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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FERNANDA DE OLIVEIRA CAIRES CILINDROSPERMOPSINA (TOXINA DE CIANOBACTÉRIA) E SEU POTENCIAL COMO DISRUPTOR ENDÓCRINO EM MURINOS DO SEXO MASCULINO RIO DE JANEIRO 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
FERNANDA DE OLIVEIRA CAIRES
CILINDROSPERMOPSINA (TOXINA DE CIANOBACTÉRIA) E SEU
POTENCIAL COMO DISRUPTOR ENDÓCRINO EM MURINOS DO SEXO
MASCULINO
RIO DE JANEIRO
2015
Fernanda de Oliveira Caires
CILINDROSPERMOPSINA (TOXINA DE
CIANOBACTÉRIA) E SEU POTENCIAL COMO
DISRUPTOR ENDÓCRINO EM MURINOS DO
SEXO MASCULINO
Volume 1.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientadora: Dra. Valéria Freitas de Magalhães
Co-orientadora: Dra. Tania Maria Ruffoni Ortiga
RIO DE JANEIRO
2015
Caires, Fernanda de Oliveira.
Cilindrospermopsina (toxina de cianobactéria) e seu potencial como disruptor endócrino em murinos do sexo masculino / Fernanda de Oliveira Caires. – 2015.
Rio de Janeiro: UFRJ/ IBCCF, 2015. 75f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Rio de Janeiro, 2015.
Orientadora: Dra. Valéria Freitas de Magalhães Co-orientadora: Dra. Tania Maria Ruffoni Ortiga
1. Cilindrospermopsina. 2. Sistema Reprodutor. 3. Toxicologia. 4. Cianotoxina.
– Teses.
I. Magalhães, Valéria Freitas (Orient.). II. Ortiga, Tania Maria Ruffoni III.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título.
Fernanda de Oliveira Caires
CILINDROSPERMOPSINA (TOXINA DE CIANOBACTÉRIA) E SEU POTENCIAL
COMO DISRUPTOR ENDÓCRINO EM MURINOS DO SEXO MASCULINO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
Aprovada em 24 de fevereiro de 2015.
________________________________________________
Drª. Valéria Freitas de Magalhães
Professora Adjunta IV, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
________________________________________________
Drª. Tania Maria Ruffoni Ortiga
Professora Associada, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
_______________________________________________
Drª. Isis Hara Trevenzoli
Professora Adjunta, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
______________________________________________
Drª. Jennifer Lowe
Professora Adjunta 4, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
______________________________________________
Dr. Olaf Malm
Professor Titular, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao CNPq pela bolsa de mestrado fornecida e ao Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho pela honrosa oportunidade.
Vejo muitos conflitos na relação orientador-orientando que não condizem com
a minha realidade, e, por isso, concluo: eu tive a melhor orientadora possível! Então
agradeço de coração à professora Valéria Magalhães, que, mesmo com sua
memória ruim (rs) se empenha tanto para ajudar. Agradeço por todos os incentivos,
elogios, ensinamentos, amizade, esforços, pelo exemplo de pessoa e por acreditar
tanto em mim!
Agradeço também à toda equipe do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia
de Cianobactérias pela disposição em ajudar, pelos toques e pelas risadas, que
sempre me proporcionaram dias tão agradáveis e um ótimo ambiente.
Agradeço à professora Sandra Azevedo por seus conhecimentos transmitidos
e à professora Raquel Moraes Soares pelo crédito ao trabalho e disponibilidade de
acrescentar conhecimento e revisar meu trabalho.
Agradeço à professora Tania Ortiga pela colaboração, por toda ajuda
prestada, conhecimento passado e empenho para que essa dissertação se torna-se
real. Acrescento o agradecimento à toda equipe do Laboratório de Endocrinologia
Molecular que sempre me tratou muito bem. Agradeço em especial ao Enrrico pela
ajuda e à, querida, Güínever pela ajuda e por seu bom humor contagiante.
Agradeço ao meu namorado, Ricardo Schwab, pela paciência nos momentos
difíceis, por ser todo ouvidos mesmo sem entender nada (rs), pela força, por
acreditar muito no meu potencial e pelo companheirismo de sempre.
Agradeço a minha família por compreenderem a importância desse momento
e valorizarem, com orgulho, o que faço.
Por fim, agradeço aos meus amigos, todos, que, perto ou longe, me ajudam a
caminhar na vida. Prefiro não citar nomes para não ser injusta com ninguém.
Obrigada por entenderem os meus furos e obrigada pelos momentos de distração e
por toda felicidade que me proporcionam, companhias sem as quais não chegaria
aqui.
Termino o meu agradecimento com uma citação:
“Se enxerguei mais longe foi porque eu
estava sobre os ombros de gigantes.”
Isaac Newton
Muito obrigada!
“Alguns homens veem as coisas como são, e dizem ‘Por quê?’
Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo ‘Por que não?’”
(George Bernard Shaw)
RESUMO
CAIRES, Fernanda de Oliveira. Cilindrospermopsina (toxina de cianobactéria) e
seu potencial como disruptor endócrino em murinos do sexo masculino. Rio de Janeiro, 2015. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
A cilindrospermopsina (CYN) - uma cianotoxina (toxina produzida por cianobactérias)
- é um potente inibidor da síntese de proteínas, capaz de provocar graves danos em
vários órgãos. Possui o potencial papel de disruptor endócrino por ser capaz de inibir
a síntese de progesterona e alterar o ciclo estral de fêmeas. Portanto, para analisar
possíveis efeitos em machos, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito subcrônico
de CYN no sistema reprodutivo masculino murino. Foi realizado um ensaio
subcrônico com 20 camundongos, com protocolo aprovado (CEUA122/14). Os
animais foram divididos em quatro grupos: controle, grupo 1, 2 e 3 (5 animais/grupo).
As injeções intraperitoneais na dose de 20 μg de CYN/Kg de peso corpóreo
ocorreram no início do experimento para todos os grupos. O grupo 1 foi eutanasiado
e os grupos 2 e 3 foram reinjetados 7 dias após a exposição à dose inicial. No 14º
dia ocorreu a eutanásia do grupo 2 e reinjeção do grupo 3. O grupo 3 foi re-injetado
no 21º dia e no 28º dia ocorreu a eutanásia. Da mesma forma que o grupo 3, o
grupo controle permaneceu até o 28o dia recebendo injeções semanais apenas da
solução veículo, água ultra pura (miliQ). Nos dias das eutanásias (7º, 14º ou 28º), o
sangue foi coletado e os tecidos (fígado, hipófise, testículos e epidídimos) coletados
e pesados. As análises estatísticas foram realizadas com a análise de variância
simples (One way ANOVA) seguida do teste de comparação múltipla de Tukey.
Nossos resultados indicam que uma ou duas doses baixas de CYN semanais
(grupo 1 e 2) causaram aumento significativo nos níveis de testosterona, associado
a um aumento na quantidade de espermatozoides no grupo 3. Por outro lado, a
toxina não causou alterações nos pesos dos tecidos, assim como na expressão dos
genes hipofisários (LHb e FSHb) e testiculares (LHcgr, StAR e CYP11A1). As
alterações observadas mostraram uma importante interferência no sistema
reprodutivo masculino, embora não se saiba o mecanismo pelo qual cause as
alterações. Portanto, mais estudos precisam ser realizados para compreender o
papel da CYN como um disruptor endócrino.
ABSTRACT
CAIRES, Fernanda de Oliveira. Cilindrospermopsina (toxina de cianobactéria) e
seu potencial como disruptor endócrino em murinos do sexo masculino. Rio de Janeiro, 2015. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
The cylindrospermopsin (CYN) - a cyanotoxin (toxin produced by cyanobacteria) - is
a potent inhibitor of protein synthesis, able to cause serious damage to various
organs It has the potential role of endocrine disruptor, able to inhibit the synthesis of
progesterone and change the estrous cycle of females. Therefore, to analyze
possible effects on males, the aim of this study was to evaluate the subchronic effect
of CYN in murine male reproductive system. A subchronic assay was performed with
20 mice, with approved protocol (CEUA122/14). The animals were divided into four
groups: 1, 2, 3 and control group (5 animals / group). The intraperitoneal injections at
a dose of 20 μg of CYN / kg body weight occurred at the beginning of the experiment
for all groups. Group 1 was euthanized and the groups 2 and 3 were re-injected 7
days after exposure to the initial dose. On the 14th day the group 2 euthanasia and
reinjection of group 3 was realized. The group 3 was re-injected at 21th day and at
28th day occurred the euthanasia. Like Group 3, the control group remained until the
28th day receiving weekly injections only vehicle, ultra pure water solution (MilliQ). In
the days of euthanasia (7th, 14th and 28th), blood was collected and tissues (liver,
pituitary, testis and epididymis) collected and weighed. Statistical analyzes were
performed with the simple analysis of variance (One way ANOVA) followed by
Tukey's multiple comparison test were chosen. Our results indicate that one or two
weekly low dose of CYN (groups 1 and 2) caused a significant increase in
testosterone levels and there is a significant increase of sperm quantity in group 3.
