Universidade Federal do Rio de Janeiro€¦ · Bruno Meirelles Paes INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL...

Bruno Meirelles Paes

INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera

membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR

Macaé

2017

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira

Programa de Pós-graduação em Produtos

Bioativos e Biociência



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade

Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientadora: Profª. Drª. Juliana Montani Raimundo


Macaé, 2017




Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio

de Janeiro para obtenção do grau de mestre em produtos

e bioativos e biociências.

Orientadora: Profª Drª Juliana Montani Raimundo

Aprovada em 07/06/2017

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________

Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo (Orientadora)

Campus UFRJ-Macaé

__________________________________________________

Profa. Dra.Cintia Monteiro de Barros

Campus UFRJ-Macaé

____________________________________________________

Prof. Dr. Leandro Louback da Silva

Campus UFRJ-Macaé

_____________________________________________________

Prof. Dr. Thiago da Silveira Álvares

Campus UFRJ-Macaé

Dedico esta conquista a todos os meus

familiares, amigos e a todas as pessoas

que me fazem felizes.

AGRADECIMENTO

Aos meus pais primeiramente, Moacyr e Alba. Sem o apoio, o incentivo ao

estudo e o amor de vocês essa conquista não seria possível.

Às minhas irmãs, Marina e Liana. Irmãos não servem apenas para brigar e

sim, para apoiar, aprender e puxar as orelhas de vez em quando.

Aos meus avós maternos, Wanilton e Alba. Com a calma, mimos, sabedoria,

experiência e o amor de vocês. Aos meus avós paternos, Herval e Maria Francisca,

também tenho mais além de agradecimentos. Apesar de não ter sido muito próximo

do meu avô e minha avó ter falecido antes do meu nascimento, construíram de

maneira perfeita os pilares de suas famílias e, um desses pilares, é o meu pai.

A todos meus familiares que contribuíram de forma significativa para essa

conquista. Destaco em especial aos meus tios, Mário, Luís Antônio, Paulinho e à

minha única e preferida tia, Cida.

Faço um agradecimento em especial à memória do meu tio Teté. Esse nos

deixou no meio dessa jornada. Sempre foi um tio muito presente e incentivador aos

estudos.

À minha namorada Fernanda. Apesar de nos reencontramos no meio dessa

jornada, foi essencial para o término da mesma através do seu amor, paciência e

carinho.

Aos meus amigos, em especial William, Reynaldo, Diego, Bruno Moraes,

Jéssica Ladeira e Cinthya Maciel. Nessa trajetória de mestrado não houve tantas

festas, bebedeiras e ressacas quanto no tempo de graduação, mas o apoio e a

amizade de vocês foram essenciais para esta conquista.

A todos os colegas que passaram e ficaram na minha vida nesse período do

mestrado.

A todos os amigos e colegas que fiz no LIP. Em especial à Cinthya Maciel,

Millena Vidal e Letícia Ferreira. Todas vocês foram essenciais para essa conquista.

Em especial à minha professora orientadora Juliana Montani. Pela calma,

conhecimento, atitudes e paciência, mas muita paciência. E mais um pouco de

paciência. Talvez mais um pouco de paciência. Pode ter certeza que o profissional

que virei hoje, tirei um pouco de você.

Aos professores que contribuíram de forma significativa para meu

crescimento profissional e formação.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

RESUMO

Alterações vasculares morfológicas e funcionais, como estresse oxidativo e

disfunção endotelial, são característicos das doenças cardiovasculares e seus

fatores de risco. Sendo assim, há a necessidade de busca por novas substâncias

capazes de atenuar e/ou prevenir a disfunção vascular. Portanto, o objetivo deste

trabalho foi avaliar o potencial farmacológico de produtos bioativos obtidos da

espécie vegetal Kielmeyera membranacea (extrato hidroalcólico das folhas – EKM,

frações e subfrações) na disfunção vascular. A atividade vasodilatadora e os efeitos

na reatividade vascular na ausência e presença de disfunção vascular foram

investigados em aortas isoladas de ratos Wistar preparadas para registro de tensão

isométrica. O EKM provocou vasodilatação dependente do endotélio através da

ativação da produção de óxido nítrico, com participação dos receptores de

bradicinina B2 e de estrogênio ERα. A incubação de anéis de aorta com 25 mM de

glicose por 2 h ou com 10 µM de pirogalol por 15 min resultou em aumento da

contração induzida por fenilefrina e redução da resposta vasodilatadora à

acetilcolina. Quando a disfunção vascular foi induzida por glicose, o pré-tratamento

com 3,5 µg/mL de EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou

parcialmente a vasodilatação em resposta à acetilcolina. No entanto, quando a

disfunção vascular foi induzida por pirogalol, o EKM normalizou apenas a reatividade

à fenilefrina. A fração butanólica do EKM provocou intenso relaxamento vascular e

foi mais potente que as demais frações e o EKM. Entre os flavonoides identificados

na fração butanólica, a orientina parece ser o principal envolvido no efeito

vasodilatador.

Palavras chave: Disfunção vascular, óxido nítrico, vasodilatação.

ABSTRACT

Functional and morphological vascular changes, such as oxidative stress and

endothelial dysfunction, are characteristics of cardiovascular diseases and its risk

factors. Therefore, there discovery of new substances capable of attenuating and/or

preventing vascular dysfunction is needed. The aim of the present work was to

investigate the pharmacological potential of bioactive products from Kielmeyera

membanacea species (hydroalcoholic extract of leaves – EKM, fracions and

subfractions) for vascular dysfunction. The vasodilatory activity and the effects on

vascular reactivity in the absence and presence of vascular dysfunction were

assessed in Wistar rat aortas prepared for isometric tension recording. EKM-induced

vasodilation was endothelium-dependent and mediated through the activation of NO

production, with the involvement of bradykinin B2 and estrogen ERα receptors.

Incubation of aortas with either 25 mM glucose for 2 h or 10 µM pyrogallol for 15

mim, resulted in augmented vasoconstriction to phenylephrine and reduced

vasodilation to acetylcholine. When vascular dysfunction was induced by glucose,

pretreatment with 3.5 µg/mL of EKM normalized vascular reactivity to phenylephrine

and partially restored vascular reactivity to acetylcholine. On the other hand, when

vascular dysfunction was induced by pyrogallol, pretreatment with EKM only restored

vascular response to phenylephrine. Butanol fraction of EKM induced intense

vasodilation and exhibited higher potency when compared with the other fractions

and EKM. Among the flavonoids isolated from butanol fraction, orientin seems to be

the main metabolite involved in the vascular effects of EKM.

Key words: Vascular dysfunction, nitric oxide, vasodilatation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo de vasodilatação causado pelo óxido nítrico (NO),

prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) 21

Figura 2. Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular

levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS 24

Figura 3. Registro representativo do teste para avaliação da integridade

do endotélio 34

Figura 4. Registro típico da resposta contrátil a 10µL de fenilefrina

seguido a exposição a concentrações crescentes e cumulativas do EKM

em anéis de aorta com endotélio 37

Figura 5. Efeito vasodilatador do EKM em anéis de aorta com e sem

endotélio 38

Figura 6. Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do EKM 39

Figura 7. Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no

efeito vasodilatador do EKM 40

Figura 8. Envolvimento da via PI3k/Akt e da ativação dos receptores de

estrogênio no efeito vasodilatador do EKM 41

Figura 9. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina 42

Figura 10. Efeitos do EKM na reatividade vascular à acetilcolina 43

Figura 11. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de

disfunção vascular induzida por glicose 44

Figura 12. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de

disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 46

Figura 13. Efeito vasodilatador das frações hexânica, em diclorometano,

em acetato de etila e butanólica do extrato hidroalcoólicos das folhas de K.

membranacea em anéis de aorta com endotélio 48

Figura 14. Efeito vasodilatador das subfrações 1, 2 e 4 da fração

butanólica do extrato hidroalcoólico das folhas de K. membranacea em

anéis de aorta com endotélio 50

Figura 15. Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração

butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarpos flavona A 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica. 33

Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de

folhas de K. membranacea (EKM) e frações.

49

Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de

folhas de K. membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas

subfrações.

51

Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração

butanólica de K. membranacea.

51

LISTA DE ABRAVIATURAS E SIGLAS

[Ca2+]i – Concentração intracelular de Ca2+

AcOEt – Acetato de etila

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ou monofosfato de adenosina cíclico

AMPK – Proteína quinase ativada pelo AMPc

ATP – Trifosfato de adenosina

BH2 – 6-7-[8H]-H2-biopterina

BH3 – Trihidrobiopterina

BH4– Tetrahidrobiopterina

BuOH – Butanol

CaMKII – Proteína quinase II dependente da calmodulina

CI50 – Concentração inibitória média

CE50 – Concentração eficaz média

DAG –Diacilglicerol

DCNT – Doenças crônicas não transmissíveis

DCVs – Doenças cardiovasculares

DM – Diabetes mellitus

DM-1 – Diabetes mellitus tipo 1

DM-2- Diabetes mellitus tipo 2

DMSO - Dimetilsulfóxido

EDHF –Fator hiperpolarizante derivado do endotélio

EKM – Extrato hidroalcóolico de folhas de Kielmeyera membranacea

eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial

ET-1 – Endotelina-1

FAD – Flavina adenina dinucleotídeo

FMN – Flavina mononucleotídeo

GCs– Guanilatociclase solúvel

GMPc –Monofosfato de guanosina cíclico

GTP – Guanosina trifosfato

HAS – Hipertensão arterial sistêmica

Hex – Hexano

IP3 –Inositol 1, 4, 5, trifosfato

iNOS – Óxido nítrico sintase induzível

LDL – Proteína de baixa densidade

L-NAME – L-NG-Nitroarginina metil éster

MeOH –Metanol

MLCK – Quinase de cadeia leve de miosina

NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NO – Óxido nítrico

nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal

NOS – Óxido nítrico Sintase

ODQ – 1H-(1,2,4)oxidiazolo(4,3-a)quinoxalin-1-ona

ONOO- - Peroxinitrito

PA – Pressão arterial

pCE50 – log da CE50 em M

PGF2 – Prostaglandina

PGI2 –Prostaciclina

Phe – Fenilefrina

PIP2 – Fosfolipídeos fosfatidilinositolbifosfato

PKA – Proteína quinase dependente de AMPc

PKC – Proteína quinase C

PKG – Proteína quinase dependente de GMPc

PLC – Fosfolipase C

ROS – Espécies reativas de oxigênio

RNS – Espécies reativas de nitrogênio

RS – Retículo sarcoplasmático

SOD – Superóxido dismutase

TXA2 – Tromboxano A2

VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 15

1.1. Doenças cardiovasculares 15

1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos

sanguíneos 16

1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais 18

1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais 18

1.2.2.1. NO 19

1.2.2.2. PGI2 21

1.2.2.3. EDHF 22

1.3. Disfunção endotelial 22

1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos

vegetais 24

1.5. Kielmeyera membranacea 26

2. JUSTIFICATIVA 30

3. OBJETIVOS 31

3.1. Objetivos gerais 31

3.2. Objetivos específicos 31

4. MATERIAIS E MÉTODOS 32

4.1. Material vegetal 32

4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações 32

4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão

isométrica 33

4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e

subfrações 34

4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do

EKM 35

4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular 35

4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de

disfunção vascular induzida por alta concentração de

glicose 36

4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de

disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 36

4.9. Análise estatística 36

5. RESULTADOS 37

5.1. Efeito vasodilatador do EKM 37

5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à

acetilcolina 41


acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas

por glicose 43



por estresse oxidativo 45

5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso

vascular 47

6. DISCUSSÃO 52

6.1. Efeito vasodilatador do EKM 52


acetilcolina 54



por glicose 55



por estresse oxidativo 56

6.5. Efeitos das frações do EKM no músculo liso vascular 56

7. CONCLUSÕES 60

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61

9. ANEXO 73

15

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doenças cardiovasculares

As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são responsáveis por

milhões de óbitos em todo o mundo, sendo as doenças cardiovasculares (DCVs) a

principal causa de morte. A cada ano, cerca de 17,5 milhões de pessoas morrem em

decorrência de DCVs, representando aproximadamente 31% de todas as causas de

morte no mundo. Deste total, mais de 75% foi registrado em países

subdesenvolvidos ou em desenvolvimento (GUIMARÃES et al., 2015). No Brasil, no

ano de 2011, foram registrados 335.213 mil óbitos, sendo 37.019 mil óbitos no

Estado do Rio de Janeiro (DATASUS, 2016; GUIMARÃES et al., 2015). Estima-se

que em 2030 o número de óbitos no mundo devido as DCVs será de 23,6 milhões,

representando assim um grave problema de saúde pública (GUIMARÃES et al.,

2015; WHO, 2016).

As DCVs são caracterizadas por desordens do coração e dos vasos

sanguíneos, como por exemplo, distúrbios coronarianos, doença cerebrovascular,

doença arterial periférica, doença cardíaca reumática, doença cardíaca congênita e

insuficiência cardíaca. Quatro em cada cinco mortes por DCVs estão associadas ao

infarto agudo do miocárdio ou acidente vascular cerebral, sendo o acúmulo de

gordura depositado nas paredes internas dos vasos sanguíneos a causa mais

comum para essas desordens (WHO, 2016).

Similarmente a qualquer doença, há fatores de risco que levam ao

desenvolvimento das DVCs, os quais podem ser divididos em fatores

comportamentais e fatores não comportamentais. Entre os fatores comportamentais

citam-se hábitos alimentares inadequados, sedentarismo, tabagismo e uso

constante e abusivo de bebidas alcoólicas. Os fatores de risco não comportamentais

englobam a hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus (DM),

dislipidemia, estresse e obesidade (BRASIL, 2016; STAPLETON et al., 2008; WHO,

2016).

A HAS, além de ser um dos principais fatores de risco para o

desenvolvimento de DCVs, está entre as DCNT mais comuns atualmente. É

caracterizada pela pressão arterial sistêmica cronicamente elevada e sustentada,

estando frequentemente associada a alterações funcionais e estruturais do coração,

16

encéfalo, rins e vasos sanguíneos (GILES et al., 2012; WEISS et al., 2016). Esta

enfermidade é classificada como uma doença multifatorial decorrente da ação

combinada de fatores ambientais, genéticos e comportamentais e é responsável por

aproximadamente 9,4 milhões de mortes por ano no mundo. Estima-se que em

2025, 1,56 bilhões de pessoas no mundo apresentem HAS (BOLÍVAR, 2013).

A obesidade, condição que poderá afetar mais de 1,3 bilhões de indivíduos no

mundo em 2030, está relacionada a desordens metabólicas, como por exemplo,

intolerância à glicose, resistência à insulina e dislipidemia. Além disso, pode afetar a

estrutura e a função cardiovascular, sendo então um fator de risco importante para o

desenvolvimento de DCVs (CHENG et al., 2015). Acredita-se que o desbalanço na

produção e liberação de substâncias anti- e pró-inflamatórias pelos adipócitos possa

ser a ligação entre obesidade, resistência à insulina e DCVs (LACHINE et al., 2016).

Adicionalmente, a obesidade e o sobrepeso são encontrados em outras situações

clínicas, como no caso de pacientes com DM tipo 2 (DM2) (OKOP et al., 2016;

CHENG et al., 2015).

