UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE … · Na indução de convulsão com estricnina no CPF...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
EDNA MARIA CAMELO CHAVES
AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] DE
ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO
FORTALEZA
2012
EDNA MARIA CAMELO CHAVES
AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] DE
ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO
Tese apresentada ao Programa de Pós - Graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Orientador (a): Profª. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos
FORTALEZA
2012
EDNA MARIA CAMELO CHAVES
AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-ESTERIL-PIRAN-2-ONA] DE ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE
AÇÃO
Tese apresentada à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.
Aprovado em: ___ /____ /____.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profª. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos (Orientadora) Universidade Federal do Ceará
___________________________________________
Profª Dra. Luiza Kalyne Almeida Moreira Leal Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Profª. Dra. Paula Matias Soares Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________
Profª Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Profª. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa Universidade Federal do Ceará
A Deus, fonte divina de luz, sabedoria e
amor, por toda a força e perseverança e
por ter colocado na minha vida pessoas tão
importantes que contribuíram para a
concretização deste sonho.
Aos meus pais, Antônio Camelo e Maria
Darci, pela oportunidade de viver e de
poder lutar para atingir meus objetivos.
Às amigas Tereza Cristina Freitas e Vilma
Freitas, pela amizade sincera, pelo
incentivo e apoio na execução desta Tese
de Doutorado.
Aos meus irmãos, Elizabete Camelo, Irani
Camelo, Irandi Camelo, Antônio Camelo,
Rocélio Camelo, em particular, à Davina
Camelo, pelo incentivo para imersão na
vida acadêmica.
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos, minha estimada
orientadora, grande pesquisadora do Laboratório de Neurofarmacologia, pela
amizade, pelos ensinamentos, pelas críticas e pela confiança para concretização de
mais um projeto na minha vida acadêmica e profissional. Muito obrigada pela valiosa
contribuição.
À professora Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pesquisadora do
Laboratório de Neurofarmacologia, por ter me aceito no Laboratório. Pessoa a quem
tenho admiração e respeito por ser uma grande pesquisadora. Muito Obrigada.
À professora Dra. Danielle Silveira Macedo, pesquisadora do Laboratório
de Neurofarmacologia, pelos ensinamentos, pela disponibilidade e contribuição na
realização deste trabalho e dos demais.
À professora Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal, pesquisadora do
Laboratório de Neurofarmacologia, por ter nos recebido no laboratório para
realização de experimentos, e por ter aceito gentilmente o convite para participar da
banca examinadora desta tese.
Às professoras Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy, Dra. Paula Matias
Soares e Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar, por terem gentilmente aceito o
convite para participar da banca examinadora da tese de doutorado.
Aos professores do Laboratório de Neurofarmacologia, Silvânia
Vasconcelos, Francisca Cléa, Glauce Viana, Marta Fontenele, Daniele Macedo, pela
contribuição em nossa formação acadêmica.
Ao professor José Maria Barbosa Filho, que gentilmente nos cedeu a
substância isolada para realização dos experimentos.
À doutoranda Ana Silvia Suassuna Carneiro Lúcio pelo isolamento da
substância utilizada nos experimentos.
Às professoras Maria Vera Moreira Leitão Cardoso, Maria do Socorro
Sherlock, Maria Veraci de Oliveira, pelo apoio e pelos ensinamentos, nesta trajetória
da pós-graduação.
Aos amigos do Laboratório de Neurofarmacologia, José Eduardo, Elaine
Cristina, Sarah Escudeiro, Raquel Lima, Marta Arruda, Clayton Aguiar, Márcia
Calheiros, Rita Neuma, Rafael Sampaio, Taciana Rodrigues, Valdécio Monteiro,
Naiara Ximenes, Caren Sousa, Germana Vasconcelos, Anália, Rodrigo Lobato,
Gilberto Cerqueira, Aline Holanda, Emiliano, Edith Venâncio, pela amizade, pelo
convívio agradável e préstimos.
Às amigas do Hospital Geral de Fortaleza, Albertisa Alves, Ilvana Lima,
Sônia Campos, Antonila Pimentel, Ana Érica, Gilvânia Grangeiro, Angela Timbó,
Luiza de Marilac, Mayrianne Brindeiro, pelo incentivo e apoio durante a realização do
doutorado.
Às amigas Leiliane Martins, Márcia Coelho, Regina Dodt, Ana Valeska,
sempre presentes em muitos momentos.
Aos técnicos do Laboratório de Neurofarmacologia, Vilani Rodrigues,
Arnaldo e Lena, pela amizade, disponibilidade e ajuda imprescindível em muitos
momentos.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, em
especial à Aura Rhanes Nogueira Yda pelo incentivo, presteza e colaboração
durante o período de realização desta tese.
Aos órgãos de fomento: CNPq, CAPES e FUNCAP, pelo apoio financeiro.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação de Farmacologia e Fisiologia
da Universidade Federal do Ceará.
RESUMO
CHAVES, E.M.C. Ação ansiolítica e anticonvulsivante da 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] de Aniba panurensis em camundongos: possível mecanismo de ação. 2012. 198f. Tese
(Doutorado). Orientadora: Silvânia Maria Mendes Vasconcelos. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. O gênero Aniba destaca-se por suas propriedades farmacológicas, tais como ansiolítica, antidepressiva e vasorelaxante. Dos frutos de Aniba panurensis conhecida popularmente por ―louro amarelo‖ foi identificada uma pirona natural, a 6-[(E)-esteril-piran-2-ona]. O objetivo do presente trabalho foi verificar os efeitos neurofarmacológicos da 6-[(E)-esteril-piran-2-ona (STY) obtida da Aniba parusinensi em camundongos através de testes comportamentais (atividade locomotora espontânea (ALE), rearing e grooming), testes de
indução de convulsão química e dosagens neuroquímicas de aminoácidos (glutamato (GLU), aspartato (ASP), ácido γ-aminobutírico (GABA), glicina (GLI), taurina (TAU), histidina (HIS) em córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE). Foram utilizados camundongos Swiss, machos, com peso médio de 28 gramas. Os animais foram tratados com dose única de STY (1, 5, 10 ou 20 mg) por via intraperitoneal. Trinta minutos após administração os animais foram submetidos aos testes comportamentais e teste de convulsão induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), estricnina, bicuculina e pilocarpina. Imediatamente após os testes os animais foram sacrificados e as áreas cerebrais de interesse dissecadas para a dosagem da concentração de aminoácidos através de HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography). No teste de ALE a STY na dose de 10 ou 20
mg/kg aumentou atividade locomotora quando comparada ao grupo controle. No Labirinto em cruz elevada e o teste da placa perfurada, a STY em todas as doses comprovou seu efeito ansiolítico, pois aumentou todos os parâmetros analisados. Na dosagem de aminoácidos neurotransmissores após o teste de comportamento houve aumento nas concentrações dos aminoácidos inibitórios (GABA, GLI, TAU, HIS) e excitatórios (ASP, GLU) no CPF, HC e CE. Após o pré-tratamento com STY os animais foram submetidos ao teste de indução de convulsão por PTZ (85 mg/kg) ou Bicuculina (12 mg/kg) foram observados aumentos na latência de convulsão e morte, com animais sobreviventes na maior dose. No teste com a indução de convulsão por estricnina (20 mg/kg/ ocorreu o aumento na latência de convulsão (STY-10: 50,42 ± 7,20; STY-20: 65,99 ± 3,22) e latência de morte (STY-1: 20 ± 1,72; STY-10: 19,17 ± 1,87; STY-20: 23,83 ± 1,55) em todos os animais pré-tratados com STY. Na indução de convulsão por pilocarpina ocorreu uma diminuição da latência de morte. Após os testes os animais realizou-se a dosagem da concentração dos aminoácidos (ASP, GLU, GLI, TAU e GABA). No CPF aumentaram ASP, TAU, GABA. Já no HC o aumentou GLU, ASP, GLI e GABA. Na indução de convulsão com estricnina no CPF ocorreu o aumento no ASP, TAU, GABA, enquanto no HC aumentou ASP, GLI, TAU, GABA. No modelo de indução com bicuculina no CPF aumentou o ASP, GLU, GLI, TAU, GABA, enquanto no HC aumentou ASP, GLU, GLI, TAU, GABA. No modelo de indução com pilocarpina no CPF aumentou ASP, GABA, GLI, enquanto no HC aumentou apenas o ASP. Conclui-se que a STY apresenta um efeito ansiolítico nos testes de comportamento, efeito protetor nos teste de indução de convulsão por PTZ, estricnina e bicuculina. Após o doseamento dos aminoácidos pode-se demonstrar a participação dos sistemas glutamatérgico, GABAérgico e glinérgico. Palavras-chave: Plantas medicinais. Aniba panurensis. Ansiedade. Convulsões.
Aminoácidos-Peptidérgicos.
ABSTRACT
CHAVES, E.M.C. Anxiolytic and anticonvulsant effects of 6-[(E)-styryl-pyran-2-one] of Aniba panurensis in mice: possible mechanism of action. 2012. 198p. Thesis (PhD).
Advisor: Silvânia Maria Mendes Vasconcelos. Pharmacology Graduate Program. Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará, Fortaleza, 2012. The genus Aniba stands out for its pharmacological properties, such as anxiolytic, antidepressant and vasorelaxant. Of the Aniba panurensis fruits popularly known as ―louro amarelo‖ a natural pyrone, 6-[(E)-styryl-pyran-2-one], was identified. The objective of this study was to verify the neuropharmacological effects of 6-[(E)-styryl-pyran-2-one] (STY), obtained from Aniba panurensis, in mice through behavioral tests (spontaneous locomotor activity (SLA), rearing and grooming), tests of chemically induced seizures and neurochemical dosages of amino acids (glutamate (GLU), aspartate (ASP), γ-aminobutyric acid (GABA), glycine (GLY), taurine (Tau), histidine (HIS) in the prefrontal cortex (PFC), hippocampus (HC) and striatum (ST). We used Swiss mice, male, with an average weight of 28 grams. The animals were treated with a single dose of STY (1, 5, 10 or 20 mg) by intraperitoneal injection. Thirty minutes after administration, the animals were subjected to behavioral tests of chemically induced seizures by pentylenetetrazol (PTZ), strychnine, bicuculline and pilocarpine. Immediately after the tests, the animals were sacrificed and the brain areas of interest were dissected to estimate the amino acid concentration via HPLC (High Performance Liquid Chromatography). In the SLA test the STY at 10 or 20 mg/kg dose increased locomotor activity when compared to the control group. In the elevated plus-maze and hole-board tests, the STY in all doses proved its anxiolytic effect, because it increased all parameters analyzed. In the dosage of amino acid neurotransmitters after behavioral test there was an increase in inhibitory amino acid concentrations (GABA, GLY, TAU, HIS) and excitatory (ASP, GLU) in PFC, HC and ST. After pretreatment with STY, the animals were tested for seizures induced by PTZ (85 mg/kg) or Bicuculline (12 mg/kg), we observed an increase in the latency of seizures and death in surviving animals at the highest dose. During the strychnine-induced seizures test (20 mg/kg) there was an increase in seizure latency (STY-10: 50.42 ± 7.20; STY-20: 65.99 ± 3.22) and latency to death (STY-1: 20 ± 1.72; STY-10: 19.17 ± 1.87; STY-20: 23.83 ± 1.55) in all animals pretreated with STY. In the pilocarpine-induced seizures there was a decrease in the latency to death. After testing the animals, we conducted the dosage of amino acid concentrations (ASP, GLU, GLY, TAU and GABA). PFC increased ASP, TAU and GABA. HC increased GLU, ASP, GLY and GABA. In the strychnine-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, TAU and GABA, while the HC increased ASP, GLY, TAU and GABA. In the bicuculline-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, GLU, GLY, TAU and GABA, while the HC increased ASP, GLU, GLY, TAU and GABA. In the pilocarpine-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, GABA, GLY, while the HC increased only ASP. We concluded that STY presents an anxiolytic effect in behavioral tests and a protective effect in tests of induced seizures by PTZ, strychnine and bicuculline. After the dosage of the amino acids we can demonstrate the involvement of glutamatergic, GABAergic and glycinergic systems. Keywords: Plants, Medicinal. Aniba panurensis. Anxiety. Seizures. Peptidergic Amino Acids.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
± Mais ou menos
% Percentagem
ºC Grau (s) Centígrado (s)
α Alfa
β Beta
γ Gama
5-HT Serotonina
® Marca Registrada
μL Microlitro
μg Micrograma
μg/g Micrograma/grama
μm Micromol/grama
μM Micromolar
ALE Atividade Locomotora
ANOVA Análise de Variância
Cm Centímetro
AMPA propionato de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazole
AMPc Adenosina Monofosfato Cíclico
ASP Aspartato
ATV Área Tegmentar Ventral
Ca2+
Íon Cálcio
CA Cainato
CE Corpo Estriado
Cl -
Íon cloreto
CPF Córtex Pré-frontal
CPFvm Cortex Pré-frontal Ventromedial
CYP Sistema Enzimático P-450
DA Dopamina
D2 Receptor Dopaminérgico do Tipo D2
D3 Receptor Dopaminérgico do Tipo D3
D4 Receptor Dopaminérgico do Tipo D4
DZP Diazepam
EUA Estados Unidos da América
Fe3+
Íon férrico
FLU Flumazenil
G Grama
GABA Ácido Gama-Aminobutírico
GABAA
Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo A
GABAB
Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo B
GABAc Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo C
GLU Glutamato
GLI Glicina
G Gromming
H Hora
HC Hipocampo
HPLC High Perfomance Liquid Chomatography
i.p. Intraperitoneal
K+
Potássio
LCE Labirinto em Cruz Elevado
LTP Potenciação a Longo Prazo
M Molar
MEK-1 Map Quinase
mL/Kg Mililitros/quilograma
mg/kg Miligrama/quilograma
mm Milímetro
mmol/L Milimol/litro
mM Milimol
mL Mililitros
min Minuto
NEBA Número de Entradas nos Braços Abertos
NQ Número de Quedas
P Nível de Significância
PTB Pentobarbital Sódico
nm Namômetros
nmol/min/mg Nanomol/minuto/miligrama
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido Nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
PTZ Pentilenotetrazol
R Rearing
r.p.m Rotações por minuto
SNC Sistema Nervoso Central
SNpc Substância Negra Par Compacta
STY Estiril Pirona
TAU Taurina
TP Tempo de Permanência
TPBA Tempo de Permanência nos Braços
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1 – Esquema do Teste do Campo Aberto ............................................... 59
Esquema 2 – Esquema A e B do teste do Labirinto em Cruz elevado .................... 61
Esquema 3 – Esquema A e B do Teste da Placa perfurada .................................... 62
Esquema 4 – Esquema A e B do teste do Rota Rod ............................................... 64
Esquema 5 – Esquema do teste do tempo de sono induzido por pentobarbital
sódico........................................................................................................................ 65
Esquema 6 – Esquema do teste de indução de convulsão por pentilenotetrazol,
estricnina, bicuculina e pilocarpina ........................................................................... 68
Esquema 7 – Determinação de aminoácidos após os testes de comportamento ... 70
Esquema 8 – Determinação de Aminoácidos após os testes de Convulsão .......... 70
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Laurus nobilis ..........................................................................................23
Figura 2A – Estrutura química da 6-[(E)-esteril-piran-2 – ona] Aniba panurensis ... 26
Figura 2B – Estrutura química da Piper methysticum .............................................. 27
Figura 3A – Aniba parusinensi folhas e frutos .......................................................... 27
Figura 3B – Aniba parusinensi folhas e frutos .......................................................... 28
Figura 4 – Vias Gabeaérgicas .................................................................................. 42
Figura 5 – Receptor GABA-A ................................................................................... 44
Figura 6 – Efeito da STY sobre a atividade exploratória avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos .............................................................................. 73
Figura 7 – Efeito da STY sobre o número de rearing avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos .............................................................................. 73
Figura 8 – Efeito da STY sobre o número de rearing avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos .............................................................................. 74
Figura 9 – Efeitos da STY sobre o número de entradas no braço aberto (NEBA) no
teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ...................................................... 75
Figura 10 – Efeito da STY sobre o tempo de permanencia nos braços abertos
(TPBA) no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ..................................... 76
Figura 11 – Efeito da STY sobre o número de entradas nos braços fechados (NEBF)
no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos .................................................. 77
Figura 12 – Efeito da STY sobre o tempo de permanencia nos braços fechados
(TPBF) no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ..................................... 77
Figura 13 – Efeito da STY sobre o número de mergulhos no teste da placa
perfurada .................................................................................................................. 79
Figura 14 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em córtex pré-frontal de camundongos .............................................. 90
Figura 15 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em hipocampo de camundongos ....................................................... 91
Figura 16 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em corpo estriado de camundongos .................................................. 93
Figura 17 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por PTZ ......... 115
Figura 18 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (18 A) e
inibitórios (18 B) em hipocampo de camundongos após convulsão induzida por
PTZ ......................................................................................................................... 117
Figura 19 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (19 A) e
inibitórios (19 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por
estricnina ................................................................................................................ 119
Figura 20 – Efeitos da STY concentração de aminoácidos excitatórios (20 A)
inibitórios (20 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por
estricnina................................................................................................................. 121
Figura 21 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (21 A)
inibitórios (21 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por
bicuculina................................................................................................................. 123
Figura 22 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (22 A)
inibitórios (22 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por
bicuculina................................................................................................................. 125
Figura 23 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (23 A)
inibitórios (23 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por
pilocarpina............................................................................................................... 127
Figura 24 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (24 A)
inibitórios (24 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por
pilocarpina............................................................................................................... 128
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Descrição das drogas utilizadas ............................................................ 56
Quadro 2 – Descrição dos equipamentos utilizados ................................................ 57
Quadro 3 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas dose de 1 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral (CPF)
hipocampo (HC) corpo estriado (CE) de camundongos ......................................... 139
Quadro 4 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas dose de 1 , 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral
(CPF) hipocampo (HC) de camundongos nos modelos de indução de convulsão por
pentilenotetrazol (PTZ) e estricnina ........................................................................ 140
Quadro 5 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas doses de 1, 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral
(CPF) hipocampo (HC) de camundongos nos modelos de indução de convulsão por
bicuculina e pilocarpina .......................................................................................... 141
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Efeito da STY, flumazenil e diazepam no teste de Rota Rod ................ 80
Tabela 2 – Efeito da administração da STY na latência de sono e duração do sono
induzida por pentobarbital sódico ............................................................................. 81
Tabela 3 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis no modelo
convulsão induzido por PTZ em camundongos ..................................................... 101
Tabela 4 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis no modelo
convulsão induzido por estricnina em camundongos.............................................. 102
Tabela 5 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis no modelo
convulsão induzido por bicuculina em camundongos............................................. 103
Tabela 6 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis no modelo
convulsão induzido por pilocarpina em camundongos ........................................... 104
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 19
1.1 Generalidades ..................................................................................................... 19
1.2 Família Lauraceae .............................................................................................. 21
1.3 Gênero Aniba ....................................................................................................... 24
1.4 Pironas ................................................................................................................. 25
1.5 Ansiedade ............................................................................................................ 29
1.6 Modelos experimentais de ansiedade ............................................................... 32
1.7 Epilepsia: modelos animais de convulsão ........................................................ 34
1.8 Aminoácidos e neurotransmissão ..................................................................... 39
1.9 Áreas cerebrais estudadas ................................................................................. 48
2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA ........................................................................... 53
3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 54
4 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 55
4.1 Planta .................................................................................................................... 55
4.2 Animais ................................................................................................................ 55
4.3 Drogas utilizadas ................................................................................................. 56
4.4 Equipamentos ...................................................................................................... 57
4.5 Preparo das drogas ............................................................................................. 58
4.6 Protocolo de tratamento ..................................................................................... 58
4.7 Testes de comportamento .................................................................................. 58
4.7.1 Teste do Campo Aberto ................................................................................... 58
4.7.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE) ................................................... .60
4.7.3 Teste da placa perfurada ................................................................................. 62
4.7.4 Teste do Rota Rod ........................................................................................... .63
4.7.5 Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital ................................................. .65
4.8 Avaliação da Atividade Anticonvulsivante ........................................................ 66
4.8.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol ....................................... 66
4.8.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricinina ................................................ 66
4.8.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina ................................................ 67
4.8.4 Teste de Convulsão induzida por Pilocarpina ............................................... 67
4.9 Dosagem de Aminoácidos .................................................................................. 69
4.10 Análise Estatística ............................................................................................. 71
5 RESULTADOS ......................................................................................................... 72
5.1 Capítulo I: Efeitos da 6–estéril- 2 -pirona sozinha ou associada com
antagonista benzodiazepínico em testes comportamentais em camundongos .. 72
5.1.1 Teste do Campo Aberto ................................................................................... 72
5.1.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado ............................................................... 74
5.1.3 Teste da Placa perfurada ................................................................................. 78
5.1.4 Teste do Rota Rod ............................................................................................ 79
5.1.5 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico ........................ 81
5.1.6 Discussão ......................................................................................................... 82
5.1.7 Conclusão ......................................................................................................... 88
5.2 Capítulo II: Dosagem de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e
corpo estriado de camundongos tratados de forma aguda com STY após os
testes comportamentais ........................................................................................... 89
5.2.1 Resultados ........................................................................................................ 89
5.2.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal,
hipocampo e corpo estriado de camundongos após tratamento com STY ......... 89
5.2.1.2 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY ................................................................................. 91
5.2.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no corpo estriado de
animais pré-tratados com STY ................................................................................. 92
5.2.2 Discussão ......................................................................................................... 94
5.2.3 Conclusões ...................................................................................................... 100
5.3 CAPITULO III: Efeitos da molécula de STY nos modelos de convulsão
induzidos por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina ................. 101
5.3.1 Resultados ....................................................................................................... 101
5.3.1.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol ................................... 101
5.3.1.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricnina ............................................. 102
5.3.1.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina ............................................ 103
5.3.1.4 Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina ........................................... 104
5.3.2 Discussão ........................................................................................................ 105
5.3.3 Conclusão ........................................................................................................ 113
5.4 CAPITULO IV: Dosagem de aminoácidos no CPF e HC de camundongos
pré-tratados com STY nos modelos de convulsão induzido por PTZ, estricnina,
bicuculina, pilocarpina............................................................................................. 114
5.4.1 Resultados ....................................................................................................... 114
5.4.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
PTZ............................................................................................................................. 114
5.4.1.2 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ .... 116
5.4.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY com em modelo de convulsão induzidas por
estricnina .................................................................................................................. 118
5.4.1.4 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
estricnina .................................................................................................................. 120
5.4.1.5 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
estricnina .................................................................................................................. 122
5.4.1.6 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY comem modelo de convulsão induzidas por
bicuculina .................................................................................................................. 124
5.4.1.7 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY com em modelo de convulsão induzidas por
pilocarpina ................................................................................................................ 126
5.4.1.8 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY comem modelo de convulsão induzidas por
pilocarpina ................................................................................................................ 128
5.4.2 Discussão ........................................................................................................ 129
5.4.3 Conclusão ........................................................................................................ 136
6 CONSIDERAÇÕES FINAS ..................................................................................... 138
7 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 142
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 143
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Generalidades
Plantas medicinais, ao longo dos anos, vêm sendo utilizadas como fonte
de moléculas precursoras para desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta
de novas moléculas de origem vegetal com potencial terapêutico tem despertado
interesse de pesquisadores e da indústria farmacêutica.
Os produtos naturais revelam grande quantidade e diversidade de
moléculas com diferentes propriedades físico-químicas e biológicas. No entanto,
apesar do grande avanço nesta área, apenas cerca de 25 a 30% das plantas foram
avaliadas no que concerne ao potencial medicinal (CALIXTO, 2005; VEIGA-JÚNIOR;
MELLO, 2008). Desta maneira, as plantas medicinais constituem campo bastante
fértil em relação à pesquisa com finalidade de obtenção de novas drogas e
compostos com atividade terapêutica (EVANS, 1996).
Plantas medicinais e seus metabólitos secundários têm sido utilizados na
investigação de funções fisiopatológicas e sítios de ação de fármacos. Inúmeras
classes de diferentes produtos naturais têm sido empregadas como matéria-prima
para síntese de diferentes substâncias bioativas. Com os avanços tecnológicos
ocorridos na indústria química, as moléculas ativas presentes nas plantas medicinais
passaram a ser utilizadas de modo cada vez mais purificado, ao invés de extratos
vegetais, atingindo produção quantitativa e qualitativa em escala industrial
(CALIXTO, 2000; ELVIN-LEWIS, 2001).
O Brasil destaca-se no cenário mundial por sua biodiversidade. Muitas
plantas dos biomas brasileiros, como o Cerrado, a Caatinga, o Pantanal, a Floresta
Amazônica e a Mata Atlântica, têm sido utilizadas como fármacos naturais pelas
populações locais com baixo poder aquisitivo no tratamento de várias doenças,
como esquistossomose, leishmaniose, malárias e infecções fúngicas e bacterianas,
doenças cardíacas, doenças psiquiátricas, câncer, dores e cicatrizações
(ALBUQUERQUE; OLIVEIRA, 2007).
No Brasil, estudos clínicos têm demonstrado os benefícios das plantas no
tratamento de doenças que comprometem o SNC, citam-se alguns exemplos de
20
sucessos terapêuticos, como Valmane® ou Valeriane®, à base de um extrato
padronizado de Valeriana officinalis; Tebonin®, Tanakan®, Kiadon®, Equitan® ou
Ginkoba®, a base de extrato de Ginkgobiloba; Laytan® ou Kawa-kawa®, extratos
padronizados de Piper methysticum; Hyperico®, Iperisan®, Börnin®, Fiotan®,
Jarsin® ou Hiperex®, extratos padronizados de Hypericumperforatum (DUARTE,
2007).
Diante da importância do uso de plantas medicinais, pesquisadores da
Assembleia Mundial da Saúde vêm discutindo questões, com resoluções,
destacando os seguintes pontos: a maioria das populações, em vários países em
desenvolvimento, depende da medicina tradicional para cuidados primários de
saúde; a força de trabalho, representada pelos adeptos e praticantes da medicina
tradicional, é potencialmente significativa para os serviços de saúde; as plantas
medicinais são de grande importância para saúde individual e das comunidades
(BRASIL, 2004; CARVALHO et al., 2007).
Os medicamentos industrializados produzidos beneficiam parcela
pequena da população, pois o custo, muitas vezes, inviabiliza o tratamento, fazendo
com que vias alternativas e de menores custos sejam utilizadas. Por outro lado, a
desinformação e o mau uso das plantas medicinais geralmente provocam o
aparecimento de reações colaterais graves ou então o insucesso no tratamento,
causando descrença na sua eficácia (CARVALHO, 2001). Considera-se planta
medicinal aquela planta administrada sob qualquer forma e por alguma via ao
homem, exercendo algum tipo de ação farmacológica (FOGLIO et al., 2006).
Nesse contexto social que os produtos naturais, em particular as plantas
medicinais, adquirem grande relevância como agentes terapêuticos e, como tais,
devem ser considerados e analisados. Todavia, o uso popular e mesmo tradicional
não são suficientes para validar científica e eticamente as plantas medicinais como
medicamentos eficazes e seguros. Neste sentido, as plantas medicinais não se
diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e sua preconização ou a
autorização oficial do seu uso medicamentoso devem ser fundamentadas em
evidências experimentais, comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles
que as utilizam é suplantado pelos benefícios que possam advir (VIANA et al.,1998;
BANDEIRA et al., 2002).
21
Parte das plantas nativas brasileiras ainda não possui estudos e são
usadas de forma empírica, sem respaldo científico quanto à eficácia e segurança.
Em um país como o Brasil, com enorme biodiversidade, existe grande lacuna entre a
oferta de plantas e as poucas pesquisas, o que sugere que ainda existe quantidade
considerável de moléculas a serem descobertas oriundas do reino vegetal (FOGLIO
et al., 2006).
Na região Nordeste, o estudo do uso tradicional das plantas e dos seus
produtos tem aumentado gradualmente durante os últimos anos e resultou em
significativo número de publicações nessa área. A região é reconhecida por sua
biodiversidade, principalmente com relação a plantas, e abrange desde a floresta
Amazônica, Mata Atlântica, sistema de mangues e dunas costeiras, até florestas
secas e savanas, sendo o principal ecossistema do Nordeste do Brasil o bioma
―caatinga‖ (AGRA et al., 2007).
Aniba panurensis é uma planta encontrada no Norte e em parte do
Nordeste do Brasil e faz parte da família Lauraceae, que tem várias substâncias
ativas com atividade biológica. Espécies da Aniba panurensis têm demonstrado
ação tóxica para fungos e bactérias (OGER et al., 1994; HAMMER et al., 1999).
