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores quanto a presença de
Staphylococcus coagulase positiva de nasofaringe, orofaringe e mãos dos manipuladores de três
restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a
fevereiro de 2014.
Região anatômica do corpo dos
manipuladores
Amostras coletadas
(N)
Nº de amostras onde foi
detectado presença de
SCP (n)
Cavidade nasofaringeana 12 2 (17%)
Cavidade orofaringeana 6 4 (67%)
Mãos 12 11 (92%)
TOTAL 30 17 (57%)
46
6.2 Identificação dos microrganismos isolados por técnicas moleculares
6.2.1 Baseadas em PCR
Entre as 31 amostras provenientes de pescado e 17 de manipuladores nas quais foram
identificadas SCP pela microbiologia convencional, 12 foram confirmadas como S. aureus
através da PCR, sendo sete (58%) isoladas de manipuladores e cinco (42%) provenientes de
alimentos (Figura 2).
Figura 2. Identificação de S. aureus em amostras de preparados de peixe cru e manipuladores de três
restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de
2014.
6.2.2 Baseadas no sequenciamento parcial do gene 16S rDNA
Os isolados que não apresentaram o produto amplificado para o femA foram sequenciados
e os resultados estão descritos na tabela 7. Outro estudo em paralelo, avaliou presença de
Salmonella sp. e Listéria sp. (gene invA e hly) nas mesmas amostras e a identificação dos
isolados com resultados negativos também foi realizada por sequenciamento do gene 16SrDNA
(Lopes, 2015).
A técnica de sequenciamento não obteve uma identificação satisfatória em seis dos
isolados bacterianos. Dentre as bactérias identificadas, 25 isolados (42,4%) eram Gram negativos
M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A PCR foi realizada com primers específicos para o gene femA. M:
marcador de tamanho de fragmento de 100 pb; (+): controle positivo
(DNA de S. aureus - ATCC 29213); (-): controle negativo (DNA de E.
coli).1 a 12: amostras de filé, sushi, sashimi e manipuladores coletadas em
3 restaurantes (em Niterói e no Rio de Janeiro). Os fragmentos de 240pb
são específicos de S. aureus.
47
e 34 isolados (57,6%) Gram positivos. Dentre os grupos de bactérias Gram negativas houve
maior prevalência de membros da família Enterobacteriaceae, com 22 cepas identificadas (88%).
Os demais, três isolados (12%) Gram-negativos foram identificadas como Pseudomonas
aeroginosa, Pseudomonas mendocina e Citrobacter freundii. Oito isolados (36,4%) foram
identificados como Klebsiela pneumonae. Em relação ao gênero Enterobacter sp., 8 isolados
também foram identificadas como Enterobacter clocae. Foram também identificados três
isolados de Serratia sp. (13,7%), além de um isolado identificado como Hafnia alvei (4.5%); 1
isolado, Providencia alcalifaciens (4,5%) e um como Proteus peneri (4,5%).
Dos 34 isolados Gram positivas, 12 foram inicialmente identificadas por provas
bioquímicas como SCP e não expressaram o gene femA. Destes, 6 (17,6%) foram identificados
como Staphylococcus sp. e 6 isolados como sendo bactérias filogeneticamente relacionadas ao
gênero Staphylococcus sp. (17,6%). Em relação aos isolados classificados bioquimicamente
como Staphylococcus coagulase negativa (SCN), 8 isolados foram identificadas como S.
epidermidis (23,5%) sendo que todos provenientes das mãos de manipuladores. Staphylococcus
epidermidis é o mais frequente dos SCN presentes em superfícies epiteliais humanas (Kloos,
1975).
Foram também identificados 11 isolados do gênero Enterococcus sp. (32,5%), sendo que
destes, 8 isolados eram da espécie Enterococcus faecalis.
48
Tabela 7. Identificação de isolados bacterianos por sequenciamento parcial do 16S rDNA.
Nº de
isolados Micro-organismo identificado
Nº de
isolados Micro-organismo identificado
1 Carnobacterium maltaromaticum KM409659.1 1 Kocuria kristinae JX861555.1
1 Carnobacterium maltaromaticum KJ124183.1 2 Kocuria rhizophila KM522854.1
1 Citrobacter freundii KM406465.1 2 Kocuria rosea LN714836.1
3 Enterobacter cloacae KC764978.1 1 Macrococcus caseolyticus EF032671.1
1 Enterobacter cloacae KC920586.1 1 Proteus peneri KC764983.1
1 Enterobacter cloacae FJ605381.1 1 Providencia alcalifaciens HQ407246.1
2 Enterobacter cloacae CP010377.1 1 Pseudomonas aeruginosa HF572851.1
1 Enterobacter cloacae CP010384 1 Pseudomonas mendocina KF886277.1
1 Enterococcus casseliflavus KJ803874.1 1 Serratia liquefaciens DQ530081.1
1 Enterococcus faecalis KP090135.1 1 Serratia liquefaciens- FJ811866.1
1 Enterococcus faecalis KF826013.1 1 Serratia marcescens JF441244.1
2 Enterococcus faecalis HQ259951.1 2 Staphylococcus aureus KP224306.1*
1 Enterococcus faecalis KP120832.1 1 Staphylococcus aureus KJ725089.1*
1 Enterococcus faecalis EU708623.1 1 Staphylococcus devriesei JX966457.1
1 Enterococcus faecalis KJ585672.1 2 Staphylococcus epidermidis FJ613567.1
1 Enterococcus faecalis KF709388.1 2 Staphylococcus epidermidis KM874438.1
2 Enterococcus thailandicus NR044160.1 3 Staphylococcus epidermidis KP004919.1
1 Hafnia alvei JX267126.1 1 Staphylococcus epidermidis KC634094.1
1 Klebsiella pneumoniae CP010361.1 1 Staphylococcus haemolyticus KM652207.1
1 Klebsiella pneumoniae GU128173.1 2 Staphylococcus saprophyticus KJ540934.1
1 Klebsiella pneumoniae KC434996 1 Vagococcus fluvialis JX026018.1
1 Klebsiella pneumoniae LN624806.2
2 Klebsiella pneumoniae HQ259959.1
1 Klebsiella pneumoniae JQ838155.1
6.3 Comparação do perfil clonal de S. aureus por PFGE
Quinze isolados identificados pelos métodos moleculares baseados na amplificação do
DNA, 12 pelo teste de PCR e 3 confirmadas pelo sequenciamento parcial do gene rDNA 16S
como S. aureus, foram tipificadas por PFGE, sendo oito destes isolados provenientes de
manipuladores e sete provenientes de amostras de pescado.
Conforme demonstrado na figura 3, o genótipo A agrupou cinco amostras distribuídas em
três perfis diferentes (A1, A2 e A3), apresentando >80% de similaridade. Três das amostras com
49
perfil A1 foram coletadas da mão de manipuladores do R1 e R3, apresentando-se idênticas à cepa
de referência S. aureus ATCC 29213. Além disso, do manipulador do R3 foi coletada uma
amostra de fossa orofaringeana (A2) que apresentou apenas uma banda de diferença da amostra
coletada da mão. A amostra relacionada ao pulsotipo A3, foi isolada de pescado.
