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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

MODELAGEM, SIMULAÇÃO E CONTROLE DE BIOPROCESSOS UMA ABORDAGEM INTRODUTÓRIA

CURITIBA, FEVEREIRO DE 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA


Número do BANPESQ/THALES: 2004014247 Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto da Cruz Meleiro – DEQ/UFPR Bolsista: Tarcila Bueno – Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

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1. RESUMO

O presente relatório apresenta os resultados finais do projeto de pesquisa em modelagem

e simulação de bioprocessos. De acordo com o cronograma proposto para este projeto de

pesquisa, as atividades realizadas até o momento consistiram da revisão bibliográfica referente à

fase inicial do projeto, estudo das principais características, formulação e seleção de modelos

matemáticos adequados para descrever o comportamento de bioprocessos e o estudo da

linguagem de programação científica FORTRAN. Além disso, foram realizadas algumas

simulações computacionais de operação industrial para avaliação da dinâmica de processos

fermentativos considerando alguns dos tipos de reatores industriais mais utilizados para este fim,

sendo também proposta uma estratégia de controle automático para o bioprocesso A-B-E

operando em regime de batelada alimentada e contínuo.

2. OBJETIVOS

O principal objetivo deste projeto é realizar um estudo sobre a modelagem matemática, a

simulação computacional e o controle automático de bioprocessos. Este trabalho serviu de base

para futuros projetos de pesquisa visando o desenvolvimento de modelos matemáticos mais

sofisticados, de técnicas de identificação de parâmetros “on-line” e “off-line” e de estratégias de

controle avançado para bioprocessos.

3. INTRODUÇÃO

A pesquisa em modelagem matemática reportada na literatura técnica especializada refere-

se basicamente às reações que ocorrem no interior da célula. Dessa forma, a modelagem

matemática de processos fermentativos pode ser definida como a tentativa de representar,

através de equações matemáticas, os balanços de massa para cada componente do biorreator

associados às complexas transformações bioquímicas que ocorrem nos processos e às

velocidades com que estas reações se processam. A formulação de um modelo matemático deve,

segundo alguns autores, possuir um comprometimento entre o grau de complexidade razoável e

solução (esforço computacional) economicamente desejável. Por sua vez, a simulação do

processo corresponde a sua análise (por exemplo, sua otimização), através do modelo

matemático proposto (BORZANI et al., 2001).

A exigência básica para se avaliar o comportamento dinâmico de um processo químico é a

disponibilidade de um modelo matemático que descreva como os estados (variáveis de interesse)

do processo variam com o tempo. Dado um conjunto de dados de entrada, um modelo pode ser

utilizado para predizer a saída (ou “resposta”) de um processo. O desenvolvimento da modelagem

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matemática dos processos fermentativos permite atingir entre outros, os seguintes objetivos:

organizar informações desconexas a respeito dos fenômenos biológicos num conjunto coerente;

pensar (e calcular) logicamente a respeito de quais componentes e interações são importantes

num sistema complexo; descobrir novas estratégias para explicar o comportamento das células

submetidas a determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente existentes no entendimento

convencionadas de determinados fenômenos e, finalmente, entender as características

qualitativamente essenciais de determinados processos (BORZANI et al., 2001).

Um dos objetivos da modelagem matemática e simulação, como ferramenta do

desenvolvimento tecnológico de processos fermentativos, é prever o comportamento dinâmico e

estacionário do processo, inclusive em condições não testadas empiricamente, possibilitando a

determinação das condições operacionais economicamente ótimas do sistema, auxiliando no

projeto e ajuste de algoritmos de controle, no qual o modelo matemático formulado passa a ser

parte integrante do mesmo (BORZANI et al., 2001).

Na formulação de modelos matemáticos que representem adequadamente os processos

fermentativos, muitas dificuldades são encontradas devido à necessidade de incorporar uma série

de características que os diferenciam dos processos químicos convencionais. Entre estas

características, podem ser citadas as seguintes: baixas concentrações e baixas velocidades de

reação, como resultado da utilização de um meio diluído; complexidade da mistura reagente e

capacidade do sistema (células microbianas) de sintetizar seu próprio catalisador; conhecimento

insuficiente de vários fenômenos limitantes da velocidade de produção e falta de sensores para

automação on line; problemas de esterilidade, segurança e eventualmente da toxicidade dos

processos fermentativos (BORZANI et al., 2001).

No controle de bioprocessos, observa-se que há diferenças no controle comparado à

indústria de sínteses químicas em muitos aspectos que afetam a sua instrumentação, tanto

negativa quanto positivamente. Um aspecto em que os bioprocessos são considerados mais

fáceis de controlar é que eles são mais estáveis, e a maioria das variáveis mais importantes tende

a sofrer alterações lentamente com o tempo na ausência de falhas nos equipamentos. Um

problema significante com os bioprocessos, entretanto, é que uma vez que a população de células

tenha morrido, o processo está perdido sem possibilidade de recuperação, e o rendimento do

produto até aquele ponto pode ser inaceitável. Isso pode significar uma perda substancial de

tempo e dinheiro. Um outro aspecto em que os bioprocessos apresentam problemas em relação à

instrumentação, é que eles devem ser absolutamente estéreis, e o ambiente estabelecido para a

produção de uma desejada linhagem celular pode também permitir o crescimento de células

indesejáveis. Desta forma, todos os sensores de medida das variáveis do bioprocesso devem ser

instalados e mantidos de modo a permitir a esterilidade do processo.