Barbosa et al. (1988) demonstram que os extratos hexânicos e clorofórmicos dos
cálices e frutos de Aniba riparia e dos cálices de Aniba SP mostraram atividade
contra S. aureus, B. cereuse C albicans., sendo inativos contra Proteussp, S.
sallinarum e E. coli. Alguns estratos de plantas tropicais do gênero Aniba mostraram
toxicidade para raças resistentes ao AZOLE de C. albicans (KLAUSMEYER et al.,
2004).
1.2 Família Lauraceae
A família Lauracea tem sido alvo de pesquisas nos últimos anos, devido à
diversidade, sendo representada por mais de 2000-2500 espécies em 52 gêneros,
encontrados principalmente na Amazônia, America, Ásia Tropical, Austrália,
Madagascar e em pequena proporção no Sul da África (ROHWER, 1993). O gênero
inclui Persea (150spp.), Ocotea (300-400 spp.), Cinnamomum (250 spp.), Aniba (40
22
spp.), Litsea (400 spp.), Neolitsea (80 spp.), Lindera (100 spp.), Laurus (2 spp.) e
Cryptocarya (200-250 spp.) (EVANS, 1996).
No Brasil, as lauráceas apresentam ampla distribuição, sendo
encontradas nas restingas do litoral, nos cerrados e nas matas em geral. As
espécies desta família possuem importância econômica devido à produção de óleos
essenciais, utilizados como medicamentos e condimentos, além da qualidade e
aceitação de suas madeiras, aplicadas em diversos fins (CZARNESKI et al., 2001).
As árvores e os arbustos da família Lauraceae são geralmente aromáticos
monóicos, dioicos, ou gimnodioicos, sendo que o gênero cassita se apresenta como
produtor de espécies de trepadeiras (BARROSO, 2002). Encontrados nas florestas
tropicais e subtropicais com casca, folhas verdese frutos. A distribuição das espécies
arbóreas depende de fatores como habitat, a regeneração dos nichos ecológicos e
as variações fenomenológicas para manutenção das espécies (SRI-NGERNYUANG,
2003).
As Lauraceaes destacam-se entre as demais famílias pela importância
econômica. Muitas espécies têm sido utilizadas pelas indústrias para fabricação de
diversos produtos em marcenaria e construção, na indústria da perfumaria e química
e medicina popular. As espécies utilizadas na culinária são a Persea americana Mill,
fruto conhecido como abacate, que apresenta alto valor comestível da sua polpa,
além do Laurusnobilis L., que possui folhas usadas como tempero (MARQUES,
2001-2011).
O nome da família Lauraceae deriva de lauer que significa ―verde‖ e laus
―louvor‖, em alusão a coroar ou cingir de louros (Figura1), pois a folha de
Laurusnobilis, o loureiro, era utilizada para confecção de coroas, para homenagear
guerreiros e atletas vitoriosos.
23
Figura 1 – Laurusnobilis
Fonte: Antica Erboristeria Romana
A Lauraceae é uma das famílias mais importantes e mais difíceis na
identificação botânica de suas espécies. Sua prospecção química revela, em
algumas espécies, a presença de compostos como neolignanas, sesquiterpenos,
flavonóides e taninos, pironas classes de metabólitos especiais com atividades
biológicas já relatadas, como antioxidantes, substâncias envolvidas na prevenção do
desenvolvimento de patologias e no retardamento do envelhecimento celular
(CAVALHEIRO; YOSHIDA, 2000; CIESLIK; GRE; ADAMUS, 2006; BATISTA et al.,
2010).
24
1.3 Gênero Aniba
O estudo botânico do gênero Aniba (família Lauracea), iniciado no século
passado, revelou dois grupos que despertaram interesse entre os pesquisadores,
tanto do ponto de vista químico como farmacológico. O primeiro grupo contendo as
2-pironas de ocorrência natural (GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB, KUBITKI, 1981). O
segundo grupo contendo neolignanas (GOTTLIEB, 1977; GOTTLIEB, 1960).
Estudos realizados trazem outras classes de substâncias, como os arilpropanoides,
ésteres de ácido benzoico, flavonoides, benzofenonas, 1-nitro—2-feniletano
(MANDARINO, 1985). Metabólitos secundários são considerados de interesse
fitoquímico (GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).
Outras espécies do gênero Aniba canellilla são importantes fornecedoras
de óleos voláteis, valiosos na indústria química (MORAES et al., 1972; SILVA et
al.,2007). Dentre elas, destaca-se Aniba rosaeodora Ducke, cujo óleo, rico em
linalol, alcança alto valor na indústria de perfumaria (DUCKE, 1938, MAIA et al.,
2007). Algumas espécies desse gênero também têm sido frequentemente referidas
como medicinais, como A. canellita (H.B.K) Mez (SILVA et al., 2007; LIMA et al.,
2008), A. duckeiKosterm. E A. hostmanniana (Nees) Mez, todas com atividade
experimentalmente comprovada contra o ancilostomídeo humano (GOULART et al.,
1975), além de A. riparia (Nees) Mez, típica da região Amazônica, cujo extrato
obtido dos frutos e cálices persistentes possui atividade antimicrobiana (BARBOSA
et al., 1987,1988).
As espécies pertencentes ao gênero Aniba são de difícil identificação,
pois se consideram apenas os caracteres morfológicos, principalmente vegetativos,
devido à extrema semelhança entre elas (MARQUES; AZEVEDO, 2011).
Os primeiros isolamentos de 2-pirona ocorreram a partir das raízes de
Piper methysticum Forst, conhecida como cava ou cava-cava. Ressalta-se que esta
foi a primeira 2-pirona natural isolada no século passado. As raízes de Piper
methysticum Forsteram utilizadas pelos nativos da Polinésia no preparo de uma
bebida, que ingerida durante festas e rituais causavam efeito estimulante, e quando
as raízes e o caule eram mastigados, obtinha-se um efeito narcótico (MANDARINO,
1985; MORS et al., 1962).
25
Em ensaios clínicos realizados, obtiveram-se novas atividades
farmacológicas sobre as 2-pironas de Piper methysticum (cava-pironas), entre elas
proteção aos ratos contra convulsões e mortes causadas por doses tóxicas de
estricnina, atividades anti-inflamatória, antipirética, espasmolítica, antitetânica e
antifibrilatoria, antifúngica e anticarcinogênica (MANDARIM, 1985; BARBOSA et al.,
1988; ALCANTARA et al., 2010). As Cumarinas são compostas por anéis de
benzeno fundido e α-pirona e apresenta atividade anti-inflamatória, antioxidante,
antibacteriana, antiviral, antitrombótica, antimutagênica e vasodilatadora (HOULT;
PAYÁ, 1996; PAYA et al., 1992).
O grande interesse apresentado pelo grupo do Prof. Klaus, de pesquisa
de produtos naturais, deve-se à ocorrência de pironas naturais, encontradas em
espécies do gênero Aniba, que pertence à família Lauraceae, da qual o Brasil é rico
em representantes. Na família Lauraceae, os derivados de 2-pironas ocorrem em
quase todas as espécies de Aniba e desde há muito vêm sendo usados como
marcadores quimiossistematicos. No entanto, em poucas espécies do gênero Aniba,
como Aniba burohellie Aniba guianensis, tais compostos não foram isolados, sendo
que nestas espécies foi isolado neolignanas (MANDARINO, 1985).
1.4 Pironas
O anel piran-2-ona consiste em um éster cíclico de seis átomos com
propriedades físicas remanescentes de alquenos e aromáticos. O composto é
intermediário-chave na síntese de metabólitos, o mesmo se relaciona ao sistema de
defesa contra outros microorganismos, sendo encontrado em bactérias, plantas,
insetos e animais (MCGLACKEN; FAIRLAMB, 2005; ROSA et al., 2007).
Enquanto o papel natural desta pequena molécula de pirona ainda não é
conhecido, várias atividades biológicas e funções ecológicas têm sido associadas a
este complexo metabólito. A piran-2-ona encontra-se presente em um grande
número de compostos com atividade biológica, como antibióticos, antifúngicos,
neurotóxicos, citotóxicos, anti-HIV, antioxidante (MORA et al., 2007; ROSA et al.,
2007; LI et al., 2009; GUO et al., 2009; VALENTE, 2010).
26
As 2-pironas aromáticas derivam da rota dos policetídeos, sendo que os
precursores são os ácidos benzóicos, que conduzem aos 6-aril derivados, ou os
ácidos cinâmicos, que conduzem aos 6-estiril derivados e a seus derivados
reduzidos (MANDARINO, 1985).
Estudos recentes sobre análise por cromatografia, em fase gasosa com
detectores de ionização de chama (CG-DIC) e de espectrometria de massas (CG-
EM), possibilitou a determinação da composição química dos óleos essenciais
obtidos do caule e folhas da Aniba. No óleo essencial das folhas de A. panurensis,
foram detectados principalmente os hidrocarbonetos sesquiterpênicos b-cariofileno
(33,5%), germacreno-D (25,4%), a-copaeno (7,5%) e b-bourboneno (7,1%). A
somatória dos demais terpenos encontrados neste óleo equivale a menos de 10%
da sua composição total (ALCANTARA et al., 2010).
A 6-[(E)-esteril- piran-2 –ona] (STY), isolada da Aniba panurensis,
apresenta estrutura semelhante aos componentes químicos das kavalcatones
encontrados nakava-kava (Figuras 2A e 2B).
Figura 2A – Estrutura quimicada 6-[(E)-esteril-piran-2 – ona]
Aniba panurensis
O O
Fonte: Barbosa Filho, 1986.
27
Figura 2B – Estrutura química da Piper methysticum
Fonte: Mandarino (1985).
As folhas e os caules das espécies A. panurensis (Meisn.) Mez (registro:
1276) apresentam papilas que são projeções digitiformes na epiderme da face
inferior das folhas (Figura 3A). Dos frutos de Aniba panurensis (Figura 3B), foi
identificada pirona natural, a 6-[(E)-esteril- piran- 2 – ona], com peso molecular de
198 (BARBOSA-FILHO, 1986).
Figura 3A – Aniba parusinensi folhas e frutos
28
Figura 3B – Aniba parusinensi folhas e frutos
Fonte: KEW (Royal Botanic Gardens)
A busca por novas estruturas metabólicas obtidos de pironas naturais,
como os policetídeos, que atuam na biossíntese do Streptomyces, tem sido alvo de
pesquisa com o desenvolvimento de novos modelos de processo enzimáticos que
possam ser empregados na produção de agentes antitumorais e antifúngicos
(BUSCH; HERTWECK, 2009). Culturas de Polyporus hispidus, uso em meio líquido
com glicose, utilizadas como fonte de carbono, produzem pigmento amarelo (4-
hidroxi-6 (3,4-dihidroxiestéril – 2 – pirona ) que têm ação inibitória sobre a isofarma b
da proteína C kinase (GONINDARD et al., 1997) e ação antiviral (LI et al., 2009;
AWADH et al., 2003).
Estudos mostram atividades biológicas das várias espécies do gênero
Aniba, como efeitos antidepressivos e ansiolíticos (MELO, 2006; SOUSA et al, 2004,
2007) da Aniba riparia que apresenta como constituinte uma riparina II ou III; os
efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Aniba canelilla (LAHLOU et al., 2005);
atividade antibiótica da Aniba riparia contra fungo (Cândida albicans), bactérias
gram-negativas (Klebsiela pneunonae) e gram-positivos (Sthaphylococcus aureus e
29
bacilos cereus) (OGER et al., 1994; HAMMER et al., 1999; MARQUES, 2001);
Aniba panurensis, como objeto de estudo, tem publicações sobre a atividade
antimicrobiana na Candida albicans (KLAUSMEYER et al., 2004); ação
vasorelaxante em aorta de ratos (ASSI, 2007); efeitos ansiolíticos mediados
possivelmente por recerptor GABA (CHAVES et al., 2009); ação protetora no modelo
de convulsão por PTZ (CHAVES et al., 2011); efeito antioxidante e ação sobre
agregação plaquetária (ALCÂNTARA et al., 2010).
Apesar de poucos estudos realizados acerca das atividades centrais das
pironas, é importante que seja investigada quanto ao seu potencial no tratamento de
doenças relacionadas ao SNC.
1.5 Ansiedade
A ansiedade é uma condição clínica diagnosticada e avaliada
principalmente pelo relato dos clientes que buscam atendimento nos serviços de
saúde. É um tipo de emoção vivenciada pelo ser humano ao longo de sua vida. É
um fenômeno emocional comum e útil aos seres humanos, sem o qual estaríamos
vulneráveis aos perigos e ao desconhecido, funcionando com valor adaptativo frente
às alterações do meio ambiente que nos cerca (GRAEFF et al., 1999; GRAEFF,
2007).
A ansiedade foi positivamente selecionada ao longo do processo
evolutivo, estando presente não apenas em humanos, mas, possivelmente, também
nas demais espécies demamíferos, bem como em escalas filogenéticas mais antigas
de vertebrados (LEDOUX, 1995).
Segundo os critérios do Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders (DMS-IV-TR), a ansiedade generalizada é caracterizada por preocupação
excessiva e tensão contínua durante os vários eventos diários da vida, com duração
de, pelo menos, seis meses, e incapacidade em controlar estes sentimentos. A
condição vem acompanhada por, no mínimo, três ou mais sintomas adicionais, que
podem ser psíquicos, como agitação, dificuldade de concentração, irritabilidade, ou
somáticos, incluindo fadiga, tensão muscular e distúrbios do sono (DSM-IV-TR,
American Psychiatric Association, 2002; STAHL, 2010).
30
A ansiedade na sua forma patológica parece depender da interação entre
predisposição e fatores ambientais, incluindo-se os de natureza sociocultural e
situacional (DUARTE, 2007). A predisposição é, em parte, determinada
geneticamente, sofrendo influências de experiências marcantes durante o
desenvolvimento e do meio ambiente (CUTIN et al., 2003).
Os transtornos de ansiedade generalizada (TAG) são considerados os
mais frequentes entre as doenças psiquiátricas, com ansiedade generalizada,
representando a patologia mais comum nos indivíduos atendidos nos serviços de
saúde (WITTCHEN et al., 2002). O medo pode ser definido como reação a uma
situação perigosa real, visto por vários autores como entidade independente da
ansiedade. Embora, por vezes, pode ser difícil separação entre as duas (BELZUNG;
GRIEBEL, 2001).
Estudos mostram que 25% dos adultos estão predispostos a desenvolver
uma das seis formas de transtornos, como o de ansiedade, o de pânico, ansiedade
generalizada, ansiedade social, estresse pós-traumático e transtorno obsessivo
compulsivo, responsáveis pela alta morbidade e pelo impacto financeiro decorrente
da improdutividade dos pacientes (GORDON; HEN, 2004; KESSLER et al., 2005).
Nos países da Europa, os estudos epidemiológicos em populações na
faixa etária entre 18 e 65 anos, estimaram prevalência para ansiedade generalizada
em 1,5 % ao ano e 5,1 % ao longo da vida, sendo duas vezes mais frequente em
mulheres do que em homens (BALDWIN et al., 2005; KINRYS; WYGANT, 2005;
WITTCHEH; JACOB, 2005). Ainda não se compreende a causa que leva às
mulheres a terem maior risco de desenvolverem transtorno de ansiedade ao longo
da vida. Relativamente, poucos estudos investigaram se as características das
mulheres com transtornos de ansiedade diferem das dos homens com os mesmos
transtornos (KINRYS; WYGAN, 2005).
Nos Estados Unidos, americanos adultos são acometidos por esta
psicopatologia nas proporções de 2,1 % ao ano e 4,1 % ao longo da vida (GRANT et
al., 2005). No Brasil, a estimativa de prevalência foi nos transtornos de ansiedade
(TA), em crianças foi de 4,8% e adolescentes 5,8% (VIANNA; CAMPOS;
LANDEIRA-FERNANDEZ, 2010).
31
As taxas de prevalência ao longo da vida para transtorno de ansiedade
generalizada (TAG) são de aproximadamente 5,7%. Entre as mulheres com mais de
40 anos de idade, esse valor chega a quase 10%. O início das manifestações às
vezes ocorre precocemente, como também é mais comum a partir da metade até a
fase tardia da idade adulta, sendo observado aumento significativo da incidência na
faixa etária dos 35 aos 45 anos. O TAG é o transtorno de ansiedade mais comum
entre idosos (KUTZ, 2010; DYMOND, 2009; KESSLER et al., 2005).
Embora a fisiopatologia dos transtornos de ansiedade, ainda não estarem
totalmente elucidadas, existem possíveis mecanismos relacionados que são citados,
como o fluxo sanguíneo cerebral na região frontal, parietal, temporal e áreas do
cingulado; metabolismo na região frontal, temporal, parietal, cerebelo, tálamo,
sistema límbico e gânglios basais; alteração nos neurotransmissores GABA,
noradrenalina e serotonina e o sistema neuroendócrino (GRAEFF, 2007).
A participação dos receptores 5HT2 (B e C) do sistema nervoso central
(córtex frontal, gânglios da base e sistema límbico – hipotálamo, septo, amígdala,
cerebelo e MCP) é responsável pela regulação dos transtornos de humor e
ansiedade. Estudos apontam para o fato da ativação destes receptores promoverem
efeito ansiolítico na amígdala medial e ansiogênico no hipocampo dorsal (MENARD;
TREIT, 1999) e hipocampo ventral (FACHINNI et al., 2004). Assim, tem sido
sugerido que a 5-HT possui papel dual na regulação das respostas defensivas.
Os benzodiazepínicos (BZD) são as classes de medicamentos
tradicionalmente utilizadas no tratamento dos transtornos de ansiedade, por
exercerefeito rápido, aumentando a sinalização GABA-A no cérebro. O mecanismo
de ação do BZD consiste na ligação deste ao canal iônico de cloreto no SNC,
receptor GABAérgico, que inibe a atividade neuronal, pelo aumento do influxo de
íon cloreto nos neurônios, hiperpolarizando a célula nervosa, resultando nos efeitos
inibitórios (FLIGHT, 2010; ROSENBAUM, 2005).
Os pacientes que necessitam de tratamento com BZD, são submetidos à
terapêutica em longo prazo. O uso dos BDZ pode causar efeitos relacionados a este
receptor, como sedação e indução do sono, redução da agressão e ansiedade,
redução do tônus muscular e da coordenação motora, ação anticonvulsivante,
32
amnésia anterógrada e tolerância e dependência (SCHMITT; KAPCZINSKI, 2004;
RANG et al., 2007).
Outros medicamentos, como os antidepressivos, passaram a ser
utilizados para o tratamento da ansiedade, como os inibidores da recaptação das
monoaminas: noradrenalina e/ou serotonina. Todavia, esses fármacos têm se
mostrado muito eficazes e com boa tolerabilidade, porém levam de quatro a oito
semanas para apresentar resultados (SCHMITT; KAPCZINSKI, 2004). Ressalta-se
que a maioria desses fármacos ADT (somente os tricíclicos) apresentam importantes
efeitos colaterais como boca seca, visão turva, constipação e retenção urinária,
podendo limitar o seu uso em alguns pacientes (BALLENGER, 2001).
Com o desenvolvimento de novas linhas de pesquisas nos últimos anos
com plantas medicinais, novas moléculas têm sido identificadas como potenciais
para produção de novas drogas, capazes de se ligarem no receptor GABA-A
(JOHNSTON; BEART, 2004; KAVVADIAS et al., 2004; BAUR et al., 2005; DUARTE,
2007). Entre os diferentes sítios alostéricos presentes neste receptor, um dos mais
estudados intensivamente e que apresenta maior importância clínica é o sítio BDZ
(HANSON; CZAJKOWSKI, 2008; SANCAR; CZAJKOWSKI, 2011). O receptor GABA
possui sítio de ligação para os anticonvulsivntes (barbitúricos), ansiogênicos (β-
carbolinas) e agentes convulsantes (picrotoxina) (MACDERMOTT et al., 1999).
A procura por medicamentos de origem vegetal, produzidos a partir de
moléculas para tratar doenças que atingem o SNC, como ansiedade e epilepsia, que
comprometem sujeitos na fase produtiva, têm impulsionado pesquisadores a estudar
compostos biologicamente ativos, que apresentem menor número de efeitos
colaterais.
1.6 Modelos experimentais de ansiedade
Os modelos animais de ansiedade têm sido utilizados para avaliar
comportamentos bem esclarecidos na literatura e permitem também delinear
mecanismos neuroquímicos envolvidos nos transtornos de ansiedade, como
metabólitos de hormônios e neurotransmissores. Além disso, estudo de tecidos
encefálicos, pelo uso de marcadores específicos e testes de compostos, para fins
33
farmacológicos assumem grande importância quando se faz a homologia entre
animais de laboratório e humano. Apesar da relação entre estes modelos e os
transtornos de ansiedade em humanos não está totalmente elucidada. Sabe-se, que
as chances de reproduzir nos modelos animais todos os sintomas desencadeados
no humano são muito pequenas, o porquê estes modelos não acessam o mesmo
fenômeno psicobiológico, pois a ansiedade é fenômeno humano subjetivo. No
entanto, respostas fisiológicas e comportamentais semelhantes têm sido descritas
em diversas espécies animais (GROSS; HEN, 2004).
Modelos animais de ansiedade podem ser induzidos, pela simples
exposição do animal, a um novo ambiente ou estímulo, comportamentos de medo ou
defensivos, comparáveis a manifestações ansiosas em indivíduos com transtornos
de ansiedade. Os modelos usualmente utilizados na avaliação de propriedades
ansiolíticas de drogas incluem tanto os que confrontam roedores com novos
ambientes ou os que envolvem o uso de estímulos nocivos, como choque elétrico ou
drogas ansiogênicas (BELZUNG; LE PAPE, 1994; VASCONCELOS, 2003;
ALMEIDA, 2006).
Para um teste comportamental ser validado, em modelo animal, é
necessário que permita quantificar respostas que variem de maneira previsível pela
ação de drogas com reconhecidas propriedades ansiolíticas ou ansiogênicas em
humanos (OHL, 2003). A descoberta do primeiro benzodiazepínico
(clordiazepóxido), que apresentava grande eficácia em termos ansiolíticos,
possibilitou nova área na pesquisa da ansiedade, pois, a partir de então, os modelos
animais puderam ter melhor validação farmacológica. Esses modelos foram
desenvolvidos com dois objetivos principais: primeiro para se avaliar os efeitos
ansiolíticos ou ansiogênicos de determinados compostos e identificar seus
mecanismos de ação (FILE et al., 1993; FILE, 2001; RODGERS, 1992; RODGERS
et al., 1997).
Os modelos mais utilizados são Labirinto em Cruz Elevado (LCE); o
Campo Aberto (CA), placa perfurada e a Caixa de Movimentação Espontânea
(CME). Os animais são submetidos a situações ansiogênicas e às drogas
ansiolíticas em doses compatíveis in vivo com aquelas necessárias ao tratamento
clínico humano e, desta forma, torna-se possível observar o fenômeno da ansiedade
no animal, a fim de validar os chamados modelos experimentais.
34
Um dos modelos mais largamente utilizados na pesquisa da ansiedade
em ratos e camundongos é o Labirinto em Cruz Elevado, baseado em respostas
incondicionadas a ambientes potencialmente perigosos. Derivou do trabalho de
Montgomery (1958) e a premissa básica é que ambientes novos evocam curiosidade
e medo, criando, desta forma, um típico conflito de aproximação/esquiva. Este autor
constatou ainda que ratos apresentassem alto grau de exploração de espaços
fechados em comparação aos abertos e em uma chance de escolha como em um
labirinto em Y, preferiam consistentemente os braços fechados (RODGERS, 1992;
RODGERS et al., 1997; RAMOS et al.,1998, 2008). Em estudo, Montgomery (1958)
interpretou a aversão aos braços abertos como gerado pela neofobia, ―medo da
novidade‖, que induziria aversão e curiosidade, pela elevação do braço aberto.
No LCE, os estudos constataram que drogas ansiolíticas, como
diazepam, aumentavam a proporção entre entradas nos braços abertos e o total de
entradas, ao passo que agentes ansiogênicos diminuem o tempo gasto embraços
abertos (PELLOW et al.,1895).
1.7 Epilepsia: modelos animais de convulsão
A epilepsia é um distúrbio no funcionamento cerebral caracterizado pela
presença de convulsões recorrentes e não previsíveis. A prevalência na população
em geral é aproximadamente 1% (STAHL, 2010). O local da descarga anômala pode
se disseminar para outras áreas do cérebro. Os sintomas produzidos dependem da
função da região do cérebro afetada. Desta forma, o envolvimento do córtex motor
causa convulsão; o envolvimento do hipotálamo causa descarga autônoma periférica
e o envolvimento da formação reticular na parte alta do tronco encefálico ocasiona a
perda de consciência (RANG et al., 2007).
As descargas anormais podem ser produzidas por diversos fatores em
algumas áreas cerebrais, em decorrência dos desequilíbrios dos neurotransmissores
(monoaminas, aminoácidos e peptídeos) (MICHOTTE, 2000), pelo envolvimento dos
sistemas de segundos mensageiros (AMPc, DAG, IP3), por desordens no
metabolismo dos carboidratos, dos aminoácidos e lipídios, por infecções,
intoxicações, tumores ou traumas encefálicos ou pela elevação da temperatura
corporal (LOSCHER, 2002).
35
A epilepsia é uma desordem neurológica crônica comum e caracterizada
por crises convulsivas recorrentes não provocadas. Episódios únicos de crise
generalizada podem ocorrer em um indivíduo normal, e não caracterizam a
epilepsia, uma vez que reações como estresse fisiológico, privação do sono, efeito
do álcool ou drogas ou, ainda, traumatismo cranioencefálico podem ser
responsáveis por esses eventos. Todavia, processos infecciosos, tóxicos ou
metabólicos podem originar crises epilépticas recidivantes e limitadas, em indivíduos
com limiar reduzido, hereditário, sem síndrome epiléptica (LÖSCHER, 1998, 2002).
O envolvimento do L-glutamato e GABA nas epilepsias tem sido
demonstrado nos estudos extensamente. O aumento da atividade excitatória,
particularmente mediada pelo glutamato em seus receptores do tipo N-metil-D-
aspartato (NMDA), é importante na etiogênese das epilepsias ao longo dos anos
(BRADFORD, 1995). A neurotransmissão gabaérgica na patogenia das epilepsias
tem como hipótese a alteração do sistema inibitório, com redução da atividade
GABAérgica, e aumento da atividade excitatória, especialmente mediada pelo
glutamato (BRADFORD; DODD, 1976; MELDRUM, 1975).
A classificação atual define duas categorias principais de epilepsia, sendo
as crises parciais e as generalizadas. Levam-se em consideração as manifestações,
características clínicas, recorrência das crises, hereditariedade, causa alterações no
eletroencefalograma e início das crises epilépticas (GUYTON, 2006).
A fisiopatologia da epilepsia ainda não está totalmente elucidada. A
epilepsia do lobo temporal humano é uma desordem crônica, frequentemente
associada a um estímulo inicial precipitante, como estado epiléptico, trauma e
convulsões febris prolongadas (GUYTON, 2006). É um dos distúrbios neurológicos
mais comuns, apresentando taxa de prevalência de 1% (BANERJEE; HAUSER,
2008).
A epilepsia do lobo temporal é o tipo mais frequente, sendo responsável
por aproximadamente 40 a 60% das epilepsias nos adultos. Em decorrência da alta
prevalência e refratariedade ao tratamento medicamentoso, é uma das síndromes
neurológicas mais estudadas (ENGLER et al., 2004a). As áreas cerebrais que
apresentam maior perda neuronal são: hipocampo, corpo estriado, amígdala, córtex
piriforme e entorrial, septum lateral, tálamo e substância nigra. As sequelas mais
36
comuns compreendem os déficits neurológicos permanentes e a disfunção
intelectual.
O desenvolvimento de novas drogas antiepilepticas com potencial
terapêutico deve-se à pesquisa em neurociências, todavia, estes medicamentos
muitas vezes não conseguem controlar completamente as crises epilépticas,
tornando o indivíduo muitas vezes incapacitado para realizar atividades do seu
cotidiano.
Os mecanismos responsáveis pela resistência clínica aos medicamentos
não são totalmente elucidados, podem incluir a insensibilidade do sítio de ação do
fármaco, falha do fármaco em alcançar algumas regiões do cérebro,
desenvolvimento de tolerância ou presença deproteínas droga-resistentes
(STABLES et al., 2002).
A primeira geração de fármacos ainda é utilizada na clínica, foram
desenvovlvidos e introduzidos entre 1910 e 1980, como a fenitoína, carbamazepina,
valproato, benzodiazepínicos, etosuximida, fenobarbital e primidona. A segunda
geração foi introduzida em 1980 até o momento atual, incluindo a lamotrigina,
felbamato, oxcarbazepina, vigabatrina, tiagabina, topiramato, gabapentina,
zonisamida e levetiracetam (LÖSCHER, 1998; LÖSCHER; LEPPIK, 2002;
GUERREIRO, 2006). Em 2005, foi aprovada a pregabalina e, atualmente, ressalta-
se o desenvovlvimento de outros fármacos que estão em fase de estudo pré-clínico
e/ou clínico que comporão a terceira geração de drogas antiepilépticas
(GUERREIRO, 2006; CARLINI; MENDES, 2011).