Ao analisar o genótipo B, observou-se 3 amostras idênticas (B1) isoladas do mesmo
restaurante (R1), uma proveniente da mão de um manipulador e as demais provenientes de
alimentos manipulados por ele (sushi de atum e filé de namorado) com perfis idênticos (figura 2).
Este resultado sugere que cepas de S. aureus provenientes da mão do manipulador estão sendo
transferidas para os alimentos.
Figura 3. Dendograma de distribuição dos perfis clonais e resistência a antimicrobianos observados entre
S. aureus isolados de preparações a base de peixe cru (sashimi e shushi) e manipuladores em restaurantes
(R1, R2 e R3) dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de
2014.
* Perfis de fragmentação do DNA cromossômico, chamados pulsotipos (PT) agrupados em 10 genótipos (A - J).
** Antimicrobianos testados : CLI – clindamicina/ CFX – cefoxitina/ RIF – rifampicina/ ERI – eritromicina/ TET
– tetraciclina/ VAN – vancomicina/ CIP – ciprofloxacina/ CLO – cloranfenicol/ LIN – linezolida/CPM – cefepime
R: resitente oxacilina (CLSI, 2015)
50
6.4 Teste de suscetibilidade a substâncias antimicrobianas (TSA)
Como foi mostrado na Figura 2, não foi observado resistência à tetraciclina, ciprofloxacina,
linezolida e vancomicina em nenhum dos isolados de S. aureus testados. Foi observado que
13,3% (2/15) dos isolados apresentaram resistência para os antibióticos clindamicina, cefepime e
rifampicina. Para os antimicrobianos cloranfenicol e eritromicina, 20% (3/15) das amostras
apresentaram resistência. A cepa isolada da mão do manipulador do R3 apresentou resistência a
cefoxitina, sendo confirmada como MRSA através do teste de concentração inibitória mínima
(MIC).
6.5 Avaliação de critérios de Boas Práticas na Manipulação dos Alimentos
Em relação à avaliação das Boas Práticas de Manipulação de Alimentos, realizada através do
preenchimento de uma lista de verificação no momento da coleta das amostras, os restaurantes
R1 e R3 apresentaram 59% (84/143) e 62% (87/143) de conformidade, respectivamente. Foram
classificados no Grupo 2, com adequação entre 51 e 75%, demonstrando falhas nas condições
higiênico-sanitárias. O estabelecimento R2 apresentou 82% (116/143) de conformidade, sendo
classificado no Grupo 1, por apresentar adequação superior a 76%. O estabelecimento R2 foi
considerado como em condições higiênico-sanitárias satisfatórias por atingir um percentual
mínimo de 80% de conformidades. Nas figuras 4, 5 e 6 pode-se visualizar a distribuição dos
percentuais de adequação de cada estabelecimento de acordo com os itens da RDC 216
(ANVISA).
51
Figura 4. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do estabelecimento R1 de acordo
com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 216 - ANVISA.
Figura 5. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do estabelecimento R2 de acordo
com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 216 - ANVISA.
52
Figura 6. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do estabelecimento R3 de acordo
com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 216 - ANVISA.
Observou-se que os itens “responsabilidade técnica” e “abastecimento de água”
apresentaram 100% de conformidade em todos os estabelecimentos. Todos os demais itens
apresentaram não conformidades.
Como pode ser observado na figura 6, o estabelecimento que atingiu melhor qualidade
microbiológica (contagem total de SCP) nos alimentos, foi o estabelecimento R2, que também
apresentou maior percentual de conformidades, ou seja, critérios higiênico-sanitários melhor
controlados.
53
Figura 7. Relação entre as amostras reprovadas quanto aos limites estabelecidos pela RDC 12 – ANVISA
e percentual de adequação das Boas Práticas definidas pela RDC 216 – ANVISA.
54
7. DISCUSSÃO
Dados fornecidos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e estatística (IBGE, 2010), referentes
ao período 2008 e 2009 mostraram que a aquisição domiciliar média per capita de pescado no
Brasil foi estimada em 4 kg/ano. Segundo dados do governo federal brasileiro durante o período
de 2012 e 2013, o consumo de pescado no país aumentou 25% (Portal Brasil, 2014). Esse
aumento foi observado sobretudo na região sudeste do pais, com destaque ao estado do Rio de
Janeiro, o qual apresentou um consumo de pescado de 5,5 kg/ano (IBGE, 2011). De acordo com
um estudo retrospectivo realizado entre o período de 1996 a 2009, a população da região
metropolitana do Rio de Janeiro (RMRJ) apresentou um crescimento de 14,15%, assim como foi
observado neste período que o consumo de pescado aumentou mais que proporcionalmente
atingindo 28,84% (INFOPESCA, 2009).
A disseminação da culinária japonesa no habito alimentar brasileiro tem contribuído
fortemente para alavancar o consumo de pescado no país (Santos, 2006). Da mesma forma que
tem crescido o número de estabelecimentos comerciais interessados em servir este tipo de
iguaria, é necessário que as agências reguladoras estejam atentas a possíveis falhas na cadeia
produtiva das preparações a base de pescado cru, tais como treinamento de manipuladores para
qualificação da mão de obra para preparar este tipo de refeição, além de instalações adequadas
para a exposição do alimento sob refrigeração (Martins, 2006). O processo de preparação de
sushi e sashimi apresenta características específicas que podem contribuir para a introdução ou
aumento de riscos microbiológicos. Primeiramente porque a maioria dos ingredientes utilizados
são consumidos crus e os que são consumidos cozidos não são reaquecidos antes do consumo.
Além disso, a preparação envolve o manuseio sem luvas, mantendo contato direto com as mãos
dos manipuladores.
No presente estudo foi obtida contagem de Staphylococcus coagulase positiva superior ao
valor estabelecido pela legislação brasileira - RDC n°12 em 29% (9/31) nas amostras, à base de
pescado cru, analisadas. Resultados semelhantes foram observados em Portugal, onde 33% das
amostras de sashimi apresentaram contagens em desacordo com a legislação (Miguéis et al,
2015). Porém, em estudo realizado por Leisner e colaboradores (2014), contagens menores
foram observadas para Staphylococcus sp. em sushi na Dinamarca, onde os valores ficaram <2 a
3.0 UFC/g. Para alimentos comercializados no MERCOSUL a contagem final se refere a SCP.
Isso ocorre devido ao fato de algumas espécies de Staphylococcus relacionadas a animais, tais
55
como S. intermedius, S. hyicus, S. delphini, entre outros, também apresentarem reação positiva
para a prova de coagulase.
