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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA ANTONIO ALVES DA SILVA NETO ALGA MARINHA VERMELHA Hypnea musciformis (WULFEN) COMO FONTE POTENCIAL DE CARBOIDRATOS PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL FORTALEZA 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
ANTONIO ALVES DA SILVA NETO
ALGA MARINHA VERMELHA Hypnea musciformis (WULFEN) COMO FONTE
POTENCIAL DE CARBOIDRATOS PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL
FORTALEZA 2013
ANTONIO ALVES DA SILVA NETO
ALGA MARINHA VERMELHA Hypnea musciformis (WULFEN) COMO FONTE
POTENCIAL DE CARBOIDRATOS PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL
FORTALEZA 2013
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Prof.ª Dra. Norma Maria Barros Benevides Coorientadora: Prof.ª Dra. Márjory Lima Holanda
Ao grande incentivador dos meus estudos, meu amado pai, Francisco Alves da
Silva (in memoriam) A minha mãe Francisca Suzete Barbosa da Silva, minhas irmãs Íris, Cálita,
Edgláucia, Edleuza, Plácida, Laís e a minha linda sobrinha Maria Clara.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela saúde, fortaleza e suporte, em todos os momentos da minha vida.
À Profª. Dra. Norma Maria Barros Benevides pela oportunidade de aprendizagem,
confiança e orientação, contribuindo para o meu crescimento profissional.
À Profª Dra. Márjory Lima Holanda pelos grandes ensinamentos na elaboração
desse trabalho, apoio e amizade.
À Profa. Dra. Luana Maria Castelo Melo Silva, por aceitar, gentilmente, a
participação na Banca examinadora.
À Profª. Dra. Maria Valderez Ponte Rocha, pelas valiosas contribuições e por ter
cedido, gentilmente, a utilização do HPLC para as análises desse trabalho.
Ao amigo Tiago Albuquerque pela grande ajuda nas análises no HPLC desse
trabalho.
A minha grande amiga Ticiana de Brito Lima, por ser uma das incentivadoras que
me ajudou a conquistar mais esse passo na minha vida, também pela amizade mais
do que valiosa e ajuda nesse trabalho. Muito obrigado, Tici!
Ao amigo George Meredite, por partilhar comigo a realização desse trabalho e pela
amizade a mim concedida.
As minhas best: Alexandra da Silva Lopes, Ana Cláudia Castro Silva, Ana Karine
Sombra de Alencar Araripe, Débora Brasileiro, Sônia Zeferino (em ordem alfabética
para não causar intrigas), pelo carinho, amizade verdadeira, risos, choros, ‘ciúmes’...
Amo muito vocês!
Ao amigo Antonio Borges de Aguiar Neto, pelo incentivo, amizade e ajuda nesse
trabalho. Tony, obrigado pela água deionizada!
À Cláudia Cinthia pela amizade e por ter me ajudado nas análises de composição
química.
A todas as amizades que conquistei no Laboratório de Carboidratos e Lectinas
(Carbolec): Ana Luíza Quinderé, Ariévilo Rodrigues, Bruno, Chistiane Oliveira,
Edfranck Vanderlei, Fabíula Moura, Felipe Barros, Gabriela de Paula, Gardênia
Mendonça, Gerardo Carneiro, Ianna de Araújo, Ismael de Queiroz, Jane de Fátima,
Luana Silva, Renata Rivanor, Natássia Ribeiro, Ricardo Basto, Ticiana Abreu, Trycia
Magalhães, Willame Silva, Ygor Eloy, Valdécio Monteiro.
A minha família (tias, primos) que sempre torceram pelo meu sucesso.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, por terem
contribuído com o meu crescimento estudantil, profissional e pessoal. Aos colegas
do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular.
À Universidade Federal do Ceará (UFC); ao Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica; à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(Capes), pelo custeio de bolsa de pesquisa no desenvolvido desse projeto.
RESUMO Alta demanda de energia e mudanças climáticas globais têm gerado interesse dos
governantes mundiais para investir em pesquisas de fontes alternativas e renováveis
de combustíveis. Nessa perspectiva, as macroalgas vêm ganhando ampla atenção
por parte de pesquisadores do mundo inteiro como fonte alternativa renovável de
biomassa para a produção de bioetanol, o qual é denominado atualmente de
combustível de “terceira geração”. A utilização das algas marinhas como matéria-
prima para produção de bioetanol apresenta vantagens, tais como (1) não
competição com a produção de alimentos, (2) alto conteúdo de carboidratos, (3)
baixo conteúdo de lignina e (4) alta produtividade. O potencial da alga marinha
vermelha Hypnea musciformis em fornecer carboidratos fermentescíveis para a
produção de bioetanol foi avaliado no presente trabalho. A alga foi obtida de cultivo
comercial, localizado na praia de Flecheiras, município de Trairi, Ceará e após
lavagem, secagem e trituração, 5 g foram adicionados a 100 mL de HCl (0,2; 0,5 e
1,0 M) em erlenmeyers, autoclavados a 121 ºC (10, 20 e 30 min). Foi observada a
presença de galactose (7,4 – 10,8 g.L-1) e glucose (3,4 – 4,7 g.L-1) em todos os
hidrolisados e a condição de hidrólise 0,5/20, apresentando uma concentração de
glicose + galactose de 14,8 g.L-1, foi selecionada para os ensaios de fermentação
dos monossacarídeos por Saccharomyces cerevisiae a 30°C. Os resultados
mostraram que a glicose e a galactose, foram consumidas simultaneamente, no
entanto esse consumo só foi iniciado após 7 h de fermentação e após 52 h, 82,5 %
da glicose e 72% da galactose tinham sido consumidas, com uma produção máxima
de 5,3 g.L-1 de bioetanol, representando uma eficiência fermentativa de 50% do
teórico e evidenciando a habilidade da S. cerevisiae em fermentar a galactose
proveniente de matéria-prima algácea com um rendimento de 0,1 g de bioetanol/g
de alga seca. Observou-se, na condição de hidrólise selecionada, uma maior
velocidade específica de consumo de substrato acompanhado da velocidade de
produção de etanol. Os rendimentos de etanol baseados no consumo de substrato
(glucose + galactose) e biomassa foram 0,315 e 0,08 (g/g), respectivamente. As
produtividades de biomassa e etanol foram 0,008 g.L-1.h-1 e 0,100 g.L-1.h-1,
respectivamente. Com os dados obtidos pode-se concluir que a alga marinha H.
musciformis se mostrou uma potencial fonte renovável de biomassa para a produção
de etanol. No entanto, são necessários mais estudos para otimizar o processo
produtivo de bioetanol a partir desses organismos.
Palavras-chave: alga, biocombustível, hidrólise ácida, Hypnea musciformis, levedura
ABSTRACT
High energy demand and global climate changes have generated interest in world
leaders to invest in research on alternative and renewable fuels. In this perspective,
the macroalgae are gaining wide attention from researchers around the world as an
alternative source of renewable biomass for bioethanol production, which is currently
called fuel "third generation". The use of seaweed as a feedstock for bioethanol
production has advantages such as (1) no competition with food production, (2) high
carbohydrates content, (3) low lignin content and (4) high productivity. The potential
of the red seaweed Hypnea musciformis to provide fermentable carbohydrates for
bioethanol production was evaluated in this study. The algae was obtained from a
commercial cultivation, located on the Flecheiras beach, Trairi, Ceará and after
washing, drying and grinding 5 g were added to 100 mL HCl (0.2, 0.5 and 1.0 M) in
Erlenmeyer flasks, autoclaved at 121 ºC (10, 20 and 30 min). It was observed the
presence of galactose (7.4 to 10.8 g.L-1) and glucose (3.4 to 4.7 g.L-1) in all
hydrolyzed and the hydrolysis condition 0.5/20, with a concentration of glucose +
galactose 14.8 g.L-1, was selected for testing fermentation of monosaccharides by
Saccharomyces cerevisiae at 30 ° C. The results showed that glucose and galactose
were consumed simultaneously, however this consumption only started after 7 h of
fermentation and after 52 h, 82.5% of glucose and 72% galactose had been
consumed, with a maximum yield of 5.3 g.L-1 of ethanol, it represents a fermentation
efficiency of 50% theory and showing the ability of S. cerevisiae ferment galactose
from algal feedstock with a yield of 0.1 g ethanol/g dry seaweed. It was observed in
the hydrolysis condition selected, a higher specific rate of the substrate consumption
accompanied by the rate of ethanol production. The ethanol yields based on
consumption of substrates (glucose + galactose) and biomass were 0.315 and 0.08
(g/g) respectively. The biomass and ethanol productivity were 0.008 g.L-1.h-1 and
0.100 g.L-1.h-1, respectively. With the date obtained it can be conclude that the red
seaweed H. musciformis showed be a potential renewable source of biomass for the
production of bioethanol. However, other studies are needed to optimize the
production process of bioethanol from these organisms.
Keywords: algae, biofuel, acid hydrolysis, Hypnea musciformis, yeast
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Perspectiva da produção de biocombustível 17
Figura 2 - Esquema da estrutura da parede celular da maioria dos
vegetais.
20
Figura 3 - Estrutura da molécula da celulose. 20
Figura 4 - Estrutura básica da carragenana com unidades D-
alternantes
24
Figura 5 - Estruturas das carragenanas comerciais: (a) kappa-
carragenana, (b) iota-carragenana e (c) lambda-
carragenana
24
Figura 6 - Representação da ação do pré-tratamento aplicado a um
material lignocelulósico.
28
Figura 7 - Esquema do processo de produção de etanol por meio
da hidrólise da biomassa.
31
Figura 8 - Via da fermentação alcóolica, onde a glicose é convertida
em piruvato e este convertido a etanol e CO2.
33
Figura 9 - Localização da área de cultivo de algas, praia de
Flecheiras – Ceará – Brasil.
36
Figura 10 - Esquema da hidrólise ácida da alga H. musciformis 39
Figura 11 - Hidrolisado ácido da alga H. musciformis, autoclavada a
121 ºC por 10, 20 e 30 min na concentração 0,5 M de
HCl.
40
Figura 12 - Eficiência de hidrólise da alga H. musciformis com base
na massa seca em função da concentração de HCl e
tempo de reação.
48
Figura 13 - Teores de açúcares redutores do hidrolisado da alga H.
musciformis.
51
Figura 14 - .Teores de carboidratos (dissacarídeos e
monossacarídeos) dos hidrolisados da alga H.
musciformis.
52
Figura 15 - Gelificação da solução da alga H. musciformis submetida
à autoclavagem a 121 ºC por 10, 20 e 30 min na
53
ausência de ácido
Figura 16 Gráfico de Pareto para a concentração de glucose como
variável resposta.
55
Figura 17 - Gráfico de Pareto para a concentração de galactose
como variável resposta.
56
Figura 18 - Concentrações de ácido acético formado durante a
hidrólise ácida da alga H. musciformis.
59
Figura 19 - Cinética fermentativa do hidrolisado (0,5/20) da alga H.
musciformis pela levedura S. cerevisiae.
60
Figura 20 - Velocidades específicas de crescimento (µX), do
substrato (µS) e da produção de etanol (µP) durante a
fermentação do hidrolisado da alga H. musciformis
(0,5/20) por S. cerevisiae.
63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Esquema comparativo entre as condições e o
desempenho dos três processos básicos de hidrólise
31
Tabela 2 - Denominações das condições de hidrólise da alga
marinha vermelha H. musciformis em função da
concentração de HCl e tempo de reação
39
Tabela 3 - Valores e níveis das variáveis do Planejamento fatorial 22
levando em consideração a concentração do ácido e o
tempo, dos hidrolisados da alga H. musciformis, na
concentração dos açúcares (glucose e galactose)
obtidos.
45
Tabela 4 - Composição centesimal da alga H. musciformis 46
Tabela 5 - Teores de açúcares redutores obtidos nos hidrolisados e
perdidos nos resíduos úmidos da alga H. musciformis
50
Tabela 6 - Concentrações e tempos de reação de glucose e
galactose dos hidrolisados da alga H. musciformis
obtidos através da CLAE e de acordo com o
planejamento experimental.
54
Tabela 7 - ANOVA para a concentração de glucose como variável
resposta.
57
Tabela 8 - ANOVA para a concentração de galactose como variável
resposta.
58
Tabela 9 - Fatores de conversão (Y) e produtividade (P) obtidos nos
ensaio fermentativo do hidrolisado (0,5/20) da alga H.
musciformis.
