UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ … contar com a amizade de vocês é muito importante para mim. À...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR - LABOMAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS

ROSA HELENA REBOUÇAS

COLONIZAÇÃO DE TECIDOS E LÍQUIDO CORPÓREO DO CAMARÃO

Litopenaeus vannamei POR Vibrio parahaemolyticus AUTÓCTONE DO AMBIENTE DE

CULTIVO

FORTALEZA

2017




CULTIVO

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial à obtenção do título de doutor. Área de

concentração: Utilização e manejo de

ecossistemas marinhos e estuarinos.

Orientador: Profa. Dra. Oscarina Viana de

Sousa.

Coorientador: Profa. Dra. Regine Helena Silva

dos Fernandes Vieira.

FORTALEZA

2017

___________________________________________________________________________

Página reservada para ficha catalográfica que deve ser confeccionada após apresentação e

alterações sugeridas pela banca examinadora.

Para solicitar a ficha catalográfica de seu trabalho, acesse o site: www.biblioteca.ufc.br, clique

no banner Catalogação na Publicação (Solicitação de ficha catalográfica)

___________________________________________________________________________

http://www.biblioteca.ufc.br/




CULTIVO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da

Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor. Área

de concentração: Utilização e manejo de ecossistemas marinhos e estuarinos.

Aprovada em: 23/06/2017.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Profa. Dra. Oscarina Viana de Sousa (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________

Prof. Dr. Vicente Vieira Faria


_________________________________________

Dra. Francisca Gleire de Rodrigues Menezes


_________________________________________

Prof. Dr. Pedro Carlos Cunha Martins

Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA)

_________________________________________

Profa. Dra. Renata Albuquerque Costa

Faculdades INTA - Sobral

Dedico esse trabalho à

“Mamãezinha querida”, minha maior

incentivadora.

AGRADECIMENTOS

A jornada percorrida para obtenção do título de Doutora em Ciências Marinhas Tropicais

não foi um caminho solitário. Foram muitas as pessoas que contribuíram, torceram, incentivaram e

inspiraram na realização desta conquista. Primeiramente agradeço a Deus pelo discernimento e pela

força a mim concedidos, sem Sua presença em minha vida não haveria vitória.

Minha gratidão especial a profissional que me inspirou a seguir o “caminho da

microbiologia”: Professora Regine Helena S. dos F. Vieira. Sua paixão e competência na arte de

ensinar me encantaram no primeiro dia de aula na disciplina Microbiologia do Pescado no curso de

Engenharia de Pesca. Obrigada por mais uma vez abrir as portas do seu laboratório e da sua

convivência. “Uma vez reginete, sempre reginete”.

Minha querida orientadora Professora Oscarina Viana de Sousa: quando crescer, eu quero

ser igual a você! Partilhar da sua companhia, amizade e sabedoria é uma grande felicidade. A você

todo meu respeito e admiração. Muito obrigada por tudo.

Muito obrigada a toda equipe da Central Analítica da UFC por me receber e acompanhar

nas análises com todo zelo e responsabilidade.

Minha gratidão às pessoas que fazem parte do Laboratório CEDECAM/CEAC: Gracinha,

Renata, Jamille, Fagner, Rubens, em especial ao Professor Rodrigo Maggioni.

Aos professores Alberto Nunes (LABOMAR-UFC), Luis Fernando Marins (FURG) e

Hassan Sabry pela doação dos animais, ração e demais materiais necessários para execução deste

trabalho.

À minha família de coração que me acolheu e colaborou durante a realização dos

experimentos desta tese... por ordem alfabética agradeço à: Francisco Silvanio, Giselle, Graciene

Fernandes, Hemilly Praxedes, Italo Magno, Jamille, Jéssica Lucinda, Jéssica Frota, Juliana e Diego,

Karla Catter, Mariana Lima, Mariana Franco, Rafael Sanro, Raul Vitor, Rebeca, Rubson Mateus,

Thiara Amaral. Em especial, as minhas irmãs de coração Fátima Cristiane, Francisca Gleire e Jade

Abreu, contar com a amizade de vocês é muito importante para mim. À Marina Tereza, partilhar da

sua experiência como pessoa e pesquisadora contribuíram para meu engrandecimento pessoal e

profissional. Gracias por las lecciones de español.

Durante os experimentos no CEAC tive a colaboração da administradora Ariana, dos

auxiliares de serviços gerais, Samara e Seu Zé. Obrigada pelo apoio e prontidão para ajudar.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram com esta tese meu MUITO

OBRIGADA!

RESUMO

A atividade de carcinicultura no nordeste do Brasil vem sendo ameaçada pelo

desencadeamento de doenças de origem viral e bacteriana. Mundialmente, desde 2009, vem

acontecendo nos cultivos de camarão surtos de uma doença emergente conhecida como

“doença da necrose hepatopancreática aguda” (AHPND, sigla em inglês) tendo o V.

parahaemolyticus como agente etiológico. Essa infecção tem chamado a atenção de criadores

devido às elevadas taxas de mortalidade registradas nas larviculturas de camarão. As rotas de

invasão desse patógeno nos tecidos de camarões Litopenaeus vannamei não são conhecidos.

Seu entendimento é parte fundamental na compreensão dos mecanismos patogênicos, além de

contribuir com a elaboração de estratégias de prevenção contra surgimento da doença. Assim,

o objetivo desta pequisa foi o de monitorar as interações da bactéria V. parahaemolyticus na

hemolinfa e tecidos de juvenis do camarão L. vannamei. Para isso foi utilizada uma estirpe

marcada de V. parahaemolyticus em bioensaios de invasão, por imersão, em 20 juvenis de

camarões L. vannamei. Foram realizadas análises microbiológicas e microscópicas das

amostras de fluido e tecidos. As amostragens foram realizadas nos tempos 0, 24, 48 e 72h

após a inoculação. Não foi detectada a presença de bactérias do gênero Vibrio na hemolinfa

pelas contagens com meio de cultura Agar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS) para os

animais oriundos dos tanques controle negativo e experimental. Foram detectadas contagens

de Vibrio spp. nas amostras de hepatopâncreas dos tanques controle negativo e experimental:

(0h: 2,2 logUFC/g e 24h: 0,6 logUFC/g); (0h: 0,3 logUFC/g e 48h: 1,1 logUFC/g) e para

amostras do intestino (24h: 1 logUFC/g); (0h: 0,7 logUFC/g e 24h: 0,6 logUFC/g). As

contagens de V. parahaemolyticus resultaram na detecção da bactéria nos tecidos do

hepatopâncreas (48h: 0,7 logUFC/g e 72h: 0,8 logUFC/g) e intestino médio (72h: 0,7

logUFC/g) para os animais do experimento desafio. Por meio das análises microscópicas,

observamos coerência entre as contagens em placas e a presença bacteriana nos tecidos. A

colonização tecidual pelo V. parahaemolyticus acontece de maneira diferenciada, com fixação

em um primeiro momento nos tecidos do intestino médio seguida de uma instalação tecidual

mais intensa no hepatopâncreas. A partir desse protocolo outras possibilidades e abordagens

se tornam viáveis usando o V. parahaemolyticus como indicador, viabilizando o

acompanhamento da colonização do organismo e análise paralela dos mecanismos

imunológicos de camarões e favorecendo o desenvolvimento de tecnologias para prevenção

ou tratamento de eventos de vibrioses nos cultivos de camarão.

Palavras-chave: Aquicultura. Patologia. Microscopia ótica.

ABSTRACT

Shrimp farming activity in Northeast Brazil has been threatened by viral and bacterial

diseases outbreaks. In a world scale, since 2009, shrimp farms have been emerging from an

emerging disease known as "acute hepatopancreatic necrosis disease" (AHPND), with V.

parahaemolyticus as the etiological agent. This infection has attracted the attention of farmers

because of the high mortality rates recorded in shrimp larvae. Invasion routes of this pathogen

in Litopenaeus vannamei shrimp tissues are not very clear. The comprehension of such routes

is fundamental to understand its pathogenic mechanisms, as much as for contributing to the

elaboration of strategies in order to prevent the further outbreaks. Thus, the objective of this

study was to monitor interactions of V. parahaemolyticus in the hemolymph and young tissues

of L. vannamei shrimp. In order to proceed with this, a strain of V. parahaemolyticus was

used, by immersion, in 20 young L. vannamei shrimps. Microbiological and microscopic

analyzes of fluid and tissue samples were performed. Samples were taken at 0, 24, 48 and 72

h after inoculation. Presence of bacteria of the Vibrio genus in the hemolymph was not

detected by the counts with Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS) medium for the animals

from the negative and experimental control tanks. Counts of Vibrio spp. were detected in

hepatopancreas samples from negative and experimental control tanks: (0h: 2.2 logCFU / g

and 24h: 0.6 logCFU / g); (0h: 0.3 logCFU / g and 48h: 1.1 logCFU / g) and for intestine

samples (24h: 1 logCFU / g); (0h: 0.7 logCFU / g and 24h: 0.6 logCFU / g). Count of V.

parahaemolyticus resulted in the detection of the bacterium in hepatopancreas tissues (48h:

0.7 logCFU / g and 72h: 0.8 logCFU / g) and medium intestine (72h: 0.7 logCFU / g) for

challenge experiment. By microscopic analysis, we observed a consistency between plaque

counts and bacterial presence in tissues. Tissue colonization by V. parahaemolyticus occurs in

a differentiated way, with fixation at first in the tissues of the midgut followed by a more

intense tissue installation in the hepatopancreas. From this protocol, other possibilities and

approaches become viable using V. parahaemolyticus as an indicator, such as monitoring the

organism's colonization, and the parallel analysis of the immunological mechanisms of

shrimp, favoring the development of technologies in order to prevent or treat vibriosis events

in shrimp culture.

Keywords: Aquaculture. Pathology. Optical microscopy.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Representação esquemática do sistema digestório de camarão

peneídeo............................................................................................... 25

Figura 02 Diagrama simples de um vetor de clonagem....................................... 28

Figura 03 Ilustração esquemática do plasmídio Psonda-ZsGreen1-Dr................. 33

Figura 04 Fluxograma do processo de competência celular para estirpes do

gênero Vibrio de acordo com Panda (1991)......................................... 35

Figura 05 Fluxograma do processo de transformação celular............................... 35

Figura 06 Fluxograma dos testes para expressão da fluorescência das colônias

transformadas...................................................................................... 37

Figura 07 Fluxograma do protocolo de lavagens celulares utilizando meio de

cultura com baixa indução de fluorescência........................................ 40

Figura 08 Fluxograma do teste desafio com V. parahaemolyticus (106T) e

camarões L. vannamei.......................................................................... 41

Figura 09 Imagens do processamento das amostras do camarão Litopenaeus

vannamei e disposição dos tecidos no interior das lamínulas em

câmara (Lab-Tek).............................................................................. 44

Figura 10 Perfil eletroforético da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de

cinco cepas classificadas fenotipicamente como Vibrio

parahaemolyticus com os primers do gene tl utilizado para detectar a

espécie. Os padrões P1 e P2 são, respectivamente, gene tl e Vibrio

parahaemolyticus IOC 18950............................................................... 45

Figura 11 Verificação a integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr diluído em

diferentes concentrações....................................................................... 47

Figura 12 Eletroforese em gel de agarose do produto de PCR de DNA Total e

Plasmidial de V. parahaemolyticus (106; 106T), Vibrio sp. (195T) e

E. coli (V517; V517T).......................................................................... 49

Figura 13 Fluorescência celular apresentada por células de V.

parahaemolyticus (106; 106T) e E. coli (V517T) corados com

laranja de acridina (a) e sem adição de corantes

(b).......................................................................................................... 50

Figura 14 Contagens de colônias bacterianas em meio seletivo para gênero

Vibrio com e sem adição de antibiótico oriundas de amostras de

hepatopâncreas, intestino médio e hemolinfa de camarão L.

vannamei desafiados com V parahaemolyticus (106T)........................

53

Figura 15 Imagens dos esfregaços das amostras de hemolinfa extraídas de

camarão L. vannamei analisadas em microscópio confocal Zeiss

(modelo LSM 710 – Alemanha)........................................................... 56

Figura 16 Imagens das amostras de hepatopâncreas extraídas de camarão L.

vannamei analisadas em microscópio confocal (modelo LSM 710 –

Alemanha)........................................................................................... 57

Figura 17 Imagens das amostras de intestino médio extraídas de camarão L.

vannamei analisadas em microscópio confocal (modelo LSM 710 –

Alemanha)........................................................................................... 57

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Bactérias do gênero Vibrio relacionadas como agentes etiológicos em

eventos de doenças ocorridas em cultivos de camarão.......................... 23

Quadro 2 Investigações realizadas sobre as rotas de invasão de estirpes

bacterianas do gênero Vibrio em camarão cultivado............................. 26

Quadro 3 Características dos isolados identificados bioquimicamente como V.

parahaemolyticus................................................................................... 30

Quadro 4 Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer tl.......... 31

Quadro 5 Concentrações dos reagentes utilizados na reação de PCR................... 38

Quadro 6 Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer

ZsGreen.................................................................................................. 39

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resultado do antibiograma para verificação da sensibilidade das estirpes à

canamicina. 46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg Micrograma

µL Microlitro

ABCC Associação Brasileira de Criadores de Camarão

AHPND Doença da Necrose Hepatopancreática Aguda (sigla em inglês)

ampr Resistência à Ampicilina

AVIB Associação de Biologistas de Víbrio

B Branco

BA Bahia

CE Ceará

CEAC Centro de Estudos em Aquicultura Costeira

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DSMZ Coleção Germânica de Microorganismos e Culturas Celulares

EMS Síndrome da Mortalidade Precoce (sigla em inglês)

FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura

FURG Universidade Federal do Rio Grande

G Gravidade ou Gramas

GFP Proteína Verde Brilhante (sigla em inglês)

H Hora

HP Hepatopâncreas

INT Intestino Médio

IOC Instituto Oswaldo Cruz

kDa Kilodalton

L Litro

LAMAP Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado

LB Luria Bertani

M Marcador Molecular

Min Minuto

mL Mililitro

mM Milimolar

OD Densidade Ótica (sigla em inglês)

ORI Origem de Replicação

PBS Solução Salina Fosfatada (sigla em inglês)

PCR Reação em Cadeia da Polimerase (sigla em inglês)

PE Pernambuco

RJ Rio de Janeiro

RPM Rotação Por Minuto

RN Rio Grande do Norte

QS Quorum Sensing

Seg Segundo

Spp Espécie

TCBS Tiossulfato Citrato Bile Sacarose

TE Tampão de Eluição

TBE Tris-Borato-EDTA

tdh Hemolisina Termoestável Direta

tl Hemolisna Termolábil

trh Hemolisina Termoestável Relacionada a Hemolisina

TSA Ágar Triptona Soja (sigla em inglês)

UFC Unidade Formadora de Colônia

UV Ultravioleta

V Volts

YNB Yeast Nitrogen Base

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

® Marca Registrada

CaCL2 Cloreto de Cálcio

H2O Água

HCl Ácido Clorídrico

MgCl2 Cloreto de Magnésio

NaCl Cloreto de Sódio

ºC Grau Célsius

p/v Relação Peso Volume

U$ Dólar

λ Comprimento de Onda

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 14

1.1 OBJETIVOS............................................................................................ 16

1.1.1 Objetivo geral........................................................................................... 16

1.1.2 Objetivos específicos................................................................................ 16

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................. 17

2.1 O gênero Vibrio......................................................................................... 17

2.1.1 Vibrio parahaemolyticus........................................................................... 18

2.1.2

Mecanismos de patogenicidade bacteriana e defesa imunológica em

camarão....................................................................................................