Oliveira e Marques (2012) realizaram um estudo de avaliação das condições higiênico-
sanitárias na preparação e comercialização de sushi e sashimi em um supermercado, localizado
em Cariri Cearense, CE. O setor de preparação foi avaliado, sendo realizados testes de Swab,
análises microbiológicas dos produtos prontos para o consumo e aplicação de um checklist sobre
as condições higiênico- sanitárias do setor. No teste de Swab dos equipamentos, utensílios e
mãos dos manipuladores, os resultados indicaram contaminação por bactérias mesófilas acima do
permitido, em 7 das 8 amostras avaliadas (87,4%), indicando uma higienização insatisfatória nos
processos do setor. Nas análises microbiológicas do sushi de salmão, sushi de camarão, salada de
camarão e sashimi, somente a salada de camarão apresentou Staphylococcus sp. acima do
permitido pela ANVISA, 2001. A lista de verificação do setor resultou em 78,57% de
conformidades, equivalendo a 6 não conformidades dos 28 itens avaliados, indicando o não
seguimento de alguns pontos importantes das Boas Práticas de Fabricação, imprescindíveis para
garantir a produção de alimentos mais seguros. Diante de todos os resultados obtidos, os autores
afirmaram que as condições higiênico-sanitárias na preparação dos sushis e sashimis do
estabelecimento em estudo não eram adequadas.
Métodos analíticos mais sensíveis e específicos são utilizados para identificação de
microrganismos patogênicos a partir de amostras de alimentos. Os métodos moleculares têm sido
utilizados de maneira rotineira para a identificação de cepas isoladas por microbiologia clássica
em plantas industriais de processamento de alimentos (COCOLIN & ERCOLINI, 2008). Dentre
esses, a PCR e o sequenciamento de genes conservados consistem nas ferramentas moleculares
mais utilizadas nos últimos anos, devido a sua praticidade, alta sensibilidade e especificidade
dentre os métodos de diagnósticos disponíveis para identificação de bactérias patogênicas.
Para confirmação da presença de S. aureus em amostras de pescado cru e manipuladores, foi
utilizado neste estudo a pesquisa do gene femA. Segundo Mehrotra e colaboradores (2000), o
gene femA tem um papel importante no metabolismo de S. aureus na fase de crescimento ativo,
sendo por isso utilizado na identificação desta espécie bacteriana. Entre as amostras de
alimentos e manipuladores identificadas como SCP pela microbiologia convencional, 12 foram
confirmadas como S. aureus através da PCR e 03 foram identificadas pelo sequenciamento
parcial do gene 16SrDNA. O estabelecimento R1 apresentou maior número de amostras
56
positivas para o gene femA, com 50% (6/12) dos isolados confirmados. Aproximadamente 60%
(7/12) das amostras identificadas como S. aureus foram provenientes de manipuladores e as
demais (5/12) foram isoladas em amostras de alimentos conforme pode ser observado na figura
3. Hammad e colaboradores (2012) identificaram alta prevalência de S. aureus em sashimi no
Japão, e ressaltaram a necessidade de medidas de higiene mais estritas para esse tipo de
preparações. Conforme demonstrado por Acco e colaboradores (2003) o manipulador tem alto
potencial para contaminação de alimentos e o treinamento desses profissionais com Boas
Práticas na manipulação é essencial.
A presença de S. aureus é um indicador de práticas inadequadas na manipulação de
alimentos, visto que este consiste em um microrganismo que pode colonizar diferentes partes do
corpo humano, sem necessariamente estar associado a alguma patologia. Neste estudo, 57% (4/7)
das cepas de S. aureus isoladas de manipuladores foram provenientes de R1. Ao avaliar os
resultados obtidos em relação à adequação das boas práticas desse estabelecimento, observou-se
adequação inferior a 43% dos itens relacionados às práticas de higiene de manipuladores,
apresentando não conformidades como hábitos de higiene inadequados, falhas nos
procedimentos de higienização das mãos e presença de lesões e enfermidades (como feridas nas
mãos). Para avaliar possíveis correlações entre o perfil clonal das cepas identificadas em
manipuladores com as cepas isoladas nos alimentos, as amostras confirmadas foram tipadas pelo
PFGE e analisadas quanto a similaridade de acordo com Van Belkum e colaboradores (2007).
Dentre os 15 isolados analisados foram observados 12 perfis de fragmentação de DNA
cromossômico, denominados pulsotipos (PT) agrupados em 10 (A – J) genótipos, onde 53%
(8/15) das amostras foram provenientes do R1. Amostras idênticas (3) foram observadas neste
mesmo restaurante (B1), encontradas nas amostras de alimentos e ao mesmo tempo na mão do
manipulador responsável pelo preparo, sugerindo que este manipulador seja o veículo de
contaminação (Figura 3). Tal ocorrência se relaciona às não-conformidades quanto aos critérios
de higienização das mãos no momento da manipulação neste mesmo restaurante. Situação
semelhante foi observada por André e colaboradores (2008), onde os autores identificaram cepas
idênticas de S. aureus na matéria-prima e no produto final de uma indústria de alimentos. O
mesmo estudo relatou similaridade em cepas isoladas de manipuladores, sugerindo contaminação
cruzada no processamento desses alimentos.
No presente estudo, nas amostras de R2 não foram observados pulsotipos do mesmo
57
genótipo, ou seja, cepas com o mesmo perfil clonal (similaridade acima de 80%), não sendo
possível correlacionar S. aureus isolados de alimentos com os isolados de manipuladores. Para o
mesmo restaurante observou-se maior rigor entre as práticas de higiene e um percentual de
adequação às boas práticas acima de 80%, com percentual de conformidades muito próximo de
100% para o quesito manipulador de alimentos. Esses dados demonstram a eficácia das boas
práticas na manipulação do alimento para a prevenção da contaminação cruzada.
As amostras do restaurante R2 apresentaram melhor perfil de suscetibilidade aos agentes
antimicrobianos testados. A linhagem de S. aureus proveniente do manipulador do R2 apresentou
sensibilidade para todos os antimicrobianos testados, sendo apenas um isolado de sashimi de
salmão resistente para dois compostos antimicrobiano testados (eritromicina e clorofenicol). As
cepas de R3 apresentaram maior perfil de resistência, em 8 dos 33 testes realizados, sendo que a
amostra proveniente da mão do manipulador (A1) apresentou resistência à cefoxitina e foi
confirmada como MRSA pelo MIC para oxacilina. Considerando que esse estabelecimento
apresentou baixo percentual de adequação às boas práticas (62,4%) e itens significativos
referentes a higienização das mãos, referentes a treinamento e quanto os aspectos de higiene dos
manipuladores em não conformidade, é importante implementar ações que garantam que
isolados resistentes (ou multirresistentes) a antimicrobianos utilizados no tratamento de
infecções estafilocóccicas não sejam disseminados por contaminação cruzada.
Entre as três amostras do R3 , foi possível relacionar isolados coletados da mão e da fossa
orofaringeana do mesmo manipulador, apresentando similaridade acima de 80%. Sugere-se,
portanto, uma possível disseminação de linhagem que coloniza a fossa orofaringeana para a mão
do mesmo. Hatakka e colaboradores (2000) avaliaram 153 amostras de mão e 136 amostras
nasais de funcionários de catering aéreo que trabalham com manipulação e distribuição de
refeições, observando maior prevalência de S. aureus em amostras da cavidade nasal do que nas
mãos dos manipuladores. O perfil clonal dessas cepas isoladas da equipe de bordo foi analisado
por PFGE demonstrando que, na maioria dos casos, o mesmo perfil dos isolados da cavidade
nasal foi observado nas mãos, concluindo que a amostragem nasal é a área mais indicada para
identificar portadores assintomáticos de S. aureus e que as amostragens de mãos podem revelar
contaminação, ou seja, carrear cepas provenientes da cavidade nasal para o alimento.