Os modelos animais de convulsão são utilizados para estudar o
envolvimento dos sistemas de neurotransmissores como moduladores da
epileptogênese, além de permitir observar as alterações comportamentais,
histológicas, e outros parâmetros neuroquímicos relacionados com atividade
epiléptica. A estimulação de determinadas áreas cerebrais produz respostas
diferentes, afetando o comportamento animal, podendo induzir processos
patológicos, tais como a epilepsia (FREITAS et al., 2003).
Ao longo dos anos, o modelo da pilocarpina e o modelo do ácido caínico,
foram os mais utilizados, desde a década de 1980, pois ambos replicaram
características fenomenológicas das epilepsias humanas do lobo temporal (TURSKI
37
et al., 1983, 1989). Administração de ácido caínico e ou pilocarpina em altas doses
produz uma crise comportamental que é acompanhada por lesão cerebral muito
semelhante ao da epilepsia do lobo temporal, sendo essa administração
intraventricular (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008).
A pilocarpina é bastante utilizada no modelo de convulsão induzido em
animais para estudar a fisiopatologia do processo convulsivo, uma vez que reproduz
as alterações comportamentais e eletroencefalográficas que são semelhantes à
epilepsia do lobo temporal de humanos (BEM-ARI et al., 1985), além de permitir o
estudo dos neurotransmissores como moduladores da epileptogênese, observar
alterações comportamentais, histopatológicas, e outros parâmetros neuroquímicos
relacionados com a atividade epiléptica (COSTA-LOTUFO et al., 2002; FREITAS,
2008).
Nas últimas décadas, a pesquisa com modelos animais tem posibilitado a
identificação dos mecanismos etiopatológicos, eletroencefalográficos e
farmacológicos de substâncias ou moléculas biologicamente ativas.
O Pentilenotetrazol (PTZ) é uma das principais substâncias indutoras de
convulsão em modelos animais, tem sido utilizada na triagem pré-clínica de novos
fármacos anticonvulsivantes, podendo ser utilizada como modelo de crises
generalizadas do tipo ausência ou mioclônicas como de crises tônico-clônicas
(QUINTANS-JÚNIOR; MELLO, 2006; SMITH et al., 2007). O PTZ atua induzindo
convulsões por inibir os canaisde íon cloreto associados aos receptores GABA-A
(LÖSCHER, 1998).
A gravidade dos eventos comportamentais após a infusão de PTZ
depende da dose administrada e da via. Após administração sistêmica i.v. ou i.p.
observa-se abalosmioclônicos, que se tornam contínuos, podendo levar a crises
tônico-clônicasgeneralizadas (FISHER, 1998; JAIN et al., 2011). As crises motoras
clônicas podem ser denominadas crises mínimas, e as generalizadas tônico-
clônicas, crises máximas (VELISEK et al., 1992).
Outro modelo utilizado de indução de convulsão é o da estricnina. A
estricnina é um alcaloide natural, de núcleo indilomonoterpénico, obtido a partir das
sementes secas de Strychnos nux-vomicaum. Esta substância pode apresentar-se
sob a forma de cristais ou pó cristalino, não possui cor nem cheiro, todavia o sabor
38
amargo pode ser detectado em pequenas quantidades (BERNY, 2007;
MARKAROVSKY, 2008). Atua como antagonista competitivo dos receptores de
glicina localizados na medula espinhal, promovendo a diminuição dos efeitos
inibitórios da glicina sobre o SNC, resultando em uma crise convulsiva intensa,
levando geralmente ao óbito (GODMAN; GILMAN, 2012).
Entre as drogas com ação convulsivante, destacam-se as que são
antagonistas do receptor GABA. As duas substâncias clássicas são a bicuculina e a
picrotoxina que atuam por mecanismos diferentes. A bicuculina atua como
antagonista direta do recptor de GABA, enquanto a picrotoxina atua como
antagonista não competitivo de receptor GABAérgico junto com o PTZ pelo fato
dessas substâncias bloquearem os canais de cloreto (UENO et al., 1997;
MACDERMOTT; ROLE; SIEGELBAUM, 1999).
Como descrito, a bicuculina (um antagonista competitivo do receptor
GABA) reduz a frequência e o tempo médio de abertura do canal do íon cloro
(DELOREY; OLSEN, 1994). Após sua administração, as crises iniciam-se com
movimentos generalizados mioclônicos, estendendo-se, em breves segundos, a
espasmos flexores generalizados (TREIMAN; HEINEMANN, 1997).
Ressalta-se que, dependendo da concentração, a bicuculina pode ou não
causar convulsão nos animaisutilizados nos modelos experimentais. Salinas e
Mcgaug (1996) utilizaram em seu estudo a dosede 0,1nM e não desencadeou
convulsão nos animais. A dose convulsivante é 3 mg/kg (HANSEN; SPERLING;
SANCHEZ, 2004).
A utilização dos modelos animais em estudos experimentais torna-se
importante, pois os mecanismos de indução, propagação e manutenção da epilepsia
ainda não estão totalmente elucidados. A epilepsia é considerada grave problema de
saúde pública em muitos países. Estudos com moléculas de origem vegetal
despertam o interesse dos pesquisadores pela possibilidade de gerar um novo
produto, que possa ser utilizado como ferramenta farmacológica (SOUSA et al.,
2004; VASCONCELOS et al., 2007;PEREIRA et al., 2009).
39
1.8 Aminoácidos na neurotransmissão
O papel dos aminoácidos na neurotransmissão começou a ser postulado
em 1950 com os primeiros experimentos feitos com glutamato aplicado em áreas
motoras específicas do córtex cerebral de macacos, observava-se o movimento dos
membros relacionados. Na década de 1960, estabeleceu-se a existência tanto de
aminoácidos excitatórios quanto inibitórios no SNC. As respostas sinápticas
excitatórias eram mediadas pelo glutamato e aspartato, enquanto as inibitórias eram
mediadas pelo GABA e glicina (ALMEIDA, 2006; RANG et al
.,2007).
Os aminoácidos constituem o principal grupo de substâncias usado para
geração de potenciais sinápticos excitatórios e inibitórios no SNC. Os primeiros
estudos em 1950 sugeriram que o glutamato gerava ação excitatória no sistema
nervoso central através de uma variedade de receptores. Essa ideia precedeu a
caracterização desses receptores (WATKINS; JANE, 2006).
Os aminoácidos são considerados unidades formadoras de proteína e são
essenciais para produçãode neurotransmissores no SNC. O desequilíbrio na
produção destes aminoácidos provocam alterações no funcionamento do SNC
(RANG et al., 2007).
O sistema nervoso central apresenta altas concentrações de aminoácidos
que se ligam aos receptores pós-sinápticos, com ação inibitória e excitatória, sendo
o ácido γ-aminobutírico (GABA) e o glutatamato respectivamente, considerados os
mais importantes aminoácidos neuroativos. No contexto atual, a participação de
outros aminoácidos na neurotransmissão vem sendo estudada. Com ação inibitória,
destaca-se a glicina, a taurina e a histidina, com ação excitatória o ácido aspártico
(GOLAN, 2010; GOODMAN; GILMAN, 2012).
O ácido γ-aminobutírico (GABA), glicina (GLI) taurina (TAU) e histidina
representam os mais importantes aminoácidos neurotransmissores com ação
inibitória, enquanto o glutamato (GLU) e o aspartato (ASP) são aminoácidos
excitatórios no SNC.
40
Neurônios glutamatérgicos perfazem cerca de 80% da população total de
neurônios no córtex cerebral, nos núcleos da base e nas vias sensitivas,
apresentando altas concentrações e ampla distribuição, com influência em todas as
funções do SNC (COTMAN et al., 1995; SOMOGYL et al., 1998; RANG; DALE,
2007),
Os receptores ionotrópicos contêm canais iônicos que quando ativados
permitem a entrada de Na+ e K+, favorecendo a despolarização do neurônio. São
divididos em receptores NMDA e receptores não-NMDA, que, por sua vez, incluem
os receptores alfa-amino-3-hydroxi-5-methyl-4 lisoxazole propionic acid (AMPA) e
kainato. Os receptores AMPA e kainato se localizam em regiões telencefálicas e
mediam a transmissão rápida em sinapses excitatórias. Quando ativados, estes
receptores induzem uma despolarização rápida do neurônio pós-sináptico que
perdura somente alguns milissegundos (GOLAN, 2010; CAIATI et al.,2010;
GOODMAN; GILMAN, 2012).
Os receptores NMDA controlam a condutânciade Na+, K+e em especial
do Ca+2 através da membrana neuronal. Outros íons como o Mg+2 e ZN+2 bloqueiam
o receptor MNDA, o primeiro de maneira voltagem dependente e o segundo
independentemente agindo em sítios diferentes (CONN, PIN, 1997). Este
mecanismo intervém na formação do fenômeno da potenciação a longo termo (LTP,
long-termpotentiation) (RANG; DALE, 2007).
A exposição excessiva dos neurônios ao glutamato pode causar aumento
exagerado de entrada de cálcio através dos canais controlados pelos receptores
NMDA do glutamato, com consequente agravamento das lesões neuroniais pela
excitocidade, podendo ocasionar a morte celular e neurodegeneração (FRIEDELER,
2003).
Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluR) agem através de
segundos mensageiros via ativação da proteína C. Em condições fisiológicas, a
ativação de mGluRs via glutamato produz corrente pós-sináptica lenta. Os mGluRs
estão presentes em todas a regiões do cérebro e vêm sendo considerados um dos
maiores moduladores de segundo mensageiros no SNC em mamíferos (LENT,
2004).
41
O GABA é um neurotransmissor inibitório quantitativamente importante no
SNC envolvido direta ou indiretamente na patogênese de muitas doenças
neurológicas, principalmente nas convulsões. Por muitos anos, acreditou-se que o
principal fator patogênico nas epilepsias era a falha na neurotransmissão
Gabaérgica (MELDRUM, 1975).
Estudos mostram que alterações nos níveis de neurotransmissores,
causam doenças neurológicas, como transtorno de ansiedade e epilepsia,
envolvendo os receptores GABA-A, alteração na transmissão glutamatérgica, pode
ocasionar o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas crônicas e
esquizofrenia (FARBER et al., 1998; OLNEY et al., 1999; WONG et al., 2003).
O GABA encontra-se distribuído em todas as partes do SNC, sendo
particularmente abundante (cerca de 10µmol/g de tecido). No sistema nigroestriatal,
(cerca de 2 a 5µmol/g) com maior concentração na substância negra e no núcleo do
globo pálido dos gânglios basais, seguidohipotálamo e hipocampo (RANG; DALE et
al., 2007, GOODMAN; GILMAN, 2012).
As sinapses inibitórias que contém GABA foram demonstradas entre os
neurônios de Purkinje do cerebelo, entre os interneurônios e as células eferentes
principais do córtex cerebelar, do bulbo olfatório, do núcleo cuneiforme, do
hipocampoe do núcelo septal lateral e entre o núcelo vestibular e os neurônios
motores trocleares (GOODMAN; GILMAN, 2012). O GABA no tecido estriatal é o
principal neurotransmissor e está localizado em interneurônios que se projetam para
a substância negra e o globo pálido (DE LUCIA et al., 2007).
42
Figura 4 – Vias Gabeaérgicas
Fonte: www.cnsforum.com/content/pictures/imagebank/hirespng/Neuro_path_GABA. png
O GABA é sintetizado pela descarbonilação do glutamato em um passo
único catalisado pela enzima ácido glutâmico-descarboxilase (GAD). A maior parte
da captação do mesmo ocorre nas células gliais. O desvio do GABA para as células
gliais produz glutamato, convertido em glutamina e transportado das células gliais
para os neurônios, em que é convertido novamente em glutamato. A glutamina,
portanto, serve como fonte de glutamato entre as células no SNC (SMITH et al.,
2007). Em humanos, a GAD apresenta duas diferentes isofarmas da enzima,
denominadas GAD-65 e GAD-67, em diferentes regiões do cérebro, o que possibilita
a síntese de GABA com ―pools‖ específicos, com funções diferentes (ESCLAPEZ et
al., 2000).
O conhecimento da composição estrutural do receptor GABA, bem como
o de sua distribuição ao longo do sistema nervoso central e periférico, tem permitido
a descoberta de drogas com potencial terapêutico para tratamento de distúrbios do
43
SNC. Os benzodiazepínicos, como o diazepam, são caracterizados como os
principais moduladores alostéricos do receptor GABA-A (JACOB et al., 2005;
JACOB; MOSS; JURD, 2008).
Os receptores para GABA podem ser inotrópicos (GABA-A e GABA-C) e
metabotrópicos (GABA-B). O GABA pode inibir neurônios por aumentar a
condutância de íons cloreto pela ativação dereceptores GABA-A e GABA-C, ou de
íons de potássio, via ação em receptores GABA-B, resultando na hiperpolarização
no adulto. GABA-A e GABA-B são encontrados nos terminais pré ou pós- sinápticos
(OWENS; KRIEGSTEIN, 2002). O GABA-A é responsável por aproximadamente
90% da transmissão sináptica inibitória no sistema nervoso central de mamíferos
(BEAR, 1996). O GABA-A faz parte da superfamília de canais iônicos reguladas por
neurotransmissores rápidos, incluindo os receptores nicotínicos periféricos e
neuronais da acetilcolina (nAChR), os receptores de serotonina tipo 3A/B (5HT3A/B) e
os receptores da glicina (GOLAN et al., 2010).
Algumas moléculas endógenas modulam de modo alostérico os
receptores GABA-A. O metabolismo dessas moléculas no cérebro produz
neuroesteroides como a pregnenolona, a desidroepiandrosterona (DHEA), a 5α-
diidrodesoxicorticosterona (DHDOC), 5α-tetraidrodesoxicorticosteronna (THDOC) e
a alopregnanolona (GOLAN et al., 2010; MODY; MAGUIRE, 2012).
Muitas drogas modificam a função do recptor GABA-A, como
benzodiazepínicos e os barbitúricos que aumentam a abertura do canal de cloreto
ou prolongam abertura deste canal (JACOB et al., 2008). Sabe-se que o receptor
GABA-A abre os canais de cloreto, sendo alvo de ação terapêutica para os
benzodiazepínicos e barbitúricos, todavia são antagonizados pela picrotoxina e
bicuculina que causam convulsões generalizadas (DALE; HAYLETT, 2010). Os
receptores GABA-B podem ser ativados seletivamente pela droga
antiespásticabaclofeno e estão acoplados à proteína G que inibem os canais de
cálcio ou ativam os canais de potássio (BORMANN, 1895), enquanto o faclofeno,
antagonista de recepptor GABA-B, é usado de forma experimental (DALE,
HAYLETT, 2010). O papel fisiológico dos receptores de GABA-C ainda não foram
esclarecidos, no entanto se sabem que são receptores ionotróficos, ligados a canais
iônicos, localizados na retina (STAHL, 2010; BORMANN; FEIGENSPAN, 1995).
44
O receptor GABA-A é uma glicoproteína estrutural heteroligomérica
constituído de cinco subunidades polipeptídicas pertencentes a diferentes famílias
ou classes, com suas respectivas isoformas: α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π e θ (KORPI et
al., 2002). Encontram-se identificadas até o momento 16 subunidades diferentes do
receptor GABA (Figura 5). As cinco subunidades dos receptores GABA-A circundam
um poro iônico central seletivo para o cloreto, que se abre na presença de GABA. O
GABA e outros agonistas liga-se a dois sítios, que estão localizados em porções
extracelulares do complexo receptor-canal na interface entre as subunidades α e β.
O receptor GABA apresenta outros sítios moduladores, em que ocorre ligação de
outros ligantes endógenos e/ou fármacos (DALE; HAYLETT, 2010).
Figura 5 – Receptor GABA-A
Fonte: AdaptadoTija C. Jacob, Stephen J. Moss and Rachel Jurd 2008.
45
As propriedades da resposta de sinalização dos interneurônios são
modaldas pelo tipo de receptor GABA-A expresso pré e pós sinapticamente. Os
receptores, contendo a combinação α1, α2, α3 ou α5 com as subunidades β-2 e y2,
são os mais predominantes no cérebro (CZAJKOWSKI, 2006).
O receptor GABA-A apresenta estrutura que desperta atenção dos
pesquisadores, pois contém variedade de sítios de ligação para drogas
farmacologicamente importantes que interagem alostericamente com os agonistas
GABA. Estes incluem ansiolíticos (benzodiazepínicos), anticonvulsivantes
(barbitúricos), ansiogênicos (β-carbolinas), agentes convulsantes (pricrotoxina)
(OLSEN 1982; TALLMAN; GALLAGER, 1985).
O agonista clássico do sítio GABA-A é muscimol, enquanto que o
principal antagonista é a bicuculina. No entanto, o antagonista competitivo dos
benzodiazepínicos mais conhecido é o flumazenil, utilizado clinicamente para
reverter os efeitos agonistas da superdosagem de benzodiazepínicos. Além desta
ação, é uma droga ansiogênica e convulsivante (RANG; DALE et al., 2007).
O flumazenil é um derivado imidabenzodiazepina, é um dos vários
derivados 1,4-benzodiazepínico, com alta afinidade pelo receptor benzodiazepínico
que age como antagonista competitivo. Na clínica, é o único antagonista dos
receptores BDZs, cuja ação consiste em bloquear algumas das ações dos BDZs,
porém não antagoniza os efeitos de outros sedativos-hipnóticos no SNC como
etanol, opióides e anestésicos gerais. O flumazenil também é utilizado como droga
para o diagnóstico de intoxicação pelos BDZs, pois se liga especificamente aos
receptores BDZs no cérebro, bloqueando os efeitos comportamentais, neurológicos
e eletrofisiólogicos de vários benzodiazepínicos, mas é desprovido de efeitos
farmacológicos (KLEINGEIST et al., 1998).
De acordo com a área cerebral, 20 a 50 % das sinapses usam GABA
como transmissor. Foi descoberto, posteriormente, que a neurotransmissão inibitória
pode ter importante papel na geração e manutenção de certos tipos de convulsão no
hipocampo e nos circuitos corticotalâmicos (AVOLI, 1996; ENGEL, 1996). O
aumento da atividade da GABA-transaminase no cérebro reduz as concentrações de
GABA o que leva à convulsão, coma e morte. A inibição desta enzima eleva
consideravelmente a concentração de GABA no cérebro, sendo alvo para o
46
desenvolvimento das novas drogas anticonvulsivantes, como a vigabatrina (RANG;
DALE et al., 2007).
O papel dos receptores GABA–B ainda é controverso no que se refere às
convulsões. Em alguns modelos de convulsão, agonistas deste receptor produzem
ação anticonvulsivante, enquanto em outros a ação é convulsivante. Como no caso
do baclofeno que tem ação convulsivante per se após infusão intraventricular em
roedores e após uso de doses terapêuticas em humanos (SNODGRASS, 1992),
mas atenuou o desenvolvimento do abrasamento ou kindlinginduzido por
pentilenotetrazol (PTZ) em roedores (SNEAD, 1996; QUINTAS-JÚNIOR et al., 2007).
Estudos farmacológicos revelaram que a microinjeção de antagonistas de
receptores GABA-A ou agonistas de diferentes subtipos de receptores de glutamato
causaram convulsões em experimentos animais in vivo (GOODMAN; GILMAN,
2012).
A origem da palavra glicina vem do grego glykos, que significa doce. Este
é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo, portanto, um dos
componentes das proteínas dos seres vivos, necessária para o funcionamento
adequado do SNC. O glutamato e a glicina estão entre os 20 aminoácidos que
constituem os blocos construtores das proteínas. Consequentemente, são
abundantes em todas as células do corpo como as renais, hepatócitos e células
endoteliais (EYNDEN et al., 2011).
A glicina é um neurotransmissor inibitório no SNC, especialmente no nível
da medula espinal, tronco cerebral e retina, sendo que na substância cinzenta da
medula espinhal é encontrada em concentrações particularmente altas (5 μmol/g). O
efeito inibitório da glicina é muito distinto de seu papel na ativação facilitadora dos
receptores de NMDA. Por não ser sintetizada pelos neurônios glutamatérgicos, é
obtida dos neurônios glicinérgicos ou de células da glia. A glicina não é armazenada
em vesículas sinápticas, mas associada ao aminoácido d-serina que supostamente
é armazenado em algum tipo de vesícula sináptica nas células da glia. A glicina no
citoplasma das células da glia, de alguma forma, fica disponível para liberação nas
sinapses, glutamatérgicas, escapando das células glias, por meio do transportador
Gly-T1 reverso. Outra forma de síntese da glicina ocorre a partir do aminoácido 1-
serina, derivado do espaço extracelular, da corrente sanguínea e da dieta,
47
transportado para o interior da célula glialpor um transportador de serina -1(SERT-
T), e convertido de 1-serina em glicina pela enzima glial serina
hidroximetiltransferase (SHMIT, 2007). Essa enzima converte 1-serina em glicina ou
glicina em 1-serina (STAHL, 2010).
O receptor da glicina é semelhante ao receptor GABA-A, sendo canal
iônico multimérico regulado por ligante. Foram encontradas mutações nos
receptores da glicina em alguns distúrbios neurológicos hereditários associados a
espasmos musculares e hiperexcitabilidade reflexa. Quando receptores de glicina
são ativados, o ânion cloreto entra no neurônio através de receptores ionotrópicos,
causando potencial pós-sináptico inibitório. A estricnina, alcaloide convulsivante que
atua principalmente sobre a medula espinhal, bloqueia tanto a resposta inibitória
sináptica quanto a resposta à glicina (RANG; DALE et al., 2007).
A glicina, junto com o glutamato, atua como coagonista de receptores
NMDA, facilitando ação da atividade excitatória dos receptores glutaminérgicos, em
contraste com a atividade inibitória da glicina. Os receptores da glicina são
antagonizados pela estricnina. A toxina tetânica bloqueia a exocitose de glicina
(GOODMAN; GILMAN, 2012).
A taurina ou ácido 2 –aminoetano sulfônico é um dos aminoácidos livres
mais abundantes em diferentes tecidos, sendo essencial para o funcionamento do
sistema nervoso central dos mamíferos, atuando na osmorregulação, estabilização e
manutenção da integridade da membrana neuronal, e na neuroproteção e no
controle da homeostasia do cálcio (SARANSAARI; OJA, 2007). Este aminoácido
pode ser encontrado em neurônios e células gliais, sendo armazenado em terminais
sinápticos, evidenciando possível ação neurotransmissora inibitória via receptores
GABA-A e de glicina (JUNYENT et al., 2009). Além disso, é capaz de modular a
atividade de diversas enzimas que podem estar relacionadas com insultos cerebrais
causados por drogas de abuso, como o etanol (GERLAI et al., 2006).
As maiores concentrações intracelulares de taurina são encontradas no
coração, leucócitos, músculo esquelético, retina e SNC, sendo o fígado o local de
maior variação nas concentrações de taurina, em que estas são dependentes da
dieta ingerida. O organismo humano, normalmente, possui entre 12 e 18g (100-
150mmol) de TAU (KENDLER, 1989).
48
Dentre as funções da taurina no cérebro estão as de neurorregulação,
neurodesenvolvimento, modulação da excitabilidade neuronal, manutenção da
função cerebelar, modulação da liberação hormonal e anticonvulsivante (KONTRO;
OJA, 1983). No cérebro, a taurina também desempenha papel osmorregulador,
protegendo-o contra a toxicidade dos íons de cálcio (LEHMAN et al., 1984). Um dos
papéis importantes da taurina vem sendo relacionado à excitoxicidade
glutamatérgica (WU; PRENTICE, 2010).
A histidina é o aminoácido precursor da histamina, importante
neurotransmissor do SNC. Esta amina biogênica é sintetizada a partir da
descarboxilação do aminoácido histidina, através da histidina-descarboxilse. As
sinalizações intracelulares da histamina são mediadas via proetina G e vários
segundos mensageiros, através da interação com quatro tipos de receptores, sendo
H1 e H2 encontrados em receptores pós-sinápticos no SNC e H3 em um receptor
pré-sináptico (HASS; SERGEEVA; SELBACH, 2008; NESTLER; HYMAN;
MALENKA, 2009). O receptor H4 tem sido relacionado com o sistema imunológico
(LIN et al., 2005). A histidina representa cerca de 3% dos aminoácidos das proteínas
do nosso organismo (BROWN; STEVENS; HAAS, 2001).
O sistema histaminérgico no SNC está envolvido com várias funções,
como a modulação do estado de excitação, vigília e sono, aprendizado e memória. A
enzima histidinadescarboxilase (HDC) converte a histamina no hipotálamo na área
do núcleo tuberomamilar e liberada para muitas áreas cerebrais como hipotálamo,
hipocampo, córtex pré-frontal (HAAS et al., 2008; WAMELEN et al., 2011).
A identificação dos aminoácidos neurotransmissores em estudos de
modelos animais é importante para ajudar na compreensão das ações
farmacológicas das moléculas estudadas que apresentam potencial terapêutico.
1.9 Áreas cerebrais estudadas
A experimentação animal tem considerável importância em pesquisas
científicas, pois vem contribuindo para o desenvolvimento da ciência e tecnologia.
Ao longo dos anos, a contribuição com descobertas de medidas profiláticas e
tratamentos de inúmeras enfermidades que acometem os seres vivos, foram
49
resultados dos estudos desenvolvidos com modelos animais, como a descoberta da
insulina, desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças e produção de soros.
Os animais foram responsáveis por descobertas que permitiram o uso terapêutico de
antibióticos, anestésicos, antidepressivos, entre outros (CHORILLI et al., 2007).
Os animais são utilizados em diversos modelos experimentais para
avaliação da atividade farmacológica de extratos vegetais, metabólitos e formas
farmacêuticas diversas. Os modelos animais foram desenvolvidos para avaliar os
diversos distúrbios, a partir de parâmetros de comportamento que indicam
ansiedade, depressão, status epilépticus, esquizofrenia em roedores, dor, entre
outros (ALMEIDA, 2006).
As áreas cerebrais estudadas neste estudo foram o córtex pré-frontal
(CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE).
O lobo frontal, constituído pelo córtex pré-frontal (CPF), córtex pré-motor e
córtex motor primário, é responsável pelo planejamento da ação e controle do
movimento (KANDEL, 2000). O CPF tem sido associado a diversos processos
emocionais, cognitivos, atencionais, entre outros (VERTES, 2006). Até o momento,
são reconhecidas três grandes regiões funcionais do CPF: a região ventromedial,
envolvida com o planejamento de ações e do raciocínio e com o ajuste social do
comportamento; a região dorso lateral, encarregada da memória operacional; e a
região cingulada anterior, envolvida com as emoções (LENT, 2004).
O córtex pré-frontal (CPF) foi originalmente descrito como região cortical
com interação recíproca acentuada com o núcleo mediodorsal do tálamo
(GOLDMAN; GILMAN, 2012; GROENEWEGEN et al., 1990). Existem diferentes
tipos celulares no córtex pré-frontal, incluindo neurônios piramidais excitatórios
(glutamato), eferentes colinérgicos, interneurônios gabaérgicos inibitórios e
interneurônios colinérgicos e esta área, além do que foi descrito, recebe projeções
de várias regiões cerebrais. O CPF recebe eferentes dopaminérgicos provenientes
da área tegmentar ventral (ATV) e envia projeções glutamatérgicas para ATV e
núcleo accumbens (SESACK; PICKEL, 1992). Com relação ao glutamato, as
terminações nervosas glutamatérgicas no CPF medial nascem principalmente de
projeções eferentes do núcleo mediodorsal do tálamo, do hipocampo e amígdala
50
(RUGGIERO et al., 2011). O núcleo da rafe, área produtora de serotonina (5HT),
recebe inervação glutamatérgica proveniente do CPF (SESACK; PICKEL, 1992).
Em seres humanos, o funcionamento anormal do CPF tem sido
correlacionado com psicopatologias incluindo esquizofrenia, sociopatia, transtorno
obsessivo compulsivo, depressão, entre outros. As interconexões do córtex pré-
frontal ventromedial (CPFvm) com a formação hipocampal parecem ser
unidirecionais, sendo que o CPFvm recebe projeções do hipocampo, principalmente
da porção CA1, mas apenas poucas fibras do CPFvm chegam à formação
hipocampal (HEIDBREDER; GROENEWEGEN, 2003; VERTES, 2006). Os aferentes
colinérgicos para o CPFvm são, em grande parte, projeções provenientes do núcleo
basal (GAYKEMA et al., 1991) e exercem papel fundamental na atenção, memória,
motivação e induzem processos de ansiedade (BERNSTON et al., 1998). A
atividade das vias colinérgicas está aumentada frente a estímulos estressantes, e
sugere-se que a hiperatividade das aferências colinérgicas para o CPF pode
contribuir para os estados de ansiedade (ROSSI et al., 2006).