19

2.1.3 Vibrioses na carcinicultura....................................................................... 21

2.1.4 Rotas de infecção de Vibrio spp. em camarão.......................................... 25

2.2 Transformação e manipulação bacteriana................................................. 27

2.2.1 Proteína verde fluorescente...................................................................... 28

3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 30

3.1 Seleção das estirpes.................................................................................. 30

3.1.1 Identificação bioquímica e fatores de virulência...................................... 30

3.1.2 Caracterização genotípica dos isolados de V. parahaemolyticus............ 31

3.1.2.1 Extração do DNA...................................................................................... 31

3.1.2.2 Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as

estirpes de V. parahaemolyticus................................................................

31

3.1.2.3 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene tl........................ 31

3.1.3 Perfil de sensibilidade à canamicina......................................................... 32

3.1.3.1 Antibiograma............................................................................................ 32

3.2 Vetor plasmidial........................................................................................ 32

3.2.1 Integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr.................................................... 33

3.3 Adaptação do protocolo de transformação do V. parahaemolyticus....... 34

3.3.1 Competência celular................................................................................. 34

3.3.2 Transformação celular.............................................................................. 35

3.3.3 Seleção dos transformados....................................................................... 36

3.3.4 Confirmação da transferência plasmidial por PCR................................. 38

3.3.4.1 Extração do DNA Plasmidial................................................................... 38

3.3.4.2 Extração do DNA Total............................................................................ 38

3.3.4.3 Amplificação por PCR para estirpes de V. parahaemolyticus

transformadas...........................................................................................

38

3.3.4.4 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene ZsGreen............. 39

3.3.5 Avaliação da fluorescência por microscopia ótica confocal................... 39

3.3.5.1 Redução da fluorescência induzida pelo meio de cultura e

autofluorescência......................................................................................

40

3.4 Teste desafio............................................................................................. 41

3.4.1 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente........................ 41

3.4.1.2 Sinais patológicos externos dos animais.................................................. 42

3.4.2 Processamento das amostras..................................................................... 42

3.4.2.1 Coleta da hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas.......................... 42

3.4.3 Análises microbiológicas.......................................................................... 43

3.4.3.1 Contagens de Vibrio spp e Vibrio resistentes à canamicina...................... 43

3.4.4 Análise por microscopia ótica confocal.................................................. 43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 45

5.1 Escolha dos isolados................................................................................. 45

5.1.1 Sensibilidade à canamicina...................................................................... 46

5.2 Vetor plasmidial........................................................................................ 47

5.3 Adaptação do protocolo para transformação do V. parahaemolyticus.... 47

5.3.1 Processo de transformação e competência celular................................... 47

5.3.1.1 Seleção dos transformados....................................................................... 48

5.3.1.2 Confirmação da transferência plasmidial por PCR................................. 48

5.3.1.3 Avaliação da fluorescência celular por microscopia ótica confocal...... 49

5.4 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente........................ 51

5.4.1 Sinais comportamentais............................................................................ 51

5.4.2 Análises microbiológicas.......................................................................... 52

5.5 Microscopia ótica confocal.................................................................... 55

6 CONCLUSÃO......................................................................................... 60

6.1 Considerações finais................................................................................. 60

7 REFERÊNCIAS...................................................................................... 61

14

1 INTRODUÇÃO

O camarão branco Litopenaeus vannamei é a espécie de maior importância

econômica, sendo a mais cultivada em todo o mundo (HUYNH et al., 2011). Nos anos de

2010 a 2015 o cultivo mundial dessa espécie produziu em média 3 milhões de toneladas,

arrecadando o equivalente a U$ 15 bilhões. Para o mesmo período, a média de produção de

camarão no Brasil foi de 69 mil toneladas, alcançando cifras de U$ 378 mil (FAO, 2017).

Apesar de seu potencial econômico a indústria aquicola vem sendo continuamente

ameaçada pelo surgimento de doenças resultando em produções ineficientes e consequente

redução nos lucros obtidos com essa atividade (MOSS et al., 2012; SOTO-RODRIGUEZ et

al., 2012).

Um aspecto no cultivo de camarões relacionado com a susceptibilidade a

doenças é o estresse animal provocado por perturbações das condições ecológicas nos

viveiros. Além do estresse ambiental, o desencadeamento das doenças na carcinicultura

pode ser estimulado pelas práticas de manejo que causam endogamia, diminuindo a

resistência aos patógenos (KAUTSKY et al., 2000; DOYLE, 2016).

A presença de patologias no camarão é um dos principais problemas enfrentado

pelos carcinicultores, implicando no aumento da taxa de mortalidade dos animais

cultivados e se refletindo diretamente na eficiência técnica do produtor (SILVA e

SAMPAIO, 2009). Entre essas patologias, a ocorrência de doenças infecciosas nos cultivos

de camarões marinhos teve um efeito devastador, causando colapso na produção de grandes

países produtores e desencadeando grandes perdas para a indústria. A partir de então, as

enfermidades passaram a ser vistas como um obstáculo econômico e uma ameaça a

viabilidade da atividade (NUNES e MARTINS, 2002).

Entre as enfermidades que acometem a carcinicultura, as de origens bacterianas

e virais são as que mais afetam o camarão de cultivo. Dentre as infecções de origem

bacteriana, destacam-se as vibrioses que são ocasionadas por micro-organismos

patogênicos e oportunistas encontrados na água e no sedimento, podendo também estar

presente na microbiota intestinal de camarões sadios (DOURADO, 2009). Recentemente,

algumas estirpes de Vibrio parahaemolyticus tem despertado atenção dos carcinicultores

devido estar relacionada como agente etiológico da Doença da Necrose Hepatopancreática

15

Aguda (AHPND) que surgiu emergencialmente na Ásia no ano de 2009 provocando

mortalidade em massa nos cultivos. (TRAN et al., 2013; DE LA PEÑA et al., 2015; LAI et

al., 2015). No Brasil esta enfermidade ainda não foi notificada. No entanto, a AHPND já foi

confirmada no México em 2013 e por se tratar de uma patologia mediada por plasmídio,

sua disseminação para outros países, incluindo o Brasil, pode ser uma questão de tempo

(NUNAN, 2014; DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015).

Apesar da importância, pouco se sabe sobre a etiologia de algumas

enfermidades, incluindo as vibrioses o que significa incapacidade de resposta a eventos de

doenças (MENDES et al., 2009). Estudos sobre as rotas de infecção de bactérias do gênero

Vibrio são ainda limitados. A geração de conhecimento nessa área é fundamental para a

compreensão da etiologia e patogênese das doenças e dos fatores determinantes para o

desencadeamento no ambiente de cultivo, com consequente desenvolvimento de novas

estratégias de controle dessas infecções. Essas pesquisas sobre as vias de infecção devem

ser realizadas com a utilização de novas tecnologias e protocolos, incluindo bactérias

geneticamente marcadas, com o uso de proteína fluorescente, microscopia eletrônica de

transmissão e hibridização in situ (AGUIRRE-GUZMÁN et al. 2010; VINOJ,

VASEEHARAN e BRENNAM, 2014).

O objetivo da presente pesquisa foi descrever a rota de colonização do fluido

corpóreo e tecidos de camarões L. vannamei por V. parahaemolyticus. Considerando a

hipótese de que a colonização da hemolinfa e órgãos de camarões L. vannamei por

bactérias do gênero Vibrio ocorre de forma diferencial. Desta forma, reconhecendo que a

elucidação das rotas e sítios de invasão de patógenos bacterianos nos sistemas de camarão

são importantes para a gestão e sustentabilidade da atividade de carcinicultura e o

aprimoramento de estratégias de controle biológico (uso de probióticos e prebióticos).

16

1.1 OBJETIVOS

1. 1. 1 Objetivo geral

Descrever a colonização do Vibrio parahaemolyticus na hemolinfa e tecidos de juvenis do

camarão Litopenaeus vannamei.

1.1.2 Objetivos específicos

Adaptar protocolo de marcação genética para V. parahaemolyticus;

Realizar teste desafio usando estirpe de V. parahaemolyticus;

Quantificar víbrios totais na hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas de juvenis de

camarões cultivados após o teste desafio usando uma estirpe de V. parahaemolyticus;

Descrever a colonização na hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas de camarões por

V. parahaemolyticus.

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O gênero Vibrio

Pertencem ao gênero Vibrio bactérias Gram-negativas muitas vezes curvas,

facultativamente anaeróbias não formadoras de esporos e móveis por meio de um flagelo

polar. O crescimento da maioria é estimulado pela presença de cloreto de sódio

(DESMACHELIER, 1999). São habitantes naturais dos ecossistemas marinho e estuarino,

onde geralmente se localizam as fazendas de cultivo de camarão (GOPAL et al., 2005;

AUSTIN, 2010). Segundo definição feita por Baumann e Schubert (1984), a família

Vibrionaceae inclui os seguintes gêneros: Víbrio, Aeromonas, Photobacterium e

Plesiomonas. Esses micro-organismos foram classificados juntos não só por serem

encontrados principalmente na água, mas também por serem capazes de causar doença

gastrintestinal em humanos. Entretanto, as técnicas biomoleculares estabeleceram que esses

gêneros possuem apenas uma relação distante e pertencem a famílias distintas: Vibrio e

Aeromonas são classificadas na família Vibrionaceae e Aeromonadaceae, respectivamente,

e as Plesiomonas devido sua íntima relação com Proteus foram colocadas na família das

Enterobacteriaceae (MURRAY et al., 2004). Atualmente, o número de espécies aceitas para

o gênero Vibrio é de137 (incluindo subespécies) (DSMZ, 2017). No entanto, esse número

ainda está em expansão, devido ao desenvolvimento de métodos de identificação de grupos

ou espécie-específicos que proporcionam novas descobertas sobre a ecologia das bactérias

pertencentes à família Vibrionaceae (AVIB, 2013).

Poucas espécies de Vibrio são relacionadas como agente etiológico em doenças

humanas causadas pela ingestão de alimento marinho ou contato com água contaminada

com víbrio (HUEHN et al., 2014). Dentre as espécies de Vibrio patogênicas para humanos,

se destacam o V. cholerae, agente etiológico da cólera, que possui distribuição cosmopolita

sendo encontrada em rios e oceanos. A espécie V. cholerae se divide em sorogrupos

determinados pela presença ou ausência do antígeno O. O sorogrupo O1 toxigênico se

divide em biótipos Clássico e El Tor, além da existência do sorotipo O139 (ABBOUDE et

al., 1993; ALBERT et al., 1993; ABBOUD et al., 2007).

Estirpes bacterianas de V. parahaemolyticus são reconhecidas como importantes

18

causadores de gastroenterite relacionada ao consumo de mariscos contaminados

(MERCOGLIANO et al., 2014; YUXUE et al., 2015). Enquanto V. alginolyticus e V.

vulnificus podem estar associados a infecções de feridas ou septicemia primária de origem

marinha em pacientes imunodeprimidos. (MERCOGLIANO et al., 2014). Um

levantamento de dados realizado sobre os casos de doenças humanas provocadas por V.

alginolyticus nos EUA entre os anos de 1988 a 2012 demonstraram que das 1331 infecções

provocadas por este patógeno, 96% ocorreram em estados costeiros e sendo a maioria

(86%) relacionada a atividades na água (SLIFKA JACOBS, NEWTON e MAHON, 2007).

Em camarões marinhos, essas bactérias estão envolvidas em várias doenças

infecciosas que causam mortalidade e perdas econômicas nos cultivos (GOARANT e

MERIEN, 2006; SAKAI et al., 2007; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; ZHANG et al.,

2014). No ambiente aquático, em condições de estresse as espécies de Vibrio tornam-se

agentes patogênicos mortais para camarões (LIGHTNER, 2005). Ainda assim, em um

ambiente natural é difícil definir quais são os agentes estressores que estimulam a

expressão da patogenicidade em uma determinada comunidade microbiana. Uma vez que a

resposta à condição estressante vai variar de organismo para organismo (SUNG et al.,

2001). A resposta imune dos camarões pode ser afetada por condições ambientais

desfavoráveis que causam estresse, aumentando sua vulnerabilidade a bactérias autóctones

como o víbrio (KUMAR et al., 2014).

Para o entendimento dos processos infecciosos se faz necessária uma descrição

das bactérias patogênicas presentes nos viveiros de camarão (WALLING et al., 2010).

Várias espécies de Vibrio possuem importância como patógenos para a aquicultura

marinha, como V. harveyi, V. alginolyticus, Listonella (Vibrio) anguillarum e, mais

recentemente, o V. parahaemolyticus (HU et al., 2012).

2.1.1 Vibrio parahaemolyticus

A bactéria V. parahaemolyticus foi descoberta por Tsunesaburo Fujino após um

surto de gastroenterite provocado pela ingestão de “shirasu” (sardinhas novas não

submetidas à cocção) no ano de 1950 em Osaka, Japão (SHINODA, 2011). Os isolados

foram primeiramente nomeados como Pasteurella parahaemolytica e somente dez anos

19

depois, os autores Fujino et al. (1965 apud SHINODA, 2011) reexaminaram os isolados de

“shirasu” propondo o nome científico V. parahaemolyticus.