61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
HCl Ácido clorídrico
H2SO4 Ácido sulfúrico
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
D. O Densidade ótica
g Grama
ºC Grau centigrado
Ca(OH)2 Hidróxido de cálcio
h Hora
L Litro
g.L-1 Gramas por litro
g.L-1.h-1 Gramas por litro por hora
mg Miligrama
mL Mililitro
min Minuto
M Molar
nm Nanômetro
% Porcentagem
rpm Rotações por minuto
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 14
1. 1. Mudanças climáticas e a crise de energia 14
1. 2. Biocombustíveis 14
1. 2. 1. Biocombustíveis de primeira geração 15
1. 2. 2. Biocombustíveis de segunda geração 15
1. 2. 3. Biocombustíveis de terceira geração 16
1. 3 Etanol 16
1. 4. Biomassa 19
1. 4. 1 Biomassa de material lignocelulósico 19
1. 4. 2. Biomassa algácea como matéria-prima para bioetanol 21
1. 5. A alga marinha vermelha Hypnea musciformis 25
1. 6. Pré-tratamento de matéria-prima para a produção de etanol 27
1. 7. Hidrólise de matéria-prima para a produção de
biocombustíveis
30
1. 7. 1. Hidrólise de biomassa 31
1. 7. 1. 1. Hidrólise com ácido concentrado 31
1. 7. 1. 2 Hidrólise com ácido diluído 32
1. 7. 1. 3 Hidrólise enzimática 32
1. 8. Fermentação 32
2. OBJETIVOS 35
2. 1. Geral 35
2. 2. Específicos 35
3. MATERIAIS E MÉTODOS 36
3.1. Coleta das algas marinhas 36
3. 2. Análise centesimal da alga marinha H. musciformis 37
3. 2. 1. Umidade 37
3. 2. 2. Proteínas totais 37
3. 2. 3. Lipídeos totais 37
3. 2. 4. Cinzas totais 37
3. 2. 5. Carboidratos totais 38
3. 2. 6. Celulose 38
3. 3. Hidrólise ácida da alga marinha vermelha H. musciformis 38
3. 4. Ajuste do pH do hidrolisado da alga marinha vermelha H.
musciformis
40
3. 5. Análise de açúcar redutor 40
3. 6. Eficiência da hidrólise ácida 40
3. 7. Microrganismos e manutenção das culturas de células 41
3. 8. Preparo do inóculo 41
3. 9. Fermentação do hidrolisado ácido 41
3. 10. Determinação da composição em monossacarídeos e em
etanol nos hidrolisados 42
3. 11. Parâmetros cinéticos 43
3. 12 . Planejamento experimental e análise estatística 44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 46
4. 1. Composição centesimal da alga H. musciformis 46
4. 2. Eficiência de hidrólise da alga H. musciformis em função da
concentração de HCl e tempo de reação
48
4.3. Açúcares redutores dos hidrolisados da alga H. musciformis 49
4. 4. Teores de carboidratos (dissacarídeos e monossacarídeos)
dos hidrolisados da alga H. musciformis
51
4. 5. Influência da concentração do ácido e do tempo de reação
na obtenção de glucose e galactose nos hidrolisados da
alga H. musciformis
53
4. 6. Teores de ácido acético (inibidor de fermentação) 58
4. 7. Cinética fermentativa e produção de etanol a partir do
hidrolisado (0,5/20) da alga H. musciformis
60
5. CONCLUSÃO 64
6. REFERÊNCIAS 65
14
1. INTRODUÇÃO 1.1. Mudanças climáticas e a crise de energia
Atualmente, diversas discussões referentes às mudanças climáticas têm sido
um dos alvos das pesquisas científicas. Segundo estudos, verificou-se que, nas
últimas décadas, houve um significativo aumento da temperatura mundial,
fenômeno conhecido como aquecimento global, sendo a poluição do ar uma das
causas desse fenômeno.
No ano de 1997, realizou-se na cidade de Quioto, no Japão, uma
Conferência, onde foi concretizado um documento denominado Protocolo de Quioto.
Nessa Conferência, critérios e normas foram estabelecidos para se reduzir os
Gases de Efeito Estufa pelos países mais poluidores (LEITE, 2007; MIKHAILOVA;
BASTIANI, 2007). O Protocolo de Quioto tornou-se Tratado no ano de 2004,
entrando em vigor em 16 de fevereiro de 2005, cujo objetivo era obrigar os países
industrializados a diminuir, durante o período de 2008 e 2012, a emissão de gases
que vem agravando o efeito estufa, resultantes da queima de combustíveis fósseis,
para um nível de 5,2% em relação aos níveis registrados no ano de 1990.
É desafiador para a sociedade do século XXI prevê a demanda para energia
de transporte, aquecimento, processos industriais e fornecimento de matéria-prima
para a indústria de modo sustentável. Uma preocupação crescente para a
segurança de provisão de óleo foi comprovada com o aumento do seu preço, o qual
aproximou-se de US$ 100,00 por barril, durante o ano de 2008 (ROCHA, 2010).
Contudo, a provisão de energia futura deve ser cumprida com uma redução
simultânea e significativa de emissões de gases (MARTINS et al., 2002).
Alta demanda de energia e mudanças climáticas globais têm gerado o
interesse dos governantes mundiais para investir em pesquisas de fontes
alternativas e renováveis de combustíveis.
1.2. Biocombustíveis
Alta demanda de energia, mudanças climáticas globais, melhoria na
qualidade do ar das grandes cidades têm gerado o interesse dos governantes
15
mundiais para investir e incentivar pesquisas de fontes alternativas e renováveis de
combustíveis.
Biocombustíveis são fontes de energia renováveis e englobam uma grande
variedade de matérias-primas, tecnologias de conversão e usos finais. Podem ser
líquidos ou gasosos feitos a partir de plantas ou resíduos, tais como, culturas
agrícolas, resíduos urbanos e agrícolas ou subprodutos florestais (BALAT, 2009).
No aspecto ambiental, o uso de biocombustível é vantajoso, pois não contribui
para o acúmulo de gases do efeito estufa e permite a reciclagem do gás carbônico
na atmosfera.
1. 2. 1. Bicombustíveis de primeira geração
São aqueles produzidos a partir de matéria-prima contendo açúcar e amido.
Esses tipos de biocombustíveis, quando produzidos de grãos, como o milho, por
exemplo, impactam negativamente nos preços dos alimentos. Quando são gerados
de materiais com grande conteúdo lipídico, comprometem a biodiversidade, pois o
seu balanço de carbono e o balanço energético global são ineficientes, uma vez que
não conseguem reduzir os gases de efeito estufa.
Os biocombustíveis de primeira geração baseiam-se em tecnologias de
conversão ditas ineficazes, como fermentação a partir de leveduras ou
transesterificação por catalisadores de base alcalina.
1. 2. 2. Biocombustíveis de segunda geração
São aqueles produzidos a partir de matéria-prima de resíduos celulósicos.
Devido à abundância relativa desses resíduos e seu baixo custo, fica excluso o
problema relacionado à produção de alimentos versus produção de combustíveis. A
matéria-prima constituída de resíduos celulósicos possui um balanço de carbono
excelente, levando uma redução da emissão de gás carbônico em até 90% quando
comparado aos combustíveis fósseis. Devido a isso, são considerados “combustíveis
limpos”, uma vez que reduzem, também, a emissão de outros poluentes
importantes, como os óxidos de nitrogênio e enxofre.
16
1. 2. 3. Biocombustíveis de terceira geração
São aqueles originados a partir de avanços feitos no aumento da produção de
biomassa, ou seja, na própria fonte. Esses biocombustíveis baseiam-se em colheitas
de energias projetadas, onde a matéria-prima provém de avançados estudos nos
campos de procriação molecular, genômica e transgenia, gerando plantas com
excelentes propriedades para a conversão em bioprodutos.
1. 3. Etanol
A história do álcool é datada de muitos séculos atrás. Muitos cientistas da
antiguidade já tinham certo conhecimento da presença de um ingrediente
combustível no vinho. Apesar dessa suposição, não há relatos ou indicações que
esse ingrediente tenha sido separado por meio fermentado (SIQUEIRA, 1997).
A partir do fim do século XV, o processo de destilação de meios fermentados
tornou-se importante. A adição de 5% de etanol anidro (em volume) à gasolina
tornou-se obrigatória desde a década de 1930.
Com a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool), pelo governo
brasileiro, no ano de 1975, a produção do etanol foi implantada em larga escala para
uso em motores a álcool. No decorrente ano, foi lançado o primeiro carro movido a
álcool e, com este feito, o teor de etanol na gasolina aumentou de 5 para uma faixa
de 20 a 25%. No fim dos anos 80, com a queda do preço do petróleo, a produção de
etanol teve um aumento significativo, vindo a sofrer uma grande queda no fim dos
anos 90 e recuperando a sua crescente produção a partir do ano de 2003 quando
foram lançados os veículos biocombustíveis (PIACENTE, 2006).
Recentemente, a demanda mundial por etanol combustível tem se expandido
de forma muito rápida, e esta deverá aumentar ainda mais no futuro próximo,
principalmente nos países mais desenvolvidos e de maior consumo de combustíveis
automotivos. Isto se deve a combinação dos seguintes fatores: substituição do
MTBE (Éter Metil Terc-Butílico) como aditivo da gasolina (para aumento da
octanagem do combustível e como aditivo oxigenado) devido ao impacto ambiental
associado ao uso daquele produto; adoção de estratégias para a redução/limitação
das emissões dos gases precursores do efeito estufa, conforme demandado para
17
alguns países pelo Protocolo de Quioto; redução da dependência de derivados de
petróleo na matriz energética; incentivos à agricultura e às indústrias locais
(PIACENTE, 2006).
Estima-se que a produção de biocombustível deva ultrapassar os 30 bilhões
até ano de 2022 (Figura 1). Atualmente, o Brasil produz 25 bilhões de etanol por ano
a partir da cana-de-açúcar. O plantio dessa matéria-prima, realizado em terras
aráveis de boa qualidade, deverá ser expandido devido à crescente demanda
nacional e internacional de álcool (MAPA, 2010).
Figura 1 - Perspectiva da produção de biocombustíveis.
Fonte: Verenium, 2008
A produção de etanol no Brasil era realizada por batelada simples (processo
descontínuo), mas quando o Proálcool foi implantado, as destilarias tiveram que ser
reestruturadas para processo de batelada alimentada, o qual apresentou-se eficiente
no quesito de conversão de açúcar a álcool. Entretanto, a fermentação alcoólica, por
processo contínuo, mostrou-se ser um processo bastante atrativo.
Processo Batelada simples: É um processo lento e que desperdiça tempo na
preparação do reator (MAIORELLA et al., 1981). Para esse processo prepara-se um
meio de cultura adequado à nutrição e ao desenvolvimento do microrganismo e
também ao acúmulo do produto desejado; coloca-se este meio de cultura em um
18
biorreator; adiciona-se o microrganismo responsável pelo processo biológico e se
aguarda que o processo ocorra. Após um determinado tempo de fermentação, retira-
se o caldo fermentado do reator e executam-se as operações unitárias necessárias
para a recuperação do produto (SCHIMIDELL E FACCIOTTI, 2001). Além do menor
risco de contaminação, este processo apresenta grande flexibilidade de operação
pela possibilidade de utilização dos fermentadores para a fabricação de diferentes
produtos e por permitir uma melhor condição de controle com relação à estabilidade
genética do microrganismo (CARVALHO E SATO, 2001). Assim, o processo
batelada é sempre utilizado como base para as comparações de eficiências
atingidas com relação aos outros processos, mas a sua baixa eficiência estimula o
surgimento de formas alternativas (SCHIMIDELL E FACCIOTTI, 2001).
Processo Batelada alimentada: é considerado mais eficiente e versátil dentre
os processos de fermentação; é também conhecido como Melle-Boinot. Esse
processo define-se como uma técnica em processos microbianos, onde um ou mais
nutrientes são adicionados ao fermentador, sob condições controladas, durante o
cultivo e os produtos permanecem nesse fermentador até o final da fermentação. É
considerado um processo satisfatório quanto à eficiência da conversão de açúcar
em álcool (ZARPELON E ANDRIETTA, 1992; CARVALHO E SATO, 2001). Devido à
flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento de dornas com meio
nutriente, é possível controlar a concentração de substrato no fermentador, de modo
que, o metabolismo microbiano seja deslocado para uma determinada via
metabólica, levando ao acúmulo de um produto específico (SCHIMIDELL et al.,
2001).