O hipocampo e suas estruturas lobulares adjacentes, temporal e parietal,
denominados de formação hipocampal, tem numerosas conexões e, principalmente,
conexões indiretas com muitas porções do córtex cerebral, bem como com as
estruturas basais do sistema límbico – a amígdala, o hipotálamo, o septo e os
corpos mamilares. Quase qualquer tipo de experiência sensorial causa ativação de
pelo menos alguma parte do hipocampo. Distribui muitos sinais para o tálamo
anterior, hipotálamo e outras partes do sistema límbico, especialmente através do
fórnix, maior via de comunicação. Assim, o hipocampo é um canal adicional através
do qual sinais sensoriais podem iniciar reações comportamentais para diversos fins
(HASSELMO, 2005).
O hipocampo está tradicionalmente relacionado a processos cognitivos,
como aprendizado e memória, também parece estar envolvido com a resposta ao
estresse (RIEDEL; MICHEAU, 2001; LATHE, 2001). É ativado por diferentes
estressores e participa do processamento de informações sobre eventos
ameaçadores (LOPEZ et al., 1999). O hipocampo possui grande densidade de
receptores para glicocorticoides (GCs) que, quando ativados, inibem a atividade do
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, limitando a resposta ao estresse (HERMAN;
CULLINAN, 1997). Além disso, também pode se tornar alvo para os efeitos
51
deletérios do estresse. Eventos estressantes teriam efeito neurotóxico sobre o
hipocampo, provavelmente mediado pelo aumento de GCs, predispondo ao
desenvolvimento da depressão (BROWN et al., 1991).
Outra área de destaque são os núcleos da base que se encontramo corpo
estriado, o globo pálido, a substância negra e os núcleos subtalâmicos. O corpo
estriado (CE) apresenta três subdivisões: o núcleo caudado, o putamen e o estriado
ventral, o qual inclui o núcleo accumbens. Este recebe impulsos de entradas
provenientes do córtex cerebral, tálamo e tronco encefálico. Os neurônios se
projetam para o globo pálido e a substância negra. as áreas do córtex emitem
projeções glutamatérgicas excitatórias para porções específicas do CE, além de
receber projeções dopaminérgicas do mesencéfalo e impulsos de entrada
serotonérgicos dos núcleos da rafe (DE LONGO et al., 2000). No corpo estriado, as
projeções de neurônios gabaérgicos espinhosos são de 90 a 95%. Esses neurônios
gabaérgicos projetam-se para o globo pálido e a substância negra. Cerca de 1 a 2%
constituem os interneurônios estriatais, que são do tipo não espinhoso e fazem
conexão com os espinhosos médios (GOLDMAN; GILMAN, 2012).
O corpo estriado apresenta área ventral e contígua, denominado corpo
estriado ventral e corpo estriado dorsal. O corpo estriado ventral é constituído por
três estruturas: a substância inominada, o núcleo accubems e o tubérculo olfatório.
A substância inominada situa-se na base do cérebro, superiormente ao trígono
olfatório e à substância perfurada anterior e ventralmente ao globo pálido e
à comissura anterior. O núcleo accumbens localiza-se em posição anterior e ventral
no cérebro, inferiormente ao putâmen (mais especificamente na porção em que ele
se liga à cabeça do núcleo caudado) e superiormente à substância perfurada
anterior. O tubérculo olfatório é uma pequena eminência situada posteriormente
ao trigono olfatório e anteriormente à porção substância perfurada anterior (MA,
1997).
O corpo estriado no homem não é proporcionalmente tão grande quando
comparado ao estriado de ratos. Em termos embriológicos, o estriado origina-se a
partir do telencéfalo, cuja etiologia do nome é latina: striatum, por causa da
aparência cheia de estrias, quando observado ao microscópio (LENT, 2004). Essas
estrias vêm dos axônios mielinizados da porção anterior da cápsula interna que, em
52
humanos, atravessam o estriado de forma a separar o caudado do putâmen. Em
roedores, caudado e putâmen representam estrutura única (MINK, 1999).
Dessa forma, ressalta-se a importância de estudos comportamentais,
farmacológicos e neuroquímicos para o esclarecimento dos mecanismos de ação de
moléculas, como a STY, objeto de estudo desta tese.
53
2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
O uso de moléculas obtidas a partir da semissíntese de plantas
medicinais tem despertado interesse de pesquisadores, pois a partir dessas
moléculas, podem-se desenvolver fármacos para serem utilizados na população.
Nesse sentido, as fontes de origem vegetal apresentam atrativo inigualável na busca
por substâncias ativas que possibilitem o desenvolvimento de novos fármacos.
Considerando a biodiversidade existente na flora brasileira e seu potencial
como fonte de moléculas bioativas a serem estudadas e exploradas, acredita-se que
muitas pessoas possam apresentar efeitos promissores no tratamento dos distúrbios
no sistema nervoso central, como a ansiedade e a epilepsia, que apresentam
terapêutica com custo alto e efeitos colaterais que afetam a qualidade de vida destes
sujeitos e suas atividades profissionais.
As várias espécies do gênero Aniba tem sido objeto de estudo nos últimos
anos, pois este grupo tem em sua composição uma molécula de esterilpirona de
ocorrência natural-[(E) - esteril- piran- 2 – ona]. O anel piran-2-ona é um composto
intermediário-chave na biosíntese de metabólitos, sendo encontrados em plantas,
animais, bactérias e insetos (MCGLACKEN; FAIRLAMB, 2005).
Aniba panurensis é uma planta que contém esteril-2-pironas, cuja
estrutura é similar às kavalactonas (kava-kava) e as cumarinas que demonstraram
atividade no SNC. A 6-[(E) - esteril- piran - 2 - ona] poderia servir como molécula
alternativa para o tratamento das doenças que compremetem o SNC.
Como não existem na literatura muitos estudos demonstrando ação
central da 6-STY, e moléculas com estrutura semelhante têm demonstrado ação no
SNC, sentiu-se a necessidade de estudar os efeitos dessa molécula em modelos
comportamentais e dosagem de aminoácidos no SNC de camundongos. A partir
deste estudo, foi possível obter possível ação da STY nos modelos ansiedade e
indução de convulsão por substâncias utilizadas em modelos validados.
54
3 OBJETIVOS
Objetivou-se verificar os efeitos neurofarmacológicos STY obitidos da
Anibaparusinensi em camundongos através de testes comportamentais, e
neuroquímicos. Para possibilitar melhor compreensão, o estudo foi dividido em
quatro capítulos:
Capítulo I:
Estudar os efeitos comportamentais causados pela molécula de 6-esteril-
2-pirona (STY), obtidos da Aniba parusinensiem camundongos, por meio dos
modelos de ansiedade, teste do campo aberto (ALE, rearing e grooming), teste do
Labirinto em Cruz Elevado, teste da placa perfurada, coordenação motora com o
teste rota Rod e tempo de sono.
Capítulo II:
Determinar as concentrações de aminoácidos após os testes de
comportamento (Aspartato, Glutamato, Glicina, GABA, Taurina e Histidina) no CPF,
HC e CE, após tratamento com a STY em camundongos.
Capítulo III:
Estudar o efeito da moléculade STY no SNC, por meio dos modelos de
indução de convulsão por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina.
Capítulo IV:
Determinar os níveis de aminoácidos após os testes de convulsão
induzidos por PTZ, estricnina, bicuculina e pilocarpinano CPF, HC de camundongos,
após tratamento com STY.
55
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Planta
A STY foi obtida a partir dos frutos planta Aniba panurensis, conforme
descrição de Barbosa Filho (1986). Este material foi obtido pelo pesquisador Dr.
José Maria Barbosa Filho, do Laboratório de Tecnológio Farmacêutica – UFPB,
através de colaboração existente entre o Laboratório de Neurofarmacologia da UFC.
Frutos verdes da Aniba panurensis foram coletados pelo Dr. Hipólito P.
Ferreira Filho, em Humaitá, no Estado do Amazonas e identificado pelo Prof. Klaus
Kubitzki, da Universidade de Hamburg, que mantém no herbário o vouchers dessa
universidade. Os frutos verdes coletados (1000g) foram moídos e colocados em
solução contendo etanol. A solução foi filtrada e depois evaporada. O resíduo (48g)
foi redissolvido em solução aquosa de EtOH a 60%. A solução foi extraída, primeiro
com hexano e depois com clorofórmio. Os solventes foram evaporados do extrato de
CHCl3, dos quais obteve-se 8,5 g, submetidos à cromatografia em coluna (sílica gel
70%). A diluição de solventes e misturas CHCl3, CHCl3-EtOAc, CHCl3-MeOH de
polaridade crescente gerou nove frações brutas, cada uma por TLC cromatografia.
O composto 6-esteril-2-pirona foi obtido como cristais amarelos, com rendimento de
2,6g. A pureza química da 6-estéril-pirona foi mais de 98%, determinada por alto
desempenho de cromatografia líquida. O composto 6-esteril-pirona foi isolado da
Aniba parviflora e Goniothalamus umbrosus. As estruturas químicas de 6-estéril-
pirona foi identificada com base em dados de espectroscopia (1H and 13C NMR) e
comparados com valores reportados na literatura (BITTENCOURT et al., 1971;
BANERJIL et al., 1980; BARBOSA-FILHO, 1986; AHMAD; DIN, 2002). A Aniba
panurensis encontra-se depositada no herbarium do Royal BotanicGardens, Kew
(K), K000601914.
4.2. Animais
Foram utilizados Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss
Webster, adultos, machos, pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará
(UFC). O manejo e a manutenção desses animais, antes, durante e após
56
experimentação, foram realizadas de acordo com regras de manutenção e
manipulação de animais de laboratório, preconizadas pelo Colégio de Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA, 2008). Este projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Nº protocolo 10/2008).
4.3 Drogas utilizadas
Quadro 1 – Descrição das drogas utilizadas.
Drogas Origem
Tween 80 a 4% - Polyoxyethilene Sorbitan
Mono-oleate
Sigma - USA
Diazepam Sigma - USA
Flumazenil Sigma – USA
Cremophor - Sigma-USA Sigma – USA
Pentilenotetrazol Sigma – USA
Estricnina Sigma – USA
Pilocarpina Sigma – USA
Bicuculina Tocris – USA
GABA, Glutamato, Glicina,Taurina, Aspartato e
Histidina
Sigma – USA
Água destilada Deionizador
Ácido perclórico Sigma – USA
57
4.4 Equipamentos
Quadro 2 – Descrição dos equipamentos utilizados.
Equipamentos Origem
Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça.
Balança para animais Filizola ID-1500 – (Brasil)
Banho-maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil.
Campo aberto para camundongos Fabricação própria
Centrífuga refrigerada Modelo 215 – Fanem (Brasil)
Cronômetros Incoterm, Brasil
Deionizador USF Elga, USA
Equipamento de HPLC (Cromatografia Líquida da Alta Performance) Detector de fluorescência e eletroquímico
Shimadzu, Japão
Freezer (-75ºC) Legacy Sistem, USA
Guilhotina Harvard, USA
Homogeinizadores elétricos Bellico, USA
Labirinto em Cruz Elevado para camundongos
Fabricação própria
Material cirúrgico
Micropipetas, H.E. Pedersen, Dinamarca
Placa Perfurada Ugo Basile, Italy
Equipamento do Rota Rod Ugo Basile, Italy
Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc. NY, USA
58
4.5 Preparo das drogas
A STY foi dissolvida em Tween 80 a 4,0% e diluída em água destilada,
obtendo-se a concentração final para ser administrada nas doses 1, 5, 10 ou 20
mg/kg, respectivamente. Os grupos controles receberam veículo (água destilada
emulsificada com Tween 80 a 4%). As drogas utilizadas ao longo do experimento
foram diazepam (1 ou 2 mg/kg), flumazenil (2,5 mg/kg), pentobarbital sódico (40
mg/kg), pentilenotetrazol (85 mg/kg), pilocarpina (400 mg/kg), estricnina (20 mg/kg) e
bicuculina (12 mg/kg). O volume total administrado nos animais foi de 10 mg/kg.
4.6. Protocolo de tratamento
Os animais foram tratados com STY de forma aguda, nas doses 1, 5, 10
ou 20 mg/kg, através da via intraperitoneal (i.p.) para o estudo das atividades no
sistema nervoso central. Os animais foram submetidos aos testes comportamentais
30 minutos (min) após o tratamento intraperitoneal ou subcutâneo para a pilocarpina.
Após uma hora da administração da STY os animais foram dissecados.
Após os testes de comportamento, os cérebros dos animais foram
decaptados e as áreas do córtex pré-frontal (CPF), hipocampo
(HC) e corpo estriado (CE), foram dissecados sobre gelo para realização dos testes
neuroquímicos. Os animais controles foram tratados com solução tween 80 4%,
conforme a diluição das substâncias pesquisadas, que foram comparadas a estes
grupos controles.
59
4.7 Testes de comportamento
4.7.1 Teste do Campo Aberto
O campo aberto é um modelo capaz de detectar ação no SNC
estimulante ou depressor. O aparato para camundongos é feito de acrílico (paredes
transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15 cm), dividido em nove quadrantes iguais. A
metodologia de Archer (1973) foi utilizada para avaliar a atividade exploratória do
animal. Os principais parâmetros para observação foram: número de cruzamentos
com as quatro patas (movimentação espontânea), número de comportamentos de
autolimpeza (―grooming‖), número de levantamentos (―rearing‖), registrados durante
um tempo de 5 minutos, cujo primeiro minuto foi de habituação (ARCHER, 1973). O
teste foi realizado meia hora após administração i.p. da STY (1,5, 10 ou 20 mg/kg),
FLU (2,5 mg/kg/ e DZP (1 ou 2 mg/kg). A tendência natural do animal em um
ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do conflito com o medo provocado por este
mesmo ambiente (Esquema 1).
60
Esquema 1 – Esquema do Teste do Campo Aberto.
61
4.7.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O Labirinto em Cruz Elevado (LCE) é baseado no modelo proposto, em
ratos, por Pellow et al. (1985), e validado por Lister (1987) para camundongos, e
consiste em dois braços abertos opostos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x
25 cm), também opostos, em forma de cruz. Os braços abertos e fechados estão
conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A plataforma, as paredes laterais
dos braços fechados são confeccionadas em acrílico transparente e o chão em
acrílico preto.
O aparelho está elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão. Após
meia hora, o tratamento com STY ou veículo por via i.p., os camundongos foram
colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para um dos braços
fechados e o comportamento observado por cinco minutos. As medidas
comportamentais registradas no LCE são: frequência de entradas e o tempo
despendido nos braços abertos e nos fechados. A frequência total de entradas é
obtida pela soma simples das frequências de entradas nos braços abertos e nos
fechados.
Dessa forma, os parâmetros utilizados para análise estatística dos dados
e confecção dos gráficos foram: número de entradas nos braços abertos (NEBA),
tempo de permanência no braço aberto (TPBA), número de entradas no braço
fechado (NEBF), tempo de permanência no braço fechado (TPBF). Aumento seletivo
nos parâmetros correspondentes aos braços abertos revela efeito ansiolítico
(PELOW et al. 1985), entre outros achados.
Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação da
STY, um grupo de camundongos foi tratado com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p.
antagonista do receptor GABA-A Benzodiazepnico e 15 min após receberam STY
(1,5, 10 ou 20 mg/kg i.p.) , sendo submetidos aos testes após 30 min. Foi utilizado
DZP (1 mg/kg i.p) como droga padrão ansiolítica (Esquema 2A e 2B).
62
Esquema 2 – Esquema A e B do teste do Labirinto em Cruz elevado.
Esquema A
Esquema B
63
4.7.3 Teste da placa perfurada
Camundongos tratados com STY nas doses (1, 5, 10 ou 20 mg/kg i.p.)
foram colocados individualmente no ―hole-board‖, que consiste em uma caixa
quadrada de acrílico transparente (50 x 50 cm) a 10 cm de altura, com 16 orifícios de
2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas. Foram registrados o
número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa
(CLARK et al., 1971), por um período de cinco minutos.
Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação da
STY camundongos que foram pré-tratados com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p. um
antagonista do receptor GABA-A Benzodiazepnico e 15 minutos após receberam
STY(1,5,10 ou 20 mg/kg) i.p., sendo submetidos aos testes após 30 minutos. Foi
utilizado DZP (1 mg/kg) i.p. como droga padrão ansiolítica (Esquema 3A e 3B).
64
Esquema 3 – Esquema A e B do Teste da Placa perfurada.
Esquema A
Esquema B
65
4.7.4 Teste do Rota Rod
O teste do Rota Rod foi realizado para avaliar cordenação motora. O
camundongo foi colocado com as quatro patas sobre uma barra de 2,5 cm de
diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm. Os animais foram
selecionados em sessões de um minuto de duração, 24 horas antes da realização
dos experimentos, sendo escolhidos aqueles que permanecem na barra giratória e
apresentaram até três quedas em um minuto. Os animais selecionados receberam o
tratamento, no dia do teste, e foram colocados no Rota Rod, por um minuto. Foram
registrados o tempo de permanência na barra giratória (em segundos) e o número
de quedas, com três reconduções, no máximo (DUNHAM; MIYA, 1957).
Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação de
STY camundongos que foram tratados com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p. um
antagonista do receptor GABA-A benzodiazepnico e 15 minutos após receberam
STY(1,5,10 ou 20 mg/kg) i.p., sendo submetidos aos testes após 30 minutos. Foi
utilizado DZP1 mg/kg, na dose ansiolítca e 2 mg/kg i. p, como padrão para
atividade relaxante muscular. Este teste permite avaliar se os tratamentos
promovem incoordenação motora nos animais por sedação e/ou relaxamento
muscular (Esquema 4A e 4B).
66
Esquema 4 – Esquema A e B do teste do Rota Rod
Esquema A
Esquema B
67
4.7.5 Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital
Os animais foram tratados com STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.), veículo
(controle) ou diazepam (1mg/Kg, i.p). Após 30 minutos, foi administrado
pentoparbital sódico (PTB) na dose de 40 mg/Kg, via i.p. Com o início da atividade
do PTB, os animais foram colocados na posição de decúbito dorsal. O tempo desde
a injeção do PTB até o animal perder o reflexo postural foi registrado como latência
de sono e o tempo de latência entre a perda e a recuperação voluntária do reflexo
postural é registrado como tempo de sono (WAMBEBE, 1985; ROLLAND et al.,
1991). O critério para recuperação dos reflexos foi fixado quando o animal saiu da
imposição por três vezes consecutivas (CARLINI et al., 1896; WANBEBE, 1985).
Foi estabelecido um tempo, máximo de 240 minutos, ou seja, animais, cujo tempo
de sono ultrapassava esse valor, o mesmo foi mantido (Esquema 5).
Esquema 5 – Esquema do teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico.
68
4.8 Avaliação da Atividade Anticonvulsivante
Os modelos de convulsão em animais reproduzem alterações
comportamentais e eletroencefalográficas que se assemelham à epilepsia em
humanos. Os convulsivantes químicos mais utilizados em pesquisas com modelo
animal são: o pentiletetrazol que inibe os canis de cloreto associados ao receptor
GABA; a estricnina que atua inibindo seletivamente os receptores de glicina pós-
sinápticos; a bicuculina que atua antagonizando o receptor GABA; e a
pilocarpinaque quando utilizada pode levar ao desenvolvimento do status epilepticus
(ALMEIDA, 2006).
4.8.1. Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol
Esse experimento teve como finalidade identificar a possível ação
anticonvulsivante da substância em teste. Os animais foram pré-tratados com STY
(1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.) veículo (controle) ou diazepam (1 mg/Kg, i.p). O
pentilenotetrazol (PTZ) 85 mg/Kg i.p. foi administrado como agente indutor das
convulsões após 30 minutos. Os animais foram colocados em gaiolas e observados
por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência de
convulsão (tempo entre a administração do PTZ até a primeira convulsão clônica ou
tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo decorrido da
administração de PTZ até a morte), em segundos (Esquema 6).
4.8.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricinina
A estricnina 20 mg/Kg i.p. foi administrada como agente indutor das
convulsões após 30 minutos do tratamento com STY(1, 10 e 20 mg/Kg, i.p.), veículo
(controle) ou diazepam (1mg/Kg, i.p). Os animais foram colocados em gaiolas e
observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência
de convulsão (tempo entre a administração da estricnina até a primeira convulsão
69
clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo
decorrido da administração de estricnina até a morte), em segundos.
4.8.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina
Esse experimento tem como finalidade identificar a possível ação
anticonvulsivante da substância em teste. A dose referenciada como convulsivante é
3 mg/kg, no entanto, parte dos animais que receberam STY não convulsionaram.
Bicuculina (12 mg/Kg i.p.) foi a dose na qual os animais exibiram convulsão. Foi
administrada como agente indutor das convulsões 30 min após tratamento com STY
(1, 10 e 20 mg/Kg, i.p.), veículo (controle), diazepam (1 mg/kg, i.p). Os animais foram
colocados em gaiolas e observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros
analisados foram latência de convulsão (tempo entre a administração do bicuculina
até a primeira convulsão clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de
morte dos animais (tempo decorrido da administração de bicuculina até a morte), em
segundos.
4.8.4. Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina
Pilocarpina (400 mg/kg s.c.) foi administrado como agente indutor das
convulsões 30 minutos após tratamento com STY(1, 10 ou 20 mg/Kg, i.p.), veículo
(controle) ou diazepam (1mg/kg)s.c. Os animais foram colocados em gaiolas e
observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência
de convulsão (tempo entre a administração da pilocarpinaaté a primeira convulsão
clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo
decorrido da administração da pilocarpina até a morte), em segundos.
70
Alterações comportamentais
O modelo de convulsão induzido por pilocarpina (400 mg/kg s.c. ) está
associado à epilepsia parcial complexa com foco no lobo temporal. Os animais
apresentam sinais colinérgicos, tremores, movimentos estereotipados (aumento da
atividade de roer, coçar, mastigar e wet-dog shakes – ato de sacudir semelhante a
um cachorro molhado), convulsões motoras límbicas que progridem com estado
epiléptico (TURSKI et al.,1987; FREITAS, 2011).
71
Esquema 6 – Esquema do teste de indução de convulsão por pentilenotetrazol,
estricnina, bicuculina e pilocarpina.
72
4.9 Dosagem de Aminoácidos
Para determinação das concentrações de aminoácidos, foi utilizado o
sistema HPLC (High Performance Liquid Chromatography), com detector de
fluorescência. A espectroscopia de fluorescência pode ser usada como método de
detecção específica, constituindo um dos mais sensíveis para compostos que
fluorescem. Fluorescência pode ser desenvolvida em compostos não fluorescentes
por reações de derivatização realizadas pré ou pós-coluna (HALLMAN et al., 1984).
Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por
30 s e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O
sobrenadante foi separado e filtrado através de uma membrana (millipore- 0,2 m)
e, posteriormente, associado a uma solução de derivatização pré-coluna, para
obtenção de fluorescência, em uma proporção de 1:1. Um minuto depois do início
dessa associação uma alíquota de 20 l foi retirada e injetada no equipamento de
HPLC para análise química.
Para análise dos aminoácidos, uma coluna RP-ODS(M) com comprimento
de 15 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 m, da Shimadzu-Japão foi
utilizada. A fase móvel foi utilizada em gradiente com duas fases: A- NaH2PO4
(50mM) e metanol (20%, v/v) em pH 5,5; B - metanol puro (100 %). Aspartato (ASP),
Glutamato (GLU), Glicina (GLI), Taurina (TAU) e GABA foram detectados com uso
de um detector de fluorescência (Modelo RF-535 da Shimadzu, Japão) com
comprimento de ondas de EX-Wavelength (370 nm) e EM-Wavelength (450 nm). Os
cromatogramas foram registrados e quantificados por um computador, usando
software da Shimadzu. A quantidade dos aminoácidos foi calculada por comparação
da altura dos picos obtidos com a média dos padrões e os resultados foram
expressos em mol/g de tecido.
Ressalta-se que, foram realizadas dosagens de aminoácidos do CPF, HC,
CE, após os testes de comportamento (Esquema 7) e teste de indução de convulsão
com PTZ, estricnina, bicuculina ou pilocarpina (Esquema 8). As áreas cerebrais
utilizadas para dosagem deaminoácidos, após os testes de indução de convulsão,
foram CPF e HC.
73
Esquema 7 – Determinação de aminoácidos após os testes de comportamento.
Esquema 8 – Determinação de Aminoácidos após os testes de Convulsão.
74
4.10 Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada através dosoftware Graph
Prism. Versão 5 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA.
Os resultados que obedeciam a uma distribuição paramétrica foram
analisados por Análise de Variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey (post
hoc).
Os resultados foram expressos pela Média ± Erro Padrão da Média
(EPM), com número de animais entre parêntese e foi considerado o nível de
significância menor que 0,05 (p<0,05). Utilizaram-se as letras do alfabeto para
carcterizar significância.
75
5 RESULTADOS
5.1 Capítulo I: Efeitos da 6–estéril- 2 -pirona sozinha ou associada com
antagonista benzodiazepínico em testes comportamentais em camundongos
5.1.1 Teste do Campo Aberto
Os parâmetros avaliados neste experimento foram atividade locomotora
(ALE), rearing e grooming e os resultados foram expressos com média ± EPM do
número de travessias, rearings e groomings. Na Figura 6, observa-se que atividade
locomotora foi aumentada pela STY na dose de 10mg/kg (43,83 ± 1,78) e 20 mg/kg
(49,00 ± 3,10) quando comparados com o controle (33,44 ± 2,60 ). O diazepam 2
mg/kg, usado como droga padrão, reduziu a ALE em relação ao controle (24,20 ±
1,7 ). O flumazenil (2,5 mg/Kg) i.p. aumentou a atividade locomotora em relação ao
controle (53,40 ± 3,6) [F(6,68)=16,72; p<0,0001].
Como demonstrado na Figura 7, não houve diferença nas doses
administradas em relação ao controle. O diazepam 2 mg/Kg i.p., usado como droga
padrão, reduziu o número de rearing (DZP-2: 4,10 ± 0,76), enquanto o flumazenil
aumentou esse número (19,13 ± 1,88), comparado ao grupo controle (10,67 ± 1,50)
[F(6,66)=8,687; p<0,0001].
A Figura 8 mostra o comportamento de grooming após administração da
STY, DZP e FLU. Nenhum efeito foi observado pela STY nesse comportamento,
exceto pelo aumento de grooming após o tratamento com a maior dose da STY-
20mg/kg (4,00 ± 0,39), comparado ao controle (2,30 ± 0,55). Por outro lado, como
esperado, o diazepam 2 mg/Kg diminuiu esse comportamento em relação ao grupo
controle. Efeito inverso foi observado com o grupo tratado somente com FLU
(3,58±0,43) [F(6,71)=8,185; p<0,0001].
76
Figura 6 – Efeito da STY sobre atividade exploratória avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos.
Para análise estatística foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey comotest
post hoc, a, b e c: p<0,05, quando comparado ao grupo controle, STY-1 e DZP-2.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
DZP
-2
FLU -2
,5
0
20
40
60
a,b
a,c
a
a,bN
úm
ero
de t
ravessia
s
77
Figura 7 – Efeito da STY sobre o número de rearing avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos.
Para análise estatística, foi utilizada ANOVA seguido por Tukey como test
post hoc, a e b: p<0,05 quando comparado ao grupo controle e STY-1.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
DZP
-2FLU
0
5
10
15
20
25
a,b
a
Nú
mero
de
reari
ng
78
Figura 8 – Efeito da STY sobre o número de rearing, avaliada através do teste de
campo aberto em camundongos.
Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey como
test post hoc, a, b e c: p<0,05, quando comparado ao grupo controle, STY e DZP-2.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
DZP
-2FLU
0
1
2
3
4
5 aa,b
a
Nú
me
ro d
eG
roo
min
g
79
5.1.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado Na Figura 9, administração da STY por
via i.p. nas doses (1, 5, 10 ou 20 mg/kg) mostrou aumento no número de entradas
nos braços abertos (STY-1: 4,0 ± 0,42; STY-5: 4,70 ± 0,42; STY-10: 4,58 ± 0,56 ou
STY- 20: 4,10 ± 0,55). A associação do FLU (2,5 mg/kg) antagonista do receptor de
benzodiazepínicos com STY bloqueou o efeito da STY ( STY- 1: 2,70 ± 0,43; STY-
5: 2,40 ± 0,42; STY-10: 2,72 ± 0,56; STY- 20: 2,50 ± 0,40, [F(11,122)= 17,88;
p<0,0001]. Efeito semelhante foi observado pelo pré-tratamento do FLU com DZP-1
(2,30 ± 0,51), quando comparado ao grupo do DZP-1 (9,00 ± 20,32)
[F(11,122)=17,81; P<0,001].