58
8. CONCLUSÕES
- Preparações a base de pescado cru servidas nos 03 restaurantes avaliados no município do
Rio de Janeiro e Niterói estavam contaminadas.
- A contaminação foi decorrente da matéria-prima do pescado utilizado para a produção
destas refeições e a falhas no cumprimento das boas praticas na manipulação preconizada
pela legislação sanitária federal.
- A eletroforese em campo pulsado (PFGE) das cepas de S. aureus mostrou a correlação entre
perfis clonais bacterianos presentes em amostras coletadas de manipuladores e amostras de
alimentos no restaurante R1.
- O sequenciamento parcial do gene 16S rDNA permitiu a identificação de diferentes espécies
de Staphylococcus sp. nas amostras de pescado cru e mostrou a presença de outros grupos
bacterianos com prevalência de membros da família Enterobacteriaceae (88%).
- A avaliação dos critérios de boas práticas demonstrou que os baixos índices de adequação
observados nos estabelecimentos R1 (59%) e R3 (62%), refletiram na qualidade
microbiológica das amostras de sushi e sashimi provenientes destes restaurantes.
- São necessárias tanto a implementação como a vigilância da adesão das Boas Práticas de
Fabricação para assegurar a qualidade sanitária destes alimentos e o atendimento às
legislações vigentes.
59
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68
ANEXO I:
CHECKLIST PARA AVALIAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS EM SERVIÇOS DE
ALIMENTAÇÃO
RELATÓRIO DE VISITA TÉCNICA
RDC 216 ANVISA
Unidade:
Data da Visita: Responsável:
TOTAL DE ITENS TOTAL DE ITENS
APLICÁVEIS TOTAL DE ITENS
CONFORME % OBTIDA DE
CONFORMIDADE
TOTAL MINIMO
REQUERIDO
154 #DIV/0! 80%
Conclusão
69
Considerando a RDC 216 de 15/09/2004 – Regulamento Técnico de Boas Práticas
para Serviços de Alimentação.
4.1 EDIFICAÇÃO E INSTALAÇÕES
C NC NA
4.1.1 - Fluxo ordenado, sem cruzamentos
Acesso controlado e independente
4.1.2 - Dimensionamento compatível
Separação com meios físicos
4.1.3 - Piso liso, impermeável, lavável
Parede lisa, impermeável, lavável
Teto liso, impermeável, lavável
Íntegros, conservados, s/ rachaduras, trincas, goteiras,
vazamentos, infiltrações, bolores, descascamentos
4.1.4 - Portas e janelas com batentes ajustados
Fechamento automático
Presença de telas e removíveis
Limpas
4.1.5 - Conexão com esgoto
Água corrente
Ralos sifonados
Grelhas com sistema de fechamento
4.1.6 - Caixa de gordura e esgoto fora das áreas de
armazenamento e preparo
4.1.7 - Áreas externas e internas sem objetos em desuso e
animais.
4.1.8 - Iluminação suficiente
Luminárias protegidas de queda e explosão nas áreas de
preparação
4.1.9 - Instalações elétricas embutidas e protegidas; de fácil
limpeza
4.1.10 - Ventilação com renovação, livre de fungos, gases, poeira
Fluxo de ar não direto nos alimentos
4.1.11 - Equipamentos e filtros para climatização conservados
Manutenção periódica, programada e com registro
4.1.12 - Instalações sanitárias e vestiários sem comunicação
direta com áreas de alimentos ou refeitórios
Organizados e em bom estado de conservação
Portas com fechamento automático
ITEM
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
70
C NC NA
4.1.13 - Instalações sanitárias com lavatórios com papel higiênico,
sabonete líquido inodoro, anti-séptico ou não, mais gel, toalha,
papel não reciclado ou outro método; lixeiras com tampa sem
acionamento manual
4.1.14 - Lavatórios exclusivos para mãos em posição estratégica
para o fluxo
Número suficiente
Facilidades (idem item 4.1.13)
4.1.17 - Superfícies lisas, impermeáveis, laváveis, isentos de
rugosidades, frestas e outras imperfeições (utilizados na
preparação, embalagem, armazenamento, transporte, distribuição
e comercial)
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
ITEM
TOTAL:
Observações:
Percentual de conformidade:
4.1.16 - Manutenção programada e periódica e calibração dos
equipamentos de medição e com registros.
4.1.15 - Materiais adequados de equipamento e utensílios
Bom estado de conservação, resistentes à corrosão,
limpeza e desinfecção.
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
71
4.2 HIGIENIZAÇÃO
C NC NA
4.2.1 - Instalações em boas condições de higiene
Operações de higienização feitas por pessoal capacitado
com comprovante
Frequência suficiente
4.2.2 - Caixa de gordura limpa periodicamente
4.2.3 - Quando não rotineiro são registradas as operações de
limpeza / desinfecção
4.2.4 – Higienização das áreas com freqüência suficiente,
inclusive pós trabalho
Evita-se formação de aerossóis
É proibido o uso de odorizantes (preparo e
armazenamento)
4.2.5 – Saneantes registrados pelo Ministério da Saúde
Diluição, tempo, modo de uso corretos (de acordo com o
fornecedor)
Identificados e guardados reservados
4.2.6 – Vassouras, rodos, etc exclusivos, conservados, disponíveis
em número suficiente, guardados diferentes para instalações e
equipamentos de contato
4.2.7 – Funcionários responsáveis por higienização com uniformes
certos e diferentes
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
Percentual de conformidade #DIV/0! %
ITEM
TOTAL:
Observações:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
72
4.3 CONTROLE INTEGRADO DE VETORES E PRAGAS
C NC NA
4.3.1 – Livres de pragas urbanas
Conjunto de ações eficazes e contínuas
4.3.2 – Controle químico (se necessário) feito por empresa
especializada com produtos aprovados pelo Ministério da Saúde
4.3.3 – Procedimentos pré e pós tratamento estabelecidos
Higienizar (quando aplicável) antes do uso
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
4.4 ABASTECIMENTO DE ÁGUA
C NC NA
4.4.1 – Água potável
Alternativa atestada 4.4.2 – Gelo feito de água potável4.4.3 – Vapor feito de água potável
4.4.4 – Reservatório edificado e revestido adequadamente
Livre de rachaduras, vazamentos, descascamentos
Limpos semestralmente
Tampados
Com registros
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
Observações:
ITEM
TOTAL:
Percentual de conformidade:
ITEM
Percentual de conformidade:
TOTAL:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
73
4.5 MANEJO DE RESÍDUOS
C NC NA
4.5.1 - Recipientes identificados e íntegros
Fácil higienização e transporte
Número suficiente e capacidade
4.5.2 - Coletores com tampas acionadas sem contato manual
4.5.3 - Coletados com boa freqüência
Estocados em local fechado e isolado
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
4.6 MANIPULADORES
C NC NA
4.6.1 - Controle de saúde registrado
4.6.2 - Com lesões e enfermidades afastados
4.6.3 - Bom asseio pessoal, uniformes compatíveis, conservados
e limpos
4.6.4 - Lavam as mãos nas horas certas
Cartazes afixados de lavagem / hábitos
Cartazes afixados de lavagem / hábitos nos banheiros
4.6.5 - Hábitos durante as atividades
4.6.6 - Cabelos presos, protegidos
Sem barba
Sem adornos, durante a manipulação
4.6.7 - Supervisionados
Capacitados em D.O.A. (Doença de Origem Alimentar),
higiene pessoal e manipulação higiênica
Comprovada com documentos
4.6.8 - Procedimentos corretos para visitantes
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
Percentual de conformidade:
ITEM
Observações:
TOTAL:
TOTAL:
ITEM
Percentual de conformidade:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
74
4.7 MATÉRIAS PRIMAS, INGREDIENTES, EMBALAGENS
C NC NA
4.7.1 - Critérios para avaliar fornecedores estabelecidos
Transporte de insumos
4.7.2 - Recepção em área protegida e limpa
Sem contaminação com alimentos prontos
4.7.3 - Inspecionados na recepção
Embalagens primárias íntegras
Temperaturas verificadas no recebimento
Armazenamento
4.7.4 - Produtos para devolução são devolvidos imediatamente?