Processo Contínuo: como o próprio nome já diz, é um processo sem
interrupções. A alimentação do meio de cultura é contínua a uma determinada vazão
e o volume de reação é mantido constante. Esse processo pode ser dividido em três
partes: (1) unidade de tratamento ácido; (2) fermentadores e (3) unidade de
separação de células. As vantagens desse processo em relação aos outros
processos citados anteriormente estão embasadas na otimização das condições de
processo para uma maior produtividade; período longo de produtividade contínua;
maior produtividade volumétrica; maior uniformidade do produto; redução dos custos
laboratoriais uma vez alcançado o estado desejado; redução do tempo de limpeza e
sanitização das dornas e maior facilidade de controle automático. A maior
19
desvantagem é que as fermentações contínuas são mais propícias à contaminação
bacteriana por longos prazos de exposição (CYSEWSKI e WILKIE, 1978;
FACCIOTTI, 2001).
Os novos projetos de fermentação que vêm sendo desenvolvidos consideram
a cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e computacionais. Com
isto obtêm-se processos que reduzem gastos com mão-de-obra; aumentam a
produtividade; reduzem o tempo não produtivo como, carga, descarga e limpeza e
reduzem a utilização de insumos (TOSETTO, 2002).
1. 4. Biomassa
Os substratos comuns utilizados para a produção de etanol são açúcar e
amido provenientes de cultivos agrícolas, principalmente da cana-de-açúcar e milho,
respectivamente. No entanto, essas matérias-primas não são suficientes para suprir
a demanda internacional.
Nos últimos anos, a busca por novas fontes de biomassas renováveis para a
produção de biocombustíveis se intensificou diante da grande produção de matéria-
prima alimentícia destinada à produção de energia, gerando uma questão polêmica
frente a crescente demanda por alimentos. Além desse aspecto, ressalta-se a
ocupação de áreas agricultáveis para a produção de biomassa destinada à produção
de bioetanol e a vulnerabilidade desse processo relacionada às oscilações dos
custos da produção do açúcar podendo causar, em situações extremas, o
desabastecimento de biocombustível no país.
O bioetanol é o principal biocombustível utilizado no mundo e seu uso é cada
vez mais difundido. Quase toda a sua produção é feita pela fermentação de
carboidratos originados de beterraba, milho ou cana-de-açúcar, os quais
representam fonte de alimento humano (KHAMBHATY et al., 2012).
1. 4. 1. Biomassa de material lignocelulósico
Celulose, hemicelulose e lignina são os constituintes de materiais
lignocelulósicos. Esses componentes encontram-se complexamente associados os
quais definem a estrutura da parede celular da maioria dos vegetais. A composição
20
desses componentes varia de acordo com a natureza do vegetal, Em geral, o maior
componente é a celulose (35–50%), seguido da hemicelulose (20–35%) e lignina
(10–25%). Outros componentes como proteínas, gorduras e cinzas fazem parte de
uma fração do material lignocelulósico (ROCHA, 2010). As grandes interações entre
celulose, hemicelulose, lignina e a barreira natural de lignina (Figura 2) minimizam o
acesso das enzimas hidrolíticas à fração de carboidrato (KESHWANI, 2009).
Figura 2 – Esquema da estrutura da parede celular da maioria dos vegetais.
Fonte: www.scidacreview.org
O principal componente da fibra vegetal é a celulose, um homopolissacarídeo
linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações β-1,4- glicosídica
(Figura 3), com grau de polimerização que varia de 1000 até 50000 unidades,
dependendo da origem da planta (ROCHA, 2010). Na natureza, a celulose existe na
forma cristalina, sendo essa característica uma barreira para sua hidrólise
enzimática.
Figura 3 – Estrutura molecular da celulose.
21
O segundo polissacarídeo mais abundante na natureza é a hemicelulose, um
heteropolímero constituído de pentoses (xilose e arabinose), hexoses (glicose,
galactose e manose) e ácidos (acético, glicurônico e galacturônico) (SAHA, 2003).
Possui função de reserva e de sustentação e o seu grau de polimerização é
geralmente inferior a 200 unidades (TSAO, 1986). Diferentemente da estrutura da
celulose que é constante, a hemicelulose pode variar na composição e na sua
organização estrutural. Devido à interação entre os diferentes açúcares, a
hemicelulose apresenta baixa cristalinidade em relação à celulose sendo mais
facilmente hidrolisada (SAHA, 2003).
Em contraste com a celulose e a hemicelulose, a lignina é um polímero
complexo formado de compostos fenólicos, que são também chamados de
monolignóis. As ligações aleatórias carbono-carbono entre os monolignóis resultam
na formação de dímeros, trímeros e tetrâmeros que definem a estrutura complexa da
lignina (ROCHA, 2010). Essas ligações carbono-carbono são responsáveis pela
grande dificuldade de romper a cadeia de lignina.
Encontram-se ainda, nos materiais lignocelulósicos, compostos extrativos
(gorduras, gomas, alcaloides, resinas e óleos essenciais e outros constituintes do
citoplasma) e os compostos não extrativos (sílica, carbonato e oxalato) os quais
conferem características como cor, sabor, resistência ao apodrecimento e
propriedades abrasivas.
A associação das frações constituintes dos lignocelulósicos confere a estes,
grande resistência ao ataque de agentes químicos, enzimáticos ou microbianos.
Desta forma, é necessária a separação seletiva de cada uma das frações por
técnicas de pré-tratamento, hidrólise e deslignificação para que estas sejam
aproveitadas (ROCHA, 2010).
1. 4. 2. Biomassa algácea como matéria-prima para bioetanol
O desenvolvimento de combustíveis a partir de biomassa continua crescendo
em ritmo acelerado. Os biocombustíveis de primeira geração com base em culturas
alimentares levantam questões éticas e morais, uma vez que há pessoas ao redor
do mundo que ainda sofrem de desnutrição e fome (KARUNAKARAN E
GURUSAMY, 2011). Nesse contexto, micro e macroalgas têm sido investigadas por
22
pesquisadores do mundo inteiro como potenciais fontes alternativas e renováveis de
biomassa para a produção de bioetanol, o qual é denominado “combustível de
terceira geração” (NIGAM E SINGH, 2010). Certas espécies de algas possuem a
capacidade de produzir altos níveis de carboidratos em vez de lipídeos como
polímeros de reserva. As macroalgas podem ser cultivadas em cordas. Como a
eficiência fotossintética das algas é maior do que as das plantas terrestres, em
média 6-8% e 1,8-2,2% respectivamente, essas são capazes de acumular biomassa
em taxas mais rápidas (KARUNAKARAN E GURUSAMY, 2011).
As algas marinhas são matérias-primas promissoras para a produção de
bioetanol devido a sua taxa de crescimento rápida e a sua grande produção de
biomassa, com produtividade superior a muitas plantas terrestres, além de
apresentar vantagens, tais como: não competitividade com fontes alimentares;
apresentam alto conteúdo de açúcar, apresentam baixo conteúdo de lignina e
possuem alta produtividade (MEINITA E HONG, 2012).
O elevado rendimento em biomassa das macroalgas está atribuído a sua
menor exigência de energia para produção de tecidos de suporte comparado às
plantas terrestres. Além disso, possuem a capacidade de absorver nutrientes ao
longo de toda a sua área de superfície e não necessitam de energia para o
transporte de nutrientes internos. Muitas espécies de algas exibem uma maior
produtividade em massa (13,1 Kg de peso seco.m-2) ao longo de um período de sete
meses, quando comparadas as plantas terrestres que produzem 0,5 - 4,4 Kg de
peso seco.m-2 em um período de um ano (BORINES et al., 2011).
As macroalgas são divididas em três principais grupos com base em seus
pigmentos fotossintéticos: Chlorophyta. Rhodophyta e Phaeophyta que são as algas
verdes, vermelhas e pardas, respectivamente. Os pigmentos das algas são clorofilas
a e b. O principal produto fotossintético em algas verdes é o amido e as camadas
externa e interna da sua parede celular são constituídas de pectina e celulose,
respectivamente (TRONO JR E GANZON-FORTES, 1988). O pigmento das algas
vermelhas é r-ficoeritrina e sua parede celular contém pequenas quantidades de
celulose, enquanto a maioria é formada por um polímero gelatinoso ou amorfo de
galactana sulfatada, tais como ágar, carragenana, funorana, etc. Já a coloração das
algas pardas é devido a predominância do pigmento xantofila (fucoxantina) e sua
23
parede celular é composta de ácido algínico, celulose e outros polissacarídeos
(BORINES et al., 2011).
Além da alta produtividade em biomassa, as algas têm outras características
benéficas quando comparadas às plantas terrestres. A mais notável dessas
características é a ausência de materiais lignocelulósicos na parede celular das
algas, tornando-se, portanto, necessária a remoção desses materiais somente em
plantas terrestres. A estrutura das algas é, geralmente, muito mais uniforme e
consistente comparada com a das plantas terrestres, porque as algas apresentam
ausência de partes funcionais específicas, tais como raízes e folhas
(KARUNAKARAN E GURUSAMY, 2011).
As algas marinhas possuem altos níveis de compostos hidrocolóides, tais
como ágar, carragenana e alginato (MEINITA E HONG, 2012). Um hidrocolóide,
também conhecido como molécula, é uma substância não cristalina de estrutura
muito grande que se dissolve em água formando uma solução viscosa.
As algas marinhas vermelhas (Rodofíceas) são consideradas como a fonte
mais importante de muitos metabólitos biologicamente ativos, em comparação com
as outras classes de algas (GAMAL et al., 2010) e biossintetizam moléculas de alta
massa molecular, na sua maioria polissacarídeos contendo galactose (galactanas) e
denominados ficocolóides, que desempenham funções tecnológicas importantes
para diferentes indústrias como farmacêutica, química, alimentícia, etc. (VAN DE
VELDE et al., 2002).
As rodofíceas estão agrupadas em duas categorias: as Agarófitas, que são as
algas vermelhas que contêm ágar e as Carrageófitas, que são as algas vermelhas
que contêm carragenana. Esses compostos são amplamente empregados nas
indústrias alimentícias (fabricação de gelatinas, queijo, enlatados, doces e outros);
farmacêutica (laxativo, emulsificante e estabilizante para medicamentos); em
pesquisas laboratoriais (meio de cultura para plantas e microrganismos diversos, e
como meio de inclusão para cortes histológicos). Possuem também várias outras
aplicações, como na fabricação de moldes dentários, produtos cosméticos e papel.
O ágar e a carragenana são galactanas extraídas de diversos gêneros e
espécies de algas marinhas vermelha da classe Rodophyta. Os principais gêneros
utilizados comercialmente para extração dessas galactanas são Gelidium,
Pterocladia, Gracilaria, Gigartina, Hypnea, Euchema, Chondrus e Iridacea. O teor
24
desses polissacarídeos varia com as condições do mar (temperatura da água,
concentração de gás carbônico, intensidade de radiação solar) e com o ciclo de vida
desses organismos.
Segundo Meinita e Hong (2012), as carragenanas tornaram-se o nome
genérico para denominar os polissacarídeos extraídos de algas marinhas vermelhas
os quais contêm galactanas sulfatadas com interações alternadas consistindo de
α(1-4)-3,6-anidro-D-galactose e β(1-3)-D-galactose (Figura 4).
Figura 4 – Estrutura básica da carragenana com unidades D-alternantes.
Segundo Van de Velde et al. (2002); FURTADO (2004), a extração e
comercialização, a nível mundial, de carragenanas chegaram a movimentar cerca de
US$ 310 milhões no ano de 2000 com um crescimento anual de 3 a 4%. As
carragenanas mais comercializadas são (kappa), (iota) e (lambda). A diferença
estrutural entre a , e -carragenana está na quantidade e posicionamento de
grupos sulfatos que esterificam os carbonos das unidades A e B da cadeia principal
(Figura 5), de modo que a -carragenana possui 1 (C-4 da unidade A), a -
carragenana 2 (C-4 da unidade A e C-2 da unidade B) e a -carragenana 3 (C-2 da
unidade A e nos C-2 e 6 da unidade B) grupos sulfato (HOLANDA, 2007).
Figura 5 – Estruturas das carragenanas comerciais: (a) -carragenana, (b) -
carragenana e (c) -carragenana.