Como demonstrado na Figura 10, STY (1, 5, 10 ou 20 mg/kg) aumentou o
tempo de permanência dos animais nos braços abertos (STY-1: 90, 33 ± 10,84
STY-5: 92,67 ± 15,8; STY-10: 60,10 ± 8,53; STY- 20: 63,36 15,33), quando
comparado com o grupo controle (27,22 ± 5,25; p<0.0001). Nos grupos pré-tratados
com FLU + STY (FLU+STY-1: 22,90 ± 2,76; STY- 5: 38,20 ± 5,75; STY-10: 32,40 ±
5,17; STY- 20: 23,89 4,10), foi observado aumento da STY em relação ao controle.
No grupo pré-tratado com FLU+ DZP, esse efeito do DZP foi bloqueado [F(11, 112)=
13,10; p<0,0001].
Quanto ao número de entradas no braço fechado (Figura 11),
administração da STY, em todas as doses estudadas, não apresentou alteração em
relação ao grupo controle (4,10 ± 0,52). Efeito semelhante foi observado nos grupos
pré-tratados com flumazenil (FLU+STY). Como esperado, os animais tratados com
DZP (2,50 ± 0,52) diminuiu NEBA e esse efeito foi revertido pelo pré-tratamento com
FLU + DZP-1(6,20 ± 0,86) [F(11,118)= 4,054; p<0,0001].
Em relação ao outro parâmetro avaliado TPBF, nenhum efeito foi
observado após o tratamento com a STY (1, 5, 10 ou 20 mg/kg), quando comparado
ao grupo controle (208,5 ± 20,91). Por outro lado, o pré-tratamento com FLU (FLU +
STY) aumentou o TPBF dos animais, quando comparados aos animais tratados,
apenas com STY (STY-1: 192,8 ± 7,37; STY-5: 196,3 ± 15,23; STY-10: 209,4 ±
13,75; STY-20: 190,5 ± 16,39). Novamente, o DZP diminuiu o TPBF e esse teste foi
revertido pelo grupo pré-tratado com FLU (149,7 ± 13,68); [F(11,119)= 14,48;
p<0,0001].
80
Figura 9 – Efeitos da STY sobre o número de entradas no braço aberto (NEBA), no
teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.
Os valores da Figura 9 representam média ± EPM do número de entradas
nos braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por
Tukey, como test post hoc, a,b,c,d,e,f,g,: p< 0,05, quando comparado aos grupos
controle, STY-1, STY-5,STY-10,STY-20, DZP-1, FLU, respectivamente.
Controle
STY-1
STY-5
STY-10
STY-20
FLU+STY-1
FLU+STY-5
FLU+STY-10
FLU+STY-20
DZP-1FLU
FLU+DZP-1
0
5
10
15
a a a a
b
a
c d ef
f,g
NE
BA
81
Figura 10 – Efeito da STY sobre o tempo de permanência nos braços abertos
(TPBA), no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.
Os valores da Figura 10 representam média±EPM no tempo de
permanência nos braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA,
seguido por Tukey, como test post hoc, a,b,c,d,e,f,g,: p<0,05, quando comparado
aos grupos controle, STY-1, STY-5, STY-10, STY-20, DZP-1 e FLU,
respectivamente.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
FLU+S
TY-1
FLU+S
TY-5
FLU+S
TY-1
0
FLU+S
TY-2
0
DZP
-1FLU
FLU+D
ZP-1
0
50
100
150
aa
aa
a
b
cd
e
a
f,g
TP
BA
82
Figura 11 – Efeito da STY sobre o número de entradas nos braços fechados (NEBF),
no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.
Os valores representam média ± EPM do número de entradas nos braços
fechados. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey, como
test post hoc, a,b e c: p<0,05, quando comparado ao controle, STY-1 e FLU,
repectivamente.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
FLU+S
TY-1
FLU+S
TY-5
FLU+S
TY-1
0
FLU+S
TY-2
0
DZP
-1FLU
FLU+D
ZP-1
0
5
10
15
a
b
c
NE
BF
83
Figura 12 – Efeito da STY sobre o tempo de permanência nos braços fechados
(TPBF), no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.
Os valores da representam a média ± EPM do tempo de permanência nos
braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey,
como test post hoc, a: p<0,05, quando comparado STY-1, STY-5, STY-20, DZP-1 e
FLU, respectivamente.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
FLU+S
TY-1
FLU+S
TY-5
FLU+S
TY-1
0
FLU+S
TY-2
0
DZP
-1FLU
FLU+D
ZP-1
0
100
200
300b
a
cd
eT
PB
F
84
5.1.3 Teste da Placa perfurada
Neste modelo experimental, após administração aguda de STY nas doses
de 1, 5, 10 ou20 mg/kg (i.p.), foi observada (Figura 13) aumento do número de
vezes que o animal colocou a cabeça no orifício da placa perfurada (STY-1: 9,0 ±
0,85; STY-5: 8,20 ± 0,61; STY-10: 8,70 ± 0,68; STY-20: 11,60 ± 1,42), comparado
ao controle (5,50 ± 0,59).
Para pesquisar a participação de mecanismos gabaérgicos no mecanismo
de ação da STY em relação a seu efeito ansiolítico, utilizou-se o flumazenil,
diazepam ou STY administrados isoladamente ou associados.
A análise do envolvimento dos receptores benzodiazepínicos no efeito da
STY mostrou que o grupo pré-tratado com FLU (FLU-2,5 +STY, i.p.) reverteu o efeito
ansiolítico da STY no parâmetro avaliado, pois ocorreu diminuição do número de
mergulhos na placa perfurada (head dips) em todas as doses administradas (STY-1:
6,0 ± 1.0; STY-5: 4,60 ± 0,42; STY-10: 5,40 ± 0,46; STY-20: 5,20 ± 0,62).
Como esperado o DZP aumentou o número de head dips, em que o efeito
foi bloqueado pelo pré-tratamento com flumazenil (FLU + DZP).
85
Figura 13 – Efeito da STY sobre o número de mergulhos no teste da placa perfurada.
Os valores da Figura 13 representam média ± EPM do número de
mergulhos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguida por Tukey, como
test post hoc, a,b,c,d,e,f, p<0,05, quando comparado a STY-1, STY-5, STY-10, STY-
20, DZP-1 e FLU, repectivamente.
Contr
ole
STY
-1
STY
-5
STY
-10
STY
-20
FLU+S
TY-1
FLU+S
TY-5
FLU+S
TY-1
0
FLU+S
TY-2
0
DZP
-1FLU
FLU+D
ZP-1
0
5
10
15
aa
a
a
b
a
c d ej
Nú
mero
de m
erg
ulh
os
86
5.1.4 Teste do Rota Rod
No Teste Rota Rod, como demonstrado na Tabela 1, não foram
observadas alterações no número de quedas após o tratamento com STY nas doses
estudadas (STY-1: 0,40 ± 0,22; STY-5: 0,50 ± 0,16; STY-10: 0,40 ± 0,21 e STY-20:
0,40 ± 0,16), comparando com o grupo controle (00 ± 00). O diazepam, padrão
positivo, na dose de 2mg/Kg promoveu aumento no número de quedas DZP-2 (2,00
± 0,23), quando comparado ao controle (00 ± 00) [F(11,113)= 2,586; p<0,0061].
87
Tabela 1 – Efeito da STY, flumazenil e diazepam, no teste de Rota Rod.
Grupos Número de Quedas Tempo de Permanência
Controle 00 ± 00(n=10) 60,0 ± 0,0 (n=10)
STY-1 0,40 ± 0,22 (n=10) 61,40 ± 3,85 (n=10)
STY-5 0,50 ± 0,16 (n=10) 56,00 ± 1,33(n=10)
STY-10 0,40 ± 0,21 (n=10) 56,80 ± 1.69 (n=10)
STY-20 0,40 ± 0,16 (n=10) 56,00 ± 1,63 (n=10)
FLU+STY-1 0,66 ± 0,28 (n=10) 52,00 ± 2,06 (n=10)
FLU+STY-5 0,20 ± 0,13 (n=10) 59,00 ± 1,00 (n=10)
FLU+STY-10 0,30 ± 0,21 (n=10) 57,00 ± 1,52 (n=10)
FLU+STY-20 0,30 ± 0,39 (n=10) 57,00 ± 1,52 (n=10)
DZP-2 2,00 ± 0,23 (n=10) a 49,00 ± 2,76 (10) a
FLU 0,25 ± 0,16 (n=8) 56,25 ±1 ,83 (n=8)
FLU+ DZP-2 1,20 ± 0,41 (n=10) 55,80 ± 1,75 (n=10)
Efeito da STY (1, 5, 10 ou 20 mg/Kg) e DZP (2 mg/Kg) sozinho ou pré-
tratados com FLU (2,5 mg/Kg), no teste de Rota Rod. Valores representam média ±
EPM do número de quedas e tempo de permanência. Em parêntese, o número de
animais por grupo. Análise estatística foi realizada através da ANOVA, seguida por
teste de Tukey, como teste pos hoc. P<0,05: a e b, quando comparado ao controle e
DZP.
88
5.1.5 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico
Neste teste, foram analisados dois parâmetros: a latência de sono (LS)
em segundos e a duração do sono (DS), também em segundos. A STY aumentou a
LS na dose de 20 mg/kg (443,3 ± 86,01) quando comparado ao grupo controle
(241,2 ± 26,29). Como esperado, o diazepam diminuiu a latência de
sono [F(4,58)= 8,044; P < 0,0001].
Em relação à duração do tempo de sono, as doses administradas
aumentaram a DS em relação ao controle. O DZP-1 também aumentou o tempo de
duração do sono em relação ao controle [F(4,48)=38,43;P<0,0001].
Tabela 2 – Efeito da administração da STY na latência de sono e duração do sono
induzida por pentobarbital sódico.
Grupo Latência de sono (seg) Duração de sono (seg)
Controle 241,2 ± 26,29 (10) 1389 ± 158,5 (10)
STY1 mg/kg 269,2 ± 26,56 (10) 2494 ± 426,3 (9) a
STY 10mg/kg 383,7 ± 53,64 (10) 2534 ± 245,8 (10) a
STY 20mg/kg 443,3 ± 36,01 (9) a 2804 ± 284,1 (10) a
DZP-1 104,2± 3,48 (10) a 6047 ± 286,1 (10) a
Nota: Os valores representam a média ± EPM do número da latência de
convulsão e de morte. Em parêntese, o número de animais por grupo. Para análise
estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey como test post hoc. Valores
significativos representam os grupos com diferença estatística relacionada ao
controle.
89
5.1.6 Discussão
Na sociedade moderna, a ansiedade é um dos mais frequentes distúrbios
do sistema nervoso central, sendo considerado problema de saúde pública
significante, pois afeta amplo segmento da população, gerando gastos relacionados
diretamente com os cuidados da doença e das hospitalizações ou, indiretamente,
como no caso de mortalidades e morbidades (BALLENGER, 2000).
Os efeitos biológicos da STY encontradas no gênero Aniba panurensis no
SNC até o momento não foram elucidados. No presente estudo, foram encontradas
evidências farmacológicas do efeito ansiolítico e anticonvulsivante da molécula
estudada nos modelos clássicos para triagem de atividades sobre o sistema nervoso
central. Segundo Ohl (2003), os modelos de screening para o SNC fornecem
informações, tais como atividade locomotora, atividade ansiolítca, atividade
relaxante muscular, antidepressiva, sedativa/ hipnótica e anticonvulsivante.
O gênero Aniba tem sido utilizado em diversos estudos comportamentais
e neuroquímicos em modelos animais no SNC no Laboratório de Neurofarmacologia
da UFC. Da Aniba riparia foi isolado a riparina II que apresenta efeito ansiolítico na
dose de 25 mg/kg (SOUSA et al., 2007). Este efeito pode estar relacionado com o
receptor GABA-A /Benzodiazepínico (MELO et al., 2006). O efeito antidepressivo da
riparina II foi obtido na dose de 50 mg/kg e parece estar envolvido com o sistema
dopaminérgico (SOUSA et al., 2004, MELO, 2006).
Estudos científicos mostram atividades biológicas referentes às espécies
do gênero Aniba, como o efeito ansiolítico (MELO et al., 2006) e antidepressivo
(SOUSA et al., 2004). Sobre a espécie Aniba panurensis, poucas informações
científicas foram encontradas. O estudo de Klausmeyer (2004) mostra que extratos
obtidos da Aniba panurensis apresentam toxicidade para as raças resistentes ao
AZOLE de Candida albicans e o de Assis (2007) a ação vasorelaxante da STY em
aorta de ratos.
A ansiedade e as desordens de comportamento representam problema de
saúde que afeta inúmeros sujeitos na sociedade moderna. A ansiedade é um estado
emocional que envolve aspectos psicológicos e fisiológicos, que faz parte do
contexto normal das experiências humanas, sendo propulsora do desempenho. As
90
manifestações do estado ansioso normal ou patológico são complexas e difíceis de
serem definidas, todavia na forma patológica ocorre a exacerbação da atividade
nervosa central e autonômica, com manifestações clínicas como palidez, sudorese
palmar, palpitação, opressão cordial, constrição da testa, dificuldade respiratória,
distúrbios gastrointestinais, tremor, tontura, boca seca, insônia entre outros (SOUZA
et al., 2007).
Os benzodiazepínicos é a classe de medicamentos mais usada nos
transtornos de ansiedade, todavia não se recomenda o seu uso para tratamento em
longo prazo, pela possibilidade de desenvolver tolerância, alterações cognitivas e na
memória, dependência física e reação de abstinência (WALKER, 1998;
ALLGULANDER et al., 2004; MAGNANI et al., 2010). Esses fármacos são utilizados
como agente hipnótico, anticonvulsivante e relaxante muscular, por serem
considerados eficazes e seguros. Em virtude destes efeitos indesejáveis, estudos
com outras moléculas têm sido desenvolvidas em busca de novos agentes com
efeito ansiolítico. Outras drogas com ação serotonérgica central têm sido usadas,
tais como a buspirona, agonista parcial do receptor 5-HT1A e a ondansetron,
antagonista 5-HT3 (GORMAN et al., 2002; LALONDE; STRAZIELLE, 2009, 2010).
Vários testes comportamentais são utilizados para avaliar ação de
molécula no SNC. Entre estes, o teste de campo aberto, modelo de animal clássico
que permite avaliar efeitos autonômicos de drogas e atividade geral de animais
(NOVAS et al., 1988). O animal, em um ambiente novo, tem tendência para explorar,
apesar da tensão e do conflito. Este teste é utilizado para estudar os efeitos
ansiolíticos ou ansiogênicos de novas moléculas sobre o comportamento do animal
em um novo ambiente. Desta maneira, a locomoção, rearing e grooming em
roedores, observados no campo aberto, são os parâmetros comportamentais mais
usados para descrever ação da administração destas substâncias no SNC
(MONTGOMERY, 1958; ALMEIDA, 2006). Ressalta-se que estudos também
informam ausência de sensibilidade para modulação da ansiedade neste modelo
(SAUDOU et al., 1994).
Durante o experimento, observou-se o comportamento de locomoção
(número de linhas cruzadas no chão da arena pelo animal), frequência de
exploração vertical (rearing), autolimpeza (grooming).
91
Neste trabalho, no teste de campo aberto, foi observado aumento na
atividade locomotora após administração da STY nas maiores doses 10 ou 20
mg/kg. Estes resultados sugerem ação excitatória sobre o SNC e efeito ansiolítico. O
diazepam, na dose de 2 mg/kg, diminuiu atividade locomotora, mostrando efeito
sedativo, conforme esperado. o flumazenil aumentou a atividade locomotora. O
diazepam, na dose de 2 mg/kg, tem sido utilizado em experimentos para avaliar
atividade locomoto ra, mostrando seu efeito sedativo (SOUSA et al., 2007; MELO et
al, 2010). Aumento ou diminuição deste comportamento pode ser utilizado como
medida para o nível de ansiedade (CRAWLEY, 1985; PELLOW, 1985).
A atividade de rearing consiste em o animal levantar-se sobre as patas
traseiras, como que investigando o ambiente, parece estar relacionada com a
hiperatividade dopaminérgica (SWANSON et al., 1997). No presente trabalho, não
houve alteração de rearing entre as doses administradas de STY. O diazepam (2
mg/kg) diminuiu o rearing, enquanto o flumazenil (2,5 mg/kg) aumentou. Na
literatura, o número de rearings tem sido descrito como aspecto de comportamento
exploratório (ESPEJO, 1997; SWANSON et al., 1997).
O aumento de grooming foi observado em roedores apreensivos
(ARCHER, 1973), e, em alguns estudos, pesquisadores observaram que drogas
ansiolíticas reduzem o grooming em campo aberto (DUNN et al., 1981; MOODY et
al., 1993). De acordo com MacFarland e Reeder (1974), quase todos os animais
gastam significante parte do tempo no comportamento de grooming. Embora vários
transmissores possam modular a expressão deste comportamento (MOODY et al.,
1993), a dopamina está particularmente envolvida (DRAGO, 1999; SERAFIM;
FELÍCIO, 2001;KAUUEFF, TUOHIMAA, 2005). Neste estudo, a STY aumentou o
número de grooming no campo aberto na maior dose STY 20 mg/kg. Este resultado
pode estar relacionado com a modulação de neurotransmissores envolvidos neste
comportamento.
Conforme Starr et al., (1989), existe participação dos receptores
dopaminérgicos D1 e D2 interagindo na locomoção e na estereotipia. Ativação dos
receptores D1 leva a locomoção (STAR et al., 1989) enquanto que ativação de D2
produz o comportamento estereotipado (USHIJIMA et al., 1995). O número
excessivo de grooming tem sido usado como modelo para avaliar desordens
obsessivas compulsivas (FEUSNER; HEMBACHER; KATHARINE, 2009). Agonistas
92
de receptores dopaminérgicos podem causar comportamentos estereotipados em
animais e exacerbar os sintomas das desordens obsessivas compulsivas e tics
(GOODMAN; GILMAN, 2012). Há evidências do envolvimento da via glutamatérgica
no comportamento excessivo de grooming em modelo animal (WELCH et al., 2007).
Diante desses resultados, pode-se sugerir que STY em altas doses (20
mg/kg) estimula os receptores dopaminérgicos do tipo D1, já que aumentou
atividade locomotora espontânea e estimulou receptores D2, produzindo o
comportamento de grooming. Contudo, são necessários estudos adicionais com a
molécula de STY.
Outros modelos conceituados para avaliar o possível efeito ansiolítico ou
ansiogênico é o Labirinto de Cruz Elevado (LCE) e a placa perfurada. Estes testes
buscam verificar aversão natural de um roedor por espaços abertos. O LCE constitui
modelo animal de ansiedade validado primeiramente para ratos (PELLOW et al.,
1985) e, posteriormente, para camundongos (LISTER, 1987). Os roedores evitam os
braços abertos do labirinto, pois é área desprotegida, permanecendo nos braços
fechados, que é área protegida. Os índices de mensuração primária da ansiedade
neste modelo consistem de medidas relativas à frequência de entradas aos braços
abertos e o tempo gasto pelos animais nestas áreas aversivas do aparato.
O LCE permite a visualização do comportamento espontâneo do animal,
sem necessitar de treinamento prévio. Neste estudo, a STY em todas as doses
aumentou o número de entradas e do tempo de permanência nos braços abertos
dos camundongos. Estas alterações indicam atividade exploratória de áreas
consideradas potencialmente perigosas, indicando efeito ansiolítico resultante da
administração da STY em todas as doses administradas. Efeito similar foi observado
com o DZP, BDZ é um padrão utilizado como controle positivo, sugerindo ação do
tipo ansiolítico para esta molécula.
Portanto, para avaliar o mecanismo de ação envolvido no efeito
ansiolítico, utilizou-se o flumazenil (2,5 mg/kg) antagonista de receptores
benzodiazepínicos. Flumazenil liga-se com alta afinidade a receptores de BZD sem,
no entanto, apresentar atividade intrínseca (DELUCIA et al., 2007).
Para realização do experimento, foram utilizados diferentes grupos pré-
tratados com flumazenil, 15 minutos antes de serem tratados com STY. Os
93
resultados mostraram que o FLU bloqueou as ações ansiolíticas da STY e sugerem
o envolvimento dos receptores GABA-A. Estes resultados estão de acordo com os
dados de outros pesquisadores que demonstraram o efeito ansiolítico da estéril - 2-
pirona natural, encontrada em outras espécies de plantas, que apresentam estrutura
química semelhante a utilizada neste estudo, como a dihidroestiril-2-pironas e três
estiril-2-pironas isoladas da P. sabulosa (DUARTE et al., 2007), e 7, 8-
dihidrokavaína e 5, 6- dihidrokavaína Piper methysticum com ação ansiolítica
atribuída às kavalactonas (SMITH et al., 2001; BILIA et al., 2004).
O teste da placa comportamento de mergulho pode refletir os estados
ansiolíticos e ansiogênicos (TAKEDA et al., 1998). Com base nesses estudos e em
informações que a expressão de um estado ansiolítico em animais pode ser refletida
por um aumento no comportamento de mergulhos, os resultados forneceram
evidências que a STY apresentou efeito ansiolítico, nas doses 1,5,10 ou 20 mg/kg
administradas por via intraperitonal. Este efeito foi bloqueado com uso do FLU,
mostrando a participação dos receptores GABAérgicos no mecanismo de ação.
Flumazenil é um derivado imidabenzodiazepina, é um dos vários
derivados 1,4-benzodiazepínico com alta afinidade pelo receptor benzodiazepínico
que age como antagonista competitivo. É o único antagonista dos receptores BDZs
utilizado na clínica, pois sua ação consiste em bloquear algumas das ações dos
BDZs. No entanto, não antagoniza os efeitos de outros sedativos-hipnóticos no SNC
como etanol, opióides e anestésicos gerais. Flumazenil também é utilizado como
droga para o diagnóstico de intoxicação pelos BDZs. Flumazenil liga-se
especificamente aos receptores BDZs no cérebro, bloqueando os efeitos
comportamentais, neurológicos e eletrofisiólogicos de vários benzodiazepínicos, mas
desprovido de efeitos farmacológicos (KLEINGEIST et al., 1998).
Outro teste utilizado para avaliar ação da molécula no SNC é o teste de
Rota Rod, entretanto é amplamente usado para medir o desempenho da
coordenação motora em animais (SEDELIS et al., 2001). Desta forma, pode-se dizer
que é um modelo simples que serve para detectar déficits neurológicos em ratos e
camundongos (DUNHAM; MIYA, 1957).
Segundo Carlini e Burgos (1979), esse teste mede o efeito de
relaxamento muscular ou incoordenação motora. Nesse caso, quanto mais intenso
94
for o efeito, menor será o tempo em que o animal consegue se equilibrar sobre a
barra (ALMEIDA, 2006). No entanto, trata-se de um método não específico, uma vez
que mede indistintamente, efeitos neurológicos, estimulantes e depressores sobre a
coordenação motora, aos quais também é atribuído o termo neurotoxicidade
(DALLMEIER; CARLINI, 1981).
No presente estudo, a STY não causou alteração na coordenação motora
no teste de Rota Rod nas doses administradas. Este resultado sugere que a
molécula de STY não apresenta atividade miorelaxante.
Outro teste realizado foi o do tempo de sono induzido por pentobarbital
sódico, com a finalidade de investigar possível atividade do tipo hipno-sedativa da
Aniba panurensis. Este teste permite identificar se determinada droga apresenta
efeito sedativo/hipnótico, considerando que duas drogas, quando apresentam o
mesmo efeito farmacológico, somam-se.
Os BDZ apresentam ação nos subtipos específicos de receptores GABA-
A, as ações dos barbitúricos, como o pentobarbital, são mais extensas e menos
específicas (JOHNSTON, 1996). O pentobarbital é uma droga capaz de induzir sono
em roedores e humanos por sua ação direta sobre o sítio de ligação de barbitúricos,
localizado especificamente entre as subunidades α1 e β1, que compõem o canal de
cloreto do complexo receptor GABA-A (GOTTESMANN, 2002;MUROI, Y.;
CZAJKOWSKI, JACKSON, 2006), aumentando a influência inibitória sobre o sistema
nervoso central.
Os barbitúricos, de maneira geral, induzem sono de ondas lentas e são
capazes de inibir o sono paradoxal. A estimulação dos sítios de ligação pelos
barbitúricos, particularmente na área pré-óptica ventrolateral, inibe o núcleo
tuberomamilar hipotalâmico, os núcleos da rafe e o locus coeruleus (na formação
reticular), estruturas que causam ativação cortical e excitação comportamental.
Assim, a inibição destas estruturas suprime o alerta e a ativação comportamental,
resultando no sono ou hipnose (CARLSON, 2002; GOTTESMANN, 2002; DUARTE,
2007).
Os resultados da STY mostram aumento na latência do sono na maior
dose (20 mg/kg) e na duração do tempo de sono nas doses administradas. Neste
experimento, o aumentona latência de sono está em consonância com o resultado
95
no teste do campo aberto, do qual os animais tratados STY tiveram aumento na
alteração da atividade locomotora espontânea.
Um resultado positivo neste teste não garante efeito hipno-sedativo puro,
uma vez que a interferência de fatores farmacocinéticos não pode ser descartada,
pois os barbitúricos são drogas metabolizadas hepaticamente, pelo complexo
citocromo P-450 NADPH e O2 (GOODMAN; GILMAN, 2012).
Os testes de comportamento em modelos animais realizados com STY
fornecem evidências da ação ansiolítica, sem interferência na coordenação motora.
Este estudo contribui consideravelmente para a pesquisa na área de plantas
medicinais, pois fornece informações relevantes sobre os efeitos biológicos molécula
dessas no SNC.
96
5.1.7 Conclusão
Os resultados com a STY nos modelos animais de ansiedade e tempo de
sono permitiu as seguintes conclusões.
No teste do campo aberto, a STY aumentou atividade locomotora
espontânea dos animais, efeito dose dependente da dose (doses altas), sugerindo
que a molécula apresenta efeito excitatório, desprovido de efeito sedativo.
No teste do Labirinto em Cruz Elevado e placa perfurada, a STY
comprovou seu efeito ansiolítico em todas as doses administradas.
O mecanismo de ação ansiolítico da STY pareceu estar relacionado
com o receptor GABA-A benzodiazepinico, pois o seu efeito ansiolítico foi revertido
pelo flumazenil, antagonista deste receptor.
No teste Rota Rod, a coordenação motora dos animais não foi alterada,
mostrando que os efeitos desta molécula não estavam relacionados com o bloqueio
neuromuscular periférico, mas com ação central.
No teste de indução do tempo de sono por pentobarbital, a STY
potencializou a latência de sono somente na maior dose. Por outro lado, em todas
as doses a STY aumentou o tempo de sono. Este efeito pode estar envolvido com
alterações farmacocinéticas do pentobarbital ou mecanismo de regulação do sono.
97
5.2 Capítulo II: Dosagem de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e
corpo estriado de camundongos tratados de forma aguda com STY após os
testes comportamentais
5.2.1 Resultados
5.2.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal,
hipocampo e corpo estriado de camundongos após tratamento com STY
Os resultados da Figura 14A mostram a concentração dos aminoácidos
excitatórios no CPF, após administrações de STY (1 ou 20 mg/kg, i.p.) ou veículo
sobre as concentrações de aminoácidos (μmol/g de tecido) em camundongos. Após
administração de STY, a concentração de ASP foi reduzida somente na dose de
1mg/kg (3596 ± 225,1), quando comparado ao controle (4427 ± 193) [F(3,22)=4,705;
p<0,0001]. STY elevou as concentrações de GLU nas doses de 10 ou 20 mg/kg em
210,8% e 253,5%, respectivamente (STY-1: 6822 ± 573,6; STY-20: 8203 ± 127,3
quando comparado ao controle (3235 ± 524) [F(3,23)=31,83; p<0,0001].
Quanto aos aminoácidos inibitórios no CPF, após administração da STY,
houve redução da GLI na dose de 20 mg/kg (3805 ± 395,8), quando comparado ao
controle (7463 ± 536,2) [F(3,23)=16,30; p<0,0001]. Houve aumento nas
concentrações de HIS (8309 ± 1288) e TAU (20,33 ± 1,78) somente na maior dose
(20 mg/kg), quando comparado ao grupo controle (HIS: 1819 ± 222,7; TAU: 3120 ±
294,7), [F(3,22)=20,97; p<0,0001]. Esse aumento de TAU equivale a 651,6%
[F(3,20)=74.12; p<0,0001]. Foi observado aumento do GABA 462,5% e 722,4%,
repectivamente, após STY (STY-1: 6915 ± 641,6; STY-20: 10801 ± 1,17), quando
comparada ao controle (1495 ± 194,3) [F(3,23)=35,91; p<0,0001].