Vibrio parahaemolyticus é um habitante natural de ambientes estuarinos e

costeiros, moderadamente halofílico capaz de crescer em concentrações de NaCl de até 8%

(YANG et al., 2010). Sua virulência em humanos está fortemente ligada a genes que

codificam para hemolisina termoestável direta (tdh) e seu homólogo hemolisina relacionada

a hemolisina termoestável (trh) (WEST, KLEIN e LOVELL, 2013).

Além da patogenicidade em humanos, essa estirpe bacteriana tem sido descrita

como patógena para camarões peneídeos em várias partes do mundo (KUMAR et al., 2014;

ZHANG et al., 2014; YINGKAJORN et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015)

sendo um importante causador de mortalidade e perdas econômicas na atividade da

carcinicultura (LOMELÍ-ORTEGA e MARTÍNEZ-DÍAZ, 2014). Estudos realizados por

Kumar et al. (2014) confirmaram o papel do V. parahaemolyticus como patógeno

oportunista podendo causar mortalidade em larga escala em camarão branco do Pacífico L.

vannamei. Sua patogenicidade está relacionada à doença da necrose hepatopancreática

aguda (AHPND) também conhecida como a síndrome da mortalidade precoce (EMS) que

surgiu em 2009 na Ásia (NUNAN, et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Estirpes

de V. parahaemolyticus isoladas de cultivos de camarão acometidos pela AHPND não

apresentaram os genes tdh e trh. Indicando que os genes responsáveis pela virulência em

humanos não são os mesmos para camarões (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et

al., 2016; LÓPEZ-LEÓN et al., 2016).

2.1.2 Mecanismos de patogenicidade bacteriana e defesa imunológica em camarão

O camarão branco L. vannamei é a espécie de camarão mais cultivada no

mundo, e como resultado da intensificação da carcinicultura, muitas fazendas apresentam

doenças virais e bacterianas (vibrioses) despertando a preocupação em relação a sanidade

dos animais e estimulando as pesquisas sobre o sistema imunológico dos invertebrados

(BURGENTS et al., 2005; CHIU-HSIA et al., 2007). Os mecanismos envolvidos na

patogênese e a reação de defesa resultado das vibrioses ainda não estão claramente

compreendidos. No entanto, em todos os filos animais, a fagocitose é considerada como

20

uma forma central e importante para eliminar micro-organismos ou outras partículas

pequenas (VAN DE BRAAK et al., 2002).

Em algumas espécies patogênicas pertencentes à família Vibrionaceae tem sido

demonstrado que os fatores de virulência são regulados através de uma rede complicada de

quorum sensing (QS) (LI, YEH e CHEN, 2010). O QS é um sistema de intercomunicação

bacteriana que controla a expressão de múltiplos genes em resposta à densidade

populacional (YE et al., 2008). Estão envolvidas nesse processo a produção, liberação e

subsequente detecção de moléculas sinalizadoras químicas chamadas de auto-indutoras

(HENKE e BASSLER, 2004). As bactérias usam o processo de comunicação QS para

controlar as transições entre comportamentos individuais e de grupo, existindo em víbrios,

dois fatores de transcrição mestre, AphA e LuxR, que coordenam a resposta QS (VAN

KESSEL et al., 2013). Fatores de virulência, desenvolvimento de biofilme e a motilidade

flagelar são mediados pelo AphA que é um pequeno regulador de transcrição PadR-familiar

DNA-obrigatório que desempenha várias funções em V. parahaemolyticus (WANG et al.,

2013).

Bactérias do gênero Vibrio produzem enzimas proteolíticas extra-celulares que

possuem papel na obtenção de nutrientes via digestão de vários substratos protéicos e

muitas podem desempenhar papel importante na virulência (ELGAML, HIGAKI e

MIYOSHI, 2013; LEE et al., 2002). O ciclo tradicional de infecção bacteriana compreende

as fases de entrada do patógeno, seguida pelo seu estabelecimento, multiplicação, uso de

mecanismos para evitar a defesa do hospedeiro, danos e saída (DONNENBERG, 2000).

Esses diferentes passos envolvem a expressão de fatores de virulência, tais como: produção

de fatores de adesão; produção de exopolissacarídeos e biofilmes; produção de enzima

lítica; sideróforos e aquisição de ferro e bacteriófagos (RUWANDEEPIKA et al., 2012).

Após infectar P. monodon com V. anguillarum, Van de Braak et al. (2002)

realizaram amostragens da hemolinfa do camarão em diferentes tempos (5min., 10 min.,

2h, 24h, 48h e 7 dias) verificando que as contagens desse patógeno decresceram com o

passar do tempo. Paralelo às contagens bacterianas, procederam a histologia dos tecidos,

onde foi detectada o encapsulamento da bactéria pelos hemócitos após o período de 24h e

aglutinação na hemolinfa após 10min. da exposição ao patógeno. A presença de

mecanismos e barreiras de defesa imunológica em camarão foi sugerida após desafio com

21

V. parahaemolyticus, quando houve ausência do patógeno na hemolinfa e músculo e as

contagens nas brânquias decresceram até o seu desaparecimento (AGUIRRE-GUZMÁN et

al., 2010). A microbiota natural do camarão pode também atuar como mecanismo de defesa

contra outros patógenos bacterianos. Shakila et al. (2006) pesquisaram a ação antagônica de

bactérias isoladas do intestino de Penaeus monodon, observando atividade antibacteriana

contra espécies dos gêneros Pseudomonas sp., Photobacterium sp., Bacillus sp. e frente a

culturas de Aeromonas hydrophila, A. sobria e do patógeno de camarões V. vulnificus.

Segundo afirmaram Aguirre-Guzmán et al. (2010), existia um número

significativamente maior de trabalhos científicos abordando a detecção e quantificação de

Vibrio sp. em camarão comparado ao número de estudos que abordava a patogenicidade

específica e as rotas de infecção desses patógenos no camarão. Assim, existe ainda carência

de informações que permitam dar subsídios a ações visando a redução de perdas na

atividade de cultivo de camarões. Vinoj, Vaseeharan e Brennan (2014) descreveram um

método para estudar a patogenicidade e colonização de V. parahaemolyticus marcado via

plasmídio com a proteína fluorescente verde (GFP) em hemolinfa, intestino, brânquias e

músculo do camarão Fenneropenaeus indicus, revelando uma eficiente colonização

bacteriana em massa através da região oral até o intestino e outros tecidos.

2.1.3 Vibrioses na carcinicultura

No Brasil a atividade da carcinicultura teve início na década de 1970

experimentando um desenvolvimento intenso e alcançando um patamar de indústria de

exportação na década de 1990 (QUEIROZ et al., 2013). A produção nacional de camarão

cultivado manteve-se constante ao longo dos anos até 2011, mas as exportações caíram

acentuadamente a partir de 2004 (ABREU et al., 2011). A indústria da carcinicultura vem

experimentando perdas econômicas significativas e estima-se que, no mundo todo,

aproximadamente 60% das perdas por doenças sejam causadas por patógenos virais e 20%

por patógenos bacterianos principalmente do gênero Vibrio (AGUIRRE-GUZMÁN et al.,

2004; FLEGEL, 2012).

A abundância natural dos víbrios em ecossistemas de cultivo de camarão,

somada às taxas de multiplicação e capacidade de se adaptar às mudanças ambientais

22

aumentam a preocupação com o surgimento das vibrioses (SAULNIER et al., 2000).

A salinidade é considerada um fator secundário na sobrevivência e crescimento

das estirpes de víbrio que se desenvolvem em ambientes com ampla variação de salinidade

(2 a 48) (EILER, JOHANSSON e BERTILSSON 2006; SOBRINHO et al., 2010). As

regiões costeiras e estuarinas apresentam variações na salidade (1-40), sendo os locais de

escolha preferencial para o cultivo de camarões marinhos. A migração desta atividade

agrícola para regiões interiores surgiu como uma alternativa para minimizar os custos da

produção e a pressão sobre as áreas costeiras. Além de aumentar as oportunidades de

emprego nas zonas rurais e auxiliar na diversificação da carcinicultura (McGRAW et al.,

2002; ARANEDA, PÉREZ e GASCA-LEYVA, 2008). Na região nordeste brasileira há

uma forte tendência para a interiorização da carcinicultura como alternativa

economicamente viável. No entanto, há a preocupação de que os agentes patogênicos para

camarões que são comuns para as zonas costeiras possam atravessar a barreira da salinidade

e atingir os cultivos de água doce (Informação verbal)1.

As bactérias do gênero Vibrio são reconhecidas como patógenos oportunistas

que causam mortalidades em larga escala em cultivos de camarão. As espécies que

preocupam mais os carcinicultores são: Vibrio alginolyticus, V. harveyi, V.

parahaemolyticus e V. nigripulchritudo (Quadro 1).

1 Prof. Dr. Pedro Carlos Cunha Martins (UFERSA) em ocasião da sua participação na banca da defesa de

tese de Rosa Helena Rebouças intitulada Colonização de tecidos e líquido corpóreo do camarão

Litopenaeus vannamei por Vibrio parahaemolyticus autóctone de ambiente de cultivo no dia 23 de junho

de 2017 no Instituto de Ciências do Mar – Labomar – UFC.

23

Quadro 1: Bactérias do gênero Vibrio relacionadas como agentes etiológicos em eventos de doenças ocorridas em cultivos de camarão.

Bactéria Hospedeiro Doença Local de infecção País Referência

V. harveyi P. monodon Vibriose Pós-larvas - KARUNASAGAR et al., 1994

Vibrio spp P. monodon Doença do pé vermelho Hepatopâncreas; órgão linfóide; hemolinfa Filipinas ALAPIDE-TENDÊNCIA e

DUREZA, 1997

Vibrio sp. luminescente P. monodon Vibriose luminescente Hepatopâncreas Filipinas LAVILLA-PITOGO, LEAÑO e

PANER, 1998

Vibrio spp. P. stylirostris Síndrome 93 Hemolinfa Nova Caledônia COSTA et al., 1998

V. vulnificus P. monodom - Hemolinfa, tecido conjuntivo - ALDAY-SANZ, ROQUE e

TURNBULL, 2002

V. alginolyticus L. vannamei Vibriose Músculo Taiwan LIU et al., 2004

V. campbelli L. vannamei - Órgão linfóide; coração; hemolinfa;

brânquias; hepatopâncreas - BURGENTS et al., 2005

V. penaeicida L. stylirostris Síndrome 93 Hemolinfa Nova Caledônia GOARANT e MERIEN, 2006

V. nigripulchritudo L. stylirostris Síndrome do verão Hemolinfa Nova Caledônia GOARANT et al., 2006

Vibrio spp. P. monodon

Necrose de cauda; doença

intestinal branca; LSS;

doença do pé vermelho

Hemolinfa Índia JAYASREE, JANAKIRAM e

MADHAVI, 2006

V. nigripulchritudo P. japonicus Síndrome do verão

Coração, cérebro, brânquias, estômago,

hepatopâncreas, órgão linfóide, glândula

antenal, músculo

Japão SAKAI et al., 2007

V. parahaemolyticus L. vannamei - Brânquias; hepatopâncreas - AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010

V. parahaemolyticus L. vannamei AHPND/EMS* Hemolinfa Índia KUMAR et al., 2014

V. parahaemolyticus L. vannamei Vibriose Camarão Tailândia YINGKAJORN et al., 2014

V. parahaemolyticus F. indicus - Brânquias, músculo, intestino; hemolinfa - VINOJ, VASEEHARAN e

BRENNAN, 2014

V. parahaemolyticus e

V. rotiferianus F. chinensis Vibriose Hemolinfa China ZHANG et al., 2014

V. parahaemolyticus L. vannamei AHPND/EMS* Hemolinfa México SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015

Fonte: Elaborada pela autora - * AHPND/EMS - Doença da necrose aguda hepatopâncreática/Síndrome da mortalidade precoce

24

As vibrioses que acometem os cultivos de L. vannamei se tornaram um grande

problema econômico global, fazendo com que o controle e prevenção de doenças em

camarões sejam o alvo principal de estudos recentes (BOWLER et al., 2015; LI et al., 2015;

CAO et al., 2015). A prevenção ou redução da mortalidade em massa na larvicultura de

camarão causada por vibrioses ainda é um problema chave para a indústria aquícola. Na

maioria dos casos, os antibióticos e antimicrobianos químicos são utilizados rotineiramente

para prevenir ou tratar a vibriose em camarões, embora tragam efeitos secundários negativos

(WEN et al., 2014; FLORES-MIRANDA et al., 2011; WONGTAVATCHAI, LÓPEZ-

DÓRIGA e FRANCIS, 2010). O uso inapropriado de agentes antimicrobianos pode contribuir

para a disseminação de genes de resistência no ambiente aquático e para o público

consumidor desse crustáceo (YANO et al., 2014). Segundo Adams e Boopathy (2013) a

resistência bacteriana aos antimicrobianos traz impactos na escolha de drogas que humanos e

animais podem usar, bem como seus resíduos em animais destinados ao consumo podem

trazer riscos à saúde dos seres vivos.

Em termos de impacto econômico, diversos países suspenderam ou proibiram a

importação de camarão vivo e ou outras formas de produtos de camarão oriundos de países

afetados pela AHPND provocada pelo V. parahaemolyticus (FAO, 2013). Essa enfermidade

foi notificada pela primeira vez em 2009 após causar perdas significantes na produção de

camarão no sudeste da Ásia. Inicialmente, não se sabia o que causava essa síndrome, porém

em 2013 o agente etiológico foi isolado e identificado como V. parahaemolyticus (TRAN et

al., 2013; DE LA PEÑA et al., 2015; ZORRIEHZAHRA e BANAEDERAKHSHAN, 2015).

Os sinais clínicos da AHPND incluem fraqueza, descoloração e redução do hepatopâncreas

que coincidem com as taxas de mortalidade (DE LA PEÑA et al., 2015). Esses sintomas

característicos da AHPND são causados por toxinas PirA e PirB que se assemelham a toxina

inseticida binária de espécies de Photorhabdus que são proteínas codificadas pelo plasmídio

pVA1 (DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015; LEE et al., 2015; SIRIKHARIN, et al.,

2015). Os genes que codificam essas enzimas são flanqueados por uma sequência

codificadora de transposase que é um elemento genético móvel que pode induzir à

transferência horizontal. Desta forma, os genes PirA e PirB podem ser potencialmente

disseminados através dos processos de transposição, conjugação e captação plasmídica. Sendo

assim, é possível que estirpes não patogênicas se tornem patogênicas (HAN et al., 2015; LEE

et al., 2015).