As DCVs são a principal causa de morte em pacientes com DM tipo1 (DM1) e

DM2 (ABDULLAH, 2016). Dados da literatura sugerem que mulheres com DM1

apresentam risco pelo menos quatro vezes maior que mulheres não diabéticas de

desenvolverem DCVs, assim como indivíduos com DM2 têm um risco aumentado

em seis vezes de apresentarem doenças macrovasculares quando comparados a

pessoas não diabéticas (BROWN et al., 2016; LACHINE et al., 2016). A

aterosclerose é considerada o principal mecanismo no desenvolvimento de

complicações macrovasculares em diabéticos, sugerindo que um estado inflamatório

crônico possa desempenhar papel vital no seu desenvolvimento (ABDULLAH, 2016;

LACHINE et al., 2016).

1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos sanguíneos

Em temos histológicos, a parede vascular das artérias e veias é constituída

por três túnicas distintas: a túnica adventícia, a túnica média e a túnica íntima.

A túnica adventícia é a mais externa da parede vascular e em artérias de

grande calibre é possível encontrar vasos sanguíneos denominados vasa vasorum

que fornecem nutrientes e oxigênio para a camada média. Esta, a mais espessa, é

17

composta basicamente por células musculares lisas e elastina, e é responsável pela

constrição e dilatação dos vasos (ORALLO, 1996).

A contração da musculatura lisa vascular ocorre devido ao aumento da

concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i). A formação do complexo

Ca2+/calmodulina resulta na ativação da quinase da cadeia leve de miosina (MLCK)

e consequente fosforilação da cadeia leve de miosina. Isto permite a interação com

os filamentos de actina e a contração do músculo liso vascular. Já a redução da

[Ca2+]i e a desfosforilação da cadeia leve de miosina pela miosina fosfatase resulta

em relaxamento vascular (BROZOVICH et al., 2016).

Há dois mecanismos principais que podem iniciar a contração do músculo

liso: a despolarização do potencial de repouso da membrana (acoplamento

eletromecânico) e a ativação de receptores de membrana por agonistas

(acoplamento fármaco-mecânico) (ORALLO, 1996).

O componente elétrico de excitação das células musculares lisas é

representado por potenciais de ação, onde o aumento da [Ca2+]i ocorre através da

sua entrada do espaço extracelular ou pela liberação das reservas intracelulares

provenientes do retículo sarcoplasmático (RS). A ativação dos canais de Ca2+

dependentes de voltagem do tipo L é a principal fonte do influxo de Ca2+ nas células

da musculatura lisa (BROZOVICH et al., 2016).

O acoplamento fármaco-mecânico resulta da ação de agonistas em

receptores específicos, cujos efeitos são mediados por diferentes quinases. As vias

RhoA e Rhoquinase (ROCK) são as mais importantes moduladoras da sensibilidade

ao Ca2+ na musculatura lisa e, diversos agonistas vasoconstritores agem através

dessas vias. Outra proteína quinase que também medeia o aumento da

sensibilidade ao Ca2+ é a proteína quinase C (PKC). A ativação dos receptores de

membrana acoplados a proteína Gq, como os receptores adrenérgicos α1, promove

ativação da fosfolipase C (PLC), resultando na hidrólise do fosfatidilinositolbifosfato

(PIP2) à diacilglicerol (DAG) e inositol1,4,5- trifosfato (IP3). O DAG ativa a proteína

quinase C (PKC), enquanto o IP3 provoca a liberação de Ca2+ do RS, levando a

contração da musculatura lisa (OGUT e BROZOVICH, 2003; ORALLO, 1996).

Por fim, a camada íntima está diretamente em contato com o sangue e é

composta por uma única camada de células endoteliais (GUYTON e HALL, 2011). O

endotélio constitui uma barreira física entre o sangue e os tecidos, além de regular o

fluxo de moléculas. Além disso, as células endoteliais metabolizam, sintetizam e

18

liberam uma variedade de substâncias que regulam o tônus vascular, a pressão

arterial e o fluxo sanguíneo local, substâncias que participam da coagulação,

fibrinólise e de reações inflamatórias e imunológicas, espécies reativas de oxigênio

(ROS) e de nitrogênio (RNS) envolvidas na oxidação e nitrosilação de proteínas e

lipídios, e fatores de crescimento que promovem o crescimento celular (SU, 2015).

1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais

As principais substâncias vasoconstritoras produzidas e liberadas pelo

endotélio vascular são derivados do ácido araquidônico, endotelina (ET-1) e

angiotensina II (DIAS et al., 2009).

A prostaglandina F2 (PGF2) e o tromboxano A2 (TXA2) destacam-se como

substâncias vasoconstritoras derivadas do ácido araquidônico (COELHO et al.,

2003). A ET-1 pode agir sobre os receptores acoplados à proteína G presentes na

musculatura lisa (receptor A de endotelina) ou nas células endoteliais (receptor B de

endotelina). A ativação dos receptores A causa uma potente contração da

musculatura lisa, enquanto a ativação dos receptores B provoca vasodilatação

(SAKURAI et al., 1992). A ação vasoconstritora da angiotensina II ocorre através da

ativação dos receptores AT1, localizados no músculo liso vascular. Além disso,

modula a proliferação celular através da ativação da via ERK1/2 (QIN e ZHOU,

2015).

1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais

Em 1980, Furgchogott e Zawadzki descobriram um fator derivado do endotélio

de extrema importância na regulação do tônus e manutenção da homeostasia

vascular, sendo este um potente vasodilatador identificado posteriormente como

óxido nítrico (NO). Este gás desempenha funções essenciais na regulação da

pressão arterial e na prevenção contra a aterosclerose, na inibição da adesão e

ativação de plaquetas e leucócitos e na inibição da proliferação das células

musculares lisas. Outros importantes vasodilatadores liberados pelo endotélio são a

prostaciclina (PGI2) e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (ZAGO e

ZANESCO, 2006; FURGHOGOTT e VANHOUTTE, 1989).

19

1.2.2.1. NO

O NO é estruturalmente uma das moléculas biológicas mais simples e

desempenha importantes funções no organismo por atuar nas mais diversas vias de

sinalização. O NO consiste apenas de um átomo de oxigênio ligado à um nitrogênio.

O seu caráter de ser um “radical livre” lhe confere propriedades específicas de

reatividade química e determina sua interação com inúmeros alvos in vivo

(DUDZINSK et al., 2005).

O NO é sintetizado por NO sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina.

Atualmente são conhecidas três isoformas de NOS em mamíferos: NOS neuronal

(nNOS), encontrada em sua maioria em neurônios; NOS induzível (iNOS), cuja

expressão gênica é regulada por citocinas e mediadores inflamatórios; e NOS

endotelial (eNOS), presente normalmente nas células endoteliais e plaquetas. Tanto

a nNOS quanto a eNOS são definidas como NOS constitutivas e dependentes de

Ca2+ (FÖRSTERMANN e SESSA, 2012; OLIVEIRA-PAULA et al., 2015).

A ativação da eNOS envolve a ligação do complexo Ca2+/calmodulina, aliado

a presença de co-fatores como a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato em sua

forma reduzida (NADPH), O2 molecular, tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina

dinucleotídeo (FAD) e flavinamononucleotídeo (FMN). A eNOS catalisa a síntese de

NO em dois passos: o primeiro é a hidroxilação da L-arginina à Nw-hidroxi-L-arginina

(permanece em grande parte ligada à enzima), e o segundo consiste na oxidação da

Nw-hidroxi-L-arginina à L-citrulina e NO (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

No endotélio vascular, a eNOS é ativada pelo aumento da [Ca2+]i induzido por

agonistas como a acetilcolina, histamina e ATP. A ligação do complexo

Ca2+/calmodulina à eNOS facilita o fluxo de elétrons da NADPH e demais cofatores

do domínio redutase para o domínio heme oxigenase. Em contraste, a eNOS

também pode ser ativada pela fosforilação do resíduo de Ser1177, o que estimula o

fluxo de elétrons, aumentando a sensibilidade ao Ca2+ e representando um

mecanismo adicional e independente para a ativação da eNOS. O resíduo de Ser1177

nem sempre está na sua forma fosforilada nas células endoteliais, porém pode

rapidamente sofrer esta ação após o estresse de cisalhamento ou ativação de

receptores de estrogênio, de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou de

insulina. As quinases envolvidas nesse processo variam de acordo com o estímulo.

O estrogênio e o VEGF fosforilam a eNOS através da Akt; a insulina ativa a Akt e a

20

proteína quinase ativada pelo AMP (AMPK); a bradicinina ativa a quinase II

dependente de calmodulina (CaMKII); e o estresse de cisalhamento provoca a

fosforilação da eNOS via Akt e proteína quinase A (PKA). Além disso, este processo

pode ser ou não dependente da [Ca2+]i, dependendo da quinase envolvida na

fosforilação da eNOS. Por exemplo, a ativação mediada pela CaMKII é dependente

do aumento da [Ca2+]i, enquanto a ativação mediada pela Akt não é afetada pela

remoção do Ca2+ (FÖSTERMANN e SESSA, 2012; MICHEL e VANHOUTTE, 2010).

Por ser um gás solúvel e ter caráter lipofílico, o NO produzido no endotélio

vascular é difundido para a musculatura lisa e se liga à metade heme da guanilato

ciclase solúvel (GCs), ativando a produção de GMPc. Este nucleotídeo cíclico ativa a

proteína quinase G (PKG), levando a fosforilação de proteínas intracelulares,

diminuição da [Ca2+]i e vasodilatação. A ativação da PKG, assim como o NO

atuando diretamente, também pode provocar a abertura de canais de K+, resultando

em hiperpolarização da membrana plasmática, o que impede o influxo de Ca2+ a

partir dos canais de cálcio tipo L (Figura 1) (ROE e REN, 2012).

21

Figura 1: Mecanismo da vasodilatação causada pelo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). AA, ácido araquidônico; eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; cAMP, monofosfato cíclico de adenosina; AC, adenilatociclase; GCs, guanilatociclase; cGMP, monofosfato cíclico de guanosina;SR, retículo sarcoplasmático; L-Arg, L-arginina; ATP,adenosina trifosfato; GTP, guanosina trifosfato; PKA, proteína quinase A; PKG, proteína quinase G. (Modificado de VANHOUTTE, 2003.)

1.2.2.2. PGI2

A PGI2 também tem papel importante na vasodilatação dependente do

endotélio e na supressão da adesão de células sanguíneas e plaquetas, sendo,

portanto, crucial na prevenção da aterosclerose e na formação de trombos. Esta

molécula promove relaxamento vascular através da ativação de receptores IP

acoplados à proteína Gs presentes nas membranas da musculatura lisa vascular,

tendo como resposta a ativação da adenilato ciclase com consequente aumento na

concentração citosólica de adenosina 3, 5-monofosfato cíclico (AMPc), o qual ativa a

quinase dependente de AMPc (PKA) (Figura 1). Esta quinase promove a redução da

[Ca2+]i através da inibição da liberação de Ca2+ do RS, aumento da captação para o

RS, aumento da extrusão do Ca2+ e inibição da entrada a partir do meio extracelular.

A PGI2 também pode induzir a hiperpolarização da célula muscular lisa através da

ativação dos canais de K+ sensíveis a ATP (PARKINGTON, 2004).

22

1.2.2.3. EDHF

O EDHF promove relaxamento da musculatura lisa vascular através da

ativação dos canais de K+ ativados por Ca2+ de intermediária e baixa condutância

com consequente hiperpolarização da membrana celular, embora outros

mecanismos ainda não conhecidos possam estar envolvidos (FÉLÉTOU, 2009).

Agonistas como acetilcolina e bradicinina também podem estimular a liberação de

fatores envolvidos na hiperpolarização (SU, 2015). A transmissão da

hiperpolarização gerada nas células endoteliais para as células da musculatura lisa

estima-se ocorrer através das junções mioendoteliais (BRYAN et al., 2005;

FÉLÉTOU, 2009). A identidade química desses compostos ainda não está bem

definida, porém os ácidos epoxieicosatrienóicos e moléculas como monóxido de

carbono e peróxido de hidrogênio são possíveis candidatos. Ressalta-se ainda que a

vasodilatação ocasionada pelos EDHF é observada sem o aumento dos níveis dos

nucleotídeos cíclicos (VANHOUTTE, 2004).

1.3. Disfunção endotelial

Em condições fisiológicas há um equilíbrio preciso entre a produção e a

liberação dos fatores vasoconstritores e vasodilatadores derivados do endotélio, e

qualquer perturbação que possa alterar esse balanço pode levar à disfunção

endotelial, contribuindo para o desenvolvimento e progressão das DCVs (SU, 2015).

A atenuação dos efeitos vasodilatadores, como por exemplo, a redução da

biodisponibilidade de NO, aliada ao aumento da produção dos fatores contráteis

derivados do endotélio favorece a ocorrência de vasoespasmos, trombose,

penetração de macrófagos, crescimento celular e reações inflamatórias que levam à

aterosclerose (VANHOUTTE, 2004).

Clinicamente, a disfunção endotelial é caracterizada pela redução da

vasodilatação dependente do endotélio em resposta a agonistas como acetilcolina e

bradicinina, ou ao estresse de cisalhamento (GILES et al., 2012; SU, 2015). A

disfunção endotelial está presente tanto em fatores de risco para DCVs, como

hipercolesterolemia, DM e HAS (SU et al., 2015), como na doença já estabelecida

(GILES et al., 2012).

23

Alguns mecanismos são propostos para explicar a disfunção endotelial, como

a diminuição da liberação e a diminuição da sensibilidade da musculatura lisa aos

fatores relaxantes derivados do endotélio, a disfunção na via de transdução de sinal

dos fatores relaxantes endoteliais e o aumento na produção dos fatores contrateis

derivados do endotélio (CARVALHO et al., 2001). Outro mecanismo, porém, não

menos relevante, é a redução da biodisponibilidade de NO devido ao estresse

oxidativo, o qual tem papel significativo no desenvolvimento da aterosclerose, HAS e

DM (COHEN e TONG, 2010).

O estresse oxidativo é caracterizado quando o processo pró-oxidativo supera

a capacidade dos mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, com

consequente aumento na formação das ROS (GILES et al., 2012). Os principais

agentes antioxidantes enzimáticos são a superóxido dismutase (SOD), catalase e

glutationa peroxidase. Os sistemas antioxidantes não enzimáticos podem se

subdividir em endógenos (vitamina E, glutationa) e exógenos (vitamina C,

carotenoides, flavonoides) (COHEN e TONG, 2010).

Há diversas enzimas que podem potencializar a produção de ROS na parede

vascular, como a NADPH oxidase, xantina oxidase, enzimas mitocondriais da cadeia

respiratória e eNOS na sua forma desacoplada. Dessas citadas, a NADPH oxidase é

a principal fonte de ânion superóxido (O2-) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012;

RODRIGO et al., 2013).