On the other hand, the toxin did not cause changes in the weights of the tissues as
well as in the expression of pituitary (LHb and FSHb) and testicular (LHcgr, StAR and
CYP11A1) genes. The changes observed have shown significant interference in the
male reproductive system, although it is not known the mechanism whereby causes
changes. Therefore, further studies are needed to understand the role of CYN as an
endocrine disruptor.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da cilindrospermopsina.................................................20
Figura 2 - Esquema do eixo hipotálamo-hipófise-testículo.........................................25
Figura 3 - Transdução de sinal induzida por LH na biossíntese de testosterona nos
testículos....................................................................................................................28
Figura 4 - Representação da circulação acoplada a proteínas, conversão em DHT ou
estradiol e via clássica de ação da testosterona........................................................30
Figura 5 - Representação esquemática da espermatogênese..................................31
Figura 6 - Representação esquemática do desenho experimental............................36
Figura 7 - Esquema das análises realizadas com os tecidos após excisão e com o
sangue dos animais....................................................................................................37
Figura 8 - Peso por grupo, em gramas, de cada animal nos diferentes dias
experimentais.............................................................................................................41
Figura 9 – Box plot do peso do fígado dos animais controle e experimentais...........42
Figura 10 - Box plot do peso dos testículos (direito e esquerdo somados)...............43
Figura 11 - Box plot do peso dos Epidídimos (direito e esquerdo)............................44
Figura 12 - Box plot da dosagem sérica de testosterona...........................................45
Figura 13 - Box plot da quantidade de espermatozoides na cabeça dos
epidídimos..................................................................................................................46
Figura 14 - Box plot da expressão gênica da StAR no testículo................................47
Figura 15 - Box plot da expressão gênica do receptor do hormônio LH (LHcgr) no
testículo......................................................................................................................48
Figura 16 - Box plot da expressão gênica de CYP11A1 no testículo.........................48
Figura 17 - Box plot da expressão hipofisária do hormônio LH.................................49
Figura 18 - Box plot da expressão de FSH na hipófise..............................................50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplos da presença de cianobactérias em reservatórios do Brasil nos
últimos anos...............................................................................................................16
Tabela 2 - Informações dos primers utilizados no PCR em tempo real para
amplificação dos genes alvo......................................................................................39
Tabela 3 - Sequência do primer para amplificação do gene GAPDH, utilizado como
controle interno...........................................................................................................39
Tabela 4 - Peso dos animais em cada dia experimental............................................41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA - Ácido aracdônico
ABP - Proteína ligadora dos androgênios (do inglês Androgen-binding protein)
AC - Adenilato ciclase
AMPc - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
AR - Receptor de Andrógeno (do inglês Androgen Receptor)
BPA - Bisfenol A
cDNA - DNA complementar (do inglês complementary DNA)
CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais
CYN - Cilindrospermopsina
CYP11A1 - Enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol
CYP17 - 17α-Hidroxilase
CYP450 - Citocromo P450
DAG - Diacilglicerol
DBO -Demanda Bioquímica de Oxigênio
17βHSD - 17 β-Hidroesteróide desidrogenase
DHEA - Deidroepiandrosterona
DHT - 5α-dihidrotestosterona
dNTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados (do inglês deoxynucleoside
triphosphates)
E2 - Estradiol
FSH - Hormônio folículo estimulante (do inglês Follicle-stimulating hormone)
GAPDH - Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GnRH - Hormônio liberador de gonadotrofinas
GSH - Glutationa
hCG - Gonadotropina coriônica humana
HSDs - Hidroxiesteróides desidrogenases
i.p. - Intraperitoneal
IP3 - Inositol trifosfato
LDL - Lipoproteínas de baixa densidade
LH - Hormônio luteinizante (do inglês Luteinizing hormone)
LHcgr - Receptor do hormônio luteinizante/coriogonadotropina (do inglês Luteinizing
hormone/choriogonadotropin receptor)
MAPK - Proteína cinase ativada por mitógeno (do inglês Mitogen-activated protein
kinases)
MCs - Microcistinas
MS - Ministério da Saúde
NOAEL - Dose sem nenhum efeito adverso observável (do inglês no observed
adverse effect level)
PKA - Proteína cinase A
PKC - Proteína cinase C
PLC - Fosfolipase C
PBS - Tampão fosfato-salino (do inglês Phosphate buffered saline)
RE - Retículo Endoplasmático
RNAm - RNA mensageiro (do inglês Messenger RNA)
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (do inglês
Reverse transcription Polymerase Chain Reaction)
SHBG - Globulina Ligadora de Hormônios Sexuais
SNIS - Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento
sptzs - Espermatozoides
StAR - Proteína reguladora aguda esteroidogênica
STXs - Saxitoxinas
3βHSD - 3 β-Hidroesteróide desidrogenase
UNICEF - Fundo das Nações Unidas para a Infância (do inglês United Nations
Children's Fund)
VMP - Valor Máximo Permitido
WHO - Organização Mundial da Saúde (do inglês World Health Organization)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
1.1 ASPECTOS GERAIS: POLUIÇÃO E QUALIDADE DA ÁGUA........................................... 14
1.2 FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS .......................................................................... 15
1.3 CIANOBACTÉRIAS .................................................................................................. 17
1.4 CIANOTOXINAS ...................................................................................................... 18
1.5 CILINDROSPERMOPSINA (CYN).............................................................................. 20
1.6 CYN E A POSSÍVEL DISFUNÇÃO ENDÓCRINA .......................................................... 22
1.7 EIXO HIPOTÁLAMO - HIPÓFISE - GÔNADAS ............................................................. 24
1.8 VIA DE TRANSDUÇÃO DO SINAL NA ESTEROIDOGÊNESE .......................................... 26
1.9 ESTEROIDOGÊNESE ............................................................................................... 27
1.10 METABOLISMO DA TESTOSTERONA E ESPERMATOGÊNESE ................................... 28
2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 3
3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 34
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 34
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................................... 34
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 35
4.1 CILINDROSPERMOPSINA ......................................................................................... 35
4.2 ANIMAIS ................................................................................................................ 35
4.3 DESENHO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 35
4.4 CONTAGEM DE ESPERMATOZOIDES ........................................................................ 37
4.5 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA ....................................................................... 37
4.6 DOSAGEM HORMONAL ........................................................................................... 40
4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ........................................................................................ 40
5 RESULTADOS .......................................................................................................... 40
5.1 PESO DOS ANIMAIS.............................................................................................40
5.2 PESO DOS TECIDOS............................................................................................42
5.3 DOSAGEM HORMONAL......................................................................................... 44
5.4 CONTAGEM DE ESPERMATOZOIDES. ....................................................................... 45
5.5 EXPRESSÃO GÊNICA ............................................................................................. 46
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 51
7 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 63
8 PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………64
9 REFERÊNCIAS.......................................................................................................65
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais: Poluição e Qualidade da Água
A água, essencial para a sobrevivência humana e parte do patrimônio do
planeta, vem se tornando foco nos últimos anos devido ao descaso na preservação
ambiental que leva à crescente dificuldade de obtenção de água potável no mundo.
Segundo dados de WHO e UNICEF (2012), aproximadamente uma em cada nove
pessoas no mundo (mais de 780 milhões) não possui acesso à água de qualidade
para o consumo. Números que se tornam ainda mais preocupantes, pois estima-se
que 80% da população mundial viva em áreas com altos níveis de ameaça à
segurança da água (WHO & UNICEF 2008).
A qualidade da água é diretamente ligada à falta de saneamento básico. No
Brasil, segundo o Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento (SNIS,
2012), 48,3% da população possui acesso à coleta de esgoto, sendo que entre o
que é coletado, somente 38,7% é tratado. Esses dados são alarmantes, pois essa
porção não tratada vai parar diretamente nos corpos hídricos do país.
Além do crescimento acelerado da população, que, por ser muitas vezes
desordenado e causar um desequilíbrio ambiental com ocupação não planejada do
solo e desmatamentos, há ainda a crescente contaminação da água associada ao
processo de urbanização, visto que já foi observada uma forte relação entre o grau
de poluição desses ambientes e a densidade populacional (STRAšKRABA &
TUNDISI, 2008). Diversos fatores podem ser associados à deterioração da
qualidade da água mundial, dentre eles estão: mineração, erosão, percolação do
chorume de lixões próximos aos corpos d’água, recepção da água da chuva que
escoa por áreas de atividades agropecuárias, falta de tratamento de esgotos
(lançados in natura) e o lançamento de resíduos industriais.
A qualidade da água é determinante no desenvolvimento ou controle de
doenças. Mais de 3,4 milhões de pessoas morrem no mundo devido a
consequências da ingestão da água contaminada e da falta de saneamento (WHO,
15
2008). A contaminação dos sistemas hídricos tem o potencial de causar um extenso
número de doenças, como mostram as estatísticas: 80% das pessoas com
enfermidades são relacionadas à água (BATTERMAN et al., 2009). Por isso, a
questão da degradação ambiental se tornou uma temática tão discutida, não apenas
por questões políticas, mas devido à preocupação com a saúde pública.
Uma consequência relevante da poluição, com o aporte excessivo de
nutrientes nos corpos hídricos superficiais, é o elevado grau de trofia verificado
nesses ambientes. O estado trófico pode ser definido como uma resposta biológica
dos ambientes aquáticos à introdução de nutrientes. O aumento de nutrientes,
principalmente nitrogênio e fósforo, em níveis maiores que a capacidade de
assimilação do ambiente aquático é denominado eutrofização (REYNOLDS, 2006),
que pode ser um fenômeno natural ou antropogênico. De maneira natural, esse
processo possui escala geológica, enquanto que a ação humana pode acelerar para
uma escala de tempo mais curta, causando o aumento da produção biológica. As
consequências são depleção de oxigênio dissolvido (aumento da demanda
bioquímica de oxigênio – DBO), elevação do pH, desequilíbrio do ecossistema, com
grande mortandade de peixe associada e inviabilização de fontes de água para
consumo. O favorecimento da ocorrência de intensas proliferações (florações) de
algas, principalmente cianobactérias, é um resultado importante da aceleração da
eutrofização dos ambientes.
1.2 Florações de Cianobactérias
As florações de cianobactérias têm sido destaque durante as últimas décadas
não só no meio científico, mas para toda a população, visto que as proliferações
podem interferir na biota local (ao diminuir a biodiversidade fitoplanctônica), causar
odores e gosto desagradáveis e interferir nos recursos pesqueiros. No Brasil, há 14
anos, segundo Sant’anna & Azevedo (2000), em quase metade dos estados (11 de
26) existiam registros da ocorrência de cianobactérias. A Tabela 1 mostra uma
compilação de trabalhos que destacam a presença de cianobactérias em
reservatórios, evidenciando a importância da temática para a saúde pública, já que a
16
presença de toxinas produzidas por muitos desses organismos pode levar a
alterações na saúde pela ingestão diária de água contaminada. Há um grande
favorecimento de proliferações dessas microalgas em reservatórios brasileiros, pois
muitos desses ambientes associam o fato de que os compostos demoram mais
tempo para deixarem o sistema (longos tempos de residência) à oferta de nutrientes
e às altas temperaturas encontradas no país.
Tabela 1: Exemplos da dominância de cianobactérias em reservatórios do Brasil nos últimos anos.
AMBIENTE USO GÊNEROS
DOMINANTES
MUNICÍPIO (s)
(ESTADO)
REFERÊ
NCIA
Levantamento em 10 reservatórios
Abastecimento Microcystis, Anabaena,
Cylindrospermopsis, Aphanacapsa, Planktothrix e
Oscillatoria
Rio Grande do
Norte (RN)
Lampare
lli, 2004
Reservatório de Ribeirão das Lajes
Produção de energia elétrica
e abastecimento
Leptolyngbya, Cyanodictyon e
Chlorella
Rio Claro e
Piraí (RJ)
Gomes,
2005
Reservatório da usina hidroelétrica
Luiz Eduardo Magalhães
(UHE Lajeado)
Pesca, piscicultura, navegação, irrigação, turismo e recreação
Cylindrospermopsis Palmas - TO Silva,
2009
Reservatórios da Estação Ecológica e
Experimental de Assis e do Clube de Campo da Usina Santa Rita
Recreação e pesca
Cylindrospermopsis e Anabaena
Assis e
Maracaí - SP
Cordeiro
-Araújo
et al.,
2010
Reservatório do Funil Produção de energia elétrica,
abastecimento, pesca e
recreação
Dolichospermum, Sphaerocavun,
Cylindrospermopsis, Eucapsis e Microcystis
Resende-RJ Rocha,
2012
17
1.3 Cianobactérias
Cianobactérias são microrganismos procarióticos fotossintetizantes
associados aos primórdios do planeta Terra, pois se estima que tenham surgido há,
pelo menos, 2,7 bilhões de anos (ZANCHETT & OLIVEIRA-FILHO, 2013).
Denominadas também como algas azuis ou cianofíceas, acredita-se que sejam
responsáveis pela liberação de oxigênio elementar na atmosfera (BADGER &
PRICE, 2003). Como grupo, possuem alta capacidade adaptativa, se distribuem nos
mais diversos habitats, como solo, pântanos, desertos, rochas e substratos
vulcânicos, embora estejam mais comumente presentes em ambientes aquáticos
(límnico e marinho). Morfologicamente, compreendem organismos unicelulares,
coloniais ou formas filamentosas multicelulares (CHORUS & BARTRAN, 1999). De
acordo com Moreira et al. (2013), existem mais de 1000 espécies e 150 gêneros,
muitas das quais são potenciais produtoras de toxinas (cianotoxinas).
Em um levantamento realizado em 39 açudes do Estado de Pernambuco em
1998, Bouvy et al. (2000), verificaram que a maioria desses ambientes (70%)
desenvolvia florações de cianobactérias potencialmente tóxicas com a presença,
principalmente, das espécies Microcystis aeruginosa e Cilyndrospermopsis
raciborskii. Lei et al. (2014) analisaram 26 reservatórios de abastecimento urbano na
China e constataram a presença da cianotoxina cilindrospermopsina (CYN)
dissolvida em metade deles. Estudos mostram dados preocupantes, pois
particularmente as florações tóxicas de cianobactérias vêm se expandindo
geograficamente, aumentando suas frequências, magnitudes e durações; e já
causaram alterações em diversos corpos d’água de grandes extensões e
importância no mundo, como Lago Vitória na África, Taihu na China e Erie nos
Estados Unidos e Canadá (PAERL et al., 2011). Wiedner et al. (2007) mostraram
que a espécie tóxica C. raciborskii, produtora das cianotoxinas saxitoxinas (STXs) ou
CYN e conhecida como uma espécie tropical, tem se expandido em direção aos
pólos, em latitudes médias da Europa, América do Norte e América do Sul, onde
prolifera em lagos e reservatórios eutrofizados. Tem sido mostrado que parâmetros
18
como luz e temperatura mais elevados (fatores alterados em um contexto de
mudanças climáticas) podem aumentar o crescimento e a seleção de espécies
tóxicas de cianobactérias (YAMAMOTO & NAKAHARA, 2005; IMAI et al., 2009).
Sendo que alguns fatores podem ser capazes de intensificar a problemática de
intoxicações com cianotoxinas, como, por exemplo, à alta intensidade luminosa
também se mostrou capaz de aumentar a toxicidade das microcistinas – MCs
(cianotoxinas) e, juntamente com a temperatura, de aumentar a produção de CYN
(TONK et al., 2005; PREUßEL et al., 2009).
1.4 Cianotoxinas
As cianotoxinas são metabólitos produzidos pelas cianobactérias conhecidos
por sua associação a diversos casos de intoxicação em todos os níveis tróficos,
capazes de causar efeitos em protozoários, bactérias, zooplâncton, peixes, aves e
mamíferos (MEREL et al., 2013), através de exposições agudas ou crônicas. Esses
metabólitos diferem uns dos outros na estrutura química e podem ser classificados
de acordo com seus alvos toxicológicos em mamíferos como: hepatotoxinas
(microcistinas e nodularinas), neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a (s) e saxitoxina
(s)) e citotoxina (CYN) (DITTMANN et al., 2013).
