UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO

Período: Agosto/2014 a Agosto/2015

() PARCIAL

(x) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Cooperação para a Inovação Científica e Tecnológica

visando minimizar assimetrias entre programas de pós-graduação na área de alimentos.

Nome do Orientador: Alessandra Santos Lopes

Titulação do Orientador: Doutor em Tecnologia de Alimentos

Faculdade de Engenharia de Alimentos – FEA

Unidade: ITEC (Instituto de Tecnologia)

Laboratório:Laboratóriode Processos Biotecnológicos (LABIOTEC)

Título do Plano de Trabalho: Isolamento e diferenciação bioquímica das espécies de

leveduras do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau

amazônico.

Nome do Bolsista: Mariano Henrique Coimbra Rodrigues

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq

(x) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/INTERIOR

( ) PARD

( ) PIBIC/CNPq – cota do pesquisador

( ) PIBIC/FAPESPA

SUMÁRIO

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO ..................................................................................... 1

ISOLAMENTO E DIFERENCIAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ESPÉCIES DE LEVEDURAS

DO GÊNERO SACCHAROMYCES E NÃO-SACCHAROMYCES PRESENTES NO

CACAU AMAZÔNICO ..................................................................................................... 4

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 4

2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 5

3 OBJETIVOS............................................................................................................... 6

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 6

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 7

4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 7

4.1 MATERIAL ......................................................................................................... 7

4.2 FERMENTAÇÃO NATURAL DAS SEMENTES DE CACAU 8

4.2.1 Coleta das Amostras ................................................................................... 7

4.2.2 Análises Microbiológicas ............................................................................ 7

4.2.3 Testes bioquímicos 9

4.2.4 Caracterização físico-química das amostras ........................................... 9

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 9

6 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 14

REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 15

4

ISOLAMENTO E DIFERENCIAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO

GÊNERO SACCHAROMYCES E NÃO-SACCHAROMYCES PRESENTES NO CACAU

AMAZÔNICO

Mariano Henrique Coimbra RODRIGUES; Alessandra Santos LOPES

1 INTRODUÇÃO

Durante os últimos anos, o conhecimento sobre o processo de fermentação

espontâneo das sementes de cacau aumentou consideravelmente no mundo (ARDHANA;

FLEET, 2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; JESPERSEN et al., 2005;NIELSEN et al., 2005,

2007b; CAMU et al., 2007; DE VUYST et al., 2008). Contudo, ainda faltam informações sobre

a cultura do cacau em regiões com grande potencial de produção, como a Amazônica, devido

principalmente à ampla diversidade microbiana e diversos fatores ligados a flora amazônica

tais como o clima, o solo, a localização geográfica, a disponibilidade de nutrientes, bem como

o método de fermentação utilizado.

Um dos fatores cruciais para se conseguir um chocolate de boa qualidade é o

processo fermentativo das sementes do cacau, que ocorre nas fazendas de forma natural.

Esse processo é conduzido essencialmente por micro-organismos, dentre os quais os mais

importantes são as leveduras e as bactérias acéticas. A fermentação quando conduzida de

forma apropriada, possibilitará as condições ideais para o desenvolvimento das propriedades

bioquímicas necessárias para a formação das características essenciais de um chocolate de

qualidade (THOMPSON et al., 2001; SCHWAN; WHEALS, 2004; AFOAKWA et al., 2008;

LIMA et al., 2011).

A fermentação das amêndoas ainda é um processo tradicional e incontrolado,

conduzido por uma ampla variedade de espécies nativas de leveduras, bactérias acéticas e

bactérias lácticas (SCHWAN; WHEALS, 2004; LIMA et al., 2011). Para transformar a

fermentação em um processo mais eficiente, é essencial conhecer como cada grupo

microbiano contribui para o processo fermentativo e na qualidade do chocolate gerado

(SALTINI et al., 2013).

Dentre a população microbiana, as leveduras constituem a parte predominante nos

primeiros dias de fermentação, uma vez que seu crescimento é favorecido na presença de

açúcares fermentáveis (glicose, frutose e sacarose). Estas, além de contribuírem para o

aroma e sabor característicos do chocolate, propiciam condições favoráveis para o

crescimento de bactérias, bem como produzem compostos voláteis como álcoois, terpenos e

cetonas (SCHWAN; WHEALS, 2004).