25
1. 5. Alga marinha vermelha Hypnea musciformis
O gênero Hypnea (Gigartinales, Rhodophyta) inclui cerca de 50 espécies
distribuídas em regiões de águas quentes (MASUDA et al. 1997). Para o Brasil, são
citadas seis espécies desse gênero: H. cenomyce J. Agardh; H. cornuta J. V.
Lamour.; H. musciformis (Wulfen in Jacqu.) J. V. Lamour.; H. nigrescens Greville ex
J. Agardh; H. spinella (C. Agardh) Kuetzing; e H. valentiae (Turner) Montagne
(SCHENKMAN 1986, NUNES 2005).
Dentre as espécies desse gênero, encontra-se a H. musciformis e segundo
Nunes (2005), a referida espécie possui ampla distribuição geográfica ao longo do
litoral brasileiro, ocorrendo desde o litoral do Rio Grande do Sul até o litoral do
Maranhão, podendo ser encontradas em áreas de infra e meso litoral, em rochas ou
como epífitas sobre outras espécies de algas. É uma espécie que suporta grandes
variações ambientais, apresentando tolerância à temperatura – 18 a 30 ºC e
salinidade – 20 a 50 ppt. (YOKOYA E OLIVEIRA 1992 a,b).
Fonte: algaebase
Divisão: Rhodophyta
Classe: Rhodophyceae
Ordem: Gigartinales
Família: Hypneaceae
Gênero: Hypnea
Espécie: Hypnea musciformis
As algas marinhas do gênero Hypnea possuem grande importância
econômica e devido a esse fato, diversos estudos, laboratoriais e em campo, foram
realizados a fim de estabelecer as melhores condições bioquímicas, fisiológicas e de
cultivo para as espécies de algas desse gênero. Estudos com a espécie de H.
musciformis foram realizados, em laboratório e no mar, para verificar as influências
de nitrogênio e fósforo, da profundidade e da sazonalidade no crescimento e no
conteúdo de carragenana presente na referida espécie de alga (SCHENKMAN,
1980). Relação entre o crescimento e os efeitos do nitrato, sazonalidade e oscilação
26
de temperatura para a referida espécie de alga foram investigados por Berchez e
Oliveira (1989). Reis et al. (2003) realizando estudos com a mesma espécie de alga
avaliaram os efeitos dos fatores bióticos no crescimento da referida alga.
Alga marinha vermelha H. musciformis é um importante recurso marinho
possuindo como constituinte preponderante da parede celular a -carragenana
(STANLEY, 1987), um polissacarídeo sulfatado muito utilizado nas indústrias
alimentícia e farmacêutica como agente gelificante, espessante e estabilizante.
Estudos com -carragenana extraído de H. musciformis mostraram que esse
polissacarídeo apresenta atividades antivirais (Neushul, 1990). Nagano et al (2002)
mostraram que lectinas extraídas de H. musciformis apresentaram atividades pró e
anti-inflamatórios. Macroalgas do gênero Hypnea também foram investigadas para a
produção de bioetanol como biocombustível de fonte renovável (KARUNAKARAN e
GURUSAMY, 2001).
Estudos para a produção de bioetanol a partir de outras espécies e gêneros
de macroalgas ainda encontram-se em grande fase de desenvolvimento. Adams e
Gallagher (2009) investigaram a macroalga Saccharina latissima para a produção de
bioetanol utilizando pré-tratamentos variáveis. A produção de bioetanol usando a
macroalga Euchema cottonii foi realizada por Candra et al. (2011). A macroalga
vermelha Kappaphycus alvarezii como uma fonte de bioetanol foi utilizada nos
estudos de Kambhaty et al. (2012). Ge et al. (2011) produziram etanol a partir de
resíduos da alga marinha parda Laminaria japonica provenientes da indústria de
extração de alginato.
A crescente demanda do mercado nacional de ficocolóides é suprida pela
importação de macroalgas, pela colheita em bancos naturais ou de algas arribadas
(OLIVEIRA, 1998; FURTADO, 1999). Em comunidades do litoral do nordeste
brasileiro, projetos estão sendo desenvolvidos a fim de orientá-las para o uso
racional desse recurso marinho, substituindo a atividade extrativista pela sustentável
– maricultura (CARVALHO FILHO, 2004; MIRANDA et al., 2004).
O cultivo de algas marinhas no litoral brasileiro vem sendo desenvolvido na
busca de suprir a grande demanda da indústria de carragenana. Um exemplo disso
é o desenvolvimento de um método de cultivo e colheita da alga marinha vermelha
exótica Kapppahycus alvarezii pela Empresa Produtora de Carragenana (Sete
Ondas Biomar), no estado do Rio de Janeiro. Essa espécie tem apresentado uma
27
grande fonte potencial de matéria-prima para a produção de produtos tanto de altos
valores agregados (Química fina) quanto os de baixos valores agregados
(biocombustíveis), isso se deve aos seus altos conteúdos de carragenanas e baixos
conteúdos de celulose na sua parede celular. Além disso, essa macroalga apresenta
uma elevada taxa de crescimento por hectare comparada com a da biomassa
terrestre (HARGREAVES et al., 2013). Apesar da Instrução Normativa do IBAMA, nº
185, que permite o cultivo comercial desta espécie entre a Baía de Sepetiba (RJ) e
na Ilha Bela (SP), ainda existem questionamentos sobre o impacto ambiental
ocasionado pelo cultivo de algas exóticas no litoral brasileiro.
1. 6. Pré-tratamento de matéria-prima para produção de etanol
A produção de biocombustíveis envolve a fermentação de açúcares por
microrganismos para produzir etanol. Como muitos açúcares não estão livremente
disponíveis, mas formam parte dos carboidratos estruturais e de armazenamento há
exigências por tratamentos, tais como: alteração na temperatura, pH e adição de
enzimas para hidrólise prévia dos açúcares antes da fermentação (Adam et al.,
2009).
O objetivo do pré-tratamento da matéria-prima para a produção de
biocombustíveis é a redução da cristalinidade da celulose e solubilização das
estruturas recalcitrantes da parede do vegetal. Diante disso, para que o processo de
obtenção de etanol seja um processo economicamente viável, torna-se necessária
uma seleção rigorosa do tipo de pré-tratamento a ser aplicado, uma vez que esta
etapa irá influenciar diretamente sobre os rendimentos de glicose durante a hidrólise
enzimática do material (ROCHA, 2010). Um eficiente pré-tratamento minimizará os
custos envolvidos na aquisição de enzimas, viabilizando o processo (ALZATE E
TORO, 2006; HAHN-HÄGERDAL et al., 2006).
O pré-tratamento propriamente dito deve ser muito eficiente em termos de
rendimento, seletividade, funcionalidade (garantindo acessibilidade da celulose aos
agentes hidrolíticos), simplicidade operacional, segurança e higiene industrial e
atributos ambientais, levando assim a reduzidos consumos de insumos químicos e
energia (ROCHA, 2010).
28
A figura 6 representa o esquema da ação do pré-tratamento aplicado a um
material lignocelulósico. Há uma desorganização na estrutura da biomassa
celulósica, beneficiando a ação das enzimas ou ácidos.
Figura 6 – Representação da ação do pré-tratamento aplicado a um material
lignocelulósico.
Fonte: (Moiser et al., 2005)
Atualmente, buscas por processos eficientes de hidrólise da biomassa de
açúcares fermentescíveis para a produção de etanol têm sido investigadas. Vários
métodos de pré-tratamentos de biomassa têm sido estudados e que podem ser
mecânicos, físicos, químicos, biológicos ou combinados.
O pré-tratamento mecânico da matéria-prima consiste na limpeza e na
desorganização do material, a fim de causar a destruição da sua estrutura celular e
torná-la mais acessíveis aos posteriores tratamentos químicos, físicos ou biológicos
(SILVA, 2010).
Explosão a vapor é um tipo de pré-tratamento físico sendo utilizado para
hidrolisar materiais lignocelulósicos. A biomassa é triturada e submetida ao vapor de
alta pressão e alta temperatura (160 – 240 ºC) por 20 minutos. Retirando-se a
pressão do sistema ocorre uma mudança brusca na temperatura com a finalidade de
causar uma ruptura nas ligações dos constituintes da parede celular dos vegetais
(celulose, hemicelulose e lignina). Para aumentar a eficiência do tratamento e
recuperação da hemicelulose pode-se adicionar SO2 ao sistema (TENGBORD et al.,
2001).
Termo-Hidrólise é também um pré-tratamento físico em que assemelha-se ao
tratamento de explosão a vapor. Enquanto na explosão a vapor utiliza-se vapor, no
termo-hidrólise é utilizada água quente pressurizada. Uma maior injeção de água
29
aumenta a solubilização do sistema. O grande consumo de água para a produção
dos hidrolisados torna esse pré-tratamento desvantajoso.
O pré-tratamento químico ácido-diluído tem por finalidade solubilizar a
hemicelulose dos materiais celulósicos e lignocelulósicos minimizando os custos
com a utilização de hemicelulases, além de promover a liberação de parte da glicose
presente na cadeia de celulose. É importante ressaltar a importância das variáveis
mais influentes nesse tipo de tratamento para atingir uma condição ótima no que diz
respeito à concentração do ácido, concentração do sólido e o tempo de pré-
tratamento. Os reagentes ácidos mais utilizados são os ácidos sulfúricos, clorídrico e
nítrico (diluídos ou concentrados). Variações na temperatura podem ocasionar
diferenciações nesse processo. A correção do pH faz-se necessária antes da
hidrólise e fermentação.
Outro tipo de pré-tratamento químico é o tratamento alcalino e seu uso
baseia-se na solubilização da lignina dos lignocelulósicos, entretanto a utilização de
álcalis como o hidróxido de sódio e outras bases apresentam desvantagens para
aplicação em potencial (ROCHA, 2010). Utilizando hidróxido de cálcio, nesse
processo, tem-se a elevação do pH o qual promove a solubilização da lignina, sendo
assim, uma alternativa de baixo custo. Esse tratamento pode ser realizado numa
ampla faixa de temperatura entre 25 – 130 ºC, durante horas ou até dias.
Dependendo da temperatura de trabalho, esse pré-tratamento remove
aproximadamente 33% da lignina (Rocha, 2010). Esse nível de remoção de lignina
em materiais que apresentam baixo conteúdo de lignina (gramas, algas) proporciona
elevada digestibilidade durante a hidrólise enzimática.
Segundo Rocha (2010), outra importante função dos álcalis após o pré-
tratamento dos lignocelulósicos é a possibilidade de remoção de inibidores formados
da degradação dos açúcares. Estes subprodutos incluem ácidos alifáticos,
furaldeídos e compostos fenólicos (furfural e hidroximetilfurfural) que estão contidos
no hidrolisado que posteriormente inibiriam o crescimento microbiano e a formação
de etanol durante a fermentação.
O pré-tratamento biológico resulta em parcial deslignificação da lignocelulose
usando microrganismos semelhantes a fungos e bactérias para degradar a lignina.
Durante o processo, estes microrganismos secretam enzimas extracelulares como
peroxidases e lacases que ajudam a remover uma quantidade considerável de
30
lignina da biomassa. O pré-tratamento biológico também pode ser usado combinado
com outros processos. Este pré-tratamento é bem menos severo não requerendo
ácidos, altas temperaturas e nem grandes tempos (36 horas) (SILVA, 2010).
O pré-tratamento organosolvente consiste na mistura aquosa de solvente
orgânico com catalisador ácido (HCl ou H2SO4), essa mistura tem a função de
quebrar a estrutura da lignina e hemicelulose. Os solventes orgânicos mais usados
são: metanol, etanol, acetona, etileno, glicerol, entre outros. Para reduzir os custos
esses solventes devem ser drenados do reator, evaporados, condensados e
reciclados. Essa remoção se faz necessária, pois os mesmos podem ser inibitórios
ao crescimento dos microrganismos na posterior fermentação (SILVA, 2010).
AFEX (Ammonia Fiber Explosion) é um pré-tratamento combinado onde utiliza
amônia para promover uma maior exposição da celulose pela modificação da
lignina, o qual facilita o ataque enzimático. Além disso, a amônia pode ser
recuperada e reciclada devido a sua elevada volatilidade. Uma desvantagem desse
processo está relacionada ao elevado custo da amônia.
O pré-tratamento explosão de CO2 assemelha-se ao AFEX, diferindo na
utilização do fluido. Enquanto o pré-tratamento AFEX utiliza amônia para promover a
exposição da celulose, a explosão de CO2 utiliza o CO2 ocorrendo a formação de
ácidos e ocasionando a hidrólise da celulose. O ponto positivo desse processo é o
baixo custo comparado ao AFEX.