O sistema renina-angiotensina-aldosterona é o principal ativador da NADPH

oxidase na HAS. A angiotensina II estimula a NADPH oxidase tanto pelo aumento da

expressão de subunidades dessa enzima quanto pelo aumento da produção de

ROS. O bloqueio do receptor AT1 reduz o estresse oxidativo e aumenta a

capacidade antioxidante plasmática, a qual é a capacidade dos agentes

antioxidantes (vitamina C, α-tocoferol) plasmáticos têm de evitar a geração de

radicais OH (COHEN e TONG, 2010).

Em condições de estresse oxidativo é possível observar uma exacerbação na

geração de O2- e uma depleção na geração de NO. Este processo é referido como

desacoplamento da eNOS. A eNOS em sua forma desacoplada ocorre, em geral,

pelo déficit do substrato L-arginina ou de cofatores como o BH4. A redução na

disponibilidade de BH4 ocasiona em um aumento na produção de O2- ao invés de

NO, resultando na formação do peroxinitrito (ONOO-) (GILES et al., 2012).

Adicionalmente, a S-glutationilação também leva ao desacoplamento da eNOS em

24

condições de estresse oxidativo, com prejuízo na vasodilatação dependente do

endotélio (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

O DM e a HAS levam à geração aumentada de ROS através da super

regulação da NADPH oxidase mediada pela PKC. Os produtos da NADPH oxidase e

da eNOS, O2- e NO, rapidamente formam ONOO-, o qual pode oxidar o BH4 a BH3.

O BH3 por sua vez pode gerar o BH2 e, como consequência, o desacoplamento da

eNOS contribui para o estresse oxidativo através da produção de O2- ao invés de

NO (Figura 2) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

Figura 2: Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS. Super-regulação da NADPH oxidase em diversos tipos de doença cardiovascular. PKC, proteína quinase C; SOD, superóxido dismutase; H2O2, peróxido de hidrogênio; ONOO-, peroxinitrito; BH4, tetrahidrobiopterina; BH3, trihidrobiopterina; BH2, 6,7-[8H]-H2-biopterina; NADPH, dinucleotídeo adenina nicotinamida fosfato (Modificado de FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos vegetais

Há tempos imemoriais os povos primitivos já buscavam na natureza o alívio e

a cura de doenças visando a manutenção da saúde. Com o passar dos anos, aliado

aos avanços do conhecimento científico e tecnológico, descobriu-se que os produtos

naturais representam fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,

25

sendo, as principais, as plantas, bactérias, fungos, insetos e organismos marinhos,

as principais fontes de obtenção de fármacos (BARREIRO e BOLZANI, 2009).

A maior parte dos fármacos em uso na clínica é de origem natural ou foi

desenvolvida por síntese química planejada a partir de seus derivados. De 1981 a

2010, 64% das novas substâncias químicas foram obtidas de origem natural e

apenas 34% de origem puramente sintética, indicando assim a importância dos

produtos naturais na descoberta de novos fármacos (CRAGG e NEWMAN, 2013).

Entre os produtos naturais que serviram de fonte para a descoberta de

fármacos utilizados para o tratamento das doenças do sistema cardiovascular pode-

se destacar: digoxina, isolada da espécie vegetal Digitalis purpurea e utilizada

anteriormente para o tratamento da insuficiência cardíaca; captopril, obtido do

veneno de cobra Jathropus jararaca, utilizado para o tratamento da HAS; ácido

acetilsalicílico, obtido a partir da salicina isolada da espécie vegetal Salix alba e

utilizado principalmente como antiagregante plaquetário; e reserpina, isolada da

espécie vegetal Rauwolfia serpentina e já foi usada para o tratamento da HAS

(BUTLER, 2004; JUNIOR et al., 2006).

Segundo KENNEDY e WIGHTMANN (2011) é notório que as plantas vivam

em seus microambientes particulares extremamente ricos em substâncias químicas,

favorecendo, em termos evolutivos, a seleção natural de espécies fitoquímicas, ou

seja, de metabólitos secundários ou especiais, como também são conhecidos. Ao

contrário dos metabólitos primários, responsáveis pelo crescimento e

desenvolvimento das plantas, os metabólitos secundários desempenham uma série

de funções protetoras, de defesa e podem gerenciar o relacionamento interplantas

(BARREIRO e BOLZANI, 2009; TAIZ e ZEIGER, 2002). Além dos metabólitos

secundários estarem associados a inúmeras funções biológicas diretamente

relacionadas à sobrevivência das plantas no meio ambiente, são responsáveis

também pelos efeitos terapêuticos das plantas medicinais, com grande importância

para o desenvolvimento de fármacos.

Entre os metabólitos com destaque para as ações no sistema cardiovascular

estão as substâncias fenólicas, as quais representam um grupo heterogêneo de

metabólitos secundários amplamente encontrados na dieta (CURIN e

ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005). Estudos epidemiológicos indicam que uma dieta

rica em vegetais e frutas, bem como o consumo consciente de bebidas como vinho

26

tinto e chás estão associados à redução do risco cardiovascular (KERTH et al.,

2011).

Os flavonoides são os principais constituintes desse grupo de metabólitos,

representando mais de 4 mil dos 8 mil compostos fenólicos. Eles compartilham de

um núcleo comum formado por 15 átomos de carbono dispostos em 3 anéis,

podendo ser divididos em flavanois (catequinas e epicatequinas), flavonois

(quercetina e kaempferol), antocianidinas (cianidinas), flavonas (apigenina) e

flavononas (naringerina). Nos compostos não-flavonoides, no anel aromático há um

ou mais grupos hidroxilas, incluindo os estilenos (resveratrol), ácidos fenólicos (ácido

gálico), saponinas (ginsenosídeo), cumarinas e taninos (CURIN e

ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005).

Diversos são os efeitos benéficos dos polifenois nas DCVS, como atividade

antioxidante, redução da hiperlipidemia, do tônus vascular e da aterosclerose, e

atividade anti-inflamatória (STOCLET et al., 2004). Os efeitos antioxidantes dos

polifenois podem ser resultantes de diferentes mecanismos. Essas moléculas podem

sequestrar diretamente ROS, como também podem inibir enzimas geradoras de

ROS, como xantina oxidase e NADPH oxidase (VÁZQUEZ et al., 2013).

Compostos polifenólicos do vinho tinto induzem o relaxamento vascular de

forma dependente do endotélio por distintos mecanismos, como regulação da

expressão da eNOS, regulação da atividade da eNOS pela fosforilação dessa

enzima na Ser1177, regulação da atividade e expressão da GCs (STOCLET et al.,

2004; VÁZQUEZ et al., 2013).

Os compostos polifenólicos do vinho tinto protegem contra a oxidação do LDL

em células endoteliais, promovem efeito antioxidante, antiagregante plaquetário,

tendo papel contra a aterosclerose. Além disso, polifenois encontrados na toranja

reduzem a susceptibilidade de oxidação do LDL em pacientes com doença

coronariana (OU et al., 2005; CURIN e ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005; KHALIL e

SULAIMAN, 2010; MIDDLETON et al., 2000).

1.5. Kielmeyera membranacea

A espécie selecionada para este trabalho foi a Kielmeyera membranacea,

pertencente à ordem Malpighiales, família Calophyllaceae, gênero Kielmeyera. Esta

ordem é uma das maiores e mais diversas do clado das rosídeas e inclui o grupo

27

dos clusioides, representado pelas famílias Clusiaceae, Calophyllaceae,

Bonnetiaceae, Hypericaceae e Podostemaceae (RUHFEL et al., 2011).

Os gêneros da família Calophyllaceae são de ampla distribuição sendo

frequentemente encontrados nas América Latina e Central, além da África Central e

Ásia. Já foram identificados 14 gêneros e aproximadamente 476 espécies

pertencentes a essa família no mundo. No Brasil já foram catalogados 8 gêneros –

Calophyllum L., Caraipa Aubl., Clusiella Planch & Triana, Haploclathra Benth.,

Kielmeyera Mart. & Zucc., MahureaAubl., Marila Sw. e Neotatea Maguire – e 81

espécies, sendo 59 endêmicas, inclusive a K. membranacea (MOBOT, 2014;

WURDACK - DAVIS, 2009; REFLORA, 2014).

Entre as atividades biológicas já estudadas para espécies da família

Calophyllaceae encontradas no Brasil citam-se o tratamento de lesões cutâneas

provocadas por leishmaniose (Calophyllum brasiliense) (LEMOS et al., 2012),

antibiótica (Kielmeyera variabilis) (TIUMAN et al., 2012) e anti-inflamatória

(Haploclathra paniculata) (SUFFREDINI et al., 2006). Já foram descritas atividades

protetoras contra a disfunção endotelial de espécies não encontradas no Brasil,

como Mammea neurophyllae e Calophyllum flavoramulum, pelo mecanismo de

inibição da formação dos produtos finais da glicação avançada (DANG et al., 2014;

FERCHICHI et al., 2012).

O gênero Kielmeyera é endêmico da América do Sul, sendo a maior parte das

47 espécies descritas na literatura encontradas exclusivamente no Brasil. Espécies

desse gênero são amplamente encontradas em todas as regiões do país,

principalmente na região sudeste e em diversos domínios fitogeográficos, como na

floresta Amazônica, em cerrados, caatingas e Mata Atlântica (restinga) (SADDI,

1982; REFLORA, 2014).

Na medicina popular, muitas espécies do gênero Kielmeyera são utilizadas no

tratamento de diversas doenças tropicais, como malária, esquistossomose,

leishmaniose e infecções fúngicas e bacterianas. Cita-se também que algumas

espécies desse gênero já foram estudadas quanto à sua atividade biológica,

destacando-se as espécies K. coriacea, K. variabilis, K. aureovinosa, K. neglata e K.

rugosa (ZAGOTO et al., 2006).

A espécie K. coriacea é relatada por ter um potencial efeito antidepressivo,

visto que o extrato hidroalcoólico do caule inibe a recaptação de serotonina,

noradrenalina e dopamina (OBICI et al., 2008). Estudos sugerem que a fração em

28

diclorometano do caule de K. coriacea pode ser uma importante alternativa

terapêutica no tratamento do transtorno da ansiedade e do pânico (BIESDORF et al.,

2012). O extrato etanólico e a fração ciclohexânica desta espécie obtidos a partir da

casca, também apresentaram atividades antioxidante e antifúngica contra T. rubrum

(AQUINO et al., 2013; SILVA et al., 2009). Segundo FIGUEIREDO e colaboladores

(2014), constituintes das folhas da espécie vegetal K. coriacea apresentaram

atividade antitumoral.

O fracionamento cromatográfico das frações mais potentes obtidas das folhas

da espécie K. variabilis conduziu à identificação de 3 flavonoides com atividade

antioxidante (COQUEIRO et al., 2013). Os extratos das folhas das espécies K.

aureovinosae e K. neglecta (extrato etanólico e fração em acetato de etila)

apresentaram atividade antibiótica e citotóxica, respectivamente (CARVALHO et al.,

2012; SOUZA et al., 2012), e a fração diclorometânica obtida do caule da K. rugosa

demonstrou atividade antitumoral sem substancial toxidez (OLIVEIRA et al., 2013).

MELO e colaboradores (2014) demonstraram atividades anti-hiperalgésicas e anti-

inflamatórias a partir do extrato metanólico do caule da K. rugosa.

As espécies do gênero Kielmeyera também têm sido estudadas quanto à sua

composição química, marcada caracteristicamente pela presença de xantonas e

cumarinas, além de antraquinonas, terpenos, esteroides e flavonoides glicosídicos

(COQUEIRO et al., 2016; MARTINS et al., 2015; NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL

et al., 2009).

Algumas substâncias já foram isoladas como por exemplo, 4-alquilcumarinas,

4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas, sendo estas duas últimas extraídas de

folhas de K. rugosa. A composição química das espécies do gênero Kielmeyera

também varia de acordo com o ambiente em que se localiza, onde em espécies

encontradas no cerrado a classe das xantonas predomina e, por outro lado, em

espécies de restinga predominam a 4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas

(NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL et al., 2009).

As xantonas apresentam efeitos benéficos em algumas DCVs, incluindo

isquemia, aterosclerose, HAS e trombose. Atividades antioxidante, anti-inflamatória,

antitrombótica e vasodilatadora são consideradas efeitos protetores provocados por

essas substancias contra as DCVs. Ressalta-se, em particular, que o antagonismo

dos inibidores endógenos da NOS provocado pelas xantonas pode representar a

base para a melhoria da função endotelial (DE-JIAN et al., 2004).

29

Já foram descritas também atividades farmacológicas das cumarinas, com

ações antioxidante, antiplaquetária, anti-inflamatória e hipotensiva (FARZEI et al.,

2013; SONG et al., 2014). Estudos demonstraram potente atividade inibitória da

formação de produtos finais de glicação avançada pelas 4-fenil e 4-(1-acetoxipropil)

cumarinas. Ressalta-se ainda que uma série de potentes inibidores da enzima

colesterol acetiltransferase, potentes agentes terapêuticos para o tratamento da

aterosclerose, tem em sua base a 4-fenilcumarina (OGINO et al., 2011).

A espécie vegetal K. membranacea, objeto deste estudo, é endêmica do

Brasil, sendo encontrada nos estados de Minas Gerais, Bahia, Espírito Santo e Rio

de Janeiro, sendo seu domínio fitogeográfico a Mata Atlântica, em especial a

restinga (REFLORA, 2013). Apesar de não haver descrição de uso popular ou

atividade farmacológica no sistema no cardiovascular, uma triagem do efeito

vasodilatador de extratos vegetais realizado no Laboratório Integrado de Pesquisa

do Campus UFRJ-Macaé mostrou que a K. membranacea e suas frações

apresentam potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014), despertando o interesse

para o estudo mais aprofundado de suas propriedades farmacológicas.

30

2. JUSTIFICATIVA

As DCVs são uma das principais causas de morte no Brasil e no mundo e são

caracterizadas por alterações funcionais e morfológicas (WHO, 2016). Visto todo

prejuízo que essas doenças causam, é de extrema importância a pesquisa e

descoberta de novas substâncias que possam atenuar e/ou prevenir o seu

desenvolvimento.

Os produtos naturais são uma importante fonte de descoberta de novas

substâncias com atividades biológicas e farmacológicas, inclusive com ações no

tratamento das DCVs (CRAGG e NEWMAN, 2013).

Até o presente momento não há relatos na literatura sobre o uso popular bem

como atividade biológica ou farmacológica da espécie vegetal Kielmeyera

membranacea no que diz respeito ao sistema cardiovascular. Uma triagem do efeito

vasodilatador de extratos vegetais realizada no Laboratório Integrado de Pesquisa

do Campus UFRJ-Macaé mostrou que o extrato hidroalcoólico das folhas de K.

membranacea apresenta uma potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014),

despertando assim o interesse para o aprofundamento do conhecimento de suas

propriedades farmacológicas.

31

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivos gerais: Identificar subastâncias bioativas obtidas da espécie

vegetal K. membranacea com potencial farmacológico em alterações

vasculares.

3.2. Objetivos específicos:

Investigar o efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico, frações e

subfrações das folhas de K. membranacea;

Investigar o mecanismo de ação do efeito vasodilatador do extrato bruto;

Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à

acetilcolina;


acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por alta concentração

de glicose;


acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por estresse

oxidativo.