Ou na impossibilidade são identificados e guardados
separadamente dos demais?
Determinada a destinação final
4.7.5 - Armazenamento limpo e organizado
Acondicionados e identificados
Prazos e validades
PVPS (primeiro que vence, primeiro que sai)
4.7.6 - Sobre paletes ou prateleiras
Cumprem espaçamentos
Paletes, superfícies – liso, resistente, lavável
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
TOTAL:Percentual de conformidade:
ITEM
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
75
4.8 PREPARAÇÃO DO ALIMENTO
C NC NA
4.8.1 - Matérias primas e ingredientes aptos
4.8.2 - Número suficiente de funcionários e equipamentos
4.8.3 - Cuidados com contaminação cruzada
4.8.4 - Lavam as mãos após crus para cozidos
4.8.5 - Tempo curto em temperatura ambiente
4.8.6 - Reembalam produtos com nome, data do fracionamento
e prazo de validade
4.8.7 - Limpam (quando necessário) embalagens das matérias
primas
4.8.8 - Cocção mínima a 70ºC (todas as partes)
4.8.9 - As temperaturas são verificadas
4.8.10 - Existem medidas que garantam que o óleo e a gordura
não contaminam quimicamente o alimento
4.8.11 - Óleos e gorduras em temperatura <180ºC ou trocados
se alteradas características
4.8.12 - Descongelamento bem feito (completo)
4.8.13 - Descongelamento sob refrigeração (5ºC) / microondas
4.8.14 - Após descongelamento são mantidos refrigerados e
não recongelados
4.8.15 - Conservação quente (acima de 60ºC) por no máximo 6
horas
4.8.16 - Resfriamento de 60ºC para 10ºC, no máximo em 2
horas, depois refrigerados a 5ºC ou congelados à – 18ºC
4.8.17 - Prazo de validade dos alimentos preparados (4ºC) até 5
dias
4.8.18 - Etiquetados (preparados) – nome, data do preparo e
prazo de validade e temperatura monitorada e registrada
4.8.19 - Crus higienizados com produtos autorizados pelo
Ministério da Saúde, sem deixar resíduos
4.8.20 - Manutenção de documentos de controle e garantia de
qualidade dos alimentos preparados
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
TOTAL:
ITEM
Percentual de conformidade:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
76
4.9 ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DOS ALIMENTOS PREPARADOS
C NC NA
4.9.1 - Rotulados e protegidos (nome, data, preparo, validade)
4.9.2 - Tempo e temperatura seguros até entrega ao consumo
(maior que 60ºC ou menor que 5ºC)
Monitorada nas etapas
4.9.3 - Veículos higienizados, sem vetores, com cobertura e sem
uso diferente
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 4
0,0 %
4.10 EXPOSIÇÃO AO CONSUMO
C NC NA
4.10.1 - Área organizada, limpa
Equipamentos compatíveis e em bom estado
4.10.2 - Manipuladores lavam as mãos, usam utensílios ou luvas
descartáveis
4.10.3 - Equipamentos da distribuição sob temperatura controlada
conservados, dimensionados e em bom funcionamento
4.10.4 - Com barreiras de proteção à ação dos consumidores, etc
4.10.5 - Pratos, copos e talheres higienizados, armazenados e
protegidos
4.10.6 - Ornamentos e plantas não contaminam
4.10.7 - Área de dinheiro / cartões é reservada
Funcionários do caixa não manipulam alimentos
embalados ou não embalados
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
Percentual de conformidade:
ITEM
TOTAL:
ITEM
TOTAL:Percentual de conformidade:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
77
4.11 DOCUMENTAÇÃO E REGISTRO
C NC NA
4.11.1 - Tem Manual de Boas Práticas e POPs
É acessível aos funcionários e autoridades quando
requeridos
4.11.2 - POPs e instruções de operações, freqüência, responsável
(e cargo), aprovados, datados e assinados pelo Responsável
Técnico
4.11.3 - Registros mantidos por no mínimo 30 dias
4.11.4 - 4 POPs implementados
4.11.5 - O POP de higienização possui: superfície (natureza),
método usado, princípio ativo, concentração, tempo de ação
temperatura, etc
4.11.6 - POP de Vetores e Pragas tem medidas preventivas e
corretivas contra 3A (acesso, abrigo, alimento)
Tem comprovante de aplicação com informações
4.11.7 - POP de Potabilidade da Água especifica como é lavada,
quem lava, a periodicidade, etc
4.11.8 - POP de Higiene e Saúde tem lavagem de mãos (como,
quando, princípios ativos)
Medidas em caso de lesões, doenças
Exames explícitos, periodicidade
Capacitação descrita (carga, conteúdo, freqüência) e
registros
TOTAL: Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %
Observações:
ITEM
Percentual de conformidade:
NA – Não AplicávelNC – Não ConformeC - Conforme
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
78
4.12 RESPONSÁVEIS
C NC NA
4.12.1 - Existe Responsável Técnico no local; proprietário ou
designado
4.12.2 - Comprovadamente capacitado em: contaminantes,
Doença de Origem Alimentar, Manipulação Higiênica e Boas
Práticas
Total de itens Aplicáveis: 0 0 0 0
#DIV/0! %TOTAL:
Observações:
Percentual de conformidade:
ITEM
Lista de Verificação das Condições Higiênico Sanitárias
Gráfico Radar com Percentuais de Adequação RDC 216 (ANVISA)
79
ANEXO II
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: Análise da qualidade
microbiológica de sushi e sashimi comercializados em restaurantes self-service na cidade do Rio de
Janeiro: enumeração de Staphylococcus coagulase-positiva e detecção de Listeria monocytogenes. XXVII
Congresso Brasileiro de Microbiologia CBM - 2013, Natal, 2013
Análise da qualidade microbiológica de sushi e sashimi comercializados em restaurantes self-
service na cidade do Rio de Janeiro: enumeração de Staphylococcus coagulase-positiva e detecção
de Listeria monocytogenes
Autores Carmo, J. M.
