SERVICcedilO PUacuteBLICO FEDERAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAacute NUacuteCLEO DE MEDICINA TROPICAL

PROGRAMA DE POacuteS- GRADUACcedilAtildeO EM MEDICINA TROPICAL

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Beleacutem 2011

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO

COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Orientador Prof Dr Juarez Antonio

Simotildees Quaresma

Beleacutem 2011

Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)

Souza Ana Maria Almeida

Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011

72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo

de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo

CDU 61636-002

Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Aprovada em _____________

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA

A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA

A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E

SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE

SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo

ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo

A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM

DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A

RECORRIAM

AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS

AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME

MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO

COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Orientador Prof Dr Juarez Antonio

Simotildees Quaresma

Beleacutem 2011

Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)

Souza Ana Maria Almeida

Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011

72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo

de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo

CDU 61636-002

Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Aprovada em _____________

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA

A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA

A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E

SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE

SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo

ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo

A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM

DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A

RECORRIAM

AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS

AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME

MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

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CACOUB P et al Extrahepatic manifestations of chronic hepatitis C Arthritis Rheum v 42 n 10 p 2204-12 Oct 1999

CATALAN-SOARES B C PROIETTI F A CARNEIO-PROIETTI FA Viacuterus linfotroacutepicos Humanos Infecccedilatildeo Doenccedila e Prevenccedilatildeo In COUTO J C F Infecccedilotildees perinatais Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2006 p 279-292

CHOO Q L KUO G WEINER A J OVERBY L R BRADLEY DW HOUGHTON M Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome Science v 244 n 4902 p 359-62 Apr 1989 apud RIBEIRO L S et al Fibromialgia e infecccedilatildeo crocircnica pelo viacuterus da hepatite C ausecircncia de associaccedilatildeo em duas amostras Rev Bras Reumatol v 47 n2 p 97-105 2007

Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)

Souza Ana Maria Almeida

Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011

72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo

de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo

CDU 61636-002

Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Aprovada em _____________

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA

A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA

A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E

SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE

SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo

ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo

A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM

DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A

RECORRIAM

AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS

AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME

MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Aprovada em _____________

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA

A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA

A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E

SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE

SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo

ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo

A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM

DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A

RECORRIAM

AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS

AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME

MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho

CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS

MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS

MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS

ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute

FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

Agrave PENA

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

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CATALAN-SOARES B C PROIETTI F A CARNEIO-PROIETTI FA Viacuterus linfotroacutepicos Humanos Infecccedilatildeo Doenccedila e Prevenccedilatildeo In COUTO J C F Infecccedilotildees perinatais Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2006 p 279-292

CHOO Q L KUO G WEINER A J OVERBY L R BRADLEY DW HOUGHTON M Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome Science v 244 n 4902 p 359-62 Apr 1989 apud RIBEIRO L S et al Fibromialgia e infecccedilatildeo crocircnica pelo viacuterus da hepatite C ausecircncia de associaccedilatildeo em duas amostras Rev Bras Reumatol v 47 n2 p 97-105 2007

RESUMO

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de

pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo

Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste

trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus

da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51

pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas

infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam

idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero

masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN

positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT

ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente

entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1

Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

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ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)

were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45

(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1

Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e

patologias relacionadas 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e

relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

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neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

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esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

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Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

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Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos

Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico

Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I

Cdna DNA complementar

CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo

E1 Proteiacutena do envoltoacuterio

ENH Eritema Nodoso Hansecircnico

ESP Esclerose sistecircmica progressive

FAN Fator Anti-nuacutecleo

FR Fator reumatoacuteide

HBV Viacuterus da hepatite B

HCV Viacuterus da Hepatite C

HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana

HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica

LE Lupus Eritematoso

LES Luacutepus eritematoso sistecircmico

MS Ministeacuterio da Sauacutede

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B

NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical

OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede

PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguiacuteneo

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

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CATALAN-SOARES B C PROIETTI F A CARNEIO-PROIETTI FA Viacuterus linfotroacutepicos Humanos Infecccedilatildeo Doenccedila e Prevenccedilatildeo In COUTO J C F Infecccedilotildees perinatais Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2006 p 279-292

CHOO Q L KUO G WEINER A J OVERBY L R BRADLEY DW HOUGHTON M Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome Science v 244 n 4902 p 359-62 Apr 1989 apud RIBEIRO L S et al Fibromialgia e infecccedilatildeo crocircnica pelo viacuterus da hepatite C ausecircncia de associaccedilatildeo em duas amostras Rev Bras Reumatol v 47 n2 p 97-105 2007

SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide

SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida

SS Siacutendrome de Sjoumlgren

UFPA Universidade Federal do Paraacute

UV ultravioleta

VHA Viacuterus da Hepatite A

VHC Viacuterus da Hepatite C

VHCHCV Hepatite C

VV Hanseniacutease generalizada

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

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SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40

31 OBJETIVO GERAL 40

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia

molecular 43

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas

HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70

15

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 HEPATITE C (VHCHCV)