As leveduras convertem os açúcares da polpa em etanol e excretam enzimas que

degradam a polpa. Simultaneamente, a presença de ácido cítrico assimilado por bactérias

5

lácticas causam um leve aumento no pH da polpa, que juntos, com o aumento de oxigênio

favorece o crescimento de bactérias acéticas. O etanol inicialmente formado pelas leveduras

é oxidado em ácido acético pelas bactérias acéticas em um processo exotérmico, causando

um aumento na massa fermentada, atingindo temperaturas de até 45º C ou mais (SCHWAN

et al., 1995; CAMU et al., 2007; NIELSEN et al., 2007).

O etanol e o ácido acético se difundem na polpa, onde juntos, com a elevação da

temperatura, são responsáveis por quebrar a parede celular e liberação de enzimas

endógenas importantes para a formação de precursores do sabor característico do chocolate

como aminoácidos livres, peptídeos e açúcares menores. Além de serem responsáveis pela

produção de etanol e pela liberação de enzimas que degradam a polpa, as leveduras são as

principais produtoras de ésteres e álcoois superiores, muito relatados por contribuírem na

complexa mistura de compostos voláteis que caracterizam o aroma do chocolate

(ARDHANA,2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; OWUSU et al.,2011).

A ecologia microbiana da fermentação das amêndoas de cacau é complexa e envolve

o crescimento sucessivo de várias espécies de leveduras, bactérias acéticas e lácticas

(ARDHANA; FLEET, 2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; DE VUYST et al., 2010; LIMA et al.,

2011; THOMPSON et al., 2013), assim as leveduras Hanseniaspora guilliermondii e

Hanseniaspora opuntiae geralmente são dominantes na parte inicial da fermentação, onde

depois Saccharomyces cerevisiae,Kluyveromyces marxianus,Pichia membranifaciens e

Pichia kudriavzevii são mais frequentemente relatadas (ARDHANA; FLEET,

2003;JESPERSEN et al., 2005 ;NIELSEN et al., 2005 ;DANIEL et al., 2009; GALVEZ et al.,

2007).

Dentre esta população, muitos estudos já têm destacado a importância do gênero

Saccharomyces para a fermentação do cacau (PAPALEXANDRATOU et al., 2013; BATISTA

et al., 2015), como sendo uma das mais predominantes; devendo muito isso à sua habilidade

de substituir outras espécies microbianas, atribuído ao seu alto poder fermentativo e

capacidade de resistir a condições cada vez mais adversas estabelecidas no meio à medida

que se prossegue a fermentação.

Estudos científicos sobre a fermentação natural do cacau amazônico e sobre a

microflora atuante nesta região ainda são escassos. Assim o presente estudo visa apresentar

dados sobre o processo de fermentação que fundamentem e incentivem futuros avanços na

pesquisa e obtenção de um chocolate de excelência.

2 JUSTIFICATIVA

As sementes do cacau são a principal matéria-prima na produção do chocolate. O

plantio de cacau é feito em países tropicais ao redor do mundo, entre os quais Costa do

6

Marfim, Gana, Indonésia e Brasil são os maiores produtores. Por muitos anos a produção e

comercialização do cacau tem sido base da economia de muitos estados brasileiros,

principalmente a Bahia. Muitos estudos relacionados ao isolamento e caracterização

bioquímica de leveduras do cacau já foram realizados na Costa do Marfim (SANCHEZ et al.,

1985), Indonésia (ARDHANA; FLEET, 2003), Gana (DANIEL et al., 2009) e na Bahia, Brasil

(SCHWAN et al., 1995; MOREIRA et al., 2013).

Embora progressos significativos já tenham sido feitos na definição da diversidade de

espécies microbianas associadas a fermentação do cacau (SCHWAN et al., 1995; ARDHANA;

FLEET, 2003; NIELSEN et al., 2005, 2007; CAMU et al. 2007; DANIEL et al., 2009;

PAPALEXANDRATOU et al., 2011), informações quantitativas sobre o perfil de crescimento

de espécies individuais no processo ainda são escassas na região Amazônica.