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4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Estudo e Formulação dos Modelos Matemáticos de Processos Fermentativos Inicialmente deve-se reconhecer que num processo fermentativo, estão envolvidos dois

sistemas que interagem continuamente: a fase biológica composta pela população microbiana ou

pela cultura de células animais ou vegetais e a fase ambiental ou o meio de cultura, como é

comumente conhecido e que contém substratos e produtos do processo (BORZANI et al., 2001).

Idealmente a modelagem de uma fermentação deveria predizer o resultado de milhares de

transformações químicas que ocorrem pela ação de uma população microbiana, ou de uma

cultura de células animais ou vegetais. Sem dúvida, uma descrição completa de todas as vias e

interações metabólicas pertinentes ao desenvolvimento microbiano seria extremamente complexa,

ou mesmo impossível. Felizmente, sabe-se que, ao menos na área de ciências exatas, muitos

problemas podem ser estudados usando uma medida das várias propriedades das diversas

entidades em questão. Nesse sentido é importante lembrar que o modelo ainda pode ser válido se

somente um número limitado de mecanismos governantes são considerados em detalhe. Portanto

na elaboração da modelagem de processos fermentativos, geralmente são introduzidas

simplificações de maneira a se obter modelos possíveis de serem manuseados e generalizados

(BORZANI et al., 2001).

• Classificação dos Modelos Matemáticos Utilizados em Processos Fermentativos

Modelos Fenomenológicos: baseiam-se na formulação de hipóteses e correlações

teóricas ou empíricas para explicar os fenômenos e o comportamento das variáveis do processo

observados experimentalmente. Os modelos fenomenológicos são baseados nas leis de

conservação de massa e energia, nos fenômenos de transporte e nas relações físico-químicas,

cinéticas e termodinâmicas (BORZANI et al., 2001).

Modelos Entrada e Saída (ou empíricos): estabelecem relações empíricas para

correlacionar o efeito de variações nas variáveis de entrada ou manipuláveis: (caso, por exemplo,

das concentrações iniciais em sistemas operados em batelada ou das concentrações de vazões

de alimentação dos sistemas operados em forma contínua) nos valores das variáveis de saída ou

medidas do processo (caso do perfil de concentrações possíveis de serem medidas no interior do

biorreator, ou no seu efluente ao longo do tempo), (BORZANI et al., 2001).

• Equações de Balanço

As equações de balanço do processo devem ser formuladas para cada variável de estado e

para o volume de controle do sistema em estudo. Para os processos fermentativos realizados em

biorreatores homogêneos, o volume de controle corresponde ao próprio volume útil do biorreator.

A equação geral de balanço apresenta-se como:

6

Termos de entrada:

Fluxo global através das fronteiras geométricas do sistema

Difusão através da fronteiras geométricas do sistema (importante apenas para biorreatores

heterogêneos, onde os volumes de controle são infinitesimais);

Transporte através das fronteiras entre as fases (caso do transporte de oxigênio da fase

gasosa para a fase líquida);

Geração dentro do volume de controle (geralmente crescimento celular e produção de

produtos metabólicos).

Termos de saída :

Fluxo global através das fronteiras geométricas do sistema;

Difusão através das fronteiras geométricas do sistema;

Transporte através das fronteiras entre as fases;

Consumo dentro do volume de controle (geralmente morte celular ou consumo de substratos)

• Estudo da Cinética de um Processo Simples O processo de criação de um modelo matemático de fermentação começa usualmente de

um esquema simplificado de reações derivadas do conhecimento das vias metabólicas

envolvidas. Quando se compõe o modelo matemático, taxas de reação são usualmente

aproximadas pelo uso de uma das relações derivadas da teoria das reações químicas ou

enzimáticas. A tabela abaixo resume as relações empregadas utilizadas com mais freqüência para

a descrição apropriada da dinâmica de sub-sistemas metabólicos individuais (VOLESKI e

VOTRUBA ,1992).

Tabela 1: Sumário das taxas mais freqüentes usadas para expressar uma cinética simples

no modelo de simulação de processos fermentativos.

kSr =1

nkSr =2

SKkSr+

=3

7

n

n

SKkSr+

=4

( )[ ]KSkr /exp15 −−=

( )KSkr /exp6 −=

SKkKr+

=7

nSKkKr+

=8

O esclarecimento da função e o significado físico-químico dos modelos das taxas de

reações matemáticas individuais listados na Tabela 1 são apresentados a seguir (VOLESKI e

VOTRUBA, 1992):

Taxa de reação do tipo r1: É caracterizada pela relação linear entre a taxa de fenômeno e a

concentração do substrato de reação. A reação caracterizada por este tipo de taxa de reação é

basicamente controlada por difusão. A relação linear entre as taxas de sub-processos e a

concentração de substrato não é típica para os processos biológicos porque todas as taxas de

reação catalisadas enzimaticamente são usualmente baixadas do que a taxa de difusão a qual

deste modo não se tornaria a taxa de controle dos parâmetros. Relações lineares entre a taxa de

reação e a concentração de substrato, entretanto são típicas pelo declínio de processos dentro da

célula, e pela influência de substâncias atípicas na célula.