Alguns fatores, como densidade populacional de cianobactérias (RAPALA et
al., 1997), condições ambientais (WIEDNER et al., 2003) e interações ecológicas
(FIGUEIREDO et al., 2004), são conhecidos por influenciarem a produção de
cianotoxinas. No entanto, ainda não foram totalmente esclarecidas as funções e o
porquê da grande variedade de toxinas produzidas, mas Holland & Kinnear (2013)
sugerem dois papéis: auxiliar na função fisiológica (através de benefícios para a
homeostase, eficiência fotossintética e as taxas de crescimento acelerado) e/ou um
papel anti-herbivoria, o que lhes concederia vantagens competitivas. Estudo recente
mostra que, por exemplo, as MCs parecem ter um importante papel de adaptação
das cianobactérias à alta intensidade luminosa (MEISSNER et al., 2014).
O primeiro registro de intoxicação associado a cianotoxinas ocorreu em 1878
na Austrália, onde foram descritas mortes de animais após o consumo de água de
19
um corpo d’água com notável presença de cianobactérias (FRANCIS, 1878). Desde
então, diversos outros casos foram relatados como consequências do efeito de
cianobactérias tóxicas. Por exemplo, em 1931, oito mil pessoas adoeceram pela
ingestão de água com floração de cianobactérias (CHEUNG et al., 2013) e em 1978,
em Palm Island (Austrália), 148 pessoas, entre elas 138 crianças, precisaram ser
internalizadas devido a severas hepatoenterites (BYTH, 1980). Posteriormente, esse
último foi relacionado à ingestão de água de um reservatório com intensa floração de
cianobactérias, principalmente da espécie C. raciborskii (HAWKINS et al., 1985). No
Brasil, em 1988, duas mil pessoas adoeceram e 88 vieram a óbito, possivelmente
devido à floração de cianobactérias tóxicas no Reservatório de Itaparica, Bahia
(TEIXEIRA et al., 1993). Em 2010, na China, mais de dois milhões de pessoas
também foram afetadas pela ingestão de água contaminada com esses
microrganismos (QIN et al, 2010).
Corpos d’água utilizados para abastecimento público ou recreação e
dominados por cianobactérias representam um risco a saúde pública. A população
pode estar exposta a cianotoxinas através da ingestão ou inalação de água
contaminada com as toxinas. A exposição pode, por exemplo, ocorrer em atividade
recreativa em ambiente contaminado, assim como por exposição intravenosa como
no caso mais grave que ocorreu no Brasil, em Caruaru – PE, no ano de 1996,
quando 116 pessoas de uma clínica de hemodiálise, de um total de 131,
apresentaram vômitos, sinais de confusão mental, distúrbios visuais, entre outros
sintomas. Destes, 100 desenvolveram falência hepática aguda e 76 faleceram
posteriormente (JOCHIMSEN et al., 1998). A CYN foi associada ao caso de Caruaru,
quando foi encontrada, juntamente com MCs, no carvão ativado do sistema de
tratamento da água (ineficiente) da clínica (CARMICHAEL et al., 2001). Após o
incidente de Caruaru, foi inserido na legislação brasileira um valor máximo permitido
(VMP) de MCs em água para consumo humano (MS n.º 1469/2000). Após duas
revisões de legislação, o Ministério da Saúde, através da Portaria MS n.º 2.914 de
2011, estabelece um VMP para as toxinas de cianobactérias MCs e STXs de 1 µg/L
e 3 µg/L, respectivamente. É recomendada a análise de CYN, com valor máximo
20
recomendado de 1 µg/L e inclui-se a análise da presença de anatoxina-a(s) quando
forem detectados gêneros potencialmente produtores dessa toxina.
1.5 Cilindrospermopsina (CYN)
Por ter sido associada aos casos de hepatoenterites que ocorreram em Palm
Island - Austrália e no Brasil, assim como por seu efeito citotóxico ainda não
plenamente estudado, a CYN tornou-se alvo do presente estudo. Essa toxina foi
primeiramente isolada, em 1992, de uma cultura de C. raciborskii (OHTANI et al.,
1992). Nesse estudo, os autores elucidaram que a CYN consiste em um alcaloide
guanidínico cíclico que apresenta um anel uracil ligado a um anel tricíclico de
guanidina (Figura 1).
Figura 1: Estrutura química da cilindrospermopsina: um alcaloide guanidínico cíclico sulfatado
(OHTANI et al., 1992).
Chiswell et al. (1999) analisaram a estabilidade da CYN em diversas
condições de intensidade luminosa, temperatura e pH. A toxina mostrou estabilidade
em temperaturas variando de 4 a 50°C por mais de 8 semanas em pH 7, no escuro
ou em variações de intensidades luminosas, e com meia-vida de 15 dias em
amostras de água de uma represa. CYN é uma substância de baixo peso molecular
(415 daltons) altamente solúvel em água e é produzida por diversas espécies, tais
como: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Aphanizomenon sp.,
Lyngbya wollei, Raphidiopsis curvata, Anabaena bergii (DITTMANN et al., 2013).
Por ter efeitos hepáticos muito proeminentes que levam a letalidade em
intoxicação aguda, CYN foi primeiramente classificada como uma toxina
21
hepatotóxica. Porém, atualmente, a toxina é dita citotóxica por já ter sido
caracterizada como indutora de danos em diversos órgãos de mamíferos como
necrose nos rins de camundongos, necrose linfocitária no timo e no baço, atrofia do
timo, hemorragias e necrose no coração e ulcerações na mucosa gástrica (TERAO
et al., 1994; SEAWRIGHT et al., 1999). Em uma cultura de hepatócitos de ratos,
doses baixas desta toxina levaram a diminuição dos níveis de glutationa (GSH),
enquanto que doses maiores causaram lesões coagulativas e necrose dos
hepatócitos (RUNNEGAR et al., 1994). Nesse estudo, os autores mostraram que os
níveis de GSH, molécula importante no processo de destoxificação de xenobióticos,
diminuíam antes do começo da toxicidade, indicando um papel desta molécula na
detoxificação da toxina. Posteriormente, Runnegar et al. (1995), concluíram que a
CYN inibe, diretamente, a síntese de GSH e que o citocromo P450 (CYP450) tem
papel importante na atividade da toxina, visto que inibidores desse complexo
enzimático levaram a diminuição parcial do efeito na produção de GSH e na
resposta tóxica. Linhagens celulares específicas, com atividades menores do
CYP450 sofreram uma toxicidade menor, evidenciando o papel crucial desse
complexo para a ativação metabólica da toxina (FROSCIO et al., 2003). Em adição,
a CYN também induz o aumento na transcrição de alguns genes relacionados ao
complexo enzimático CYP450 (ZEGURA et al., 2011), o que poderia ser a maneira
pelo qual esse complexo age ativamente na toxicidade dessa toxina.
Não são muitas as informações acerca do mecanismo de ação da CYN, mas
sabe-se que é um potente inibidor da síntese proteica, capaz de inibir a síntese de
globina em reticulócitos de coelhos (TERAO et al., 1994), provavelmente através do
bloqueio do processo de alongamento da cadeia polipeptídica (FROSCIO et al.,
2008). Terao et al. (1994) observaram que a CYN também causa a dissociação dos
ribossomos do retículo endoplasmático (RE) e proliferação acentuada das
membranas de hepatócitos de camundongos. Segundo Runnegar et al. (2002), a
retirada do anel tricíclico da toxina, diminui a inibição da síntese proteica em mais de
cem vezes e o grupamento uracil da molécula tem um papel importante em sua
atividade biológica, sugerindo que poderia causar a inibição através da interação
com o RNA ribossômico. Possivelmente também através da ligação do seu
22
grupamento uracil, cause danos na estrutura do DNA, possuindo grande potencial
genotóxico (SHEN et al., 2002) e possível efeito carcinogênico (FALCONER &
HUMPAGE, 2001). Adicionalmente, foi detectado significativo dano no cólon de
camundongos, com quebra simples do DNA, depois da injeção i.p. das doses de 100
e 200 µg de CYN/kg de peso corpóreo (BAZIN et al., 2010). ŽEGURA et al. (2011)
verificaram que 0,5 µg de CYN/ml foi capaz de causar aumento na expressão do
RNAm de genes envolvidos na resposta ao dano celular responsivos ao P53, genes
apoptóticos e associados a resposta ao estresse oxidativo em linfócitos de sangue
periférico humano.
Efeitos a longo prazo da exposição à CYN foram melhores estudados em
peixes. Sabe-se que em tilápias a toxina é capaz de causar estresse oxidativo e
mudanças histopatológicas com exposições a doses de 10 e 100 μg de CYN/ litro
(GUZMÁN-GUILLÉN et al., 2013, 2013A; RÍOS et al., 2014). No entanto, pouco se
sabe sobre efeitos crônicos em mamíferos. E em relação aos efeitos crônicos no
sistema reprodutor, não se tem conhecimento de nenhum estudo até o presente
momento. Embora seja um efeito comumente observado com a exposição a
diversos contaminantes ambientais e, inclusive, na exposição às cianotoxinas MCs,
com diminuição dos níveis do hormônio progesterona, distúrbios no ciclo estral de
fêmeas, decréscimo no peso dos testículos e níveis de testosterona em machos (WU
et al., 2014; LI et al., 2008).
1.6 CYN e a Possível Disfunção Endócrina
Atualmente, existe uma grande preocupação em relação aos efeitos da
exposição a compostos (sintéticos ou naturais) no sistema reprodutor, visto que
muitos vêm sendo reportados como potenciais disruptores endócrinos
(KORTENKAMP, 2007). Alguns contaminantes ambientais, tais como dibenzo-p-
dioxina, dibenzofuranos, e bisfenilas policloradas) possuem a capacidade de alterar
os ciclos estrais (ciclos reprodutivos), tanto em ratos quanto humanos (CHAO et al.,
2007), gerando uma preocupação quanto às consequências de alterações no
sistema reprodutor. Particularmente, há uma importante atuação dos contaminantes
23
na produção hormonal e na qualidade e quantidade do sêmen humano, com
consequências sobre o sucesso reprodutivo das espécies (COLBORN et al., 1993).
A CYN é um composto biologicamente ativo por ser capaz de interferir em
diversas vias metabólicas. Gácsi et al. (2009), observaram a indução de apoptose
em linhagens celulares de ovários de hamster (CHO-K1) causada pela exposição
por um curto período de tempo e a baixas concentrações da toxina (1-2 μM por 12
horas). Nesse mesmo estudo, a CYN causou necrose celular quando as células
foram expostas a concentrações mais altas e por períodos mais longos. Reisner et
al. (2004) sugeriram que a ingestão de água contaminada com a CYN por
camundongos machos poderia causar efeitos diretos ou indiretos no metabolismo do
colesterol, já que a toxina causou a diminuição nos níveis de colesterol hepático. A
injeção diária intraperitoneal de CYN em camundongos fêmeas gestantes causou
uma grande mortalidade materna, diminuição no tamanho dos filhotes e antecipação
do nascimento (ROGERS et al., 2007). Chernoff et al. (2011) expuseram
camundongos em diferentes períodos gestacionais a doses i.p. diárias (50 μg de
CYN/kg) durante 4 dias seguidos. Os autores encontraram como resposta à
exposição à toxina uma redução de peso dos filhotes no dia do nascimento,
letalidade fetal, sangramento vaginal nas mães e diminuição na sobrevivência dos
recém nascidos na primeira semana pós-parto.
Em ensaios in vitro Young et al. (2008) constataram que a CYN inibe a
produção de progesterona, mesmo com uma pequena concentração (0,0625 µg/ml),
em cultura de células da granulosa humana retiradas de mulheres realizando
tratamentos de fertilização. Porém, a toxina não se mostrou capaz de alterar os
níveis de produção de estrogênio. A exposição à toxina teve um papel citotóxico
nessas células após 24h. Esse trabalho evidenciou o papel de interferente endócrino
dessa cianotoxina, tendo em vista seu potencial para alterar a relação entre os
níveis séricos de progesterona: estrogênio. Por outro lado, o mesmo grupo
encontrou que mulheres com a fisiologia reprodutiva normal se mostram mais
resistentes aos efeitos citotóxicos e de desregulador endócrina da CYN (YOUNG et
al., 2012).