Estes dados quantitativos, aliados com a análise bioquímica apropriada são

necessários para determinar quais espécies microbianas são mais importantes no processo

fermentativo. Com esse conhecimento, será possível otimizar o processo de fermentação e,

se necessário, selecionar espécies apropriadas.

As leveduras exercem papel fundamental neste processo, sendo crucial para a

formação do aroma característico do cacau, onde algumas espécies apresentam

predominância nesse processo e, consequentemente, influenciam no sabor do chocolate

obtido. Vários estudos têm destacado a importância de algumas espécies fundamentais neste

processo (SANCHEZ et al., 1985; SCHWAN et al., 1995; ARDHANA; FLEET, 2003), em

especial da espécie Saccharomyces cerevisiae, aparecendo como uma das mais importantes

neste processo.

Embora a região amazônica possua uma vasta diversidade microbiana, e o cacau

esteja inserido como um dos principais produtos da cadeia produtiva da região, ainda não há

estudos sobre o papel das leveduras no processo fermentativo do cacau amazônico, e acerca

da grande importância exercida pelo gênero Saccharomyces, bem como suas características

bioquímicas.

Assim, as informações e conhecimentos obtidos nesta pesquisa apresentaram dados

para melhor compreender a participação deste gênero neste processo, bem como

compreender mais suas atividades bioquímicas e seus arranjos subsequentes, para através

disso viabilizarnovos avanços relacionados à diversidade microbiana atuante no cacau

amazônico e aprimorar a qualidade do chocolate produzido.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

7

Isolamento e diferenciação através de testes bioquímicos das espécies de

leveduras do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau

amazônico.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Isolamento de leveduras presentes no cacau amazônico;

Diferenciação através de testes bioquímicos das leveduras do gênero

Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau amazônico;

Caracterização físico química das amêndoas de cacau fermentadas.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

As amêndoas de cacau foram fermentadas nas pequenas propriedades rurais

localizadas nos municípios de Medicilândia e Tucumã, correspondendo a diferentes regiões

microclimáticas do estado do Pará. Em cada região, as fermentações foram realizadas em

duplicatas.

4.2 FERMENTAÇÃO NATURAL DAS SEMENTES DE CACAU

Foi utilizado o processo fermentativo padronizado pela Comissão Executiva do Plano

da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). O método da CEPLAC consiste na fermentação em caixa

de madeira composta por três compartimentos que medem de 3 a 6 metros de comprimento,

com divisórias a cada metro, e com 1 metro e 20 centímetros de largura por 1 metro de altura.

4.2.1 Coleta das Amostras

Amostras de aproximadamente 100g (compostas por pequenas porções de 10g

retiradas de diferentes locais da caixa de fermentação) foram coletadas nos tempos 0h, 24h,

48h, 96h, 144h e 168 horas de fermentação, sendo armazenadas em sacos estéreis de

polietileno e transportadas sob congelamento, durante todos os tempos de fermentação foi

medida a temperatura das amostras de acordo com Camu et al. (2007).

4.2.2 Análises Microbiológicas

Para o isolamento das leveduras foram pesados 20 g de amostra de amêndoas de

cacau de cada localidade, assepticamente transferida para sacos estéreis de polietileno, e

8

homogeneizadas em 180mL de água peptonada a 1%. Em seguida, a partir dessa diluição

foram realizadas diluições decimais seriadas, até a diluição 10-7, alíquotas de 1 mL foram

semeadas em placas de Petri, estéreis, contendo meio Ágar Dextrose Potato (PDA, SIGMA®)

acidificado com ácido tartárico a 10% pela técnica de semeadura por profundidade, e posterior

incubação à 25ºCde 1 a 4 dias (DANIEL et al., 2009).

Após esse período de incubação, as levedurasforam contadas pelo método de

contagem padrão em placas, determinando-se o número de Unidades Formadoras de

Colônias por grama de sementes de cacau (UFC/g) conforme Daniel et al., (2009).

Em seguida, as cepas foram purificadas em meio Ágar Extrato de Malte acidificado

com ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1% pela técnica de semeadura por profundidade,

e posterior incubação à 25ºC de 1 a 2 dias.