1. 7. Hidrólise de matéria-prima para a produção de biocombustível
O bioetanol vem sendo produzido pela hidrólise e fermentação de materiais
lignocelulósicos desde o fim do século XIX, mas somente nos últimos 20 anos essa
tecnologia tem sido proposta para atender o mercado de combustíveis.
As tecnologias para a obtenção de bioetanol com base em materiais
lignocelulósicos envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares
fermentescíveis e sua posterior fermentação para a produção do bioetanol. Para
executar essa tarefa, a hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, com
base no uso de rotas ácidas e/ou enzimáticas para a separação dos açúcares e
remoção da lignina. Uma configuração genérica e simplificada do processo é
apresentada na Figura 7 (BNDES; CGEE, 2008).
31
Figura 7 – Esquema do processo de produção de etanol por meio da hidrólise da
biomassa.
Fonte: BNDES; CGEE, 2008
1. 7. 1. Hidrólise da biomassa
Há basicamente três técnicas empregadas para a obtenção de açúcares
fermentescíveis para a produção de etanol, tais como: hidrólise com ácido
concentrado, hidrólise com ácido diluído e hidrólise enzimática. A Tabela 1
apresenta uma comparação entre as condições e o desempenho dos três processos
básicos de hidrólise.
Tabela 1 – Esquema comparativo entre as condições e o desempenho dos três
processos básicos de hidrólise.
Processo Insumos Temperatura Tempo Sacarificação
Ácido diluído < 1% H2SO4 215 ºC 3 min 50-70%
Ácido concentrado 30-70% H2SO4 40 ºC 2-6 h 90%
Enzimático Celulase 70 ºC 1,5 dia 75-95%
1. 7. 1. 1. Hidrólise com ácido concentrado
Esse processo envolve a hidrólise da hemicelulose. Soluções aquosas de
ácidos fortes (sulfúrico, clorídrico e fosfórico) atuam na quebra da celulose e da
hemicelulose presentes na biomassa, em baixas temperaturas.
Tipicamente, a fração de hemicelulose é hidrolisada mais rapidamente que a
fração de celulose, e os monossacarídeos liberados da hemicelulose são expostos
32
no meio reacional por muito tempo, o que leva à degradação e perda desses
açúcares. A recuperação do ácido usado no processo é essencial por razões
econômicas e devido a problemas ambientais (RABELO, 2010).
1. 7. 1. 2. Hidrólise com ácido diluído
A celulose e a hemicelulose são hidrolisadas separadamente. A hemicelulose
hidrolisada pode ser removida após o primeiro passo da hidrólise. Desta forma, as
condições de hidrólise tanto para a hemicelulose quanto para a celulose podem ser
otimizadas. Porém, devido às altas temperaturas aplicadas no segundo passo
(aproximadamente 200°C), uma quantidade considerável de açúcares e lignina
solúvel é degradada, levando a uma inibição durante o processo de fermentação
(RABELO, 2010).
1. 7. 1. 3. Hidrólise enzimática
Nesse processo, a biomassa é pré-tratada a fim de favorecer o ataque da
enzima utilizada. Inicialmente, a hemicelulose é hidrolisada em um processo similar
ao que ocorre na hidrólise com ácido diluído. Já na etapa da hidrólise, propriamente
dita, as enzimas (celulases) promovem a quebra da celulose. Como as condições
são mais brandas, a quantidade de subprodutos liberada é menor e isso acarreta um
alto rendimento de açúcares fermentescíveis. Para uma maior conversão da
celulose, faz-se necessária altas concentrações de enzima aumentando o custo da
produção.
1. 8. Fermentação
No aspecto bioquímico, a fermentação alcoólica é realizada por leveduras e
outros microrganismos que fermentam a glicose para etanol e CO2. A glicose é
convertida a piruvato pela glicólise e o piruvato é convertido em etanol e CO2 em um
processo de duas etapas. Na primeira etapa, o piruvato é descarboxilado em uma
reação irreversível catalisada pela enzima piruvato descarboxilase. Esta reação é
uma descarboxilação simples e não envolvem a oxidação do piruvato. A enzima
33
descarboxilase piruvato requer Mg2+ e tem como coenzima pirofosfato de tiamina.
Na segunda etapa, o acetaldeído é reduzido a etanol através da ação da enzima
álcool desidrogenase, com o poder redutor fornecidos pelo NADH derivados da
desidrogenação do gliceraldeído 3-fosfato (ROCHA, 2010).
Figura 8 – Via da fermentação alcóolica, onde a glicose é convertida a piruvato e
este convertido a etanol e CO2.
Fonte: www.sobiologia.com
Segundo Tosetto (2002), as leveduras são organismos eucarióticos e formam
uma das classes mais importantes dos fungos. As células de Saccharomyces
cerevisiae apresentam-se normalmente na forma unicelular e com 2 a 8 micrômetros
de diâmetro. Estas se reproduzem basicamente por brotamento, onde a célula mãe,
após um período de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula.
A levedura realiza a fermentação do açúcar objetivando obter energia
necessária para a sua sobrevivência, resultando, desse processo metabólico, um
subproduto, o etanol. Pesquisadores têm buscado novas técnicas para aumentar a
eficiência das leveduras na produção do etanol.
Durante o pré-tratamento empregado na hidrólise, há formação de uma série
de compostos que podem atuar como interferentes tanto no processo de hidrólise
quanto no processo de fermentação. Esses compostos e suas concentrações nos
hidrolisados vão depender do tipo de matéria-prima e das condições empregadas no
pré-tratamento. Os inibidores potenciais da fermentação encontram-se agrupados
34
em três categorias que são (1) os derivados fenólicos; (2) os ácidos orgânicos
fracos, como o ácido acético e (3) os derivados furânicos que são o Furfural e o 5-
Hidroximetilfurfural - HMF (SANTOS E GOUVEIA, 2009).
35
2. OBJETIVOS
2. 1. Geral
O presente trabalho objetivou avaliar o potencial fermentativo dos
polissacarídeos da macroalga marinha vermelha Hypnea musciformis visando a
produção de bioetanol.
2. 2. Específicos
Realizar hidrólise da alga marinha vermelha H. musciformis em condições
ácidas;
Determinar o rendimento de hidrólise ácida;
Determinar a composição monossacarídica dos hidrolisados da alga H.
musciformis por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
Determinar o teor de açúcares redutores dos hidrolisados da alga H.
musciformis;
Avaliar o potencial fermentescível dos hidrolisados da alga H. musciformis;
Produzir etanol a partir dos hidrolisados da alga H. musciformis por
Saccharomyces cerevisiae.
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Coleta das algas marinhas
As algas marinhas vermelhas da espécie H. musciformis (Wulfen) J. V
Lamouroux (Rhodophyta, Gigartinales, Hypneacea) foram colhidas em cordas de
cultivo localizadas a aproximadamente 200 metros da costa, na praia de Flecheiras
(03º13´06´´S - 39º16´47´´W), município de Trairi, estado do Ceará, Brasil. A coleta
foi realizada com ajuda de um membro da Associação de Produtores de Algas de
Flecheiras e Guajiru (APAFG), a qual mantém parceria com o Laboratório de
Carboidratos e Lectinas (CARBOLEC) do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, da Universidade Federal do Ceará.
Após coletadas, as algas foram lavadas, secas ao sol e transportadas ao
laboratório, onde foram trituradas com auxílio de liquidificador.
Figura 9 – Localização da área de cultivo de algas, praia de Flecheiras – Ceará –
Brasil.
37
3.2. Análise centesimal da alga H. musciformis
3. 2. 1. Umidade
O teor de umidade foi determinado em estufa a 105 oC por 24h. Sendo
calculado pela diferença entre os pesos inicial e final das amostras, valor expresso
em percentagem (NAGAKURA, 1972).
3. 2. 2. Proteínas totais
Para determinação da proteína total a análise foi realizada através do método
semi-micro Kjeldahl (PEARSON, 1973), utilizando-se o fator de 6,25 para conversão
do nitrogênio total em proteína bruta.
3. 2. 3. Lipídeos totais
O teor de lipídeos foi quantificado pelo método de Soxhlet, por um período de
quatro horas, utilizando etanol como solvente de extração. Para o cálculo do teor de
lipídeos totais foi baseado na equação 01.
(01)
3. 2. 4. Cinzas totais
A determinação de cinzas corresponde ao teor de minerais contidos na
amostra. 0,5 g de alga seca foi colocada em estufa a 60 ºC por 24 h. As amostras
foram pesadas em cadinhos de porcelana seco, limpos e em seguida armazenadas
em dessecador. Em seguida, as amostras foram incineradas em mufla a 550 ºC por
4 h.
38
3. 2. 5. Carboidratos totais
O conteúdo de carboidratos totais foi determinado por diferença entre,
somando-se os teores de umidade, proteínas totais, lipídeos totais e cinzas totais.
3. 2. 6. Celulose
De acordo com o que foi descrito por Ge et al. (2011), o conteúdo de celulose
foi determinado através de duas etapas de hidrólise ácida. A primeira etapa foi
realizada a 4 ºC por 120 min contendo 3 mL de H2SO4 (72%) em 0,3g de alga seca.
Após esse tempo, adicionou-se 84 mL de deionizada e a segunda etapa foi realizada
a 121 ºC por 60 min. A solução foi filtrada, e o hidrolisado líquido foi analisado, por
CLAE, para o seu conteúdo monossacarídico. O cálculo para o teor de celulose foi
baseado na equação 02.
(02)
3. 3. Hidrólise ácida da alga H. musciformis
Pesou-se 5 g da alga seca de H. musciformis em balança analítica modelo
AND – HR – 200 (max 210 g; d = 0,1 mg), os quais foram colocados em erlenmeyer
de 250 mL. Em seguida, foram adicionados 100 mL de HCl nas concentrações de
0,0; 0,2; 0,5 e 1,0 M. As soluções foram autoclavadas a temperatura de 121 °C por
10, 20 e 30 minutos (Figura 10), gerando, portanto, 12 condições de hidrólise
denominadas segundo a Tabela 2.
39
Figura 10 – Esquema da hidrólise ácida da alga marinha H. musciformis
Tabela 2 - Denominações das condições de hidrólise da alga H. musciformis em
função da concentração de HCl e tempo de reação.
Tempo de reação (min)
HCl (M)
10 20 30
0,0 0,0/10 0,0/20 0,0/30
0,2 0,2/10 0,2/20 0,2/30
0,5 0,5/10 0,5/20 0,5/30
1,0 1,0/10 1,0/20 1,0/30
Após resfriamento a temperatura ambiente, os homogenatos foram filtrados
em tecido nylon. Os resíduos foram secos em estufa a 40 °C e as fases líquidas,
denominadas hidrolisados (Figura 11), foram armazenadas a 4 °C para posteriores
dosagens dos teores dos açúcares redutores, glicose, galactose e fermentação para
a produção de bioetanol.
20 min 30 min
121 °C
40
Figura 11 - Hidrolisado ácido da alga H. musciformis autoclavada a 121 ºC por 10;
20 e 30 min, na concentração 0,5M de HCl.
Fonte: autoria própria
3. 4. Ajuste do pH dos hidrolisados da alga H. musciformis
O pH dos hidrolisados foi ajustado para 5,0 com a adição de Ca(OH)2
(Hidróxido de cálcio) sob agitação constante, utilizando-se um pHmetro Tecnal (Tec -
3MP). Após o ajuste do pH, as soluções foram filtradas em duas etapas: a primeira
em tecido nylon e a segunda em papel de filtro.
3. 5. Análise de açúcar redutor
Os teores de açúcares redutores dos hidrolisados foram determinados pelo
método de Somogy-Nelson (1944), tendo a galactose como curva-padrão. As
absorbâncias foram medidas em espectrofotômetro a 540 nm.
3. 6. Eficiência da hidrólise ácida
Os resíduos obtidos após a filtração dos hidrolisados ácidos da alga foram
mantidos em estufa de secagem a 105 ± 1 °C, em cadinhos de porcelana até a
obtenção de peso constante dos mesmos. A eficiência da hidrólise ácida foi
41
determinada com base nas massas inicial e residual da alga seca antes e depois da
hidrólise, respectivamente, segundo a Equação 03.