1, Cabral, C.C
1, Lopes, C.S. C
1, Leonardo, R
1, Carvalho, A.C.S.
1, Del Aguila,
E.M. 1, Silva, J.T
1, Paschoalin, V.M.F
1
E-mail do primeiro autor: [email protected]
Instituição 1 UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janerio (Athos da Silveira Ramos
149 Cidade Universitária, Centro de Tecnologia,RJ)
Introdução
O consumo de pescado cru vem aumentando gradativamente no Brasil, especialmente após a introdução
da culinária japonesa no país e devido a busca de consumo por produtos sem conservantes e aditivos
químicos. As preparações conhecidas como sushi e sashimi são as mais consumidas dessas iguarias, que
apesar de serem muito apreciadas, oferecem constante risco para o consumidor. As doenças transmitidas
por alimentos (DTAs) constituem um problema mundial de saúde pública, ocasionando mortes e prejuízo
econômicos em todo o mundo, sendo Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus dois dos principais
microrganismos envolvidos nas toxi-infecções alimentares.
Objetivos
O presente estudo teve como objetivo avaliar a contaminação de preparações a base de pescado cru
(sushi e sashimi) comercializados em três restaurantes self-service (A, B e C) de diferentes regiões do
município do Rio de Janeiro.
Materiais e Métodos
Foram coletadas 16 amostras de sushi e sashimi preparados a partir de salmão, atum e peixe branco. As
amostras coletadas foram analisadas no Laboratório de Análises Avançadas em Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Foi realizada a contagem de cepas
de Staphylococcus coagulase positiva (SCP) nas amostras, de acordo com metodologia descrita na
Instrução Normativa n° 62 de 26 de agosto de 2003 do MAPA. Foi analisada a presença de L.
monocytogenes pela PCR multiplex usando como alvo os genes iap (“invasion-associated protein”-
presente em todas espécies de Listeria) que codifica uma proteína de 60 kDa e hly (gene de hemolisina-
fator de virulência).
Resultados
Os resultados mostraram que 37,5% (6/16) das amostras analisadas apresentaram-se contaminadas por
SCP, das quais 12,5% (2/16) estavam acima do limite estabelecido pela legislação (5x10³UFC/g). Em
19% (3/16) das amostras analisadas, detectou-se contaminação por L. monocytogenes, sendo que 100%
(3/3) das amostras de sashimi coletadas no estabelecimento C estavam contaminadas com o patógeno.
Considerações finais
As análises microbiológicas das amostras de sushi e sashimi demonstraram que nos três estabelecimentos
havia contaminação por bactérias patogênicas o que oferece riscos à saúde dos consumidores,
evidenciando a necessidade de um controle-higiênico sanitário mais criterioso em todas as etapas do
processo, desde a aquisição da matéria-prima, armazenamento, elaboração e distribuição dos pratos.
Palavras-chaves: Listeria monocytogenes, qualidade microbiológica, sashimi, Staphylococcus aureus,
sushi
80
ANEXO III
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: Enumeração de
Staphylococcus Coagulase-Positiva em preparados de peixe cru - sushi e sashimi - e avaliação de
prováveis contaminantes em dois restaurantes self service dos municípios do Rio de Janeiro e
Niterói. CHEMRIO 2014, Symposium
ENUMERAÇÃO DE Staphylococcus COAGULASE-POSITIVA EM PREPARADOS DE
PEIXE CRU - Sushi e Sashimi - E AVALIAÇÃO DE PROVÁVEIS CONTAMINANTES
EM DOIS RESTAURANTES SELF SERVICE DOS MUNICÍPIOS DO RIO DE JANEIRO
E NITERÓI.
J.M. Carmo.¹, C.C.S. Lopes¹, L. Rosemberg¹, E.M. Del Aguila1, A.C.S. Carvalho¹, V.M.F.
Paschoalin1
1Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química
E-mail: [email protected]
As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) possuem grande frequência entre a população brasileira.
Com a introdução da culinária japonesa notam-se mudanças no perfil alimentar da população, os pescados
que tradicionalmente eram consumidos após cozidos, são ingeridos crus. Pratos como sushi e sashimi
apesar de muito apreciados, possuem um alto risco a saúde do consumidor, devido a suas características
organolépticas e composição química que os tornam altamente perecíveis e de rápida deterioração,
necessitando de maior controle durante a manipulação e oferta ao consumidor. Dentre os microrganismos
causadores de DTAs, temos como um dos principais o Staphylococcus spp.. A manipulação sem a higiene
adequada das mãos é substancialmente um fator determinante para a sua dissipação, visto que o
manipulador pode ser um portador assintomático desses microrganismos. O objetivo desse estudo foi a
enumeração de Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP) em amostras de sushi e sashimi coletas em dois
restaurantes self-service (RI e RII) na cidade do Rio de Janeiro e Niterói e verificar se os manipuladores
desses alimentos são prováveis fontes de contaminação. Foram coletados aproximadamente 200 g de cada
amostra, sendo elas: Sushi e Sashimi de salmão, namorado e atum; analisou-se também o filé e a matéria-
prima utilizada no preparo desses pratos. Além disso, foram coletados swabs das mãos, orofaringe e
nasofaringe, dos manipuladores. Não foi realizado coleta de matéria-prima de atum, pois os restaurantes já
recebem esse peixe filetado. Observou-se a presença de SCP em 100% das amostras avaliadas no RI e RII,
porém apenas 18% (2/11) das amostras do RI apresentaram contagem acima do estabelecido pela RDC 12
da ANVISA. Identificou-se o crescimento de colônias características de Staphylococcus aureus em 58%
(15/26) das amostras dos manipuladores que foram analisadas, no entanto são necessários mais estudos
para correlacioná-las com as cepas encontradas nos alimentos.
81
ANEXO IV
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: Presença de
Staphylococcus Coagulase Positiva em preparações a base de pescado cru (sushi e sashimi)
comercializados em uma rede restaurantes dos municípios de Niterói e Rio de Janeiro. III
Seminário em Inovação e Tecnologia na Área de Alimentos, SITA, 2014
PRESENÇA DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASE POSITIVA EM PREPARAÇÕES A
BASE DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI) COMERCIALIZADOS EM UMA REDE
RESTAURANTES DOS MUNICÍPIOS DE NITERÓI E RIO DE JANEIRO.
