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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS-ICE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUIMICA-PPGQ

Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos

Banny Silva Barbosa

Manaus -Amazonas

Janeiro – 2013

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS-ICE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUIMICA-PPGQ

Banny Silva Barbosa

Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Química, Universidade Federal do Amazonas, para obtenção do

título de Mestre em Química, Área de concentração em Química

Orgânica.

Orientador: Dr. Sergio Massayoshi Nunomura

Manaus -Amazonas

Janeiro – 2013

iii

Banny Silva Barbosa

Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Química, Universidade Federal do Amazonas, para obtenção do

título de Mestre em Química, Área de concentração em Química

Orgânica.

Aprovada em 30 de janeiro de 2013.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________

Prof. Dr. Sergio Massayoshi Nunomura

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

___________________________________________________

Prof. Dr. Adrian Martin Pohlit


___________________________________________________

Prof. Dr. Nilson Luiz de Aguiar Carvalho


iv

Dedico à minha família que me proporcionou

educação e confiança, em especial à minha avó materna

Francisca de Melo Ribeiro (in memorian) que me

ensinou a lutar - “O Senhor è o meu pastor e nada me

faltará”.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus pela graça, sabedoria, misericórdia e o seu imenso amor;

A minha mãe, Rosangela Ribeiro, pela confiança, ao meu padrasto, Francisco Pontes,

minha irmãs Bonny Barbosa e Fernanda Pontes, meu irmão André Pontes, minha Tia, Waldecira

Oliveira, meu pai, Waldenei Barbosa e familiares pelo apoio;

Ao Prof. Dr. Sergio Massayoshi Nunomura, pela orientação segura, confiança, paciência,

incentivo, educação e conhecimentos compartilhados para o meu aprendizado, meu

AGRADECIMENTO ESPECIAL;

Á Prof. Dra. Rita Nunomura pelo apoio;

Ao Prof. Msc Roberto Figliuolo que cedeu boa parte dos padrões comerciais de lipídeos e

nos estimulou a iniciar essa linha de pesquisa no grupo;

Aos amigos de turma do mestrado e companheiros do Laboratório de Princípios Ativos da

Amazônia – LAPAAM:, Rita Cynara, Magno Muniz, Andréia Montoia, Tiago Pereira,

Marycleuma Henrique, Suniá, Ellen Cristina, Patrícia Pinto, Kethellin Galeno, Viviane Guedes,

Berna, David, Paulo Senna e Renata, em especial à Andreza Barreto, Paula Suellen e Mauro

Garcia pelo apoio e valorosas discussões;

Às amigas da Nova Igreja Batista – NIB, Aline Bentes, Aline Amaral, Cecília Caetano,

Daniele Araújo, Helenkássya Araújo, Jeanne Costa, Jeane Cristini, Karol Diniz, Auxiliadora

Rodriguez, Milena, Nágila Lima, Patrícia Rocha, Sandrelany Pinho, Talita Oliveira e Vanessa

Brito, pelo apoio e incentivo;

Aos amigos Dione, Ana Pantoja, Alessandra, Amanda e Andréa, pelo apoio;

Ao Programa de Pós-Graduação em Química da UFAM pela oportunidade de realização

do curso de mestrado;

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, onde realizei as atividades

experimentais;

À CAPES pela bolsa concedida;

À FINEP e CNPq por incentivo financeiro ao grupo LAPAAM;

E finalmente um agradecimento a todos os demais que, direta ou indiretamente

contribuíram para a realização deste trabalho.

vi

Ficha Catalográfica

(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)

B238a

Barbosa, Banny Silva

Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes

amazônicos / Banny Silva Barbosa. – Manaus, 2013.

159 f.; il. color.

Dissertação (Mestrado em Química) –– Universidade Federal do

Amazonas.

Orientador: Dr. Sergio Massayoshi Nunomura

1.Ácidos graxos 2. Lipídeos 3.Glicolipídeos 4. Peixes da

Amazônia I. Nunomura, Sergio Massayoshi (Orient.) II. Universidade

Federal do Amazonas III. Título

CDU (2007) 613.281(811.3)(043.3)

vii

RESUMO

Considerando a importância do pescado para o povo amazônico, o seu potencial no mercado, a

sua valorização nutritiva, e à escassez de informações referentes à composição lipídica dos peixes

amazônicos objetivou-se determinar a composição lipídica presente no músculo dorsal de seis

espécies de peixes amazônicos, jaraqui, curimatã, pacu, sardinha, pescada e surubim, através das

análises dos ácidos graxos constituintes de suas diferentes classes de lipídeos e dos esteróides

presentes em seus lipídeos insaponificáveis. O estudo envolveu o desenvolvimento e a aplicação

de metodologias para extração dos lipídeos totais, separação de classes de lipídeos, extração de

lipídeos insaponificáveis, derivatização de ácidos graxos e esteróides, análises por cromatografia

gasosa com detector de ionização de chamas e com espectrometria de massas para avaliação

quanti e qualitativa de esteróides e de ácidos graxos dos lipídeos em classes. E ainda abordou a

determinação da qualidade nutricional dos lipídeos através dos índices de aterogenecidade, de

trombogenecidade e pela quantidade de ácidos graxos hipocolesterolêmicos. Os resultados

indicaram que os peixes em estudo contêm lipídeos interessantes, possuindo maior quantidade de

lipídeos totais os peixes curimatã e pacu, com maior participação dos lipídeos neutros, e

colesterol como esteróide marjoritário para todos os peixes. Os ácidos graxos insaturados,

essenciais para a saúde humana, foi encontrado em maior quantidade nos peixes sardinha e pacu

na classe dos fosfolipídeos e nos peixes peixes curimatã, pescada, jaraqui e surubim na classe dos

lipídeos neutros. Apesar de o peixe pacu ter mostrado maior quantidade de ácidos graxos de

ômega 3 e 6 o peixe pescada se destacou pela qualidade nutricional.

Palavras-chaves: ácidos graxos poliinsaturados, lipídeos neutros, fosfolipídeos, glicolipídeos,

esteróides.

viii

ABSTRACT

Seeing the importance of fish for amazonian people, it potential in the market, it nutritive value,

and information shortages relative to the lipid composition of amazonian fish, it was aimed to

determinate the lipid composition attendant in dorsal muscle of six amazonia fish species, jaraqui,

curimatã, pacu, sardinha, pescada and surubim, through fatty acids analyses constituent of their

diferent classes of lipids and attendant steroids in their unsaponifiable lipids. This study involved

the development and methodology application for extraction of total lipids, separation of lipid

class, extraction of unsaponifiable lipids, derivatization of fatty acids and steroids, analyses of

gas chromotagraphy with detector of flames ionization and with mass spectrometry for

quantitative and qualitative evaluation of steroids and fatty acids of lipids in class. And also

approached the determination of lipids nutritional quality through atherogenicity,

thrombogenicity index and quantity of hypercholesterolemic fatty acids. The results indicated the

fish in study have interesting lipids, having bigger quantity of total lipids the fishes curimatã and

pacu, with bigger participation of neutral lipids, and cholesterol as majority steroid for all fishes.

The unsaturated fatty acids, essentials for human health, it was found in bigger quantity in fishes

sardinha and pacu in phospholipids class and in pescada (whitefish), curimatã, jaraqui and

surubim in neutral lipids class. Besides pacu fish has shown bigger quantity of omega 3 and 6

fatty acids, the fish pescada (whitefish) highlighted for nutritional quality.

Keywords: polyunsaturated fatty acids, neutral lipids, phospholipids, glycolipids, steroids.

ix

LISTA DE ILUSTRAÇÃO

Página

Figura 1. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Characiformes

exemplificado por um aracu (Leporinus sp.) ..................................................................................... 4

Figura 2. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Peciformes,

exemplificado por um acará (Apistogramma sp.) .............................................................................. 6

Figura 3. Ésteres de glicerol (1- e 2- MAG, 1,2- e 1,3 – DAG e TAG). RCO representa o grupo

acil dos ácidos graxos RCOOH. Todas as outras letras estão relacionadas aos átomos derivados

da molécula de glicerol ...................................................................................................................... 8

Figura 4. Ácido fosfátidico e suas ramificações mais comuns ........................................................ 10

Figura 5. Estrutura básica dos esfingolipídeos ................................................................................ 11

Figura 6. Estrutura dos ácidos graxos poli-insaturados ................................................................... 14

Figura 7. Reação de transesterificação de triacilglicerideo com ácool primário produzindo

glicerol e ésteres alquilicos .............................................................................................................. 14

Figura 8. Prostaglandinas resultantes dos ácidos graxos AA e EPA ............................................... 16

Figura 9. Colesterol e sitosterol ....................................................................................................... 18

Figura 10. Tocoferóis e tocotrienóis. Tocoferóis tem uma cadeia lateral C 16 saturada,

tocotrienóis tem ligações duplas nas três posições indicadas pelas setas. R = H ou CH3; α = 5,7,8-

trimetiltocol; β = 5,8-dimetiltocol; γ = 7,8-dimetiltocol; δ = 8-metiltocol ...................................... 18

Figura 11. Β-caroteno. Outros carotenos variam na natureza nos grupos terminais cíclicos .......... 19

Figura 12. Mecanismo genérico da reação de sililação ................................................................... 20

Figura 13. Peixes jaraqui (Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ..................................... 48

Figura 14. Peixes sardinha (Triportheus elongatus Gunther, 1864) ............................................... 48

Figura 15. Peixe pacu (Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ......................................................... 48

Figura 16. Peixes curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ............................................... 48

Figura 17. Peixe surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766)...................................... 48

Figura 18. Peixe pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ......................................... 48

Figura 19. Perfil cromatográfico por CCD dos lipídeos neutros de sardinha (Triportheus

elongatus Gunther, 1864) extraídos com diferentes solventes ........................................................ 52

x

Figura 20. Perfil cromatográfico de EFS 7,8, 5 e 6.1 representando a fração referente a MTBE,

EFS 7,8, 5 e 6.2 a fração de acetona e EFS 7,8, 5 e 6.3 a última fração ......................................... 53

Figura 21. Perfil cromatográfico, onde 1= material insaponificável, 2= padrão de colesterol e 3=

tocoferol ........................................................................................................................................... 57

Gráfico 1. Curva analítica do fame C 19:0 em 7 concentrações ..................................................... 50

Gráfico 2. Curva analítica do esteróide sitosterol em 4 concentrações .......................................... 56

Gráfico 3. Curva analítica do EMAG C19:0 em 5 concentrações................................................... 78

xi

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Alguns ácidos graxos de ocorrência natural .................................................................... 13

Tabela 2. Informações das espécies em estudo ............................................................................... 22

Tabela 3. Proporção de mistura se solventes para extração de lipídeos totais ................................ 26

Tabela 4. Quantidade em peso de cada espécie de peixe e de padrão interno usado para extração 27

Tabela 5. Condições testadas para desenvolvimento do método de separação de classes de

lipídeos ............................................................................................................................................ 30

Tabela 6. Peso de lipídeos totais de cada peixe utilizado para a separação de classes de lipídeos . 31

Tabela 7. Relação de reagentes, solvente e amostra de lipídeos neutros (L.N.) na reação de

saponificação para os peixes em estudo .......................................................................................... 32

Tabela 8. Otimização do método ..................................................................................................... 35

Tabela 9. As primeiras oito condições testadas para otimização do método de derivatização para

análise de cadeia graxa por CG ....................................................................................................... 38

Tabela 10. As demais condições testadas para otimização do método de derivatização para

análise de cadeia graxa por CG ....................................................................................................... 39

Tabela 11. Quantidade de massa usada por cada amostra para a reação de derivatização para

análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa ........................................................................... 40

Tabela 12. Padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos ........................ 42

Tabela 13. Otimização do método de análise de ácidos graxos ..................................................... 44

Tabela 14. Rendimento percentual dos extratos de lipídeos totais (L.T) ....................................... 49

Tabela 15. Áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do ácido nonandecanóico .. 50

Tabela 16. Concentração e eficiência do método de extração de lipídeos totais............................. 51

Tabela 17. Rendimento das frações obtidas para separação de lipídeos, comparando-se o método

de Johnston e EFS ........................................................................................................................... 51

Tabela 18. Frações da EFS com solventes não-organoclorados ...................................................... 52

Tabela 19. Rendimento em percentual das classes de lipídeos dos métodos diferentes testados .... 53

Tabela 20. Rendimento em percentual dos lipídeos em classes nos peixes em estudo ................... 54

Tabela 21. Rendimentos percentuais dos lipídeos insaponificáveis dos peixes .............................. 55

Tabela 22. Áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol ............................................... 55

xii

Tabela 23. Quantidade em mg/mg de sitosterol nos lipídeos insaponificáveis dos peixes ............. 56

Tabela 24. Observação da resolução dos cromatogramas obtidos durante o desenvolvimento do

método para análise de lipídeos insaponificáveis ............................................................................ 63

Tabela 25. Identificação do tempo de retenção (min) de cada esteróide na mistura usada para

otimização do método de análise de esteroides ............................................................................... 64

Tabela 26. Identificação pelo tempo de retenção (min) de esteróides nos peixes estudados .......... 71

Tabela 27. Quantidade em mg/mg de esteróides nos peixes em estudo .......................................... 72

Tabela 28. Percentual de esteróides nos lipídeos insaponificáveis ................................................. 72

Tabela 29. Rendimento em percentual para a reação de derivatização ........................................... 73

Tabela 30. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados por

fase sólida ........................................................................................................................................ 74


fase sólida ........................................................................................................................................ 76


fase sólida ........................................................................................................................................ 77

Tabela 33. Áreas resultantes das análises do padrão de EMAG C 19:0 .......................................... 77

Tabela 34. Quantidade em mg/mg de EMAG C 19:0 nos lipídeos neutros dos peixes................... 78

Tabela 35. Tempos de retenção em min da mistura dos padrões comerciais ésteres metílicos de

ácidos graxos disponíveis .............................................................................................................. 91

Tabela 36. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos lipídeos neutros ........................... 97

Tabela 37. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos presentes em lipídeos neutros.............. 98