As leveduras isoladas foram semeadas em tubo de ensaio com tampa rosqueável

contendo o meio sólido Yeast Extract Peptone Dextrose 2% (YEPD), colocadas em estufa a

25 ºC, durante 48 horas, e para sua manutenção, foram estocadas a 8ºC.Todas as análises

microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do

Pará (UFPA).

4.2.3 Testes bioquímicos para a diferenciação do gênero Saccharomyces e não

Saccharomyces.

4.2.3.1 Testes de assimilação de fontes de carbono

Os testes foram feitos utilizando o Meio Yeast Nitrogen Base ou YNB (6,7g/100ml),

acrescentado da fonte de carbono a ser testada. Quatro fontes de carbono, que são

assimiladas pela levedura Saccharomyces cerevisiae foram testadas: glicose, galactose,

sacarose e maltose, todas na proporção de 2 g/100 mL,e uma fonte de carbono não

assimilada pela levedura foi também testada (manitol 2g/100ml), antes da sua exclusão. Em

todos os testes, foram colocadas em estufa a 30 ºC, durante 72 horas.

4.2.3.2 Teste de exclusão por estresse

Os testes de exclusão por estresse foram realizados em 4 etapas, utilizando placas de

Petri estéreis, organizados da seguinte forma:

9

Primeiramente as leveduras foram crescidas em meio sólido YEPD, acidificado com

ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1%, e incubadas a 37 ºC durante 72 horas;

As leveduras que cresceram no teste anterior foram transferidas para o meio sólido

YEPD, acidificado com ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1%, contendo 8%, (v/v)

de etanol e colocadas em estufa a 30ºC durante 72 horas;

As leveduras crescidas na presença de etanol foram semeadas em meio básico (MY)

sólido contendo 20 g% (p/v) de glicose e colocadas em estufa a 30ºC durante 72 horas;

As leveduras resistentes as estas concentrações de fonte de carbono foram crescidas

em meio básico (MY) sólido contendo 20 g% (p/v) de sacarose, adicionado de 8% (v/v)

de etanol a 30 ºC durante 72 horas.

4.2.3.3 Testes de capacidade fermentativa

Os testes de capacidade fermentativa foram realizados a partir das colônias de

leveduras resistentes ao teste anterior. Foi inoculado em tubos de ensaio, previamente

identificados, contendo em seu interior tubos de Durhan e 10 ml de meio líquido YP,

acrescentado da fonte de carbono a ser testada. Os tubos foram colocados em estufa a 30 ºC

durante 24 horas e foi observado o crescimento das leveduras, pela turvação dos meios, e a

formação de gás (VAUGHAN-MARTINI e MARTINI 1993). As fontes de carbono testadas

foram: glicose, manitol e sacarose, todas apresentado a proporção de 2 g%.

4.2.4 Caracterização físico-química das amostras

As análises físico–químicas foram realizadas no Laboratório de Processos

Biotecnológicos da Universidade Federal do Pará.

Foram monitorados os seguintes parâmetros durante a fermentação, de acordo com

os Métodos Oficiais para Cacau e Derivados (Capítulo 31) da AOAC (1997);

Acidez total titulável (31.1.06);

pH da massa das sementes de cacau (31.1.07);

Umidade (31.1.02).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA DAS LEVEDURAS

Foram isoladas nas duas localidades um total de 76 cepas, distribuídas da seguinte

maneira: Tucumã (28) e Medicilândia (48). As colônias crescidas apresentaram diferenças

morfológicas na cor (branca e branco-amarelada), aspecto (superfície lisa e rugosa) e brilho

10

(brilhante e opaca). Após a observação microscópica das leveduras crescidas, verificou-se

que apresentaram as formas redondas e ovais.

5.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

TABELA 1: Média da Contagem Total de Leveduras* durante a fermentação do cacau em duas localidades amazônicas.

Tempos de fermentação em horas

Localidade 0 24 48 96 144 168

Tucumã 1,6x108 1x107 5x106 5,1x105 1,5x10

7

1x107

Medicilândia 1,8x106 5,7x105 6x103 1,3x105 3x106 1x106

*UFC/g de cacau

A Tabela 1 apresenta os dados das fermentações realizadas em Tucumã e

Medicilândia, onde a contagem de leveduras ficou entre 106 ̴ 108 UFC/g no tempo 0 h.Nos

tempos seguintes, de 24 h e 48 h, houve um decréscimo no número de colônias formadas.