CARMO, J.M. (1) (2); SILVA, D. J. (2); PEIXOTO, J. C. (2); LOPES, C.S. C.(1); CARVALHO,
A.C.S. (1); DEL AGUILA, E.M.(1); PASCHOALIN, V.M.F. (1)
(1) Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Centro de Tecnologia, Instituto de Química,
Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, RJ. E-mail: [email protected]
O perfil alimentar da população é influenciado por diversos aspectos, tais como a disponibilidade
dos alimentos, hábitos regionais e aspectos econômicos. Considerando a elevação de consumo de
sushi e sashimi no país, é importante a realização de uma reflexão no contexto da Segurança
Alimentar e Nutricional (SAN). Preparações muito manipuladas são consideradas de alto risco,
especialmente quando elaboradas por pessoas que não possuam treinamento adequado. O contato
direto do alimento com as mãos pode levar ao aumento da incidência de patógenos como
Staphylococcus aureus. O objetivo do presente estudo foi avaliar a presença de Staphylococcus
coagulase positiva (SCP) em amostras de sushi e sashimi coletadas em três estabelecimentos (E1,
E2, E3) comerciais não especializados na culinária nipônica, no município de Niterói e Rio de
Janeiro – RJ, comparando com os limites estabelecidos pela RDC 12 (ANVISA). Foram obtidas
entre 10 e 11 amostras de alimentos, distribuídas entre matéria-prima, peixe filetado e
preparações prontas para consumo – sushi e sashimi - em cada estabelecimento. Os valores
mínimos e máximos de SCP encontrados ficaram entre 0,3x10² e 1,4x104 UFC/g, sendo que
27%(3/11) e 60%(6/10) das amostras de E1 e E3, respectivamente, apresentaram contagens
superiores ao estabelecido pela legislação (5x10³ UFC/g) e 100% das amostras de E2
apresentaram-se de acordo com o preconizado pela ANVISA. Critérios de Boas Práticas também
foram avaliados através da aplicação de uma lista de verificação de acordo com a RDC 216 e
observou-se que E2 apresentou percentual de adequação superior à E1 e E3 demonstrando que a
adoção de critérios higiênico-sanitários adequados contribui para um melhor controle na
proliferação de micro-organismos em alimentos.
Palavras chave: Staphylococcus, boas práticas, sushi e sashimi.
82
ANEXO V
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: Avaliação da presença
de Staphylococcus spp em sushis e sashimis e correlação com as boas práticas em restaurantes
localizados na cidade do Rio de Janeiro e Niterói. VII Congresso Latino-Americano e XIII
Congresso Brasileiro de Higienistas de Alimentos, Búzios 2015.
Avaliação da presença de Staphylococcus spp em sushis e sashimis e correlação com as boas
práticas em restaurantes localizados na cidade do Rio de Janeiro e Niterói
Evaluation of Staphylococcus spp contamination of sushi and sashimi: correlation with good
practices in restaurants in the municipalities of Rio de Janeiro and Niterói
¹Josiane Marília do CARMO, ¹Claudio Sabbatini Capella LOPES, 2Eduardo Mere DEL
AGUILA, 3Ana Carolina da Silva CARVALHO,
3Vânia Margaret Flosi PASCHOALIN
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira Ramos 149,
Bloco A, 5 andar, Ilha do Fundão- RJ.
Palavras-chave: Staphylococcus spp, sushi, sashimi, contamination
Resumo:
As doenças de origem alimentar são um problema mundial de saúde pública e pescados
consumidos in natura, como preparos de sushi e sashimi podem oferecer riscos para o
consumidor. Staphylococcus spp é um dos principais agentes etiológicos. O objetivo desse estudo
foi identificar e enumerar Staphylococcus coagulase positiva (SCP) em amostras de sushi e
sashimi de três restaurantes e avaliar os critérios de boas práticas adotados e a presença do
microrganismo nos manipuladores. As boas práticas foram avaliadas através de uma lista de
verificação. Trinta e uma amostras de alimentos foram analisadas, 9 apresentaram contagem
acima do valor estabelecido pela legislação. Com isso, conclui-se que as não conformidades
verificadas devem ser corrigidas, pois a presença das mesmas significa a existência de riscos à
saúde do consumidor.
Introdução:
As doenças de origem alimentar constituem um problema mundial de saúde pública e
apesar dos esforços de pesquisadores e autoridades sanitárias, continuam causando mortes e
prejuízo em todo o mundo. Os pescados, tradicionalmente consumidos após cocção, também são
ingeridos in natura como preparos de culinária japonesa, comumente consumidos em nosso país
(Martins, 2006). Preparos como sushi e sashimi, podem oferecer risco para a saúde do
consumidor, uma vez que o pescado é um produto altamente perecível e que a deterioração pode
ocorrer durante a estocagem, manipulação, processamento e distribuição inadequados (Valandro,
2010). Dentre os microrganismos comumente envolvidos na contaminação de pescados, o
Staphylococcus spp é um dos principais patógenos contaminantes. A manipulação de pescados in
natura sem a higiene adequada das mãos é um fator determinante para a disseminação de DTAs
(doenças transmitidas por alimentos), visto que o manipulador pode ser portador assintomático
desses microrganismos.
O objetivo desse estudo foi verificar a qualidade microbiológica de preparos a base de
pescado cru, identificando e enumerarando Staphylococcus coagulase positiva (SCP). A
avaliaçao de amostras de sushi e sashimi provenientes de três restaurantes (EI, EII e EIII) nos
municípios do Rio de Janeiro e Niterói foi realizada e também foram avaliados os critérios de
boas práticas na manipulação adotados nesses estabelecimentos comerciais, assim como a
83
presença do microrganismo nos manipuladores desses alimentos.
Material e Métodos:
Foram coletados 31 amostras de aproximadamente 200g de sushi e sashimi de salmão,
namorado e atum de 3 restaurantes. Foram analisados o filé e a matéria-prima utilizada no
preparo desses pratos. Além disso, foi coletado material das mãos, orofaringe e nasofaringe dos
manipuladores, utilizando swabs. Frações de 25g de cada amostra foram transferidas para sacos
estéreis para homogeneização em 0,1% de salina peptonada por 60s.Três diluições seriadas foram
realizadas e plaqueadas em ágar Baird-Parker e incubadas a 36 ± 1ºC por 48 h. Placas contendo
20-200 colônias foram selecionadas para contagem e 3 a 5 colônias típicas e atípicas foram
isoladas para realização de provas bioquímicas (coagulase, catalase e coloração de gram), de
acordo com a metodologia descrita pela Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de 2003 do
MAPA.
Os critérios de Boas Práticas adotados em cada restaurante foram avaliados através de
uma lista de verificação elaborada de acordo com a RDC 216 de 15 de setembro de 2004, da
ANVISA, a qual estabelece o Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços de
Alimentação. Itens relacionados a edificações e instalações; higienização; controle integrado de
pragas; abastecimento de água; manejo de resíduos; manipuladores de alimentos; matérias primas
e embalagens; preparação do alimento; armazenamento e transporte; exposição ao consumo;
documentação e registros e responsabilidade técnica foram verificados nos três estabelecimentos.