Taxa de reação do tipo r2: É derivada da adsorção isotérmica de Freundlich e é típica para

processos controlados por adsorção física sobre superfícies sólidas ou sobre estruturas. Este

fenômeno é caracterizado em sua maioria por reações hidrolíticas. A cinética deste tipo pode ser

aplicada na modelagem de processos envolvendo a utilização de substratos sólidos como

celulose, amido, entre outros.

Taxa de reação do tipo r3: É uma das muitas fórmulas típicas utilizadas para a modelagem de

processos fermentativos porque representa a taxa de mudança de fenômenos controlados por

quimiosorção do substrato sobre o sítio ativo assim como sobre a molécula da enzima. O valor da

constante k representa a velocidade máxima com a qual o subsistema pode participar em todo o

processo.

Taxa de reação do tipo r4: É a modificação dos casos anteriores de quimiosorção onde há mais

de um sítio ativo presente em cada molécula biocatalítica. A cinética deste tipo é útil para

descrever as dinâmicas de mecanismos de reações em complexos multienzimáticos, em

8

organelas especializadas ou, assim como a revisão de Harder and Roels, quando se modela a

síntese de enzimas catabólicas, as quais são controladas pela taxa da síntese de RNAm em torna

da dependência da quimiosorção da proteína CA e da cAMP no sítio do promotor do DNA

cromossomal. O uso deste método para descrever as taxas de reação de um subprocesso,

entretanto, não é muito freqüente na modelagem prática porque a equação resultante contém

parâmetros difíceis de identificar e também porque o comportamento sigmoidal dos sub-sistemas

chave na biossíntese não é muito usual. Os cálculos da simulação dos processos subseqüentes

podem ser significativamente diminuídos quando este tipo de modelo com parâmetros de números

não integrais n são usados, porque a expressão numérica da quantificação Sn é finalizada pelo

uso dobrado de séries que expressam numericamente o exponencial e o logaritmo.

Taxa de reação do tipo r5: É um tipo um tanto incomum de taxa de reação sugerida para

descrever o processo dinâmico. Esta taxa é baseada na pura interpretação física derivada das

equações de movimento num ponto de massa cercado caracterizado pela dissipação de forças. A

força exercida pelo ponto da unidade de massa contra a resistência aos seus arredores é

expressa pela equação básica ν = κ . ν2

Substitui-se a velocidade ν definida no espaço de estado pela concentração onde:

dtdP

dtdDrv =−== (1)

e seguindo o rearranjo da equação original onde o tempo é eliminado, a equação modificada pode

ser resolvida pelas condições vinculadas a trajetória onde: ( ) ( k; rS e ,rS =>>== 000 )

)

O uso da cinética tipo r5 não é tão freqüente na composição de um modelo matemático

para simulação de processos. Isto poderia ser usado, entretanto, para a descrição de taxas de

sub-processos com consideração limites internos de reação do sistema, assim como neste caso,

por exemplo, na reação de modelagem concernente a incorporação de elementos ou fosfatos em

várias estruturas celulares ou na parede celular.

Taxa de reação do tipo r6: É derivado de uma hipótese física similar assim como o modelo

cinético acima. A substância com concentração S, entretanto, é considerada diretamente

participante na dissipação da energia cinética durante o curso da reação. A relação para

dissipação de energia cinética, entretanto, é resolvida por diferentes condições vinculadas na

trajetória metabólica ( . O uso prático desta equação é na simulação da reação de

redução de atividade (slow-down - reação de ordem zero) e, conseqüentemente, para expressar

alguma realimentação no processo. Este tipo particular de cinética, similarmente r

krS == ;0

5, não é

extensivamente usado na prática. A interpretação física pode ser, quando comparada ao modelo

de inibição derivada da cinética enzimática, um tanto quanto incerta.

9

Taxa de reação do tipo r7: Este tipo é baseado no princípio do impedimento reversível hipotético

do sítio ativo de reação por quimiosorção da substância de concentração S. Esta substância

bloqueia a atividade enzimática e causa um efeito demonstrado por inibição negativa. Modelos

deste tipo de taxa podem ser usados em modelos de simulação de processos em termos capazes

de realizar um realimentação negativa no esquema metabólico do processo.