32

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório Integrado de Pesquisa, Pólo

Universitário do Campus UFRJ-Macaé Professor Aloísio Teixeira. Todos os

protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética com Animais de

Experimentação do Campus UFRJ-Macaé, sob protocolo MAC019. Foram utilizados

ratos Wistar machos (200-280 g), os quais foram mantidos em biotério com

temperatura e umidade controladas, em um ciclo de 12h/12h claro/escuro, com água

e ração disponibilizadas sem restrição.

4.1. Material vegetal

Folhas da espécie Kielmeyera membranacea foram coletadas no PARNA de

Jurubatiba no município de Carapebus – RJ (22°16´S/41°39´W). A coleta e a

identificação botânica foram realizadas pela Profª. Drª. Tatiana Ungaretti Paleo

Konno e, uma exsicata foi depositada no Herbário do Centro de Ciências da Saúde

da UFRJ (RFA38752).

4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações

Todos os extratos, frações e subfrações utilizados nos experimentos foram

cedidos pelo Laboratório de Produtos Bioativos do Campus UFRJ-Macaé. Os

resultados farmacológicos guiaram a análise fitoquímica da K. membranacea.

Após a seleção do material, este foi seco em estufa com circulação de ar com

temperatura ajustada para 40 °C. A secagem foi considerada completa quando o

peso da amostra se tornou constante. As folhas de K. membranacea foram trituradas

em moinho de facas.

Para o processo de maceração foi utilizado 50,35 g de folhas de K.

membranacea, previamente secas e pulverizadas, utilizando-se etanol:água (7:3)

como sistema de solvente extrator, em temperatura ambiente. O extrato

hidroalcoólico foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (IKA®) sob pressão

reduzida resultando no extrato bruto. As frações do extrato bruto foram obtidas

através de partição líquido-líquido utilizando solventes com polaridade crescente:

hexano PA (Hex), diclorometano PA (CH2Cl2), acetato de etila PA (AcOEt) e butanol

33

PA (BuOH). Foram utilizados 6,19 g do EKM ressuspendido em 100 ml de metanol–

água (MeOH:H2O) 9:1. Será feito um fracionamento da fração com maior potência e

perfil vasodilatador.

Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade

vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais

promissora para o prosseguimento do estudo. Esta foi submetida à fracionamento

cromatográfico em coluna de vidro, tendo como fase estacionária 17 cm de sílica-gel

60 silanizada de fase reversa (tamanho 0,063-0,200 mm). Para o fracionamento,

uma massa de 0,888 g da Fr. BuOH foi solubilizada em água destilada e aplicada na

coluna. O gradiente de eluição utilizado foi iniciado com 100% de água destilada e

finalizado com 100% de metanol e a proporção de solventes seguiu conforme

apresentado na Tabela 1. As subfrações foram recolhidas em frascos de vidro e

reunidas por gradiente totalizando 5 subfrações.

Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica

4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão isométrica

Ratos Wistar machos foram eutanasiados para retirada da porção torácica da

aorta, a qual foi transferida imediatamente para uma cuba contendo solução de

Krebs-Henseilet (em mM: NaCl 118; KCl 4,7; KH2PO41,2; MgSO4 1,2; CaCl2 2,5;

NaHCO3 25; glicose 11; pH 7,4) para remoção do tecido conjuntivo adjacente. A

aorta então foi cortada em cilindros de aproximadamente 3 mm de comprimento, que

foram posicionados em cubas verticais de 10 mL preenchidas com a mesma solução

de Krebs-Henseilet, continuamente oxigenada com mistura carbogênica composta

(95% de O2 e 5% de CO2), à uma temperatura constante de 37 °C. Uma das

Subfração Gradiente de eluição

Volume (ml)

Rendimento (g)

1 100% H2O 200 0,353

2 70% H2O e 30% MeOH

200 0,278

3 50% H2O e 50% MeOH

400 0,1031

4 30% H2O e 70% MeOH

600 0,0713

5 100% MeOH 1000 0,0138

34

extremidades do tecido era conectada a um transdutor de tensão isométrica

(MLT0201; ADInstruments), e os sinais gerados eram digitalizados (Power Lab 4/30;

ADInstruments) e armazenados em computador para posterior análise através do

programa LabChart Pro (ADInstruments). Durante o período de estabilização da

preparação, 90 minutos, a solução nutridora era substituída nos tempos de 20, 40 e

60 minutos. Após o período de equilíbrio, a integridade do endotélio vascular era

verificada através da indução da contratura do músculo liso vascular com 10 µM de

fenilefrina, seguida da adição de 10 µM de acetilcolina. O endotélio foi considerado

íntegro quando o relaxamento em resposta à acetilcolina foi igual ou superior a 80%.

Em alguns experimentos foi realizada a remoção mecânica do endotélio utilizando-

se uma cânula, sendo confirmada pela ausência de relaxamento (ou inferior 10%)

frente à acetilcolina (Figura 3).

A

B

Figura 3: Registros representativos do teste para avaliação da integridade do endotélio. Em A, aorta com endotélio e em B, aorta sem endotélio.

4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e subfrações

O EKM e suas frações foram solubilizados em DMSO, em soluções estoques

de 10 e 50 mg/mL. Em estudo controle realizado no Laboratório Integrado de

Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM

5 min

2 g

Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM

5 min

1 g

35

Pesquisa, foi possível observar que este solvente não alterou a atividade vascular na

concentração máxima utilizada (0,65%).

Após o período de equilíbrio da preparação, a contratura do músculo liso

vascular foi induzida com 10 µM de fenilefrina e, estabelecido o platô, foram

adicionadas concentrações crescentes cumulativas do extrato, frações ou

subfrações (1 a 30 µg/mL).

4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do EKM

Para determinar o mecanismo vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis

de aorta com e sem endotélio. A investigação do mecanismo de ação do extrato

seguiu-se em anéis aórticos com endotélio através do pré-tratamento dos mesmos

por 15 minutos (antes da indução da contratura com fenilefrina) com diferentes

inibidores ou antagonistas: L-NG-Nitroarginina metil éster(L-NAME; 100 µM), inibidor

da NO sintase; 1H-[1,2,4]oxadiazol [4,3-a] quinoxalino-1-um (ODQ; 10 µM), inibidor

da GCs; wortmannin (0,3 µM), inibidor da PI3K; atropina (10 µM), antagonista não

seletivo dos receptores muscarínicos; fulvestrant (10 µM), antagonista seletivo dos

receptores de estrogênio ERα; indometacina (10 µM), inibidor da enzima

ciclooxigenase; HOE 140 (10 µM), inibidor dos receptores de bradicinina B2

(RAIMUNDO et al., 2009; PONTES et al., 2012).

4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular

Curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para

acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas em aortas com endotélio na ausência e

presença de EKM (3,5 µg/mL). A concentração do EKM utilizada foi definida por ser

um pouco maio do que a sua CI50. A curva concentração-resposta para fenilefrina

também foi realizada em anéis de aorta sem endotélio e em anéis com endotélio

pré-tratados com L-NAME (100 µM) (RATTMANN et al., 2012).

36

4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção

vascular induzida por alta concentração de glicose

Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 2 horas com solução

Krebs-Henseilet contendo 25 mM de glicose. Após este período, curvas

concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5

M) foram obtidas na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL) (DHAR et al., 2010).

4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção

vascular induzida por estresse oxidativo

Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 15 min com 10 µM de

pirogalol. Após este período, curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 –

10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas na ausência e presença de

EKM (3,5 µg/mL) (YEAH-SIANG et al., 2011).

4.9. Análise estatística

Todos os resultados foram apresentados como média ± E.P.M. Os resultados

de relaxamento vascular foram expressos como percentual de relaxamento da

contratura máxima induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram realizadas

utilizando-se o programa Prism 5.0 (GraphPad Software, USA). A concentração

inibitória média (CI50) do EKM e frações, e a concentração eficaz média (CE50) da

fenilefrina e da acetilcolina, foram calculadas através de regressão não linear. Para

múltiplas comparações foi utilizado o teste análise de variância (One-way - ANOVA)

seguido do pós teste Dunnett ou Newman-Keuls. As diferenças entre os grupos

foram consideradas estatisticamente significativas quando P< 0,05.

37

5. RESULTADOS

5.1. Efeito vasodilatador do EKM

Para a avaliação do efeito vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis de

aorta com endotélio preparados para registro de tensão isométrica. A contração do

músculo liso vascular foi induzida através da adição de 10 µM de fenilefrina e, após

a observação do platô de contração, foram adicionadas concentrações cumulativas

do EKM (Figura 4). O EKM provocou relaxamento da musculatura lisa vascular de

forma dependente da concentração, sendo de 88,3 ± 3,8 % na concentração de 30

µg/mL (P<0,05; Figura 5). A concentração necessária para reduzir a contratura

induzida por fenilefrina em 50% (CI50) foi de 3,2 ± 0,1 µg/mL.

Para avaliar a importância da participação dos fatores endoteliais no

relaxamento provocado pelo EKM, foram realizados experimentos com anéis de

aorta sem endotélio. A remoção do endotélio inibiu completamente a atividade

vasodilatadora do EKM, como mostrado na figura 5.

Figura 4: Registro típico da resposta contrátil a 10 μM de fenilefrina seguido da exposição a concentrações crescentes e cumulativas do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em um anel aorta com endotélio.

38

1 10 100

0

20

40

60

80

100

* **

Com endotélio

Sem endotélio

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

Figura 5: Efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) em anéis de aorta com (n= 12) e sem endotélio (n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

Sabendo que o efeito vasodilatador provocado pelo EKM é totalmente

dependente do endotélio e o principal fator vasodilatador produzido e liberado pelo

endotélio é o NO, foram realizados experimentos para investigar a participação da

via do NO/GMPc no seu efeito vasodilatador. O relaxamento provocado pelo EKM foi

completamente inibido após o pré-tratamento com L-NAME, inibidor da NOS, e com

ODQ, inibidor da GCs, confirmado a participação da via NO/GMPc no efeito

vasodilatador do extrato (Figura 6).

39

A B

Figura 6: Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM em aortas com endotélio na ausência (n= 12) e presença de L-NAME (A; n= 6) ou ODQ (B; n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

A fim de identificar como o EKM ativa a produção endotelial de NO, foram

utilizados antagonistas dos receptores muscarínicos e de bradicinina: atropina e

HOE140, respectivamente. Na presença de atropina não houve alteração

significativa na curva concentração-resposta do EKM (Figura 7A). Porém, ao pré-

tratar os anéis aórticos com HOE140, houve um efeito inibitório significativo da

vasodilatação provocada pelo EKM na concentração de 30 µg/mL, indicando que os

receptores de bradicinina B2 estão envolvidos no efeito do EKM (Figura 7B).

1 10 100

0

20

40

60

80

100

*

Com endotélio

+ L- NAME 100 M

**

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

1 10 100

0

20

40

60

80

100

*

Com endotélio

+ ODQ 10 M

**

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

40

A B

Figura 7: Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM, em aortas com endotélio, na ausência (n= 12) e presença de atropina (A; n= 6) ou HOE140 (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

Com o intuito de avaliar a participação da via PI3K/Akt na ativação da eNOS

foi utilizado o bloqueador wortmaninn, inibidor da PI3K, o qual inibiu completamente

o relaxamento provocado pelo EKM (Figura 8). Em seguida, foi avaliada a

participação dos receptores de estrogênio no efeito do EKM, já que estes receptores

provocam a ativação da eNOS através da via PI3K/Akt. Na presença de fulvestrant,

o relaxamento provocado pelo EKM foi significativamente reduzido (Figura 8B),

sugerindo a participação desses receptores no mecanismo de ação do EKM.

1 10 100

0

20

40

60

80

100

Com endotélio

+ HOE 140

*

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

1 10 100

0

20

40

60

80

100Com endotélio+ Atropina

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

41

A B

Figura 8: Envolvimento da via PI3K/Akt e dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM na ausência (n=12) e presença de wortmannin (A; n= 5) ou fulvestrant (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado ao controle.

5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina

Para avaliar os efeitos do EKM na reatividade vascular, foram realizadas

curvas concentração-resposta para fenilefrina e para acetilcolina em aortas com

endotélio na ausência e presença do EKM.

O pré tratamento com o EKM (3,5 µg/mL) reduziu a contração induzida pela

fenilefrina em até 58,83% na concentração de 10 µM (Figura 9A), com alteração da

pCE50 de 7,1 ± 0,1 para 6,2 ± 0,1 (P< 0,05). Como o efeito vasodiltador do extrato é

dependente do endotélio e da liberação de NO, conforme mostrado anteriormente, o

mesmo experimento foi realizado em aortas sem endotélio. Como apresentado na

figura 9B, o EKM não provocou qualquer alteração significativa da curva

concentração-resposta para fenilefrina em aortas sem endotélio (pCE50 7,5 ± 0,1 e

7,4 ± 0,1), indicando que o efeito do extrato em atenuar a vasoconstrição induzida

pela fenilefrina é dependente do endotélio. Resultados semelhantes foram obtidos

em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (Figura 9C), indicando que o EKM

reduz a contração induzida pela fenilefrina através da ativação da produção de NO

(pCE50 7,7 ± 0,2 e 7,7 ± 0,1).

1 10 100

0

20

40

60

80

100Com endotélio

+ Fulvestrant

*

EKM (g/mL)%

Rela

xa

me

nto

1 10 100

0

20

40

60

80

100

*

Com endotélio

+ Wortmannin

* *

EKM (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

42

Figura 9: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à fenilefrina. Em A e B, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com e sem endotélio, respectivamente. Em C, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (100 µM). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado a com endotélio.

B

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 Com endotélio

+ EKM 3,5 g/mL

**

*

** *

Log [Fenilefrina], M

Co

ntr

ação

(g

)

A

B

C

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 Sem endotélio

+ EKM 3,5 g/mL


Co

ntr

ação

(g

)

C

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Com endotélio + L-NAME

+ EKM 3,5 g/mL


Co

ntr

ação

(g

)

43

Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um deslocamento

para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina com alteração da

pCE50 de 7,3 ± 0,1 para 7,9 ± 0,3 (P> 0,05), sem alterar o relaxamento máximo

(Figura 10).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0

20

40

60

80

100

120 Controle

+ EKM 3,5 g/mL

*

**

Log [Acetilcolina], M

% R

ela

xam

en

to

Figura 10: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à acetilcolina. Curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

5.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na

presença de alterações vasculares induzidas por glicose

A incubação das aortas com 25 mM de glicose por 2 horas resultou em

aumento da contração máxima induzida por fenilefrina de 1,5 ± 0,1 g para 2,2 ± 0,2 g

(P< 0,05) e pCE50 de 6,6 ± 0,1 (Figura 11 A). O relaxamento máximo provocado pela

acetilcolina foi reduzido de 98,4 ± 0,4 % para 25,9 ± 4,5 % (P< 0,05), com pCE50 de

3,3 ± 0,7 (Figura 11 B).

Na presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada

e a vasodilatação em resposta à acetilcolina (10 µM) foi parcialmente restaurada

para 75,5 ± 2,9 %, com pCE50 de 6,3 ± 0,1 (P< 0,05; Figura 11 A e B).

44

A

B

Figura 11: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por glicose. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle; #P<0,05 comparado a + 25 mM glicose.