24
Em estudo anterior (CAIRES, 2013) realizado no Laboratório de Ecofisiologia
e Toxicologia de Cianobactérias (LETC_UFRJ) e no Laboratório de Endocrinologia
Molecular (LEM-UFRJ), a exposição i.p. aguda à dose de 64 µg de CYN
purificada/Kg de peso corpóreo fez com que as fêmeas experimentais parassem de
ciclar. Os animais expostos deixaram de apresentar as quatro fases fisiológicas do
ciclo estral ou, quando voltaram a ciclar, tiveram um prolongamento intenso da
duração no tempo total, isto é, o ciclo que durava em média seis dias antes da
injeção, passou a durar nove ou treze dias nas duas fêmeas que recuperaram a
ciclagem.
1.7 Eixo Hipotálamo - Hipófise - Gônadas
O sistema reprodutor masculino é composto por testículos, epidídimos, ductos
deferentes, glândulas sexuais acessórias e pênis, sendo semelhante na maioria dos
mamíferos (SOKOL, 1997), como camundongos e humanos. Da mesma forma, a
esteroidogênese, isto é, a síntese de hormônios esteroides, é um processo similar
entre mamíferos, sendo fundamental para funções fisiológicas essenciais, tais como
adaptação ao estresse, balanço eletrolítico, metabolismo de carboidratos e
reprodução.
O sistema reprodutor é regulado, de maneira geral, pelo eixo hipotálamo –
hipófise – gônadas (Figura 2) (SOKOL, 1997). Células neurais peptidérgicas
hipotalâmicas sintetizam e secretam o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH)
que estimula síntese e a liberação dos hormônios gonadotróficos (hormônio
luteinizante – LH e hormônio folículo estimulante – FSH). LH e FSH apresentam uma
estrutura única de cada hormônio, a cadeia beta, que lhes dá especificidade à
ligação aos seus receptores e uma estrutura heterodimérica comum (cadeia alfa). A
regulação desse eixo depende dos níveis séricos dos próprios hormônios que o
compõem. Os esteróides sexuais atuam sobre o hipotálamo e a hipófise,
promovendo a redução da síntese e secreção de GnRH e LH/FSH. Em adição, a
inibina, glicoproteína secretada pelas células de Sertoli, também inibe a síntese de
FSH e sensibilidade hipofisária à GnRH (SPRITZER & REIS, 2012).
25
LH e FSH estimulam a produção dos hormônios esteróides e a maturação das
células germinativas em indivíduos principalmente nas gônadas de ambos os sexos.
O LH estimula a síntese e secreção de testosterona pelas células de Leydig,
componente celular mais abundante do compartimento intersticial do parênquima
testicular, com retículo endoplasmático liso bem desenvolvido, numerosas gotículas
lipídicas e mitocôndrias com cristas tubulares (COUTO, 2011). O FSH estimula a
espermatogênese, agindo nas células de Sertoli, que ficam no compartimento dos
túbulos seminíferos (SPRITZER & REIS, 2012).
Figura 2: Esquema do eixo hipotálamo-hipófise-testículo. T: Testosterona; GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas; LH: hormônio luteinizante; FSH: hormônio folículo-estimulante (SPRITZER & REIS, 2012).
26
A regulação hormonal se dá por feedback negativo, uma grande concentração
de testosterona inibe, principalmente, a produção de GnRH no hipotálamo e, direta
ou indiretamente, a síntese e secreção de LH e FSH na hipófise (SWERDLOFF &
WANG, 1998). Da mesma forma, quando há diminuição da testosterona, a
retroalimentação negativa diminui, levando a maiores níveis de LH e FSH e os níveis
testosterona são novamente restabelecidos. Além disso, existe ainda a ação da
inibina, produzida pelas células de Sertoli, que promove uma maior ou menor
síntese e liberação de FSH e altera a sensibilidade hipofisária à GnRH (LUISI et al.,
2005). Segundo Peter & Dubuis, (2000), a produção dos hormônios esteróides
possui ainda um controle agudo (no qual a StAR, proteína reguladora aguda
esteroidogênica, possui papel central) e uma regulação a longo prazo, da transcrição
de genes associados a síntese de outras enzimas esteroidogênicas.
1.8 Via de Transdução do Sinal na Esteroidogênese
Segundo Papadopoulos, (2010), a síntese dos hormônios esteróides tem
início quando o LH se liga ao seu receptor LHcgr, acoplado a proteína G na
membrana das células de Leydig e induz a ativação da adenilato ciclase (AC),
responsável pela formação de AMPc a partir de ATP, como mostra a Figura 3A. O
AMPc ativa a proteína cinase A (PKA), que, por sua vez, induz a fosforilação de
fatores de transcrição que regulam a transcrição do gene da proteína StAR e uma
série de eventos que incluem a de-esterificação do colesterol de gotículas de
gordura.
Existe ainda outras duas vias que regulam a expressão da StAR. A primeira
(representada na Figura 3A) é mediada pelo ácido aracdônico (AA), que é liberado a
partir de fosfolipídeos e ativada pelo AMPc. O AA metaboliza duas famílias de
enzimas lipoxigenases, que aumentam a expressão da StAR e uma família de ciclo-
oxigenases que inibe a expressão. A segunda, consiste em uma via de sinalização
via proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK), que tem sido associada a uma
cascata de ativação de sinalizadores transmembranares e proteínas cinases
27
citoplasmáticas que culminam na regulação de diversos processos, entre eles, a
expressão da proteína StAR (MANNA & STOCCO, 2011).
Além das vias relacionadas, também é descrita a via da proteína cinase C
(PKC) como participante da regulação da biossíntese de esteróides (DEVLIN, 2007).
A fosfolipase C é ativada pela proteína G e hidrolisa o fosfatidil inositol bifosfato,
gerando Inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O DAG ativa a PKC, enquanto
o IP3 ativa o canal de cálcio, o que, em conjunto com a StAR, levam a elevação da
clivagem das cadeias laterais do colesterol (ação das enzimas esteroidogênicas) e,
com isso, a síntese dos hormônios.
1.9 Esteroidogênese
A StAR se localiza na membrana externa das mitocôndrias e interage com os
lipídios da membrana mitocondrial externa para promover a passagem do colesterol
para a membrana interna onde o complexo enzimático do citocromo P450
(CYP11A1 - clivagem da cadeia lateral do colesterol) está localizado. CYP11A1, nas
células de Leydig de adultos, tem a expressão regulada por AMPc e LH (LAVOIE &
KING, 2009). Sua regulação é importante visto que é responsável pelo primeiro
passo de conversão enzimática, isto é, converte o colesterol internalizado em
pregnonolona (PARKER & SCHIMMER, 1995).
28
Figura 3: Transdução de sinal induzida por LH na biossíntese de testosterona nos testículos. A Esquema das etapas envolvidas na síntese de testosterona nas células de Leydig. Transporte de colesterol para o interior da mitocôndria: StAR, proteína reguladora aguda esteroidogênica). AC: Adenilato ciclase; AA: Ácido Aracdônico; REL: Retículo Endoplasmático Liso. B Via esteroidogênica
simplificada (DHEA, deidroepiandrosterona; 3βHSD, 3β -Hidroesteróide desidrogenase; 17βHSD, 17 β-Hidroesteróide desidrogenase (COUTO, 2011; FROMENT et al., 2006 – modificados).
Em seguida, uma série de enzimas de três classes principais de proteínas:
enzimas do complexo citocromo P450 específicas, hidroxiesteróides desidrogenases
(HSDs) e esteroides redutases (MILLER, 1998), são responsáveis pelas etapas da
esteroidogênese. Já no retículo endoplasmático liso, a pregnonolona é convertida a
progesterona pela 3 β-Hidroesteróide desidrogenase (3βHSD) ou em 17- OH-
pregnenolona, que pode ser convertida através de diversos passos em testosterona
(ação da 17 β-Hidroesteróide desidrogenase - 17βHSD) e estradiol (Figura 3B).
1.10 Metabolismo da Testosterona e Espermatogênese
Após sua síntese, a testosterona é liberada e cai na corrente sanguínea ou é
29
lançada no espaço intersticial entre os túbulos seminíferos, onde vai difundir-se para
realizar sua ação parácrina. Nos vasos sanguíneos, é transportada por carreadores
proteicos até atingir os órgãos periféricos (Figura 4). Segundo Kapoor et al. (2008), a
testosterona circulante está presente em três frações: livre (2-3%), ligada à
Globulina Ligadora de Hormônios Sexuais – SHBG (50-80%) e ligada a albumina
(20-50%). Nos testículos, a proteína de ligação dos androgênios (ABP), secretada
por influência do FSH, liga-se com grande afinidade à testosterona e 5α-
dihidrotestosterona (DHT) para diminuir sua solubilidade (DADOUNE & DEMOULIN,
1993). Já nas células alvo, segundo Spritzer & Reis, (2012), os efeitos poderão ser
diretamente pela testosterona ou poderá ser metabolizada em DHT pela ação da 5
α-redutase ou em estradiol (E2) pela ação da enzima aromatase, como mostra a
Figura 4.
A ação de andrógenos (hormônios sexuais masculinos) promove o
desenvolvimento sexual, incluindo formação dos órgãos sexuais, descida dos
testículos e aumento de tamanho após o início da puberdade (quando a secreção de
GnRH aumenta e induz sua síntese). Esse andrógeno promove o desenvolvimento
das características secundárias masculinas, como a distribuição de pelos, hipertrofia
da mucosa laríngea juntamente com um alargamento da laringe, aumento do
desenvolvimento muscular, entre outros.
Os andrógenos ligam-se a proteínas específicas no núcleo e induzem as
alterações no metabolismo e na expressão gênica (NELSON & COX, 2011).
Segundo Walker, (2010), em um processo conhecido como a via clássica de ação, a
testosterona, após se difundir pela membrana plasmática das células de Sertoli, se
liga ao receptor de andrógeno (AR), que, no núcleo, se liga ao elemento responsivo
de andrógenos, permitindo o recrutamento de fatores de transcrição que alteram a
função de genes e, consequentemente, a função celular (Figura 4).
Porém, a necessidade fisiológica de níveis de testosterona mais altos do que
os necessários para via clássica levaram à descoberta de uma via alternativa de
ação da testosterona, que não fosse através do AR. Foi descrita, então, que esse
hormônio interage com um receptor na membrana plasmática e assim ativa a
30
fosfolipase C (PLC). A PLC, por sua vez, cliva PIP2, que em baixas concentrações
inibe canais de K+, culminando na despolarização da membrana e influxo de Ca2+
(WALKER, 2010).
Figura 4: Representação da circulação acoplada a proteínas, conversão em DHT (ação da 5
α-redutase) ou em estradiol (E2) (pela ação da aromatase) e via clássica de ação da testosterona (T)
(WALKER, 2010; WEINBAUER et al., 2010- modificados).
A testosterona, nas células de Sertoli (que envolvem e nutrem as células
germinativas), estimula a produção de numerosos fatores importantes para as
células espermatogênicas, a maturação dos espermatozoides no epidídimo, além da
manutenção quantitativa da espermatogênese (DE GENDT et al., 2004). Altos níveis
de testosterona intratesticulares são necessários para que a espermatogênese
ocorra via regulação da expressão gênica pelo receptor intracelular de andrógeno
(JAROW et al., 2005). Diversos estudos demonstraram que esse hormônio é
importante na formação e manutenção de conexões entre as células de Sertoli e
germinativas e liberação dos espermatozoides (LUI et al., 2003; WONG & CHENG,
31
2005).
Do ponto de vista toxicológico, xenobióticos afetam também a
espermatogênese, um processo contínuo de divisão celular, diferenciação e
maturação. Na espermatogênese, um processo cíclico ocorre nos túbulos
seminíferos, no qual espermatogônias diplóides se dividem e se diferenciam para
dar origem a espermatozoides (sptzs), como mostra a Figura 5.
Figura 5: Representação esquemática da espermatogênese (SALADIN, 2003. – modificado).