25

2.1.4 Rota de infecção de Vibrio spp. em camarão

As vibrioses em camarões são classificadas como infecções secundárias e

oportunistas, ocorrendo em todos os estágios de vida do animal (larval, pós-larval, juvenil e

adulta). O processo de infecção causada pelo gênero Vibrio em camarão pode ser cuticular,

entérico (intestinal) e sistêmico (envolvendo vários órgãos). Quando localizada, apresenta

lesões melanizadas na carapaça e/ou abcessos pontuais no hepatopâncreas. Os locais

comumente afetados pelos víbrios incluem o órgão linfóide, hepatopâncreas, coração,

glândula antenal, tecido conectivo dermal, músculo esquelético e cordão nervoso (NUNES e

MARTINS, 2002) (Figura 1).

Figura 1: Representação esquemática do sistema digestório de camarão peneídeo.

Fonte: Fao (2001).

Em pós-larvas de camarão, o V. harveyi provoca destruição em massa do sistema

digestório, especialmente no hepatopâncreas e intestino anterior (SOONTHORNCHAI et al.,

2010). Opacidade do corpo, necrose e letargia foram sintomas observados em larvas e pós-

larvas de L. vannamei infectadas por V. harveyi, V. parahaemolyticus, e V. penaeicida

(AGUIRRE-GUZMÁN, VÁSQUEZ-JUAREZ e ASCENCIO, 2001).

Burgents et al. (2005) experimentaram um processo de infecção por V. campbelli

em pós-larvas de camarão L. vannamei observando invasão deste patógeno em brânquias,

hepatopâncreas, órgão linfóide, coração e hemolinfa. Pesquisadores no entanto alertam que

estudos sobre as rotas de infecção por bactérias do gênero Vibrio em camarões são

influenciados pelos protocolos, estirpes bacterianas empregadas e dose infectante

hepatopâncreas estômago

olho intestino médio

intestino posterior coração

segmento abdominal

ânus

pleópodos pereópodos

esôfago

antena

26

(SAULNIER et al., 2000; BURGENTS et al., 2005; AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010;

VINOJ, VASEEHARAN e BRENNAN, 2014) (Quadro 2).

Quadro 2: Investigações realizadas sobre as rotas de invasão de estirpes bacterianas do gênero Vibrio em

camarão cultivado.

Bactéria Crustáceo Protocolo de infecção Locais de infecção Referência

V. anguillarum P. monodon Injeção Hemolinfa, órgão linfóide VAN DE BRAAK

et al., 2002

V. campbelli L. vannamei Injeção

(104 UFC/mL)

Hemolinfa, órgão

linfóide, coração,

brânquias, hepatopâncreas

BURGENTS et

al., 2005

V. campbelli L. vannamei Injeção

(104 UFC/mL)

Coração, órgão linfóide,

hepatopâncreas, músculo,

brânquias

BURGE et al.,

2007

V. anguillarum F. chinensis Injeção

(107 UFC/mL) Órgão linfoide

YANG et al.,

2008

V. alginolyticus L. vannamei Injeção

(105 UFC/mL) Hemolinfa

LI, YEH e CHEN,

2008

V. parahaemolyticus L. vannamei Imersão

(106 UFC/mL)

Brânquias,

hepatopâncreas

AGUIRRE-

GUZMAN et al.,

2010

V. parahaemolyticus F. indicus Imersão

(103 a 108UFC/mL)

Músculo, brânquias,

intestino, hemolinfa

VINOJ,

VASEEHARAN

e BRENNAN

et al., 2014

V. furnissi P. monodon Injeção

(105UFC/mL) Hemolinfa

SUBRAMANIAN

et al., 2014

V. parahaemolyticus L. vannamei Imersão

(106 UFC/mL) Órgãos e tecidos

PEÑA-

NAVARRO e

VARELA-

MEJÍAS, 2015

V. harveyi Black Tiger

Shrimp

Imersão

(106 UFC/mL) Intestino

RUNGRASSAM

EE et al., 2016

Fonte: elaborada pela autora.

Foram testadas as possíveis rotas de infecção de V. parahaemolyticus em espécies

distintas de camarão, L. vannamei e Fenneropenaeus indicus, respectivamente. O protocolo

de infecção utilizado nestes testes foi o de imersão dos animais ao inóculo bacteriano. Sendo

observadas respostas diferentes no que se refere ao processo infeccioso e resposta

imunológica (AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010; VINOJ, VASEEHARAN e BRENNAN

2014).

No trabalho apresentado por Aguirre-Guzmán et al. (2010) foi detectada a

presença de V. parahaemolyticus após 30min. de infecção seguida de um decréscimo até o

desaparecimento, sugerindo que existe algum mecanismo que inibiu o processo infeccioso até

a eliminação da bactéria. O mesmo comportamento não foi notado por Vinoj, Vaseeharan e

Brennan (2014) em camarões F. indicus imersos em água contendo inóculo de V.

parahaemolyticus. Neste as contagens do patógeno e dos tecidos infectados mostraram-se

crescentes ao longo do experimento.

27

A resposta imunológica do camarão frente à patologia ocasionada por víbrios

pode também variar de acordo com o estágio de vida do animal. Em estudo realizado por

Soonthornchai et al. (2010) ao infectar por imersão pós-larvas e juvenis de Penaeus monodon

com V. harveyi, observaram a mortalidade das pós-larvas em dois dias de experimento em

contraste com a sobrevivência dos juvenis a altas doses da bactéria.

Estudos sobre as rotas de infecção podem se beneficiar pelo emprego de novas

tecnologias e protocolos, incluindo bactérias marcadas geneticamente com proteína verde

fluorescente, microscopia eletrônica de transmissão, hibridização in situ dentre outras

(AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010).

2.2 Transformação e manipulação bacteriana

Plasmídios são definidos como sendo moléculas de DNA extracromossômicas

encontradas em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (ACTIS, TOMALSKY e CROSA,

1999). Uma característica essencial dos plasmídios bacterianos é a sua capacidade de replicar

como elemento genético autônomo de uma forma controlada dentro do hospedeiro

(SUMMERTON, ATKINS e BESTWICK, 1983; DEL SOLAR et al., 1998). Sua estabilidade

pode ser alterada quando ocorrem rupturas nas ligações fosfodiéster, convertendo o DNA

super-enrolado nas formas circular aberta e linear (MIDDAUGH et al., 1998; LATULIPPE e

ZYDNEY, 2009). E dentre estas, a isoforma super-enrolada apresenta mais alta eficiência de

transfecção (LATULIPPE e ZYDNEY, 2009).

Esses genes podem se propagar por meio da transferência conjugativa que é um

processo importante, não só porque é um mecanismo crucial de propagação de alguns

plasmídios, mas também para espalhar genes que desempenham um papel na infecção e

resistência a antibióticos (WEGRZYN, 2005).

Os plasmídios possuem muitas propriedades úteis como vetores de clonagem

incluindo: (1) seu pequeno tamanho, o que facilita o isolamento e a manipulação do DNA; (2)

origem independente de replicação; (3) múltiplas cópias, de modo que estão presentes em

várias cópias na célula, propiciando tanto rendimento elevado de DNA, quanto expressão dos

genes clonáveis em altos níveis; (4) presença de marcadores selecionáveis, como genes de

resistência a antibióticos, que facilitam a detecção e seleção de clones plasmidiais

(MADIGAN et al., 2010). Podem ser veículo para introdução de novos genes em células,

existindo vetores plasmidiais comerciais disponíveis que podem ser usados para transportar

um gene desejado para um organismo hospedeiro (BAHERI, HILL e ROESLER, 2001).

28

A tecnologia do DNA recombinante permite que um fragmento de DNA de

interesse, conhecido como inserto, seja ligada a outra molécula de DNA chamada vetor e esta

molécula de DNA recombinante pode ser introduzida em uma célula hospedeira compatível

num processo chamado de transformação. Neste procedimento, a célula hospedeira que

recebeu o DNA recombinante recebe o nome de transformante ou célula transformada

(NASCIMENTO et al., 2003). A maioria dos vetores plasmidiais contém pouco mais do que

as sequências de nucleótideos essenciais necessárias para a sua utilização em clonagem de

DNA: uma origem de replicação (ORI), um gene de resistência à antibiótico, e uma região na

qual o fragmento de DNA exógeno pode ser inserido (Figura 2) (LODISH et al., 2000).

Figura 2: Diagrama simples de um vetor de clonagem.

Fonte: LODISH, et al., 2000.

Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser

introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de

transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o

número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela

aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídio, ou seja, capacidade de crescer em meios

contendo antibiótico (NASCIMENTO et al., 2003).

2.2.1 Proteína verde fluorescente

A bioluminescência é um fenômeno natural no qual a luz visível é gerada por um

organismo em resposta a uma reação química (KENDALL e BADMINTON, 1998). A

proteína verde fluorescente (GFP) é uma proteína espontaneamente fluorescente formada por

Região na qual o DNA pode ser

inserido Vetor de

clonagem

plasmidial

29

238 aminoácidos (27kDa) derivados do cnidário do Pacífico, Aequoria victoria (PRASHER,

1995). A GFP na forma selvagem tem como característica a produção de uma luz verde

brilhante fluorescente quando estimulada com a luz ultravioleta (UV). Sua fluorescência é

muito estável, o que confere uma grande vantagem para sua observação (WARD, 2005;

CHALFIE et al., 1994).

Além da GFP, foram isoladas proteínas homólogas a partir de recifes de coral não

luminescentes que podem ser utilizadas como marcadores de organismos in vivo. O fluoróforo

obtido do recife de coral Zoanthus sp. (ZsGreen) é formado por 231 aminoácidos (26,1KDa)

emite fluorescência verde com espectros de excitação de 496nm e emissão em 506nm (MATZ

et al., 1999).

A proteína verde ZsGreen possui elevada sensibilidade (relação sinal/ruído),

permitindo uma fácil observação do brilho fluorescente por meio da microscopia de

fluorescência (NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013). Em comparação com a GFP oriunda

da A. victoria, a proteína ZsGreen apresenta melhor estabilidade e maior intensidade luminosa

(NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013; KAISHIMA et al., 2016).

As técnicas fluorescentes possuem diversas utilidades científicas, sendo

adequadas para estudar mecanismos patogênicos, tais como, Doença de Parkinson e processos

cancerígenos in vivo através do uso de células mamárias e de pequenos peixes como modelos

animais (VLASHI et al., 2009; MATSUI, GAVINIO e TAKAHASHI, 2012). Há ainda a

possibilidade de uso de células fúngicas, bacterianas e vírus como biossensores de patógenos.

(NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013; VLASHI et al., 2009; PANTELI et al., 2015). A

expressão da proteína verde fluorescente é altamente adequada para monitorar bactérias vivas

dentro de ambientes complexos e podem ser convenientemente analisadas dentro de amostras

fracionadas. Localização bacteriana, associação e processos de multiplicação podem ser

monitorados através da fluorescência. Desse modo o uso de marcadores fluorescentes facilita

a visualização não somente da localização de cada uma das bactérias em ambientes

complexos, mas também auxilia na análise da regulação gênica nesses ambientes (CHALFIE

e KAIN, 2005).

30

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Seleção das estirpes

Foram selecionadas cinco cepas de V. parahaemolyticus pertencentes ao acervo

microbiológico do Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado

(LAMAP/LABOMAR-UFC). Essas estirpes foram isoladas de ambiente de carcinicultura no

Estado do Ceará, Brasil e fazem parte do projeto de pós-doutorado desenvolvido pela

pesquisadora Dra. Francisca Gleire Rodrigues de Menezes intitulado “Monitoramento de

resistência a substâncias antimicrobianas em áreas costeiras com concentração em cultivos de

camarão L. vannamei”.

Alguns critérios foram obedecidos para eleição dos isolados, tais como: origem do

isolado, identificação fenotípica e genotípica para V. parahaemolyticus, positividade para

detecção dos fatores de virulência (gelatinase, caseinase, fosfolipase, lípase e β-hemólise) e

sensibilidade à canamicina.

3.1.1 Identificação bioquímica e fatores de virulência

As cepas utilizadas foram identificadas previamente de acordo com Noguerola e

Blanch (2008) e apresentaram o seguinte perfil fenotípico com respostas positivas para as

provas: descarboxilação da lisina e ornitina, crescimento a 3, 6 e 8% de NaCl, crescimento a

20, 30, 35 e 40ºC, citrato, gelatinase, indol, NO2, oxidase, L-arabinose, arabinose, manitol,

ampicilina 10µg, O129/10µg; e respostas negativas para as provas: arginina, crescimento a

0% de NaCl, crescimento a 4 e 10ºC, arginina, hidrólise da esculina, gás, luminescência,

ONPG, Voges-Proskauer, decomposição da xantina, lactose, inositol, melibiose, ramnose,

salicina, sorbitol, sacarose e O129/150µg. Os fatores de virulência foram testados para os

isolados confirmados como pertencentes ao gênero Vibrio spp. de acordo com Austin et al.

(2005) e Liuxy, Lee e Chen (1996) (Quadro 3).

Quadro 3: Características dos isolados identificados bioquimicamente como V. parahaemolyticus.

Cepa Origem Provas de virulência

(+)

52 Água (CD) GEL; CAS; FOS; β

53 Água (CD) GEL; CAS; FOS; LIP

106 Hepatopâncreas GEL; CAS; FOS; LIP; β

194 Hemolinfa GEL; CAS; FOS; β

195 Hemolinfa GEL; CAS; FOS; β

CD = canal de drenagem de viveiro de camarão; GEL = Gelatinase; CAS = Caseinase; FOS = Fosfolipase; LIP =

Lipase; β = Beta-hemólise. Fonte: Acervo LAMAP.

31

As identificações bioquímicas foram ser confirmadas por meios moleculares com

a finalidade de evitar resultados falso-positivos (CROCI et al., 2007).