111 Consideraccedilotildees Gerais

As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes

etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo

Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam

importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA

SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud

RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande

variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes

(ALMEIDA 2010)

A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose

podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente

infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em

geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das

sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que

existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e

pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos

prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados

no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente

Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et

al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos

progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma

questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de

lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees

histoloacutegicas mais graves

As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave

prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-

epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil

16

salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes

e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos

Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o

VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece

como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco

satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de

drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de

hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE

ONO-NITA 2007)

A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a

vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico

do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)

112 Agente Etioloacutegico

O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae

representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B

(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro

com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem

disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE

2000)

O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta

uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo

resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)

(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O

genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b

ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20

o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)

17

113 Epidemiologia

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma

questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma

prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial

(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo

infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)

De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes

infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer

teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira

insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras

dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e

desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores

caminhos (BRASIL 2005b)

A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na

eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV

porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)

A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no

Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica

equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)

De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem

hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees

de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees

de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da

doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da

enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE

2005)

18

Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris

(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus

C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada

em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo

todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA

e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda

114 Modo de Transmissatildeo

A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por

meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno

Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou

roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute

possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem

tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)

Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de

sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis

socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi

observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas

designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual

do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 110) (CONTE 2000)

A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os

liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes

Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que

aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania

intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de

transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas

acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos

casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da

hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

19

As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a

administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente

eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo

aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998

apud CONTE 2000)

A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e

ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de

risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso

de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud

CONTE 2000)

A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto

(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo

nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et

al 1998 apud CONTE 2000)

115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica

A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente

vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos

infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre

naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a

maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)

A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis

persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute

representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica

representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que

gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al

2009 BLOCK SCHIANO 1999)

Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV

ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir

por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa

Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em

doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico

numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica

com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de

graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves

e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina

aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade

desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica

Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores

soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado

mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo

persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica

quase todos permanecendo na categoria moderada

Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de

hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose

descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes

hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)

Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de

natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de

aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria

tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico

em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute

a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos

de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a

hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero

de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles

(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)

Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila

cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida

21

Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases

normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)

A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande

minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia

hepaacutetica aguda

Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a

natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17

anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D

contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de

isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente

fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de

100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria

das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto

somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em

uma delas havia acentuado alcoolismo

A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira

geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva

Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo

hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural

da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os

contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila

enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral

que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o

Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB

A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos

pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a

dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro

lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito

raro (LOPES 2010)

Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo

satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o

contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo

detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com

22

viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral

ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)

Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No

entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores

demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram

negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas

do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados

Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores

hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois

mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no

fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas

nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR

Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim

Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18

anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo

controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz

muito lentamente

Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito

frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia

genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os

inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias

imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia

humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos

viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do

que nos casos de VHC isoladas

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm

por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente

normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada

23

armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que

interferem na leitura entre outras causas de erro

As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do

diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo

genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o

genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da

carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de

cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de

replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos

no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no

sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande

minoria dos casos

116 Diagnoacutestico

Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a

doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute

esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em

especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria

sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa

estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo

praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar

mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por

transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)

A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma

associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em

meacutedia satildeo de 50rdquo

Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b

frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com

24

depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa

Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos

1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o

efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de

hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo

da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas

poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila

Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas

CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo

peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro

desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular

consequumlente seria portanto miacutenima

Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune

celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas

vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em

camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC

Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente

esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et

al 1998)

25

12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo

seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT

SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo

do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500

nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser

utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo

em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem

utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do

envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos

nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-

especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que

for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS

SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citoloacutegicas (serotipagem)

Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem

utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT

SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a

hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics

Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da

regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais

vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma

viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do

VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os

testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV

Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da

teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em

26

comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De

LARANAGA et al 2000)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas

sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico

Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA

1999)

A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de

subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata

razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada

Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos

genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da

detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1

253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias

regiotildees mundiais

13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC

As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais

variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso

variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou

incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias

cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1

(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)

A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em

vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e

de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou

hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos

geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)

27

A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e

pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos

mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra

ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)

Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites

virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na

fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem

disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes

transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral

A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista

essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De

forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de

Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)

A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000

CACOUB et al 1999)

A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator

reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso

sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB

1998 WENER et al 1996)

14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-

se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e

parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na

prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos

antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de

28

neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2

glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados

aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos

saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto

observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR

anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal

dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com

o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento

articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos

pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide

Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e

as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve

associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios

reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto

entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma

alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido

observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO

PROIETTI 2004 2005)