Taxa de reação do tipo r8: É uma variação da taxa acima (r6) derivada da inibição de um grande

número de sítios ativos de reação de um processo bioquímico. Uma vantagem desta abordagem,

que usa altos valores para o expoente n, é a possibilidade da simulação de um sub-sistema

metabólico quando a concentração da substância S excede um certo valor final. Isto é feito

através de uma função do tipo sigmoidal. A identificação e os problemas computacionais

associados a este tipo de cinética são similares àqueles com a taxa tipo r4 descrita acima. Quando se constrói um modelo matemático de processos fermentativos, o uso de uma

simples relação de taxa listada na Tabela 1 pode cobrir o necessário para muitos casos

relacionados ao primeiro e segundo nível do sistema hierárquico. Freqüentemente, usa-se

combinações destas relações de taxa baseados na superposição de vários fenômenos simples

fornecidos no sub-sistema. O método da superposição depende de relações recíprocas entre os

sub-sistemas. Freqüentemente, a adição ou multiplicação do produto é usada dependendo se

existe um efeito seqüencial ou alternativo de acordo com as seguintes relações:

(2) ∑=

=n

iirr

1

(3) ∏=

=n

iirr

1

4.2 Identificação de Modelos Matemáticos

A formulação de um modelo matemático de processos fermentativos, do ponto de vista da

análise dos sistemas, é usualmente realizada em três estágios (VOLESKI e VOTRUBA, 1992):

1. Análise qualitativa da estrutura do sistema, usualmente baseada no conhecimento das vias

metabólicas e da “biogênese” do produto desejado;

2. Formulação do modelo em uma forma matemática geral. Este estágio às vezes é chamado

de síntese da estrutura do operacional do processo.

3. Identificação e determinação dos valores das constantes do modelo e/ou parâmetros que são

baseados em experimentos ou dados de outras operações de um processo real.

10

4.3 Controle operacional do processo

No controle de um bioprocesso, sensores (temperatura, pressão, pH, oxigênio dissolvido,

nível) acoplados ao biorrreator transmitem um sinal pneumático ou elétrico calibrado de acordo

com uma escala da variável para um indicador, registrador ou controlador. Estes indicadores,

registradores e controladores podem ser constituídos de unidades individuais, unidades

combinadas que realizam estas três funções para uma ou mais variáveis ou sistemas complexos

de controle distribuído com capacidade praticamente ilimitada. Como o próprio termo implica, os

indicadores simplesmente medem as variáveis ou um valor em escala definidas, os registradores

realizam uma cópia dos valores, além de indicá-los, e os controladores comparam o valor da

variável medida com o valor desejado, o set point, computam o erro, e calculam uma resposta

baseada no algoritmo do controlador. A resposta do controlador geralmente é transmitida a um

elemento controlador final: o sinal geralmente atua sobre uma válvula de controle, mas ele pode

ser uma entrada para um controlador de velocidade ou o set point de outro controlador ou ser

usado de outras formas para controlar o processo. O elemento final de controle age sobre a

variável manipulada para produzir os resultados desejados. A combinação de um sensor, um

indicador, registrador ou controlador, e um elemento final de controle (quando um controlador é

usado) constitui um loop de controle.

O algoritmo de controle mais comum na indústria de bioprocessos é o algoritmo de

controle proporcional integral (PI). O erro é fornecido ao algoritmo PI e uma saída é calculada, a

qual depende das constantes do controlador. A combinação dos dois componentes do algoritmo

de controle (proporcional e integral) é apresentada na seguinte equação:

( ) ( )

∆++= ∑

=

n

KICR KEtKEKFKF

1)(

τ

onde “F(K)” é a saída, Kc é o ganho proporcional, “E” é o erro, τi é o tempo integral e t é o

tempo. A resposta devido ao componente proporcional do algoritmo de controle é baseada no

tamanho do erro. O ganho pode ser qualquer valor em uma faixa que o controlador aceite. Se uma

saída para a válvula de controle é maior do que 1 ou menor do que 0, a válvula é completamente

aberta ou fechada (dependendo da ação). O ganho proporcional determina, portanto, o quanto o

loop de controle é sensível. O elemento integral do controlador PI calcula uma saída baseada no

tempo em que o erro está presente.

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5. MATERIAIS E MÉTODOS:

5.1 Estudo da Linguagem Fortran e de Métodos Numéricos para Resolução de Equações Diferenciais

Como este projeto é de cunho teórico-computacional, iniciou-se nesta etapa o estudo da

linguagem de programação FORTRAN, a qual inclui recursos de programação estruturada, de

operações sobre caracteres, de manipulação e de uso de arquivos, entre outros (HEHL, 1986).

Uma vez que a simulação dinâmica de um processo envolve a resolução de equações

diferenciais, um estudo inicial realizado nesta etapa mostrou que o método de Runge-Kutta de 4ª

ordem é um método numérico adequado para integrar o tipo de equações diferenciais

normalmente utilizadas para representar o comportamento dinâmico de bioprocessos. A idéia

básica deste método é aproveitar as qualidades dos métodos da série de Taylor

computacionalmente aceitáveis (RIGGIERO e LOPES, 1996).

De forma resumida, podemos dizer que os métodos de Runge-Kutta se caracterizam por

certas prioridades, tais como: são de passo igual a um, não exigem cálculo de qualquer derivada

de f(x,y), porém, é preciso calcular f(x,y) em vários pontos; após expandir f(x,y) pelo método de

Taylor para função de duas variáveis em torno de (xn, yn) e agrupar os termos semelhantes, sua

expressão coincide coma do método de série de Taylor de mesma ordem (RIGGIERO e LOPES,

1996).