3.1.2 Caracterização genotípica dos isolados de V. parahaemolyticus

3.1.2.1 Extração do DNA

As estirpes bacterianas previamente identificadas por métodos bioquímicos como

sendo V. parahaemolyticus foram testadas com o gene tl (hemolisina termolábil), específico

para a espécie. A extração do DNA Total foi efetuada utilizando-se o kit de extração Wizard®

Genomic DNA Purification Kit (Ref.: A1125 - Promega). O DNA, produto da extração, foi

estocado em refrigerador com temperatura de aproximadamente 10ºC.

3.1.2.2 Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as estirpes de V.

parahaemolyticus

No processo de amplificação foi utilizada como controle positivo, uma estirpe de

referência: V. parahaemolyticus cedida pelo Instituto Oswaldo Cruz-RJ (IOC 18950). Para

confirmar geneticamente as espécies de V. parahaemolyticus foi utilizado o gene tl com

sequência dos iniciadores Forward: 5‟-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3‟ e

Reverse: 5‟-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3‟. As ciclagens foram efetuadas em

Termociclador (Amplitherm) nas condições indicadas no Quadro 4:

Quadro 4: Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer tl.

Etapas Temperatura/Tempo

Desnaturação inicial 94ºC/3 minutos

Desnaturação (30 ciclos) 94ºC/1 minuto

Anelamento 58ºC/1 minuto

Extensão 72ºC/1 minuto

Extensão final 72ºC/5 minutos

Fonte: BEJ et al., 1999.

3.1.2.3 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene tl

Os produtos da PCR foram aplicados em gel de agarose 1% preparado com

tampão Tris-Borato-EDTA 1X (TBE 1X) e a corrida eletroforética realizada em 120 volts (V)

32

em tampão TBE. A cada cavidade do gel foram aplicados 5µL da amostra acrescida de 1µL de

Gel Red (Invitrogen) e 2µL de Blue Juice (Invitrogen). O padrão molecular 1Kb plus DNA

Ladder foi usado como referência dos geis para identificação das bandas. Os geis foram

analisados em equipamento de fotodocumentação (Kodak EDAS290).

3.1.3 Perfil de sensibilidade à canamicina

3.1.3.1 Antibiograma

A sonda plasmidial ZsGreen1-Dr possui característica de resistência a canamicina

(CAN) como marca seletiva. O antibiograma foi realizado pela técnica da difusão em ágar

(NCCLS, 2003).

Ao ágar Mueller Hinton 1% NaCl (MH1%) foi acrescido o antibiótico CAN na

concentração de 30µg/mL. O controle positivo foi realizado com inoculação em ágar MH1%

sem adição do antibiótico. A partir da cepa de V. parahaemolyticus crescida em Triptona Soja

Ágar 1% NaCl (TSA1%) foi ajustado o inóculo bacteriano de acordo com a Escala de

McFarland 0,5 (2x108UFC/mL). Alíquotas de 200µL foram transferidas para duas placas de

Petri. Em seguida, foram vertidos 15mL de ágar MH1% + CAN e ágar MH1%,

respectivamente. Os inóculos foram homogeneizados com movimentos circulares. As placas

foram mantidas em repouso sobre a bancada até a solidificação do meio. Após solidificação as

placas foram incubadas invertidas em estufa bacteriológica a 28ºC/24h. A ausência de

crescimento bacteriano nas placas de Petri contendo Ágar MH1% + CAN indica a

sensibilidade ao antimicrobiano testado.

3.2 Vetor plasmidial

O plasmídio ZsGreen1-Dr foi obtido junto ao Laboratório de Biologia Molecular

do Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal do Rio Grande –

FURG. Possui origem de replicação SV40 e um cassete que confere resistência a

neomicina/canamicina (Figura 3).

33

Figura 3: Ilustração esquemática do plasmídio Psonda-ZsGreen1-Dr.

Fonte: Laboratório de Biologia Molecular - FURG

3.2.1 Integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr

A integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr foi verificada pela corrida em gel de

agarose. O plasmídio foi diluído em solução TE nas proporções de 1:1 e 1:2. Os produtos

foram aplicados em gel de agarose 3% preparado com tampão TBE 1X e a corrida

eletroforética realizada em 120 V em tampão TBE. A cada cavidade do gel foram aplicados

5µL da amostra acrescida de 1µL de Gel Red (Invitrogen) e 2µL de Blue Juice (Invitrogen). O

padrão molecular 1Kb plus (DNA Ladder) foi usado como referência do gel para identificação

das bandas. O gel foi analisado em equipamento de fotodocumentação (Kodak EDAS290).

pSonda – ZsGreen1-Dr (2 sequências)

4.311pb

HSV/TK/polyA/sinais

Resistência

CAN

34

3.3 Adaptação do protocolo de transformação do V. parahaemolyticus

Com base nas confirmações fenotípica para gênero, genotípica para espécie e

respostas aos testes de virulência foram selecionadas as estirpes de Vibrio sp. (195) e V.

parahaemolyticus (106) utilizadas nos testes de otimização do processo de transformação

celular. Como controle positivo foi utilizado uma cepa de E. coli competente (V517).

O processo de transformação celular compreendeu duas etapas distintas: a

competência celular e a transformação celular.

3.3.1 Competência celular

Para estabelecer a competência bacteriana foi utilizado o método químico com

Cloreto de Cálcio descrito por Panda, Dasgupta e Das (1991).

A estirpe de V. parahaemolyticus foi crescida em 1mL de caldo Luria Bertani 1%

de NaCl (LB1%) sob agitação de 150 RPM a 37ºC overnight. Em seguida foram adicionados

50mL de caldo LB1% que foram incubados sob agitação (150 RPM/37ºC) para o crescimento

da cultura até a fase exponencial. Leituras de absorbância foram realizadas em

espectrofotômetro (Thermo) em intervalos de 30 minutos a partir do instante T=0 até que o

crescimento celular atingisse o valor de 3,4 x 108 UFC/mL (OD550 = 0,3). A partir do

crescimento em caldo LB1%, foram distribuídos 20mL em dois tubos tipo falcon estéreis para

centrifugação (10.000 x g/3min.). O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em

15mL de 10mM Tris HCl pH 7,6/10mM MgCl2 e incubado em temperatura ambiente por

20min. Essa etapa foi realizada com o intuito de estimular a secreção de Dnase das células,

que impede a transformação celular.

Logo após nova centrifugação (10.000 x g/3min.), o sobrenadante foi descartado e

o pellet ressuspenso em 10mL de solução de 10mM Tris HCl/25mM CaCl2 seguida da

incubação por 15min em temperatura ambiente. Procedeu-se nova centrifugação (10.000 x

g/3min.) e descarte do sobrenadante para prosseguir com lavagens sucessivas do pellet com

10mL de solução de 10mM Tris HCl/25mM CaCl2 e 10mL de 10mM Tris HCl/50mM CaCl2 a

0ºC. Por fim, o pellet foi ressuspenso em 1mL de 10mM Tris HCl/50mM CaCl2. Alíquotas de

200µL foram distribuídas em criotubos que foram adicionados de glicerol na proporção de 1:1

para conservação das amostras em temperatura de congelamento.

A Figura 4 apresenta a representação esquemática do processo de competência

celular.

35

Figura 4: Fluxograma do processo de competência celular para estirpes do gênero Vibrio de acordo com Panda

(1991).

Fonte: Elaborada pela autora.

3.3.2 Transformação celular

Em 200µL da suspensão com células competentes foram adicionados 10µL do

plasmídio ZsGreen1-Dr, sendo incubado em um banho de gelo a 0ºC por 30min. Em seguida

as células foram submetidas a choque térmico em banho-maria a 37ºC/2min. O processo que

compreende o banho de gelo e o choque térmico foi repetido. Logo após o choque térmico,

0,8mL de caldo LB1% foram adicionados à mistura anterior e posteriormente incubados a

37ºC/1h. A Figura 5 apresenta o fluxograma do processo de transformação celular.

Figura 5: Fluxograma do processo de transformação bacteriana.


36

3.3.3 Seleção das células transformadas

O sucesso da transformação celular é caracterizado pela expressão do gene pela

célula manipulada. O vetor utilizado neste experimento (ZsGreen1-Dr) carreia a resistência a

canamicina como marca seletiva. Sua fluorescência verde é expressa quando exposta a um

espectro de luz de excitação e emissão máxima de 496nm e 506nm, respectivamente (MATZ

et al., 1999).

Foram testados diferentes protocolos para seleção/detecção das colônias

transformadas: aplicação de comprimento de onda luminosa no espectro do ultravioleta

(365nm) e detecção de expressão de resistência a antibiótico. Foram realizados testes (Figura

6) para identificar as células transformadas utilizando-se meio de cultura não seletivo sólido

(Ágar LB1%) acrescido do antibiótico (canamicina) que corresponde a marca seletiva do

plasmídio e um aminoácido (L-arabinose) indutor de fluorescência.

Teste 1:

O plasmídio ZsGreen1-Dr é marcado com o gene de resistência à canamicina. A

partir do criotubo com V. parahaemolyticus transformado foram plaqueados 100µL na

superfície de placas de Petri contendo Ágar LB1% acrescido de canamicina na concentração

de 30µg/mL, e Ágar LB1% sem adição de antimicrobiano. As placas foram incubadas em

estufa bacteriológica a 37ºC/48h. Após o período de incubação foi observado o crescimento

de colônias nas placas de ágar LB1% com e sem adição de canamicina. As placas foram

expostas à luz ultravioleta (UV – λ=365nm) por 5seg. para verificação da presença ou

ausência de fluorescência das colônias. As colônias a serem selecionadas devem apresentar

resistência à canamicina e fluorescência após exposição à luz UV.

Teste 2:

A expressão da proteína fluorescente do plasmídio ZsGreen1-Dr foi induzida com

a adição de 0,2% p/v de L-arabinose. As cepas transformadas foram crescidas em caldo LB

suplementado com 0,2% de L-arabinose, 10µg de canamicina e 1% de NaCl sob agitação a

37ºC por um período de 48h. Após 10h, 24h e 48h de incubação procedeu-se o plaqueamento

em superfície com auxílio de swab estéril em placas de Petri contendo Ágar Marine

suplementado com 0,2% (p/v) e 2% (p/v) de L-arabinose, respectivamente. As placas foram

37

incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC/24h. Posteriormente ao período de incubação as

placas foram expostas a luz UV (λ=365nm) por 5seg. para visualização da fluorescência.

Teste 3:

Como controle do procedimento de transformação foi utilizada uma cepa de

Escherichia coli competente (V517). A partir dos criotubos com V. parahaemolyticus e E. coli

V517 transformadas foram adicionados 0,8mL de caldo LB1% e LB sem adição de NaCl

acrescido de 0,2% de L-arabinose, respectivamente. Os criotubos foram incubados em banho-

maria a 37ºC/1h. Em seguida foram plaqueados 100µL na superfície de placas de Petri

contendo Ágar LB1% e LB sem adição de NaCl, respectivamente, ambos acrescidos de

canamicina nas concentrações de 0µg, 3µg e 30µg. As placas foram incubadas em estufa

bacteriológica a 37ºC/48h. Após o término do período de incubação foram observados os

crescimentos de colônias na superfície do ágar e as placas foram expostas à luz UV

(λ=365nm) por 5seg. para observação da fluorescência.

Figura 6: Fluxograma dos testes para expressão da fluorescência das colônias transformadas.


38

3.3.4 Confirmação da transferência plasmidial por PCR

3.3.4.1 Extração do DNA Plasmidial

A presença do plasmídio ZsGreen1-Dr na estirpe de V. parahaemolyticus (106

e106T) e na estirpe de E. coli (V517) foi verificada através da extração plasmidial realizada

com o kit de extração Pure Yield Plasmid Miniprep System (Ref.: A1222 - Promega). Em

seguida, os produtos da extração foram analisados pela corrida eletroforética em gel de

agarose (3%). O produto da extração foi estocado em refrigerador com temperatura de

aproximadamente 10ºC.

3.3.4.2 Extração do DNA Total

A eficiência para detectar o gene plasmidial ZsGreen no produto de extração do

DNA Total das cepas bacterianas transformadas com o vetor plasmidial ZsGreen1-Dr foi

testada. A extração do DNA Total dos isolados foi efetuada utilizando-se o kit de extração

Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Ref.: A1125 - Promega). Em seguida, os produtos

da extração foram analisados pela corrida eletroforética em gel de agarose (3%). O DNA,

produto da extração, foi estocado em refrigerador com temperatura entre 2 a 8ºC.

3.3.4.3 Amplificação por PCR para as estirpes de V. parahaemolyticus transformadas

A PCR do DNA Plasmidial e Total foi realizada com a enzima Taq DNA

polimerase. As concentrações e volumes dos reagentes utilizados na amplificação estão

expostos no Quadro 5.

Quadro 5: Concentrações dos reagentes utilizados na amplificação do DNA.

Reagentes Concentração inicial

(mol)

H2O ultra-pura 10,4

Tampão 5X 1,0

MgCl2 0,2

dNTP 0,1

ZsGreen F 0,1

ZsGreen R 0,1

Taq Polimerase 0,1

DNA molde 0,5


39

Os primers utilizados para identificação da proteína verde fluorescente foram:

ZsGreen Forward 5‟-ACCGGTCGGTACCGGCTCAGTC-3‟ e ZsGreen Reverse: ZsGreen 5‟-

AGTCGCGGTACCTCAGGGCAATG-3‟ (HEDDLE e MAZALEYRAT, 2007).

As ciclagens foram efetuadas em Termociclador (Amplitherm) nas condições

indicadas no Quadro 6:

Quadro 6: Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer ZsGreen.

Etapa Temperatura/Tempo

Desnaturação inicial 94ºC/5minutos

Desnaturação (30 ciclos) 94ºC/1minuto

Anelamento 56ºC/1minuto

Extensão 72ºC/1,5minutos

Extensão final 72ºC/7minutos

Fonte: SUSIC, BOHANEC e MUROVEC, 2014.

3.3.4.4 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene ZsGreen

Os produtos de PCR foram aplicados em gel de agarose 1% preparado com

tampão TBE 1X e a corrida eletroforética realizada em 120 V em tampão TBE. A cada

cavidade do gel foram aplicados 5µL da amostra acrescida de 1µL de Gel Red (Invitrogen) e

2µL de Blue Juice (Invitrogen). O padrão molecular 1Kb plus (DNA Ladder) foi usado como

referência dos géis para identificação das bandas. Os géis foram analisados em equipamento

de fotodocumentação (Kodak EDAS290).