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-

Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La

aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados

de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes

com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos

de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis

significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de

autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-

anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar

relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a

definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes

e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados

consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com

leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON

et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra

semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al

2000)

Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos

antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas

infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e

HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome

antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os

tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a

resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre

doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas

frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK

SHOENFELD 2002)

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK

et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de

anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL

associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo

dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto

30

esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL

satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al

2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees

podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em

indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)

A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas

(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como

Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser

atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-

reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais

(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e

L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute

outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al 2009)

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e

componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos

como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A

associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD

1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-

Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a

homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)

A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a

resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo

antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do

antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre

31

reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode

resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al

2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel

importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos

sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos

no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico

(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)

15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para

doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um

terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites

auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al

(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator

reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas

virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e

exantema suacutebito

A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees

com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira

de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a

sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da

interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999

CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie

do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite

infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina

cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo

transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo

anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo

influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito

32

16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma

variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas

doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica

progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren

(SS) polimiosite e dermatomiosite

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo

aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade

Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados

(DELLAVANCE et al 2003)

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade

reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2

(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de

antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de

fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente

Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo

de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa

realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN

A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas

permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos

padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite

um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como

marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico

A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaccedilotildees

minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente

33

minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune

tais como infecccedilotildees principalmente virais

minus uso de medicamentos e neoplasias

minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente

sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila

minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico

O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos

os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O

tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia

inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em

minus Baixo menor 180

minus Moderado 1160

minus Moderadamente elevado 1320

minus Alto maior 1640

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados

satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar

utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de

180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-

positivos

Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a

1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do

padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um

antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas

situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de

um padratildeo de fluorescecircncia

O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor

de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por

consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo

centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de

autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas

especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas

tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)

34

Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem

estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado

fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo

com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)

O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado

Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os

pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de

anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o

citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com

LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave

presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em

pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al 2003)

Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas

Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas

Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA

LES AR lupus induzido por drogas

Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES

Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST

Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda

SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda

Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003

35

Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria

Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria

Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)

Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto

Fonte Dellavance et al 2003

36

Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes

Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite

Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas

Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria

Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal

Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida

Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica

Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo

Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade

Fonte Dellavance et al 2003

37

Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia

Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo

Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico

Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas

Fonte Dellavance et al 2003

Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave

Nucleolar Homogecircneo

Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo

Fonte Dellavance et al 2003

De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram

comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros

membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de

um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com

placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade

imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo

homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de

pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave

38

infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica

Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos

padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo

do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem

milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em

todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo

pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica

desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de

autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo

sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo

considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem

satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual

21 ASPECTOS EacuteTICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o

sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)

Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o

genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo

relacionadosrdquo

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-

CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da

identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua

posterior utilizaccedilatildeo

Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os

participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica

40

3 OBJETIVOS

31 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo

viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico

laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV

II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade

III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo

infectados

IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas

41

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se

pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute

(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material

bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de

2009 a maio de 2010

411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C

A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA

para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a

presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)

oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios

catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA

Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo

individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados

412 Grupo de natildeo infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos

doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis

Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo

HEMOPA

42

42 MEacuteTODO

421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente

foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente

identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC

Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a

pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral

(genotipagem)

Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na

soroteca

422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C

Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos

pacientes

As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira

com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes

homogeneizados rapidamente no voacutertex

O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da

microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs

poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo

em amostra uacutenica (um poccedilo)

Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA

tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes

43

Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de

controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e

contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC

Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se

cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem

diluiacuteda

Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos

Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura

ambiente (18-24ordmC) por 15 min

Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a

reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge

1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo

reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre

os valores 09 ndash 11

423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do

RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se

em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes

incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas

44

Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se

no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas

Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente

identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo

ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a

14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para

encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo

Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60

microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min

descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de

RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das

Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12

microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O

primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC

O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto

da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras

foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos

temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com

temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30

segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de

72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC

Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de

agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de

etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os

resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes

45

positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como

indetectaacuteveis por este meacutetodo

A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA

produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio

de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma

amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1

microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL

Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT

O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra

(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As

amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial

de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de

desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de

extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7

minutos e um hold de 4ordmC

O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g

de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que

migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados

foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que

apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os

negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da

2ordf PCR

424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem

do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo

AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia

Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais

46

Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes

sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes

Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo

AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de

DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e

RNAse 11 microL RSA I 2 microL

O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra

(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para

cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo

de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para

digerir (cortar) os fragmentos

Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos

genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de

tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese

com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV

(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de

tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram

padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral

425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no

Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia

indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do

substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado agrave fluoresceiacutena