Tabela 38. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos glicolipídeos ............................. 104

Tabela 39. Relação percentual dos tipos dde ácidos graxos em glicolipídeos .............................. 105

Tabela 40. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos fosfolipídeos ............................. 109

Tabela 41. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos nos fosfolipídeos ............................... 110

Tabela 42. Qualidade nutricional dos lipídeos neutros dos peixes ................................................ 111

Tabela 43. Qualidade nutricional dos glicolipídeos dos peixes..................................................... 111

Tabela 44. Qualidade nutricional dos fosfolipídeos dos peixes .................................................... 112

Tabela 45. Constituintes dos lipídeos totais dos peixes ................................................................ 112

xiii

LISTA DE CROMATOGRAMAS

Página

Cromatograma 1. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na

condição patrícia .............................................................................................................................. 58


condição Col+toc1 ........................................................................................................................... 59


condição Col+toc4 ........................................................................................................................... 59


condição Col+toc 6 .......................................................................................................................... 60


condição Col+toc11 ......................................................................................................................... 61


condição Col+toc23 ......................................................................................................................... 61


condição Col+toc23 no CG-DIC ..................................................................................................... 62

Cromatograma 8. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de esteróides

analisado nas condições do método silil_II ..................................................................................... 63

Cromatograma 9. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de esteróides

analisado nas condições do método col+toc 23 ............................................................................... 64

Cromatograma 10. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe

curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ............................................................................ 65


pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ..................................................................... 67


sardinha (Triportheus elongatus Gunther, 1864) ............................................................................ 68


jaraqui (Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) .................................................................. 69


surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ................................................................. 70

xiv

Cromatograma 15. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe pacu

(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ............................................................................................. 71

Cromatograma 16. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos

graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB1 ............................................... 79














graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB11 ................................................ 85


graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB32 ................................................ 86


graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX18.............................................. 86






graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 14A .......................................... 88



xv






graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43 A no espectrometro de

massas .............................................................................................................................................. 90

Cromatograma 33. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de curimatã

(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ........................................................................................... 92

Cromatograma 34. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídoes neutros de pescada

(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) .................................................................................. 94

Cromatograma 35. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de sardinha

(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ........................................................................................... 94

Cromatograma 36. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de jaraqui

(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) .............................................................................. 95

Cromatograma 37. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de surubim

(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................... 96

Cromatograma 38. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de pacu

(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ............................................................................................. 96

Cromatograma 39. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de curimatã

(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ........................................................................................... 99

Cromatograma 40. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pescada

(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ................................................................................ 100

Cromatograma 41. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de sardinha

(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ......................................................................................... 100

Cromatograma 42. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de jaraqui

(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ............................................................................ 101

Cromatograma 43. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de surubim

(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................. 102

Cromatograma 44. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pacu

(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ........................................................................................... 103

xvi

Cromatograma 45. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de curimatã

(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ......................................................................................... 105

Cromatograma 46. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pescada

(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ................................................................................ 106

Cromatograma 47. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de sardinha

(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ......................................................................................... 107

Cromatograma 48. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de jaraqui

(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ............................................................................ 107

Cromatograma 49. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de surubim

(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................. 108

Cromatograma 50. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pacu

(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ........................................................................................... 108

xvii

LISTA DE ESPECTROS

Página

Espectro 1. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de lipídeos

neutros do peixe curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ................................................. 66

Espectro 2. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de lipídeos

neutros do peixe curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ................................................. 93

xviii

LISTA DE EQUAÇÕES

Página

Equação 1. IA ................................................................................................................................. 47

Equação 2. IT .................................................................................................................................. 47

Equação 3. HH ................................................................................................................................. 47

xix

LISTA DE ANEXOS

Página

ANEXO 1. Espectros de massas dos componentes detectados na análise da mistura de padrões

comerciais esteróides disponíveis por CG-EM ............................................................................. 119

ANEXO 2. Espectros de massas dos componentes detectados na análise da mistura de padrões

comerciais de ésteres metílicos de ácidos graxos disponíveis por CG-EM .................................. 121

xx

ABREVIATURAS

AA Ácido araquidônico

AGI Ácidos graxos insaturados

AGL Ácidos graxos livres

AGMI Ácidos graxos monoinsaturados

AGPI Ácidos graxos poliinsaturados

AGS Ácidos graxos saturados

BF3 Trifluoreto de boro

BHT Butil hidróxi tolueno

BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

CCD Cromatografia em camada delgada

CG-DIC Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização de Chama

CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

DAG Diglicerídeo

DHA docosahexanoic acid

EFS Extração em fase sólida

EMAG Éster metílico de ácido graxo

EPA Eicosapentanoic acid

EtOH Etanol

FL Fosfolipídeos

GL Glicolipídeos

HH Hipocolesterolêmicos/Hipercolesterolêmicos

HPLC High peformance liquid chromatography

IA Índice de aterogenicidade

IT Índice de trombogenicidade

LAPAAM Laboratório de Princípios Ativos da Amazônia

L.N. Lipídeos Neutros

L.T. Lipídeos Totais

MeOH Metanol

MAG Monoacilglicerídeo

xxi

MTBE Metyl-Tert- Butyl Ether

AP Alta Polaridade

rcf relative centrifugal force

TAG Triacilglicerídeo

TMCS Trimethylchlorosilane

TMS Trimetilsilil

xxii

SUMÁRIO

Página

RESUMO ............................................................................................................................... .....VII

ABSTRACT ............................................................................................................................... VIII

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ......................................................................................................... IX

LISTA DE TABELAS .................................................................................................................. XI

LISTA DE CROMATOGRAMAS ............................................................................................ XIII

LISTA DE ESPECTROS ......................................................................................................... XVII

LISTA DE EQUAÇÕES ......................................................................................................... XVIII

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................. XIX

ABREVIATURAS ...................................................................................................................... XX

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ ....1

1.1 Contexto e motivação ............................................................................................................... 1

1.2 Considerações gerais sobre os grupos dos peixes amazônicos estudados ................................. 3

1.2.1 Superordem Ostariophysi ...................................................................................................... 3

1.2.2 Superordem Acantopterygii ................................................................................................... 5

1.3 Lipídeos ..................................................................................................................................... 7

1.3.1 Lipídeos Saponificáveis ......................................................................................................... 7

1.3.1.1 Gliceróis .............................................................................................................................. 7

1.3.1.2 Fosfolipídeos ....................................................................................................................... 9

1.3.1.3 Esfingolipídeos ................................................................................................................. 11

1.3.1.4 Ceras .................................................................................................................................. 12

1.3.1.5 Ácidos graxos .................................................................................................................... 12

1.3.3 Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis .......................................................... 14

1.3.4 Ocorrência de ácidos graxos poliinsaturados em peixes e sua importância na saúde humana

....................................................................................................................................................... 15

1.3.5 Lipídeos Insaponificáveis .................................................................................................... 17

1.3.5.1 Esteróides .......................................................................................................................... 17

1.3.5.2 Tocóis ................................................................................................................................ 18

1.3.5.3 Carotenóides ...................................................................................................................... 19

1.3.6 Reações comuns envolvendo lipídeos insaponificáveis ....................................................... 19

xxiii

1.3.7 Ocorrência de lipídeos insaponificáveis e importância na saúde humana ............................ 20

1.4 Informações referentes às espécies de peixes selecionadas para estudo ................................. 21

2 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 23

2.1 Geral ....................................................................................................................................... 23

2.2 Específicos .............................................................................................................................. 23

3 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 24

3.1 Material .................................................................................................................................... 24

3.1.1 Seleção das espécies e coleta do material biológico............................................................. 24

3.1.2 Reagentes, solventes e instrumentos cromatográficos utilizados ......................................... 24

3.2 Métodos ................................................................................................................................... 25

3.2.1 Extração de lipídeos totais ................................................................................................... 25

3.2.1.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais ...................................... 25

3.2.1.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo .............................................................. 26

3.2.1.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais............................ 27

3.2.2 Separação em classes e de seus componentes ...................................................................... 28

3.2.2.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos ......................... 28

3.2.2.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo .................................................... 31

3.2.3 Extração de lipídeos insaponificáveis .................................................................................. 31

3.2.3.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis ................................................... 31

3.2.3.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo ............................................ 32

3.2.3.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis. ......... 33

3.2.4 Preparação de amostras para análise de esteroides ............................................................... 33

3.2.4.1 Verificação do método de reação de sililação ................................................................... 33

3.2.4.2 Aplicação do método de reação de sililação nos peixes em estudo................................... 33

3.2.5 Análise de esteróides por cromatografia gasosa ................................................................... 34

3.2.5.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-DIC e

CG-EM) ........................................................................................................................................ 34

3.2.5.2 Análise qualitativa de esteroides dos peixes em estudo por CG-EM ................................ 36

3.2.5.3 Análise quantitativa dos esteroides dos peixes em estudo por CG-DIC ........................... 36

3.2.6 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa ............................................................ 36

3.2.6.1 Otimização da metodologia de derivatização de ác. graxos em seus ésteres metílicos..... 36

xxiv

3.2.6.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo ................................. 40

3.2.6.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos neutros .... 41

3.2.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa ...................................... 41

3.2.7.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa (CG-DIC

e CG-EM) ..................................................................................................................................... 41

3.2.7.2 Análise qualitativa da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo por CG-EM ... 46

3.2.7.3 Análise quantitativa da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo por CG-DIC 46

3.8 Determinação da qualidade nutricional dos lipídeos dos peixes ............................................ 46

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 48

4.1. Seleção das espécies e coleta do material biológico ............................................................... 48

4.2 Extração de lipídeos totais ...................................................................................................... 49

4.2.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais ......................................... 49

4.2.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo ................................................................. 49

4.2.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais............................... 50

4.3 Separação em classes e de seus componentes ......................................................................... 51

4.3.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos ............................ 51

4.3.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo ....................................................... 53

4.4 Extração de lipídeos insaponificáveis...................................................................................... 54

4.4.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis ...................................................... 54

4.4.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo ............................................... 55

4.4.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis ........... ..55

4.5 Preparação de amostras para análise de esteroides .................................................................. 57

4.5.1 Verificação do método de reação de sililação ...................................................................... 57

4.6 Análise de esteróides por cromatografia gasosa ...................................................................... 57

4.6.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-DIC e

CG-EM) ........................................................................................................................................ 57

4.6.2 Análise qualitativa de esteroides dos peixes em estudo por CG-EM ................................... 65

4.6.3 Análise quantitativa dos esteroides dos peixes em estudo por CG-DIC .............................. 72

4.7 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa ............................................................... 73

4.7.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres metílicos .. 73

4.7.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo .................................... 76

xxv

4.7.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos neutros ....... 77

4.8 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa ......................................... 79

4.8.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa (CG-DIC e

CG-EM) ........................................................................................................................................ 79

4.8.2 Análise da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo ........................................... 92

4.8.2.1 Lipídeos neutros ................................................................................................................ 92

4.8.2.2 Glicolipídeos ..................................................................................................................... 99

4.8.2.3 Fosfolipídeos ................................................................................................................... 105

4.9 Qualidade nutricional dos lipídeos em classe ....................................................................... 110

4.9.1 Lipídeos neutros ................................................................................................................. 110

4.9.2 Glicolipídeos ...................................................................................................................... 111

4.9.3 Fosfolipídeos ...................................................................................................................... 111

4.9.4 Lipideos no total ................................................................................................................. 112

5 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 113

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 114

ANEXOS ..................................................................................................................................... 119

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Contexto e motivação

Um grande potencial da produção de peixes de água doce se situa na Bacia Amazônica

que representa 20% de toda a água doce do mundo contendo mais de 2.000 espécies das mais

variadas ordens de peixes, representando 75% de todas as espécies de água doce do Brasil e 30%

da fauna de peixes do mundo (Roubach et al., 2003).

A capital do Estado do Amazonas, Manaus, com um desembarque que varia entre 22.000

e 35.000 t/ano é o maior centro produtor e consumidor da região (Santos et al., 2009). Sendo o

Estado do Amazonas possuidor de um dos maiores índices de consumo de peixes do mundo,

entre 38,5 e 55,0 Kg/pessoa/ano na capital Manaus e 510 a 600 g/pessoa/dia no interior do

Amazonas, enquanto que no mundo esse índice chega somente à de 16 Kg/pessoa/ano (Batista et

al., 1998, Barthem et al., 2003).

O consumo de pescado no Amazonas se encontra distribuído entre várias espécies,

somente nos mercados de Manaus, são encontradas pelo menos 100 diferentes espécies

biológicas, sendo os peixes mais consumidos: tambaqui, jaraqui, curimatã, matrinxã, tucunaré,

pacus, sardinhas, pescada, pirapitinga e caparari (confundido com surubim) tais, peixes ocorrem

em diferentes rios de águas clara, branca ou preta (Santos et al., 2009). Considerando que a

composição química depende, dentre outros fatores, da espécie, do seu habitat, do período do

ano, do tipo e quantidade de alimento disponível e do estado de maturidade sexual, o teor de

proteínas, lipídeos e minerais em cada uma dessas espécies deve ser significativamente variável

(Arbeláez-Rojas et al., 2002).

O interesse pela composição química de peixe tem crescido, principalmente em relação à

composição lipídica, pelo fato do consumo de ácidos graxos estar diretamente relacionado com a

saúde humana (Blanchet et al., 2005; Almeida et al., 2007, Almeida et al., 2008; Inhamuns et al.,

2009, Inhamuns et al., 2001). Na natureza, os ácidos graxos podem está presentes na sua forma

livre ou principalmente como ésteres em óleos e gorduras (mono-, di- e triacilglicerídeos), como

ésteres com alcóois de cadeia longa em ceras ou então como ésteres com uma ligação fosfatídica

em estruturas de membranas (fosfolipídeos). Os ácidos graxos de ocorrência natural têm

diferentes estruturas variando desde o tamanho da cadeia carbônica, como na presença de

ligações duplas (insaturações), ramificações, outras funções orgânicas ou até mesmo a presença

2

de estruturas cíclicas. Os ácidos graxos considerados essenciais, isto é, imprescindíveis para o

homem e que não podem ser sintetizados pelo mesmo, subdividem-se em duas subclasses: os

ômega 3 (ω-3) e ômega 6 (ω-6). Os ácidos da série ω-3, que são encontrados principalmente em

óleos de peixes (Alexander, 1998), são responsáveis por evitar distúrbios neurológicos e visuais,

porque são importantes no desenvolvimento do cérebro (Kasim-Karakas, 2001; Hanahan, 1997).