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Controle

+ 25 mM glicose

+ 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM

**

*


Co

ntr

ação

(g

)

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0

20

40

60

80

100

120

Controle+ 25 mM glicose

+ 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM

* * * ***

*

###

#


% R

ela

xam

en

to

45


presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo

O pré-tratamento com pirogalol provocou um deslocamento para esquerda da

curva concentração-resposta da fenilefrina, com aumento da contração máxima de

1,5 ± 0,1 g para 1,9 ± 0,1 g e alteração da pCE50 para 7,6 ± 0,1 (Figura 12 A). Na

presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada (Figura 12

A). O relaxamento vascular induzido pela acetilcolina foi significativamente reduzido

com o pré-tratamento com pirogalol de 98,4 ± 0,4 % para 23,6 ± 0,4 %, e alteração

da pCE50 para 3,5 ± 0,1. O pré-tratamento com EKM (3,5 µg/mL) não foi capaz de

restaurar a disfunção endotelial provocada pelo pirogalol (Figura 12 B).

46

A

B

B

Figura 12: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Controle

+ Pirogalol

*

*

**

*

*

*+ EKM 3,5 g/mL


% C

on

tração

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Controle

+ Pirogalol

+ EKM 3,5 ug/mL

* *

** *

**

* *

*

* *

*

*


% R

ela

xam

en

to

47

5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular

As frações do EKM foram testadas com a finalidade de sugerir as possíveis

classes de metabólitos secundários responsáveis pela atividade vasodilatadora do

extrato, além de direcionar as etapas posteriores de fracionamento. A partição

líquido-líquido do extrato bruto originou quatro frações (hexânica, em diclorometano,

em acetato de etila e butanólica) que foram testadas em aortas com endotélio.

A fração hexânica (Fr. Hex) não alterou significativamente o tônus vascular. A

fração em diclorometano (Fr. CH2Cl2) provocou um intenso e significativo

relaxamento de 77,7 ± 0,9 % na concentração de 100 µg/mL. De forma semelhante,

a fração em acetato de etila (Fr. AcOEt) provocou intenso relaxamento dos anéis

aórticos a partir da concentração de 10 μg/mL. Com 30 μg/mL foi observado

relaxamento de 79,1 ± 5,0 %. A fração butanólica (Fr. BuOH) também provocou

relaxamento vascular, sendo este significativo a partir da concentração de 3 μg/mL.

Na concentração de 30 μg/mL, foi observado relaxamento de até 85,2 ± 1,3 %

(Figura 13).

48

Figura 13: Efeito vasodilatador das frações hexânica (FrHex), em diclorometano (Fr

CH2Cl2), em acetato de etila (Fr AcOEt) e butanólica (Fr BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B, C e D, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5-7 experimentos. *P<0,05 comparado com controle.

A tabela 2 mostra as CI50 do extrato bruto e suas frações, onde observa-se

que as frações em diclorometano e em acetato de etila foram menos potentes que o

extrato, enquanto a fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também

mais potente que o extrato. Sendo assim, a fração butanólica foi selecionada para os

demais experimentos, com o objetivo identificar as prováveis substâncias

responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM.

1 10 100

0

20

40

60

80

100

*

*

Fr. AcOEt (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

1 10 100

0

20

40

60

80

100

** *

*

Fr. CH2Cl2 (g/mL)

% R

ela

xam

en

to

A B

C D

1 10 100

0

20

40

60

80

100

Fr hex (g/ml)

% R

ela

xam

en

to

1 10 100

0

20

40

60

80

100

* ** *

Fr BuOH (g/ml)

% R

ela

xam

en

to

49

Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) e frações

Amostra CI50 (µg/mL)

EKM 3,2 ± 0,5*

Fr. Hex -

Fr. CH2Cl2 67,3 ± 0,7*

Fr. AcOEt 11,3 ± 2,3*

Fr. BuOH 1,7 ± 0,4

*P<0,05, comparado a Fr BuOH

Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade

vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais

promissora para o prosseguimento do estudo.

O fracionamento da fração butanólica resultou na obtenção de 5 subfrações,

sendo que 3 delas foram avaliadas. As subfrações 3 e 5 não foram testadas por

dificuldades de solubilização. Na concentração de 30 µg/mL, as subfrações 1, 2 e 4

provocaram relaxamento de 85,6 ± 0,7 %, 98,2 ± 1,8 % e 36,5 ± 6,0 %,

respectivamente (Figura 14).

50

C Figura 14: Efeito vasodilatador das subfrações (Subfr.) 1, 2 e 4 da fração butanólica (Fr. BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B e C, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 2-6 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

As CI50 das subfrações foram obtidas e foi possível observar a equivalência

de potências entre a Fr BuOH e a subfração 2 (Tabela 3).

1 10 100

0

20

40

60

80

100 Subfr. 1

Fr. BuOH

g/mL

% R

ela

xa

me

nto

1 10 100

0

20

40

60

80

100 Subfr. 2

Fr. BuOH

g/mL

% R

ela

xam

en

to

1 10 100

0

20

40

60

80

100 Subfr. 4

*

*

*

Fr. BuOH

g/mL

% R

ela

xa

me

nto

A B

51

Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K.

membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas subfrações.

Amostra CI50 (µg/mL)

EKM 3,2 ± 0,5*

Fr. BuOH 1,7 ±0,4

Subfraçao 1 6,3 ± 1,7*

Subfração 2 1,9 ± 0,3

Subfração 4 -

*P<0,05, comparado a Subfração 2

A análise por métodos espectrométricos da subfração 2 da fração butanólica

resultou na obtenção e identificação de 4 constituintes majoritários, a orientina,

isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona A, todos eles pertencendo a classe dos

flavonoides (Tabela 4; Anexo 1).

Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração butanólica de K. membranacea

Subfração Constituintes Majoritários

1 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, luteolina-O-glicuronídeob, metoxi

luteolina-C-glicuronídeoc

2 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, podocarpusflavona Ab

3 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab

4 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab

5 podocarpusflavona Ab aProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms e pelo espectro ms2 do ion molecular. bProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms. cflavonoide não identificado completamente.

52

6. DISCUSSÂO

A disfunção endotelial está envolvida tanto no desenvolvimento como na

progressão das DCVs (GILES et al., 2012; SU et al., 2015). Baseado nessas

evidências, a descoberta de novos produtos bioativos que possam atenuar e/ou

prevenir as alterações vasculares relacionadas às DCVs torna-se de extrema

importância. Neste trabalho foram investigados os efeitos vasculares de produtos

bioativos obtidos da espécie K. membranacea, uma espécie endêmica no Brasil.

6.1. Efeito vasodilatador do EKM

Diversos estudos relatam a atividade vasodilatadora provocada por produtos

naturais, incluindo diversas espécies vegetais, podendo ser este efeito, dependente

ou não de fatores derivados do endotélio vascular.

O efeito vasodilatador provocado pelo EKM é dependente da liberação dos

fatores vasodilatadores endoteliais, tendo em vista que a resposta vasodilatadora foi

observada em anéis de aorta com endotélio e inexistente em anéis de aorta sem

endotélio. Em experimentos realizados com L-NAME e ODQ (inibidores da eNOS e

GCs, respectivamente), o efeito do EKM foi completamente inibido, indicando que a

ação vasodilatadora se deve a liberação de NO, principal fator vasodilatador liberado

pelo endotélio.

A maior parte dos produtos bioativos vegetais com atividade vasodilatadora

dependente do endotélio exerce seu efeito vasorelaxante através da via NO/GMPc

(LUNA-VÁZQUEZ et al., 2013; McNEILL e JURGENS, 2006). Assim como o EKM, a

brasilina, um homoisoflavonoide obtido da Caesalpina sappan, induz a ativação da

eNOS, sendo seu efeito inibido com o pré tratamento com L-NAME (HU et al., 2003).

PARK e colaboradores (2015) mostraram o efeito vasodilatador dependente do

endotélio provocado pelo extrato etanólico de Camellia japonica, com aumento da

concentração de GMPc em aortas intactas e redução do efeito e da concentração de

GMPc em aortas onde a eNOS foi inibida. Resultados semelhantes foram obtidos

para o extrato das folhas de Apocynum venetum (LAU et al., 2015).

O NO promove vasodilatação através da ativação da GCs, que por sua vez

aumenta os níveis de GMPc com posterior ativação da PKG, proteína responsável

pela diminuição da [Ca2+]i, além de poder também ativar os canais de K+, o que gera

53

hiperpolarização da membrana celular levando a vasodilatação (VANHOUTTE,

2001; CARVALHO et al., 2001).

A ativação da eNOS ocorre principalmente devido ao aumento da [Ca2+]i e

ligação do complexo Ca2+/calmodulina à enzima, como ocorre após a ativação de

receptores muscarínicos, de bradicinina e de histamina. No entanto, a fosforilação

da eNOS em determinados resíduos de aminoácidos também pode levar a ativação

da enzima, como devido à ativação de receptores de insulina e de estrogênio

(FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

Com o intuito de identificar os receptores envolvidos na ativação da produção

endotelial de NO, anéis de aorta com endotélios foram pré-tratados com

antagonistas de diversos receptores endoteliais. Na presença da atropina não houve

alteração significativa na curva concentração-resposta do EKM, sugerindo assim a

ausência da participação dos receptores M3 para o efeito vasodilatador do extrato.

Por outro lado, ao pré-tratar os anéis aórticos com HOE140, houve uma pequena

inibição da vasodilatação provocada pelo EKM, sugerindo um envolvimento parcial

dos receptores de bradicinina B2 no mecanismo de ação do EKM. A bradicinina é um

dos agonistas da eNOS melhores caracterizados e os receptores B2 são

amplamente distribuídos no endotélio vascular de mamíferos (DUDZINSKI et al.,

2006). Estes receptores são acoplados a proteína Gq e medeiam a ativação da

eNOS principalmente através do aumento da [Ca2+]i, porém também podem induzir a

fosforilação da eNOS no resíduo Ser1177 mediada pela CAMKII (FÖSTERMANN e

SESSA, 2012).

Na presença de wortmannin, o efeito do EKM foi completamente inibido,

indicando que a via PI3K/Akt tem um papel crucial na ativação da eNOS provocada

pelo extrato. A via PI3K/Akt é uma importante via de sinalização envolvida no

controle do tônus vascular que tem sido proposta para a ação de substâncias

oriundas de produtos naturais (LUNA-VÁSQUEZ et al., 2003; LAU et al., 2015).

Como exemplo, o efeito vasodilatador provovado pela epigalocatequina-3-galato, a

catequina mais abundante encontrada em Camellia sinensis, foi significativamente

reduzido quando utilizado o bloqueador wortmannin, sugerindo assim que esta

substância ativa a via NO/GMPc pela indução da fosforilação da eNOS (ROMANO e

LOGRANO, 2009).

Há um papel especial dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador de

substâncias fenólicas, onde a ativação desses receptores leva a produção de NO

54

através da via PI3K/Akt (TANG et al., 2015). O tratamento das células endoteliais

com concentrações nanomolares de resveratrol leva a uma rápida fosforilação do

resíduo Ser1177, aumentando a atividade enzimática da eNOS e, este efeito é

observado nas células endoteliais humanas através da ativação do receptor ERα (LI

e FÖSTERMANN, 2009). Em adição, a delfinidina, um polifenol encontrado no vinho

tinto, e a isoflavona, são também substâncias que ativam o receptor ERα e

promovem o aumento da expressão e da atividade da eNOS (CHAPOLIN et al.,

2010; RÄTHEL et al., 2009). O receptor ERα também está envolvido na atividade

vasodilatadora do EKM, uma vez que na presença de fulvestrant o efeito do extrato

foi significativamente inibido.

Desta forma, até o momento é possível dizer que o efeito vasodilatador do

EKM é mediado pela ativação de receptores B2 e de receptores ERα. No entanto,

como o wortimannin inibiu completamente o efeito do EKM, pode ser que outro

receptor que ative a via PI3K/Akt esteja envolvido na ação vascular do extrato.

6.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina

O pré-tratamento de anéis de aorta com EKM modificou a reatividade vascular

à fenilefrina e à acetilcolina. A resposta vasoconstritora foi reduzida na presença de

EKM somente em aortas com endotélio, indicando que o efeito do extrato é

dependente do endotélio. Ainda, em aortas com endotélio pré-tratadas com L-

NAME, o efeito do EKM foi inibido, indicando que a resposta vasoconstritora à

fenilefrina é reduzida devido a ativação da produção endotelial de NO induzida pelo

extrato. Estes resultados corroboram os demais experimentos que mostraram que o

efeito vasodilatador do EKM ocorre através da ativação da via NO/GMPc.

Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um discreto

deslocamento para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina, sem

alterar o relaxamento máximo. Este efeito pode ser decorrente do aumento da

produção de NO induzido pelo extrato ou também estar relacionado a um aumento

da biodisponibilidade do NO, uma vez que DUTRA e colaboradores (2012)

mostraram que o EKM apresenta atividade antioxidante utilizando-se o método de

DPPH. AMEER e colaboradores (2010) demonstraram que extratos derivados de

plantas podem provocar o deslocamento da curva concentração-resposta da

55

acetilcolina para a esquerda como resultado do aumento da meia-vida do NO devido

a redução da sua inativação.


presença de alterações vasculares induzidas por glicose

Há uma clara relação entre o DM e doenças micro e macrovasculares, sendo

o estado hiperglicêmico sustentado um fator de risco importante para a disfunção

endotelial (SHI e VANHOUTTE, 2017; ZHOU et al., 2011). A incubação dos anéis de

aorta em meio com alta concentração de glicose resultou em um aumento da

contração máxima induzida pela fenilefrina e redução do relaxamento máximo

induzido pela acetilcolina.

A literatura mostra resultados divergentes sobre os efeitos da glicose na

contração vascular induzida pela fenilefrina. Já foi mostrado que em vasos isolados

de animais com diabetes induzida por estreptozotocina a reatividade à fenilefrina

estava aumentada (TOPAL et al., 2013), em aortas incubadas por 3 h com 44 mM

de glicose foi observada redução da resposta contrátil a fenilefrina (EL-AWADY et

al., 2014), e em aortas incubadas por 6 h com 55 mM de glicose não foi observada

alteração da resposta à fenilefrina (WU et al., 2015).

De forma similar ao observado neste trabalho, já foi mostrado que a

exposição a altas concentrações de glicose leva a redução da resposta

vasodilatadora à acetilcolina devido a disfunção endotelial. Esta disfunção está

associada a alterações morfológicas dos vasos, redução dos níveis de SOD e GSH,

aumento da atividade da NADPH oxidase, peroxidação lipídica e redução da

atividade da eNOS (WU et al., 2015; EL-AWADY et al., 2014; DHAR et al., 2010).

O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou parcialmente a

reatividade à acetilcolina. Uma vez que a disfunção endotelial no DM está

relacionada ao estado de estresse oxidativo (SHI e VANHOUTTE, 2017), o efeito

restaurador do EKM pode ser devido à sua propriedade antioxidante (DUTRA et al.,

2012). Resultados semelhantes já foram observados com outros produtos naturais

como o própolis (EL-AWADY et al., 2014) e o estilbeno glicosilado polidatina, uma

das principais substâncias ativas extraídas da Polygonum cuspidatum (WU et al.,

2015).