3.3.5 Avaliação da fluorescência por microscopia ótica confocal

A partir das culturas de V. parahaemolyticus (106 e 106T) e E. coli (V517 e

V517T) crescidas em ágar TSA 1% NaCl e sem adição de NaCl (24h/37ºC) com o auxílio de

uma alça bacteriológica foram preparados esfregaços bacterianos para observação em

microscopia confocal. As lâminas foram preparadas em duplicata, sem e com adição de

corante laranja de acridina.

Para a coloração com laranja de acridina utilizou-se a técnica descrita pelo

fabricante (BD, 2004): os esfregaços das amostras foram preparados em lâminas de vidro e

secas ao ar. Em seguida os esfregaços foram fixados com metanol durante 2 minutos. O

excesso do metanol foi escorrido e as lâminas colocadas para secar ao ar. As lâminas foram,

então, mergulhadas em solução aquosa de laranja de acridina 4% durante 2 minutos e lavadas

40

com água destilada e secar ao ar. Uma gota de óleo mineral 1:1 foi colocada sobre os

esfregaços corados com laranja de acridina e sem adição de corantes e sobre cada lâmina foi

colocada uma lamínula e as bordas foram seladas com esmalte incolor. As lâminas foram

observadas em microscópio confocal modelo LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento

de onda de excitação 400nm e emissão 500nm.

3.3.5.1 Redução da fluorescência induzida pelo meio de cultura e autofluorescência.

Para este procedimento foi utilizado o meio de cultura Yest Nitrogen Base (YNB)

que possui característica de baixa indução de fluorescência celular de acordo com Bhatta,

Goldys e Learmonth (2006). Foram utilizadas neste protocolo uma cepa padrão de E coli

(ATCC 25922) e duas estirpes de V. parahaemolyticus (106 e 106T). As cepas crescidas em

ágar TSA foram repicadas para caldo LB para crescimento em overnight sob agitação 150 x

g/37ºC. A partir deste crescimento, alíquotas foram transferidas para o meio YNB até

obtenção da densidade ótica 0,1. A leitura da densidade ótica das culturas foi verificada em

espectrofotômetro (Thermo) a um comprimento de onda de 600nm. Uma alíquota de 1mL foi

transferida para um tubo de microcentrífuga e procedeu-se a centrifugação nas condições de

2.400 x g/8min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 1mL de água

destilada estéril. A centrifugação e lavagens com água destilada foram repetidas por três vezes

e o pellet ressuspenso em 1mL de água destilada estéril. Em seguida foram preparados

esfregaços em lâminas de vidro. Uma gota da suspensão celular foi colocada no centro da

lâmina de vidro. Após a secagem em bico de Bunsen, uma gota de glicerol (1:1) foi

depositada sobre o esfregaço que foi coberta com uma lamínula. As lâminas foram observadas

em microscópio confocal, modelo LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento de onda de

excitação 400nm e emissão 500nm. A fotossensibilização foi testada pela excitação com laser

a 488nm, com bleaching a cada 5seg. (Figura 7).

Figura 7: Fluxograma do protocolo de lavagens celulares utilizando meio de cultura com baixa indução de

fluorescência.

Elaborada pela autora

Esfregaço em lâmina de vidro coberto com

lamínula

Microscópio Confocal

Condições do bleaching: Laser 488nm a cada 5seg.

Caldo LB

overnight

150RPM/37ºC

Caldo YNB OD = 0,1 a 600nm

Lavagens com água destilada

2.400RPM/8min

3 vezes

41

3.4 Teste desafio

3.4.1 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente

Os procedimentos de infecção e patogenicidade foram conduzidos em área restrita

na unidade de bioensaio do Centro de Estudos em Aquicultura Costeira –

CEAC/LABOMAR/UFC. Camarões juvenis (n=20), L. vannamei, (9,7g±0,5) obtidos do

Laboratório de Nutrição de Organismos Aquáticos - CEAC/LABOMAR/UFC, foram

aclimatados por 15 dias em tanque circular (500L) com aeração e água do mar filtrada. Os

animais foram alimentados com ração comercial duas vezes ao dia (manhã e tarde) durante

todo o período do bioensaio. Nos períodos da manhã e tarde, foram ofertadas 5 e 10g de ração

(35% proteína bruta), respectivamente, sendo lançadas diretamente nos tanques.

Em um aquário de vidro contendo 38L de água do mar filtrada e com aeração,

foram adicionados 2L de inóculo do V. parahaemolyticus 106T de forma que a concentração

bacteriana final fosse 107 UFC/mL. Em seguida 50 animais foram depositados no aquário

permanecendo pelo período de 2h. Após a exposição, os camarões foram lavados com água do

mar filtrada e colocados em tanque circular com 500L de água do mar filtrada. Foi utilizado

um controle negativo com 50 camarões juvenis que permaneceram por 2h imersos em 40L de

água do mar sem exposição ao inóculo bacteriano. Logo após a infecção por imersão (T = 0h),

cinco (05) animais dos tanques experimental e controle negativo foram coletados e

transportados para o Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado –

LAMAP/LABOMAR/UFC, para processamento e execução das análises laboratoriais. As

coletas se repetiram nos tempos 24, 48 e 72h (Figura 8).

Figura 8: Fluxograma do teste desafio com V. parahaemolyticus 106T e camarões L vannamei.


5 animais

T= 0, 24, 48 e 72h 5 animais

T= 0, 24, 48 e 72h

V. ph 106T

107

UFC/mL

Tratamento

Período de imersão: 2h

Controle negativo

Período de imersão: 2h

Lavagem com água do mar

42

Ao final do experimento, a água do mar utilizada nos aquários e tanques foram

descontaminadas com hipoclorito de sódio 10ppm por um período de 24h. e os camarões não

utilizados foram abatidos por imersão em banho de gelo e destruídos por incineração.

3.4.1.2 Sinais patológicos externos dos animais

Durante os períodos de aclimatação (15 dias) e de experimento (4 dias), os

animais foram acompanhados para observação de sinais patológicos externos de acordo com

Manilal et al. (2010): necrose e/ou pontos pretos na carapaça, necrose nas patas, anorexia,

letargia e mortalidade. As observações dos sinais patológicos externos foram realizadas pelo

método focal nos dez minutos anteriores e dez minutos posteriores ao arraçoamento no

período da manhã (8h) (ALTMANN, 1974).

3.4.2 Processamento das amostras

Cada amostra foi composta por 05 camarões retirados do tanque experimental e

05 do tanque controle negativo. Os animais foram inicialmente insensibilizados em água

gelada e em seguida sacrificados individualmente por imersão em banho de gelo.

3.4.2.1 Coleta da hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas

A carapaça do camarão foi desinfetada com álcool 70% e foi aspirada 0,1mL da

hemolinfa de cada animal com uma seringa para insulina (BD ultra-fine 30U) por meio de

uma punção ventral direta entre o último esternito cefalotorácico e o primeiro abdominal

(LIGHTNER, 1996). Como anticoagulante utilizou-se uma solução de citrato de sódio 10%

(p/v) na proporção de 1:1 (BARRETO et al., 2012). Em seguida, os animais foram dissecados

para retirada do intestino e hepatopâncreas.

O conteúdo intestinal teve sua saída forçada pela utilização de uma espátula

esterelizada. Foram seccionados e descartados fragmentos (± 0,5cm) da parte anterior

(próxima ao hapatopâncreas) e posterior (próxima ao ânus). O fragmento correspondente ao

intestino médio foi dividido em duas partes iguais para as análises. O hepatopâncreas foi

dividido em duas partes por meio de corte longitudinal. Um fragmento de cada tecido foi

destinado à análise microbiológica e a outra metade foi utilizada para análise microscópica.

43

3.4.3 Análises Microbiológicas

Para as análises microbiológicas, as amostras foram reunidas em “pools” para

animais dos tanques experimental e controle, respectivamente. A hemolinfa foi

homogeneizada e os tecidos foram macerados e diluídos em 9mL de salina 1% NaCl, que

corresponde à diluição 10-1

, a partir desta foram preparadas diluições seriadas até 10-5

(TZUC

et al., 2014).

3.4.3.1 Contagens de Vibrio spp. e Vibrio resistentes à canamicina

A quantificação da população de Vibrio sp. e Vibrio parahaemolyticus 106T foi

realizada por meio da técnica “Spread Plate” (DOWNES; ITO, 2001). De cada diluição foi

tomada uma alíquota de 0,2mL que foi inoculada em duas placas contendo meio ágar

Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS) e TCBS com adição de 30µg de canamicina/mL. O

inóculo foi espalhado com o auxílio de uma alça de Drigalski e as placas foram incubadas a

30°C/18 horas. Ao final do período de incubação foram realizadas as contagens das placas

que apresentaram número de colônias entre 25 e 250 colônias e os resultados foram expressos

em UFC/g.

Os resultados das contagens bacterianas foram analisados pelo Teste de hipótese de

Mann-Whitney para verificar se há ou não diferença significativa para as contagens entre os

tecidos analisados

3.4.4 Análise por microscopia ótica confocal

A hemolinfa e os tecidos do intestino médio e hepatopâncreas foram observados a

fresco em microscópio confocal. Após o preparo, as amostras foram imediatamente

conduzidas à Central Analítica da Universidade Federal do Ceará – Campus do Pici. As

amostras foram analisadas em microscópio óptico confocal, modelo LSM 710 (Zeiss,

Alemanha) com comprimento de onda de excitação 400 e emissão 500nm.

Uma gota da hemolinfa foi colocada no centro de uma lâmina de vidro e coberta

com uma lamínula que foi selada com esmalte incolor.

O intestino médio dos animais coletados em cada amostra foi lavado com solução

salina fosfatada (PBS) para retirada de sujidades. Em seguida, os mesmos foram dispostos no

interior de lamínulas em câmara (Lab-Tek).

44

Para os hepatopâncreas, foram realizados cortes finos. Os fragmentos foram

lavados com solução PBS e dispostos no interior de lamínulas em câmara (Lab-Tek) (Figura

9).

Figura 9: Imagens do processamento das amostras do camarão Litopenaeus vannamei e disposição dos tecidos

no interior das lamínulas em câmara (Lab-Tek).

1: punção da hemolinfa; 2: hepatopâncreas; 3 retirada do intestino médio; 4: fragmentos dos hepatopâncreas

dispostos em lamínula em câmara (Lab-Tek); 5: fragmentos dos intestinos médio dispostos em lamínula em

câmara (Lab-Tek).

1

3 2

5 4

45

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Escolha dos isolados

Entre cinco isolados com características de V. parahaemolyticus apenas dois (02)

foram confirmados genotipicamente baseado na presença do gene tl. Durante a caracterização

fenotípica, alguns isolados presuntivos de V. parahaemolyticus podem demonstrar reações

atípicas na série de testes bioquímicos (DILEEP et al., 2003; CROCI et al., 2007; TERZI,

BÜYÜKTANIR, YURDUSEV 2009).

A Figura 10 apresenta o resultado da corrida eletroforética dos isolados

identificados bioquimicamente e analisados geneticamente com os primers tl para

confirmação da espécie como V. parahaemolyticus.

Figura 10: Perfil eletroforético da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de cinco cepas classificadas

fenotipicamente como V. parahaemolyticus com os primers do gene tl utilizado para detectar a espécie. Os

padrões P1 e P2 são, respectivamente, gene tl e V. parahaemolyticus IOC 18950.

M* - Marcador; B** - controle negativo (branco)

A hemolisina termolábil (tlh) é uma exotoxina que ataca e provoca a lise

incompleta na membrana dos eritrócitos com liberação da hemoglobina, possui ação de

fosfolipase A2/lisofosfolipase. Algumas hemolisinas como tdh e trh possuem papéis na

virulência bem esclarecidos, enquanto a ação virulenta da tlh ainda não está bem definida

(SHINODA et al., 1991; ZHANG eAUSTIN, 2005).

O gene tl vem sendo utilizado com eficiência para confirmar geneticamente os

isolados identificados bioquimicamente como sendo V. parahaemolyticus ratificando sua

M* 52 53 106 194 195 P1 P2 B**

12.000

2.000 1.650

1.000 850 650 500 400 300 200 100

5.000

46

especificidade para identificação deste patógeno (CHAKRABORTY, SURENDRAN e

JOSEPH, 2008; TERZI, BÜYÜKTANIR, YURDUSEV, 2009).

5.1.1 Sensibilidade à canamicina

Os resultados da confirmação molecular da espécie e a sensibilidade dos isolados

de V. parahaemolyticus ao antibiótico correspondente à marca seletiva do vetor plasmidial

ZsGreenl-Dr estão mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Resultado do antibiograma para verificação da sensibilidade das estirpes à canamicina.

Bactéria Identificação molecular

(gene tl)

Antibiograma

30µg/mL CAN

52 Vibrio sp. S

53 V. parahaemolyticus S 106 V. parahaemolyticus S 194 Vibrio sp. S 195 Vibrio sp. S

CAN = canamicina; S = sensível

Os cinco isolados pertencentes ao gênero Vibrio testados apresentaram

sensibilidade à canamicina na concentração de 30µg/mL. Esse antimicrobiano está

classificado no grupo dos aminoglicosídeos agindo sobre a síntese de proteína e destruindo a

membrana citoplasmática de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Sua utilização é

comum na clínica veterinária como agente antimicrobiano e também como promotor de

crescimento (HUGHES e HERITAGE, ALI e ULLAH, 2017). Na clínica humana seu uso é

recomendado pela Organização Mundial da Saúde no tratamento da tuberculose (ARBEX et

al., 2015).

A escolha da estirpe bacteriana a ser transformada foi baseada no critério de

sensibilidade ao antibiótico que corresponde à marca seletiva do vetor plasmidial. Após a

introdução do DNA plasmidial, a transformante passou a expressar o perfil de resistência

antimicrobiana contida no vetor.

O perfil de resistência ao antibiótico que confere a marca seletiva do vetor

plasmidial tem sido a técnica utilizada para verificar o sucesso da transformação bacteriana

(CHU e LU, 2008; POLLACKI-BERTI, WOLLENBERG e RUBY 2010; MANJUSHA e

SARITA, 2011).

47

Diluição 1:1

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

5.2 Vetor plasmidial

As diferentes isoformas do DNA plasmidial podem ser separadas por diferentes

métodos, incluindo a eletroforese em gel de agarose (LATULIPPE e ZYDNEY, 2011). A

Figura 11 indica a corrida eletroforética em gel de agarose (3%) do plasmídio ZsGreen1-Dr

diluído em diferentes concentrações para verificação da sua integridade.