98
Figura 14 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em córtex pré-frontal de camundongos
Figura A
Figura B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 7-
8). Análise estatística foi realizada através de ANOVA e teste de Tukey como post
hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP),
glutamato (GLU), glicina (GLI), histidina (HIS), taurina (TAU) e ácido γ-aminobutírico
(GABA).
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-20
0
2000
4000
6000
8000
10000
ASPGLU
a
aa
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
Córtex pré-frontal
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
0
5000
10000
15000
20000
25000
GLI HIS TAU GABA
a,b
a,b
a,b
a
a,b
µm
ol/
g d
e te
cid
o
99
5.2.1.2 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY
Foi observado aumento na concentração de ASP, Figura 15 A, após o
tratamento agudo com STY em ambas as doses (STY-1: 5304 ± 499,8; STY-20:
7271 ± 348,7) quando comparado com o controle (3143 ± 535,5) [F(3,23)=19,43;
p<0,0001]. Efeito semelhante foi encontrado nas concentrações de GLU, porém
somente com tratamento na maior dose (STY-20: 9214 ± 558,8), quando comparado
ao controle (4053 ± 683,3) [F(3,23)=24,70; p<0,0001].
Em relação aos aminoácidos inibitórios, Figura 15 B, após a
administração da STY, a concentração de GLI aumentou 1.242%, na dose STY-20
(85,73 ± 1,80), comparado ao controle (6,09 ± 1,10) [F(3,23)=776,6; p<0,0001].
Aumento semelhante foi observado nas concentrações de HIS, TAU e GABA, com
maior dose de STY (HIS:10,38 ± 431,3; TAU:18,34±570.7; GABA: 23758 ± 1,33),
quando comparado ao controle (HIS:1919 ± 301,5; TAU: 4555 ± 642,9; GABA: 3843
± 569,6). Na maior dose de STY, o percentual de aumento foi TAU 541% e GABA
617%. HIS, TAU, GABA [F(3,23)=138,7; p<0,0001], [F(3,23)=170,2; p<0,0001],
[F(3,23)=115,1; p<0,0001], respectivamente.
100
Figura 15 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em hipocampo de camundongos.
Figura A
Figura B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 7-
8). Análise estatística foi realizada através de ANOVA e teste de Tukey como post
hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP),
glutamato (GLU), glicina (GLI), histidina (HIS), taurina (TAU) e ácido γ-aminobutírico
(GABA).
Hipocampo
Contr
ole
STY-1
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-20
0
5000
10000
15000
ASP GLU
a
a,b
a,b
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
Hipocampo
Contr
ole
STY
-1
STY
-20
Contr
ole
STY
-1
STY
-20
Contr
ole
STY
-1
STY
-20
Contr
ole
STY
-1
STY
-20
0
20000
40000
60000
80000
100000
GLI HIS TAU GABA
a
a,b
a,ba,b
a,b
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
101
5.2.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no corpo estriado de
animais pré-tratados com STY
Após administração de STY, as concentrações de ASP aumentaram na
menor dose administrada (STY-1: 36415 ± 735,6), quando comparado com o
controle (11036 ± 1085) [F(3,23)= 251,2; p<0,0001]. Efeitos opostos foram
observados nas concentrações de GLU. A menor dose reduziu (STY-1: 5399 ±
655,8), enquanto a maior dose aumentou a concentração (18195 ± 845,2),
comparado ao controle (12370 ± 1,371 (8) [F(3,23)=40,70; p<0,0001] (Figura 16A).
A Figura16 B aduz os resultados dos aminoácidos inibitórios após a
administração da STY. A concentração de GLI, TAU e GABA aumentou na maior
dose (GLI: 14639 ± 749,8; TAU: 84325 ± 1884; GABA: 23838 ± 803,6), comparado
ao controle (GLI: 5281 ± 881,4; TAU: 24954 ± 3327; GABA: 19094 ± 1160). GLI
[F(3,23)=40,35; p<0,0001]; TAU: [F(3,24)=53,26; p<0,0001] GABA: [F(3,23)=102,9;
p<0,0001] e HIS [F(3,23)=40,35; p<0,0001]. Contudo, administração de STY em
baixa dose reduziu a concentração de HIS e GABA (HIS: 19554 ± 1734; GABA:
16906 ± 1160), comparado ao controle (HIS: 5179 ± 588.6; GABA: 19094 ± 1160).
102
Figura 16 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em corpo estriado de camundongos.
Figura A
Figura B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 7-
8). Análise estatística foi realizada através de ANOVA e teste de Tukey como post
hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP);
glutamato (GLU), glicina (GLI), histidina (HIS), taurina (TAU) e ácido γ-aminobutírico
(GABA).
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
0
10000
20000
30000
40000
ASP GLU
Corpo estriado
a
a,b
a
µmol
/g d
e te
cido
Corpo estriado
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
Controle
STY-1
STY-20
0
20000
40000
60000
80000
100000
GLI HIS TAU GABA
a,b
a
a,b
a,ba
aµmol
/g d
e te
cido
103
5.2.2 Discussão
Os aminoácidos, como neurotransmissores e suas funções no sistema
nervoso central, tem despertado o interesse de pesquisadores nos últimos anos.
Desta forma, procurou-se determinar a influência da STY administrada de forma
aguda nas concentrações dos aminoácidos mais estudados no SNC, sendo o
glutamato (GLU) e aspartato (ASP) excitatórios, seguidos da glicina (GLI), histidina
(HIS), taurina (TAU) e o ácido γ-aminobutírico (GABA) inibitórios (DANBOLT, 2001;
HAN et al., 2011).
Neste estudo, as concentrações de GLU, ASP, GLI, HIS, TAU e GABA
foram determinados no córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado de
camundongos, após administração de STY (1 ou 20 mg/kg, i.p.).
No córtex pré-frontal, após administração aguda de STY, as
concentrações dos dois principais aminoácidos GLU e GABA aumentaram em
ambas as doses, mostrando alteração destes aminoácidos. De acordo com Del Arco
e Mora (1999), o glutamato tem efeito modulatório sobre o sistema gabaérgico em
que um aumento de glutamato endógeno no córtex pré-frontal está relacionado com
concentrações aumentadas de GABA extracelular. O córtex pré-frontal
funcionalmente regula a liberação de dopamina no estriado dorso lateral, que é
mediado por receptores do ácido γ-aminobutírico tipo GABA-A, alterando as funções
de locomoção e rearing (DEL ARCO; MORA, 1999).
O córtex pré-frontal é uma das estruturas que compõem o sistema
límbico, juntamente com hipocampo, hipotálamo, amígdala, tálamo e giro cingulado
(LENT, 2004). O córtex pré-frontal medial (CPFM) tem sido alvo de interesse dos
pesquisadores, por possuir conexões proeminentes com amígdala e outras
estruturas límbicas. O sistema límbico é considerado o centro emocional do cérebro.
Nesta área, encontram-se os mecanismos que regulam o medo e a ansiedade
(PRICE; DREVETS, 2010). O CPFM participa de funções importantes, como
memória, aprendizado e tomada de decisões, planejamento e execução de tarefas
complexas, além de participar da modulação autonômica e endócrina em resposta
ao estresse (CZEH et al., 2008). Anormalidades nessa área cortical parecem
104
favorecer o desenvolvimento de ansiedade, depressão (MUSAZZI et al. 2010, 2011)
e toxicodependência (GOLDSTEIN; VOLKOW, 2011).
O glutamato é o neurotransmissor mais predominante no SNC de
mamíferos, medeia à transmissão química na maioria das sinapses do sistema
nervoso central, em aproximadamente 50%, e está envolvido em muitos processos
fisiológicos, desde o desenvolvimento da formação de sinapses à aprendizagem e
memória. O glutamato está envolvido na síntese de ácidos graxos, e incorporado em
proteínas, contribui com a regulação dos níveis de amônia e o controle do balanço
osmótico e aniônico, serve como precursor para o GABA e vários intermediários do
Ciclo de Krebs (ALMEIDA, 2006).
O glutamato é convertido a GABA pela ação da enzima mitocondrial
glutamato descarboxilase (GAD), que é encontrada quase que exclusivamente em
neurônios gabaérgicos. O GABA pode ser inativado através da receptação por
transportadores de alta afinidade que se encontram localizados nos neurônios e nas
células gliais através da reação de transaminação catalisada pela enzima GABA
transferase (PURVES et al., 2005; GOLAN, 2010).
O aspartato atua como agonista relativamente seletivo de receptores
glutamatérgicos NMDA extrassinápticos, que estão relacionados com a
excitotoxidade (BRADFORD; NALDER, 2004). O entendimento do mecanismo da
modulação mútua entre os aminoácidos é complexo, pois envolve muitas vezes mais
de um sistema. Os dados obtidos no presente estudo, no teste de comportamento
(EPM e PF), sugerem que a STY é uma molécula que produz efeitos ansiolíticos.
Esse efeito excitatório do glutamato pode estar sendomodulado pela atividade
serotonérgica. Torna-se difícil o estudo dos aminoácidosem virtude da interligação
entre os excitátórios e inibitórios.
O GABA é encontrado em abundância no tecido cerebral (cerca de 10
µmol/g tecido), no sistema nigroestriado, e em concentração menor em toda a
substância cinzenta (2-5µmol/g tecido) (RANG et al., 2007). Este aminoácido atua
como neurotransmissor em muitas vias diferentes do SNC e também na medula
espinhal. É liberado principalmente por interneurônios curtos, sendo que os únicos
tratos gabaérgicos longos são projetados do cerebelo para o estriado (RANG et al.,
2007). As alterações ocorridas nesse aminoácido são descritas na fisiopatologia de
105
doenças como ansiedade, epilepsia e, possivelmente, esquizofrenia (SHAH et al.,
2002).
Além disso, administração de STY, nas maiores doses, aumentou a
concentração dos aminoácidos inibitórios HIS e TAU no CPF. Segundo L’Amoreaux
(2010), a TAU interage com os receptores GABA-A, no entanto a identidade
molecular do receptor de TAU não está totalmente elucidada. Nos resultados deste
estudo, observou-se aumento de TAU e GABA no CPF com percentual de 651,6% e
722,4%, respectivamente. Para L’Amoreaux (2010), a relação entre o aumento das
concentrações de GABA sugere que os efeitos da STY relacionados a este
aminoácido são similares aos encontrados em drogas benzodiazepínicas. Sabe-se
que os BZDs aumentam as concentrações de GABA (PEREIRA, 2009).
Estudos dos aminoácidos na neurotransmissão têm sido realizados em no
laboratório pesquisado. Várias substâncias estão sendo estudadas e os aminoácidos
determinados em diferentes concentrações. Dentre estas substâncias, a cumarina,
de origem vegetal que em testes comportamentais, mostra a diminuição da
atividade locomotora, no teste do campo aberto, confirmando o efeito inibitório e
sugerindo que este efeito comportamental está relacionado com elevação nas
concentrações de GABA no córtex pré-frontal (PEREIRA, 2009).
Outra área estudada foi o hipocampo, região do lobo temporal, envolvida
nos processosde consolidação da memória, como a espacial e contextual
(FERBINTEANU; SHIRVALKAR; SHAPIRO, 2011), além de possuir também função
mais geral no processamento das informações e subsequente regulação no
comportamento.
A STY, na maior dose, após os teste de comportamento na maior dose
(20 mg/kg), aumentou a concentração dos aminoácidos no hipocampo: GLU
(excitatório), GLI, GABA e TAU (inibitórios). Neurônios glutamatérgicos no
hipocampo podem liberar GABA, por mecanismo de compensação, que atuaria de
forma a minimizar a excitação produzida pela atividade excessiva do glutamato
(HIBBERT et al., 2005). A função inibitória do GABA no hipocampo tem sido bem
relatada na literatura (CASTRO-SIERRA et al., 2007; RANG et al.,2007 ). O aumento
de GABA nesta estrutura faz com se pense em uma correlação da STY com
ansiedade nessa região.
106
Outro aminoácido estudado foi a taurina, encontrado em grande
quantidade no hipocampo, nos interneurônios, nos neurônios piramidais e nas
células granulares denteadas (MAGNUSSON et al., 1989). Estudos têm
demonstrado que os receptores do glutamato ionotrópicos NMDA, agonistas do
cainato e AMPA evocam a liberação de taurina no cérebro em desenvolvimento e
em adultos (MAGNUSSON et al., 1991; SARANSAARI; OJA 1991). A taurina inibe o
dano nos neurônios piramidais do hipocampo, por meio do aumento da condutância
do íon clotero que leva a hiperpolarização. Para Frosini et al. (2003), a taurina é um
agonista dos receptor GABA-A, uma vez que o influxo de cloro ativa os neurônios
pós-sinápticos deste receptor. No entanto, para Smith et al. (2006), a TAU é
considerada agonista fraco dos receptores GABA-A.
Como demonstrado nos experimentos, ocorreu aumento de TAU, nas
áreas estudadas: córtex pré-frontal (651,6%) hipocampo (541%) e corpo estriado
(541%) após administração da STY (20 mg/kg). Esses resultados mostram que a
STY altera as concentrações de TAU somente na maior dose. O aminoácido
inibitório taurina tem apresentado importante papel na manutenção da homeostase
cerebral, além de ter uma ação protetora sobre os neurônios diante dos efeitos
excitotóxicos evocados pelos aminoácidos excitatórios, atenuando o influxo de cálcio
durante a isquemia (WANG et al., 2005, 2007). Em estudo prévio, TAU elevou a
condutância da membrana íon cloreto, ao abrir os canais de cloreto, então,
induzindo a hiperpolarização dos neurônios no hipocampo, e reduzindo a
excitabilidade celular (DEL OLMO et al., 2000).
A histidina precursora do neurotransmissor histamina está envolvida com
várias funções no SNC. Dentre estas, citam-se o ritmo circadiano e o sono (DERE et
al., 2003), a motivação, as alterações comportamentais (IMAIZUMI et al., 1994), a
ansiedade (FAGNELLO; MATTIOLLI, 2007), o medo, a percepção da dor, a
aprendizagem e memória (GIANLORENÇO; CANTO-DE-SOUZA, MATTIOLI, 2010,
2011).
Os receptores de histamina H3 encontram-se localizados nos neurônios
pré-sinápticos, podendo atuar como autorreceptores, além de estarem envolvidos
com a síntese e regulação da liberação de histamina. Os corpos celulares
histaminérgicos são encontrados no núcleo tuberomamilar do hipotálamo posterior e
107
inervam praticamente todas as regiões do SNC (HASS; SERGEEVA; SELBACH,
2008).
O estudo de Zarrindast et al. (2006) mostra que após microinjeção de
histamina no hipocampo dorsal de ratos expostos ao LCE, ocorreu aumento do
percentual de entradas nos braços abertos, caracterizando, assim, efeito ansiolítico
da histamina. Os autores sugerem que o efeito ansiolítico da histamina é mediado
por receptores H1, pois ao administrar microinjeções de pirilamina (antagonista H1)
e histamina, os animais diminuíram o tempo percentual e a entrada nos braços
abertos. No estudo de Gianlorenço, Canto-De-Souza e Mattioli (2011), após
administração de L-histidina no hipocampo dorsal de camundongos, os resultados
mostraram efeito ansiolíticos no teste do LCE.
No presente trabalho, o tratamento com STY 20 mg/kg promoveu o
aumento da histidina no córtex pré-frontal e hipocampo. Este resultado confirma os
achados no LCE, em que os animais aumentaram o TEBA e TPBA. Resultado
similar confirmando ação ansiolítica foi encontrado no teste da placa perfurada com
o aumento dos mergulhos no equipamento utilizado para o teste. No corpo estriado,
ocorreu o aumento da histidina na menor dose, com ação ansiolítica no LCE e placa
perfurada. Os resultados obtidos apontam para efeito ansiolítico da STY, mediado
pelos receptores H1, que se encontram localizados principalmente no hipocampo
dorsal de camundongos.
Outro aspecto importante do sistema histaminérgico é a participação na
regulação, síntese e liberação de histamina neural e de outras aminas biogênicas
tais como acetilcolina, glutamato e GABA (HASS; SERGEEVA; SELBACH, 2008).
A dosagem da concentração de aminoácidos no SNC pode fornecer
informações novas, no sentido de facilitar a compreensão das alterações ocorridas.
No estudo de Chan et al. (2010), foi determinada a concentração de aminoácidos
no sistema nervoso central em camundongos alimentados e em jejum no córtex
pré-frontal, hipotálamo, hipocampo, amígdala e medula. Os resultados encontrados
mostram que o glutamato foi encontrado em todas as áreas estudadas. As
concentrações de GLU, GABA e ASP não sofreram alterações, enquanto que a
glutamina e leucina foram aumentadas no hipocampo. Neurônios de fibras
excitatórias do hipocampo (glutamatérgicas) podem liberar GABA, principalmente
108
quando atividade excitatória estiver aumentada (CHAN et al., 2010). A STY no
hipocampo aumentou as concentrações de ASP, GLU, GLI, HIS, TAU e GABA,
demonstrando a complexidade em relação à modulação destes aminoácidos.
O corpo estriado foi outra área utilizada nos experimentos para
identificação da concentração dos aminoácidos. Em relação aos aminoácidos
excitatórios, na menor dose, ocorreu o aumento do ASP, enquanto GLU aumentou
na maior dose. Os aminoácidos inibitórios aumentaram na maior dose GLI (27,7%),
TAU (337%) e GABA (12,4%).
O estriado é constituído por aproximadamente 95% de neurônios
GABAérgicos do tipo espinhososmédios. Estes neurônios dão origem a quase todos
os impulsos de saída estriatais, projetam-se para o globo pálido e a substância
negra, e são alvo de impulsos de entradas excitatórias proveniente do córtex e
tálamo de fibras dopaminérgicas originárias da substância negra e área tegmentar
ventral, de axônios locais colaterais, de outros neurônios espinhais e de
interneurônios estriatais (GERFEN, 1992). Os interneurônios estriatais, que são do
tipo não espinhosos e fazem conexão com os espinhosos médios (MINK, 1999).
Esses interneurônios diferem em seus tamanhos e em neurotransmissores. Os
neurônios piramidais corticoestriatais são, em sua maioria, glutamatérgicos
(GERFEN, 2003).
Os neurônios que chegam ao estriado, vindos do córtex cerebral, têm
seus corpos nas seguintes áreas: sensoriais; pré-frontal; motoras; pré-motoras; e
límbicas (GERFEN, 2003). Dourmap et al. (1997) demonstraram que o corpo
estriado possui uma importante inervação dos sistemas opioide e glutamatérgico.
A STY aumenta as concentrações de aminoácidos excitatórios ASP e
GLU nos neurônios estriatais, podendo ser relacionado com aumento da
neurotransmissão glutamatérgica, possivelmente por interagir com receptores
ionotrópicos do tipo NMDA (RANGE et al., 2007). A STY aumenta a concentração de
aminoácidos inibitórios, em particular de GABA, produzindo efeito similar aos
benzodiazepínicos. Possivelmente, esta molécula tem afinidade pelos subtipos de
receptores GABA-A.
109
A quantificação da concentração dos aminoácidos neurotransmissores em
modelos animais é importante ferramenta para identificação de novas moléculas
com potencial terapêutico.
110
5.2.3 Conclusões
Os resultados da concentração dos aminoácidos após a STY, nas áreas
cerebrais do córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado, permitiu as seguintes
conclusões:
No córtex pré-frontal, o aumento do GLU pode explicar o
aumento nos parâmetros comportamentais, enquanto os inibitórios, parecem
modular este comportamento, sem causar sedação, o que pode explicar ação
ansiolítica da STY nos modelos de LCE e placa perfurada.
No hipocampo, em camundongos tratados com STY, mostraram
que esta molécula aumentouas concentrações de GLU e ASP e aumento d as
concentrações de GLI, HIS, TAU e GABA. Esses resultados sugerem que a
STY tem ação não seletiva nesses aminoácidos, podendo interferir nos
aminoácidos excitatórios e inibitórios ao mesmo tempo.
No corpo estriado, o principal efeito observado foi aumento dos
aminoácidos inibitórios, porém esse efeito somente foi observado, após o uso
da STY na maior dose.
111
5.3 Capítulo III: Efeitos da molécula de STY nos modelos de convulsão
induzidos por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina
5.3.1 Resultados
5.3.1.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol
No modelo de convulsão induzido por PTZ, os parâmetros de latência de
convulsão e latência de morte encontram-se na Tabela 1. Nenhuma alteração foi
observada na latência de convulsão nos grupos pré-tratados com STY (em todas as
doses estudadas), quando comparadas ao controle (61,60 ± 4,78). Como esperado,
o grupo pré-tratado com DZP (1 mg/kg) intensificou esse parâmetro. Neste teste, os
animais exibiram convulsão [F(4,50)=24,63; p<0,0001].
Por outro lado, a STY aumentou a latência de morte nas doses de 10
mg/kg (343,7 ± 30,03) e 20 mg/kg (3,44 ± 69,68) comparado com o grupo controle
(154±17,27). Apenas os animais do grupo STY-20 e DZP apresentaram percentual
de sobrevivência de 10 e 70%, respectivamente [F(4,49)=36,25; p<0,0001].
Tabela 3 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis, no modelo
convulsão induzido por PTZ em camundongos.
Grupo
(mg/kg)
Latência de
Convulsão (s)
% Animais
exibidindo
convulsão
Latência de
Morte (s)
Animais
sobreviventes(%)
Controle 61,60 ±4,78 (10) 100 154,0 ±17,27 (10) 0
STY-1 60,70 ±2,48(10) 100 215,8 ±16,60(10) 0
STY-10 67,27 ±3,0 9 (10) 100 343,7 ±30,03(10)a 0
STY-20 68,90 ±3,49 (10) 100 344 ±69,68 (10)a 10
DZP-1 122,5 ±9,44 (10)a 100 1007 ±98,98(10)a 70
112
Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da
latência de convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido
por Tukey no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em
relação ao grupo controle.
5.3.1.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricnina
Outro modelo utilizado foi a convulsão induzida por estricnina (Tabela 2).
Neste modelo, os animais pré-tratados com STY nas doses 10 ou 20 mg/kg
aumentaram a latência de convulsão (STY-10: 50,42 ± 7,20; STY-20: 65,99 ± 3,22),
quando comparado ao grupo controle (26,73 ± 2,73). Efeito semelhante, também, foi
observado com o grupo pré-tratado com diazepam, (DZP-1: 30,90 ± 1,12)
[F(4,53)=9,318 ; p<0,0001].
Nos grupos pré-tratados com STY, houve aumento na latência de morte
dos animais (STY-1: 20 ± 1,72; STY-10: 19,17 ± 1,87; STY-20: 23,83 ± 1,55)
comparado ao controle (12,18 ± 0,93). Diazepam (1 mg/kg) também aumentou a
latência de morte (DZP-1: 71 ± 6,89), quando comparado ao grupo controle
[F(4,54)=53,59; p<0,0001]. Os animais convulsionaram e, posteriormente, morreram.
Tabela 4 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis, no modelo
convulsão induzido por estricnina em camundongos.
Grupo
(mg/kg)
Latência de
Convulsão (s)
% Animais
exibidindo
convulsão
Latência de
Morte (s)
Animais
sobreviventes
(%)
Controle 26,73 ± 2,73(11) 100 12,18 ± 0,93 (11) 0
STY-1 38,90 ± 6,93(10) 100 20,0 ± 1,72 (12)a 0
STY-10 50,42 ± 7,20 (12)a 100 21,30 ± 1,45(10)a 0
STY-20 65,99 ± 3,32 (11)a 100 23,83 ± 1,55(12)a 0
DZP-1 30,90 ± 1,12 (10) 100 71,0 ±6 ,89 (10)a 0
113
Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da latência de
convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey
no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em relação ao
grupo controle.
5.3.1.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina
No modelo de convulsão induzido por bicuculina (Tabela 5), os animais
pré-tratados com STY aumentaram a latência de covulsão somente quando
administradas em doses altas (10 ou 20 mg/kg) (STY-10: 125,9 ± 7,97; STY-20:
160,3 ± 6,49), quando comparado ao controle (75,00 ± 6,02). De maneira
semelhante, o diazepam aumentou a latência de convulsão quando comparada ao
grupo controle [F(4,50)=152,1; p<0,0001]. Os animais exibiram convulsão.
No entanto, em relação à latência de morte ocorreu aumento nesse
parâmetro somente com dose mais alta de STY (361,2 ± 108,1), comparado ao
grupo controle (156,9 ± 22,77). Apenas os animais do grupo STY-20 e DZP
apresentaram percentual de sobrevivência de 10 e 100%, respectivamente
[F(4,47)=82,02; p<0,0001].
Tabela 5 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis, no modelo
convulsão induzido por bicuculina em camundongos.
Grupo
(mg/kg)
Latência de
Convulsão (s)
% Animais
exibidindo
convulsão
Latência de
Morte (s)
Animais
sobreviventes
(%)
Controle 75,0 ± 6,0 (10) 100 156,9 ± 22,7 (10) 0
STY-1 81,4 ± 9,1(10) 100 159,8±17,3 (10) 0
STY-10 125,9 ± 7,9 (10)a 100 237,7±18,0 (10) 0
STY-20 160,3 ± 11,5(10)a 100 361,2±108,1(9)a 10
DZP-1 596,2 ± 35,6 (10)a 100 1.200±0,0(10)a 100
114
Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da latência de
convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey
no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em relação ao
grupo controle.
5.3.1.4 Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina
No modelo de convulsão induzida por pilocarpina, não houve alteração
na latência de convulsão nos grupos pré-tratados com STY, quando comparado ao
controle (476,4 ± 27,29) [F(4,37)=0,8816; p>0,4603].
Nas doses administradas de STY, houve aumento na latência de morte
dos animais que utilizaram STY-1 (STY-1: 294,4 ± 41,09), quando comparado ao
controle (160,9 ± 20,43). O diazepam 1 mg/kg aumentou a latência de morte (DZP-
1: 771 ± 6,89 (10) [F(4,38)=13,02; p<0,0001]. Os animais morreram.
Tabela 6 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis, no modelo
convulsão induzido por pilocarpina em camundongos.
Grupo
(mg/kg)
Latência de
Convulsão (s)
%
Animais
exibidindo
convulsão
Latência de
Morte (s)
Animais
sobreviventes
(%)
Controle 476,4 ± 27,29(9) 100 160,9 ± 20,43 (9) 0
STY-1 464,2 ± 38,5 (10) 100 294,4± 41,09(10)a 0
STY-10 437,4 ± 20,64(10) 100 103,1±12,46 (10)b 0
STY-20 497,9 ±10,85(9) 100 95,60±18,37 (10)b 0
DZP-1 431,2 ± 56,84(8) 100 771,636,84(8)a 0
Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da latência de
convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey
no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em relação ao
grupo controle.
115
5.3.2 Discussão
A epilepsia é um dos principais transtornos neurológicos. É uma
desordem neurológica crônica comum, caracterizada por crises convulsivas
recorrentes não provocadas, que afeta cerca de 0,5-1% da população mundial, tem
incidência cumulativa para toda a vida em cerca de 3-4% dos pacientes, em que
estima-se que mais de 50 milhões de pessoas no mundo apresentem algum tipo
desse transtorno (ROPPER; BROWN, 2005). A prevalência da epilepsia nos países
desenvolvidos variou entre 4 e 10 casos por 1.000, enquanto que nos países em
desenvolvimento variou de 14 a 57 por 1.000 (CARPIO; HAUSER, 2008; TÉLLEZ-
ZENTENO; HERNÁNDEZ-RONQUILLO, 2012). O impacto psicossocial e
socioeconômico, além de problemas relacionados à independência, mobilidade,
educação, ao emprego e a relacionamentos pessoais, gera sofrimento ao indivíduo
(FISHER et al., 2005).
As crises convulsivas podem ser não epilépticas, quando provocadas em
cérebro normal por tratamentos, como eletrochoque ou administração de
convulsivantes químicos, ou podem ser epilépticas quando ocorrem sem estímulo
provocativo (GERGEL et al., 1994). Em indivíduo normal, episódios únicos de
crisesconvulsivas generalizadas podem ocorrer e não caracterizam a epilepsia, uma
vez que reações como estresse fisiológico, privação do sono, efeito de drogas de
abuso ou, ainda, traumatismo cranioencefálico podem ser responsáveis por esses
eventos (RAMOS, 2008). Além disso, outras condições clínicas, podem desencadear
as crises epilépticascomo, os processos infecciosos, tóxicos ou metabólicos,
hereditário, sem síndrome epiléptica manifestada (LÖSCHER; SCHMIDT, 2002).
Elucidação para o estabelecimento da epilepsia é a inibição da síntese do
GABA, expressão alterada dos receptores GABA, bloqueio de neurotransmissores
inibitórios no SNC, perda de interneurônios GABAérgicos (KANG;KLESSIG, 2008).
Isso poderia resultar em estimulação intensa e, consequentemente, manifestada
através de convulsões generalizadas.