56


presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo

A literatura mostra que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia

das DCVs e do DM e desempenha um papel importante na disfunção endotelial (SHI

e VANHOUTTE, 2017; BARADARAN et al., 2014; COHEN & TONG, 2010; HIGASHI

et al., 2009).

Foram realizados experimentos onde o dano vascular foi induzido com

pirogalol, o qual rapidamente se auto-oxida em meio aquoso contendo O2 formando

O2-. Este radical rapidamente reage com o NO para formar ONOO-, que por sua vez

causa o desacoplamento da eNOS através da oxidação do seu cofator BH4, levando

a produção de O2- ao invés de NO (QIAN et al., 2012). Na presença de pirogalol, a

resposta contrátil à fenilefrina foi aumentada e a resposta vasodilatadora à

acetilcolina foi reduzida, como mostrado em outros trabalhos (ALI & WOODMAN,

2015; QIAN et al., 2012; DHAR et al., 2010).

O pré-tratamento com EKM normalizou a reatividade à fenilefrina, o que pode

estar relacionado à atividade antioxidante do EKM, assim como à ativação da

produção de NO induzida pelo EKM. No entanto, o extrato não foi capaz de restaurar

a vasodilatação dependente do endotélio induzida pela acetilcolina, o que indica que

o EKM, provavelmente, não é capaz sequestrar o O2- produzido pela oxidação do

pirogalol.

6.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular

Os resultados obtidos com a avaliação do efeito vasodilatador das frações do

EKM mostraram que substâncias presentes principalmente nas frações butanólica e

em acetato de etila são responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM. Ainda, a

fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também mais potente que o

extrato.

Os solventes utilizados na partição líquido-líquido do EKM extraem diversas

substâncias e esta extração baseia-se na polaridade das mesmas. As substâncias

preferencialmente extraídas pelo solvente butanol são flavonoides glicosilados,

saponinas e taninos, enquanto o solvente acetato de etila extrai, preferencialmente,

57

flavonoides, taninos, xantonas, ácidos triterpênicos, saponinas e cumarinas simples

(FILHO e YUNES, 1997; SIMÕES et al., 2010).

As subfrações 1 e 2 da fração butanólica provocaram relaxamento vascular

semelhante ao obtido com o EKM e com a fração butanólica, enquanto o

relaxamento provocado pela subfração 4 foi significativamente menor e seu efeito

vasodilatador máximo não ultrapassou 50%.

A avaliação fitoquímica da subfração 2 da fração butanólica resultou na

identificação dos flavonoides orientina, isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona

A (Figura 15). Estes flavonoides também foram identificados na subfração 1.

A B

C D

Figura 15: Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarposflavona A em A, B, C e D, respectivamente.

O potencial farmacológico dos flavonoides para prevenção e tratamento das

DCVs é bastante descrito na literatura. Atividade antioxidante, ativação das vias

NO/GMPc e PGI2/AMPc, ativação dos canais de K+ e bloqueio dos canais de Ca+2

tipo L são mecanismos de ação descritos na literatura para os efeitos vasculares dos

flavonoides (AHMAD et al., 2013; VÁZQUEZ et al., 2013). Além disso, os flavonoides

são um dos únicos constituintes químicos que podem ser extraídos de hastes, folhas

58

e flores de diversas espécies de vegetais, os quais apresentam um grande espectro

de atividades biológicas, apresentando uma baixa toxidez (AN et al., 2016).

A orientina é um flavonóide C-glicosilado solúvel em água, podendo ser

extraída de diversas espécies vegetais. Entre as suas principais atividades

biológicas destacam-se as atividades antioxidante, vasodilatadora e cardioprotetora

(LAM et al., 2016). Os níveis de catalase, glutationa peroxidase e SOD estão

aumentados quando camundongos são tratados com orientina (LAM et al., 2016).

Além disso, em um estudo realizado por FU e colaboradores (2005), foi

demonstrado que a resposta vasodilatadora à orientina em aortas isoladas de

coelhos envolve a ativação da via NO/GMPc. A orientina apresenta efeito

cardioprotetor através do aumento da atividade antioxidante endógena e da redução

da agregação plaquetária induzida por ácido araquidônico em coelhos (FU et al.,

2007). Acredita-se que esses efeitos cardioprotetores da orientina estejam, em

parte, associados à via de sinalização da via PI3K/Akt (LAM et al., 2016).

A isoorientina, por sua vez, destaca-se por suas atividades antimicrobiana e

hepatoprotetora (CHELYN et al., 2014) e sua ação no sistema cardiovascular ainda

permanece pouco estudada. ALMEIDA e colaboradores (2006) demonstraram um

discreto relaxamento vascular em aortas isoladas de ratos, enquanto em aortas

isoladas de coelhos não foi observado efeito significativo (FU et al., 2005).

A isovitexina apresenta efeito antioxidante, mediado principalmente através

do aumento da concentração de glutationa e de SOD (LV et al., 2016; MÜLLER et

al., 2016). Em concentrações entre 0,1 e 30 µM, a isovitexina não provocou

relaxamento em aortas de coelhos (FU et al., 2005). A vitexina, isômero da

isovitexina, apresenta efeito vasodilatador em aortas isoladas de ratos de forma

dependente do vasoconstritor utilizado. Em anéis de aorta pré-contraídos com

fenilefrina a vitexina não apresentou atividade vasodilatadora (KIM et al., 2000),

enquanto em aortas pré-contraídas com forbol, um ativador da quinase ativadora da

proteína quinase ativada por mitógeno (MEK), a vitexina provocou relaxamento

vascular independente do endotélio (JE et al., 2014). No entanto, em aortas isoladas

de coelhos, a vitexina não apresentou efeito vasodilatador (FU et al., 2005).

Por fim, a podocarpusflavona A já foi identificada na espécie vegetal

Kielmeyera variabilis e possui atividade antioxidante (COQUEIRO et al., 2013).

Assim como na K. membranacea, essa substância pode ser encontrada na fração

59

butanólica das folhas da K. variabilis, justificando a atividade antioxidante exibida

pelo EKM.

Tendo em vista a presença apenas de amentoflavona e podocarpusflavona A

como constituintes majoritários nas subfrações 3 e 4, espera-se um efeito

vasodilatador para subfração 3 semelhante ao observado para subfração 4.

Diferente da podocarpusflavona A, que ainda não possui efeito vasodilatador

descrito na literatura, a amentoflavona apresenta atividade vasodilatadora

dependente da via NO/GMPc em aortas isoladas de ratos (KANG et al., 2004). A

subfração 5, por sua vez, possui como constituinte majoritário apenas a

podocarpusflavona A, a qual ainda precisa ser estudada.

Portanto, para determinar todos os metabólitos secundários envolvidos no

efeito vasodilatador do EKM novos estudos ainda precisam ser realizados, como a

avaliação dos efeitos vasculares das substâncias isoladas.

60

7. CONCLUSÕES

O EKM provoca intensa vasodilatação dependente do endotélio em anéis de

aorta pré-contraídos com fenilefrina;

O mecanismo de ação do EKM envolve a ativação da eNOS a partir da

ativação da via PI3K/Akt;

A ativação dos receptores endoteliais de bradicinina B2 e de estrogênio ERα

está envolvida no mecanismo de ação do EKM;

O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e reverteu parcialmente a

disfunção endotelial em aortas com disfunção vascular induzida por alta

concentração de glicose;

O EKM normalizou somente a reatividade à fenilefrina em aortas com disfunção

vascular induzida por estresse oxidativo;

A fração butanólica foi a mais potente vasodilatadora entre as frações obtidas

do EKM;

Entre os flavonoides já identificados na fração butanólica, a orientina parece

ser a principal responsável pelo efeito vasodilatador;

Novos estudos ainda são necessários para determinar os metabólitos

secundários responsáveis pelas atividades vasodilatadora e restauradora da

disfunção vascular exibidas pelo EKM.

61

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDULLAH S. A., ABDULRAHMAN A., MOHAMMAD B., JUSTIN L., LANNES M., ANGLE M., LO B., TEITELBAUM J.. Safety and outcome of high doses IV milirinone in subarachnoid hemorrhage with refractory vasospasm. Stroke, v. 47, p. 201-221, 2016. AHMAD A., KHAN R. M.A., ALKHARFY K. M. Effects of selected bioactive natural products on the vascular endothelium. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 61, p. 111-121, 2013. ALI S. F., WOODMAN O. L. Tocotrienol Rich Palm Oil Extract Is More Effective Than Pure Tocotrienols at Improving Endothelium-Dependent Relaxation in the Presence of Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2015, p. 1-10, 2015. ALMEIDA, R.R., RAIMUNDO, J.M., OLIVEIRA, R.R., KAPLAN, M.A.C., GATTASS, C.R., SUDO, R.T., ZAPATA-SUDO, G. Activity of Cecropia lyratiloba extract on contractility of cardiac and smooth muscles in Wistar rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 33, p. 109-113, 2006. AMEER, O.Z., SALMAN, I.M., SIDDIQUI, M.J.A., YAM, M.F., SRIRAMANENI, R.N., MOHAMED, A.J., SADIKUN, A., ISMAIL, Z., SHAH, A.M., ASMAWIAM, Z.. Pharmacological mechanisms underlying the vascular activities of Loranthus ferrugineus Roxb.in rat thoracic aorta. Journal of Ethnopharmacology, v. 127, p. 19–25, 2010. AQUINO F. J. T., MARTINS C. M., MORAIS S. A. L., CUNHA L. C. S., ALOISE G. R. G., CHANG R., OLIVEIRA A., MORAES T. S., CUNHA W. R., MARTINS C. H. G. Antioxidant and antimicrobial activity of Kielmeyera coriacea Mart. and Zucc. Journal of Medicinal Plants Research, v. 7, n. 37, p. 2722-2728, 2013. AVIRAM M., ROSENBLAT M. Pomegranate for your cardiovascular health. Rambam Maimonides. Medical Journal, v. 4, n. 2, 2013. BARABADAN A., NASRI H., KOPAEI M.R. Oxidative stress and hypertension: Possibility of hypertension therapy with antioxidants. Journal of Research in Medicinal Sciences, v. 19, n. 4, p. 358-367, 2014. BARREIRO E. J., BOLZANI V. S. Biodiversidade: Fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, 2009. BOLIVAR J. J. Essential hypertension: Na approach to its etiology and neurogenic pathophysiology. International Journal of hypertension, v. 213, p. 1-11, 2013. BRASIL. Doenças cardiovasculares. Disponível em:<http://brasil.gov.br>. Acesso em: 12 de abril de 2016. BROWN T. L., MAAHS D. M., BISHOP F. K., SNELL-BERGEON J. K., WADWA R. P. Influences of gender on cardiovascular disease risk factors in adolescents with

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ali%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26075031

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Woodman%20OL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26075031

62

and without type 1 diabetes. International Journal of Pediatric Endocrinology, v. 8, p. 1-8, 2016. BROZOVICH F. V., NICHOLSON C. J., DEGEN C. V., GAO Y. Z., AGGARWAL M., MORGAN K. G. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews, v. 68, p. 476-532, 2016. BRYAN R. M., YOU J., GOLDING E. M., MARRELI S. P. Endothelium-derived hyperpolarizing factor: A cousin to nitric oxide and prostacyclin. Anesthesiology, v. 102, n. 6, p. 1261-1277, 2005. BUTLER M. S. The role of natural products chemistry in drug discovery. Journal of Natural Products, v. 67, p. 2141-2153, 2004. CARVALHO A. P., MIRANDA O. P., JULIÃO L. S., OLIVEIRA G. M. A. M., GOMES M. Plant extract obtained from Kielmeyera aureovinosa which has antibiotic activity, isolated chemical compound, compositions comprising same, uses thereof and methods for preventing and treating bacterial infections. Organização Mundial da Propriedade Intelectual, n. 174622, 2012. CARVALHO M. H. C., NIGRO D., LEMOS V.S, TOSTES R. C. A., FORTES Z. B. Hipertensão arterial: o endotélio e suas múltiplas funções. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 8, n. 1, p. 76-88, 2001. CARVALHO P. F. Z., TOMAZETT P. K., SANTOS S. C., FERRI P. H., BORGES C. L., MARTINS W. S., SOARES C. M. A., PEREIRA M. Transcriptional profile of Paracoccidioides induced by oenothein B, a potential antifungal agent from the Brazilian Cerrado plant Eugenia uniflora. BMC Microbiology, v. 13, p. 1-16, 2013. CHANG H. W., LI Y. W., HSIEH C. H., LIU P. Y., LIN G. M.. Association of body mass index with all-cause mortality in patients with diabetes: A systemic review and meta-analysis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy, v. 6, n. 2, p. 109-119, 2015. CHALOPIN, M., TESSE, A., MARTÍNEZ, M.C., ROGNAN, D., ARNAL, J.F., ADRIANTSITOHAINA, R.A. Estrogen receptor alpha as a key target of red wine. PLoS ONE, v. 5, e8554, p.1-7, 2010. CHELYN J. L., OMAR M. H., MOHD N. S., RANGGASAMY R., WASIMAN M. I. I., ISMAIL Z. Analysis of flavone C-glycosides in the leaves of Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau by HPTLC and HPLC-UV/DAD. The Scientific World Journal, v. 10, p. 1-15, 2014. COELHO S. M., TAYLOR A. R., RYAN K. P., SOUSA-PINTO I., BROWN M. T., BROWNLEE C.. Spatiotemporal patterning of reactive oxygen production and Ca2+ wave propagation in Fucus rhizoid cells. Plant Cell, v. 14, p. 2369-2381, 2003.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25405231


63

COGOLLUDO A., MORENO L., VILLAMOR E. Mechanism controlling vascular tone in pulmonary arterial hypertension: Implications for vasodilator therapy. Pharmacology, v. 79, p. 65-75, 2006. COHEN R. A., TONG X. Y. Vascular oxidative stress: the common link in hypertensive and diabetic vascular disease. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 55, n. 4, p. 308-316, 2010. CONSOLINI A. E., SARUBBIO M. G. Pharmacological effects of Eugenia uniflora (Myrtaceae) aqueous crude extract on rat's heart. Journal of Ethnopharmacology, v. 81, n. 1, p. 57-63, 2002. COQUEIRO A., REGASINI L. O., SKRZEK S. C., QUEIROZ M. M., SILVA D. H., DA SILVA BOLZANI V. Free radical scavenging activity of Kielmeyera variabilis (Clusiaceae). Molecules, v. 18, n. 2, p. 2376-2385, 2013. CRAGG G. M., NEWMAN D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1830, n. 6, p. 3670-3695, 2013. CURIN Y., ANDRIANTSITOHAIANA R. Polyphenols as potential therapeutical agents against cardiovascular diseases. Pharmacological Reports, v. 57, p. 97-107, 2005. DANG B. T., GÉNY C., BLANCHARD P., ROUGER C., TONNERRE P., CHARREAU B., RAKOLOMALALA G., RANDRIAMBOAVONJY J. I., LOIRAND G., PACAUD P., LITAUDON M., RICHOMME P., SÉRAPHIN D., DERBRÉ S.. Advanced glycation inhibition and protection against endothelial dysfunction induced by coumarins and procyanidins from Mammea neurophylla. Fitoterapia Journal, v. 96, p. 65-75, 2014. DATASUS. Disponível em: <http://tabnet.datasus.gov.br>. Acesso em: 14 de abril 2016. DE-JIAN J., ZHONG D., YUAN - JIAN L. Pharmacological effects of xanthones as cardiovascular protective agents. Cardiovascular Drug Reviews, v. 22, n. 2, p. 91-102, 2004. DHAR A., DHAR I., DESAI K. M., WU L. Methylglyoxal scavengers attenuate endothelial dysfunction induced by methylglyoxal and high concentrations of glucose. British Journal of Pharmacology, v. 161, n. 8, p. 1843-1856, 2010. DIAS R. G., NEGRÃO C. E., KRIEGER M. H. Nitric oxide and the cardiovascular system: Cell activation, vascular reactivity and genetic variant. Sociedade Brasileira de Cardiologia, v. 96, n. 1, p. 68-75, 2009. DUDZINSKI D. M., IGARASHI J., GREIF D., MICHEL T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. The Annual Review of Pharmacology and Toxicology, n. 46, p. 235-276, 2005. DUDZINSKI D. M., THOMAS M. Life history of eNOS: Partners and pathways. Cardiovascular Research, v. 75, p. 247-260, 2007.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13881981