Figura 11: Verificação a integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr diluído em diferentes concentrações.

Foi verificada a presença de três bandas em alturas diferentes em todas as

diluições do plasmídio. Os padrões de bandas apresentados indicam a presença do DNA

plasmidial nas formas: super-enrolada, circular aberta e linear. O DNA plasmidial é

naturalmente encontrado na isoforma super-enrolada, podendo ser quebrada por uma

variedade de processos químicos ou mecânicos resultando nas isoformas linear e circular

aberta (LATULIPPE e ZYDNEY, 2009).

A qualidade da solução estoque plasmidial pode ser verificada pela eletroforese

em gel de agarose. O contraste na intensidade do brilho das bandas apresentadas pode indicar

a presença em maior ou menor quantidade da isoforma plasmidial. A isoforma super-enrolada

é a de menor peso molecular, sendo a que migra mais no gel, seguida das formas linear e

circular aberta (LATULIPPE e ZYDNEY, 2010).

Circular aberto

Super enrolado

Linear

12.000

2.000 1.650

1.000

850

650

500

400

300

5.000

Diluição 1:2

M* 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 B**

M* - Marcador; B** - Controle negativo (branco)

48

5.3 Adaptação do protocolo para transformação do V. parahaemolyticus

5.3.1 Processo de transformação e competência celular

5.3.1.1 Seleção dos transformados

A seleção dos transformados se deu pela capacidade de resistência ao antibiótico

que corresponde à marca seletiva do plasmídio ZsGreen1-Dr.

Após a inoculação em ágar não seletivo acrescido de canamicina (30µg/mL) das

estirpes de Vibrio sp. (195T), V. parahaemolyticus (106T) e E. coli competente (V517T) as

colônias foram expostas à luz UV (λ=365nm), não sendo observada a expressão da

fluorescência nas colônias crescidas. Uma característica inerente aos diferentes tipos de

fluoróforos, é que a expressão da fluorescência se dá pela exposição a um determinado

espectro de luz de excitação. A proteína originada do coral Zoanthus sp. (ZsGreen) necessita

ser exposta a um comprimento de luz com excitação máxima de 493nm com emissão máxima

da fluorescência verde a 505nm (MATZ et al., 1999; NAKAMURA, ISHII, KONDO, 2013).

Experimentos com o propósito de transfecção do vetor pGFPuv para estirpes de

Aeromonas hydrophila foram realizados por Chu e Lu (2008). As células transformadas foram

confirmadas pelo crescimento das colônias em ágar contendo antibiótico e pela emissão da

fluorescência após exposição à luz UV (λ= 300nm). Colônias de V. parahaemolyticus

transformadas com GFP e resistência a canamicina, apresentaram fluorescência verde ao

serem observadas por microscopia ótica confocal (VINOJ, VASEEHARAN, BRENNAN,

2014). A seleção das supostas células transformadas pode ser realizada pela resistência ao

antibiótico que corresponde à marca seletiva do vetor plasmidial (POLLACKI-BERTI,

WOLLENBERG e RUBY 2010). Assim sendo, as colônias resistentes à canamicina foram

selecionadas e o sucesso da transfecção vetorial foi testado pela técnica da PCR com primer

específico para o gene ZsGreen.

5.3.1.2 Confirmação da transferência plasmidial por PCR

A extração do DNA Total e Plasmidial das estirpes Vibrio sp. (195T) e V.

parahaemolyticus (106T) permitiu a detectar a presença do vetor plasmial que carreia gene

para fluorescência (pZsGreen1-Dr). Na Figura 12 está representada a corrida eletroforética do

DNA Total e Plasmidial dos isolados de Vibrio sp (195T), V. parahaemolyticus (106 e 106T) e

49

E. coli (V517 e V517T) não transformados e transformados com o plasmídio ZsGreen1-Dr. O

par de primers para ZsGreen foi usado para amplificar a região onde se localiza o marcador de

fluorescência.

Figura 12: Eletroforese em gel de agarose do produto de PCR de DNA Total e Plasmidial de Vibrio sp. (195T),

V. parahaemolyticus (106; 106T) e E. coli (V517; V517T).

M* - marcador; B** - controle negativo (branco).

A presença do gene ZsGreen foi confirmada pela PCR de DNA total e plasmidial.

Observou-se no gel de agarose 3% a presença de bandas nas diferentes isoformas do

plasmídio. Em Soares et al. (2004) a presença de clones foi avaliada pela PCR das colônias e

PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para confirmação da presença do gene

introduzido.

5.3.1.3 Avaliação da fluorescência celular por microscopia ótica confocal

Esfregaços bacterianos foram observados em microscópio óptico confocal modelo

LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento de onda de emissão 400nm e excitação

500nm. Esperava-se que a expressão da fluorescência ocorresse apenas nas células

submetidas à transfecção do vetor plasmidial. Porém, células bacterianas do controle

negativo, não submetidas ao processo de transformação, apresentaram autofluorescência. Em

bactérias vivas, a autofluorescência pode ser provocada por uma variedade de biomoléculas

intracelulares e metabólitos que têm espectros de comprimento de onda de excitação e

emissão específicos (AMMOR, 2007; BAO et al., 2008). A autofluorescência verde intrínseca

da cultura de E. coli tem sido negligenciada há muito tempo e corrigida empiricamente em

experiências com proteína verde brilhante (GFP) (MIHALCESCU et al., 2015).

M* B** 106T 106 V517T V517 195T M* 106T V517T 195T B**

100

12.000

1.650 1.000

5.000

2.000

50

Na Figura 13 foi observada a fluorescência dos esfregaços bacterianos corados e

sem adição do corante laranja de acridina.

Figura 13: Fluorescência celular apresentada por células de V. parahaemolyticus (106; 106T)e E. coli (ECT)

corados com laranja de acridina (a) e sem adição de corantes (b).


A autofluorescência pode afetar a sensibilidade dos ensaios de fluorescência

microscópica ou de citometria de fluxo interferindo ou mesmo impedindo a detecção de

fluorescência específica de baixo nível (YANG et al., 2012). Para evitar/reduzir o fenômeno

da autofluorescência celular deve ser utilizado um meio de cultura minimamente definido,

reduzindo compostos autofluorescentes, a fim de maximizar o sinal repórter (YOUNG et al.,

2012). Knight e Billinton (2001) afirmam que a autofluorescência celular e/ou a

autofluorescência dos meios tendem a diminuir mais rapidamente do que a fluorescência da

GFP com a incidência prolongada da luz. Com base nestas afirmações, a autofluorescência

celular foi diferenciada da fluorescência do vetor plasmidial. A célula de E. coli

(ATCC25922), manteve a fluorescência inalterada. No entanto, para a célula transformada

106T, o sinal de fluorescência decaiu em 50% após 45 segundos do fotobranqueamento.

O presente experimento diferiu da afirmação de Knight e Billinton (2001) quando

o sinal do repórter ZsGreen1-Dr decaiu após a incidência prolongada da luz. No entanto, foi

51

comprovado que as proteínas fluorescentes derivadas da família Aequoria victoria apresentam

baixa fotoestabilidade (BARBIERI e DAMRON, 2016).

A autofluorescência apresentada pela E. coli (ATCC25922) pode ser explicada

pela presença das flavinas que são coenzimas essenciais ao metabolismo bacteriano e que

podem ser excitadas a 450-490nm emitindo fluorescência verde nos comprimentos de onda de

500 a 560nm (YANG et al., 2012; MIHALCESCU et al., 2015). Dentre os víbrios um fator

que diferencia as espécies são os regulons de saída, as estirpes V. harveyi e V. fisheri são

reconhecidas pela capacidade de emitir bioluminescência através de um complexo mecanismo

genético regulados pelos genes luxAB com pico de emissão a 490nm. Nas espécies

patogênicas Vibrio cholerae e V. parahaemolyticus foram encontrados mecanismos capazes de

estimular a luminescência tais como o V. harveyi (BASSLER, GRRENBERG e STEVENS,

1997; GODE-POTRATZ e McCARTER, 2011; YOSHIZAWA et al., 2012).

Os filtros de luz utilizados no microscópio óptico confocal para este experimento

foram determinados pela característica do fluoróforo que apresenta excitação e emissão

máximas de 400nm e 500nm, respectivamente, estando dentro da faixa que estimula a

autofluorescência da estirpe de E. coli (ATCC25922) e que barra a emissão da luminescência

do gênero Vibrio. Desta forma, por meio deste ensaio, a fluorescência emitida pela sonda foi

diferenciada da autofluorescência intrínseca pelo reconhecimento do fotobranqueamento das

células bacterianas testadas.

5.4 Teste desafio com V. parahaemolyticus fluorescente

5.4.1 Sinais patológicos externos

Durante os 15 dias de aclimatação não foram notadas mudanças comportamentais

e corporais externas nos animais, tais como, natação errática, letargia, anorexia, opacidade e

atrofia do hepatopâncreas, melanização, pontos brancos ou erupções na carapaça. No decorrer

do teste desafio, os sinais externos de patologia nos camarões permaneceram inalterados no

tanque controle negativo. Todavia, para o tanque experimental, foram notados sinais de

letargia nos camarões desafiados com a estirpe de V. parahaemolyticus (106T) a partir das 24h

de inoculação. O apetite permaneceu inalterado durante os períodos de aclimatação e controle,

não havendo sobras de ração nos tanques controle negativo e experimental. Não foi registrada

mortalidade dos camarões no decorrer do experimento, incluindo os períodos de aclimatação e

teste desafio.

52

A idade dos animais influencia na resposta imunológica frente a estirpes

bacterianas com potencial patogênico. Pós-larvas de camarão P. monnodom foram sensíveis à

exposição com V. harveyi na densidade de 107UFC/mL, apresentando mortalidade após dois

dias de infecção. Em contraste os animais juvenis que sobreviveram mesmo após exposição a

doses consideradas altas (107UFC/mL) do mesmo patógeno (SOONTHORNCHAI et al.,

2010). Pós-larvas de L. vannamei (0,5 – 2g), após serem inoculadas por imersão com uma

estirpe de V. parahaemolyticus isolada de camarões doentes com AHPND (108UFC/mL)

apresentaram sinais da doença após 18h e mortalidade em massa no 4º dia após a infecção

(TRAN et al., 2013). Em contrapartida, experimentos realizados com juvenis de camarões

(19,6±2,5g e 8,32±0,57g, respectivamente) demonstram a resistência à estirpes de bactérias

do gênero Vibrio potencialmente patogênicas (BURGE et al., 2007; PEÑA-NAVARRO e

VARELA-MEJÍAS, 2015).

Em um experimento realizado por Soto-Rodriguez et al. (2012) juvenis de

camarão L. vannamei (5 e 15g, respectivamente) apresentaram sensibilidade distinta ao

patógeno V. parahaemolyticus na dose de 103UFC/g. Os animais mais jovens exibiram taxas

de mortalidade a partir de 7h (50±37,8%) de exposição, atingindo a 100% após 48h. Os

animais com peso maior se mostraram mais resistentes, manifestando morbidade inicial após

10h (2,5 ±4,3%) da inoculação, atingindo 92,5±8,3% da população com 96h de exposição ao

patógeno.

A dose infectante também é um fator crucial que influencia diretamente na taxa de

mortalidade. Juvenis de L. vannamei com peso variando entre 1-4g foram submetidos à

infecção por imersão com V. parahaemolyticus isolado de um surto de AHPND, com doses

variando de 101 a 10

6UFC/mL. O grupo de animais submetidos a dosagens mais altas (10

6 e

105) do patógeno apresentaram 100% de mortalidade até a 21ªh e 104ªh após a infecção,

respectivamente (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Fato semelhante foi constatado quando

juvenis de L. vannamei (2-4g) foram expostos ao víbrio causador da AHPND em diferentes

concentrações (105 a 10

8UFC/g). Os animais submetidos a dosagens mais altas do patógeno

apresentaram mortalidade em poucas horas após a exposição (CHOI et al.; 2016).

Demonstrando que a taxa de mortalidade está relacionada com a idade dos animais e a

dosagem do inóculo bacteriano.

5.4.2 Análises microbiológicas

As contagens de Vibrio spp. e Vibrio resistente a canamicina (V. parahaemolyticus

53

- 106T) foram acompanhadas durante os quatro tempos de amostragens. A partir do instante

t=0h seguido dos tempos 24, 48 e 72h após a inoculação. Nos gráficos estão apresentados os

valores logaritizados do número de UFC de Vibrio spp. e Vibrio resistente a canamicina. A

contagem de vibrios totais foi feita em meio de cultura TCBS normal enquanto que na

contagem de Vibrio resistente a canamicina foi usado o meio TCBS com adição de

canamicina. (Figura 14).

Figura 14: Contagens de colônias bacterianas em meio seletivo para gênero Vibrio oriundas de amostras de

hepatopâncreas e intestino médio de camarão L. vannamei desafiados com V parahaemolyticus (106T).

Vibrio spp – contagens em meio TCBS sem adição de canamicina (30µg/mL); Vibrio spp. RCAN – contagens em meio TCBS

com adição de canamicina (30µg/mL).


Não foram detectados vibrios nas amostras de hemolinfa de qualquer animal

(controle e experimental) analisados durante o perido do experimento.

Analisando os animais do tanque controle negativo, foi detectado crescimento

microbiano nos tecidos do hepatopâncreas (2,2 logUFC/g e 0,6 logUFC/g) e intestino (1

logUFC/g) sobre o meio TCBS, sem canamicina, no primeiro (T=0h) e segundo (T=24h) dias

54

de amostragens. Ao mesmo tempo não foi verificado crescimento bacteriano a partir das

amostras de hemolinfa e tecidos sobre o meio seletivo acrescido de canamicina ao longo do

experimento. A ausência de crescimento bacteriano nas placas de TCBS com adição de

canamicina confirma que os animais não entraram em contato com a estirpe 106T. Sendo,

portanto, o resultado esperado para essas contagens.