Esse decréscimo permaneceu nos tempos posteriores de fermentação das localidades. As

leveduras proliferam nos estágios iniciais da fermentação, sendo que sua atividade é intensa

nas primeiras 48 h. Posteriormente, sofrem um declínio mediante fermentação prolongada,

devido ao esgotamento das fontes de energia adequada (SCHWAN; WHEALS, 2004; CAMU

et al., 2007).

Os resultados encontrados estão de acordo com o encontrado em muitos estudos, tais

quais Jespersen et al. (2005), que encontrou valores de 106 ̴ 107 UFC/g depois das primeiras

24 h. Os resultados também estão de acordo com Sanchez et al. (1985), que obteve valores

máximos de contagem de leveduras de mais de 107UFC/g. Comparando ainda com os valores

encontrados por Ardhana e Fleet (2003), onde a contagem de leveduras oscilou entre 107 ̴ 108

UFC/g, mostram que os resultados obtidos no seguinte estudo são bastante positivos e estão

dentro da média encontrada na literatura.

5.3 Testes Bioquímicos

A partir das cepas isoladas do meio YEPD que foram semeadas em tubos de ensaio,

foram obtidas 31 cepas isoladas da localidade de Tucumã e 46 cepas isoladas da localidade

de Medicilândia. Estas cepas isoladas foram submetidas aos testes bioquímicos para a

diferenciação do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces. Este gênero de levedura

apresenta grande importância no processo fermentativo do cacau (DE CAMARGO et al, 1963;

SCHWAN et al., 1995; ARDHANA; FLEET, 2003), aparecendo como uma das mais

predominantes leveduras neste processo, conduzindo como as outras, uma forte fermentação

11

alcoólica. Em particular, a espécie Saccharomyces cerevisae apresenta predominância nas

primeiras 72 h de fermentação (SCHWAN et al., 1995); porém, sua importância se estende

também na fermentação de vinhos e inclusive na produção industrial de álcool combustível.

Devido à sua importância, procurou-se isolar e diferenciar este gênero de outros presentes,

para melhor compreender os processos bioquímicos que são realizados por esta levedura.

5.3.1 Testes de assimilação de fontes de carbono

Os testes bioquímicos de assimilação de fontes de carbono foram realizados

utilizando-se o meio YNB, onde era variada a fonte de carbono a ser testada como nutriente

das leveduras, visando-se realizar uma triagem das leveduras, a partir do qual as colônias

resistentes que assimilavam as fontes de carbono, eram submetidas ao próximo teste.

A partir das 31 cepas isoladas da localidade de Tucumã e das 46 cepas isoladas da

localidade de Medicilândia, foram testadas com a fonte de carbono glicose, onde foram

obtidas 29 cepas resistentes da localidade de Tucumã e 38 cepas resistentes da localidade

de Medicilândia. Em seguida estas cepas foram submetidas à outra fonte de carbono, sendo

esta a galactose. Foram obtidas 24 cepas isoladas da localidade Tucumã e permaneceram

as 38 cepas resistentes da localidade Medicilândia. Mais uma vez, estas foram testadas, desta

vez com a fonte de carbono sacarose, obtendo 23 cepas isoladas da localidade Tucumã e 37

cepas isoladas da localidade de Medicilândia. A próxima fonte de carbono testada foi a

maltose, onde nenhuma cepa resistente foi obtida da localidade de Tucumã e apenas 1 cepa

foi isolada da localidade de Medicilândia.

Uma última fonte de carbono, que não é assimilada pelo gênero Saccharomyces foi

testada, sendo o manitol a fonte de carbono. Das 31 cepas isoladas de Tucumã foram obtidas

4 cepas resistentes desta localidade e a partir das 46 cepas isoladas de Medicilândia, foram

obtidas 4 cepas resistentes desta localidade.