Nos mecanismos pré-sinápticos, dois acontecimentos permitem o
aumento nos níveis da concentração de glutamato na fenda sináptica: a diminuição
da autorregulação da liberação do glutamato, regulação mediada pelos receptores
116
pré-sinápticos, e a diminuição da capacidade dos transportadores de glutamato, o
retirarem da fenda sináptica. Entre os mecanismos pós-sinápticos podem ocorrer
alterações da função e do número dos receptores pós-sinápticos (MORIMOTO et al.,
2004).
A atividade convulsiva pode está associada a mudanças bioquímicas em
algumas áreas cerebrais e afeta diversos neurotransmissores, como dopamina,
glutamato, serotonina e ácido γ-aminobutírico (GABA) (CAVALHEIRO et al., 1994).
O metabolismo dos carboidratos, os sistemas de segundos mensageiros e a
expressão gênica, são também processos envolvidos na fisiopatologia das
alterações neuronais (SIMONIC et al., 2000).
As drogas que tem ação depressora do SNC, como os BZD e
barbitúricos, ligam-se especificamente a um sítio de ligação do GABA, e atuam de
modo alostérico, aumentando a afinidade do GABA pelo receptor. Outros
mecanismos de ação dos antiepilépticos são a inibição da função dos canais de
sódio e a inibição dos canais de cálcio (RANG et al., 2007).
Neste estudo, para mimetizar características específicas relacionadas às
convulsões, a fim de identificar o envolvimento dos possíveis Sistema GABAérgico,
Glutamatérgico, Colinérgico e as vias da Glicina envolvidos na ocorrência de
convulsões, foram utilizados modelos de indução de convulsão química.
Os modelos de convulsão são usados para estudar o envolvimento dos
aminoácidos neurotransmissores, na epileptogênese, além de permitir observar as
alterações comportamentais, histológicas relacionadas com o processo convulsivo
(MARINHO et al., 1997, 1998). Os modelos de convulsão químicos utilizados no
presente estudo foram PTZ (VELISEK et al., 1992), estricnina (ALMEIDA, 2006),
bicuculina (FUKUDA et al., 1997) e pilocarpina (TURSKI et al., 1987). Sabe-se que
os modelos de indução de convulsão química ou elétrica são utilizados na
identificação de possíveis moléculas que possam originar novos prótotipos de
drogas. Os produtos naturais obtidos a partir de metabólitos de plantas podem
contribuir significativamente para descoberta de novas drogas antiepilépticas com
melhor perfil de segurança e eficácia.
No modelo de convulsão induzido por PTZ, os animais que recebram
previamente STY não apresentaram alterações em relação à latência de convulsão.
117
No entanto, em doses altas, os animais apresentaram um aumento na latência de
morte, mostrando um efeito parcialmente protetor. O PTZ (85 mg/kg) na dose
utilizada é considerada convulsivante, capaz de suprimir os efeitos inibitórios da
transmissão GABAérgica e desencadear crises convulsivas (FRADLEY et al.,
2007). Esse modelo é utilizado para detectar compostos com atividade
anticonvulsivante das crises tônico-clônica (grande mal). Assim, a STY no presente
estudo apresentou efeito protetor, pois aumentou a latência de morte através do
modelo estudado. Este efeito pode estar relacionado ao sistema GABAérgico, por
possível interação do receptor GABA-A/Benzodiazepínico com a STY. Como
esperado, o diazepam, utilizado como padrão positivo, aumentou a latência de
convulsão e ocorreu 70% de sobrevivência dos animais.
Os benzodiazepínicos exercem atividade anticonvulsivante verificada em
testes realizados em modelos animais. Estudos mostram que BDZ são altamente
eficazes contra convulsões quimicamente induzidas, causadas pelo leptazol,
bicuculina e por drogas semelhantes, mas sua eficácia é reduzida em relação a
convulsões eletricamente induzidas (WANG, 2005; UENO, 1997).
Outras classes de fármacos anticonvulsivantes tendem a refrear a
excitabilidade neuronal ao prolongar as ações inibitórias do GABA, como os
barbitúricos e benzodiazepinas, outras diminuem a tendência de certos neurônios
dispararem potenciais de ação de alta frequência, como a fenitoína e carbamazepina
(FRADLEY et al., 2007).
Estados epilépticos podem ser induzidos experimentalmente por bloqueio
dos receptores de GABA. A diminuição na inibição GABA permite o desequilíbrio
nos neurotransmissores, prevalecendo os excitatóriosque que levam aos estados
convulsivos. Drogas que antagonizam o receptor GABA-A, como a bicuculina e a
picrotoxina são utilizadas nos modelos animais de indução de convulsão
(GODMAN;GILMAN, 2012).
Muitos dos fármacos anticonvulsivantes apresentam vários mecanismos
de ação, como a estimulação de mecanismos inibitórios centrais (GABAérgicos) ou a
inibição dos mecanismos excitatórios centrais (glutamatérgicos). Além disso, tais
compostos podem agir inibindo a excessiva descarga da membrana via canais de
Ca+2, Na+1 ou K+1. Muitas dessas drogas antiepilépticas possuem múltiplas ações,
118
contribuindo para as suas eficácias. Todavia, nenhuma é ideal para os diversos tipos
de crises, sendo necessárias várias associações com uso crônico (COSSART;
BERNARD; BEN-ARI, 2005).
Entre as substâncias indutoras de convulsão utilizadas na triagem pré-
clínica de novos fármacos anticonvulsivantes, o PTZ tem sido o mais utilizado nos
modelos animais (LÖSCHER; SCHMIDT, 1998, 2002), podendo ser utilizado como
modelo de crise generalizada dos tipos ausência, mioclônicas e de crises tônico-
clônicas (OLIVEIRA et al., 2001).
O PTZ é um derivado tetrazólico, com atividade convulsivante em várias
espécies, como ratos, camundongos, gatos, cães e primatas, quando administrado
por via sistêmica (FISHER et al.,2005). O tipo e a gravidade da crise induzida pelo
PTZ estão relacionados à dose e via de administração utilizada (LÖSCHER;
FASSBENDER; NOLTING, 1991). No teste de PTZ subcutâneo (s.c.), doses entre
80 a 100 mg/kg em camundongos e 70 a90 mg/kg em ratos são capazes de induzir
crises clônicas generalizadas em todos os animais do grupo. Doses maiores são
necessárias para induzir crises tônicas (LÖSCHER; COLS, 1998).
A utilização do PTZ para indução química de convulsão é um dos
modelos mais usados em experimentos realizados com animais (ELISABETSKY,
BRUM, 1999). A capacidade do PTZ em suscitar convulsões e,
correspondentemente, induzir um estado convulsivo, começa com a sua influência
na liberação e ação pós-sinápticado receptor GABA. Uma consequência disso
parece ser a liberação de uma multiplicidade de mecanismos sinápticos mediados
pela ativação de três principais receptores ionotrópicos do glutamato (NMDA – N-
metil-D-aspartato, AMPA- (ácidoalfa-amino-3-hidróxido-5-metil-4 isoxazole
propionico e cainato) (DHIR et al., 2005).
Estudos têm demonstrado que os efeitos específicos do PTZ são
largamente mediados pelo receptor GABA-A, embora o mecanismo de bloqueio do
receptor pelo PTZ ainda não tenha sido esclarecido (JUNG et al., 1997; HANSEN et
al., 2004).
Apesar do mecanismo das convulsões por PTZ não ser compreendido, é
relatado que esta substância é capaz de inibir a condutância do canal de cloreto por
ligação dos sítios do complexo receptor GABA-A (JUNG et al., 1997; HANSEN et al.,
119
2004), aumentando a densidade dos receptores de glutamato ( SCHRODER;
BECKER; LOSSNER, 1993). No estudo de Cremer et al. (2007), foi demonstrado o
efeito de convulsões induzidas por PTZ sobre as densidades de cainato, o NMDA,
A1, e nos locais de ligação para BZD, no cérebro epiléptico, alterando o equilíbrio
entre a excitação de receptores (NMDA) e modulação destes (A1, BZ, locais de
binding, kainato).
Estudos têm demonstrado que o tratamento com o PTZ produz dano
neuronal em nível de DNA, proteínas e lipídios (ILHAN et al., 2004, 2005; AKBAS, et
al., 2005; GUZMAN et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008). Outros estudos, com
metabólitos de plantas, têm demonstrado o efeito potetor nos modelos de convulsão
estudados, como a lectina isolada a partir das sementes de A. Angustifólia
(VASCONCELOS et al., 2009), a rutina um flavonoide com ação anticonvulsivante
(NASSIRI-ASL; SHARIATI-RAD; ZAMANSOLTANI, 2008), a proteína do látex obtida
do Calatropis procera mostram este efeito neuroprotetor (LIMA et al., 2012),
Erythrina mulugu, com ação anticonvulsivante (VASCONCELOS et al., 2007).
Apesar do mecanismo do PTZ não ter suas ações bem compreendidas,
Ramanjaneyulu e Ticku (1984) sugerem que o PTZ atue como antagonista do sítio
sensível à picrotoxina (domínio transmembrânico TM2, que forma o canal de cloreto)
do complexo receptor GABA-A (deprimindo a corrente mediada pelo GABA). Em
relação à farmacodinâmica, o PTZ parece interagir com o complexo receptor GABA-
benzodiazepínico-ionóforo-cloreto (FISHER, 1989). A sua atividade convulsivante,
utilizando o mecanismo via íons cloreto foi descrita por Pellmar e Wilson (1977).
Estudos eletrofisiológicos confirmam essa hipótese, mostrando que o PTZ inibe a
corrente de íons cloreto ativado por GABA-A, de maneira concentração dependente
e voltagem-independente (HUANG et al., 2001). Estudos sugerem a contribuição de
aminoácidos excitatórios nos efeitos convulsivantes do PTZ, sendo que essa
atividade nos receptores N-metil-D- aspartato (NMDA) pode estar relacionada à
redução da neurotransmissão GABAérgica (LÖSCHER,POTSCHKA, 2002).
A estricinina foi outra droga utilizada nos experimentos em animais.
Sabe-se que esta provoca convulsões por inibição, bloqueando principalmente os
receptores de glicina na coluna vertebral, atuando através de receptor que se
120
assemelha ao receptor GABA-A um canal iônico de cloro multimérico (RANG et al.,
2007).
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a STY, no modelo
de indução de convulsão por estricnina (20 mg/kg), aumentou a latência de
convulsão nas doses de 10 e 20 mg/kg e de morte em todas as doses
administradas quando comparada ao controle, demonstrando efeito de proteção da
STY, com a possível participação do sistema glicinérgico.
A estricnina é um antagonista competitivo dos receptores da glicina, que
atua bloqueando a resposta inibitória sináptica da glicina no SNC. Desta forma, a
estricnina é capaz de produzir forte crise convulsiva tônico-clônica de maneira
generalizada, pois atua especificamente na medula espinhal, bloqueando o
funcionamento dos neurônios inibitórios, as células Renshaw, inibindo o seu receptor
específico de glicina (SORACI et al., 2001; ANDRADE, 2003). A diminuição do efeito
inibitório pós-sináptico do arco reflexo causa excitação incontrolada do reflexo
espinhal (TILLEY et al., 2003). A morte do animal ocorre por parada respiratória, em
decorrência do comprometimento do músculo diafragmático (ANDRADE, 2003).
A morte por envenenamento pela estricnina resulta da paralisação do
centro respiratório do cérebro e não pelas convulsões. Pode ser facilmente
absorvida, inalada, feita por via parenteral, podendo causar intoxicação em poucos
minutos, pois sua formulação extremamente tóxica. Spinosa (2008) relata que se a
via for oral, há necessidade de 40 minutos de exposição para visualização de traços
no plasma. Os sinais incluem as câimbras, crises musculares, em especial na região
cervical e lombar, rigidez, contrações, sonolência, dores de cabeça e grande
deficiência do oxigênio em tecidos do corpo. O mau funcionamento renal pode
ocorrer como efeito secundário (SCHMITT, 2011).
Outro teste utilizado nos experimentos foi modelo de indução da
convulsão por bicuculina, considerado potente antagonista dos receptores GABA-A
em verterados. Atua competindo com o GABA, reconhecendo o mesmo sítio do
receptor (CZAJKOWSKI, 2006). É uma droga convulsivante, que reduz por
diminuição de frequência de abertura e tempo a entrada do canal para abertura do
cloro (Cl- ). Dependendo da concentração, a bicuculina pode causar convulsão em
modelo animal.
121
Neste estudo, a dose utilizada para induzir convulsão foi de 12 mg/kg de
bicuculina por via i.p. Na indução por bicuculina, ocorreu aumento na latência de
convulsão nas maiores doses (10 ou 20 mg/kg). Em relação à latência de morte, a
maior dose apresentou efeito protetor. Nesta dose, um animal sobreviveu. O DZP,
como esperado, apresentou efeito protetor, pois os animais sobreviveram.
Observa-se, portanto, que a STY apresenta ação anticonvulsivante parcial
na dose de 12 mg/kg de bicuculina, pois ocorreu aumento signitificativo na latência
de morte dos animais e de convulsão, demonstrando, assim, efeito protetor, durante
o desenvolvimento do processo convulsivo. Sugere-se que a STY possa atuar no
sistema de GABAérgico como agonista, com ação semelhante aos BZDs.
Sabe-se que mecanismo de ação dos benzodiazepínicos consiste em
potencializar a resposta ao GABA, facilitando a abertura dos canais de cloreto
ativados pelo receptor GABA-A (GODMAN; GILMAN, 2012).
A utilização de benzodiazepínicos no controle das convulsões, como o
diazepam, encontra-se amplamente discutido na literatura. Como esperado, os
resultados deste estudo expõem a diminuição da intensidade das crises convulsivas
e sobrevivência dos animais nos modelos de indução de convulsão por PTZ e
bicuculina. Os benzodiazepínicos no SNC apresentam propriedades depressoras,
ansiolíticas, sedativo-hipnóticas e/ou anticonvulsivantes (LÖSCHER, 2002).
A fim de investigar a participação da STY no sistema colinérgico, utilizou-
se o modelo de convulsão induzida por pilocarpina (400 mg/kg) em camundongos.
A convulsão pode ser caracterizada por episódios de alteração no comportamento
dos animais, como piloereção, acinesia inicial, ataxia tremores, automatismo
mastigatório como mioclonia dos músculos faciais e movimentos de cachorro
molhado, que persiste de 10 a 15 minutos, seguido de convulsões motoras límbicas,
incluindo movimentos clônicos das extremidades superiores que ocorrem em
aproximadamente 30 minutos após administração de pilocarpina (TURSKI, 1983a,
1989, 2008; FREITAS, 2004).
Na indução de convulsão por pilocarpina, os animais que receberam STY
não apresentaram alteração em relação à latência de convulsão. Enquanto na
latência de morte, a dose de 1 mg/kg apresentou efeito protetor, com as doses de 10
ou 20 mg/kg, os animais morreram em um tempo menor, mostrando que não há
122
proteção em doses maiores. Nas maiores doses, a STY parece está hiperexcitando
a síntese e/a liberação de acetilcolina e modificando a atividade do sistema
colinérgico.
Em condições fisiológicas, a estimulação colinérgica induzida por ACh é
importante para os processos cerebrais de memória e aprendizagem (BARTUS et
al., 1982). No entanto, altas concentrações de ACh estão associadas à
hiperexcitação elétrica dos neurônios que pode causar convulsão (TURSKI et al.,
1983a,b,c).
A pilocarpina na dose convulsivante (400 mg/kg) parece interargir com o
sistema GABAérgico, uma vez que ativação do receptor GABA-A pode estar
diminuída em decorrência do aumento da concentração do cálcio intracelular
induzida pelos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, que pode ser essencial
para instalação e propagação da atividade epiléptica (PISANI et al., 2004; FREITAS,
2011).
Para o estudo da Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), um dos modelos que
melhor mimetiza as alterações funcionais e morfológicas é o de indução sistêmica
por Pilocarpina (400 mg/kg) (TURSKI et al., 1989). É conhecido que em doses
elevadas, a pilocarpina, um agonista muscarínico,
induz alterações comportamentais, como convulsões e lesões cerebrais em
roedores através superestimulação cortical (LIMA, 2012).
A pilocarpina administrada em doses altas por via periférica é capaz de
produzir convulsão em roedores. O início dessas convulsões pode ser bloqueado
pela atropina, atenuando atividade colinérgica endógena (JOPE et al., 1986;
MARINHO et al., 1997). Assim, o processo convulsivo decorrente da utilização de
pilocarpina em doses convulsivas parece envolver ativação dos receptores
muscarínicos, podendo envolver o metabolismo de fosfoinositídios e sendo capaz
de produzir alterações comportamentais e lesões cerebrais (MARINHO et al., 1998).
Atividade epiléptica no hipocampo é responsável pela morte neuronal e
formação de fibras musgosas. Em animais em desenvovlvimento, interfere na
neurogênese e na atividade sináptica (ZHANG et al., 2004).
Os estudos mostram a interação da pilocarpina com alguns sistemas de
neurotransmissores cerebrais, como a inibição das convulsões por antagonista do
123
receptor 5HT2 (JOPE; WILLIANS, 1995), agonista do receptor GABA-A (GAISOR, et
al., 1999), antagonista do receptor NMDA (GRIFFITH et al., 2004), bloqueador dos
canais de sódio e cálcio (NASCIMENTO et al., 2006), participação dos receptores
dopaminérgicos (FREITAS et al., 2005a), receptores muscarínicos (MARINHO et al.,
1998).
Esse modelo envolve principalmente a participação do sistema
colinérgico, e drogas, como o DZP, não são eficazes de reverter a convulsão.
Embora vários sistemas de neurotransmissão estejam envolvidos nos modelos
experimentais de convulsão, a STY quanto aos efeitos observados no presente
estudo nos modelos de PTZ, estricnina e bicuculina, assemelha-se a drogas que
interagem com o receptor GABA/BZD.
124
5.3.3 Conclusão
De acordo com os experimentos utilizando-se os modelos de convulsão
induzido por PTZ(85 mg/kg), estricnina (20 mg/kg), bicuculina (12 mg/kg) e
pilocarpina (400 mg/kg) com STY, pôde-se concluir:
No modelo de PTZ, os animais exibiram convulsões com aumento na
latência de morte nas doses de 10 e 20 mg/kg. Na maior dose, obteve-se um
sobrevivente.
No modelo de estricnina, os animais convulsionaram e não houve
sobrevivente. No entanto, o tempo para latência de convulsão foi aumentado nas
doses de 10 e 20 mg/kg, enquanto que a latência de morte foi aumentada em todas
as doses administradas.
No modelo de bicuculina, os animais convulsionaram. Ocorrreu o
aumento para latência de convulsão nas doses de 10 e 20 mg/kg. Na latência de
morte, ocorreu o aumento na maior dose 20 mg/kg, sendo que nesta, teve-se um
sobrevivente.
No modelo de pilocarpina na latência de convulsão, não houve
alteração. No entanto, na latência de morte, na menor dose 1mg/kg, houve
diferença. No entanto, na dose de 10 e 20 mg/kg, os animais morreram em menor
tempo. Neste modelo não houve animais sobreviventes.
A STY, portanto, aumentou o tempo de latência de convulsão nos
modelos de estricinina e bicuculina, enquanto que a latência de
morte aumentou nos modelos PTZ, estricnina e bicuculina e morte através de
mecanismos GABAérgicos e glicinérgica. A via colinérgica parece estar envolvida
apenas na menor dose 1mg/kg, possivelmente interagindo com o sistema
GABAérgico.
125
5.4 Capítulo IV: Dosagem de aminoácidos no CPF e HC de camundongos pré-
tratados com STY nos modelos de convulsão induzido por PTZ, estricnina,
bicuculina, pilocarpina
5.4.1 Resultados
5.4.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ
Os resultados da Figura 17 apresentam a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de
STY(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por PTZ (85
mg/kg).
O pré-tratamento da STY não alterou as concentrações de ASP nos
animais submetidos ao modelo de convulsão induzido por PTZ. No entanto, a STY,
nas maiores, doses aumentou a concentração de GLU 314% e 363% (STY-10: 1,07
± 0,16; STY-20: 1,09 ± 0,15), comparado ao controle (0,34 ± 0,04) [F(3,23)=11,39;
p<0,0001].
Quanto à concentração dos aminoácidos inibitórios, Figura17 B, o pré-
tratamento com STY encontrou-se aumentado nas maiores doses e aumentou a
concentração em 288% GLI (STY-20: 1,87 ± 0,50), comparado ao controle (0,67 ±
0,07), no modelo de PTZ. [F(3,27)=8,768; p<0,0004]. Efeito semelhante foi
observado nas concentrações de TAU e GABA, somente no pré-tratamento da STY
nas de doses de STY-10 (TAU:1,49 ± 0,77; GABA: 1,39 ± 0,5) ou STY-20 (TAU: 2,58
± 0,37; GABA:1,43± 0,61), quando comparado ao grupo controle (TAU:0,77 ± 0,12;
GABA: 0,6 ± 0,1), TAU [F(3,26)=15,59 p<0,0001], GABA [F(3,27)=9,045 p<0,0003].
126
Figura 17 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e
inibitórios (B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por PTZ.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6-
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.5
1.0
1.5
ASP
a,ba,b
GLU
µm
ol/
g d
e te
cid
o
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
GLI GABA
a,b,c
a,b,c
a,b a,b a,b
TAU
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
127
5.4.1.2 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ
Os resultados da Figura 18 evidenciam a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B), no hipocampo de camundongos, após
administrações de STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.), no modelo de convulsão induzido
por PTZ (85 mg/kg). Concentração de ASP foi aumentada após tratamento com
STY em todas as doses estudadas (STY-1: 1,67 ± 0,25; STY-10: 1,67 ± 0,33; STY-
20: 2,95 ± 1,5), comparado ao controle (0,98 ± 0,08), sendo que na maior dose o
aumento foi de 304% [F(3,27)=13,13; p<0,0001]. Enquanto o GLU aumentou 400%
somente na maior dose (1,98 ± 0,16), comparado ao controle (0,51 ± 00)
[F(3,27)=17,73; p<0,0001].
Em relação aos aminoácidos inibitórios, a concentração de GLI aumentou
220%, após o tratamento da STY na maior dose (STY-20: 3,07 ± 0,25), comparado
ao controle (1,39 ± 0,37 ) [F(3,27)=62,48; p<0,0004]. Nenhuma alteração foi
observada nas concentrações de TAU nas doses estudadas [F(3,26)=0,6264;
p<0,6264]. A concentração de GABA foi aumentada 167% e 169%, após
administração da STY 10 ou 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 1,37 ± 0,15); STY-
20: 1,39 ± 0,13), comparada ao controle (0,82 ± 0,17) [F(3,27)=4,315; p<0,0001].
128
Figura 18 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (18 A) e
inibitórios (18 B) em hipocampo de camundongos após convulsão induzida por PTZ.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6-
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
.
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0 Hipocampo
ASP GLU
a,b,c
a a a,b,c
µm
ol/
g d
e te
cid
o
Hipocampo
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
GLITAU GABA
a,b,c
a,b a,b
µm
ol/
g d
e te
cid
o
129
5.4.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
estricnina
Os resultados da Figura 21 mostram a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B), no CPF de camundongos, após administração de
STY (1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por
estricnina (20 mg/kg).
A concentração de ASP se comporta de maneira diferente, dependendo
da dose. Em baixas doses, diminui a concentração ASP, enquanto em altas doses,
aumentou a concentração 174% (STY-20: 0,84 ± 0,08), comparado ao controle (0,49
± 0,1) [F(3,29)=17,10; p<0,0001]. No entanto, a concentração de GLU não sofreu
alteração em nenhuma das doses administradas, quando comparada ao grupo
controle [F(3,29)=1,558; p<0,2234].
Quanto aos aminoácidos inibitórios, a concentração de GLI não sofreu
alteração nas doses administradas [F(3,30)=2,252; p<0,1051]. No entanto, verificou-
se aumento em TAU nas doses administradas (STY-1: 0,94 ± 0,1; STY- 10: 1,97 ±
0,09; STY-20: 1,93 ± 0,24), comparado ao controle (0,29 ± 0,05). O percentual para
a dose de 10 e 20mg/kg foi 679,3 % e 665,5%. [F(3,31)= 26,81; p<0.0001], e em
GABA nas doses de 10 e 20mg/kg (194% e 276%), respectivamente (STY-10: 0,97
± 0,1); STY-20: 1,38 ± 0,15), comparada ao controle (0,56 ± 0,17 (7)
[F(3,31)=10,90; p<0,0001].
130
Figura 19 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (19 A) e
inibitórios (19 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por estricnina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6-
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Córtex pré-frontal
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
ASP GLU
a
b
a,b,c
µm
ol/
g d
e te
cid
o
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
GLI TAU GABA
a
a,ba,b
a
a,b
µm
ol/
g d
e te
cid
o
131
5.4.1.4 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
estricnina
Após o teste de convulsão induzido por estricnina, Figura 22, realizou-se
a dosagem da concentração dos aminoácidos excitatórios (A) e inibitórios (B), após
administração de STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.) ou veículo e estricnina (20 mg/kg). A
concentração de ASP aumentou nas maiores doses 223% e 1.059%, STY (STY-10:
0,86 ± 0,2; STY-20: 3,39 ± 0,44), comparado ao controle (0,37 ± 0,01),
[F(3,39)=29,09; p<0,0001]. A concentração de GLU aumentou após administração
de STY em todas as doses (STY-1: 0,85 ± 0,08); STY-10: 1,44 ± 0,11; STY-20: 1,74
± 0,2), comparado ao controle (0,21 ± 0,08). Nas doses de 10 e 20 mg/kg (685,7% e
828,5%), respectivamente [F(3,32)=8,688; p<0,0003].
Os aminoácidos inibitórios aumentaram em todas as doses, após o teste
de convulsão induzido por estricnina. A GLI apresentou aumento de 150,7% e
167,9%, nas doses STY-10 (1,93 ± 0,17) e STY-20 (2,15 ± 0,16), comparado ao
controle (1,28 ± 0,25) [F(3,31)=4,966; p<0,0069]. A TAU aumentou a concentração
nas maiores doses (STY-10: 2,02 ± 0,23; STY-20: 1,87 ± 0,22), comparado ao
controle (0,97 ± 0,31). O percentual nas doses foi de 10 e 20 mg/kg (208,2% e
192,7), respectivamente [F(3,30)= 10,98; p<0,0001]. Enquanto GABA aumentou em
todas as doses administradas (STY-1: 1,37 ± 0,23; STY-10: 1,87 ± 0,22; STY-20:
2,08 ± 0,12) comparada ao controle (0,24 ± 0,10) [F(3,31)=19,31; p<0,0001].
132
Figura 20 – Efeitos da STY concentração de aminoácidos excitatórios (20 A)
inibitórios (20 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por estricnina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6-
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Hipocampo
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
ASP GLU
a
a,b,c
a
aa,b
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
Hipocampo
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
GLI TAU GABA
a,ba a,b a,b
a
aa
µmol
/g d
e te
cido
133
5.4.1.5 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
bicuculina
Os resultados da Figura 23 mostram a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de STY
(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por bicuculina
(12 mg/kg).
A concentração de ASP aumentou nas maiores doses (STY-10: 0,35 ± 0,0
e STY-20: 0,3 4± 0.0), comparado ao controle (0,01 ± 0,0). Na maior dose, o
percentual foi de 340%. A concentração de GLU aumentou nas doses 10 e 20
mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,04 ± 0.,3; STY-20: 2,05 ± 0,42), comparado ao
controle (0,01 ± 0,00) [F(3,37)=26,89; p<0,0001].
Os aminoácidos inibitórios após a administração de STY e bicuculina (12
mg/kg) em córtex pré-frontal aumentaram todas as concentrações. A concentração
GLI aumentou nas doses de 10 e 20 mg/kg, 310% e 430, respectivamente (STY-10:
0,31 ± 0,06 e STY-20: 0,43 ± 0,0), comparado ao controle (0,10 ± 0,0)
[F(3,38)=9,618; P<0,0001. A concentração de TAU aumentou nas doses
administradas (STY-10: 1,3 ± 0,17; STY-20: 1,91 ± 0,32), comparado ao controle
(0,55 ± 0,15), [F(3,37)= 23,09; p<0,0001]. A concentração de GABA aumentou nas
doses de 10 e 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 1,83 ± 0,2 e STY-20: 1,91 ±
0,0) comparada ao controle (0,57 ± 0,13) [F(3,35)=50,83; p<0,0001].
134
Figura 21 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (21 A)
inibitórios (21 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por bicuculina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6 -
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Córtex pré-frontal
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
ASP GLU
a,b,c
a,c
µmol
/g d
e te
cido
Córtex pré-frontal
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
GLITAU GABA
a
aa,b
a a,b a,b
a,b
µm
ol/
g d
e te
cid
o
135
5.4.1.6 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
bicuculina
Os resultados da Figura 22 demonstram a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B) no HC de camundongos após administração de STY
(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por bicuculina
12 mg/kg).