5.2 Descrição dos processos

Modelagem de processos alternativos da fermentação A-B-E (Acetona, Butanol e Etanol) O processo fermentativo proposto trata da conversão fermentativa da matéria prima

(açúcares) em uma mistura de solventes orgânicos – acetona, butanol e etanol – como produtos

finais acumulados no caldo fermentativo. Este processo fermentativo anaeróbio representa uma

complexa formação de produto não associado ao crescimento através de dois intermediários

associados ao crescimento celular, o ácido butírico e o ácido acético. Além disso, ocorre a

formação de hidrogênio e dióxido de carbono durante a bioconversão catalisada por uma bactéria

estritamente anaeróbia, Clostridium acetobutylicum, a qual é dotada de um comportamento

fisiológico bastante interessante.

O modelo matemático deste processo pode auxiliar no estudo deste tipo de fermentação de

várias formas (VOLESKI e VOTRUBA, 1992):

- Direcionar o trabalho experimental através de simulações computacionais de formas

alternativas de operação do processo (usando biorreatores do tipo tanque agitado ou do tipo

tubular, operação em regime contínuo ou batelada, com células livres ou imobilizadas, etc.).

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- Fornecer a base teórica para o desenvolvimento de estratégias de controle automático e

otimização do sistema fermentativo.

Diferentes modos de operação da fermentação A-B-E foram considerados neste estudo,

desde a linha de operação da fermentação em batelada até os típicos modos de operação em

regime contínuo, considerando também as operações com retenção de microrganismos e

batelada alimentada. A modelagem fenomenológica tem a grande vantagem de que os termos

matemáticos individuais usados nas equações dos modelos têm um significado físico real na

interpretação do processo (VOLESKI e VOTRUBA, 1992).

Os experimentos originais da cultura em batelada, realizados por VOLESKI e VOTRUBA

(1992) e utilizados neste trabalho, foram realizados usando a bactéria Clostridium acetobutilicum.

A cepa produziu pouco resíduo de ácido butírico no fim da fermentação e uma boa produção dos

solventes orgânicos. A cultura sofreu um processo de seleção da cepa usando um meio

enriquecido com ácido butírico. O meio “Clostridium reforçado semi-sólido” (RCM) foi usado para

manutenção da cultura e ativação dos esporos. O meio RCM contém (em g/L): extrato de levedura

3,0; Lab-Lemco powder, 10,0; Amido solúvel, 1,0; Dextrose 5,0; Cisteína hidroclorida 0,5; NaCl

5,0; acetato de sódio, 3,0; Agar 0,5. Seguido de esterilização, pH foi de aproximadamente 6,8. Os

esporos foram armazenados em tubos teste “screw-cap”de 15 cm. Cada tubo foi usado para o

início de uma fermentação. Os esporos foram aquecidos e agitados (shocked) colocando os tubos

testes na água de banho (70° a 75°C) por 20 a 25 minutos. Transferiu-se 3% do inóculo para

garrafas de soro de 100ml contendo 30ml da mesma solução RCM. Depois de 24 horas de

ativação dos esporos, 3% do inóculo foi passado para um meio de cultura em glicose líquida

contendo em (g/l): Glucose, 50; Extrato de levedura, 11; (NH4)SO4 ,9; K2HPO4, 0,8; KH2PO4, 0,8;

(MgSO4 . 7H2O), 0,3;(FeSO4.7H2O), 0,02; (MnSO4.H2O), 0,02; NaCl 0,02. Depois de 16 a 20

horas, 3% do inóculo foi usado para experimentos em cultura em batelada conduzidos em um

fermentador modificado de capacidade igual a 14 litros (Microferm), contendo 10 litros de caldo de

fermentação em pH inicial de 6,4. Antes da inoculação, o fermentador foi pulverizado com gás

nitrogênio altamente puro para asseguar a anaerobiose. Os solventes e os ácidos do caldo

fermentativo foram analisados em cromatografia gasosa (Carle gás chromatograph) (VOLESKI e

VOTRUBA, 1992).

Processo em batelada (descontínuo) de fermentação A-B-E A fermentação em batelada é a mais usada, principalmente na área alimentícia. Seu modo

de operação pode ser descrito assim: no instante inicial, a solução nutriente esterilizada no

fermentador é inoculada com microrganismos e incubada, de modo a permitir que a fermentação

ocorra sob condições ótimas (BORZANI et al., 2001).

A fermentação descontínua (batelada) pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades,

quando o substrato é adicionado de uma só vez no início da fermentação, pois este pode exercer

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efeitos de inibição, repressão ou desviar o metabolismo celular a produtos que não interessam.

Além disso, este tipo de operação apresenta “tempos mortos”, ou seja, tempos em que o

fermentador não está sendo usado para o processo fermentativo propriamente dito, tais como

tempo de carga e descarga da dorna e período correspondente a lavagem e esterilização do

fermentador. Por outro lado, a operação em batelada apresenta menores riscos de contaminação

(comparados aos processos contínuos de fermentação) e grande flexibilidade de operação

(BORZANI et al., 2001).