(03)
Onde:
EH = Rendimento de hidrólise
mi = Massa inicial de alga seca
mR = Massa do resíduo de alga após hidrólise
3. 7. Microrganismos e manutenção das culturas de células
Para os testes fermentativos foi utilizada a levedura Saccharomyces
cerevisiae proveniente de uma levedura comercial de panificação. As cepas foras
mantidas em meio sólido de crescimento Saboraud, da marca HIMEDIA, à
temperatura ambiente.
3. 8. Preparo do inóculo
O inóculo foi preparado através da transferência de três colônias da levedura
S. cerevisiae cultivada em meio Ágar-Saboraud para erlenmeyers de 250 mL
contendo 50 mL de caldo Saboraud estéril composto por glicose (40 g.L-1) e peptona
(10 g.L-1). Os erlenmeyers foram incubados por 24 horas à temperatura e agitação
constantes (30 ºC e 130 rpm, respectivamente) até a obtenção de uma leitura de
densidade ótica (D.O) de 1,0 a 630 nm.
3. 9. Fermentação do hidrolisado ácido
Com base nos teores de açúcar redutor e no rendimento de hidrólise das
condições testadas, a condição 0,5/20 reuniu os maiores teores de galactose e
glucose. Assim, ela foi selecionada para o ensaio de fermentação alcoólica
utilizando a levedura S. cerevisiae.
42
Para o ensaio fermentativo, 10 mL do inóculo foram transferidos,
assepticamente, para erlenmeyers (250 mL) contendo 90 mL do hidrolisado ácido
0,5/20 da alga marinha H. musciformis, com pH previamente ajustado para 5,0 com
Ca(OH)2. O experimento foi realizado em triplicata e a fermentação conduzida sob
temperatura e agitação constantes à 30 °C e 130 rpm, respectivamente, por 52
horas. Alíquotas de 2 mL foram coletadas, assepticamente, em intervalos de 2 horas
para determinação da D.O. a 630 nm. Em seguida, elas foram centrifugadas à 4 ºC,
14.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi reservado para determinação dos
teores de glucose, galactose e etanol por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) com a finalidade de acompanhar a cinética do processo fermentativo.
3. 10. Determinação da composição em monossacarídeos e em etanol nos
hidrolisados
As análises dos teores de galactose, glicose e etanol foram realizadas na
Central Analítica do Laboratório de Bioengenharia do Departamento de Engenharia
Química da Universidade Federal do Ceará.
Os carboidratos (glucose e galactose) gerados pelos processos de hidrólise e
o etanol proveniente da fermentação foram determinados através de Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) usando o sistema Waters CLAE (Waters, Milford,
MA, USA) equipado com detector de índice refrativo Waters 2414 e coluna Aminex
HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). O eluente utilizado foi ácido sulfúrico em
água MiliQ (Simplicity 185, Millipore, Billeria, MA) 5 mM a uma taxa de fluxo 0,5 mL
min-1 a 65 ºC e tempo de corrida de 30 minutos. Os interferentes (ou inibidores) da
fermentação formados durante a hidrólise ácida também foram analisados por CLAE
com um tempo de corrida de 55 min.
Os açúcares e etanol foram identificados comparando-se os seus tempos de
retenção com os tempos de retenção dos padrões: glucose e etanol, ressaltando
que a coluna utilizada nesse experimento não é capaz de separar os
monossacarídeos galactose, xilose e arabinose. No entanto, como já é sabido que a
alga marinha H. musciformis, utilizada nesse trabalho, possui como polissacarídeo
majoritário galactana sulfatada considerou-se as concentrações de arabinose e
xilose desprezíveis. Com relação a determinação dos inibidores a comparação com
43
os tempos de retenção padrão foram para furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético
e ácido fórmico.
3. 11. Parâmetros cinéticos
As cinéticas das utilizações dos substratos (glicose e galactose), produção de
biomassa e etanol formado foram analisadas durante a fermentação alcoólica do
hidrolisado 0,5/20. Os parâmetros cinéticos velocidades específicas de crescimento
celular (µX); do consumo de substratos (µS1 para glucose e µS2 para galactose),
formação de etanol (µP) foram calculados segundo as equações de 04 – 07,
respectivamente:
(04)
(05)
(06)
(07)
Onde:
X = concentração de célula (g.L-1);
S1 = concentração de glucose (g.L-1);
S2 = concentração de galactose (g.L-1);
P = concentração de etanol (g.L-1).
Já os fatores de conversão de substrato (glicose + galactose) em biomassa
(YX/S) e em etanol (YP/S) e formação de etanol por biomassa (YP/X) foram estimados
segundo as equações 8 – 10, respectivamente:
(08)
(09)
44
(10)
As produtividades em biomassa e etanol foram estimadas segundo as
equações 11 e 12, respectivamente.
(11)
(12)
Onde:
Xm = concentração de célula máxima (g.L-1).
X0 = concentração de célula inicial (g.L-1).
X = concentração de célula final (g.L-1).
Pm = concentração de etanol máxima (g.L-1).
P0 = concentração de etanol inicial (g.L-1).
S = concentração de substrato final (g.L-1).
S0 = concentração de substrato inicial (g.L-1).
tf = tempo final (h).
3. 12. Planejamento experimental e análise estatística
Os resultados obtidos na hidrólise da alga marinha H. musciformis foram
analisados no software STATISTICA versão 7.0, a fim de estimar os efeitos das
variáveis e suas interações sobre a resposta analisada em relação aos açúcares
(glucose e galactose) gerados nos hidrolisados. A Análise de variância (ANOVA) foi
aplicada para verificar a diferença significativa ao nível de 85%.
Um Planejamento Fatorial de 22, com dois pontos centrais, foi realizado a fim
de avaliar se a concentração do ácido clorídrico (0,2; 0,5 e 1,0 M) e o tempo (10, 20
e 30 min) de hidrólise influenciaram nas concentrações dos açúcares glucose e
galactose (variáveis respostas) segundo os níveis apresentados na Tabela 3.
45
Tabela 3 – Valores e níveis das variáveis do Planejamento fatorial 22 levando em
consideração a concentração do ácido e o tempo, dos hidrolisados da alga H.
musciformis, na concentração dos açúcares (glucose e galactose) obtidos.
Variáveis Níveis
+1 0 -1
Concentração do ácido (M)
0,2 0,5 1,0
Tempo (min) 10 20 30
Outro software, Prisma versão 4.0, foi utilizado para avaliar se a concentração
do ácido, no mesmo intervalo de tempo, influenciou de forma significativa na
eficiência da hidrólise e nos teores de açúcares redutores. E para verificar se houve
diferença significativa foi aplicado o teste estatístico de Bonferroni ao nível de
confiança de 95% (p<0,05).
46
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4. 1. Composição centesimal da alga H. musciformis
Os teores de umidade, proteínas, cinzas, lipídeos, carboidratos totais e
carragenana da alga utilizada nesse experimento estão listados na Tabela 4.
Tabela 4 - Composição centesimal da alga H. musciformis.
Referências Espécie estudada
Umidade Proteínas Cinzas Lipídeos
Carboidratos totais
Sulfato Celulose/
amido Galactana
Presente trabalho
Hypnea musciformis
12,1 14,6 12,6 1, 3 11,4 48,0 20,2
KIM et al. 2011
Gelidium amansii
- 13,1 8,6 1,1 77,2
KHAMBHATY et al. 2012
Kappaphycus alvarezii
13,4 - - - 12,66 51,0 11,75
SAITO e OLIVEIRA,
1990
Hypnea musciformis
- - - - - 28,3 18,85
PARK et al. 2012
Gelidium amansii
- - - - 14,9 52,4 -
ARMAN E QUADER,
2012
Hypnea musciformis
10,8 - 15,3 - - - -
WI et al. 2009 Gelidium amansii
- - - - 53,4 -
A alga seca ao sol apresentou um teor de umidade de 12,1 %, proteínas
14,6%, cinzas 12,6%, lipídeos 1,3% e carboidratos totais de 59,4%, sendo 11,4% de
amido/celulose e 48% de carragenana. Tais resultados se mostraram semelhantes
aos obtidos por Kim et al. (2011), quando analisaram a composição química de uma
outra espécie de alga marinha vermelha (Gelidium amansii) a qual apresentou
13,1% de proteínas, 8,6 % de cinzas 1,1% de lipídeos e 77,2% de carboidratos.
Diante desses resultados foi possível observar que os carboidratos totais
representaram a maior porção dos componentes químicos dessas espécies de algas
marinhas vermelhas e que dentre esses carboidratos totais, que incluem
47
polissacarídeos de reserva (amido) e estruturais (celulose e galactanas sulfatadas),
a maior porção se refere às galactanas sulfatadas (agaranas e/ou carragenanas)
como também observado por Khambhaty et al., (2012) para a alga Kappaphycus
alvarezii, cujos teores foram 51,0% de -carragenana e 12,6% de fibras. Resultados
semelhantes também foram obtidos por Park et al. (2012) em seus estudos sobre a
hidrólise ácida (H2SO4 2,0%) de 190 kg da alga G. amansii com o objetivo de avaliar
seu potencial como fonte promissora de carboidratos para produção de bioetanol
obtiveram 67,3% de carboidratos totais sendo 14,9% de celulose e 52,4% de ágar.
Já o teor de sulfato obtido no presente estudo está de acordo com Saito e Oliveira
(1990) que avaliando a composição química dos carboidratos sintetizados por
espécies de algas marinhas abundantes no litoral brasileiro, através da análise do
espectro de Infra-Vermelho, sugeriram que a espécie H. musciformis coletada nos
litorais de Itamaracá (PE), João Pessoa (PB), Recife (PE), Santa Cruz (ES) e
Ubatuba (SP) sintetizava provavelmente k-carragenana, apresentando teores de 3,6-
anidro-galactose e sulfato que variaram de 25,2 - 31,4 % e 17,6 - 20,1%,
respectivamente. De acordo com Arman e Quader (2012), analisando as galactanas
presentes no extrato bruto de H. musciformis sugeriram que as estruturas químicas
desses polissacarídeos correspondiam a -carragenana como carboidrato
majoritário, porém com pequenas porções de e -carragenanas. Uma análise mais
cuidadosa através do espectro de Infra-veremlho desse extrato mostraram fortes
bandas características de galactose-4-sulfato a 846,95 cm-1; 3,6-anidrogalactose a
928,92 cm-1 e sulfato a 1221,25 cm-1. Tais resultados corroboram para um teor mais
elevado de sulfato para o carboidrato de H. musciformis quando comparado com o
carboidrato de K. alvarezii, espécie de alga que também sintetiza -carraagenana e
que mostrou um teor de sulfato de 11,75% (KHAMBHATY et al., 2012).
Vale ressaltar que o elevado teor de carboidrato determinado para H.
musciformis também foi observado por Wi et al. (2009) que analisando a
composição química da alga marinha vermelha G. amansii obtiveram 53,4% de
carboidrato total, salientando-se o fato das algas marinhas possuírem quantidades
muito pequenas de lignina solúvel e não solúvel em ácido (3,2±0,3 % e 1,5±0,6%,
respectivamente), o que torna o processo de obtenção de bioetanol mais simples por
não promover a formação de carboidratos não fermentescíveis, além de compostos
furânicos que são inibidores do processo fermentativo.
48
Ge et al. (2011) analisando o resíduo celulósico obtido a partir da extração de
alginato da alga Laminaria japonica, como fonte de carboidratos fermentescíveis
para produção de bioetanol, não encontraram teores de hemicelulose e lignina.
4. 2. Eficiência de hidrólise da alga H. musciformis em função da concentração
de HCl e tempo de reação.
As eficiências das diferentes condições de hidrólise da alga marinha H.
musciformis são mostrados na Figura 12. Foi possível observar que a menor
concentração de HCl utilizada associada ao menor tempo de hidrólise foi capaz de
solubilizar a estrutura algal, apresentando eficiência de 62,5%. Aumentos na
concentração do ácido, bem como no tempo não resultaram em aumentos
proporcionais no rendimento de hidrólise, no entanto a condição mais drástica de
hidrólise (1,0/30) mostrou eficiência de 71,9%. Já a média geral de eficiência foi de
72,2%.
Figura 12 - Eficiência de hidrólise da alga H. musciformis com base na massa seca
em função da concentração de HCl e tempo de reação.
De acordo com o teste estatístico de Bonferroni foram verificadas diferenças
significativas (p<0,05) apenas nas condições 0,2/10 e 0,5/10, sugerindo que o tempo
49
e as concentrações de HCl testadas não mostraram influência na eficiência de
hidrólise, porém a condição 0,5/30 foi capaz de solubilizar 78,7% da estrutura algal.