Após o teste de indução de convulsão por bicuculina (12 mg/kg), foram
realizados a dosagem da concentração dos aminoácidos no hipocampo. A
concentração de ASP aumentou na dose de 20 mg/kg (0,40 ± 0,07), comparado ao
controle (0,11± 0,02 ) [F(3,36)=14,30; P<0,0001] GLU, aumentou nas doses 10 e
20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,02 ± 0,0 ); STY-20: 0,40 ± 0,0)
[F(3,36)=48,51; P<0,0001].
Em relação à concentração dos aminoácidos inibitórios, a GLI aumentou
nas doses de 10 e 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,57 ± 0,01; STY-20: 0,79 ±
0,1), comparado ao controle (0,02 ± 0,0) [F(3,38)=11,00; p<0,0001]. Verificou-se
aumento na concentração de TAU na dose de 20 mg/kg (1,33 ± 0,21), comparado
ao controle (0,15 ± 0,09 ) [F(3,37)= 16,42; p<0,0001]. A concentração de GABA
aumentou na dose de 20 mg/kg (2,17± 0,37), comparada ao controle (0,02 ± 0,05)
[F(3,38)=75,58; p<0,0001].
136
Figura 22 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (22 A)
inibitórios (22 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por bicuculina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6 -
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Hipocampo
Conto
rle
STY-1
STY-10
STY-20
Conto
rle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.2
0.4
0.6
ASP GLU
a,b,ca,b,c
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
Hipocampo
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
1.0
2.0
3.0
GLITAU GABA
a,b
a,b,c
a,b,c
a,b,c
µm
ol/
g d
e te
cid
o
137
5.4.1.7 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal
de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
pilocarpina
Os resultados da Figura 25 revelam a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de STY
(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por pilocarpina
(400 mg/kg).
A concentração de ASP reduziu na menor dose (STY-1: 0,15 ± 0,0) e
aumentou na maior dose (STY-20: 0,49 ± 0,03), comparado ao controle (0,46 ± 0,0).
[F(3,25)=14,81; p<0,0001]. A concentração de GLU aumentou na menor dose (STY-
1: 0,16 ± 0,0), comparada com o controle (0,0 ± 0,0) [F(3,23)=50,98; p<0,0004].
Os aminoácidos inibitórios a concentração de GLI aumentaram nas doses
de 1 mg/kg (0,03 ± 0,0), comparado ao controle (0,0 ± 0,0) [F(3,24)=5,99; p<0,0041].
Não houve alteração nos níveis da TAU [F(3,26)= 1,847 p<0,597]. A concentração
de GABA aumentou nas doses administradas (STY-1: 0,12 ± 0,0; STY-10: 0,04 ±
0,01; STY-20: 0,04 ± 0,02), comparada ao controle (0,05 ± 0,0) [F(3,25)=9,426;
p<0,0003].
138
Figura 23 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (23 A)
inibitórios (23 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por pilocarpina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6 -
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
ASP GLU
a
a
b bµm
ol/
g d
e t
ecid
o
Córtex pré-frontal
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
Contr
ole
STY-1
STY-10
STY-20
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20GLI
TAU
GABA
GLI TAU GABA
a
a
b b
µm
ol/
g d
e t
ecid
o
139
5.4.1.8 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de
animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por
pilocarpina
Os resultados da Figura 26 demonstram a concentração dos aminoácidos
excitatórios (A) e inibitórios (B) no HC de camundongos após administração de STY
(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por pilocarpina
(400 mg/kg).
Em relação à ASP, ocorreu aumento na menor dose (STY-1: 0,03 ± 0,0),
enquanto que nas maiores doeses ocorreu a diminuição (STY-10: 0, 0 ± 0,0; STY-
20: 0,0 ± 0,0), comparado ao controle (0,02 ± 0,0) [F(3,26)=16,56; p<0,0001]. Não
houve alteração na concentração de GLU nas doses administradas [F(3,27)=2,238;
p< 0,1098].
A concentração de GLI diminuiu nas doses de 10 ou 20 mg/kg (STY-10:
0,03 ± 0,0); STY-20: 0,05 ± 0,0), comparado ao controle (0,0 ± 0,0 ) [F(3,27)=10,03;
p<0,0002]. Não houve alteração nas concentrações da TAU e GABA
respectivamente, [F(3,27)= 1,027 p<0,3982]; [F(3,27)=5,482; p<0,9127].
140
Figura 24 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (24 A)
inibitórios (24 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por pilocarpina.
A
B
Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6 -
8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post
hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-
1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido
γ-aminobutírico (GABA).
Hipocampo
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
ASPGLU
a
a,b
a,b
µmol
/g d
e te
cido
Hipocampo
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
Controle
STY-1
STY-10
STY-20
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
GLI TAU GABA
aa
a,b,c
µmol
/g d
e te
cido
141
5.4.2 Discussão
Os aminoácidos no SNC encontram-se em altas concentrações, em
particular, o glutamato, com ação excitatória, e o GABA com ação inibitória. Sabe-se
que as anormalidades na neurotransmissão ocorrem quando há desequilíbrio na
transmissão excitatória e inibitória, podendo motivar diversas doenças neurológicas.
A epilepsia é uma dessas disfunções cerebrais desordenadas, decorrentes de
anormalidade e hipersincronia da atividade neuronal, muito associada a processos
patológicos secundários (NAGA et al., 2004).
A fisiopatologia da convulsão ocorre principalmente pelo desequilíbrio
entre os aminoácidos excitatórios e inibitórios do SNC. Entre esses aminoácidos, os
mais importantes durante a crise convulsiva são o glutamato e o aspartato que são
aminoácidos excitatórios, e o GABA e a glicina que são inibitórios. Entretanto, outros
neurotransmissores podem atuar de maneira direta ou indireta nesses aminoácidos
e induzir crise convulsiva, como o sistema colinérgico (modelo de pilocarpina) e
glicina (estricinina) entre outros (GODMAN; GILMAN, 2012; COSSART;
BERNARD;BEN-ARI, 2005).
A identificação dos possíveis mecanismos de ação de moléculas com
potencial para o desenvolvimento de novas drogas, que interfiram com a
neurotransmissão GABAérgica ou mesmo glutamatérgica, justifica-se em
decorrência dos diversos tipos de distúrbios que comprometem o SNC pelo
desequilíbrio entre os aminoácidos. Dentre estas neuropatologias humanas, citam-
se epilepsias, Coreia de Huntington, ansiedade, esclerose amiotrófica lateral e
isquemia, dentre outras (WONG et al., 2003).
As concentrações de aminoácidos ASP, GLU, GLI, TAU e GABA, após
administração de STY, nos testes de convulsão induzidos por PTZ (85 mg/kg),
estricnina (20 mg/kg), bicuculina (12 mg/kg) e pilocarpina (400 mg/kg), em CPF e HC
foram estudados em camundongos com idade de dois meses que apresentaram
convulsão e sobreviveram ou morreram. As pesquisas envolvendo mecanismos de
epilepsia têm sido focadas nas mudanças na atividade de aminoácidos inibitórios em
particular, o ácido aminobutírico – GABA e excitatórios, glutamato e aspartato
(SZYNDLER et al., 2006). A desordem do equilíbrio dos aminoácidos excitatórios e
142
inibitórios no tecido cerebral dá origem à atividade epiléptica (MODY, 1999).
Neurotransmissores excitátorios e inibitórios medeiam a transmissão sináptica e
controlam a estabilidade e eficiências das conexões sinápticas (LOSCHER;
SCHMIDT, 2002; MELDRUM; ROGAWSKI, 2007; KAUL et al, 2011).
Entre as áreas cerebrais mais comprometidas, cita-se o hipocampo que é
mais vulnerável à lesão isquêmica (PULSINELLI, 1992), uma vez que a inervação
excitatória é realizada por neurônios glutamatérgicos, o que provalvemente resulta
em excitoxidade através dos receptores de glutamato NMDA e não NMDA (cainato e
AMPA).
O PTZ foi utilizado neste estudo no modelo de indução de convulsão, pois
esta droga tem ação convulsivante e atua reduzindo a neurotransmissão mediada
por receptores GABA-A (OWENS; KRIEGSTEIN, 2002;). Além disso, estudos têm
demonstrado que o tratamento com o PTZ produz dano neuronal em nível de DNA,
proteínas e lipídios (ILHAN et al., 2004, 2005; AKBAS et al., 2005; D'ANTUONO et
al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008).
Os resultados obtidos após administração de STY e indução da convulsão
por PTZ demonstram aumento na concentração do GLU, no CPF, e HC e ASP, no
HC. Esses resultados sugerem possível diminuição na taxa de metabolização do
GLU nesta área cerebral, favorecendo o desenvolvimento do foco epiléptico. Por
outro lado, os aminoácidos inibitórios aumentaram tanto no córtex quanto no
hipocampo. O aumento de AAE e AAI no córtex pré-frontal pode estar relacionado,
com efeito, modulatório do glutamato sobre o sistema gabaérgico, em que um
aumento de glutamato endógeno no córtex pré-frontal está relacionado com o
aumento nas concentrações de GABA extracelular (DEL ARC; MORA, 1999).
Assim, aumento da liberação de GABA pode ocorrer por exocitose clássica ou
transporte reverso ou, ainda, por aumento de sua atividade em seus receptores,
bem como a sua reduzida recaptação da fenda sináptica, poderia contribuir para
proteção do SNC contra as convulsões (BRADFORD,1995).
No estudo de Luca et al. (2005), foram dosadas as concentrações de
aminoácidos em camundongos após subdoses de PTZ (20-30 mg/kg) no modelo de
kindling em dois grupos de camundongos, o primeiro grupo, o controle, sem
modificação genética e o segundo grupo de camundongos geneticamente
143
modificados para investigar convulsões de ausência. Os resultados obtidos após
administração do PTZ mostram o aumentou do GABA, no CPF e HC. A
concentração de glutamato aumentou no CPF e HC. Após o uso do PTZ por 60 dias,
foram encontradas diferentes alterações nos aminoácidos, com aumento dos
animoácidos excitátórios.
Outro aspecto abordado diz respeito à concentração de aminoácidos após
o uso do PTZ para induzir convulsão. No fluido intersticial de células gliais,
evidenciou-se aumento dos AAE neurotransmissores glutamato e aspartato, nos
primeiros 10 minutos, sendo que glicina, taurina, glutamina e fosfoserina foram mais
evidentes nos minutos seguintes. Segundo Sechi et al. (1997), esse aumento de
glutamato e aspartato pode ser devido à excessiva liberação sináptica ou ativação
de vias bioquímicas nas células neuronais ou gliais. A glicina pode estar envolvida
na manutenção das crises, devido ao seu efeito modulador nos receptores NMDA,
potenciando a resposta excitatória. Prado et al. (2011) citam que para que ocorra a
síntese de glutamato/glutamina, o cérebro necessita do aminoácido aspartato.
A liberação de aminoácidos excitatórios de estruturas neurais durante a
hipóxia e isquemia tem sido observada tanto in vitro (PELLEGRINI-GIAMPIETRO et
al., 1990; COLLARD; MENON-JOHANSSON, 1993; O’REGAN et al., 1995) quanto
in vivo (BENVENISTE et al., 1984; HAGBERG et al., 1985; GLOBUS et al., 1988).
Aminoácidos excitatórios são neurotóxicos em excesso e a hiperestimulação
resultante dos seus receptores contribui para a morte neuronal durante os insultos
cerebrais. Na isquemia induzida, a presença de radicais livres e aminoácidos
excitatórios agravam os danos neuronais (PELLEGRINI-GIAMPIETRO et al., 1990).
Adicionalmente, alterações nas funções GABAérgicas têm sido relatadas
em ratos geneticamente propensos à epilepsia, no modelo de indução de convulsão
com o PTZ (SEJIMA, 1997; LI et al., 2000). De fato, drogas que bloqueiam os
receptores GABA-A são convulsivantes muitos potentes, como é o PTZ, picrotoxina,
e bicuculina, usadas em modelos animais.
A estricnina, outro agente convulsivante, foi utilizada para induzir
convulsão. Essa substância provoca convulsões tônicas típicas por ação
predominante na medula espinhal. Interfere apenas na inibição pós-sináptica (PIPS
– potencial inibitório pós-sináptico) espinhal, bloqueando a glicina nesse local (DE
144
LUCIA et al., 2007). A ação convulsivanteda estricnina 20 mg/kg, no estudo, foi
observada, pois os animais apresentaram crise convulsiva tônico-clônica
generalizada, com rigidez tônica dos membros, seguida de tremor por interrupção
do tônus por relaxamento. No entanto, demonstrou-se que STY apresenta efeito
protetorparcial, já que houve aumento no tempo de latência de morte.
No modelo de convulsão induzido por estricnina, os animais tratados com
STY demonstraram que o ASP, no CPF, e o HC aumentaram nas maiores doses
174% e 1.059%, respectivas áreas estudadas. Por outro lado, os aminoácidos
inibitórios aumentaram tanto no córtex quanto no hipocampo. Nas maiores doses no
CPF TAU 679% e 665,5%, enquanto GABA aumentou 194% e 2276%. No
hipocampo, ocorreu o aumento da concentração de GLU na dose de STY-10
(685,7%) ou STY-20 (828,5%). Os aminoácidos inibitórios aumentaram todos no
hipocampo. A glicina aumentou a concentração nas doses de 10 ou 20 mg/kg
(150,7% e 167,9%), enquanto TAU aumentou 208,2% e 192,7%, respectivamente.
O GABA aumentou em todas as doses estudadas, 1,10 ou 20 mg0kg (570%, 779%
e 866%), respectivamente. Sugere-se que a estricnina pode atuar bloqueando a
ação da glicina no sistema nervoso central, gerando hiperexcitabilidade do neurônio,
mas não bloquendo a concentração de outros aminoácidos inibitórios.
Apesar de os animais terem morrido após o teste de indução de
convulsão por estricnina, os resultados demonstram o aumento da latência de morte
nas doses estudadas. A STY conduz ao aumento das concentrações de GLI, no HC,
e o aumento de GABA e TAU, no CPF. O aumento de TAU produz neuroproteção
contra a neurotoxidade em nível celular produzido pelas convulsões (KONTRO;
OJA, 1987; EL IDRISSI; L’AMOREAUX, 2008).
A glicina é um neurotransmissor inibitório no sistema nervoso central,
encontrado na medula espinal, sendo liberada por interneurônios inibitórios,
chamados de células de Renshaw e tronco cerebral. Quando receptores de glicina
são ativados, o ânion cloreto entra no neurônio através de receptores ionotrópicos,
causando potencial pós-sináptico inibitório. Este potencial limita ativação de
neurônios motores e possibilita o relaxamento muscular. A estricnina atua
especificamente como antagonista nos receptores ionotrópicos de glicina, inibindo
ação do neurotransmissor (SPINOSA et al., 2008; NICHOLSON, 2004; ANDRADE,
145
2003). Além disso, a glicina é um coagonista de receptores NMDA, facilitando ação
excitatória dos receptores glutamatérgicos.
Neste estudo, a dose utilizada na indução de convulsão foi de 20 mg/kg.
Em experimentos anteriores realizados no laboratório de Neurofarmacologia, esta
foi a dose estabelecida. A dose tóxica da estricnina para animais pequenos é de
0,25 a 2 mg/kg, enquanto para cães e gatos considera-se 0,75 a 2 mg/kg (SPINOSA
et al., 2008; SCHMITT, ROSSATO, 2011 ). As alterações clínicas, dependendo da
dose, manifestam-se em média nos primeiros 10 minutos, com episódios de
convulsão, rigidez extensora e muscular, opistótono, taquicardia, apneia, hipertermia
e raramente vômito (ANDRADE, 2003).
O aminoácido glicina pode modular a sinalização do cálcio nas células
gliais. As concentrações de glicina no fluido cérebro espinhal foram encontradas em
torno de 10 µM, enquanto a concentração do neurotransmissor no interior do citosol
pode chegar a 10 µM. O estudo mostra que depois da morte de neurônios
glicinérgicos, a sinalização de cálcio microglial pode ser modulada. Além disso, em
células não neuronais, foi demonstrado que a glicina protege diferentes tipos de
células contra a morte celular isquêmica, como células renais, hepatócitos e células
endoteliais (EYNDEN et al., 2011).
No presente estudo, outro modelo utilizado foi o da indução de convulsão
por bicuculina. O mecanismo deação da bicuculina é por antagonismo dos
receptores GABA-A (FUKUNDA et al., 1997). Após administração da STY, ocorreu
no CPF o aumento da concentração de ASP e GLU, nas maiores doses. ASP
aumentou 39% e 157%, enquanto o GLU aumentou 47,5% e 200%,
respectivamente. A GLI aumentou 31,1% na maior dose, enquanto TAU aumentou
nas doses de 10 e 20 mg/kg, 306% e 382%, respectivamente. GABA aumentou nas
maiores doses 940% e 1.010%, respectivamente. No HC, os aminoácidos
excitatórios e inibitórios aumentaram na maior dose. GABA aumentou 217% e TAU
133%. Sugere-se que a STY tenha ação similar às drogas BZD por ativar os
receptores GABAérgicos que pertencem a uma superfamília de canais iônicos,
favorecendo o aumento da abertura do canal de cloro para entrada desse ânion,
levando à hiperpolarização do neurônio pós-sináptico (DELOREY; OLSEN, 1994;
MACDERMOT et al., 1999).
146
A função inibitória do GABA em hipocampo é descrita pela literatura
(CURTIS et al., 1970). Portanto, quando ocorre inibição do GABA-A, nos modelos
animais, pode ocorrer aumento, seguido por estabilização dos PEPS. O aumento na
concentração dos AA inibitórios GABA pode ser mediado através dos canais de
sódio voltagem-dependente, uma vez que os camundongos apresentaram aumento
na latência de convulsão e tempo de morte, sugerindo que a STY apresenta efeito
sobre a latência de morte nos animais, similar às drogas gabaérgicas.
No estudo realizado por Szyndler et al. (2006) foi observada elevação
nos níveis de glutamato no hipocampo durante ou após ataques epiléticos em
humanos, bem como em ratos. Além disso, diminuição da função dos receptores
GABA foi observada tanto in vitro quanto in vivo em modelos de convulsão, como na
epilepsia clínica (GROVES et al., 2006).
As células granulares e piramidais são as principais componentes
envolvidas na fisiologia do hipocampo, sendo que o GABA e glutamato os
neurotransmissores dominantes. Em camundongos modificados geneticamente,
observou-se que as concentrações de aminoácidos no cérebro eram diferentes,
alguns animais apresentavam predisposição maior para convulsão. Após 60 dias, a
expressão dos receptores é considerada completa (ENGSTROM; WOODBURY,
1988; MUSUMECI et al., 2000).
A concentração dos aminoácidos livres no cérebro de camundongos com
predisposição para convulsão após a administração de várias drogas com ação
anticonvulsivante foi demonstradas no estudo de Honda (1984), do qual os animais
tratados com fenobarbital aumentaram as concentrações de glutaminina e histidina,
enquanto a fenitoina aumentou a concentração de glutamina. No grupo tratado com
ACTH (0,05mg/kg), ocorreu o aumento nas concentrações de aspartato, ácido
glutâmico, glutamina, glicina e GABA. Outro grupo recebeu vitamina B6 e obteve-se
aumento na concentração de taurina. As substâncias utilizadas alteram as
concentrações dos aminoácidos livres no cérebro, sendo importante a identificação
do possível mecanismo de ação para melhor condução da terapêutica
medicamentosa.
No modelo experimental de epilepsia induzido por pilocarpina, os
sistemas de neurotransmissão ainda não estão completamente definidos. Esse
147
modelo de convulsão em animais é bastante utilizado para estudar a fisiopatologia
do processo convulsivo, uma vez que reproduz alterações comportamentais,
eletroencefalográficas e neuroquímicas que são semelhantes à epilepsia do lobo
temporal em humanos (FREITAS, 2011; CAVALHEIRO et al., 1991; TURSKI et al.,
1983a).
A pilocarpina é um alcaloide extraído das folhas da planta jaborandi
(Pilocarpus jaborandi), a qual possui propriedades colinérgicas capazes de
induzir status epilepticus, culminando com lesões encefálicas específicas e
movimentos estereotipados convulsivantes. A pilocarpina é capaz de induzir status
epilepticus tanto administrada diretamente no encéfalo ou por via intraperitonial
(TURSKI et al., 1983). As crises convulsivas motoras e límbicas iniciam-se por volta
de 15-25 minutos após a injeção de pilocarpina. Os animais evoluem para estado
de crises contínuas clônicas, que caracterizam o status epilepticus (SANABRIA;
CAVALHEIRO, 2000).
Após administração de STY e indução da convulsão por pilocarpina,
demonstrou-se alteração na concentração de GLU e GABA na menor dose no CPF.
No HC, o ASP aumentou na menor dose. A pilocarpina foi capaz de modificar a
concentração dos aminoácidos excitatórios, quando comparado ao controle. O
processo convulsivo decorrente de altas doses de pilocarpina parece envolver o
sistema glutamatérgico, com ativação do receptor NMDA (ISOKAVA et al., 1998).
Freitas (2006) cita que concentração dos aminoácidos ASP, Tirosina (TIR), GLI, GLU
podem atuar durante a propagação e/ou manutenção da atividade epiléptica.
A concentração dos aminoácidos neurotransmissores possibilita
oentendimento dos mecanismos que levam ao desenvolvimento das epilepsias,a
partir dos modelos experimentaisrealizados com animais, principalmente ratos e
camundongos. O modelo experimental se faz valer pela capacidade deste em
representar o processo convulsivo no tratamento agudo e crônico.
148
5.4.3 Conclusão
No modelo de PTZ, os AAE aumentaram, no CPF e HC. O GLU
aumentou nas duas áreas estudadas, enquanto o ASP aumentou no hipocampo. Os
AAI, GLI, TAU e GABA aumentaram no CPF, enquanto no HC aumentaram GLI e
GABA. Neste modelo, na maior dose, teve-se um animal sobrevivente, sugerindo a
participação dos aminoácidos inibitórios, conferindo maior proteção contra o agente
convulsivante.
No modelo de estricnina, ocorreu o aumento da ASP no CPF e HC,
enquanto o glutamato aumentou no HC nas doses administradas. Os AAI TAU e
GABA aumentaram nas maiores doses, enquanto no HC, demonstrou-se o aumento
de GLI, TAU e GABA. Neste modelo, os animais não sobreviveram, no entanto
obteve-se aumento na latência de convulsão e de morte, sugerindo o envolvimento
do AAIs.
No modelo de bicuculina, os AAEs (ASP e GLU) aumentaram tanto no
CPF quanto no HC. Os inibitórios GLI, TAU e GABA aumentaram no CPF e HC.
Neste modelo, na maior dose, sobreviveu um animal, sugerindo o envolvimento do
sistema GABAérgico.
No modelo de pilocarpina, o ASP aumentou no CPF e HC, enquanto o
GLU aumentou no CPF. Enquanto os AAIs, no CPF, aumentou glicina e GABA. No
HC, ocorreu a diminuição da glicina e GABA. Neste modelo, sugere-se o
envolvimento do sistema glutamatérgico .Os animais que receberam pilocarpina 400
mg/kg apresentaram convulsões intensas com mortalidade de 100% em um intervalo
menor de tempo nas maiores doses.
A STY, portanto, aumentou a concentração dos AAEs e AAIs nos
modelos estudados, com destaque para envolvimento do sistema GABAérgico e
glutamatérgico.
149
6 CONSIDERAÇÕES FINAS
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, no teste do campo aberto
(Capítulo I), a STY aumentou a atividade locomotora espontânea dos animais,
sugerindo que a molécula apresenta efeito excitatório, desprovido de efeito sedativo.
No rearing, não ocorreu alteração, enquanto no grooming, ocorreu aumento na
maior dose. No teste do labirinto em cruz elevada e placa perfurada, a STY
comprovou efeito ansiolítico em todas as doses administradas.
O mecanismo de ação ansiolítico da STY parece estar relacionado com o
receptor GABA-A Benzodiazepinico, pois o efeito ansiolítico foi revertido pelo
flumazenil, antagonista deste receptor.
No teste Rota Rod, a coordenação motora dos animais não foi alterada,
mostrando que os efeitos desta molécula não estão relacionados com o bloqueio
neuromuscular periférico, mas com ação central.
No teste de indução do tempo de sono por pentobarbital, a STY
potencializou o efeito sedativo/hipnótico do pentobarbital sódico, o que não parece
ser efeito específico, já que o efeito sedativo não foi confirmado no campo aberto.
Este efeito pode estar envolvido com alterações farmacocinéticas do pentobarbital
ou mecanismo de regulação do sono.
A STY alterou tanto a concentração de aminoácidos excitatórios quanto
inibitórios nas áreas cerebrais estudadas. No Quadro 3, encontra-se o resumo das
concentrações estudadas.
Nos modelos de convulsão induzidas por PTZ, estricnina e bicuculina,
demonstra-se o efeito parcial anticonvulsivante da STY, enquanto o modelo de
pilocarpinaa STY não apresentou proteção.
Nos Quadros 4 e 5, encontram-se os aminoácidosexcitatórios e inibitórios
que sofreram alterações após o uso do agente químico indutor da convulsão em
modelo animal.
150
Quadro 3 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas doses de 1 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral (CPF)
hipocampo (HC) corpo estriado (CE) de camundongos.
Controle STY-1 STY-20
CPF
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
Histidina
-
-
-
-
-
-
↓
↑
↑
-
-
-
↑
↑
↑
↑
↓
↑
HC
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
Histidina
-
-
-
-
-
-
↑
-
-
-
↑
-
↑
↑
↑
↑
↑
↑
CE
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
Histidina
-
-
-
-
-
-
↑
↓
↓
↑
-
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↓
Símbolos: ↑ ou ↓ em relação ao controle quando estatisticamente significativo; − ausência de efeito significativo.
151
Quadro 4 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas doses de 1 , 10 ou 20 mg/kg em córtex pré-frontral
(CPF) hipocampo (HC) de camundongos nos modelos de indução de convulsão por
pentilenotetrazol (PTZ) e estricnina.
Pentilenotetrazol (85mg/kg) STY-1 STY-10 STY-20
CPF
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
-
-
-
-
-
-
↑
↑
↑
-
-
↑
↑
↑
↑
HC
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
↑
-
-
-
-
↑
-
↑
-
-
↑
↑
↑
-
↑
Estricnina (20 mg/kg)
CPF
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
↓
-
-
↑
-
↑
-
↑
↑
-
↑
-
↑
↑
-
HC
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
-
↑
↑
-
-
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
Símbolos: ↑ ou ↓ em relação ao controle quando estatisticamente significativo; − ausência de efeito significativo.
152
Quadro 5 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos
após administração de STY nas doses de 1 , 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral
(CPF) hipocampo (HC) de camundongos nos modelos de indução de convulsão por
bicuculina e pilocarpina.
Bicuculina(12 mg/kg) STY-1 STY-10 STY-20
CPF
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
-
-
-
↓
↓
-
-
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
HC
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
-
-
-
-
-
-
-
-
-
↑
↑
↑
↑
↑
↑
Pilocarpina (400 mg/kg)
CPF
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
↓
↑
↑
-
-
-
↓
↓
-
-
↑
↓
↓
-
-
HC
Aspartato
Glutamato
GABA
Taurina
Glicina
↑
-
-
-
-
↓
-
-
-
↓
↓
-
-
-
↓
Símbolos: ↑ ou ↓ em relação ao controle quando estatisticamente significativo; − ausência de efeito significativo.
153
7 CONCLUSÕES
A molécula de STY no teste atividade locomotora apresenta efeito
excitatório, desprovido de efeito sedativo;
O mecanismo de ação ansiolítico da STY parece estar relacionado com
o receptor GABA-A Benzodiazepinico, pois o efeito ansiolítico foi revertido pelo
flumazenil, antagonista deste receptor;
No teste Rota Rod, os efeitos desta molécula não estão relacionados
com o bloqueio neuromuscular periférico, mas com ação central;
O Aumento do GLU no córtex pré-frontal pode explicar o aumento nos
parâmetros comportamentais, enquanto os inibitórios modularam este
comportamento, sem causar sedação, o que pode explicaração ansiolítica da STY
nos modelos de LCE e placa furada;
A STY, portanto, apresentou efeito anticonvulsivante, uma vez que
ocorreu aumento no tempo de latência de morte e sobrevivência dos animais nos
modelos PTZ, estricinina e biculina. A via colinérgica parece está envolvida apenas
na menor dose 1 mg/kg, possivelmente, interagindo com o sistema GABAérgico.
A STY, portanto, aumentou a concentração dos AAEs (GLU, ASP) e
AAIs (GABA, TAU, GLI), nos modelos estudados, sugerindo o possível
envolvimento dos sistemas glutamatérgico, GABAérgico.
154
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