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics

Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina

tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia

47

fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada

Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo

A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia

marca Nikon modelo Eclipse E-200

Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram

a) aspecto da matriz nuclear

b) aspecto do nucleacuteolo

c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear

d) aspecto do fuso mitoacutetico

e) aspecto do citoplasma

43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual

tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de

resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao

estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)

isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for

menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor

de ldquoprdquo for maior que 005

Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia

central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios

padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras

O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de

n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades

estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as

proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma

associaccedilatildeo

48

5 RESULTADOS

O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em

2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico

Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma

predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30

a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60

anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de

paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi

proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo

de sangue (Tabela 1)

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero

Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251

Total 51 1000

Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado

30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196

gt 60 3 59 Total 51 1000

Naturalidade

Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20

Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20

Total 51 1000

Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001

IASEP 1 20 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

49

Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1

(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos

pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram

o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)

Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico

Genoacutetipo viral - HCV

Tipo 1 45 882 Qui-quadrado

Tipo3 6 118 p lt 00001

Total 51 1000

FAN Qui-quadrado

Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008

Negativo 38 745 Total 51 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero

masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila

estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute

independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior

ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)

Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Gecircnero Teste estatiacutestico

(Teste G) Masculino Feminino

N N

Positivo 10 294 3 176

Negativo 24 706 14 824 p = 05652

Total 34 1000 17 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3

predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa

entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)

50

Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Gecircnero

Grupos estudados Teste estatiacutestico

(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)

do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo

tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)

Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

lt 30 04 118 0 00

30 a 40 15 314 3 500 p = 06401

41 a 50 15 314 1 167

51 a 60 08 196 2 333

gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e

a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o

genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a

idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi

respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma

amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica

entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )

De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com

FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e

68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As

idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com

o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN

51

negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades

encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE

Tamanho da amostra 45 6 13 38

Idade miacutenima 20 32 30 20

Idade maacutexima 68 57 53 68

Amplitude Total 48 25 23 48

Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43

Mediana 43 42 46 42

Desvio Padratildeo 107 93 78 113

Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST

ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo

semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo

atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos

(Tabela 7)

Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos

Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico

(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907

ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355

ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110

γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194

Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349

Fonte Protocolo da pesquisa

Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e

fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os

52

pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia

estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)

Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos

Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo

micro plusmn DP micro plusmn DP

AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704

ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347

ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732

γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369

Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa

Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN

citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em

pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV

sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa

uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

(Tabela 9)

Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)

Infectados Natildeo infectados

N n

Positivo 13 255 2 2

Negativo 38 745 98 98 p lt 00001

Total 51 1000 100 1000

Fonte Protocolo da pesquisa

Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos

viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os

genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3

No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)

(Tabela 10)

53

Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute

FAN (citoplasmaacutetico)

Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)

Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n

Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000

Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa

54

6 DISCUSSAtildeO

Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus

Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios

substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais

terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam

significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de

antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo

O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos

antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes

padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do

aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-

anticorpos

A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN

(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura

dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo

relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-

anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al

2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las

imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE

LARANAGA et al 2000)

Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode

identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a

ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem

estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos

alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)

No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da

Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos

pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos

encontrados na literatura como

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com

Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias

32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do

55

padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com

hanseniacutease (91) e co-infectados (237)

Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de

pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas

HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de

prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo

citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue

(67) e HTLV 12 (133)

Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e

Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica

que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-

imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes

por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais

apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em

indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente

O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser

encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre

outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica

definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim

como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do

tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva

dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos

Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-

imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com

FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune

Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados

estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-

imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes

sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas

Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi

observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do

grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico

56

Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a

tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo

(DE LARANAGA et al 2000)

Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a

medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em

indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir

apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo

houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)

Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes

em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e

(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste

trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero

masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)

anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana

respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de

43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo

Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de

infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na

referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)

anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos

em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da

infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos

indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)

sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no

desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle

da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos

no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os

resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)

Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-

actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de

tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi

descrita

Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes

com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila

57

pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria

necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a

finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-

anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a

presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo

Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com

hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em

516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda

Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de

aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)

Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a

relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as

elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1

Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma

distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e

3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os

grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis

altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica

Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa

associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam

graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de

aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do

estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica

Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b

(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma

maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e

hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em

acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que

identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi

identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas

pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco

58

(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados

que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo

pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que

estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo

raros

No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o

FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia

estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3

Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor

resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo

pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de

reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila

poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses

autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis

vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo

hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja

quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a

concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave

hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em

parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)

59

7 CONCLUSOtildeES

minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos

dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico

minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com

infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle

minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da

negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo

essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo

entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV

minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute

superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila

natildeo eacute estatisticamente significativa

minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado

minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos

celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com

relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos

minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter

implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave

menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois

os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes

sejam avaliados futuramente

minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que

uma causa da agressatildeo hepaacutetica

minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os

FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados

pelo HCV

minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi

positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim

que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo

houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos

dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente

60

REFEREcircNCIAS

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