E ainda, relata-se que, o consumo do ácido graxo da série ω-3, ácido 5,8,11,14,17-

eicosapentaenóico (EPA), tem sido associado à redução dos riscos de aterosclerose, câncer,

trombose e pressão alta (Simão et al., 2007).

O aumento do consumo de ácidos graxos poliinsaturados na alimentação, bem como a

redução de ácidos graxos saturados é responsável pela redução dos elevados índices dos lipídeos

de baixa densidade LDL (low density lipids) no sangue, que podem conduzir a doenças

coronarianas (Cozza e Costa, 2000). O estudo da absorção sobre diferentes formas químicas de

ácidos graxos poliinsaturados em humanos demonstrou que a estrutura química, na qual o ácido

se encontra ligado, possui influência para a saúde do ser humano (Netleton, 1995).

Poucos estudos sobre a composição de lipídeos em peixes existem no Brasil, sobretudo

em peixes amazônicos, porém aqueles que têm sido publicados mostraram que peixes de água

doce apresentam interessantes valores nutricionais (Almeida et al., 2006; Almeida et al., 2006;

Bentes et al., 2009; Moreira et al., 2003; Inhamuns et al., 2009; Inhamuns et al., 2001).

Assim, considerando a importância do pescado no mercado regional, o seu potencial

nutritivo, e a escassez de informações referentes à composição lipídica dos peixes amazônicos,

este trabalho tem como objetivo determinar o perfil de ácidos graxos, os esteróides presentes,

bem como a qualidade nutricional dos lipídeos de seis espécies de peixes amazônicos: jaraqui

(Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu (Mylossoma duriventre),

sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel,

1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766).

3

1.2 Considerações gerais sobre os grupos dos peixes amazônicos estudados

A ictiofauna amazônica está representada principalmente pela superordem Ostariophysi,

que agrupa cerca de 85% das espécies amazônicas (mais de 1700 espécies), das quais 43% estão

incluídos na ordem Characiformes, 39% na ordem Siluriformes (bagres) e 3% na ordem

Gimnotiformes (peixe elétrico). E ainda representando a ictiofauna amazônica há a superordem

dos Acanthopterygii, que apesar de contribuir com apenas cerca de 500 espécies, possui papel

importante no comércio de peixes do Amazonas (Val et al., 1995 e Barthem et al., 2003).

1.2.1 Superordem Ostariophysi

É o grupo mais dominante de peixes de água doce no mundo. A formação do weberian

apparatus, uma modificação de quatro ou mais vértebra anterior que conecta bexiga nadatória ao

ouvido interno para transmissão de som, aparenta ser a única característica que é compartilhada

por todos os membros deste grupo. Todas as subordens de Ostariophysi são representadas no

Amazonas, exceto para a Cypriniformes (peixes tipo carpa). Os Ostariophysans amazônicos

incluem no mínimo 12 famílias da ordem Characiformes, 12 de Siluriformes e 6 de

Gymnotiformes (Val et al., 1995).

A ordem dos Characiformes, conhecidos também como peixes de escama, possui como

maioria, as espécies migradoras de curta distância, movimentando-se entre rios e lagos. Possui

boca em posição variável, geralmente terminal, ou seja, no mesmo nível do eixo longitudinal do

corpo, e possui ainda ausência de espinhos na região ventral e nadadeira adiposa (nadadeira

ímpar localizada entre a caudal e a dorsal) (Santos et al., 2009). São considerados como os que

possuem a morfologia do corpo mais bruta generalizada dos Ostariophysans amazônicos.

Incluem cerca de 1200 espécies distribuídas entre 12 famílias (Val et al., 1995).

4

Figura 1. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Characiformes

exemplificado por um aracu (Leporinus sp.) (Lima, 2005).

Uma das famílias representante pela ordem Characiformes é a Characidae, que em geral

inclui peixes de diferentes modos de reprodução e hábitos alimentares. A disposição dos dentes é

muito variável, caracterizando sua capacidade de explorar uma grande variedade de habitats. Por

causa da grande variedade de formas é difícil caracterizar morfologicamente o grupo como um

todo. Grande parte das espécies possui nadadeira anal longa, maxilar superior fixo, com dentes

firmemente implantados e nadadeira dorsal com cerca de 10-13 raios (Soares et al., 2008).

Outra família representante dos characiformes é a família Prochilodontidae, que se

caracteriza pelo formato fusiforme do corpo (alongado e ligeiramente abaulado no meio),

presença de um espinho na base da nadadeira dorsal, lábios carnosos, boca protrátil (que tem a

capacidade de se estender para frente), em forma de ventosas. Os dentes são numerosos,

diminutos e enfileirados, fracamente implantados sobre os lábios. O intestino é muito longo e o

estômago tem paredes grossas e musculares. Seus representantes apresentam hábito alimentar

detritívoro (que se alimenta de detritos) e iliófago (se alimenta de lodo ou detritos), consumindo

matéria orgânica particulada, algas e perifíton (organismos aquáticos que vivem aderidos ao

substrasto do ambiente). São migradores, formam cardumes e realizam movimentos dentro do

ecossistema aquático com fins de se alimentar e reproduzir. A família é formada por cerca de 40

espécies de 3 gêneros, Prochilodus, Ichthyoelephas e Semaprochilodus, que estão distribuídos

5

amplamente na América do Sul. Na Amazônia, seus representantes são conhecidos como jaraqui

e curimatã (Soares et al., 2008).

Outra ordem, que juntamente com a ordem do Characiformes são as mais importantes na

Amazônia é a dos Siluriformes. Esse último caracteriza-se por conter corpo nu, sem escamas ou

coberto parcialmente com placas ósseas (Barthem et al., 2003 e Santos et al., 2009). A família

Pimelodidae da ordem do Siluriformes compreende formas diversificadas, com exemplares muito

pequenos e grandes. Possui corpo nu, aberturas branquiais amplas, prolongando-se para a frente,

até próximo ao queixo e para trás, além da inserção do primeiro raio da nadadeira peitoral. As

espécies pertencentes a esta família apresentam, em geral, a dorsal e peitoral providas de

espinhos afiados e a nadadeira adiposa sempre presente. Possuem um par de barbilhões maxilares

(na extremidade do maxilar superior) e dois pares mentonianos (no queixo ou mento), dentes

diminutos e frágeis com borda incisiva, mas não cortante, localizados sobre uma placa óssea nas

maxilas e palato. A maioria das espécies apresenta canais da linha lateral cutâneos ramificados ou

anastomosados (em forma de redes) na cabeça e parte anterior do corpo, possuem hábito noturno

e tem órgãos sensitivos para explorar o ambiente na ausência de luz (barbilhões e barbelas

quimioreceptoras). A família inclui 31 gêneros e 90 espécies, denominadas conjuntamente de

bagres ou peixes-lisos, mas com vários nomes populares específicos. Alguns representantes desse

grupo estão entre os maiores peixes de água doce da América do Sul e a maioria apresenta

destacada importância na pesca comercial ou de subsistência. No mercado de Manaus foram

encontradas 22 espécies pertencentes a 16 gêneros (Soares et al., 2008 e Santos et al., 2009).

1.2.2 Superordem Acanthopterygii

Muitas das ordens que a incluem (cyprinodontiformes, symbranchiformes,

pleuronectiformes, tetraodontiformes e perciformes) são extremamente importantes no Amazonas

do ponto de vista comercial (Val et al., 1995 e Barthem et al., 2003).

A ordem dos Perciformes caracteriza-se por serem peixes sedentários, típicos de lagos e

caracterizados por corpo coberto com escamas, nadadeiras dorsal, anal e pélvica com alguns raios

duros, em forma de espinho; nadadeira pélvica situada logo abaixo ou a frente da nadadeira

peitoral (Santos et al., 2009). Essa ordem inclui as famílias Scianidae, Nandidae, e Cichlidae

(Val et al., 1995).

6

Figura 2. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Peciformes,

exemplificado por um acará (Apistogramma sp.) (Lima, 2005)

Os peixes da família Scianidae são caracterizados por serem peixes acantopterígios, ou

seja, possuem as nadadeiras com espinhos precedidos de raios e apresentam dois espinhos na

nadadeira anal; e ainda por possuírem linha lateral contínua, da cabeça até o final da nadadeira

caudal, sendo que as escamas da linha lateral maiores que aquelas do restante do corpo.

Normalmente a nadadeira dorsal é longa e nadadeira caudal com uma projeção mediana em forma

de lança. As espécies destacam-se pela presença de otólitos (estruturas calcárias) muito grandes

em relação aos outros grupos de peixes. Esse grupo é formado por cerca de 70 gêneros,

principalmente marinhos e estuarinos, amplamente distribuído pelos oceanos, sendo cinco deles

exclusivamente de água doce; quatro ocorrem na Amazônia (Petilipinnis, Plagioscion,

Pachypops e Pachyurus), com cerca de quatorze espécies (Soares et al., 2008 e Santos et al.,

2009).

7

1.3 Lipídeos

Lipídeos caracterizam-se por ser um grupo complexo de substâncias baseadas em ácidos

graxos ou relacionadas a eles, como óleos e gorduras (ésteres formados a partir de ácidos graxos),

fosfolipídeos (diésteres do ácido 3-glicerofosfórico), glicolipídeos (diacilgliceróis ligados a

unidades de carboidratos), ceras (cujos principais componentes são ésteres de ácidos graxos e

alcoóis de cadeia longa), esteróides, terpenos, sabões, detergentes e sais biliares. Aqueles

contendo cadeia graxa são chamados lipídeos saponificáveis e os que não os contém são lipídeos

insaponificáveis (Curi et al., 2002 e Hanahan, 1997, Gunstone, 2008).

1.3.1 Lipídeos saponificáveis

1.3.1.1 Gliceróis

Os gliceróis são compostos por uma molécula de glicerol esterificada com ácidos graxos.

Dependendo do número de grupos hidroxila do glicerol esterificados, os acilgliceróis são

denominados monoacilgliceróis (MAG), diacilgliceróis (DAG) e triacilgliceróis (TAG) (Nelson e

Cox, 2005).

Há dois tipos de monoacilglicerol designado com números ou letras gregas como, por

exemplo, 1-(ou α-) monoestearina e 2-(ou β-) monoestearina. Também há dois isômeros para

diacilgliceróis designados, por exemplo, 1,2-diestearina e 1,3-diestearina, algumas vezes

descritos como isômeros simétrico (1,3-) e assimétrico (1,2-); porém muito frequentemente

ocorrerão grupos acila diferentes e isso aumentará o numero de formas de isômeros, assim como

na molécula de triacilglicerídeo também (Gunstone, 2008). Quando os ácidos graxos presentes

nos gliceróis naturais são iguais, estes são ditos gliceróis simples, quando diferentes são

chamados gliceróis mistos (Gurr, 2002).

8

Figura 3. Ésteres de glicerol (1- e 2- MAG, 1,2- e 1,3 – DAG e TAG). RCO representa o grupo

acil dos ácidos graxos RCOOH. Todas as outras letras estão relacionadas aos átomos derivados

da molécula de glicerol.

Nos triacilgliceróis, como os grupos polares hidroxilas e carboxila dos ácidos graxos

fazem ligações de ésteres, são apolares, moléculas hidrofóbicas, e essencialmente insolúveis em

água. O ponto de fusão dos triacilglicerídeos é determinado, fundamentalmente, pela natureza dos

ácidos graxos na molécula e são extremamente importantes no armazenamento de energia nos

organismos, devido à vantagem de que o átomo de carbono dos ácidos graxos é mais reduzido

que aquele contido no açúcar, sendo o rendimento da oxidação de triacilglicerídeos duas vezes

maior em energia que a oxidação de carbohidrato, e ainda porque triacilgliceróis são hidrofóbicos

e assim desidratados, resultando que o organismo que carrega gordura como fonte de energia não

necessita carregar o peso extra da água de hidratação que é associado com polisacarídeos

estocados (Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).

Triacilglicerídeos são produzidos a partir de duas vias biossintéticas principais

conhecidas, a via sn-glicerol 3-fosfato que predomina no fígado e no tecido adiposo, e uma via de

monoacilglicerol no intestino. Em sementes de plantas de maturação e de alguns tecidos de

origem animal, uma terceira via tem sido reconhecido na qual um diacilglicerol transferase está

envolvido. A principal via de biossíntese de triacilglicerol é a sn-glicerol-3-fosfato, por meio do

qual mais de 90% de triacilgliceróis do fígado são produzidos, no qual esta molécula sofre uma

esterificação com ésteres de ácido graxo coenzima A, sendo o fosfato removido por reação de

MAG

DAG

TAG

1-MAG 2-MAG

1,2-DAG 1,3-DAG

9

hidrólise antes da última esterificação. A molécula de sn-glicerol-3-fosfato, também particpa

como precursor dos fosfolipídeos, aqui classificada como outra classe de lipídeos (Christie, 2011;

Dewick, 2002; Nelson e Cox, 2005).

1.3.1.2 Fosfolipídeos

Os fosfolipídeos são classificados, como os lipídeos que contém grupo fosfato presentes

em suas estruturas moleculares, como os glicerofosfolipídeos e podendo compreender parte dos

esfingolipídeos, mas especificamente as esfingomielinas. São conhecidos por suas propriedades

biológicas e químicas, sendo componentes primários das membranas e essencial para a função

celular, além de atuar como agentes emulsificante (composto que promove a dispersão coloidal

de um líquido em outro) e surfactante (composto que reduz a tensão superficial de uma solução,

como detergentes), devido a sua característica de substância anfifílica (Curi et al., 2002;

Hanahan, 1997; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).