Ao ligar-se aos seus receptores nas células de Sertoli, o FSH estimula a via
do segundo mensageiro AMPc, ativando, assim, vários fatores necessários para a
produção de sptzs especializados. Essa produção ocorre a partir das células tronco
indiferenciadas, também chamadas de espermatogônias. A espermatogônia divide-
32
se por mitose dando origem a dois tipos de células: espermatogônia do tipo A (que
permanece em estado inicial de diferenciação e serve como substituta para a célula
parental) e do tipo B (STANBENFELDT & EDQVIST, 1996). Na segunda fase da
espermatogênese, a fase meiótica, os espermatócitos primários (diplóides) dão
origem a espermatócitos secundários (haploides) e, posteriormente, espermátides. A
fase pós-meiótica é a fase conhecida como espermiogênese, quando ocorre a
diferenciação das espermátides arredondadas em espermatozoides, com
condensação nuclear, redução do citoplasma, desenvolvimento da cauda e
formação do acrossoma. Segundo Stanbenfeldt & Edqvist, (1996), essa fase se
inicia nos túbulos seminíferos e termina na cabeça dos epidídimos. Espermiação, a
quarta fase, é o nome dado ao processo de liberação dos sptzs para o lúmen tubular
seminífero (WALKER, 2010). Os sptzs (ainda sem movimento), posteriormente,
seguem para a cabeça do epidídimo, onde, durante a passagem, sofrem o processo
de maturação, que confere motilidade progressiva e a habilidade necessária para
sofrer a reação acrossômica, interagir com a zona pelúcida, reconhecer e fundir-se
com a membrana plasmática do ovócito II (SULLIVAN et al., 2005). O transporte dos
espermatozoides pelo epidídimo é mediado pela contração de músculos lisos que
contornam o ducto. O epidídimo, de camundongos e humanos, é dividido em
cabeça, corpo e cauda, e também é responsável pela estocagem e proteção dos
gametas (SULLIVAN et al., 2005).
Sendo assim, compostos que interferiram morfológica e/ou fisiologicamente
nas células dos testículos ou no epidídimo muito possivelmente causarão alterações
na capacidade reprodutiva e produção hormonal, afetando, consequentemente, o
bom funcionamento do organismo como um todo.
33
2 JUSTIFICATIVA
A grande demanda por água potável resulta na obtenção desta a partir de
corpos hídricos com florações de cianobactérias. Além disso, o aumento das
florações tóxicas que vem ocorrendo em reservatórios de todo mundo pode levar a
um aumento da exposição humana e animal às toxinas de cianobactérias.
Sabe-se sobre o efeito da CYN em exposição aguda, porém, poucos estudos
focaram nos efeitos de uma exposição contínua à toxina. Estudo subcrônico
realizado em camundongos machos mostrou que a ingestão de água contaminada
com CYN em três diferentes doses foi capaz de aumentar o peso dos testículos dos
animais (HUMPAGE & FALCONER, 2003), mas a diferença não se manteve após a
normalização com o peso dos animais. Da mesma forma, Sukenik et al. (2006)
também observaram um aumento no peso desses órgãos quando não normalizados,
e, em adição, corroboraram os resultados de Reisner et al. (2004) sobre as
alterações no metabolismo de colesterol (precursor hormonal) induzidas pela
exposição à CYN.
Por haver uma crescente ameaça à qualidade dos corpos d’água, a produção
de cianotoxinas favorecida tornam-se importantes fatores de ameaça a qualidade da
saúde pública. Porém, análises de efeitos a longo prazo da CYN são escassos ou
inexistentes para machos, até onde se tem conhecimento. Logo, os efeitos já
observados da CYN como potencial disruptor endócrino precisam ser melhor
investigados, já que podem gerar consequências para o crescimento evolutivo e
sucesso reprodutivo de todas espécies. Por isso, realizamos o presente estudo com
a finalidade de ampliar o conhecimento acerca dos efeitos tóxicos da CYN e melhor
entendê-los.
34
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito da cilindrospermopsina com um número crescente de injeções
intraperitoneais semanais (de uma a quatro doses) em alguns parâmetros
fisiológicos e moleculares do sistema reprodutor de camundongos do sexo
masculino.
3.2 Objetivos Específicos
Verificar o efeito de CYN sobre:
O peso dos animais;
O peso do fígado (alvo primário da toxina) dos animais;
O peso dos testículos e epidídimos;
Os níveis séricos de testosterona;
A quantidade de espermatozoides na cabeça do epidídimo;
A expressão gênica de genes hipofisários: LHb e FSHb;
A expressão gênica de genes testiculares: StAR, CYP11A1 e LHcgr.
35
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Cilindrospermopsina
A toxina utilizada no experimento deste estudo foi obtida de uma solução
padrão (10 µg/ml) fornecida pela Abraxis (Warminster, USA).
4.2 Animais
Todos os camundongos utilizados eram do sexo masculino e apresentavam
um background genético híbrido de duas linhagens distintas (129sv/C57BL6), peso
aproximado de 20 a 30 g e idades de 12 a 18 semanas. Os animais foram mantidos
em biotério em fotoperíodo de 12 h (ciclos controlados de claro/escuro, com início do
ciclo claro às sete horas da manhã), à temperatura de 23 ± 2°C, com dieta alimentar
padrão (ração comercial) e água ad libitum.
O experimento, aprovado pela Comissão de Ética com Uso de Animais em
Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ (referência:
122/14), foi realizado de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals (BAYNE, 1996).
4.3 Desenho Experimental
Foi realizado um ensaio subcrônico com 20 animais durante um período total
de 28 dias. Os animais foram divididos em 4 grupos: controle, grupo 1, 2 e 3 (5
machos/grupo). A divisão em grupos baseou-se no tempo entre a primeira exposição
à toxina e o dia do sacrifício (7, 14 e 28 dias). As injeções intraperitoneais da dose
de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo ocorreram a cada sete dias, isto é, o grupo 1
recebeu apenas uma dose, o 2 recebeu duas e o 3 um total de quatro doses (Figura
36
6). Da mesma forma, o grupo controle recebeu até o 28º dia injeções semanais
contendo apenas 200 µl da solução veículo: água ultra pura (miliQ).
Figura 6: Representação esquemática do desenho experimental. Os animais foram pesados e expostos semanalmente a dose i.p. de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma dose (no 1º dia), o grupo 2 a duas (no 1º e 7º dia) e o grupo 3 a quatro doses da toxina (1º, 7º, 14º e 21º dia). O grupo controle foi exposto apenas à solução veículo em injeções nos mesmos dias do grupo 3. A eutanásia ocorreu em atmosfera de CO2 uma semana após a última injeção de CYN de cada grupo; o sangue foi coletado e os tecidos excisados.
Os animais foram submetidos à eutanásia em atmosfera de CO2 e tiveram os
tecidos excisados e sangue coletados para posteriores análises, conforme
esquematizado na Figura 7. O sangue obtido foi centrifugado a 600 x g a 4°C por 15
minutos e o soro armazenado em freezer -20°C. Os tecidos (fígado, testículos e
hipófise) foram pesados e congelados em nitrogênio líquido e armazenados em
seguida em freezer – 70°C, enquanto que a cabeça de cada epidídimo foi separada,
teve o peso aferido e imediatamente foi colocada em solução para a contagem dos
espermatozoides.
37
Figura 7: Esquema das análises realizadas com os tecidos após excisão e com o sangue dos
animais.
4.4 Contagem de Espermatozoides
A contagem foi realizada segundo método adaptado de Wang, (2003). As
cabeças dos epidídimos excisados foram colocadas individualmente em 1 ml de
solução tampão fosfato-salino (PBS, do inglês phosphate buffered saline) de pH 7,4
pré-aquecida à 35°C – 37°C, picotadas com tesoura cirúrgica (para permitir a
liberação dos espermatozoides) e, então, incubadas por 15 minutos. Após o período
de incubação, a contagem dos espermatozoides íntegros se deu em câmara de
Fuchs-Rosenthal em microscópio binocular Olympus BX-51.
4.5 Avaliação da Expressão Gênica
A expressão dos genes LHb e FSHb (hipófise), StAR, CYP11A1 e LHcgr
(testículos) foi quantificada por RT-PCR (do inglês Reverse transcription Polymerase
Chain Reaction) em tempo real. Para isso, primeiramente, a extração do RNA total
de uma porção do testículo esquerdo foi executada através do método do TRIzol
38
(TRIzol Reagent, Invitrogen, USA) de acordo com as informações do fabricante,
utilizando-se o Tissue Lyser LT (Qiagen) com 40 oscilações por 2 minutos para o
rompimento do tecido. A verificação da integridade do RNA obtido foi realizada por
eletroforese em gel de agarose 2% em TAE 1X (0,04 M Trisacetato + 1 mM EDTA).
A avaliação da pureza e a quantificação foram realizadas em nanofotômetro
(NanophotometerTM Pearl Implen). A partir do RNA isolado, para obtenção do cDNA
(DNA complementar), realizou-se a transcrição reversa com kit fornecido pela
Applied Biosystems (High Capacity cDNA Reverser Transcription Kit, Applied
BiosystemsTM, USA). Com base na quantificação realizada, 1 μg do RNA avolumado
para um volume de 10 μl com água ultra pura tratada com pirocarbonato de dietila
(água DEPC, livre de DNase e RNase) foi incubado a 70 °C por 10 minutos e
resfriado durante 1 minuto em gelo. Posteriormente, 0,8 μL dNTP 25X
(deoxinucleotídeos trifosfato, 10 mM), 2 μL Tampão 10X, 2 μL de Random Primers
10X, 1,0 μL de enzima (Transcriptase Reversa, 15 u) e 4,2 μL de água DEPC foram
adicionados. Após um spin (Interprise Minispin Centrifuge), a reação foi colocada no
termocilador (Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler) com as seguintes
condições de ciclagem: 1 ciclo de 25°C por 10 minutos, seguido de 1 ciclo de 37ºC
por 120 minutos, 1 ciclo de 85°C por 5 minutos e hold final a 4°C. Controles
negativos de reagentes (Ctrl-, sem a presença de amostra do tecido) e da enzima
(RT-, sem a presença da enzima transcriptase reversa) foram preparados nas
mesmas condições. O cDNA resultante permaneceu armazenado a 4°C.
Foi realizada a padronização do ensaio com diluições em série de cDNA para
calcular a eficiência do ensaio. A amplificação no PCR das amostras de cDNA na
diluição de 1:160 (testículo) ou 1:640 (hipófise) e dos controles foi realizada em
duplicata na máquina Mastercycler Ep 5 Realplex (Eppendorf, Hamburg, Germany).
As amostras foram adicionadas (5 μL) com 7,5 μL do mix com água DEPC, Maxima
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 2X (Thermo Scientific, Waltham, USA) e
primers específicos IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, USA),
identificados na Tabela 2. O protocolo utilizado consiste em uma incubação inicial a
50°C por 2 minutos, seguida de 10 minutos a 95°C, 40 ciclos (95°C por 15
segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 45 segundos). No fim de cada ciclo
39
foram adquiridos os dados de fluorescência. A curva de dissociação (melting curve)
seguiu os ciclos sob as condições: 95ºC por 15 segundos, seguida de 60°C por 15
segundos, aquisição por 20 minutos e 95°C por 15 segundos.
Tabela 2: Informações dos primers utilizados no PCR em tempo real para amplificação dos
genes alvo.
Primer Código de Identificação Tecido
LHb Mm.PT.58.42092877 Hipófise
FSHb Mm.PT.58.32556598 Hipófise
StAR Mm.PT. 58.23462722 Testículo
CYP11A1 Mm.PT.58.16276181 Testículo
LHCGR Mm.PT.58.16745023 Testículo
A amplificação do gene GAPDH (gene de expressão constitutiva que codifica
um membro da família da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi
utilizada como o controle interno. A expressão gênica de cada gene alvo foi
normalizada com a expressão do GAPDH, fornecido pela IDT ( Integrated DNA
Technologies, Coralville, USA), cuja sequência encontra-se na Tabela 3. Após a
normalização, a quantificação foi realizada pelo método da curva padrão, que produz
uma relação linear entre os valores de CT (do inglês cycle threshold) e a quantidade
inicial da amostra e, assim, permite determinar a concentração com base nos
valores de CT (WONG & MEDRANO, 2005).
Tabela 3: Sequência do primer para amplificação do gene GAPDH, utilizado como controle
interno.
Primer Sequência
GAPDH forward
GAPDH reverse
GTGACCAGGCGCCCAATAC
TCTCTGCTCCTCCCTGTTC
40
4.6 Dosagem Hormonal
A dosagem sérica de testosterona foi realizada por kits de ELISA (do inglês,
enzyme-linked immunosorbent assay), seguindo o protocolo do fabricante (USCN
Life Science, Houston, USA).