Para os animais amostrados do tanque experimental, o número de bactérias do

gênero Vibrio spp. nos tecidos do hepatopâncreas, nos instantes T=0 e 48h de análises foram

0,35 logUFC/g e 1,1 logUFC/g. A quantificação de Vibrio spp. no intestino médio no tempo

T= 24h foi de 0,61 logUFC/g. As contagens de Vibrio resistente a canamicina apresentaram-se

nos tempos T=48 e 72h no meio TCBS com canamicina na hemolinfa (0,7 logUFC/g e 0,8

logUFC/g). As amostras de intestino médio apresentaram crescimento bacteriano no instante

T=72h (0,7 logUFC/g).

Dos animais amostrados do tanque experimental, a partir do instante T=0 foi

possível realizar as contagens de Vibrio spp. nos tecidos do hepatopâncreas e intestino médio.

Em contrapartida, a enumeração bacteriana de Vibrio resistente a canamicina dos camarões do

tanque experimental foi detectada partir do instante T=48h.

Para ambos os gráficos, Vibrio spp e Vibrio resistente a canamicina, chama

atenção o 3º dia (T=48h) de amostragens, em que as contagens oriundas das amostras do

hepatopâncreas se mostram superiores no gráfico Vibrio spp. Isso se deve ao fato de que o

ágar sem adição do antibiótico se torna menos seletivo, permitindo o desenvolvimento de

colônias oriundas de células não transformadas (Vibrio spp.) como de células transformadas

(106T).

Os valores encontrados para as contagens de Vibrio spp e Vibrio resistentes a

canamicina apresentaram distribuição não normal. Portanto, foram analisados como dados

não paramétricos pelo Teste de hipótese de Mann-Whitney. Não havendo diferença

significativa para as contagens entre os tecidos analisados.

A colonização bacteriana em organismos aquáticos, incluindo os camarões, é um

fato natural. Estirpes do gênero Vibrio têm sido isoladas a partir de amostras da hemolinfa de

animais aparentemente sadios (ALBUQUERQUE-COSTA, LIMA-ARAÚJO e

FERNANDES-VIEIRA, 2013). No entanto, há uma divergência sobre a presença de bactérias

na hemolinfa de animais que não apresentam sinais patológicos (ALBUQUERQUE-COSTA,

LIMA-ARAÚJO e FERNANDES-VIEIRA, 2013, KUMAR et al., 2014).

A existência de fatores de proteção imunológica do animal pode explicar as

alterações nas contagens bacterianas. Dentre as ferramentas de defesa imune do camarão, os

55

hemócitos possuem papel importante no combate às bactérias patogênicas, sendo responsáveis

pela agregação e redução da carga bacteriana na hemolinfa e órgãos do camarão (VAN DE

BRAAK et al., 2002; SOONTHORNCHAI et al., 2010). Outra teoria aceita é a de que no

momento em que ocorre ausência da bactéria no fluído e tecido dos camarões, provavelmente,

o micro-organismo não foi capaz de vencer suas barreiras imunológicas. A cutícula e o trato

digestivo, na maioria dos casos, mecanismos de proteção contra o ataque de patógenos

altamente virulentos (MARTIN, RUBIN e SWANSON, 2004; AGUIRRE-GUZMAN et al.,

2010; SOONTHORNCHAI et al., 2010).

Estirpes de V. parahaemolyticus vêm sendo isoladas de camarões acometidos pela

AHPND com o intuito de compreender e/ou elucidar os processos infecciosos provocados por

esta bactéria (JOSHI et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et al., 2016). Em

camarões, o órgão mais afetado pela vibriose AHPND é o hepatopâncreas, e à medida que a

patologia progride causa atrofia da glândula a tal ponto que provoca a morte do animal

(SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Camarões L. vannamei moribundos afetados pela doença

AHPND apresentaram baixa ou nenhuma densidade de Vibrio sp. na hemolinfa

(0,075logUFC/mL), alta densidade no hepatopâncreas (2,89 logUFC/g) e no estômago (3,6

logUFC/g) (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Em contrapartida, juvenis de camarão F.

indicus (10±1,5g) expostos por imersão ao V. parahaemolyticus marcado com GFP

apresentaram maior índice da bactéria na hemolinfa (4,6 logUFC/mL), seguido do intestino

(2,5 logUFC/g) e hepatopâncreas (1,9 logUFC/g) (VINOJ, VASEEHRARAN e BRENNAN,

2014).

O que vem sendo constatado é que, aparentemente, certa densidade bacteriana

deve ser alcançada para que a toxina patogênica que causa a doença seja expressa (SOTO-

RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et al., 2016). Além disso, o potencial de virulência pode

variar entre estirpes da mesma espécie (JOSHI et al., 2014; VINOJ, VASEEHRARAN e

BRENNAN, 2014).

5.7 Microscopia ótica confocal

O uso de proteínas fluorescentes é um meio de visualização e detecção direta do

micro-organismo, permitindo diferenciar as células marcadas das que ocorrem naturalmente

nos ambientes (VINOJ, VASEEHARAN e BREENAN, 2014). Desta forma, a invasão

bacteriana aos fluídos e tecidos dos camarões analisados acompanhada por meio da

microscopia ótica confocal, permitiu visualizar as células marcadas com fluoróforo verde

56

(ZsGreen1-Dr).

A hemolinfa e os tecidos dos animais do tanque controle negativo não

apresentaram sinais de fluorescência. Durante as análises dos fragmentos do fluido e tecidos,

na microscopia confocal, foi observado um background verde próprio do tecido do camarão.

Esse fato permite confirmar a presença da célula marcada dentro do tecido, sem que haja a

necessidade de utilizar corantes teciduais. Esse background verde ocorre naturalmente em

amostras teciduais de camarão e peixes (XU, SHOEMAKER e KLESIUS, 2012; SHANTI e

VASEEHARAN, 2014).

Nas imagens extraídas a partir das amostras de hemolinfa de camarão L. vannamei

(Figura 15), tanto no controle negativo quanto no tratamento, não foram observadas células

fluorescentes, ratificando as contagens de víbrios realizadas neste estudo que não confirmou a

presença bacteriana nas amostras do fluído dos camarões em todos os dias de amostragens.

No entanto, percebemos estruturas esféricas com baixa intensidade de brilho em contraste

com o background verde da hemolinfa. Essas estruturas podem ser devido à ativação dos

hemócitos que fazem parte do sistema de defesa do organismo (SOONTHORNCHAI et al.,

2010).

Figura 15 Imagens dos esfregaços das amostras de hemolinfa extraídas de camarão L. vannamei analisadas em

microscópio confocal Zeiss (modelo LSM 710 – Alemanha).

A1: controle T = (0h); A2: controle T = (24h); A3: controle T = (48h); B1: tratamento T = (0h); B2: tratamento T = (24h); B3:

tratamento T = (24h); HCT: hemócito?; ( ) indica a localização do hemócito.


HCT?

HCT?

HCT?

HCT?

57

Analisando as imagens dos fragmentos de hepatopâncreas (Figura 16), sinais de

fluorescência foram observados com maior intensidade a partir do terceiro dia de coleta

(T=48h). As células bacterianas foram observadas agrupadas e raramente notamos células

isoladas neste órgão. Observou-se uma coerência entre os resultados obtidos a partir das

imagens da microscopia confocal e das contagens bacterianas do hepatopâncreas, detectando

contagens bacterianas o Vibrio 106T a partir das 48h de amostragem.

Figura 16 Imagens das amostras de hepatopâncreas extraídas de camarão L. vannamei analisadas em

microscópio confocal (modelo LSM 710 – Alemanha).

C1: controle T = (0h); C2: controle T = (24h); C3: controle T = (48h); D1: tratamento T = (0h); D2: tratamento T = (24h); D3:

tratamento T = (48h); Vph106T: V. parahaemolyticus 106T.


Para o intestino médio, células fluorescentes foram visíveis a partir do instante T

= 0h dia após a imersão, aumentando a densidade no terceiro dia de amostragens (Figura 17).

Vph106T

58

Figura 17 Imagens das amostras de intestino médio extraídas de camarão L. vannamei analisadas em

microscópio confocal (modelo LSM 710 – Alemanha).

E1: controle T = (0h); E2: controle T = (24h); E3: controle T = (48h); F1: tratamento T = (0h); F2: tratamento T = (24h); F3:

tratamento T = (48h); Vph106T: V. parahaemolyticus 106T.


As contagens de Vibrio spp. nos tecidos dos intestinos foram presentes nos tempos

T=0 e 24h de coletas. Em contraste com as contagens de víbrios (106T), sendo a bactéria

marcada detectada somente no 3º dia (48h) de amostragem. As bactérias do gênero Vibrio

quando expostas a condições ambientais adversas são capazes de entrar numa fase viável, mas

não cultivável (VNC) (BAFFONE et al., 2003), o que pode explicar a ausência da bactéria V.

parahaemolyticus 106T nos três primeiros dias de amostragens. Além disso, a análise dos

mecanismos de defesa imunológica dos camarões é um fator que não pode ser neglicenciado

quando o assunto é localização da infecção tecidual desses animais. Há a hipótese de que a

presença da bactéria patogênica nos tecidos pode desencadear a expressão de genes, tais como

os peptídeos antimicrobianos (AMP, sigla em inglês) e proteínas específicas de um complexo

e ainda incompreendido sistema imune. Já foi demonstrado que os genes estimuladores de

interferons (STING, sigla em inglês) atuam na ativação de uma resposta imunológica de

forma distinta nos diferentes tecidos, com ativação mais intensa no tecido intestinal do que no

hepatopâncreas (GU et al., 2017; LI et al., 2017). Somada a essas informações, temos a

especificidade do potencial virulento das estirpes. Observações sobre a colonização de V.

Vph106T

Vph106T Vph106T

59

harveyi e V. parahaemolyticus em tecidos de camarão P. monodom indicaram que a presença

da bactéria no estômago do camarão provocou danos teciduais, enquanto sua permanência no

intestino anterior, médio e posterior não trouxe prejuízos aos tecidos (SOONTHORNCHAI et

al., 2015). O presente estudo sugere que por via de imersão, o V. parahaemolyticus (106T)

colonizou primeiro o intestino médio, seguido do hepatopâncreas, confirmando que o

hepatopâncreas é um importante órgão de acumulação bacteriana (BURGENTS et al., 2005;

SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015).

O uso da GFP para marcação e localização bacteriana em tecidos de organismos

aquáticos tem sido explorado nos últimos anos (LING et al., 2000; RENGPIPAT,

WONGTAGPRASERT e PALAGA, 2009; SHANTHI e VASEERAHAN 2014 ). Contudo,

pouco se tem divulgado sobre o uso da proteína oriunda dos corais do gênero Zoantus

(ZsGreen) para marcação dos diversos gêneros bacterianos com teste desafio em animais

aquáticos para determinar sua localização. A Zsgreen foi utilizada com sucesso para marcação

de bactérias do gênero Edwardsiella permitindo sua localização nos tecidos de peixes (XU,

SHOEMAKER e KLESIUS, 2012). Do mesmo modo, proteína fluorescente Zsgreen se

mostrou eficiente para marcação e localização de Vibrio parahaemolyticus na hemolinfa,

hepatopâncreas e intestino de camarões L. vannamei. Pesquisas com as bactérias V.

parahaemolyticus e V. rotiferianus tem despertado atenção devido ao seu potencial para

desencadear eventos de mortalidade em massa em cultivos de camarão (KUMAR et al., 2014;

SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; ZHANG et al., 2014).

As estirpes de V. parahaemolyticus relacionadas com o desencadeamento dos

eventos de mortalidade em massa de pós-larvas de camarão acometidas pela AHPND têm

apresentado o plasmídio PVA1 (DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015; LEE et al., 2015;

SIRIKHARIN, et al., 2015). A troca de material genético entre estirpes bacterianas da mesma

espécie e mesmo entre espécies distintas é ocasionada pela transferência plasmidial que

ocorre naturalmente no ambiente (BENNET, 2008). A identificação de plasmídios que

codificam para virulência em crustáceos é um alerta para a possibilidade de que novas estirpes

bacterianas não relacionadas a eventos patogênicos e/ou disseminação de estirpes portadoras

do potencial virulento se espalhem por regiões ainda não acometidas por estas doenças.

Estirpes de V. campbelli isoladas de cultivos de camarão na China (2013) e na

América Latina (2016) foram identificadas como agentes etiológicos da AHPND. Essas cepas

patogênicas continham o plasmídio que codifica paras as toxinas PirAB, confirmando esses

genes como sendo responsáveis pelo desencadeamento da doença e indicando a transferência

horizontal dos genes entre as espécies bacterianas (DONG et al., 2017; HAN, 2017).

60

A elucidação das vias de invasão e acompanhamento da instalação bacteriana nos

tecidos podem ser ferramentas imprescindíveis para o desenvolvimento de tecnologias e

técnicas de manejo preventivo dos processos patológicos.

61

6 CONCLUSÃO

O protocolo para transformação celular pelo método químico foi modificado e

adaptado para transfecção plasmidial em uma estirpe selvagem de Vibrio parahaemolyticus,

permitindo a diferenciação das cepas marcadas com o fluoróforo verde. Esse procedimento

permitiu o acompanhamento desse patógeno nos tecidos e hemolinfa dos camarões após

exposição a dose infectante por imersão.

A colonização tecidual pelo V. parahaemolyticus acontece de maneira

diferenciada, com fixação em um primeiro momento nos tecidos do intestino médio seguida

de uma instalação tecidual mais intensa no hepatopâncreas. Durante o acompanhamento das

bactérias nos camarões, por cultivo e microscopia, não foi detectada presença de espécies de

Vibrio cultiváveis e do V. parahaemolyticus (106T) nas amostras de hemolinfa o que está

relacionado a presença de hemócitos que atuam no sistema de defesa desses crustáceos.

6.1 Considerações finais

A facilidade de detecção e interpretação dos resultados mostram a importância

dessa estirpe marcada com fluoróforo como uma ferramenta no estudo e entendimento do

papel do V. parahaemolyticus como patógeno em camarões marinhos. A partir desse

protocolo, outras possibilidades e abordagens se tornam viáveis usando o V. parahaemolyticus

transformado como indicador. Um bom exemplo é a possibilidade de acompanhamento da

colonização do organismo e análise paralela dos mecanismos imunológicos do camarão

favorecendo o desenvolvimento de tecnologias para prevenção ou tratamento de eventos de

vibrioses nos cultivos de camarão.

Atenção deve ser dada a eventos de autofluorescência em outros gêneros

bacterianos presentes na microbiota de camarões e que podem resultar em leituras errôneas

dos resultados.

62

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