Apesar das diferenças estruturais, todos os glicerofosfolipídeos são constituídos de uma

porção apolar e alifática de dois ácidos graxos conectados por uma ligação de éster no primeiro e

segundo carbono da molécula de glicerol (ou com menos uma ligação éter no primeiro carbono),

conhecida como “cauda”, e de uma porção polar, que contêm normalmente uma unidade de

fosfato ou outros grupos carregados (polares) no terceiro carbono, denominada “cabeça” (Curi et

al., 2002; Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011). Eles são denominados como

derivados do composto ácido fosfatídico, de acordo com o álcool polar do grupo “cabeça”, e os

ácidos graxos em suas estruturas compreende uma grande variedade, contendo, em geral, um

ácido graxo saturado C16 ou C18 no C-1 e um ácido graxo insaturado C18 a C20 no C-2 (Nelson

e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).

10

O-

O

O

O

R1

O

R2

OP

O

O-

O

O-

NH3

+

O

OH

OH

O

NH3

+

O

N+

O

CH3CH3

CH3

OH OH

O

OHOH

OH

Figura 4. Ácido fosfátidico e suas ramificações mais comuns: fosfatidilserina (FS),

fosfatidilglicerol (FG), fosfatidilinositol (FI), fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE).

Sob condições fisiológicas (pH 7,4), as formas mono- e diprotonada do ácido fosfórico

estão em equilíbrio rápido. Assim, o ácido fosfatídico resultante é novamente capaz, através de

sofrer reação de condensação éster com diferentes álcoois, e formar uma grande variedade de

fosfolipídios, isto é, a fosfatidilcolina (FC), fosfatidiletanolamina (FE), bem como a

fosfatidilserina (FS), fosfatidilglicerol, (FG), fosfatidilinositol (PI) e compostos derivados

altamente fosforilados, como fosfolipídios de carga negativa (figura 4).

Os fosfolipídeos constituem uma grande e generalizada classe de biomoléculas, onde,

com excessão das esfingomielinas, todos são fosfoacilgliceróis. Quando em concentrações

apropriadas, os fosfolopídeos suspensos em água se organizam em estruturas ordenadas na forma

de micelas ou bicamadas lipídicas (Motta, 2005, Curi et al., 2002 e Gunstone, 2008). As

esfingomielinas, também contem uma “cabeça” polar e duas “caudas” apolares, mas diferente do

glicerofosfolípideo não tem contem glicerol, ela é composta por uma molécula de esfingosina,

FS

Ácido fosfatídico

FC

FG

FI

FE

11

que é um álcool amina de cadeia longa, uma molécula de ácido graxo de cadeia longa e um grupo

“cabeça” polar que realiza uma ligação fosfodiéster (Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005).

1.3.1.3 Esfingolipídeos

Os esfingolipídeos são o segundo maior componente lipídico das membranas animais e

vegetais, não contem glicerol, mas apresentam como esqueleto básico da molécula, alcoóis amino

de C18, que são a esfingosina e dihidroesfingosina, e seus homólogos C16, C17, C19, e C20. As

moléculas mais simples desse grupo são as ceramidas, derivadas de ácidos graxos ligados ao

grupo amino (−NH2) no C2 da esfingosina, ocorrem apenas em pequenas quantidades em tecidos

de plantas e animais, mas formam os compostos progenitores dos esfingolípidos mais

abundantes:

Esfingomielinas – são ceramidas que contém tanto uma fosfocolina ou uma

fosfoetanolamina em suas estruturas, podendo ser classificada, mais especificamente, como

esfingofosfolipídeos.

Cerebrosídeos – são ceramidas com o grupo “cabeça” consistindo de um resíduo de um

único açúcar, sendo os galactocerebrosídeos possuídores do açúcar β–D-galactose e os

glucocerebrosídeos contendo como açúcar no grupo “cabeça” a β-D-glucose.

Gangliosídeos – são ceramidas oligosacarídeos que incluem entre seus grupos de açúcares

no mínimo um resíduo de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico e seus derivados) (Motta,

2005; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).

NH

H3C(H2C)12

H

OH

O

O

(CH2)n

CH3

açúcar açúcar açúcar

Figura 5. Estrutura básica dos esfingolipídeos.

esfingosina

cerebrosídeo ceramida

12

1.3.1.4 Ceras

A maioria das ceras são ésteres de ácidos graxos de cadeia longa (C14 a C36) saturada e

insaturada com alcoóis de cadeia longa (C16 a C30). Seus pontos de fusão geralmente são mais

altos que aqueles dos triacilglicerídeos, e possuem funções variadas, para fitoplânctons, por

exemplo, elas são a principal forma de fonte de energia metabólica, mas também funcionam

como revestimento de proteção em folhas, caules, frutos e na pele de animais, devido a sua

propriedade de impermeável à água (Nelson e Cox, 2005).

1.3.1.5 Ácidos graxos

Os ácidos graxos, assim como estruturas diretamente a eles relacionadas (como álcoois,

aldeídos ou aminas) são, em geral, componentes fundamentais dos lipídeos, que desempenham

um papel vital na sobrevivência dos organismos vivos. Deve ser enfatizado que ácidos graxos na

sua forma livre existem em níveis muitos baixos, e ocorrem principalmente na forma de ésteres

ou amidas (Curi et al., 2002; Hanahan, 1997).

Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos, geralmente monocarboxílico, de longas cadeias

de hidrocarbonetos acíclicas, apolares, na maioria das vezes sem ramificações e número par de

átomos de carbono. Podem ser saturados, monoinsaturados (contém uma ligação dupla) ou

poliinsaturados (contêm duas ou mais ligações duplas). Os mais abundantes contêm 16 e 18

átomos de carbono e em geral, as ligações duplas nos ácidos graxos poliinsaturados estão

separadas por um grupo metileno, −CH=CH−CH2−CH=CH−, ou seja, suas duplas ligações estão

dispostas em um arranjo não-conjugado, o que os torna suscetíveis a serem oxidados a

hidroperóxidos (Belitz et al., 2004).

Os ácidos graxos insaturados naturais ocorrem normalmente com configuração cis (Z). Na

tabela 1, são apresentados exemplos dos ácidos graxos mais comuns com suas respectivas cadeias

e nomenclatura oficial da IUPAC (União Internacional Química Pura e Aplicada).

13

Tabela 1. Alguns ácidos graxos de ocorrência natural (Gunstone et al., 2004; Gurr, 1999; Gurr,

2002).

Nome usual Nome oficial (ácido) N° de átomos de

carbono

Ponto de fusão Família

Butírico butanóico 4 -7,9 -

Capróico hexanóico 6 -8,0 -

Caprílico octanóico 8 12,7 -

Cáprico decanóico 10 29,6 -

Láurico dodecanóico 12 42,2 -

Mirístico tetradecanóico 14 52,1 -

Palmítico hexadecanóico 16 60,7 -

Palmitoléico cis-9 -hexadecenóico 16 1,0 -

Esteárico octadecanóico 18 69,6 -

Oleico cis- 9- octadecenóico 18 16,0 -

Petroselenico cis- 6- octadecenóico 18 33,0 -

Linoleico cis- 9,12- octadecadienóico 18 -5,0 -6

α-linolênico cis- 9,12,15-octadecatrienóico 18 -11,0 -3

γ-linolênico cis-6,9,12- octadecatrienóico 18 - -6

Araquidico eicosanóico 20 75,4 -

Gondóico cis-11-eicosenóico 20 24,0 -

- cis –11,14 -eicosenóico 20 - -6

- cis- 8,11,14 -eicosatrienóico 20 - -3

Araquidônico cis-5,8,11,14-eicosatetraenóico 20 -49,5 -3

EPA cis –5,8,11,14,17-eicosapentaenóico 20 - -

Behênico docosanóico 22 80,0 -

Erúcico cis-13-docosenóico 22 24,0 -

- cis 13,16 docosadienoico 22 - -6

- cis-13,16,19- docosatrienóico 22 - -3

- cis- 7,10,13,16 – docosatetraenóico 22 - -6

DHA cis-4,7,10,13,16,19- docosahexaenóico 22 - -3

Nervônico cis -15-tetracoseinóico 24 - -

Os ácidos graxos poliinsaturados possuem outra nomenclatura, além da IUPAC, bastante

utilizada para descrevê-los, que é o sistema ômega, que se refere à posição das ligações duplas,

em relação ao carbono mais afastado do grupo carboxila. Por exemplo, o ácido linoléico que

possui nome da IUPAC como ácido (Z, Z)-9,12-octadecadienóico pertence à série ω-6, enquanto

que o ácido δ-linolênico nomeado de ácido (Z, Z, Z)-9,12-15-octadecatrienóico, pertence à série

ω-3 (Curi et al., 2002).

14

OH

O

O

OH

Figura 6. Estrutura dos ácidos graxos poliinsaturados.

Os pontos de fusão dos ácidos graxos podem ser definidos por suas estruturas, como

podemos ver na tabela 1, podem ser relacionados com o aumento do comprimento da cadeia

hidrocarbonada aumentando o ponto de fusão, e com cadeias ramificadas e ligações duplas cis

abaixando o ponto de fusão das cadeias saturadas equivalentes. E ainda é interessante o fato de o

ponto de fusão depender da cadeia ser par ou ímpar, e determinar o estado físico da matéria, onde

ácidos graxos saturados com dez ou mais átomos de carbono são sólidos em temperatura

ambiente e todos os insaturados são líquidos nesta temperatura (Gurr et al., 2002; Motta, 2005).

1.3.3 Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis

Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis são a transesterificação e a

esterificação, onde a transesterificação consiste de um éster resultando em outro éster e a

esterificação consiste em ácido graxo produzindo um éster. Ambas as reações se processam da

reação com um álcool de cadeia curta, na presença de um catalisador, podendo ser uma base ou

um ácido para a primeira e somente via ácida para a segunda (Barreto, 2010).

O

O

O

O

R1

R2

O

O

R3

R OH

R1

O

OR

R2

O

OR

R3

O

OR

OH

OH

OH

+ +

Figura 7. Reação de transesterificação de triacilglicerideo com ácool produzindo glicerol e

ésteres alquilícos.

ácido linoléico

(Z, Z)-9,12-octadecadienóico

ω-6

ácido α-linolênico

ácido (Z, Z, Z)-9,12-15-octadecatrienóico

ω-3

Triacilglicerídeo

álcool

Ésteres de ácidos graxos

Glicerol

15

1.3.4 Ocorrência de ácidos graxos poliinsaturados em peixes e sua importância na saúde

humana

As principais funções dos ácidos graxos poliinsaturados, em peixes e nos mamíferos

terrestres superiores, são como reserva de energia na forma de triacilglicerídeos, como

precursores de eicosaenóides (produtos naturais com 20 átomos de carbonos que são divididos

como prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos) e como constituintes essenciais de

fosfolipídios de biomembranas. Os ácidos graxos de peixes diferem dos poliinsaturados

encontrados em plantas, por serem de cadeia mais longa, com a presença de um maior número de

insaturações e pertencerem à série ômega 3 (ω-3), ao invés da ômega 6 (ω-6). Tanto a série ω-3,

quanto a ω-6, possui ácidos graxos essenciais ao homem, ou seja, que o ser humano não consegue

sintetizar, como o ácido linoléico e o ácido linolênico, que são fundamentais para o metabolismo

e obtidos a partir da dieta. Os ácidos graxos essenciais são precursores para a biossíntese de

vários metabólitos importantes (Motta, 2005). Os ácidos da série ω-6 são responsáveis pela

proteção dérmica e pela produção de importantes mediadores farmacológicos lipídicos como os

derivados do ácido araquidônico. Os ácidos da família ω-3 são responsáveis por evitar distúrbios

neurológicos e visuais, porque são importantes no desenvolvimento do cérebro (Kasim-Karakas,

2001; Hanahan, 1997).

Óleos de peixes são ricos em ômega 3, porque peixes naturalmente consomem dietas ricas

em tais ácidos. Os ácidos graxos poliinsaturados são sintetizados por fitoplânctons, que são

consumidos por peixes, moluscos e crustáceos (cadeia alimentar). Normalmente os peixes

possuem fosfolipídios com alto teor dos ácidos docosahexaenóico e eicosapentaenóico, mais

conhecidos por suas siglas em inglês, DHA e EPA, respectivamente. Esses ácidos graxos

constituem mais de 50% do total de ácidos graxos em alguns fosfolipídeos de peixes, geralmente

numa razão de cerca de 2:1. Já o ácido araquidônico, também conhecido por sua sigla em inglês –

AA, normalmente é responsável por somente 1 a 2% do total de ácidos graxos existentes em

fosfoglicerídeos de peixes, com a notável exceção das fosfotadilinositols, onde o ácido

araquidônico pode ser o principal ácido graxo poliinsaturado (Netleton, 1995).

A quantidade de ácido graxo ômega 3 que ocorre em diferentes espécies de peixes varia

muito, com as espécies ricas em gordura tendo as maiores quantidades de ácidos graxos ômega.

O tipo e a quantidade de ácidos graxos nos peixes variam principalmente com o que o peixe

come, mas outros fatores também influenciam na composição de ácidos graxos: tamanho ou

16

idade, estado reprodutivo, localização geográfica e estação do ano influenciam todo o conteúdo

de gordura e composição (Netleton, 1995).

Para o homem, o consumo de uma dieta rica de ácidos graxos da série ω-3 reduz riscos

associados a doenças cardiovasculares, arterosclerose, hipertensão, inflamações em geral, asma,

artrite, psoríase e de vários tipos de câncer (Andrade et al., 2009; Moura et al., 2006). Os

mecanismos pelos quais os ácidos graxos ω-3 e 6 previnem doenças está relacionado ao fato de

que a partir dos ácidos graxos poliinsaturados se derivam substâncias denominadas eicosanóides,

que são hormônios paracrinos, isto é, atuam somente em células próximas ao local onde foram

sintetizados por um curto período de tempo, devido a sua rápida degradação. Estes compostos são

produzidos em quantidades muito pequenas, mas que apresentam funções metabólicas potentes,

como regulação da pressão sanguínea, diurese, agregação plaquetária, sistema imune, secreções

gástricas, reprodução, contração de músculos lisos, etc., porém a ingestão desequilibrada de ω-6,

ou seja, excessiva, está associada ao aumento da produção de eicosanóides que potencializam as

inflamações. Então a ingestão de ω-6 equilibrada com ω-3 ou somente deste último previnem

doenças por estar relacionado à substituição de ω-6, especialmente AA, por ácidos ω-3 como

EPA e DHA, reduzindo a produção de prostaglandina tipo E2, de tromboxano tipo A2, e

contribuindo para a formação de leucotrieno B4, que é indutor da resposta inflamatória, aumento

da concentração de prostaglandina E3 e leucotrieno A5 (Netleton, 1995).