• Balanço de massa para o crescimento celular:

BXkXydtdX

2)1(56,0 −−=

yyBK

KSkdtdy

I

I )]1(56,0[ 1 −−+

=

• Balanço material para o substrato:

XKS

SkSXkdtdS

S+−−= 43

• Balanço material para o ácido butírico

XBAK

BAkXKB

KSkdt

dBABAI

I

+−

+= 65

• Balanço material para o ácido acético

XSK

SKAA

AAkXBK

KKS

Skdt

dAA

SAAI

I

S ++−

++= 98

• Balanço material para o butanol

dtBAd

SXkdtdB )(

841,07 −=

14

• Balanço material para a acetona

dtAAd

XKS

SkdtdA

S

)(484,010 −

+=

• Balanço material para o etanol

XKS

SkdtdE

S+= 11

O modelo matemático para o processo de fermentação em batelada apresentado neste

trabalho consiste em uma série de equações diferenciais ordinárias representando os balanços de

massa do biorreator para o substrato, a biomassa, metabólitos intermediários e produtos chave

finais. O modelo matemático foi capaz de refletir bem todas as fases da cultura em batelada. O

comportamento do processo pode ser visto na Figura 1.

0 5 10 15 20 25 30 350,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Biom

assa

(g/l)

Tempo (h)

Biomassa

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Prod

utos

inte

rmed

iário

s (g

/l)

Ácido Butírico Ácido Acético

0 5 10 15 20 25 30 350

10

20

30

40

50

60

Subs

trato

(g/l)

Tempo (h)

Substrato

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Prod

utos

(g/l)

Butanol Acetona Etanol

Figura 1 – Processo fermentativo A-B-E em reator de mistura operando em regime de batelada.

Processo em batelada alimentada A-B-E O processo em batelada alimentada é definido como uma técnica onde um ou mais

nutrientes são adicionados ao fermentador durante o cultivo e em que os produtos aí permanecem

até o final da fermentação. A vazão de alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, a

mudança de volume pode ou não ocorrer, dependendo da concentração de substrato e da taxa de

evaporação do sistema. O processo em batelada alimentada é útil para o estudo da cinética de

processos fermentativos, pois permite a manutenção de baixos níveis de substrato por longos

períodos de tempo, que é favorável a estimação de parâmetros cinéticos, também permite manter

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a concentração celular constante e controlar velocidades de crescimento em condições

transientes. Além disso, há evidências que as máximas velocidades de alguns processos podem

ser encontradas somente nestas circunstâncias (BORZANI et al., 2001).


XdtdV

VBXkXy

dtdX 1)1(56,0 2 −−−=

yyBK

KSkdtdy

I

I )]1(56,0[ 1 −−+

=


)(1043 SS

dtdV

VX

KSSkSXk

dtdS

S

−++

−−=


)(165 BA

dtdV

VX

BAKBAkX

KBKSk

dtdBA

BAI

I −+

−+

=


)(8 AADXBK

KKS

Skdt

dAAI

I

S

−++

=


BdtdV

VBA

dtdV

VdtBAd

SXkdtdB 1)].(1)(

[831,07 −+−=


AdtdV

VAA

dtdV

VdtAAd

XKS

SkdtdA

S

1].1)([5,010 −+−

+=

16


EdtdV

VX

KSSk

dtdE

S

111 −

+=

O modelo matemático foi capaz de refletir bem o comportamento do processo operando em

regime de batelada alimentada, como pode ser visto na Figura 2.

0 5 10 15 20 25 30 35 400,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Biom

assa

(g/l)

Tempo (h)

Biomassa

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Prod

utos

inte

rmed

iário

s (g

/l)

Ácido Butírico Ácido Acético

0 5 10 15 20 25 30 35 400

10

20

30

40

50

60

Subs

trato

(g/l)

Tempo (h)

Substrato

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Prod

utos

(g/l)

Butanol Acetona Etanol

Figura 2 – Processo fermentativo A-B-E em reator de mistura operando em regime de batelada

alimentada.

Processo contínuo de fermentação A-B-E

O processo de fermentação contínua caracteriza-se por possuir uma alimentação contínua

no meio de cultura a uma determinada vazão constante através da retirada contínua de caldo

fermentado. A manutenção do volume constante no reator é de primordial importância, afim de

que o sistema atinja a condição de estado estacionário, condição na qual as variáveis de estado

(concentração de células, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo

do tempo de operação do sistema (BORZANI et al., 2001).


DXBXkXydtdX

−−−= 2)1(56,0

yyBK

KKS

Skdtdy

I

I

S

)]1(56,0[ 1 −−++

=

17


)( 043 SSDKS

SkSXkdtdS

S

−++

−−=


)('5 BADXBK

KKS

Skdt

dBAIBA

IBA

S

−++

=


)(8 AADXBK

KKS

Skdt

dAAI

I

S

−++

=


DBBADdtBAD

XKS

SkdtdB

S

−+−+

= )].()(

[831,0'7


DAAADdtAAd

XKS

SkdtdA

S

−+−+

= )].()(

[5,010


DEXKS

SkdtdE

S

−+

= 11


regime contínuo, como pode ser visto na Figura 3.