5.3.2 Teste de exclusão por estresse

Os testes de exclusão por estresse foram realizados a partir de 30 cepas isoladas da

localidade de Tucumã e 44 cepas isoladas da localidade de Medicilândia, a partir do teste

anterior (5.3.1). Estes foram realizados em 4 etapas, com diferentes meios de cultura, onde o

objetivo era realizar uma seleção, a partir das colônias de leveduras resistentes à etapa

anterior.

Na 1ª etapa, utilizando o meio YEPD acidificado com ácido tartárico e cloranfenicol,

foram obtidas 25 cepas isoladas da localidade de Tucumã e 43 cepas isoladas da localidade

de Medicilândia. As cepas resistentes foram então submetidas ao próximo teste, com o meio

YEPD acidificado com ácido tartárico e cloranfenicol, acrescentado de etanol. Desta etapa,

12

permaneceram as 25 cepas isoladas da localidade de Tucumã e as 43 cepas isoladas da

localidade de Medicilândia.

Na 3ª etapa, foi utilizado o meio MY, acrescentado da fonte de carbono glicose. Nesta

etapa, ainda permaneceram as 25 cepas isoladas da localidade Tucumã e as 43 cepas

isoladas da localidade Medicilândia. Na última etapa, utilizando o meio MY, acrescentado da

fonte de carbono sacarose e de etanol, foram obtidas as 25 cepas isoladas da localidade

Tucumã e as 43 cepas isoladas da localidade Medicilândia.

5.3.3 Testes de capacidade fermentativa

Os testes de capacidade fermentativa foram realizados a partir das 25 cepas isoladas

de Tucumã e das 43 cepas isoladas de Medicilândia, a partir do teste anterior (5.3.2). Estes

foram realizados utilizando-se o meio MY, variando a fonte de carbono a ser testada como

nutriente, para determinar em quais houve crescimento da levedura, através da fermentação,

que eram determinadas a partir da turvação do meio e formação de gás carbônico, produzido

no processo fermentativo.

A primeira etapa foi feita utilizando-se glicose como fonte de carbono, onde a partir

das 25 cepas isoladas de Tucumã, obteve-se 22 cepas desta localidade, e das 43 cepas

isoladas de Medicilândia, foram obtidas 41 cepas, todas apresentando turvações no meio de

cultura e formação de bolhas de gás carbônico. Em seguida, foi testada a fonte como manitol,

onde a partir das 22 cepas de Tucumã, 18 cepas foram obtidas. Já a partir das 41 cepas de

Medicilândia, obteve-se 40 cepas formadas. Por fim, utilizou-se a sacarose como meio

nutritivo para as 18 cepas de Tucumã, obtendo-se 6 cepas, e das 40 cepas de Medicilândia,

foram obtidas 36 cepas formadas. Observou-se que, embora tenha havido fermentação

nessas cepas formadas, apenas em algumas foi observada a formação de gás carbônico.

5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS AMOSTRAS

A caracterização físico-química das amostras levaram em consideração os

resultados de pH, umidade, cinzas e acidez das amêndoas de cacau. Os resultados de pH e

temperatura são apresentados na tabela abaixo.

13

Tabela 1. Média do pH e temperatura, durante a fermentação do cacau município de Tucumã– PA.

Tempo de

fermentação

(horas)

0

24

48

96

120

144

168

pH 5,25±0,50 4,84±0,38 4,53±0,20 5,76±0,36 6,45±0,67 6,07±0,07 6,48±0,20

Temperatura oC 26 36 43,5 43 45,5 45 44

* Resultados expressos em média±desvio padrão.

Tabela 2. Média do pH e temperatura durante a fermentação do cacau município de Medicilândia – PA.

* Resultados expressos em média±desvio padrão.

A tabela 1 mostra os resultados de pH da localidade Tucumã. Os resultados mostram

que houve uma queda no valor do pH nas primeiras 48 h de fermentação, que coincide com

o aumento de temperatura e acúmulo de ácido acético na polpa, assim mostrando que este

irá se difundir na polpa. Estes resultados estão de acordo como encontrado por Thompson et

al. (2001). Os valores oscilaram entre 5,2 e 6,48, e de acordo com os encontrados por Ardhana

e Fleet (2003), já que o pH da polpa normalmente aumenta quando começa a fermentação.