CH3

CO2H

CH3

CO2H

O

OH

CO2H

OH

CH3

O

OH

CO2H

OH

CH3

Figura 8. Prostaglandinas resultantes (PGE2 e PGE3) dos ácidos graxos araquidônico e

eicosapentaenóico.

Ácido araquidônico (n 5,8,11,14) Ácido eicasapentaenóico (n 5,8,11,14,17)

PGE2 PGE3

17

E ainda um importante ácido graxo para o homem é CLA (ácido linoleico conjugado), que

embora possua poucos estudos, há evidência de propriedades anticancerígenas. Tal evidência

vem a partir de estudos de cultura de células (incluindo células humanas) e de estudos com

animais vivos, principalmente ratos e camundongos, (Gurr, 1999).

1.3.5 Lipídeos insaponificaveis

Dentre os compostos insaponificáveis podemos destacar os esteróides, tocóis e

carotenóides, que serão comentados a seguir (Gurr, 1999).

1.3.5.1 Esteróides

Os esteróides são triterpenos modificados contendo o sistema de anel tetracíclico do

lanosterol, mas faltando três grupos metila nos carbonos C-4 e C-14, o qual confere à molécula a

caraterística de ser quase planar e relativamente rígida, por causa do anel fundido não permitir

rotação na ligação C-C. São comuns nas membranas dos organismos eucarióticos, onde eles são

importantes para propocionar a estabilidade. Eles ocorrem em muitos óleos e gorduras,

compartilham algumas das suas propriedades fisicas e estão relacionados intimamente aos óleos e

gorduras em discussões de alimentação e saúde, podendo ser encontrados em suas formas livres e

também esterificadas (Dewick, 2002; Gunstone, 2008; Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005).

O colesterol, o principal esteróide em tecido animal, que exemplifica a estrutura

fundamental dos esteróides, é anfipático com um grupo “cabeça” polar e um corpo de

hidrocarboneto apolar. Tem sido associado com doenças coronárias e muitas recomendações de

ingestão de lipídeos estão relacionados a sua influência no sitema cardiovascular. Esteróides

similares sao encontrados em outros eucariontes: estigmasterol em plantas e ergoesterol em

fungos, por exemplo. Os esteróides, no geral, são um precursor essencial de ácidos biliares,

corticóides, hormônios sexuais e hormônios derivados da vitamina D (Gunstone, 2008, Nelson e

Cox, 2005).

18

CH3CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

Figura 9. Colesterol (esquerda) e sitosterol (direita).

1.3.5.2 Tocóis

Os tocóis são compostos com fenólicos heterocíclicos com cadeia lateral isoprenóide

lipofílica de 16 carbonos. Compreendem os tocoferóis e os tocotrienóis, que possuem duas

qualidades, mas são propriedades idênticas: apresentam atividade da vitamina E e poderosos

antioxidantes naturais lipofílicos, isto porque como são hidrofóbicos, se associam com

membranas celulares, depósitos lipídicos e lipoproteínas no sangue, e ainda porque o anel

aromático reage e destrói formas de oxigênio radicalares, protegendo ácidos graxos insaturados

de oxidação (Gunstone, 2008, Nelson e Cox, 2005).

Os tocóis, em geral, são encontrados em proporções variáveis em plantas, sendo que as

fontes principais são óleos vegetais, germe de trigo, sementes oleaginosas, vegetais folhosos

verde-escuros e alimentos de origem animal, principalmente gema de ovo e fígado. Tanto

tocoferóis como tocotrienóis ocorrem em uma variedade de isômeros que diferem na estrutura de

acordo com o número e a localização de grupos substituintes no anel cromanol. Os isômeros mais

abundantes nos alimentos são γ- e o α- tocoferol (Gurr, 2002).

O

CH3 CH3 CH3

CH3

R

OH

R

R

CH3

Figura 10. Tocoferóis e tocotrienóis. Tocoferóis tem uma cadeia lateral C16 saturada, tocotrienóis

tem ligações duplas nas três posições indicadas pelas setas. R = H ou CH3; α = 5,7,8-

trimetiltocol; β = 5,8-dimetiltocol; γ = 7,8-dimetiltocol; δ = 8-metiltocol.

19

1.3.5.3 Carotenóides

Os carotenóides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza que

desempenham papéis fundamentais na saúde humana, sendo essenciais para a visão. O β-caroteno

e outros carotenóides foram reconhecidos no século XX como as principais fontes de vitamina A,

sendo que a conversão ocorre naturalmente no fígado (Nelson e Cox, 2005).

Quanto à estrutura química, os carotenóides são tetraterpenóides, terpenos de 40 carbonos

unidos por unidades opostas no centro da molécula e a ciclização, hidrogenação, desidrogenação,

migração de duplas ligações, encurtamento ou alongamento da cadeia, rearranjo, isomerização,

introdução de funções com oxigênio ou a combinação destes processos resultam na diversidade

de estruturas dos carotenóides. Quando estes são compostos somente de carbono e hidrogênio são

chamados de carotenos e quando oxidados, carotenóides (Rodrigues-Amaya et al., 1999).

CH3

CH3 CH3CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3CH3

Figura 11. β-caroteno. Outros carotenos variam na natureza nos grupos terminais cíclicos.

1.3.6 Reações comuns envolvendo componentes insaponificáveis de óleos

Uma reação comum com lipídeos insaponificáveis, especificamente com esteróides, para

realização de sua análise é a sililação, a qual trata-se de uma reação que busca bloquear os sítios

próticos, havendo uma redução de interações do tipo dipolo-dipolo, elevando a volatilidade dos

compostos, usando-se normalmente compostos trimetilsilil como reagente, além de gerar

produtos com polaridade reduzida. O mecanismo de reação é via substituição nucleofilica de

segunda ordem, conforme mostrado a seguir (Becker, 2012).

20

amostra OH CH3 Si

CH3

X

CH3

amostra O+

H

Si-

CH3

CH3CH3

X O Si

CH3

CH3

CH3

amostra H X+ +

Figura 12. Mecanismo genérico da reação de sililação, onde X varia de acordo com os diferentes

derivatizantes (Becker, 2012).

1.3.7 Ocorrência de componentes insaponificavéis em óleos de peixes e a importância na

saúde humana

Estudos com peixes, mais especificamente estudos com tubarão, apontam para a presença

de lipídeos insaponificáveis em sua composição, sendo tais lipídeos importantes para a saúde

humana (Gunstone, 2004). O colesterol, apesar de atualmente ser visto frequentemente como uma

substância maléfica à saúde humana, possui função importante para o transporte de ácidos graxos

através do sangue na forma de lipoproteínas, as quais são de grande interesse para pesquisas

sobre arterosclerose, apresentando níveis acima de 7000 ppm como componentes em óleo de

peixe (Gunstone, 2008).

Outro lipídeo insaponificavel de grande importancia para o homem são os tocóis, por

desempenhar papel de antioxidante, protegendo ácidos graxos poliinsaturados vulneráveis (ou

ácidos graxos residuais de lipídeos) em membranas celulares e lipoproteínas de processos de

peroxidação (Fulchs et al., 2001), já que os produtos da peroxidação de lipídeos podem causar

danos as células. Os tocotrienóis são encontrados como poderosos inibidores da enzima que

cataliza a etapa limitante na biossíntese do colesterol (Gurr, 1999). Esses compostos se

apresentam como pouca quantidade em óleos de peixe, mas possuem papéis significativos na

saúde. Bem como os carotenoides, que mais recentemente, apresentaram efeitos benéficos contra

cânceres, doenças de coração e degeneração macular e foram estimuladas intensas investigações

sobre o papel desses compostos como anti-oxidantes e como reguladores de resposta do sistema

imune (Almeida et al., 2006; Delgado-Vargas et al., 2000; Orban et al., 2011; Orban et al., 2000;

Prego et al., 2012).

21

1.4 Informações referentes às espécies de peixes selecionadas para estudo

Informações gerais das espécies a serem estudadas se encontram descritas na Tabela 2.

Quanto à estudos existentes sobre lipídeos não foram encontrados para as espécies amazônicas

estudadas neste trabalho.

Tabela 2. Informações sobre as espécies em estudo (Santos et al., 2009; Soares et al., 2008).

Sardinha comprida Curimatã Pacu comum ou pacu

manteiga

Jaraqui-de –escama-

grossa

Pescada branca Surubim

Espécies Triportheus elongatus

Gunther, 1864

Prochilodus nigricans

Agassiz, 1829

Mylossoma duriventre

Cuvier, 1817

Semaprochilodus

insignis Schomburgk,

1841

Plagioscion

squamosissimus

Heckel, 1840

Pseudoplatystoma

fasciatum Linnaeus,

1766

Ordem Characiformes Characiformes Characiformes Characiformes Perciformes Siluriformes

Família Characidae Prochilodontidae Characidae Prochilodontidae Sciaenidae Pimelodidae

Porte médio porte Grande porte Porte médio Grande porte Grande porte Grande porte

Biologia Pelágica bentopelágica pelágica bentopelágica Bentônico

Ocorrência águas brancas, claras e

pretas

Águas claras, pretas e

branca.

águas brancas, claras e

pretas


pretas

Claras, brancas, pretas e

mixtas


pretas

Alimentação onívora com tendência

herbívora

Detrívoro Herbívoro, com

tendência onívora

detritívoro carnívoro Piscívoro

Hábito diurno, migradora Diurno, migrador diurno, migradora diurno, migradora Noturno Noturno, migradora

Desova Total em rios de águas

brancas

Total, em águas claras

e brancas

Total em confluências

de rios de águas pretas

e brancas

Total em rios de águas

pretas e brancas

parcelada Total na enchente

Fecundação Externa Externa externa externa Externa Externa

Época sazonal

para

reprodução

Seca inicio da enchente Final da seca inicio da

enchente

Seca e cheia início da enchente Todo o ano com pico na

enchente

Entre a enchente e cheia

Importância

econômica

Insignificante no geral

e destacada no grupo

Moderada, domina o

mercado em épocas do

ano

Insignificante no geral

e destacada no grupo

Destacada no geral e no

grupo

Insignificante no geral e

destacada no grupo

Insignificante, pesca

comercial na Amazônia

internacional

Participação da

produção

pesqueira do

amazonas

9,17% (2003) 9,41% (2003) 15% as duas espécies

(2003)

30,7% as duas especies

(2003)

0,94% (2003) 2,07% (2003)

Destacada: acima de 20%;

Moderada: entre 5 e 20 %;

Insignificante: abaixo de 5%.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Conhecer e quantificar os constituintes lipídicos de óleos de seis espécies de peixes

amazônicos, jaraqui (Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu

(Mylossoma duriventre), sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada

(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum

Linnaeus, 1766), utilizando métodos inéditos de análises.

2.2 Específicos

Obter lipídeos totais de seis espécies de peixes amazônicos;

Separar os óleos extraídos por classe de lipídeos utilizando métodos

cromatográficos;

Otimizar a derivatização dos diferentes lipídeos a ésteres metílicos de ácidos

graxos para análise por cromatografia gasosa- CG;

Otimizar o método de análise de ésteres metílicos de ácidos graxos

poliinsaturados por cromatografia gasosa de alta resolução com detector de ionização por

chama- CG-DIC;

Confirmar a identificação dos ácidos graxos poliinsaturados por cromatografia

gasosa acoplada com detector de espectrometria de massas- CG-EM;

Identificar os ácidos graxos nas classes de lipídeos dos peixes.

Quantificar os diferentes ácidos graxos identificados nas amostras analisadas;

Identificar os esteróides presentes nos lipídeos dos peixes;

Quantificar esteróides presentes nos lipídeos dos peixes.

24

3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Material

3.1.1 Seleção das espécies e coleta do material biológico

Foram estudadas seis espécies diferentes de peixes, selecionadas dentre as que

apresentam maior importância econômica para o Estado do Amazonas, segundo levantamento

realizado pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA (Santos et al., 2009),

listadas a seguir: jaraqui (Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu

(Mylossoma duriventre), sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada

(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum

Linnaeus, 1766).

Os peixes foram adquiridos no mercado de Manaus, na Feira da Manaus Moderna, na

manhã do dia 05 de abril de 2012, sendo 5 pacus, 8 sardinhas, 6 jaraquis, 2 surubims, 5

curimatãs e 2 pescadas. Todos na fase adulta, a quantidade de cada peixe foi estabelecida

baseada no critério de se obter pelo menos 300 g de músculo dorsal e também uma variedade

mínima de dois indivíduos de cada espécie. Sendo a coleta dos peixes realizada no período de

enchente (janeiro a junho), a qual do ano em questão, 2012, apresentou a maior cheia até o

momento superando a de 2009 um mês antes, com 29,97 m contra 29,77 m de 2009

(http://www.portodemanaus.com.br/?pg=nivelhj.php).

A identificação das espécies foi feita comparando-se com a literatura (Soares et al.,

2008 e Santos et al., 2009).