4. 3. Açúcares redutores dos hidrolisados da alga H. musciformis
A Tabela 5 mostra os teores totais de açúcares redutores determinados nos
hidrolisados da alga marinha H. musciformis, bem como a quantidade de açúcares
redutores perdidos nos resíduos úmidos obtidos após filtração dos hidrolisados. O
menor e o maior teores de açúcares redutores totais obtidos nos hidrolisados da
alga H. musciformis foram 1,33 e 2,31 g para 0,2/10 e 1,0/30, respectivamente.
Observou-se ainda que as maiores concentrações de açúcares redutores (1,60; 2,00
e 2,31 g) e os maiores volumes recuperados (74, 78 e 84 mL) foram gerados nos
hidrolisados com 1,0 M de HCl (1,0/10; 1,0/20 e 1,0/30). Já as maiores perdas de
açúcares redutores (0,67; 0,79 e 0,81 g) foram observadas para os hidrolisados
submetidos a um maior tempo de reação (0,2/30; 0,5/30 e 1,0/30) chegando a
representar (26,07; 27,00; 25,97%) dos açúcares redutores totais. Esses resultados
sugerem a necessidade de uma metodologia de filtração mais eficiente que reduza
as perdas de açúcares redutores no resíduo úmido.
Khambhaty et al. (2012) analisando a produção de bioetanol a partir do
resíduo da alga K. alvarezii, obtido após extração do extrato algal (biofertilizante),
verificaram um rendimento de sacarificação de 26,2% em escala laboratorial
utilizando H2SO4 0,9 M. Verificaram ainda perdas de 16,1% de açúcares redutores
no resíduo úmido para escala laboratorial.
50
Tabela 5 – Teores de açúcares redutores obtidos nos hidrolisados e perdidos nos
resíduos úmidos da alga H. musciformis
Hidrolisados
Volumes
totais dos
hidrolisados
recuperados
(mL)
Concentrações
de açúcares
redutores (g.L-
1) e quantidade
absoluta (g)
Açúcares
redutores
perdidos no
resíduo (g)
Açúcares
redutores
perdidos no
resíduo úmido
(%)
0,2/10 72 1,85(1,33) 0,52 28,11
0,5/10 74 2,25(1,67) 0,58 25,78
1,0/10 78 2,05(1,60) 0,45 21,95
0,2/20 73 2,15(1,57) 0,58 26,98
0,5/20 72 2,44(1,76) 0,68 27,87
1,0/20 84 2,38(2,00) 0,38 15,97
0,2/30 74 2,57(1,90) 0,67 26,07
0,5/30 72 2,83(2,04) 0,79 27,92
1,0/30 74 3,12(2,31) 0,81 25,97
Os teores de açúcares redutores dos nove hidrolisados da alga marinha H.
musciformis são apresentados na Figura 13. Foi possível observar que dentre as
condições de hidrólise testadas a maior concentração do ácido (1,0 M) foi capaz de
gerar teores de açúcares redutores variando de 20,5 a 31,3 g.L-1. A condição de
hidrólise ácida mais branda (0,2 M), gerou teores de açúcares redutores variando de
18,5 a 25,7 g.L-1. Já a condição de hidrólise ácida intermediária (0,5 M) apresentou
teores de açúcares redutores variando de 22,5 a 28,4 g.L-1. O tempo de hidrólise não
influenciou na formação desses açúcares redutores não apresentando diferença
significativa entre as médias dos teores de açúcares redutores (p<0,05) dos
hidrolisados em diferentes concentrações de ácido no mesmo tempo de reação.
Porém, foram observadas diferenças significativas (p<0,05 e p<0,01) entre os teores
de açúcares redutores dos hidrolisados 0,2/10 - 0,5/30; 0,5/10 - 1,0/30; 1,0/10 -
0,5/30 e 0,2/10 - 1,0/30; 1,0/10 - 1,0/30, respectivamente.
No presente trabalho, o rendimento médio dos açúcares redutores nos
hidrolisados com base na alga seca foi de 54,8%. Resultado inferior de rendimento
de açúcares redutores (21,1%) foi observado por Meinita et al. (2012) quando
51
avaliaram o efeito da concentração de K. alvarezii sobre a produção de açúcares
redutores utilizando HCl como catalisador da hidrólise, onde foi verificado a
formação máxima de 25,32 g.L-1 de açúcares redutores a uma concentração de 12%
de alga, a 0,2 M de HCl a 130 ºC por 15 min.
Khambhaty et al. (2012) obtiveram, no final do quinto ciclo de re-extração da
alga K. alvarezii, 65,6 g de açúcares redutores, isso levando em consideração a
perda de açúcares redutores total no resíduo (11,6 g).
Estes resultados sugerem que as condições mais drásticas de hidrólise
promoveram uma diminuição nos teores de açúcares redutores através da
desidratação dos monossacarídeos e consequente formação de compostos
furânicos (SANCHEZ, 1988).
Figura 13 – Teores de açúcares redutores dos hidrolisados da alga H. musciformis.
4. 4. Teores de carboidratos (dissacarídeos e manossacarídeos) dos
hidrolisados da alga H. musciformis.
Os teores dos monossacarídeos (glucose e galactose) dos hidrolisados estão
apresentados na Figura 14. Foi possível observar em todos os hidrolisados a
presença de glucose e galactose em concentrações que variaram de 3,4 – 4,7 e 7,4
– 10,8 g.L-1, respectivamente. A condição de hidrólise 1,0/20 apresentou os maiores
teores de glucose e galactose (15,5 g.L-1) representando um rendimento de 31%
52
com base na massa seca da alga. No entanto, a condição selecionada para o
experimento de fermentação (0,5/20) apresentou um teor de monossacarídeos
(glicose e galactose) de 14,8 g.L-1, que apesar das condições de hidrólise mais
brandas, apresentou um rendimento (29,6%,) semelhante ao obtido para o
hidrolisado 1,0/20. Já os maiores rendimentos de monossacarídeos solúveis obtidos
por Kim et al. (2011) para a alga G. amansii hidrolisada em concentrações molares
de ácido HCl 0,1 M e H2SO4 0,2 M foram de 11,6 e 9,8%, respectivamente.
Os resultados obtidos nesse trabalho também foram superiores aos relatados
por Meinita et al. (2012) quando realizaram a hidrólise ácida de 10% (m/v) da alga
Kappaphycus alvarezii em solução ácida de HCl 0,2 M a 130 ºC por 15 min e
obtiveram teores de monossacarídeos de 13,5 g.L-1 , representando um rendimento
de 13,5%. Ge et al. (2011), utilizando pré-tratamento ácido do resíduo celulósico de
L. japonica proveniente da extração de alginato, obtiveram o rendimento máximo de
27,8% de glicose com base na massa do resíduo para a condição de hidrólise
H2SO4 0,1%; 121 ºC; 1 h.
Figura 14 – Teores de carboidratos (dissacarídeos e monossacarídeos) dos
hidrolisados ácidos da alga H. musciformis.
Vale ressaltar que quando a alga H. musciformis foi submetida as mesmas
condições de hidrólise (121 ºC por 10, 20 e 30 min) na ausência do HCl foi verificada
gelificação do meio (Figura 15), resultado característico da solubilização da
53
carragenana e evidente manutenção da integridade molecular desse polissacarídeo,
inviabilizando a determinação dos teores de carboidratos.
Figura 15 – Gelificação da solução da alga H. musciformis submetida a
autoclavagem a 121 ºC por 10, 20 e 30 min na ausência de HCl.
Fonte: autoria própria
4. 5. Influência da concentração do ácido e do tempo de reação na obtenção de
glucose e galactose nos hidrolisados da alga H. musciformis
A metodologia de análise de superfícies de respostas pode ser executada
para otimização do experimento. Neste sentido, otimizar significa encontrar os
valores das variáveis (concentração do ácido e tempo de reação) que irão produzir a
melhor resposta desejada (maior concentração de glucose e galactose), isto é,
encontrar a região ótima na superfície definida pelos fatores. A metodologia de
superfície de resposta baseia-se na construção de modelos matemáticos empíricos
que geralmente empregam funções polinomiais lineares ou quadráticas para
descrever o sistema estudado e, consequentemente, dão condições de explorar
(modelar e deslocar) o sistema até a sua otimização. Um planejamento experimental
construído para estimar coeficientes, segundo algum modelo aproximado, reúne
certos critérios desejáveis, sendo os principais: proporcionar boas estimativas para
todos os coeficientes, exigindo poucos experimentos além de fornecer condições de
avaliação dos coeficientes e do modelo, ou seja, da regressão e da falta de ajuste.
54
Planejamentos fatoriais de dois níveis, completos ou fracionários, podem estimar
apenas efeitos principais e interações (TEÓFILO E FERREIRA, 2006).
A Tabela 6 apresenta as concentrações de glucose e galactose obtidas nos
hidrolisados da alga H. musciformis, considerando as variáveis concentração do
ácido clorídrico e tempo de reação.
Tabela 6 – Concentrações e tempos de reação de glucose e galactose dos
hidrolisados da alga H. musciformis obtidos através da CLAE e de acordo com o
planejamento experimental.
GLUCOSE GALACTOSE
Concentração
do ácido (M)
Tempo
(min)
Concentração
(g.L-1)
Concentração
do ácido (M)
Tempo
(min)
Concentração
(g.L-1)
0,2 10 3,17 0,2 10 7,25 1 10 4,31 1 10 10,84
0,2 30 4,07 0,2 30 8,89 1 30 4,38 1 30 9,98
0,5 20 4,36 0,5 20 10,23 0,5 20 4,62 0,5 20 10,72
Os gráficos de Pareto (Figuras 16 e 17) mostram os efeitos padronizados de
cada variável independente (concentração de HCl e tempo de reação), bem como os
de suas interações sobre a variável dependente (concentração de glucose e
galactose) nos hidrolisados de H. musciformis permitindo visualizá-los grafica e
numericamente. Nestes gráficos, os efeitos são representados por barras e quando
elas ultrapassam o valor de p = 0,15 conclui-se que as variáveis independentes
apresentaram efeito significativo estatisticamente com um nível de confiança de 85%
sobre a variável resposta analisada.
De acordo com a Figura 15 observou-se que nenhuma das variáveis
independentes (concentração de HCl e tempo de reação) foi significativa (p>0,15),
na faixa de valores estudados, para incrementar a concentração de glucose formada
nos hidrolisados da alga H. musciformis. No entanto, essas variáveis apresentaram
efeitos positivos (3,448 e 2,638, respectivamente) na formação de glucose, exceto a
interação entre elas (concentração do ácido:tempo) que apresentou um efeito
negativo (-2,257).
55
Figura 16 – Gráfico de Pareto para a concentração de glucose como variável
resposta.
Já a concentração de galactose foi influenciada pela concentração do ácido,
apresentando um efeito significativo (p<0,15) e positivo (6,096) na faixa estudada, ou
seja, quanto maior a concentração de HCl maior foi a concentração de galactose
formada nos hidrolisados da alga H. musciformis. Semelhante ao observado para
glucose, o tempo de reação também não apresentou influência sobre a formação de
galactose (1,126), bem como a interação entre as variáveis independentes a qual
mostrou efeito negativo (-3,607) sobre a formação desse monossacarídeo.
56
Figura 17 – Gráfico de Pareto para a concentração galactose como variável
resposta.
Segundo Teófilo e Ferreira (2006) o modelo obtido a partir desse
planejamento experimental pode não ser exatamente aquele que descreve a região
estudada do sistema e, neste caso, não pode ser usado para fazer estimativas para
deslocamento e muito menos para extrair conclusões sobre a região ótima. A
maneira mais confiável de se avaliar a qualidade do ajuste do modelo é empregando
a Análise de variância (ANOVA). Através das Análises de variância (ANOVA) é
possível observar os valores dos desvios quadráticos provocados em cada variável
(Soma quadrática – SQ) e seus graus de liberdade correspondentes (GL). A partir
desses parâmetros são calculadas as médias quadráticas (MQ), que divididas pelos
erros puros experimentais, permitem a determinação dos parâmetros F e,
subsequentemente, do p-valores, utilizados na verificação da hipótese nula. Altos
valores dos parâmetros SQ, MQ e F, geradores dos p-valores <0,15, indicam uma
influência significativa das variáveis independentes sobre a variável resposta.