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1476-5381

64

DUTRA A. R., MELLO R. J., MONTANI J., KONNO T. U. P., MUZITANO M. F., GUIMARÃES D. O., LEAL I. C. R. Avaliação da atividade antioxidante de espécies vegetais da Restinga de Jurubatiba. Livro de Resumos, II Jornada Fluminense de Produtos Naturais, Arraial do Cabo, p. 56, 2012. FARZAEI M. H., ABBASABADI Z., ARDEKANI M. R., RAHIMI R., FARZAEI F. Parsley: a review of ethnopharmacology, phytochemistry and biological activities. Journal of Traditional Chinese Medicine, v. 33, n. 6, p. 815-826, 2013. FÉLÉTOU M. Calcium-activated potassium channels and endothelial dysfunction: therapeutic options? British Journal of Pharmacology, v. 156, n. 4, p. 545-562, 2009. FERCHICHI L., DREBRÉ S., MAHMOOD K., TOURÉ K., GUILET D., LITAUDON M., AWANG K., HADI A. H., LE RAY A. M., RICHOMME P.. Bioguided fractionation and isolation of natural inhibitors of advanced glycation end-products (AGEs) from Calophyllum flavoramulum. Phytochemistry, v. 78, p. 98-106, 2012. FIGUEIREDO C. R., MATSUO A. L., MASSAOKA M. H., GIROLA N., AZEVEDO R. A., RABAÇA A. N., FARIAS C. F., PEREIRA F. V., MATIAS N. S., SILVA L. P., RODRIGUES E. G., LAGO J. H. G., TRAVASSOS L. R., SILVA R. M. G. Antitumor activity of Kielmeyera coriacea leaf constituents in experimental melanoma, tested in vitro and in vivo in syngeneic mice. Advanved Pharmaceutical Bulletin, v. 4, p., 429-436, 2014. FIGUEROA E. O., SILVA L. C. N., MELO C. M., NEVES J. K., SILVA N. H., PEREIRA V. R, CORREIA M. T. Evaluation of antioxidant, immunomodulatory, and cytotoxic action of fractions from Eugenia uniflora L. and Eugenia malaccensis L.: correlation with polyphenol and flavanoid content. The Scientific World Journal, v. 2013, p. 1-7, 2013. FILHO V. C., YUNES R. A. Estratégias para obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceito sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, n. 2, p. 99-105, 1997. FÖRSTEMANN U., SESSA W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. European Heart Journal, v. 33, ed. 7, p. 829-837, 2012. FU X. C., WANG M. W., LI S. P., ZHANG Y., WANG H. L.. Vasodilatation produced by orientin and its mechanism study. Biological Pharmacollogycal Bullard, n. 28, v. 1, p. 37-41, 2005. FU X.C., WANG M.W., LI S.P., WANG H.L. Anti-apoptotic effect and the mechanism of orientin on ischaemic/reperfused myocardium. Journal of Asian natural products research, v. 8, p. 265 -72, 2007. FURCHGOTT R. F., VANHOUTTE P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The Faseb Journal, v. 3, p. 2007-2018, 1989.

65

GILES T. D., SANDER G. E., NOSSAMAN B. D., KADOWITZ P. J.. Impaired vasodilatation in the pathogenesisof hypertension: Focus on nitric oxide, endothelial-derived hyperpolarizing factors, and prostaglandins. The Journal of Clinical Hypertension, v. 14, n. 4, p. 198-205, 2012. GOVERS R., RABELINK T. J. Cellular regulation of endothelial nitric oxide synthase. The American Journal of Physiology- Renal Physiology, v. 280, n. 2, p. F193-206, 2001. GOMES F. S., PROCÓPIO T. F., NAPOLEÃO T. H., COELHO L. C., PAIVA P. M. Antimicrobial lectin from Schinus terebinthifolius leaf. Journal of Applied Microbiology, v. 114, n. 3, p. 672-679, 2013. GUIMARÃES R. M., ANDRADE S. S. C. de A., MACHADO E. L., BAHIA C. A., OLIVEIRA M. M., JACQUES F. V. L. Diferenças regionais na transição da mortalidade por doenças cardiovasculares no Brasil, 1980 a 2012. Pan American Journal of Public Health, v. 37, n. 2, p. 83-89, 2015. GUN A., OZER M. K., BILGIC S., KOCAMAN N., OZAN G. Effect of caffeic acid phenethyl ester on vascular damage caused by consumption of high fructose corn syrup in rats. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2016, p. 1-8, 2016. GUYTON A. C., HALL J. E. Tratado de Fisiologia Médica, 12° edição. Editora Elsevier Brasil, p. 551, 2011. HEIN T. W., XU W., XU X., KUO L. Acute and chronic hyperglycemia elicit JIP1/JNK-mediated endothelial vasodilator dysfunction of retinal arterioles. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 57, n. 10, p. 4333-4340, 2016. HIGASHI Y., NOMA K., YOSHIZUME M., KIHARA Y. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular diseases. Circulation Journal, v. 73, 411-418, 2009. ISLAM M. Z., WATANABE Y., NGUYEN H. T., YAMAZAKI E. H., OBI T., SHIRAISHI M., MIYAMOTO A. Vasomotor effects of acetylcholine, bradykinin, noradrenaline, 5-hydroxytryptamine, histamine and angiotensin II on the mouse basilar artery. The Journal of veterinary Medical Science, v. 76, n. 10, p. 1339-1345, 2014. JE H. G., HONG S. M., JE H. D., SHON U. D., CHOI Y. S., SEO S. Y., MIN Y. S., CHUNG S. J., SHIN Y. Y., LEE T. J., PARK E. S., JEONG J. H.. The inhibitory effect of vitexin on the agonist-induced regulation of vascular contractility. Pharmazie, v. 69, p. 224-228, 2014. JUNIOR C. V., BOLZANI V. S., BARREIRO E. J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006. KANG D.G., YIN M.H., OH H., LEE D.H., LEE H.S. Vasorelaxation by amentoflavone isolated from Selaginella tamariscina. Planta Medica, v. 70, n. 8, p. 718-722, 2004. KANG G., LEE Y. R., JOO H. K., PARK M. S., KIM C. S., CHOI S., JEON B. H. Trichostatin A Modulates Angiotensin II-induced Vasoconstriction and Blood

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/7703701



66

Pressure Via Inhibition of p66shc Activation. The Korean Journal of Physiology and Pharmacology, v. 19, n. 5, p. 467-472, 2015. KEDZIERSKI R. M., YANAGISAWA M. Endothelin system: the double-edged sword in health and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 41, p. 851-876, 2001. KENNEDY D. O., WIGHTMAN E. L. Herbal extracts and phytochemicals: Plant secondary metabolites and the enhancement of human brain function. American Society for Nutrition, v. 2, p. 32-50, 2011. KERTH V. B. S., SELLOUM N. E., CHATAIGNEAU T., AUGER C. Vascular protection by natural product-derived polyohenols: In vitro and in vivo evidence. Planta Medica, v. 77, p. 1161-1167, 2011. KHALIL M. I., SULAIMAN S. A. The potential role of honey and its polyphenols in preventing heart diseases: A review. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicine, v. 7, p. 315-321, 2010. KIM S. H., KANG K. H., KIM K. W., KIM N. D. Procyanidins in crataegus extract evoke endothelium-dependent vasorelaxation in rat aorta. Life Science, v. 67, p. 121-131, 2000. KOTCHEN T. A., JR A. W. C., LIANG M. Ushering hypertension into a new era of precision medicine. American Medical Association, v. 315, n. 4, p. 343-344, 2016. KUNES J., HOJNÁ S., KADLECOVÁ M., DEBESOVÁ Z., RAUCHOVÁ H., VOKURKOVÁ M., LOUKOTOVÁ J., PECHÁNOVÁ O., ZICHA J.. Altered balance of vasoactive systems in experimental hypertension: The role of relative NO deficiency. Physiological Research, v. 53, p. S23-S24, 2004. LACHINE N. A., ELNEKIEDY A.A., MEGALLAA M. H., KHALIL G. I., SADAKA M. A., ROHOMA K. H., KASSAB H. S.. Serum chemerin and high-sensitivy C reactive protein as markers of subclinical atherosclerosis in Egyptian patients with type 2 diabetes. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism, v. 7, n. 2, p. 47-56, 2016. LAM K. Y., LING A. P., KOH R. Y., WONG Y. P., SAY Y. H. A review on medicinal properties of orientin. Advances in Pharmacological Sciences, v. 10, p. 1-8, 2016. LAU Y. S., LING W. C., MURUGAN D., KWAN C. Y., MUSTAFA M. R.. Endothelium-dependent relaxation effect of Apocynum venetum leaf extract via Src/PI3K/Akt signalling pathway. Nutrients, v. 30, n. 7, p. 5239-5253, 2015. LEMOS L.M., MARTINS T. B., TANAJURA G. H., GAZONI V. F., BONALDO J., STRADA C. L., SILVA M. G., DALL´OGLIO E. L., DE SOUZA JÚNIOR P. T., MARTINS D. T. Evaluation of antiulcer activity of chromanone fraction from Calophyllum brasiliesnse Camb. Journal Ethnopharmacology, v. 141, n. 1, p. 432-439, 2012.

67

LI, H., XIA, N., FÖRSTERMANN, U. Cardiovascular effects and molecular targets of resveratrol. Nitric Oxide, v. 26, p.102-110, 2012. LIU J., WANG Y., QIU L., YU Y., WANG C. Saponins of Panax notoginseng: chemistry, cellular targets and therapeutic opportunities in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Investigational Drugs, v. 23, n. 4, p. 523-539, 2014. LUNA-VÁZQUEZ, F.J., IBARRA-ALVARADO, C., ROJAS-MOLINA, A., ROJAS-MOLINA, I., ZAVALA-SÁNCHEZ, M.A. Vasodilator compounds derived from plants and their mechanisms of action. Molecules, v. 18, p. 5814-5857, 2013. LV H., YU Z., ZHENG Y., WANG L., QIN X., CHENG G., CI X.. Isovitexin exerts anti-inflammatory and anti-oxidant activities on lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting MAPK and NF-κB and activating HO-1/Nrf2 pathways. International Journal of Biological Sciences, v. 12, n. 1, p. 72-86, 2016. MASSRY K. F. E., GHORAB A. H. E., SHAABAN H. A., SHIBAMOTO T. Chemical compositions and antioxidant/antimicrobial activities of various samples prepared from Schinus terebinthifolius leaves cultivated in Egypt. Journal of Agricultural and Food Chemstry, v. 57, n. 12, p. 5265-5270, 2009. MATLUNG H. L., BAKKER E. N., VANBAVEL E. Shear stress, reactive oxygen species and arterial structure and function.Antioxid Redox Signal, v. 11, n. 7, p. 1699-1709, 2009. McNEILL, J.R., JURGENS, T.M. A systematic review of mechanisms by which natural products of plant origin evoke vasodilatation. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, v. 84, p. 803-821, 2006. MELO M. S., BRITO R. G., SANTOS P. L., NOGUEIRA P. C., MORAES V. R., MATOS M. C., FERRO J. N., BARRETO E. O., JUNIOR L. W., BOTELHO M. A., JUNIOR L. J. Q. Involvement of cerebral nervous system areas and cytokines on antihyperalgesic and anti-inflammatory activities of Kielmeyera rugosa Choisy (Calophyllaceae) in rodents. Phytotherapy Research, v. 28, n. 12, p. 1806-1815, 2014. MIDDLETON E. JR., KANDASWAMI C., THEOHARIDES T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacological Reviews, v. 52, n. 4, p. 673-751, 2000. MICHEL T., VANHOUTTE P. M. Cellular signaling and NO production. European Journal of Physiology, v. 459, n. 6, p. 807-816, 2010. MILLER V. M., VANHOUTTE P. M. Endothelium-dependent contractions to arachidonic acid are mediated by products of cyclooxygenase. American Journal of Physiology, v. 248, n. 4, p.H432-437, 1985. MOBOT. Missouri Botanical Garden. 2014. Disponível em: < http://www.mobot.org>. Acesso em: 19/08/2016.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Michel%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20082095

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vanhoutte%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20082095

68

MOHAMMED R. S., ABOU A. H. Z., EL HAWARY S. S., SLEEM A. A., ASHOUR W. E.. Flavonoid constituents, cytotoxic and antioxidant activities of Gleditsia triacanthos L. leaves. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 21, n. 6, p. 547-553, 2014. MORAIS T. R., COSTA – SILVA T. A., TEMPONE A. G., BORBOREMA S. E., SCOTTI M. T., SOUZA R. M., ARAUJO A. C., OLIVEIRA A., MORAIS S. A., SARTORELLI P., LAGO J. H. Antiparasitic activity of natural and semi-synthetic tirucallane triterpenoids Schinus terebinthifolius (Anacardiaceae): structure/activity relationships. Molecules, v. 19, n. 5, p. 5761-5776, 2014. MÜLLER S. D., FLORENTINO D., ORTMANN C. F., MARTINS F. A., DANIELSKI L. G., MICHELS M., CONSTANTINO L. S., PETRONILHO F., REGINATTO F. H.. Anti-inflammatory and antioxidant activities of aqueous extract of Cecropia glaziovii leaves. Journal of Ethno pharmacology, v. 185, n. 7, p. 255-262, 2016. NEWMAN D. J., CRAGG G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, p. 311-335, 2012. NOGUEIRA P. C. L., ANDRADE M. S., ANDRADE L. M., MORAES V. R. S., RIBEIRO A. S., BITTRICH V., AMARAL M. C. E., FERREIRA A. G., ALCÂNTARA G. B., LEÃO K.V., ALVES P. B. Chemical constituents from Kielmeyera rugosa Choisy (Clusiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, v. 36, p. 921-924, 2009. OBICI S., OTOBONE F. J., SELA V. R. S., ISHIDA K., SILVA J. C., NAKAMURA C. V., CORTEZ D. A. G., AUDI E. A. Preliminary toxicity study of dichloromethane extract of Kielmeyera coriacea stems in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 115, p. 131-139, 2008. OGINO M., FUKUI S., NAKADA Y., TOKUNOH R., ITOKAWA S., KAKOI Y., NISHIMURA S., SANADA T., FUSE H., KUBO K., WADA T., MARUI S.. Discovery of a potent and orally available acyl-CoA: cholesterol acyltransferase inhibitor as an anti-atherosclerotic agent: (4-phenylcoumarin) acetanilide derivatives. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 59, n. 10, p. 1268-1273, 2011. OGUT O., BROZOVICH F. V. Regulation of force in vascular smooth muscle. Journal of Molecular and Celular Cardiology, v. 35, p. 347-355, 2003. OKOP K. J., MUKUMBANG F. C., MATHOLE T., LEVITT N., PUOANE T. Perceptions of body size, obesity threat and the willingnen to lose weight among black South African aduslts: A qualitative study. Public Health, v. 16, p. 1-13, 2016. OLIVEIRA A. C., BRITTO A. C., HENRIQUES R. M., CARDOSO G. M., ANJOS C. S., JESUS A. M., COSTA E. V., MORAES V. R., NOGUEIRA P. C., BEZERRA D. P. In vivo growth inhibition of sarcoma 180 by Kielmeyera rugosa Choisy (Calophyllaceae). Natural Product Reaearch, v. 27, n. 23, p. 2248-2250, 2013. OLIVEIRA-PAULA G. H., LACCINI R., TANUS-SANTOS J. E.. Inducible nitric oxide synthase as a possible target in hypertension. Currente Drug Target, v. 15, n. 2, p. 164-174, 2015.