O mesmo se pode concluir da localidade de Medicilândia, que oscilou os valores de

pH entre 5,33 e 5,27; porém demonstrando que a acidez desta localidade é ligeiramente maior

que da localidade de Tucumã, o que pode ser devido a uma maior produção de compostos

ácidos pelas espécies microbianas que atuam na microflora desta localidade.

Assim, o decréscimo constante do pH encontrado, caracterizou uma acidez elevada

no início e termino da fermentação, sendo a acidez inicial de 37,67 e 25,63 (ml Na OH/ 100g),

com valor médio final de 19,75 e 21,10 (ml Na OH/ 100g) para o cocho 1 e 2 de Medicilândia,

respectivamente. No município de Tucumã os valores das médias encontradas para o cocho

Tempo de

fermentação

(horas)

0

24

48

96

120

144

168

pH 5,33± 0,12 4,91±0,11 4,53±0,02 4,63±0,04 4,72±0,02 4,83±0,93 5,27±0,30

Temperatura oC 24,5 30 39 42 45 45 46

14

1 e 2 foram no início de fermentação 12,24 e 17,63 (ml Na OH/ 100g), com valores médio final

de 3,47 e 8,57.

Os altos valores de acidez durante o processo fermentativo são atribuídos, aos ácidos

acético e láctico, resultantes da oxidação do etanol. Foi observado uma elevada acidez

durante a fermentação realizada nas três localidades estudadas, com exceção do cocho 2

Tucumã. Lefeber et al. (2011), encontrou um constante aumento na acidez durante a

fermentação, realizada na Bélgica.

Com relação aos valores de umidade, os resultados estão expressos na tabela abaixo:

Tabela 3 - Média da umidade durante a fermentação do cacau município de Medicilândia e Tucumã – PA.

Parâmetro

Valores (%) ± DP*

Tempo 0 horas

Valores (%) ± DP*

Tempo 168 horas

Umidade – Tucumã 37,48±0,89 37,11±1,77

Umidade - Medicilândia 38,60±1,53 36,80±0,23

O teor de umidade ficou entre 36.8 % e 38.60 %, para as duas localidades estudadas

que de acordo com o método da AOAC, está dentro dos parâmetros, considerando valores

de 30 % a 40 %, para o cacau fermentado e seco em estufa. Foi notado, que a medida que

se aumentava os tempos de fermentação, o teor de umidade diminuía, já que os açúcares da

polpa eram consumidos, sofrendo hidrólise, para produzir outros compostos bioquímicos.

6 CONCLUSÃO

Apesar da fermentação ser um processo bastante heterogêneo, as leveduras

exercem um papel crucial, e o gênero Saccharomyces é um dos mais predominantes,

portanto, exercendo grande importância na obtenção do aroma característico do chocolate

produzido. Através dos testes bioquímicos foi possível revelar que, a partir do total inicial de

76 cepas, 42 cepas deram resultado positivo para este gênero e 34 cepas deram resultados

negativos. Isso mostra que há uma leve predominância deste gênero de levedura atuando na

microflora da região amazônica. Os valores físico-químicos das amêndoas de cacau também

revelaram que o cacau encontrado nestas localidades apresentava um maior teor de acidez,

em comparação com que outros encontrados em diferentes estudos; já o teor de umidade

apresentou um valor razoável dentro dos parâmetros seguidos pela metodologia.

Portanto, devido à importância deste gênero de levedura, em um processo crucial

para a formação de um cacau de qualidade, pode-se melhor compreender sua participação

15

nesta etapa, bem como sua atividade bioquímica; assim como também foi possível avaliar

como este gênero atua na microflora amazônica, para através disso aprimorar a qualidade do

chocolate produzido.

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DIFICULDADES

As atividades do projeto foram realizadas de forma plena, não havendo dificuldades a relatar.

PARECER DO ORIENTADOR

O bolsista MARIANO HENRIQUE COIMBRA RODRIGUES teve desempenho excelente no

decorrer do projeto.

DATA:10/08/2015

Alessandra Santos Lopes

ORIENTADORA

Mariano Henrique Coimbra Rodrigues

BOLSISTA