4.7 Análises Estatísticas
As análises foram realizadas com o uso do programa GraphPad Prism 5.0
(GraphPad Software Inc, USA). A normalidade das variáveis foi verificada pelo teste
Kolmogorov-Smirnov. Em casos de distribuição normal, foi escolhida a análise de
variância simples (One way ANOVA) seguida do teste de comparação múltipla de
Tukey para identificar possíveis diferenças. Foi utilizado o teste de Mann Whitney
para variáveis não pareadas. Os pesos dos animais foram expressos em média ±
desvio padrão e os demais resultados em box plot. Foi considerado significativo o
grau mínimo de significância de 95% (p inferior a 0,05).
5 RESULTADOS
5.1 Peso dos Animais
Todos os animais foram pesados em balança semi-analítica antes do início do
experimento e antes de cada injeção ou do sacrifício. A Figura 8 representa os
pesos de cada animal em todos os dias experimentais: antes do início do
experimento (dia 0); no sétimo dia após a primeira injeção (Dia 7); no décimo quarto
dia, após duas injeções (Dia 14); no vigésimo primeiro (Dia 21) e após três injeções,
no vigésimo oitavo dia (dia 28). Os resultados indicam que a maioria dos animais
tende a uma pequena variação positiva de peso. Porém, sem nenhuma diferença
significativa entre o peso de cada animal nos diferentes dias e sem relação com as
injeções da toxina.
41
Figura 8: Peso por grupo, em gramas, de cada animal (1, 2, 3, 4 e 5) nos diferentes dias
experimentais. A Peso dos animais do Grupo 1 (expostos a apenas uma dose de CYN) antes do
início do experimento (dia 0) e antes da eutanásia (dia 7). B Peso dos animais expostos a duas doses
da toxina (Grupo 2) no dia 0, antes da segunda injeção (7 dias) e antes da eutanásia (14 dias). C
Peso semanal (obtido antes das injeções e da eutanásia) dos animais do Grupo 3, que foram
expostos a três doses de CYN. D Peso dos animais do grupo controle nos diferentes dias
experimentais, sempre antes das injeções apenas da solução veículo (água ultra pura). *Dose da
toxina = injeção i.p. de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo.
Tabela 4: Peso dos animais em cada dia experimental.
Grupo 0 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias
1 26,78 ± 0,8
27,46 ± 0,9
- - -
2 27,22 ± 1,3
27,28 ± 1,4
27,94 ± 1,5
- -
3
26,3 ± 1,6
25,9 ± 1,8
26,76 ± 1,9
27,66 ± 2,2
27,38 ±2,1
Controle
26,1 ± 0,8
26,1 ± 1,1
25,7 ± 1,4
26,1 ± 1,3
27,1 ± 1,5
* Valores em média ± desvio padrão.
42
Em resumo, a Tabela 4 mostra a média dos pesos dos animais de cada grupo
e o desvio padrão, explicitando que a CYN, neste experimento, não interferiu no
peso corpóreo, visto que foi observada uma baixa oscilação entre todos os animais e
entre os grupos experimentais.
5.2 Peso dos Tecidos
A massa de todos os tecidos excisados foi determinada no dia do sacrifício
em balança semi-analítica e normalizado em relação ao peso de cada animal. O
fígado não apresentou diferença significativa de peso entre os diferentes grupos
experimentais em relação ao grupo controle (Figura 9).
Figura 9: Box plot do peso do fígado de animais expostos semanalmente (i.p.) a dose de 20 µg de
CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma dose, o grupo 2 a duas e o
grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma semana após a única ou
última injeção de CYN. Nenhuma diferença significativa observada entre os grupos.
O peso de cada testículo do animal foi obtido individualmente e somado,
como mostrado na Figura 10. Não houve nenhuma diferença significativa, embora
43
haja uma tendência a diminuição dos pesos no grupo 1 (expostos a apenas uma
dose de CYN).
Figura 10: Box plot do peso dos testículos somados de animais expostos semanalmente (i.p.) a dose
de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma dose, o grupo 2
a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma semana após a
única ou última injeção de CYN. Nenhuma diferença significativa observada entre os grupos.
Da mesma forma, os pesos dos epidídimos esquerdo e direito, obtidos
separadamente, foram somados e analisados estatisticamente em relação aos
outros grupos. Nenhuma diferença significativa foi observada em relação ao peso
desse tecido (Figura 11). Porém, há uma clara tendência de diminuição no peso dos
epidídimos dos animais do grupo 1.
44
Figura 11: Box plot do peso dos Epidídimos (direito e esquerdo) de animais expostos semanalmente
(i.p.) a dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma
dose, o grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma
semana após a única ou última injeção de CYN.
5.3 Dosagem Hormonal
A dosagem sérica de testosterona reforçou o papel de disruptor endócrino da
CYN, pois a toxina aumentou a concentração de testosterona sérica em relação ao
grupo controle tanto no grupo 1, quanto no grupo 2, indicando um efeito rápido no
sistema reprodutor (Figura 12). Embora não se observe diferença significativa no
grupo 3, quando observada a média, pode-se sugerir que parece ter havido uma
recuperação nos níveis com o tempo, com os valores se mantendo ainda maiores
que os dos animais do grupo controle. O aumento dos níveis hormonais podem
corroborar os dados encontrados para a quantidade de espermatozoides encontrada
no presente estudo (mostrado a seguir).
45
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
0
100
200
300
Dosagem Sérica
** **
Grupos experimentais
Testo
ste
ron
a (
ng
/dl)
Figura 12: Box plot da dosagem sérica de testosterona de animais expostos semanalmente (i.p.) a
dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma dose, o
grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma semana
após a única ou última injeção de CYN. Foi observado aumento significativo (p < 0,01) nos níveis
hormonais dos animais do grupo 1 e 2 em relação ao grupo controle.
5.4 Contagem de Espermatozoides
O número total de espermatozoides por animal foi obtido através da soma da
contagem em cada epidídimo individualmente. A Figura 13 mostra uma importante
diferença entre os grupos, com um aumento aparentemente progressivo à medida
que os animais foram expostos a mais injeções da toxina. A análise estatística
mostrou um aumento significativo na quantidade de espermatozoides da cabeça do
epidídimo no grupo de 28 dias em relação aos animais do grupo controle e aos
animais do grupo de 7 dias.
46
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
0
10
20
30 **
Espermatozoides
Grupos experimentais
Nú
mero
de E
sp
erm
ato
zó
ides (
x 1
06 /
ml)
Figura 13: Box plot da quantidade de espermatozoides na cabeça dos epidídimos dos animais do
grupo controle e dos grupo 1 (expostos a uma dose), grupo 2 (expostos a duas doses) e grupo 3
(expostos a quatro doses). A injeção i.p. semanal da dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo
levou a um aumento significativo na quantidade de espermatozoides dos animais do grupo de 28 dias
em relação ao grupo controle e grupo de 7 dias (p < 0,01).
5.5 Expressão Gênica
5.5.1 Testículo
A toxina não causou alterações significativas na expressão de nenhum dos
genes avaliados no testículo, visto que a análise estatística não resultou em
nenhuma diferença significativa da expressão em relação ao controle e entre os
grupos experimentais. A expressão da StAR, essencial para o transporte de
colesterol para a membrana mitocondrial interna, parece ter uma tendência de
diminuição da expressão nos animais expostos a duas doses (Grupo 2, Figura 14).
Enquanto que os resultados em relação à expressão do receptor de LH (Figura 15) e
do gene da proteína CYP11A1 responsável pela conversão de colesterol em
47
pregnenolona (Figura 16) aparentam se manter semelhantes a expressão nos
animais do grupo controle. No entanto, em todos os ensaios, houve uma importante
variação da expressão desses genes entre os animais, com grande variação,
principalmente nos resultados do grupo 1, expostos a apenas uma dose de CYN.
StAR Testículo
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0Exp
ressão
deS
tAR
testi
cu
lar
(rela
tiva a
o G
AP
DH
)
Figura 14: Box plot da expressão gênica da StAR no testículo de animais expostos semanalmente
(i.p.) a dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma
dose, o grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma
semana após a única ou última injeção de CYN. Não foi encontrada nenhuma diferença significativa
entre os grupos.
48
LHcgr Testículo
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0Exp
ressão
LH
cg
r te
sti
cu
lar
(rela
tiva a
o G
AP
DH
)
Figura 15: Box plot da expressão gênica do receptor do hormônio LH (LHcgr) no testículo de animais
expostos semanalmente (i.p.) a dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo
exposto a apenas uma dose, o grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos
animais ocorreu uma semana após a única ou última injeção de CYN. Não foi encontrada nenhuma
diferença significativa entre os grupos.
CYP11A1 Testículo
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Exp
essão
de C
YP
11A
1 t
esti
cu
lar
(rela
tiva a
o G
AP
DH
)
Figura 16: Box plot da expressão gênica de CYP11A1 de animais expostos semanalmente (i.p.) a
dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma dose, o
grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma semana
após a única ou última injeção de CYN. Não foi encontrada nenhuma diferença significativa entre os
grupos.
49
5.5.2 Hipófise
Assim como observado no testículo na expressão dos genes StAR, LHcgr e
CYP11A1, a expressão gênica dos hormônios hipofisários LH e FSH não diferiram
dos resultados encontrados no grupo controle (Figuras 17 e 18, respectivamente).
LHb Hipófise
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
Exp
ressão
hip
ofisári
a d
e L
Hb
(rela
tiva a
o G
AP
DH
)
Figura 17: Box plot da expressão hipofisária do hormônio LH de animais expostos semanalmente
(i.p.) a dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a apenas uma
dose, o grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais ocorreu uma
semana após a única ou última injeção de CYN. Não foi encontrada nenhuma diferença significativa
entre os grupos.
50
FSHb Hipófise
Contr
ole
Gru
po 1
Gru
po 2
Gru
po 3
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Exp
ressão
hip
ofisári
a d
e F
SH
b
(rela
tiva a
o G
AP
DH
)
Figura 18: Box plot da expressão da gonadotrofina FSH na hipófise de animais expostos
semanalmente (i.p.) a dose de 20 µg de CYN/Kg de peso corpóreo, com o grupo 1 sendo exposto a
apenas uma dose, o grupo 2 a duas e o grupo 3 a quatro doses da toxina. O sacrifício dos animais
ocorreu uma semana após a única ou última injeção de CYN. Não foi encontrada nenhuma diferença
significativa entre os grupos.
51
6 DISCUSSÃO
Embora a exposição humana se dê, em sua maioria, por via oral, comparando
as vias i.p. e oral, Falconer et al. (1999) e Seawright et al. (1999) verificaram que os
padrões de danos observados não são afetados pela via de administração. Os
efeitos encontrados se refletem em ambas, embora a exposição i.p. seja mais tóxica
que a via oral. Por isso, os autores sugerem que os estudos dos efeitos da injeção
i.p. possuem ligação direta com efeitos causados pela intoxicação oral na saúde
animal e humana.
A cilindrospermopsina não se mostrou capaz de interferir no peso dos animais
expostos a doses semanais baixas. Humpage & Falconer, (2003) mostraram que a
exposição a concentrações altas da toxina por via oral durante 10 semanas (432 e
657 µg/kg de peso corpóreo/dia) diminuiu significativamente o peso dos animais,
possivelmente devido a alteração do metabolismo dos mesmos, segundo os autores.
Enquanto Reisner et al. (2004), não encontraram efeito da toxina no peso dos
animais do sexo masculino expostos a 66 µg de CYN /Kg de peso corpóreo/dia
durante 3 semanas. Da mesma forma, em um estudo realizado com camundongos
machos e fêmeas com exposição a concentrações crescentes da toxina na água,
porém mais baixas do que as utilizadas no trabalho citado de Humpage & Falconer,
(2003) (variando de 10 a 55 µg/kg de peso corpóreo/dia), por 42 semanas, também
não foi verificada diferença significativa no peso corporal dos animais (SUKENIK et
al., 2006), corroborando com o presente estudo e indicando que doses baixas da
CYN, em exposição subcrônica, não possuem efeito direto no peso de
camundongos. Logo, a toxina não parece ter efeito direto no peso dos animais.