69

ORALLO F. Regulation of cytosolic calcium levels in vascular smooth muscle. Pharmacology, v. 69, n. 3, p. 153-171, 1996. PAES, B. M. Potencial farmacológico de Kielmeyera membranacea no sistema cardiovascular: investigação da atividade vasodilatadora do extrato hidroalcoólico de folhas e frações. Trabalho de Conclusão de Curso, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2014. PAULA G. H. O., LACCHINI R., SANTOS J. E. T. Endothelial nitric oxide synthase: From biochemistry and gene structure to clinical implications of NOS3 polymorphims. Gene, v. 575, p. 584-599, 2016. PARK S. H., SHIM B. S., YOON J. S., LEE H. H., LEE H. W., YOO S. B., WI A. J., PARK W. S., KIM H. J., KIM D. W., OAK M. H.. Vascular protective effect of an ethanol extract of Camellia japonica fruit: endothelium-dependent relaxation of coronary artery and reduction of smooth muscle cell migration. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 10, p. 1-9, 2015. PARKINGTON H. C., COLEMAN H. A., TARE M. Prostacyclin and endothelium-dependent hyperpolarization. Pharmacological Research, v. 49, p. 509-514, 2004. PENSO J., CORDEIRO K. C., DA CUNHA C. R., DA SILVA CASTRO P. F., MARTINS D. R., LIÃO L. M., ROCHA M. L., DE OLIVEIRA V. Vasorelaxant activity of 7-β-O-glycosides biosynthesized from flavonoids. European Journal of Pharmacology, v. 773, p. 75-80, 2014. PICCINELLI A. C., SANTOS J. A., KONKIEWITZ E. C., OESTERREICH S. A., FORMAGIO A. S., CRODA J., ZIFF E. B., KASSUYA C. A. Antihyperalgesic and antidepressive actions of (R)-(+)-limonene, α-phellandrene, and essential oil from Schinus terebinthifolius fruits in a neuropathic pain model. Nutritional Neuroscience, v. 16, n. 5, p. 217-224, 2014. PONTES L. B., ANTUNES F., SUDO R. T., RAIMUNDO J. M., LIMA L. M., BARREIRO E. J., SUDO G. Z. Vasodilatory activity and antihypertensive profile mediated by inhibition of phosphodiesterase type 1 induced by a novel sulfonamide compound. Fund.Clin.Pharmacol. v. 26, p. 690-700, 2012. QIAN L. B., FU J. Y., CAI X., XIA M. L. Betulinic acid inhibits superoxide anion-mediated impairment of endothelium-dependent relaxation in rat aortas. Indian Journal of Pharmacology, v. 44, n. 5, p. 588-592, 2012. QIN B., ZHOU J. Src family kinases (SFK) mediate angiotensin II-induced myosin light chain phosphorylation and hypertension. Plos One, v. 10, n. 5, 2015. RAIMUNDO J. M., TRINDADE A. P., VELOZO L. S., KAPLAN M. A., SUDO R. T., ZAPATA-SUDO G. The lignan eudesmin extracted from Piper truncatum induced vascular relaxation via activation of endothelial histamine H1 receptors. European Journal of Pharmacology, v. 15, p. 150-154, 2009.

70

RÄTHEL T. R., LEIKERT J. F., VOLLMAR A. M., DIRSCH V. M.. The soy isoflavone genistein induces a late but sustained activation of the endothelial nitric oxide-synthase system in vitro. British Journal of Pharmacology, v. 144, n. 3, p. 394-399, 2005. RATTMANN Y. D., ANSELM E., KIM J. H., DAL-ROS S., AUGER C., MIGUEL O. G., SANTOS A. R. S., CHATAIGNEAU T., SCHINI-KERTH V. B.. Natural products extract of Dicksonia sellowiana induces endothelium-dependent relaxations by a redox-sensitive Src - and Akt – dependent activation of eNOS in porcine coronary arteries. Journal of Vascular Research, v. 49, p. 284-298, 2012. REFLORA. Listas de Espécies da Flora do Brasil. 2013. Disponível em: < http://floradobrasil.jbrj.gov.br>. Acesso em: 19/07/2016. RODRIGO R., LIBUY M., FELIÚ F., HASSON D. Oxidative stress-related biomarkers in essential hypertension and ischemia-reperfusion myocardial damage. Disease Markers, v. 35, ed. 6, p. 773-790, 2013. RODRIGUES P. A., MORAIS S. M., SOUZA C. M., MAGALHÃES D. V., VIERIRA I. G., ANDRADE G. M., RAO V. S., SANTOS F. A. Gastroprotective effect of Byrsonima sericea DC leaf extract against ethanol-induced gastric injury and its possible mechanisms of action. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 84, n. 1, p. 113-122, 2012. ROE N. D., REN J. Nitric oxide synthase uncoupling: A therapeutic target in cardiovascular diseases. Vascular Pharmacology, v. 57, p. 168-172, 2012. RUHFEL B. R., BITTRICH V., BOVE C. P., GUSTAFSSON M. H. G., PHILBRICK C. T., RUTISHAUSER R., XI Z., DAVIS C. C.. Phylogeny of the clusioid clade (MALPIGHIALES): Evidence from the plastid and mitochondrial genomes. American Journal of Botany, v. 98, n. 2, p. 306-325, 2011. SADDI N. A taxonomic revision of the genus Kielmeyera Mart. (Guttiferae). Tese de PhD. University of Reading, UK, p. 1-213, 1982. SAKURAI T. H. M., KASUYA Y., TAKUWA Y., NAKAUCHI H., MASAKI T., GOTO K. Level of ETB receptor mRNA is down-regulated by endothelins through decreasing the intracellular stability of mRNA molecules. Biochemestry Biophysical Research Commun, v.186, n.1, p. 342-7, 1992. SHEN K., LEUNG S. W., JI L., HUANG Y., HOU M., XU A., WANG Z., VANHOUTTE P. M.. Notoginsenoside Ft1 activates both glucocorticoid and estrogen receptors to induce endothelium-dependent, nitric oxide-mediated relaxations in rat mesenteric arteries. Biochemical Pharmacology, v. 88, n. 1, p. 66-74, 2014. SHI Y., VANHOUTTE P. M.. Reactive oxygen-derived free radicals are key to the endothelial dysfunction of diabetes. Journal of Diabetes, v. 1, n. 3, p. 151-162, 2017. SIANG L. Y., SUBRAMANIAM G., HADI A. H. A., MURUGAN D., MUSTAFA M. R.. Reactive oxygen species-induced impairment of endothelium-dependent relaxations






71

in rat aortic rings: protection by methanolic extracts of Phoebe grandis. Molecules, v. 16, p. 2990-3000, 2011. SIMÕES C.M.O., SCHENKEL E.P., GOSMANN G., MELLO J.C.P., MENTZ L.A., PETROVICK P.R. (ORGS). Farmacognosia da planta ao medicamento, 6ª Edição. Rio Grande do Sul. Editora UFRGS, v. 8, p. 35, 2010. SOBRAL I. S., SOUZA – NETA L. C., COSTA G. A. N., GUEDES M. L. S., MARTINS D., CRUZ F. G. Xantonas, triterpenos e atividade antibacteriana do extrato em diclorometano de Kielmeyera cuspidata Saddi, Clusiaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 19, n. 3, p. 686-689, 2009. SONG B., WANG Z., LIU Y., XU S., HUANG G., XIONG Y., ZHANG S., XU L., DENG X., GUAN S.. Immunosuppressive activity of daphnetin, one of coumarin derivatives, is mediated through suppression of NF-κB and NFAT signaling pathways in mouse T cells. PLoS One, v. 9, n. 5, p. 1-11, 2014. SOUZA Z. L., DE OLIVEIRA F. F., DA CONCEIÇÃO A. O., SILVA L. A., ROSSI M. H., SANTOS J. S., ANDRIOLI J. L. Biological activities of extracts from Chenopodium ambrosioides Lineu and Kielmeyera neglecta Saddi. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 11, n. 20, p. 11-20, 2012. STAPLETON P. A., JAMES M. E., GOODWILL A. G., FRISBEE J. C. Obesity and vascular dysfunction. Pathophysiology, v. 15, p. 79-89, 2008. STOCLET J. C., CHATAIGNEAU T., NDIAYE M., OAK M. H., BEDOUI J. E., CHATAIGNEAUT M., KERTH V. B. S.. Vascular protection by dietary polyphenols. Science Direct, v. 500, p. 299-313, 2004. SU J. B. Vascular endothelial dysfunction and pharmacological treatment. World Journal of Cardiology, v. 7, n. 11, p. 719-741, 2015. SUFFREDINI I. B., PACIENCIA M. L., VARELLA A. D., YOUNES R. N. Antibacterial activity of Brazilian Amazon plant extracts. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 10, n. 6, p. 400-402, 2006. TAIZ L., ZEIGER E. Plant physiology. Sinauer Associates, Inc Sunderland, ed. 3ª, v. 3, p. 283-308, 2002. TANG Y., LI S., ZHANG P., ZHU J., MENG G., XIE L., YU Y., JI Y., HAN Y.. Soy isoflavone protects myocardial ischemia/reperfusion injury through increasing endothelial nitric oxide synthase and decreasing oxidative stress in ovariectomized rats. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 10, p. 1-14, 2016. TOPAL G., KOÇ E., KARAKA Ç., ALTUG T., ERGIN B., DEMIRCE C., MELICOGLU G., MERIÇLI A. H., KUCUR M., ÖSDEMIR O., DOGAN B. S. U.. Effects of Crataegus microphylla on vascular dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Phytotherapy Research, v. 27, p. 330-337, 2013.

http://www.bjid.org.br/

http://www.bjid.org.br/

72

VANHOUTTE P. M. Endothelium-derived free radicals: for worse and for better. Journal of Clinical Investigation, v. 107, n. 1, p. 23-25, 2001. VANHOUTTE P. M., TANG E. H. C. Endothelium-dependent contractions: When a good guy turns bad. Journal of Physiology, v. 586, n. 22, p. 5295-5304, 2008. VANHOUTTE P. M. Endothelium-dependent hyperpolarizations: The history. Pharmacological Research, v. 49, p. 503-508, 2004. VÁZQUEZ F. J. L., ALVARADO C. I., MOLINA A. R., MOLINA I. R., SÁNCHEZ A. R. Vasodilator compounds derived from plants and their mechanisms of action. Molecules, v. 18, p. 5814-5857, 2013. VELAYUTHAM R., SANKARADOSS N., AHAMED K. F. Protective effect of tannins from Ficus racemosa in hypercholesterolemia and diabetes induced vascular tissue damage in rats. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 5, n. 5, p. 367-373, 2012. WEISS, A., BELOOSESKY Y., GROSSMAN A., SHLESINGER A., KOREN-MORAG N., GROSSMAN E.. The association between orthostatia hypertension and all-cause mortality in hospitalized elderly persons. Journal of Geriatric Cardiology, v. 13, p. 239-243, 2016. WHO. Cardiovascular Diseases. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/>. Acesso em: 12 de abril de 2016. WURDACK K. J., DAVIS C. C. Malphighiales phylogenetics: Gaining ground on one of the most recalcitrant clades in the angiosperm tree of life. American Journal of Botany, v. 96, n. 8, p. 1551-1570, 2009. ZAGO A. S., ZANESCO A. Óxido nítrico, doenças cardiovasculares e exercício físico. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 87, n. 6, p. E264-E270, 2006. ZAGOTO J. N., BRACHT A., PAGADIGORRIA C. L., ISHII – IWAMOTO E. L., CORTEZ D. A., YAMAMOTO N. S. Effects of the Kielmeyera coriacea extract on energy metabolism in the rat liver. Journal of Ethnopharmacology, v. 105, n. 1-2, p. 47-54, 2006.

ZHAO Y., VANHOUTTE P. M., LEUNG S. W. S. Vascular nitric oxide: Beyond eNOS. Journal of Pharmacological Sciences, v. 129, p. 83-94, 2015 ZHOU S., CHEN H. Z., WAN Y. Z., ZHANG Q. J., WEI Y. S., HUANG S., LIU J. J., LU Y. B., ZHANG Z. Q., YANG R. F., ZHANG R., CAI H., LIU D. P., LIANG C. C.. Repression of P66Shc expression by SIRT1 contributes to the prevention of hyperglycemia-induced endothelial dysfunction. Circulation Research, v. 109, n. 6, p. 639-648, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20HZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wan%20YZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20QJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wei%20YS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Huang%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lu%20YB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20ZQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20RF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cai%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20DP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liang%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21778425

73

ANEXO

Figura 1. Cromatograma da subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea

Tabela 1. Perfil de fragmentação dos flavonoides presentes na subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea. Análise por Cromatografia líquida de alta eficiência-espectroscopia de massa (CLAE-EM).

Flavonoides Tempo de

retenção (min)

Peso

Molecular

m/z

[M+H]

Luteolina 6-C-glicosídeo

(isoorientina) 5,67 448 449

Luteolina 8-C-glicosídeo

(orientina) 6,07 448 449

Apigenina 6-C-

glicosídeo (isovitexina) 7,01 432 433

Podocarpusflavona A 12,76 552 553

RT: 0,00 - 35,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time (min)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

uA

U

5,67

7,01

6,0731,37

12,760,73 8,708,81 11,310,88 30,1913,02 20,39 21,5319,2213,91 22,5318,76 23,7415,195,36 25,06 26,644,603,842,68

NL:1,30E4

UV_VIS_3 UV 3 FR2_FRBUOH

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