3.1.2 Reagentes, solventes e instrumentos cromatográficos utilizados

Acetato de etila – Química CREDIE

Acetona – Química CREDIE

Ácido acético (99,8%) – Merck

Ácido fosfomolíbdico P.A – Merck

Água destilada

Alumina 90 – Merck

Anisaldeído (18%) – Vetec

Trifluoreto de Boro em meio metanólico (BF3 12%) – Aldrich

Clorofórmio PA – Química CREDIE

Éter etílico – Labsynth

http://www.portodemanaus.com.br/?pg=nivelhj.php

25

Etanol anidro (99,5%) – Química CREDIE

Fenolftaleína PA – Nuclear

Hexano, grau HPLC (95%) – TEDIA

Hidróxido de potássio (85%) - Merck

Metanol (99,85%) – Química CREDIE

Metilato de sódio (30%) – COGNIS

Metil t-butil éter, grau HPLC – TEDIA

Nitrogênio comprimido –WHITE MARTINS

Silica gel (0,040-0,063 mm) – Merck

Cromatográfo gasoso com detector de ionização de chamas (CG-DIC) - Agilent, modelo HP

6890 Plus, configurado com detectores de ionização por chama, sistema de injeção

automática, Chemstation.

Cromatográfico gasoso acoplado com espectrômetro de massas (CG-EM) – THERMO,

modelo, equipado com injetor automático, detector de espectro de massas com fonte de íons

por impacto eletrônico, analisador do tipo quadrupolo e software XCalibur.

3.2 Métodos

3.2.1 Extração de lipídeos totais

A extração de lipídeos totais dos peixes foi realizada utilizando um método eficiente

que não usa solventes organoclorados e que foi desenvolvido como parte inical deste estudo.

3.2.1.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais

Foi desenvolvida uma metodologia alternativa ao método convencional de Bligh e

Dyer (1959), o qual é normalmente usado para extração de lipídeos totais de material

biológico, avaliando-se solventes não-organoclorados em comparação com o clorofórmio.

Testaram-se os éteres dietílico e metiltertbutílico em diferentes proporções numa mistura com

metanol e água (tabela 3), usando como matriz para extração uma solução com 5 mg de cada

padrão comercial: triestearina, ácido esteárico e DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil.

26

Tabela 3. Proporção de mistura de solventes para extração de lipídeos totais.

Solvente Metanol Água

Clorofórmio 4 4 2

Éter dietílico 4 2 2

MTBE 4 2 2

O experimento acima foi monitorado por cromatografia em camada delgada (CCD)

(sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido

fosfórico 8% aquoso) e seu rendimento foi medido. Os solventes utilizados neste experimento

tiveram seus coeficientes de partição em mistura previamente testados.

Depois de definida a mistura de solventes para a extração de lipídeos totais foi

analisada o procedimento de extração, utilizando uma matriz biológica, 200 g do músculo

dorsal de um indivíduo de tucunaré-comum (Cichla monoculus Spix & Agassiz, 1831). Os

lipídeos foram extraídos com cerca de 1 L de MTBE:metanol:água (4:2:2), usando

multiprocessador de alimentos (Philips walita), sendo a mistura resultante filtrada em funil de

Büchner, separadas suas fases em funil de separação, e a fase de MTBE centrifugada por 10

min à 25°C a 15500 rcf (relative centrifugal force), concentrada em rotaevaporador, e por fim

seca sob nitrogênio gasoso.

3.2.1.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo

Os peixes foram limpos em água corrente e o músculo dorsal de cada um foi retirado

com auxílio de uma faca. Os indivíduos de mesma espécie foram reunidos, pesados conforme

mostra a tabela 4 e extraídos seus lipídeos totais usando multiprocessador de alimentos

conforme metodologia resultante do ítem acima, onde para cada 100 g de peixe uma mistura

de 500 mL dos solventes MTBE:MeOH:água na proporção 4:2:2 e a adição de 32,0 mg do

padrão interno éster metílico do ácido graxo C 19:0 (EMAG) foram realizadas. Depois de

filtrado em funil de Buüchner as fases da mistura foram separadas em funil de separação e a

fase etérea foi centrifugada por 10 min à 25°C a 15500 rcf e concentrada em rotaevaporador,

seca sob nitrogênio gasoso e liofilizadas.

27

Tabela 4. Peso do músculo dorsal de cada espécie de peixe e de padrão interno EMAG C19:0

usado para extração.

Peixe Músculo dorsal (g) Padrão interno (mg)

curimatã 606,01 192,0

pescada 606,40 192,0

sardinha 298,82 95,8

jaraqui 608,06 191,6

surubim 600,93 191,7

pacu 305,86 96,0

3.2.1.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais

Cerca de 50 mg de lipídeos totais liofilizados de cada espécie de peixe em estudo,

além do lipídeo total do peixe tucunaré, que foi usado como teste foram eluídas em cartucho

de Extração em Fase Sólida (EFS) a fim de separar o EMAG dos demais constituintes do

extrato para verificação de recuperação do padrão, durante o processo de extração de lipídeos

totais.

Para o procedimento utilizando EFS, um cartucho de vidro de com diâmetro 0,9 cm,

foi empacotado à seco com cerca de 2 cm de sílica flash, com auxílio de ar comprimido, e 1

cm de sulfato de sódio foi colocado no topo do cartucho. As amostras foram eluídas com 20

mL de uma mistura dos solventes hexano:acetato de etila na proporção 99,7:0,3 (solvente grau

HPLC), coletando-se em balão de fundo redondo de 50 mL. Cada amostra foi concentrada em

rotaevaporador, mantida sob vácuo em dessecador com secante sulfato de sódio e ainda seco

sob nitrogênio para determinação de massa.

Cada amostra resultante obteve seu perfil cromatográfico realizado por CCD (sistema

clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido fosfórico 8%

aquoso) e depois de preparadas, por diluição, solução na concentração de 1 mg/mL em

hexano, foram analisados por CG-DIC. O método do CG-DIC usado, consistia de uso do gás

de arraste hélio com fluxo de 1m L/min, modo de injeção split 2:1 à 250°C, com temperatura

do forno começando em 200°C, mantendo nessa temperatura por 10 min, subindo numa

rampa de 6°C/min até 260°C e mantendo-se nessa última temperatura por 5 min, a fase

estacionária utilizada foi uma coluna HP 5, a temperatura do detector utilizada foi de 270°C.

28

Utilizando o mesmo método no CG-DIC uma curva analítica com o padrão comercial

de EMAG C 19:0 foi feita com 7 concentrações diferentes em dois dias consecutivos, para o

uso do método de quantificação por padrão interno, onde através da regressão linear da

equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em mg/mL) gerada

pela curva da média, calculou-se as concentrações reais das amostras, as quais deveriam ser

na concentração de 1 mg/mL, já que as amostras foram preparadas nessa concentração e

como houve uma filtração somente do analito este deve estar em sua totalidade inicial

equivalente ao peso encontrado de lipídeos totais.

3.2.2 Separação em classes e de seus componentes

Procurando-se um método para separação dos lipídeos em classes, que reduzisse o

tempo do processo, bem como a quantidade de solvente e de amostra utilizados, e seguindo

ainda o conceito da metodologia descrita por Johnston e colaboradores (1983), em que se

obtêm suas diferentes classes (lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos) através do

fracionamento em coluna aberta dos extratos de lipídeos totais, por ordem de polaridade,

desenvolveu-se uma metodologia de extração em fase sólida (EFS).

3.2.2.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos

Inicialmente foi feita uma comparação entre o método descrito por Johnston e

colaboradores (1983) e um sistema utilizando EFS, a partir de lipídeos totais extraídos de

sardinha-comprida (Triportheus elongatus Gxunther, 1864). Separando os lipídeos totais em

neutros e polares pelo método de Johnston (1983), cerca de 20 g de sílica gel (63-200 µm),

previamente ativada por 2 h à 80°C em estufa de circulação de ar, foram empacotadas em

suspensão com clorofórmio em uma coluna cromatográfica de vidro com 1,6 cm de diâmetro,

correspondendo a altura de sílica contida na coluna de 22 cm. Uma fase de 1 cm de altura, da

coluna, do sal secante sulfato de sódio foi colocada no topo da sílica empacotada e cerca de 1

g de amostra de lipídeos totais foi adicionada solubilizada em 1 mL de clorofórmio, com

auxílio de uma pipeta de Pasteur. Logo depois de o sulfato de sódio ter adsorvido a amostra,

400 mL do solvente clorofórmio foi adicionado aos poucos, seguido de 400 mL de acetona, e

este seguido de 400 mL de metanol; sendo cada solvente representante de uma fração, as

quais foram concentradas em rotaevaporador, transferidas para frascos menores e secas sob

nitrogênio gasoso, correspondendo a lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos

respectivas à ordem de eluição dos solventes.

29

Para a extração por fase sólida (EFS) foi empacotado à seco 2 cm do cartucho de

vidro, que mede 0,9 cm de diâmetro, com sílica flash, e adicionando no topo da sílica 1 cm de

sulfato de sódio, adaptadou-se no EFS e cerca de 500 mg dos lipídeos totais de sardinha

solubilizados em 0,5 mL de clorofórmio foram eluídos com 20 mL de cada solvente,

clorofórmio, acetona e metanol, nessa sequência, coletando-se frações de 10 em 10 mL.

Quando secas às frações, foram determinados seus pesos e feito o perfil cromatográfico por

CCD (sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido

fosfórico 8% aquoso). Ainda usando EFS, outros experimentos foram realizados, em um

verificou-se a substituição do solvente clorofórmio por solventes não-organoclorados: o éter

dietilico e o metiltertbutiléter, em outro foi feita uma comparação do uso do metanol e etanol

com água como último sistema no processode eluição, e em um ultimo testou-se a

modificação da estrutura do cartucho de EFS, usando um com 1,3 cm de diâmetro e

empacotando a seco 1,20 cm de altura a sílica flash.

30

Tabela 5. Condições testadas para desenvolvimento do método de separação de classes de lipídeos.

Método Johnston EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 EFS 7 EFS 8

peixe Sardinha sardinha sardinha sardinha sardinha tucunaré Tucunaré tucunaré sardinha

L.T. (g) 1 0,4993 0,5006 0,4996 0,5015 0,503 0,5008 0,5000 0,5002

1°sistema CHCl3 CHCl3 CHCl3 éter dietílico MTBE MTBE MTBE MTBE MTBE

vol(ml) 400,0 20,0 20,0 20,0 20,0 40,0 40,0 40,0 40,0

2°sistema Acetona acetona acetona - - acetona Acetona acetona acetona

vol(ml) 400,0 20,0 20,0 - - 40,0 40,0 40,0 40,0

3°sistema MeOH MeOH MeOH - - MeOH:H2O

(8:2)

EtOH:H2O

(8:2)

EtOH:H2O

(8:2)

EtOH:H2O

(8:2)

vol(ml) 400,0 20,0 20,0 - - 40,0 40,0 40,0 40,0

h sílica (cm) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,2 1,2

di (cm) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 1,3 1,3

padrão int

(mg/100g) - - - - - 32,0 32,0 32,0 -

31

3.2.2.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo

De cada espécie de peixe cerca de 500 mg de lipídeos totais lifiolizados, conforme

tabela 6, foram separados, por classe usando sistema de EFS sob vácuo seguindo a

metodologia desenvolvida no item anterior. O método consistiu de usar um cartucho de 1,3

cm de diâmetro, com 1,2 cm de altura de sílica flash, adicionando no topo da sílica 1 cm de

sulfato de sódio, aplicando-se cada amostra solubilizada em 1 mL de MTBE e eluir com 50

mL de cada sistema de eluição, MTBE 100%, acetona 100% e etanol:água 8:2, nessa

sequência, coletando-se frações de 50 em 50 mL, e quando secas foram determinados seus

pesos e perfil por CCD (sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico

10% em ácido fosfórico 8% aquoso).

Tabela 6. Peso de lipídeos totais de cada peixe utilizado para a separação de classes de

lipídeos.

Peixe L.T.(mg)

curimatã 499,80

pescada 500,20

sardinha 472,60

jaraqui 499,30

surubim 480,50

pacu 500,30

3.2.3 Extração de lipídeos insaponificáveis

A fim de se separar uma fração rica em esteróides e tocoferóis (lipídeos

insaponificáveis) e analisá-los qualitativamente e quantitativamente, os lipídeos neutros foram

submetidos ao procedimento de saponificação segundo método de Azevedo-Meleiro e

colaboradores (2004) em duplicata, extraindo os lipídeos insaponificáveis.

3.2.3.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis

Com o objetivo de se testar inicialmente o procedimento de extração de

insaponificáveis em óleo de peixe, cerca de 200 mg de lipídeos neutros de sardinha foram

submetidas ao procedimento de saponificação.

À amostra de lipídeo neutro de sardinha foi adicionado 4 mL de solução de hexano

com 0,1% butil hidróxi tolueno - BHT e 4 mL de solução de hidróxido de potássio 10 %

(KOH) metanólico em balão de fundo redondo em agitação por 16 h no escuro à temperatura

ambiente, e em ambiente de nitrogênio gasoso. Obtida uma fase hexânica e outra metanólica,

32

estas foram separadas e a fase hexânica foi lavada cerca de 3 vezes com água milli-Q na

proporção 1:1 (v/v), até completa remoção do excesso de KOH, o que foi comprovado com o

indicador fenolftaleína. A seguir, a fração hexânica foi concentrada em rotaevaporador a

40°C, sêca na presença de gás nitrogênio para determinação do peso e monitorada por CCD

(hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído) para verificação da presença de tocoferóis e

esteróides por comparação com padrões comerciais (colesterol e α-tocoferol).

3.2.3.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo

Durante esse procedimento foi feita a adição de 0,1 mg do padrão comercial do

esteróide β-sitosterol em cada amostra de lipídeo neutro de peixe a fim de se determinar a

eficiência da extração de insaponificáveis, procedimento discriminado no próximo item, o

ítem 3.2.3.3.

O procedimento para extração dos lipídeos insaponificáveis a partir da fração dos

lipídeos neutros dos peixes em estudo foi realizado conforme testado no ítem 3.2.3.1, onde a

reação de saponificação considerou a relação 1 g de amostra para 20 mL de reagente e 20 mL

de solvente, descriminado na tabela 7. Depois que a fase hexânica foi separada da metanólica

e lavada com água milli-Q, até completa remoção do excesso de KOH, esta foi concentrada

em rotaevaporador, seca na presença de gás nitrogênio para determinação do peso,

monitorada por CCD (hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído) e reservada para reação

de sililação.