18

0 20 40 60 80 100 120 1400

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13Pr

odut

os

Tempo (h)

Substrato Butanol Acetona Etanol

0 20 40 60 80 100 120 1401

2

3

4

5

6

7

8

Prod

utos

Inte

rmed

iário

s

Tempo (h)

Ácido Butírico Biomassa Ácido Acético

Figura 3 – Processo fermentativo A-B-E em reator de mistura operando em modo contínuo.

Processo contínuo com retenção de células A operação de fermentação contínua com retenção de células tem como objetivo a obtenção

da alta densidade celular no reator, aumentando-se assim consideravelmente as velocidades, e,

portanto em última análise, a produtividade do processo. O reciclo de células pode ser interno ou

externo, ao reator (BORZANI et al., 2001).


BXkXydtdX

2)1(56,0 −−=

yyBSdtdy )]1(56,0),([ −−= µ


)( 043 SSDXKS

SkSXkdtdS

S

−++

−−=


)(65 BADXBAK

BAkXKB

KSkdt

dBABAI

I −+

−+

=

19


)(98 AADXAAK

AAkXBK

KKS

Skdt

dAAAAI

I

S

−+

−++

=


DBBADdtBAD

SXkdtdB

−+−= )].()(

[831,07


DAAADdtAAd

XKS

SkdtdA

S

−+−+

= )].()(

[5,010


DEXKS

SkdtdE

S

−+

= 11


regime contínuo com retenção de células, como pode ser visto na Figura 4.

0 20 40 60 80

1

2

3

4

5

6

0

Prod

utos

Tempo (h)

Substrato Butanol Acetona Etanol

0 20 40 60 80

2

4

6

8

10

0

Prod

utos

Inte

rmed

iário

s

Tempo (h)

Ácido Butírico Biomassa Ácido Acético

Figura 4 – Processo fermentativo A-B-E em reator de mistura operando em modo contínuo com

retenção de células.

20

5.3 CONTROLE DIGITAL REALIZADO NOS REGIMES EM BATELADA ALIMENTADA E CONTÍNUO.

Foram propostas estratégias de controle operacional para regimes de operação em batelada

alimentada e contínuo. Pôde-se observar graficamente, que o microrganismo sofre uma inibição

devido ao acúmulo de ácido butírico no meio de cultura. Devido a este metabólito tóxico, propôs-

se que o controle funcionasse de forma a manter a concentração de ácido butírico constante no

meio de cultura através do aumento da taxa de diluição do caldo feito com a adição de substrato

ao meio. Quando o sensor detectar concentrações de ácido butírico maiores que 5g/l, um sinal é

enviado ao controlador, e, comparado ao set point, gera-se um erro. A resposta é proporcional ao

erro e à integral do erro. O sinal do controlador atua na válvula de alimentação fazendo com que o

meio nutriente seja adicionado (à uma vazão constante) ao caldo fermentativo e

conseqüentemente haja redução da concentração do metabólito inibidor. A simulação proposta

com o algoritmo do controlador PI, gerou os seguintes gráficos de controle.

0 5 10 15 20 25 30 35 400

1

2

3

4

5

6

Prod

utos

(g/l)

Tempo (h)

Butanol Acetona Etanol Set-point

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Prod

utos

(g/l)

Tempo (h)

Butanol Acetona Etanol Set-point

Figura 5 – Controle do processo fermentativo A-B-E em reator de mistura operando: a) em regime

de batelada alimentada com set point igual a 5g/l, e b) em regime contínuo variando o set point.

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ao longo do período de trabalho, realizaram-se as seguintes etapas:

1. Revisão bibliográfica introdutória referente à modelagem matemática de processos

biotecnológicos e estudo do processo fermentativo A-B-E;

2. Estudo da linguagem de programação FORTRAN;

21

3. Realização de simulações computacionais, utilizando o FORTRAN, do processo

fermentativo A-B-E em diferentes modos de operação (batelada, batelada alimentada,

contínuo, contínuo com retenção de células).

4. Realização do controle operacional do processo A-B-E operando em regime de batelada

alimentada.

Os principais objetivos deste trabalho foram estudar as técnicas de modelagem

matemática aplicada a processos fermentativos, implementar a simulação computacional e

controle operacional de um processo fermentativo de importância significativa para a indústria de

biotecnologia, além da avaliação de alguns métodos numéricos para a integração de equações

diferenciais.

De acordo com os resultados apresentados nos gráficos acima, pode-se perceber que os

objetivos foram alcançados plenamente, pois os resultados obtidos através da simulação

computacional foram totalmente coerentes com aqueles obtidos experimentalmente, ou seja, os

gráficos reproduzem com fidelidade o comportamento do microrganismo nas condições

apresentadas (dados obtidos na literatura – VOLESKI e VOTRUBA, 1992).

Pode-se ainda, observar através dos gráficos gerados que o controle operacional proposto

(o controlador PI atuou de forma a controlar a concentração de ácido butírico, por manipulação da

vazão de alimentação), teve seus parâmetros bem ajustados e controlou de forma estável todas

as perturbações hipotéticas geradas tanto no regime de batelada alimentada, quanto no regime

contínuo de operação.

No regime contínuo de operação observou-se que nas variações geradas por diversos set

points, o controlador agiu de maneira otimizada, gerando poucas oscilações.