Resultados e Discussão:
Em todas as 31 amostras de pescado coletadas nos estabelecimentos (EI, EII e EIII) foi
detectada a presença de Staphylococcus coagulase positiva (SCP). Destas, 9 amostras (29%)
apresentaram contagem de patógenos acima do valor estabelecido pela RDC n°12 (BRASIL,
2001), que estabelece o limite máximo de 5x103
UFC/g , como mostrado na tabela 1.
Tabela 1. Valores mínimos e máximos em UFC/g, de Staphylococcus coagulase positiva em
amostras de peixes, files e preparados (sushi e sashimi) de salmão, atum e namorado, coletados
em três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013
a fevereiro de 2014.
Estabelecimentos
comerciais
Número de
amostras
Valores mínimos e
máximos (UFC/g)
Nº e % de
amostras
reprovadas
E1 11 0,3x10² - 1,1 x 104 3 (27%)
E2 10 9,0x10² - 2,2 x 10³ 0 -
E3 10 9,0x10² - 14,1 x 10³ 6 (60%)
Trinta colônias isoladas dos manipuladores com características morfológicas foram
analisadas e dentre estes, 17 foram identificadas como SPC (57%) - tabela 2.
84
Tabela 2. Quantidade total de amostras coletadas e positivas para Staphylococcus coagulase
positiva de nasofaringe, orofaringe e mãos dos manipuladores de três restaurantes dos municípios
do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
Região anatômica do corpo dos
manipuladores
Amostras coletadas (n) Presença de SCP nas
amostras (n)
Nasofaringe 12 10 (83,4%)
Orofaringe 6 5 (83,3%)
Mãos 12 12 (100%)
Em relação à avaliação das Boas Práticas na Manipulação de Alimentos, realizada através
do preenchimento de uma lista de verificação no momento da coleta das amostras, os
estabelecimentos E1 e E3 apresentaram 61,1% (84 itens) e 62,4% (87 itens) de conformidade,
respectivamente, demonstrando falhas nas condições higiênico-sanitárias. O estabelecimento E2
apresentou 82,5% (116 itens) de conformidade. Uma vez que para ser considerado com condições
higiênico-sanitárias satisfatórias, é necessário atingir um percentual mínimo de 80% de
conformidades, apenas o E2 pode ser considerado tendo condições higiênico-sanitárias adequadas
(Figuras 1 e 2).
Figura 1. Percentual de adequação aos requisitos de Boas Práticas estabelecidos pela RDC 216
de 15 de setembro de 2004 (ANVISA) nos restaurantes (E1, E2 e E3) localizados nos municípios
de Niterói e Rio de Janeiro -RJ, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014.
85
Figura 2. Resultado da avaliação das condições higiênico-sanitárias dos restaurantes (E1, E2 e
E3) localizados nos municípios de Niterói e Rio de Janeiro -RJ, no período de setembro de 2013
a fevereiro de 2014.
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
E1 E2 E3
RESULTADO DA AVALIAÇÃO HIGIÊNICO-SANITÁRIA
Conformidades
Não conformidade
Não aplicável
O perfil fenotípico de S. aureus encontrado nas amostras de preparados de peixe in natura
(sushi e sashimi) analisadas, assim como a contagem de SCP nesses alimentos são semelhantes
ao descrito por Albuquerque e col (2006) que estimaram em SCP <100 a 1,4 x 106 SCP em
amostras de sushi comercializados em Fortaleza. A presença de microrganismos patogênicos,
incluindo S. aureus, nas mãos de manipuladores de alimentos também foi observada por Almeida
e col (1995). A adequada higiene das mãos, assim como outras medidas de controle higiênico-
sanitário, são fatores determinantes para evitar a transferência de patógenos para os alimentos.
Oliveira e Marques (2012) analisaram as condições higiênico-sanitárias na preparação e
comercialização de sushi e sashimi em estabelecimento comercial que cumpriu 78,6% dos
critérios de conformidade, indicando que preceitos de boas práticas imprescindíveis para garantir
a segurança na produção de alimentos não foram seguidos, resultando na enumeraçao de
Staphylococcus spp acima do estabelecido pela ANVISA.
Conclusão Foi detectada a presença de Staphylococcus coagulase positiva em amostras de sushi e
sashimi, em três estabelecimentos comerciais, nos municípios de Rio de Janeiro e Niterói, sendo
que 29% (9/31) das amostras apresentaram contagens acima dos limites estabelecidos pela
legislação.
Nos três estabelecimentos foram detectadas não-conformidades às Boas Práticas na
Manipulação de preparações à base de pescado cru que deverão ser corrigidas, uma vez que a
não-observâncias dos critérios indica a existência de riscos à saúde do consumidor.
Referências Bibliográficas
ALMEIDA, R.C.C.; KUAYE, A.Y.; SERRANO, A. M.; ALMEIDA, P.F. Avaliação e controle
de qualidade microbiológica das mãos de manipuladores de alimentos. Revista de Saúde
Pública. São Paulo, v. 29, n. 4, p. 290-294, 1995.
86
ALBUQUERQUE W. F.; BARRETO N.S.E.; SILVA A. I. M.; VIEIRA R. H. S. F., Ocorrência
de Víbrio parahaemolyticus e Estafilococos coagulase positivo em sushis comercializados em
alguns estabelecimentos de Fortaleza – CE. Revista Higiene Alimentar. São Paulo: v. 20,
n.116, p.58-61, nov, 2006.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 62, de
26 de agosto de 2003. Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle
de Produtos de Origem Animal e Água. Disponível em: http:www.agricultura.gov.br
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução: RDC nº
12, de 2 de janeiro de 2001. Aprova o Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos
para Alimentos. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução: RDC nº
216, de 15 de setembro de 2004. 2004. . Disponível em: http://www.anvisa.gov.br
FANG, T. J.; WEI, Q. K.; LIAO, C. W.; HUNG, M. J.; WANG, T. H. Microbiological quality
of 18ºC read-to-eat food products sold in Taiwan. International Journal of Food Microbiology
80, 241-250, 2003.
GERMANO, P. M. L.; GERMANO, M. I. S. Higiene e vigilância sanitária de alimentos. 3.ed.
ver. e ampl. – Barueri, São Paulo: Manole, 2008.MARTINS, F.O. Avaliação da qualidade
higiênico-sanitária de preparações (“sushi” e “sashimi”) à base de pescado cru servidos em
bufês na cidade de São Paulo, 142 p. Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo -
Faculdade de Saúde Pública, 2006.
OLIVEIRA, T.W.N; MARQUES,L.F. Avaliação das condições higiênico-sanitária no preparo
de sushi e sashimi de um estabelecimento comercial. Revista Semiárido De Visu, v.2, n.1,
p.194-201, 2012.
VALANDRO, M.J. Avaliação da qualidade microbiológica de sashimis a base de salmão,
preparados em restauranes especializados em culinária japonesa na cidade de Porto Alegre
, 67p. Dissertação (Mestrado) – Universidade do Rio Grande do Sul – Faculdade de Veterinária,
2010.
Autora a ser contatado: Josiane Marília do Carmo, IQ-UFRJ, Av. Athos da Silveira Ramos 149,
Bloco A, 5 andar – RJ, [email protected].