A exposição a CYN já foi amplamente associada a alterações patológicas no
fígado de mamíferos, inclusive, nos humanos que ingeriram água com floração de
Cylindrospermopsis raciborskii na Austrália (BYTH, 1980). Tais alterações envolvem,
comumente, hepatomegalia, cor amarelada e necrose (TERAO et al., 1994;
52
HAWKINS et al., 1997; FALCONER et al., 1999). Porém, no presente estudo, não foi
observada nenhuma alteração significativa no peso ou houve mudança aparente na
coloração do fígado dos animais experimentais e controle. Apesar de Humpage &
Falconer, (2003) terem registrado o aumento do fígado de animais expostos pela via
oral por 10 semanas a doses altas de CYN (216, 432 e 657 µg/kg de peso
corpóreo/dia), quando foram utilizadas doses mais baixas da toxina, isto é, 30, 60 e
120 µg/kg de peso corpóreo/dia durante 11 semanas por gavagem, o peso do fígado
permaneceu inalterado nos animais expostos. Sukenik et al. (2006) mostraram que a
exposição crônica à toxina com concentrações crescentes na água, atingindo doses
de 10 a 30 µg/kg de peso corpóreo/dia o aumento do fígado dos camundongos
(machos e fêmeas) só ocorreu após 42 semanas de exposição. Enquanto que com
20 semanas, nenhuma diferença significativa foi encontrada. Os efeitos não
observados podem ser relacionados a baixas doses utilizadas.
No presente estudo, foi utilizada uma dose semanal baixa de 20 µg de
CYN/kg de peso corpóreo mesmo que não tenha sido administrada pela via oral (via
que não permite a absorção completa da dose da toxina pelo trato digestivo devido
ao efeito de primeira passagem) como nos trabalhos citados. Já os efeitos
associados no fígado, classicamente relatado como órgão-alvo da toxina, podem
não ter sido encontrados pela falta de análises histológicas ou de função hepática.
Embora a hipótese de que tais alterações seriam encontradas apenas com doses
maiores ou por períodos mais longos de exposição seja sustentada por DUY et al.
(2000), que relatam que a dose i.p. diária de 20 µg/kg de peso corpóreo/dia durante
12 dias seguidos não causou alterações patológicas em diversos órgãos de
camundongos, incluindo o fígado. Os autores também sugerem esta como a dose
sem nenhum efeito adverso observável (NOAEL) para essa via de exposição.
Porém, mesmo sem alterações visíveis importantes na aparência macroscópica do
fígado, foram vistos tais efeitos específicos no sistema reprodutor (aumento de
testosterona e do número de sptzs).
Também não houve nenhuma diferença significativa no peso dos testículos e
dos epidídimos dos animais experimentais em relação aos animais do grupo
53
controle. Segundo Reisner et al. (2004), a ingestão diária de água com CYN por três
semanas causou um aumento no peso dos testículos dos camundongos. Por outro
lado, posteriormente, o mesmo grupo não encontrou alterações no peso dos
testículos relativos ao peso corporal de cada animal em camundongos expostos em
um ensaio crônico de um total de 42 semanas, com concentrações crescentes de
CYN na água consumida diariamente (SUKENIK et al., 2006). Humpage & Falconer,
(2003), não observaram diferença no peso dos epidídimos dos camundongos e
encontraram aumento significativo no peso dos testículos dos animais que, após os
órgãos serem normalizados com o peso corporal, não se manteve. Os autores
sugerem que seja uma consequência do baixo peso desse tecido e,
consequentemente, do maior erro associado a pesagem. Tal explicação também
pode ser inferida para os resultados do presente estudo, tanto para o peso dos
testículos, quanto para o peso dos epidídimos. Uma outra explicação pode ser a não
geração de efeitos visíveis nos tecidos devido à baixa dose utilizada, como já foi
ressaltado no parágrafo anterior. Maiores investigações em relação do efeito da
exposição à CYN, com análises histopatológicas nos testículos e epidídimos de
camundongos precisam ser realizadas, visto que pouco se sabe acerca da possível
ação da toxina nesses tecidos.
Disruptores endócrinos são substâncias que podem antagonizar os
hormônios, bloquear a sua ação natural ou, ainda, aumentar ou diminuir a
quantidade hormonal original (SANTAMARTA, 2001). Porém, devido ao sistema
endócrino envolver muitas etapas de regulação e ações enzimáticas no eixo
hipotálamo-hipófise-gônadas, os alvos de possíveis alterações são variados.
Anteriormente, a CYN já se mostrou como uma molécula disruptora em potencial,
visto que já foi capaz de causar a inibição da síntese de progesterona em células da
granulosa humana (YOUNG et al., 2008). Em adição, sua capacidade de interromper
ou prolongar o ciclo estral de fêmeas também foi relacionado à exposição aguda à
toxina em estudo realizado no LETC/LEM da UFRJ (CAIRES, 2013). Porém, não há
nenhuma informação detalhada em relação ao mecanismo de ação da toxina que
gere essas consequências.
54
Neste estudo, a exposição à toxina causou o aumento significativo dos níveis
de testosterona de animais expostos a uma ou duas doses (grupos 1 e 2,
respectivamente). A causa desse aumento é desconhecida. Diversas outras
substâncias, de diferentes classes, também podem alterar os níveis de testosterona.
O Bisfenol A (BPA), por exemplo, um composto utilizado na fabricação do
policarbonato, embora tenha ainda efeitos controversos, Galloway et al. (2010),
mostraram a associação da quantidade de BPA excretada com elevadas
concentrações de testosterona em homens adultos italianos. Possivelmente, essa
substância causaria um aumento nos níveis por uma atividade antiandrogenica que
alteraria os mecanismos de controle de feedback ou devido à redução da atividade
da aromatase. Nitrofurazona é um composto com peso molecular semelhante à CYN
que possui ação semelhante de causar antecipação do parto de camundongos
(CHERNOFF et al., 2011) e, em adição, também causa um aumento nos níveis
séricos de testosterona logo após a exposição (SHODA et al., 2001).
A produção de testosterona pelas células de Leydig localizadas nos testículos
é feita a partir do colesterol. A fonte de colesterol pode ser a partir de síntese de
novo realizada pelas próprias células que capturam ésteres de colesterol
armazenados ou a obtenção direta de lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL
(GEBARA et al., 2002). Segundo Reisner et al. (2004), a ingestão de água com
concentração subletal de CYN por três semanas, alterou significativamente o
metabolismo do colesterol, diminuindo os níveis encontrados no fígado e
aumentando o conteúdo plasmático. Do mesmo modo, Sukenik et al. (2006),
observaram um aumento significativo do colesterol no plasma de camundongos
após a ingestão diária de água com baixas concentrações de CYN durante 42
semanas. Possivelmente, a toxina induz essa alteração através da redução nos
níveis de GSH no fígado, o que leva a uma maior quantidade de lipoproteínas
oxidadas, fazendo com que a reabsorção hepática destas seja prejudicada
(REISNER et al., 2004). Tais resultados indicam que a CYN levaria a aumento do
colesterol circulante, que é utilizado para síntese dos hormônios esteroides nos
testículos.
55
O colesterol carreado pelo LDL é liberado no citosol e pode ser armazenado
em ésteres de colesterol que também podem ser utilizados para a síntese hormonal.
Logo, assim como a toxina aumenta os níveis de gotículas de gordura no fígado
(SEAWRIGHT et al., 1999), poderia causar o mesmo efeito nas células de Leydig,
que já são células que contêm abundância em gotículas de gordura (COUTO, 2011),
favorecendo ainda mais essa maior disponibilidade de colesterol para síntese de
hormônios esteroides.
A desregulação da síntese de testosterona pode ser, ainda, por uma alteração
na regulação da expressão de proteínas importantes do processo de síntese e/ou na
disponibilização do receptor de LH (LHcgr), visto que todas as vias responsáveis
pela síntese dos hormônios só se iniciam com a sua ativação. Porém, uma
expressão maior do receptor (que poderia levar a uma maior ligação de LH e,
consequentemente ao aumento na síntese dos hormônios) não foi observada como
efeito da exposição à CYN em nenhum grupo experimental no presente estudo.
Logo, o aumento de testosterona não está relacionado a essa etapa da
esteroidogênese.
A proteína StAR medeia o transporte do colesterol para o interior da
membrana mitocondrial, e, por isso, é responsável por uma etapa limitante da
síntese de hormônios esteroides e um alvo em potencial de disruptores endócrinos.
Sua expressão é regulada por três vias. Uma via de transdução de sinal que envolve
a produção de AMPc e ativação da PKA que induzem a expressão do gene da
proteína. Outra via mediada pelo AA, que aumenta a expressão da StAR como
consequência da ativação pelo AMPc. Além da ação da sinalização da MAPK,
também associada a regulação da proteína. A alteração nos níveis séricos de
testosterona poderia ser devido a um aumento de estímulo em qualquer uma das
vias de regulação. Assim, esperaríamos que a expressão gênica da StAR fosse
positivamente influenciada, o que não foi visto no presente estudo. Isto corrobora
com os dados encontrados por Young et al. (2012), que realizaram estudos in vitro
com a exposição de células da granulosa luteínicas humanas estimuladas com
gonadotropina da coriônica humana – hCG a diferentes concentrações de CYN. Na
56
ocasião, os resultados obtidos não indicaram alteração da atividade esteroidogênica,
sugerindo que a síntese da proteína StAR não seria alterada pela CYN. Porém, foi
mencionado que o ensaio não possuía sensibilidade suficiente para detectar
pequenas alterações na síntese da StAR.
No lúmen mitocondrial, o colesterol é convertido em pregnenolona, que será,
posteriormente, transportada para o RE, onde ocorrerão as etapas de síntese da
testosterona a partir da progesterona ou da própria pregnenolona. Na mitocôndria, a
etapa inicial é catalisada pela enzima de clivagem da cadeia lateral, a CYP11A1,
que consiste em uma enzima citocromo P450 de classe I. O aumento na atividade
de enzimas citocromo P450 pode resultar da indução da síntese de citocromo P450
por exposição a fatores ambientais, como compostos xenobióticos. Segundo Zegura
et al. (2011), a concentração de 0,5 µg de CYN/ml levou a um aumento na
expressão de genes do CYP450, o que pode indicar uma possível modificação da
função dessa enzima envolvida na síntese de hormônios esteroides. O resultado do
efeito da exposição semanal à toxina na expressão gênica da CYP11A1, entretanto,
não apresentou diferença significativa nos camundongos do presente estudo.
A progesterona também serve como precursor para a síntese de testosterona,
através da conversão, catalisada pela enzima 17α-Hidroxilase (CYP17) a
androstenediona, que é convertida a testosterona pela ação da enzima específica
para a produção de andrógenos, 17βHSD (KOSTIC et al., 2011). Young et al. (2008)
sugeriram um papel de disruptor endócrino da CYN após uma exposição de células
da granulosa humana à concentração baixa da toxina purificada (0,0625 µg/ml) ter
causado a inibição da síntese de progesterona em células da granulosa humana.
Dessa forma, através da diminuição dos níveis normais de progesterona, as células
de Leydig podem induzir e regular positivamente a síntese de testosterona, de
maneira compensatória. Ao passo que, por exemplo, a atividade da enzima CYP17
aumentada poderia levar a um favorecimento nesta etapa da via esteroidogênica, já
que tal enzima também catalisa a conversão de pregnenolona em 17-OH-
pregnenolona, que pode ser convertida à 17α-OH-progesterona ou DHEA (atividade
das enzimas 3βHSD e CYP17, respectivamente), ambas precursoras diretas de
57
testosterona. Isto é, a atividade de CYP17 aumentada, poderia também privilegiar a
síntese de testosterona a partir de DHEA pela via Δ5, uma via bem utilizada em
testículos humanos (MOLINA, 2007), sugerindo um possível efeito correspondente
em humanos expostos à toxina.
Embora tenha sido observado que os fígados dos animais não tenham
alterado seu peso, há ainda uma possível relação entre uma maior disponibilidade
de testosterona sérica e outros efeitos (não analisados) no fígado dos
camundongos. Terao et al. (1994) realizaram a injeção i.p. em camundongos
machos de uma dose dez vezes maior que a dose desse estudo e concluíram que a
toxina gera quatro fases de alterações patológicas, em períodos diferentes. A
primeira interação não envolve grande alteração no tamanho do fígado dos animais,
porém, há a presença de alterações morfológicas nos hepatócitos dos animais.
Considerando-se que a metabolização hepática é responsável pela maior parte da
inativação da testosterona (GEBARA et al., 2002), caso a dose tenha sido pequena
a ponto de não causar hepatomegalia, mas grande a ponto de gerar problemas na
morfologia e no funcionamento das células hepáticas, pode ter resultado em uma
diminuição de inativação com consequentes maiores níveis séricos do hormônio em
questão. Análises histopatológicas do fígado seriam importantes meios para
entender os efeitos causados pela exposição à toxina nesse experimento.