Tabela 7. Relação de reagentes, solvente e amostra de lipídeos neutros (L.N.) na reação de

saponificação para os peixes em estudo.

Saponificação

Peixe L.N.(mg) Reagente (mL) Solvente (mL)

curimatã 295,6 6,0 6,0

pescada 301,0 6,0 6,0

sardinha 250,8 6,0 6,0

jaraqui 298,8 6,0 6,0

surubim 236,8 6,0 6,0

pacu 295,3 6,0 6,0

33

3.2.3.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis

No experimento do ítem 3.2.3.2, usando uma pipeta automática, 100 µL de uma

solução do padrão β-sitosterol em hexano na concentração de 1 mg/mL foi adicionado às

amostras de peixes. Esse padrão foi quantificado para verificar a recuperação total do que foi

adicionado inicialmente, ou seja, a concentração de 0,1 mg/mL, através da análise quantitativa

das amostras sililadas na concentração de 1 mg/mL por CG-DIC (3.2.5.3) em método de

análise desenvolvido no ítem 3.2.5.1. E calculando a eficiência do método em porcentagem

da razão entre a concentração real e a esperada em uma amostra de 1 mg/mL, através da

regressão linear da equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em

mg/mL) resultante de uma curva analítica com o padrão esteróide β-sitosterol em solução.

3.2.4 Preparação de amostras para análise de esteróides

3.2.4.1 Verificação do método de reação de sililação

A fração hexânica extraída do tratamento resultante da reação de saponificação dos

lipídeos neutros de sardinha, bem como padrões comerciais de colesterol (esteróide) e de α-

tocoferol (tocol), foi reagido segundo metodologia descrita por Bowden et al. (2009), onde

em um frasco de 2 mL cerca de 10 mg da fração hexânica foram adicionados 200 µL de

reagente derivatizante, sendo 100 µL de BSTFA+TMCS (99:1) e 100 µL de piridina e

mantido por 30 min na lavadora ultra-sônica à 80°C. Ao término depois de verificado a

conversão por CCD (hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído), uma solução de 1 mg/mL

a partir da mistura resultante foi realizada para identificação dos esteróides através de análise

no CG-EM.

3.2.4.2 Aplicação do método de reação de sililação nos peixes em estudo

Para todas as amostras de lipídeos insaponificáveis foi realizada a reação de sililação

segundo metodologia descrita por Bowden et al. (2009), conforme descrito acima no ítem

3.2.4.1. E ao término comparou-se a conversão das amostras por CCD (hexano:acetato 80:20

e revelador anisaldeído) com padrões comerciais de esteróides.

34

3.2.5 Análise de esteróides por cromatografia gasosa

3.2.5.1 Otimização da metodologia de análise de lipídeos insaponificáveis por

cromatografia gasosa (CG-DIC e CG-EM)

O processo de otimização foi feito usando tanto o CG-DIC quanto o CG-EM, sendo

inicialmente utilizado o CG-DIC configurado com uma coluna cromatográfica apolar HP-5,

gás de arraste hélio, injetor no modo split 10:1 à 250°C, volume de injeção de 1µL, detector

na temperatura de 300°C com fluxo de H2 30 mL/min, de ar sintético 300 mL/min e de N2 de

25 mL/min. Posteriormente, utilizou-se o CG-EM, a fim de confirmar a possibilidade de

identificação de componentes em regiões mal resolvidas e assim buscar um aprimoramento do

método, com coluna apolar ZB-5 e linha de transferência e fonte de íons na temperatura de

275°C e 250°C, respectivamente.

O desenvolvimento de um método de separação foi feito a partir de uma mistura de

padrões comerciais disponíveis de esteróides e tocoferóis, alterando os parâmetros de

temperatura do forno do aparelho, bem como o fluxo do gás de arraste (tabela 8), a fim se

obter boa separação dos contituintes da mistura. Os padrões usados foram: colesterol,

ergoesterol, estigmasterol, β-sitosterol e α-tocoferol.

A identificação inequívoca de cada esteróide e tocoferol, foi feita pela análise e

comparação dos tempos de retenção dos padrões e dos espectros de massas com as bibliotecas

disponíveis (Wiley e Adams).

35

Tabela 8. Otimização do método de análise de lipídeos insaponificáveis.

Método Coluna Fluxo

(mL/min) Rampas do forno

Tempo total

(min) Detector

1

Hidalgo Zb-5 0,6 120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 5ºC/min até 300ºC

e mantendo por 10 min 30,66 EM

2 ColToc_1

Zb-5 1,0

120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15 ºC/min até 250ºC, subindo 3ºC/min até

300ºC e mantendo por 5 min 32,32 EM

3

ColToc_4

Zb-5 1,0

120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 5ºC/min até

280ºC, mantendo por 5 min, subindo 10ºC/min até 300°C, mantendo por 5 min. 28,66 EM

4 ColToc_6

Zb-5 1,0


270ºC, mantendo por 8 min, subindo 10ºC/min até 300°C 28,32 EM

5 ColToc_11

Zb-5 1,0


260ºC, mantendo por 5 min, subindo 10ºC/min até 300°C 24,66 EM

6 ColToc_23

Zb-5 1,0

120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, mantendo por 30 min,

subindo 5ºC/min até 300ºC. 50,66 EM

7

Silil_II HP-5 2,1 120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 240ºC, mantendo por 45 min,

subindo 5ºC/min até 300ºC e mantendo por 3 min 70,00 DIC

36

3.2.5.2 Análise qualitativa de esteróides dos peixes em estudo por CG-EM

As amostras de esteróides sililados dos peixes em estudo foram analisadas

qualitativamente por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em método

desenvolvido na seção 3.2.5.1. A identificação inequívoca dos esteróides das amostras de

lipídeos insaponificáveis dos peixes foi feita pela comparação dos seus espectros de massas

com as bibliotecas disponíveis (Wiley e Adams).

3.2.5.3 Análise quantitativa de esteróides dos peixes em estudo por CG-DIC

A quantificação dos esteróides presentes em cada amostra de lipídeos insaponificáveis

de peixes foi realizada por meio da técnica de CG-DIC, empregando o método de

normalização de área, utilizando o padrão interno β-sitosterol para as amostras (3.2.3.2). A

quantificação por padrão interno consiste na construção de uma curva analítica, a partir de

soluções-padrão com concentrações conhecidas de um analito que não contenha na matriz de

análise; que no caso neste trabalho as curvas analíticas foram construídas baseadas em

soluções-padrão de β-sitosterol, nas concentrações na faixa de 0,00625-0,05 mg/mL (4

pontos). E a equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em

mg/mL) gerada pela curvas, proporcionou calcular pela regressão linear as concentrações dos

esteróides nas amostras.

3.2.6 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa

Cada amostra obtida foi analisada na descrição dos ácidos graxos residuais pela

conversão das diferentes amostras de lipídeos em seus respectivos ésteres metílicos e

posterior análise por CG-DIC e CG-EM. Para tal foi necessário otimizar a metodologia de

derivatização já desenvolvida por Barbosa e colaboradores (2009), onde se realizou uma

reação de transesterificação/saponificação utilizando como catalisador o metilato de sódio

(anidro) em metanol, em baixa concentração, seguido da esterificação com BF3/MeOH.

3.2.6.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres

metílicos

Foi feito inicialmente dois experimentos, reproduzindo o método de Barbosa et al.

(2009) e testando outro reagente como esterificante o cloreto de amônia em ácido sulfúrico ao

invés de trifluoreto de boro, usando amostras de lipídeos neutros (fração MTBE),

glicolipídeos (fração acetona) e fosfolipídeos (fração EtOH:água) de peixe. Onde o

esterificante a base de cloreto de amônia foi preparado da seguinte forma: pesando-se cerca de

37

10 g de NH4Cl e adicionando 300 mL de MeOH, seguida da adição em pequenas porções de

15 mL de ácido sulfúrico concentrado com eventual agitação.

E depois várias condições foram testadas, dispostas resumidamente na tabela 9 e

tabela 10, partindo do experimento inicial descrito acima, avaliando-se diferentes

concentrações do catalisador na etapa de transesterificação (experimento I-X), bem como a

adição de álcool em etapas (experimento VII -X), a inversão das etapas normalmente usadas

para primeiro a etapa de esterificação e posteriormente a de transesterificação (experimento

XIII – XIV), e ainda a substituição do álcool por um solvente aprótico (experimento XVII –

XVIII). Buscando o procedimento que fosse mais favorável para a conversão dos ácidos

graxos contidos nas amostras em seus respectivos ésteres metílicos.

Uma observação importante deve ser feita em relação ao experimento IV, o catalisador

básico foi neutralizo com 4 mL de ácido acético, controlando o pH da mistura ao valor de 2

com papel indicador universal de pH. E ainda, após cada reação foi empregado um tratamento

para extração da fase orgânica, onde cerca de 3 mL de hexano foi colocado no tubo de ensaio

e agitado vigorosamente, em seguida 3 mL de solução saturada (15%) aquosa de cloreto de

sódio foi adicionado e também agitado. Depois a fase hexânica (orgânica) foi separada da

hidroalcoólica e transferida para um frasco, seca sob nitrogênio gasoso, e monitorada por

CCD (hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4, revelador ácido fosfomolibdico 20%

etílico) usando padrões comerciais de éster metílico do ácido nonandecanóico, triestearina,

ácido esteárico, DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil, monopalmitolglicerídeo e

dipalmitolglicerídeo para verificação do sucesso ou não de conversão após reação, A fase

orgânica foi solubilizada em 0,5 mL de hexano e tratada em extrator por fase sólida (EFS)

usando cartucho de 0,9 cm de diâmetro contendo 2 cm de altura de sílica flash fase normal e

0,5 cm de altura de sulfato de sódio no topo, eluindo-se com 20 mL do sistema de eluição

hexano:acetato de etila 98:2, coletando em balão de fundo redondo de 50 mL, concentrando

em rotaevaporador, transferindo para frasco, seco sob nitrogênio e monitorado por CCD

(hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4, revelador ácido fosfomolibdico 20% etílico); a

fim de se obter somente os ésteres metílicos para a análise no cromatógrafo gasoso e impedir

problemas de impureza em contato com a fase estacionária do CG.

38

Tabela 9. As primeiras oito condições testadas para otimização do método de derivatização para análise de cadeia graxa por CG.

Método Barbosa et al. 2009 Exp. I Exp. II Exp. III Exp. IV Exp. VI Exp. VII Exp. VIII Exp. IX Exp. X

amostra (classe) L.N., Glico., Fosf. L.N., Glico., Fosf. L.N., Glico., Fosfo. L.N. L.N. L.N., Glico.,

Fosf. L.N. L.N. L.N. L.N.

quantidade (mg) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

1ª reação transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest.

catalisador CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+

concentração 0,24 M 0,24 M 5,38 M 0,35 M 0,35 M 0,35 M 0,35 M 0,23 M 0,35 M 0,69 M

via metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica

volume 4 mL 4 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 1mL +1mL 1mL +2mL 1mL +1mL 1mL +1mL

tempo (min) 15 15 30 30 30 30 30 30 30 15

agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom

temperatura (°C) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

2ª reação esterif. esterif. esterif. esterif. neutraliz. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif.

catalisador BF3 NH4Cl- H2SO4 BF3 NH4Cl- H2SO4 ác. Acético BF3 BF3 BF3 NH4Cl-

H2SO4 BF3

concentração 1 M 0,63 M 1 M 0,63 M - 1 M 1 M 1 M 0,63 M 1 M

via metílica metílica metílica metílica - metílica metílica metílica metílica metílica

volume 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL - 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL

tempo (min) 15 15 30 30 - 30 30 30 30 15

agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom - ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom

temperatura (°C) 50 50 50 50 - 50 50 50 50 50

39

Tabela 10. As demais condições testadas para otimização do método de derivatização para análise de cadeia graxa por CG.

Método Exp. XI Exp. XIII exp. XIV exp. XV exp. XVI exp. XVII exp. XVIII exp. XIX exp. XX

amostra L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N.PI L.N., Glico.,

Fosf.

quant. (mg) 50 50 50 50 50 50 50 50 50

1ª reação transest. esterif. esterif. transest. transest. transest. transest. transest. transest.

catalisador CH3O-Na+ BF3 novo BF3 novo CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+

concentração 0,46 M 1 M 1 M 1,19 M 1,04 M 1,04 M 0,69 M 0,69 M 0,69 M

via metílica metílica metílica metílica Metílica DMSO DMSO+MeOH metílica metílica

volume 2mL+1mL 7mL 5mL 1mL+1mL 2mL 2mL 1mL+1mL 2mL 2mL

tempo (min) 25 45 30 40 30 30 30 30 30

agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom Ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom

Temp. (°C) 40 40 50 50 50 50 50 80 50

2ª reação esterif. - transest. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif.

catalisador BF3 - metoxido BF3 BF3 BF3 BF3 BF3 BF3

concentração 1 M - 0,69 M 1 M 1 M 1 M 1 M 1 M 1 M

via metílica - metílica metílica Metílica metílica metílica metílica metílica

volume 5 mL - 2mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL

tempo (min) 15 - 30 30 30 30 30 30 30

agitação ultrassom - ultrassom ultrassom Ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom

Temp.(°C) 50 - 50 50 50 50 50 80 50

40

3.2.6.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo

Cerca de 50 mg de cada classe de lipídeo representada pelas frações obtidas de cada

peixe na etapa de separação de lipídeos por polaridade foram colocadas em tubos de ensaio de

capacidade de 15 mL, confome tabela 11, para realizar a derivatização para análise da cadeia

graxa por cromatografia gasosa. À estas amostras foram adicionados 2 mL de solução de

metóxido de sódio metanólica 0,69 M à 50°C no ultrassom por 30 min, depois adicionou-se

ao tubo de ensaio 5 mL de solução de trifluoreto de boro metanólica 14% que equivale à 1 M

e foram mantidas no ultrassom por mais 30 min à 50°C e ao término sofreram tratamento pós-

reacional.

Tabela 11. Quantidade de massa usada por cada amostra para a reação de derivatização para

análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa.