Observando os gráficos de simulação do processo fermentativo, percebe-se que no decorrer

do processo, após algumas horas, quando a concentração de ácido butírico excedesse o limite

celular, o processo estaria caminhando para a morte celular e para a perda de produtividade. A

partir da avaliação da modelagem, e com a proposta de controle apresentada, foi fornecido às

células um ambiente “encorajante” ao desempenho fermentativo. Com a concentração do

composto inibidor controlado, foi possível obter o produto de interesse em uma concentração

ótima e evitar a queda de biomassa durante o processo fermentativo.

7. CONCLUSÕES

Os estudos realizados até o momento, proporcionaram o embasamento teórico fundamental

para o desenvolvimento e o aperfeiçoamento adequados nas áreas de modelagem matemática e

simulação e controle de bioprocessos. Devido ao caráter computacional do projeto, pôde-se

explorar certas habilidades na área de programação científica.

22

Utilizou-se com estudo de caso a modelagem matemática e a simulação do processo

fermentativo para a produção de acetona, butanol e etanol (A-B-E). Nesta etapa foram

investigados alguns tipos alternativos de processos de produção (produção em batelada,

produção em batelada alimentada, produção contínua, produção contínua com retenção de

células).

Os modelos matemáticos do processo foram capazes de descrever adequadamente o

comportamento do processo, reproduzindo fielmente os dados de literatura.

Verificou-se que a estratégia de controle proposta foi capaz de controlar o processos

adequadamente, tanto na operação em batelada alimentada quanto em modo contínuo.

8. REFERÊNCIAS

BORZANI, W.; AQUARONE, E.; LIMA, U.A. e SCHIMIDELL, W.; Biotecnologia Industrial; Volume 2; Editora Edgard Blucher LTDA, 2001; 522p

HEHL, M. E., Linguagem de programação estruturada FORTRAN 77, Ed Mc Graw- Hill,

São Paulo, 1986, 511p.

RUGGIERO, M.A.G. e LOPES, V.L.R.; Cálculo Numérico: Aspectos teóricos e computacionais, São Paulo: Pearson Education do Brasil, 2ª Edição,1996, 406p.

VOLESKI B. e VOTRUBA J.; ; Elsevier Science Publishers B. V.; London – New York –

Tokio; 1992; 266p.

23

APÊNDICE

Tabela 1 - Constantes cinéticas utilizadas

Constantes

Cinéticas

Batelada Contínuo Retenção de células Batelada Alimentada

K1 0,0090 (l/g.h) 0,44 (h-1) 0,38 (l/g.h) 0,0090 (l/g.h)

K2 0,0008 (l/g.h) 0,0008 0,014 (l/g.h) 0,0008 (l/g.h)

K3 0,0255 (l/g.h) 0,005 (l/g.h) 0,03 (l/g.h) 0,0255 (l/g.h)

K4 0,6764 (h-1) 1,25 (h-1) 0,85 (h-1) 0,6764 (h-1)

K5 0,0136 (l/g.h) 0,6 (l/g.h) 0,270 (l/g.h) 0,0136 (l/g.h)

K6 0,1170 (h-1) 0,0 0,050(h-1) 0,1170 (h-1)

K7 0,0113 (l/g.h) 0,367 (l/g.h) 0,090 (l/g.h) 0,0113 (l/g.h)

K8 0,7150 (h-1) 0,225 (h-1) 0,660 (h-1) 0,7150 (h-1)

K9 0,1350 (h-1) 0,0 0,01 (h-1) 0,1350 (h-1)

K10 0,1558 (h-1) 0,187 (h-1) 0,132 (h-1) 0,1558 (h-1)

K11 0,0258 (h-1) 0,033 (h-1) 0,019 (h-1) 0,0258 (h-1)

K12 0,6139 (h-1) - 0,6 (h-1) 0,6139 (h-1)

K13 0,0185 (h-1) - 0,019 (h-1) 0,0185 (h-1)

K14 0,00013 (l/g.h) - - 0,00013 (l/g.h)

KI (g/l) 0,833 6,0 0,42 0,833

KS (g/l) 2,0 1,0 1,0 2,0

KBA (g/l) 0,5 0,0 0,5 0,5

KAA (g/l) - 0,0 0,5 0,5

KIBA (g/l) - 0,97 -

D hr1 - - 0,113 -

24

Tabela 2 - Nomenclatura utilizada

X Biomassa

P Produto

S Substrato

E Etanol

AA Ácido Acético

BA Ácido Butírico

B Butanol

A Acetona

y RNA- marcador

D Taxa de Diluição

V Volume

Tabela 3 – Condições Iniciais para a resolução numérica das EDOs.

Condições Iniciais

em g/l X

Batelada Contínuo Retenção

de células

Batelada

Alimentada

X 0,03 4,2 4,24 0,03

S 52,0 5,0 3,3 50,0

AA 0,0 1,8 3,27 0,0

AB 0,0 0,81 5,88 0,0

E 0,0 0,24 0,24 0,0

A 0,0 5,88 0,81 0,0

B 0,0 3,9 1,84 0,0

y 1,0 1,2 1,2 1,0

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