Por mais que todos os mecanismos de resposta mencionados anteriormente
possam estar relacionados com os níveis altos de testosterona encontrados, a
regulação da síntese hormonal é, primariamente, regulada pelo LH produzido na
hipófise (VELDHUIS et al., 1988). O LH é transportado na circulação até os
testículos onde atuam nas células de Leydig (células-alvo), ativando a transdução de
sinais e aumentando substrato para síntese hormonal. Por isso, resultados que
aumentam os níveis de testosterona podem ser efeitos diretos de uma maior
estimulação pelo LH. O que não parece ser o caso nesse trabalho, visto que a
expressão gênica hipofisária do LH não apresentou aumento significativo entre os
animais estudados. Embora ainda assim a secreção possa estar alterada, já que,
por dificuldades metodológicas, esta não foi medida nesse estudo. Por outro lado,
58
como o eixo hipotálamo-hipófise-testículos é regulado por um mecanismo de
feedback negativo hormonal, os níveis altos de testosterona em situações de
homeostase, levariam a uma inibição das secreções de LH como uma tentativa de
recuperar os níveis séricos normais. Logo, sugere-se que tenha sido causado algum
problema de comunicação nesse processo de retroalimentação.
O GnRH hipotalâmico é secretado e conduzido no sistema porta hipofisário
para a hipófise anterior, onde se liga a receptores específicos e atua estimulando e
regulando a secreção das gonadotropinas, entre elas o LH. A testosterona, por sua
vez, exerce retroalimentação negativa, inibindo a secreção de GnRH, e age na
produção hormonal hipofisária reduzindo a sensibilidade desta a GnRH (SALADIN,
2003). Com isso, pode-se interpretar que a problemática no mecanismo de
regulação estaria na resposta do tecido hipotalâmico e não propriamente na síntese
direta de LH na hipófise.
Segundo Gebara et al. (2002), no cérebro, a aromatização da testosterona em
estradiol tem importante efeito na regulação da secreção de gonadotrofina e na
função sexual. Sendo assim, um processo defeituoso de aromatização, que seria
catalisado pela enzima aromatase em condições normais, pode não só causar um
acúmulo de testosterona, já que esta não seria convertida, assim como pode levar a
um defeito de regulação de GnRH.
A testosterona é igualmente convertida em DHT, o mais ativo agonista do
receptor de testosterona (KRONENBERG et al., 2008). Um defeito no processo de
conversão de testosterona em outras moléculas, isto é, na atividade da enzima 5 α-
redutase poderia, de certa maneira, ter levado a um aumento ainda maior de
testosterona circulante pelo fato de não haver reação.
Segundo Terao et al. (1994), a CYN é um potente inibidor da síntese proteica.
Por isso, a toxina poderia agir diminuindo a síntese de proteínas responsáveis por se
ligarem à andrógenos na corrente sanguínea (SHBG) e nos testículos (ABP) (assim
como, é importante ressaltar, na síntese proteica das enzimas cujas expressões
foram medidas). Assim, considerando que alterações na concentração do SHBG
59
podem conduzir a variações nos níveis circulantes de testosterona e que tal proteína
é sintetizada no fígado (MARCONDES, 2002), que é um importante alvo da toxina,
esse torna-se um mecanismo em potencial de ação da CYN. Por outro lado, a ABP
possui importante função na manutenção da elevada concentração de testosterona
no testículo necessária para a espermatogênese. Logo, se sua síntese prejudicada
fosse um efeito da exposição à CYN, a quantidade de sptzs produzida
provavelmente estaria diminuída, o que não foi visto no presente estudo.
O excesso de testosterona sérica pode, por fim, ter causado um processo de
dessensibilização do AR, isto é, a diminuição do número de receptores, assim como
ocorre em vários outros sistemas biológicos de sinalização após estimulação intensa
de agonistas. Dessa forma, o organismo pode ser capaz de responder de maneira
compensatória e normalizar a síntese de testosterona (como o que pode ser visto no
grupo experimental 3), por mais que possa ter tido alguma alteração patológica
induzida pela CYN.
Chernoff et al. (2011), após a exposição diária via i.p. de camundongos
fêmeas grávidas (em diferentes períodos gestacionais) durante cinco dias à dose de
50 µg de CYN/kg de peso corpóreo/dia observaram alterações em parâmetros
histológicos, em marcadores de alterações hepáticas e na expressão de genes
envolvidos no metabolismo lipídico, resposta inflamatória e estresse oxidativo.
Porém, mesmo com doses consideravelmente maiores do que as utilizadas no
presente estudo, houve uma recuperação em todos os efeitos observados,
evidenciando que esses animais parecem ter um mecanismo de depuração e
recuperação eficiente em relação a essas doses de CYN utilizadas.
Sabe-se que a testosterona secretada atua como agente parácrino na
espermatogênese. Sabe-se que sua função parácrina é necessária para formação e
manutenção de conexões entre as células de Sertoli e germinativas, além da
liberação dos sptzs para a porção da cabeça do epidídimo (WONG & CHENG,
2005). Além disso, a falta de testosterona causa falha na espermiação em ratos e
humanos, problemas no processo de espermiogênese e comprometimento da
barreira hemato-testicular (HAYWOOD et al., 2003; CHANG et al., 2004), reforçando
60
o papel crucial que possui nesse processo. Por isso, o aumento significativo no
número de sptzs observado como resposta à exposição à CYN no grupo 3, isto é, o
grupo cuja eutanásia foi realizada 28 dias após a primeira injeção, muito
provavelmente possui ligação direta com o aumento de testosterona e AR. A
espermatogênese consiste em um processo dinâmico e muito bem organizado, e,
por isso, torna-se um processo longo e complexo, com várias fases de
transformação. Segundo Adler, (2000), as fases proliferativa e meiótica, isto é, de
diferenciação da espermatogônia até o desenvolvimento dos espermatócitos em
espermátides, dura em torno de 20 dias em camundongos. Já o processo completo
de diferenciação das espermátides em sptzs dura cerca de 9 dias em camundongos.
Considerando que, segundo Stabenfeldt & Edqvist, (1996), essa etapa se inicia nos
túbulos seminíferos, mas tem fim no epidídimo e que a porção da cabeça dos
epidídimos foi a utilizada para a contagem de spzts no presente estudo, esse
período total que ocorre em camundongos justifica o atraso observado na resposta
da produção de sptzs induzida por testosterona.
O aumento significativo no número de sptzs poderia também estar associado
a um aumento na expressão de FSH, já que este hormônio hipofisário atua nas
células de Sertoli para estimular a secreção de agentes parácrinos que são
essenciais para a espermatogênese. Porém, nenhuma alteração significativa na sua
expressão foi encontrada, indicando a possível existência de outro alvo de alteração
ou que apenas a síntese da proteína poderia estar alterada. Em adição, a explicação
utilizada de problemas no feedback negativo também se encaixa para FSH. Outra
hipótese é de alteração da ação da glicoproteína inibina, que é fisiologicamente
secretada pelas células de Sertoli e responsável pela síntese e liberação de FSH,
assim como pela alteração da resposta da hipófise a presença de GnRH. Ou seja, a
inibina em organismos normais participa do feedback negativo na hipófise, baixando
os níveis de FSH, controlando a taxa de produção de sptzs (LUISI et al., 2005).
Os resultados da expressão gênica dos genes no presente estudo mostram
uma importante variação individual das respostas, visto que a dispersão dos
resultados apresentou-se, muitas vezes, com uma amplitude grande nos grupos
61
experimentais. Chernoff et al. (2011), ao analisarem a toxicidade em diferentes
períodos gestacionais de camundongos, encontraram um aumento significativo na
variância nos grupos expostos à CYN, indicando ser uma característica de resposta
induzida pela toxina. Da mesma forma, outros autores também já encontraram uma
tendência de variabilidade de respostas individuais à toxina (SEAWRIGHT et al.,
1999; NORRIS et al., 2001). Dessa forma, torna-se interessante estudar fatores que
poderiam levar a uma variação de respostas possivelmente causadas pela CYN.
De maneira geral, supostamente, a toxina pode causar um aumento reversível
(como possível resultado de adaptação do organismo, através de dessensibilização
de receptores, por exemplo) nos níveis de testosterona por aumentar a
disponibilidade de colesterol, assim como pode estar interferindo na expressão de
enzimas esteroidogênicas não analisadas no presente estudo. Alterações na
esteroidogênese mediadas por interferência na expressão gênica podem ser vistas
rapidamente (LIN et al., 2014), por isso, existe a possibilidade da interferência da
toxina na atividade ou expressão das proteínas não ter sido observada pela análise
realizada apenas dias depois da exposição. Além disso, a CYN pode, ainda, estar
interferindo no mecanismo de regulação, o que justificaria a falta de resposta
imediata em hormônios envolvidos na regulação negativa. A alteração parcial da
conversão em DHT ou E2 pode ter influenciado a falta de regulação momentânea e
contribuído para aumentar os níveis de testosterona circulante, assim como a
inibição da síntese da SHBG. Por fim, os níveis mais altos de testosterona,
provavelmente por ação direta, levaram a um aumento significativo na quantidade de
sptzs presentes na cabeça do epidídimo. Porém, esse aumento quantitativo não
está, necessariamente, relacionado ao aumento da capacidade reprodutiva, já que a
análise qualitativa não foi realizada.
De acordo com Rodrigues (2013), a testosterona é o esteroide mais
abundante no organismo masculino. Níveis basais de testosterona são associados
ao correto desenvolvimento e atividade reprodutiva dos indivíduos. Por isso,
qualquer alteração na síntese desse hormônio e/ou na regulação envolvida, como
especula-se nesse estudo, pode levar a interferências na normalidade do sistema
62
reprodutor. Por exemplo, Furman et al. (2014), encontraram relações diretas entre
níveis altos de testosterona e imunossupressão, isto é, enfraquecimento da resposta
do sistema imunológico em homens de diferentes idades. O efeito da exposição à
toxina aumentando significativamente os níveis de testosterona torna-se ainda mais
preocupantes, visto que estudo recente indica que esse hormônio é um potente
promotor de tumor na próstata de ratos (que foram anteriormente injetados com
agente cancerígeno) mesmo em pequenas doses (BOSLAND, 2014). Além disso, a
testosterona também foi capaz de causar o aparecimento de tumores malignos em
outros sítios. Por isso, a ingestão crônica da toxina gerando aumento de
testosterona poderia ser extremamente crítica, particularmente, para pacientes com
câncer de próstata, intensificando os riscos à saúde pública causados pela CYN.
Os resultados reforçam os previamente encontrados que sugerem o papel
disruptor endócrino dessa toxina. No entanto, existem diversas possibilidades de
mecanismo de ação endócrina da CYN. Seus efeitos podem ser em vias e alvos
variados, com ações sinérgicas ou não, de maneira que ainda não podem ser bem
esclarecidos. Por isso, para entender melhor o papel disruptor endócrino da toxina,
mais estudos se fazem necessários.
63
7 CONCLUSÕES
A exposição i.p. semanal de CYN não foi capaz de causar alterações
nos pesos dos animais de nenhum dos grupos experimentais.
Os pesos do fígado, testículos e epidídimos também não apresentaram
diferença significativa entre os grupos expostos à toxina.
Por outro lado, a injeção i.p. de CYN foi capaz de causar:
o Aumento significativo nos níveis séricos de testosterona em dois
grupos experimentais: 1 e 2 (expostos a uma ou duas doses
semanais, respectivamente);
o Crescimento significativo na quantidade de espermatozoides na
cabeça do epidídimo no grupo de animais expostos a quatro
doses de CYN i.p. (grupo 3);
Porém, no presente estudo, os aumentos encontrados não tiveram
ligação com a expressão gênica dos genes testiculares (LHcgr, StAR e
CYP11A1) e hipofisários (LHb e FSHb), visto que nenhum foi expresso
com diferença significativa em relação ao grupo controle.
64
8 PERSPECTIVAS
Os resultados encontrados no presente estudo mostram que a CYN é capaz
de interferir no sistema reprodutor masculino, porém, novos experimentos se fazem
necessários para responder de que maneira seria essa interferência. Primeiramente,
é importante analisar o efeito também nos níveis de colesterol, visto que esse efeito
da CYN é embasado na literatura e por consistir no precursor dos hormônios
esteroides. Pretende-se avaliar a expressão de outras enzimas esteroidogênicas e
de conversão da testosterona (aromatase e 5 α-redutase), além da síntese dessas
mesmas enzimas. Além de fazer as análises histológicas dos tecidos, é preciso
estudar qualitativamente os sptzs em quantidade aumentada e a fertilidade desses
animais.
65
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