As Tabelas 7 e 8 de ANOVA apresentam os valores de Fcal para as formações
de glucose e galactose, respectivamente, nos hidrolisados de H. musciformis frente
as concentrações de HCl e tempos de reação estudados. O valor do Fcal (13,82)
para a concentração de glucose como variável resposta, foi menor que o Ftab
57
(24,58), logo o modelo não se ajustou significativamente. Já para a concentração de
galactose como variável resposta, o valor de Fcal (25,38) foi superior ao Ftab (24,58),
porém aproximado, sugerindo que o modelo não foi significativo.
Portanto, estes resultados sugerem que novos parâmetros devem ser
considerados como variáveis independentes (temperatura de hidrólise e faixas mais
amplas de concentração de ácido) para gerar dados que possam ser mais
significativos na formação de glucose e galactose nos hidrolisados da alga H.
musciformis, bem como na construção de um modelo matemático capaz de
representar e extrair uma condição ótima de hidrólise.
Tabela 7 – ANOVA para a concentração de glucose como variável resposta.
Fonte de variação
Soma quadrática
Graus de liberdade
Média quadrática
Fcal
Regressão 1,276483 4 0,31912083 13,82
Resíduo 0,50107 2 0,25053
Falta de ajuste
(FA) 0,46727 1 0,46727
Erro puro (EP) 0,03380 1 0,0380
Total 1,31028 5
R2 0,6176
Ftab
(85% de
confiança)
aF(4,1)=24,58
a Fcalc para a falta de ajuste = MQFA/MQEP
58
Tabela 8 – ANOVA para concentração de galactose como variável resposta.
Fonte de variação
Soma quadrática
Graus de liberdade
Média quadrática
Fcal
Regressão 9,22383333 4 2,30595833 25,38
Resíduo 3,167568 2 1,583784
Falta de ajuste
(FA) 3,047518 1 3,047518
Erro puro (EP) 0,120050 1 0,120050
Total 1,31028 5
R2 0,66
Ftab
(85% de
confiança)
aF(4,1)=24,58
a Fcalc para a falta de ajuste = MQFA/MQEP
4. 6. Teores de ácido acético (inibidor de fermentação)
No presente estudo analisou-se, por CLAE, a formação dos inibidores da
fermentação gerados na hidrólise ácida da alga H. musciformis. Em todos os
hidrolisados foram observados a presença dos inibidores furfural e ácido acético. A
Figura 18 apresenta os teores de ácido acético nos hidrolisados da alga H.
musciformis, neutralizados e não-neutralizados com Ca(OH)2.
59
Figura 18 - Concentrações do ácido acético formado durante a hidrólise ácida da
alga H. musciformis.
A concentração de ácido acético variou de 0,02 a 4,71 g.L-1 e de 0,45 a 9,07;
nos hidrolisados neutralizados e não-neutralizados, respectivamente, mostrando
uma diminuição na concentração desse inibidor quando os hidrolisados foram
neutralizados com Ca(OH)2 (Figura 19). Yazdani et al. (2011) avaliando a conversão
de celulose e hemicelulose em açúcares monoméricos da alga Nizimuddinia
zanardini observaram a presença de inibidores durante a hidrólise (7% H2SO4; 60
min), onde a concentração máxima de ácido acético foi de 31,8 g/Kg. Nos estudos
de Rocha et al. (2011), a hidrólise do bagaço de caju com ácido sulfúrico diluído
formou uma concentração de ácido acético de 2,73 g.L-1.
A condição de hidrólise (0,5/20) não-neutralizada da alga H. musciformis
apresentou uma baixa concentração de ácido acético, a qual ainda sofreu
diminuição quando neutralizada com Ca(OH)2. Por esse fato, aliado a uma boa
eficiência de hidrólise e ao alto teor de açúcar redutor essa condição foi selecionada
para ser fermentada por S. cerevisiae para a obtenção de etanol.
Com relação aos compostos furânicos, o furfural apresentou concentração
média, nos hidrolisados da alga H. musciformis, de 1,75 g.L-1 e concentrações de
HMF não foram observadas. Nos estudos de Yazdani et al. (2011), mencionado
anteriormente, a concentração de furfural foi de, aproximadamente, 0,83 g/kg e
concentrações de HMF não foram detectadas em todo o experimento.
60
Hargreaves et al. (2013) avaliaram a remoção de HMF nos hidrolisados de K.
alvarezii para a produção de etanol utilizando carvão ativado, onde obtiveram a
diminuição na concentração de HMF de 35 para 1,5 g.L-1.
4. 7. Cinética fermentativa e produção de etanol a partir do hidrolisado (0,5/20)
da alga H. musciformis
A cinética fermentativa do hidrolisado 0,5/20 de H. musciformis está mostrada
na Figura 19. Diante dos resultados obtidos foi possível observar que ambos os
monossacarídeos (glicose e galactose) foram consumidos simultaneamente, no
entanto esse consumo só foi iniciado após 7 horas de fermentação, sendo que após
52 h de experimento 82,5% da glucose e 72% da galactose já tinham sido
consumidas. Vale ressaltar ainda que não foi verificado crescimento acentuado da
biomassa (S. cerevisiae), uma vez que a diferença entre as concentrações inicial e
final foi de 0,4 g.L-1.
Rocha et al. (2011) em seus estudos sobre a produção de etanol a partir do
bagaço de caju (biocombustível de 2ª geração) produziram 8,0 g.L-1 de etanol após
24 h de fermentação quando a levedura Kluyveromyces marxianus consumiu
completamente a glucose presente no meio. Resultado semelhante foi observado no
presente estudo quando a levedura S. cerevisiae, após 29 h de fermentação, já
havia consumido a glucose presente no meio, obtendo uma produção de 5,3 g.L-1 de
etanol.
Figura 19 – Cinética fermentativa do hidrolisado (0,5/20) da alga H. musciformis pela
levedura S. cerevisiae.
61
Já a produção máxima de etanol, no presente estudo, foi de 5,3 g.L-1 após 52
h de fermentação, representando uma eficiência fermentativa de 50% do volume de
produção teórico do etanol, evidenciando assim a habilidade da S. cerevisiae em
fermentar a galactose proveniente da matéria-prima algácea com um rendimento de
0,1 g de bioetanol/g de alga seca. Esses resultados permitiram calcular as
produtividades em biomassa e etanol, bom como os fatores de conversão de
substrato em biomassa e etanol e etanol por biomassa, os quais estão mostrados na
Tabela 9.
Tabela 9 – Fatores de conversão (Y) e produtividade (P) obtidos nos ensaios
fermentativos do hidrolisado (0,5/20) da alga H. musciformis.
YX/S YP/S YP/X PX (g.L-1.h-1) PP (g.L-1.h-1)
0,030 0,315 0,08 0,008 0,100
Os resultados obtidos mostraram que a conversão de substrato em biomassa
(YX/S) foi de 0,03, isto é, 0,03 g de célula foi produzida por grama de substrato. Já a
conversão de etanol por biomassa (YP/X) apresentou um valor de 0,08, ou seja, 0,08
g de etanol foi produzido por grama de célula e a conversão de substrato em etanol
(YP/S) foi de 0,315, significando dizer que 0,315 g de etanol foi produzido por grama
de substrato.
Quanto às produtividades em biomassa e em etanol, foram verificados valores
de 0,008 g.L-1.h-1 e 0,100 g.L-1.h-1, respectivamente.
Hargreaves et al. (2013) avaliaram duas estratégias para a produção de
etanol de 3ª geração a partir de K. alvarezii. A primeira tratou da produção de etanol
em uma única etapa: sacarificação ácida seguida de enzimática de 33,3% (m/m) de
alga seca e co-fermentação (S. cerevisiae CBS1782) da fração líquida e do resíduo
do pré-tratamento. Já a segunda tratou da produção de etanol em duas etapas:
fermentação da fração líquida rica em galactose (81,5 g.L-1) e sacarificação e co-
fermentação do resíduo do pré-tratamento. Os resultados mostraram produções
máximas de 64 g.L-1 de etanol para a primeira estratégia e 38 e 53 g.L-1 para a
segunda estratégia totalizando 91 g.L-1. Obtiveram ainda uma taxa de conversão de
0,457 g de etanol/g de substrato consumido. Diante dos resultados foi possível
calcular a possibilidade de obtenção de 105 L de etanol por tonelada de alga seca.
62
Ge et al. (2011) em seus estudos sobre a sacarificação do resíduo da extração
de alginato da alga L. japonica verificaram que a 0,1% de H2SO4 a 121 ºC por 1,0 h
seguido de hidrólise enzimática (celulase e celobiase) a concentração de glicose
alcançou seu valor máximo (277,5 mg/g de resíduo) e uma taxa de conversão de
celulose de 92,5%. Após rotaevaporação e a concentração de glucose no
hidrolisado foi para 34 g.L-1 e após fermentação por S. cerevisiae foi observado um
rendimento máximo de 14,0 g.L-1 de etanol representando uma taxa de conversão
de 41,2% e um rendimento teórico de 80,8%. Esse resultado demonstrou que 0,143
L de etanol poderia ser produzido a partir da utilização de 1 Kg de resíduo de alga
processada.
Em um outro estudo sobre a sacarificação da alga L. japonica, Kim et al.
(2011) observaram que a bactéria Escherichia coli KO11 recombinante era capaz de
produzir etanol 25,8 g.L-1 após 116 h de fermentação a partir de um hidrolisado de
180 g da alga com HCl 0,1 N, a 121ºC por 15 min, rico em manitol (90 g.L-1),
representando uma taxa de conversão de 0,41 g de etanol/g de manitol.
Lee e Lee (2012) avaliando a fermentação do manitol por diferentes leveduras
observaram que a S. cerevisiae (KCCM50550) foi hábil em produzir 2,7 g.L-1 de
etanol a partir de 10 g.L-1 de manitol.
Estudos de parâmetros cinéticos na produção de etanol a partir de biomassa
algácea (biocombustível de 3ª geração) ainda são escassos na literatura o que levou
a comparações com bioetanol de 2ª geração produzido a partir de bagaço de caju
por K. marxianus onde foi observado produtividade de etanol de 0,13 g.L-1.h-1.e uma
taxa de conversão de 0,231 g de etanol/g de substrato (ROCHA et al., 2011).
A Figura 19 apresenta as velocidades de crescimento (µX), consumo do
substrato - µS1 (glucose); µS2 (galactose) , e produção de etanol (µP) durante a
fermentação por S. cerevisiae do hidrolisado 0,5/20 da alga H. musciformis. As
velocidades específicas de consumo de substrato e formação de etanol
apresentaram comportamento típico de uma fermentação alcoólica.
As velocidades específicas de consumo do substrato (µS) e produção de
etanol (µP) apresentaram perfis similares, uma vez que esses parâmetros possuem
uma correlação direta. Nos resultados expostos na Figura 18, a formação de etanol
não mostrou-se associada ao crescimento da levedura, mas ao consumo do
substrato.
63
O perfil da Figura 20 apresenta certa similaridade com o obtido por Rocha et
al. (2011) quando estudaram os mesmos parâmetros cinéticos na fermentação do
bagaço de caju por Kluyveromyces marxianus CE025.
Figura 20 – Velocidades específicas de crescimento (µX), dos substratos µS1
(glucose) e µS2 (galactose) e da produção de etanol (µP) durante a fermentação do
hidrolisado da alga marinha vermelha H. musciformis (0,5/20) por S. cerevisiae.
Nas primeiras horas de fermentação, foi observado uma maior velocidade de
consumo dos substratos acompanhado da velocidade de produção de etanol.
Próximo a 10ª hora de fermentação a velocidade de consumo do substrato µS1
(glucose) diminuiu em virtude da diminuição da sua concentração, diferente do que
foi observado para o substrato µS2 (galactose). Nessa fase, enquanto a galactose
está sendo consumida devagar, há um aumento na velocidade de crescimento
celular. Isso sugere que, com a diminuição de glucose no meio fermentativo, o
microrganismo adpatou-se ao meio contendo galactose, utilizando esse
monossacarídeo não mais para produzir etanol, mas sim para o seu crescimento
celular.
64
5. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos concluiu-se que a alga marinha vermelha H.
musciformis, abundante no litoral cearense, mostrou-se uma potencial fonte
renovável de biomassa para a produção de bioetanol. No entanto, demais estudos
são necessários para otimizar e aperfeiçoar o processo produtivo de bioetanol a
partir desses organismos.
65
6. REFERÊNCIAS
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