Peixe m para derivatização 1 (mg) m para derivatização 2 (mg)

Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip. Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.

curimatã 55,1 4,0 10,8 49,5 40,4 17,3

pescada 49,6 3,7 6,8 50,2 0,0 12,5

sardinha 47,1 3,5 50,0 51,6 1,3 50,0

jaraqui 54,5 3,3 13,7 49,9 0,0 21,3

surubim 59,5 9,4 50,0 49,5 0,5 50,0

pacu 53,0 6,1 4,8 50,0 0,0 3,3

No tratamento pós-reacional houve a extração da fase orgânica, onde cerca de 4 mL de

hexano foi colocado no tubo de ensaio e agitado vigorosamente, em seguida 4 mL de solução

saturada (15%) aquosa de cloreto de sódio foi adicionado e também agitado. Depois a fase

hexânica (orgânica) foi separada da hidroalcoólica e transferida para um frasco, seca sob

nitrogênio gasoso, e ainda monitorada por CCD (hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4,

revelador ácido fosfomolibdico 20% etílico) usando padrões comerciais (éster metílico do

ácido nonandecanóico, triestearina, ácido esteárico, DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil,

monopalmitolglicerídeo e dipalmitolglicerídeo) para verificação do sucesso ou não de

conversão após reação; e ainda esta fase orgânica tratada em EFS conforme ítem 3.2.6.1.

41

3.2.6.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos

neutros

O padrão interno (EMAG C19:0) adicionado em todos os peixes durante o processo de

extração de seus respectivos lipídeos totais, ítem 3.2.1.2, a fim de se verificar a recuperação

total ao término de todas as etapas envolvidas na análise da cadeia graxa, sofreu análise

quantitativa nos lipídeos neutros esterificados dos peixes, ítem 3.2.7.3, após análise por CG-

DIC em método desenvolvido no ítem 3.2.7.1.

3.2.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa

A análise quantitativa e qualitativa da composição da cadeia graxa foi realizada pela

separação dos constituintes de cada amostra e suas respectivas detecções por cromatografia

gasosa e detectores de ionização de chamas e de espectro de massas. Para tal separação

buscou-se fazer a otimização do método de Barbosa e colaboradores (2009).

3.2.7.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa

(CG-DIC e CG-EM)

O processo de otimização foi feito usando tanto o CG-DIC quanto o CG-EM.

Inicialmente utilizou-se o CG-DIC configurado no modo dual, isto é, com duas colunas

cromatográficas em paralelo, uma polar (HP INNOWAX-20) e outra apolar (HP-5) de

idênticas dimensões (30 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e espessura do

filme de 0,25 µm), que permite a análise simultânea de uma mistura em duas fases

estacionária diferentes, permitindo a identificação com maior precisão dos ésteres metílicos. E

posteriormente configurado com uma coluna cromatográfica polar específica para ácidos

graxos (zebron ZB-FFAP), de 60 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e

espessura do filme de 0,25 µm. O gás de arraste usado foi o hélio, o injetor foi usado no modo

split 10:1 e temperatura 250°C, o volume de injeção foi de 1 µL, detector DIC na temperatura

de 270°C com fluxo de H2 30 mL/min, de ar sintético 300 mL/min e de N2 de 25 mL/min. O

CG-EM usado, com linha de transferência e fonte de íons na temperatura de 275°C e 250°C,

respectivamente, foi configurado com coluna polar de 60 m (zebron ZB-FFAP), e seu uso se

deve ao fato de confirmar a possibilidade de identificação dos componentes em regiões mal

resolvidas e assim buscar um aprimoramento do método.

O desenvolvimento de um método de separação foi feita a partir de uma mistura de

padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos (tabela 12), com uma

quantidade maior dos dois últimos componentes da separação para marcação do término da

42

análise, alterando os parâmetros de temperatura do forno do aparelho, bem como o fluxo do

gás de arraste e coluna (diferentes diâmetros, comprimentos e fase estacionária) usando modo

dual ou simples (tabela 13).

Tabela 12. Padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos.

Nome usual Nome oficial (ácido) Fórmula Família

1 valérico pentanóico C 5:0 -

2 capróico hexanóico C 6:0 -

3 - heptanóico C 7:0 -

4 - octanóico C 8:0 -

5 - nonanóico C 9:0 -

6 cáprico decanóico C 10:0 -

7 - undecanoico C 11:0 -

8 - cis-10 -undecenóico C 11:1 cis 10

9 laúrico dodecanóico C 12:0 -

10 - tridecanóico C 13:0 -

11 mirístico tetradecanóico C 14:0 -

12 miristoléico cis-9- tetradecenóico C 14:1 cis- 9 ω-5

13 - pentadecanóico C 15:0 -

14 palmítico hexadecanóico C 16:0 -

15 palmitoléico cis-9 -hexadecenóico C 16:1 cis -9 ω -7

16 palmitoléico trans -9 -hexadecenóico C 16:1 trans-9 ω -7

17 - heptadecanóico C 17:0 -

18 esteárico octadecanóico C 18:0 -

19 petroselínico cis-6-octadecenóico C 18:1 cis -6 ω -12

20 cis- vaccênico cis- 11- octadecenóico C 18:1 cis -11 ω -7

21 oléico cis- 9- octadecenóico C 18:1 cis- 9 ω -9

22 trans -

vaccênico trans- 11 -octadecenóico C 18:1 trans-11

ω -7

23 elaídico trans-9-octadecenóico C 18: 1 trans-9 ω -9

24 - cis – 12-octadecenóico C 18: 1 cis-12 ω -6

25 -

C 18:2 conj.

26 linolelaídico trans- 9,12 -octadecadienóico C 18:2 trans –9,12 ω -6

27 linoléico cis- 9,12- octadecadienóico C 18:2 cis- 9,12 ω -6

28 γ-linolênico cis- 9,12,15-octadecatrienóico C 18:3 cis-9,12,15 ω -3

29 α-linolênico cis-6,9,12- octadecatrienóico C 18:3 cis- 6,9,12 ω -6

30 - cis-6,9,12,15-octadecatetraenóico C 18: 4 cis-6,9,12,15 ω -3

31 - nonadecanóico C 19:0 -

32 araquídico eicosanóico C 20:0 -

33 - cis-5-eicosenóico C 20:1 cis -5 ω - 15

34 - cis-11-eicosenóico C 20:1 cis -11 ω - 9

35 - cis – 8- eicosenóico C 20:1 cis -8 ω - 12

36 - cis-13-eicosenóico C 20:1 cis 13 ω - 7

37 - cis –11,14 -eicosenóico C 20:2 cis 11,14

ω - 6

43

38 - cis- 8,11,14 -eicosatrienóico C 20:3 cis- 8,11,14 ω - 6

39 - cis- 11,14,17- eicosatrienóico C 20:3 cis- 11,14,17 ω - 3

40 araquidônico cis-5,8,11,14-eicosatetraenóico C 20:4 cis-5,8,11,14 ω - 6

41 EPA cis –5,8,11,14,17-eicosapentaenóico C 20:5 cis-5,8,11,14,17 ω - 3

42 - uncosanóico C 21:0 -

43 behênico docosanóico C 22:0 -

44 erúcico cis-13-docosenóico C 22:1 cis -13 ω - 9

45 - cis- 13,16 docosadienoico C 22:2 cis –13,16 ω - 6

46 - cis-13,16,19- docosatrienóico C 22: 3 cis-13,16,19 ω - 3

47 - cis- 7,10,13,16 –docosatetraenóico C 22:4 cis-7,10,13,16 ω - 6

48 DHA cis-4,7,10,13,16,19docosahexaenóico

C 22: 6 cis-

4,7,10,13,16,19

ω - 3

49 - tricosanóico C 23:0 -

50 - tetracosanóico C 24:0 -

51 nervônico cis -15-tetracoseinóico C 24:1 cis-15 ω - 9

A identificação inequívoca dos ésteres metílicos de ácidos graxos da mistura foi feita

pela comparação com os tempos de retenção da mitura de padrões e pela comparação dos

espectros de massas com as bibliotecas disponíveis (Wiley e Adams) quando usado o CG-

EM.

Continuação da tabela 12

44

Tabela 13. Otimização do método de ánalise de ácidos graxos.

Método Coluna

Fluxo

(mL/min) Rampas do forno Detector

1 Barbosa et

al., 2009 dual 2,8

107ºC, subindo 7ºC/min até 149ºC e mantendo-se nessa temperatura (isoterma) por 54 min , em seguida subindo

6 ºC/min até 260ºC, e mantendo-se nessa temperatura por 1,50 min DIC

2 BB2 dual 2,8 102ºC, subindo 7ºC/min até 150ºC, mantendo por 30 min, subindo 5ºC/min até 260ºC e mantendo por 15 min DIC

3 BB3 dual 1,6 110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 20 min aumentando 3ºC/min até 260ºC e matendo por 10 min DIC



6 BB8 dual 2,8

110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 4,29 min aumentando 5ºC/min até 200ºC e matendo por 10 min,

aumentando 5ºC/ min até 250ºC DIC

7 BB9 dual 2,8

110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC aumentando 6ºC/min até 185ºC e matendo por 5 min, aumentando 5ºC/min até

250ºC DIC

8 BB11 dual 1,4

110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC aumentando 6ºC/min até 185ºC e matendo por 10 min, aumentando 6ºC/min

até 250ºC e mantendo por 5 min EM

9 BB32 dual 1,4

50ºC mantendo por 1,5 min, subindo 20 ºC/min até 175ºC, mantendo por 10 min, aumentando 20ºC/min até

190ºC, aumentando 5°C até 250°C e mantendo por 5 min EM

10 MIX 3 ZBFFAP 2,2 200ºC subindo 2ºC/min até 260ºC, mantendo por 10 min DIC

11 MIX 16 ZBFFAP

2,2 150ºC, subindo 7ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC, e mantendo por 5 min DIC

12 MIX 18 ZBFFAP

2,2 150ºC, subindo 8ºC/min até 240ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC, e mantendo por 2 min DIC

13 MIX 20 ZBFFAP

2,2 150ºC, subindo 20ºC/min até 240ºC, mantendo por 8 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC

14 MIX 22 ZBFFAP


15 MIX 24 ZBFFAP


16 MIX 33 ZBFFAP

2,2 140ºC, mantendo por 5 min, subindo 6ºC/min até 260ºC, mantendo por 5 min DIC

17 MIX 39 ZBFFAP

2,2 140ºC, subindo 6ºC/min até 220ºC, aumentando 1ºC/min até 260ºC, mantendo nessa temperatura por 5 min DIC

18 MIX 40 ZBFFAP


45

Continuação da Tabela 13

19 MIX 44 ZBFFAP

2,2 160ºC, subindo 10ºC/min até 240ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até 260ºC, mantendo nessa

temperatura por 2 min DIC

20 MIX 47 ZBFFAP 2,3 160ºC, subindo 8ºC/min até 220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 2ºC/min até 260ºC DIC

21 MIX 55 ZBFFAP 2,3

140ºC, subindo 7 ºC/min até 190ºC, aumentando 2ºC/min até 240ºC, aumentando 4ºC/min até 260ºC e mantendo

nessa temperatura por 5 min DIC

22 MIX 64 ZBFFAP 2,3 140ºC, subindo 0,5ºC/min até 260ºC, mantendo por 20 min DIC

23

MIX 71 ZBFFAP 1,1

140ºC, subindo 2 ºC/min até 170ºC, aumentando 1ºC/min até 200ºC, aumentando 4ºC/min até 260ºC e mantendo

nessa temperatura por 5 min DIC

24 MIX 82 ZBFFAP 1,1

140ºC, subindo 2ºC/min até 170ºC, mantendo por 5 min, aumentando 1ºC/min até 200ºC, aumentando 4ºC/min

até 260ºC e mantendo nessa temperatura por 5 min DIC

25 MIX 19 - EM ZBFFAP

1,5 140ºC, subindo 6ºC/min até 220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 5ºC/min até 240, aumentando 5ºC/min até

260°C e mantendo nessa temperatura por 5 min EM


1,5 120ºC, mantendo por 5 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 20 min, aumentando 15ºC/min até 260ºC,

e mantendo nessa temperatura por 10 min EM


1,5 120ºC, subindo 10ºC/min até 155ºC, mantendo por 15 min, aumentando 5ºC/min até 160ºC, mantendo por 50

min, aumentando 2ºC/min até 260ºC, e mantendo por 10 min nessa temperatura. EM

28

MIX 14A ZBFFAP 1,8

120ºC, subindo 10ºC/min até 165ºC, mantendo por 10 min, aumentando 1ºC/min até 165ºC, mantendo por 40

min, aumentando 4ºC/min até 210ºC, mantendo por 4 min , aumentando 2ºC/min até 260ºC, mantendo por 5

min

DIC

29 MIX 27A ZBFFAP

1,8 165 ºC, mantendo por 60 min, subindo 10 ºC/min até 230ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até

260ºC, mantendo por 5 min DIC

30 MIX 30A ZBFFAP

1,8 165 ºC, mantendo por 60 min, subindo 8ºC/min até 190ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até

220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC

31 MIX 35A ZBFFAP

1,8 160ºC, mantendo por 60 min, subindo 10 ºC/min até 200ºC, aumentando 0,5ºC/min até 260ºC DIC

32 MIX 39A ZBFFAP

1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 1ºC/min até 260ºC DIC

33 MIX 41A ZBFFAP

1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 10ºC/min até


34 MIX 43A ZBFFAP

1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 10ºC/min até


46

3.2.7.2 Análise qualitativa da composição da cadeia graxa dos peixes por CG-EM

As amostras de ésteres metílicos de lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos de

peixes foram preparadas na concentração de 1 mg/mL em hexano e analisadas

qualitativamente pela separação dos constituintes de cada amostra por cromatografia gasosa e

detectadas por espectrometria de massas em método desenvolvido na seção 3.2.5.1. A

identificação inequívoca dos ésteres metílicos de ácidos graxos das amostras de lipídeos de

peixes foi feita pela comparação dos seus espectros de massas com as bibliotecas disponíveis

(Wiley e Adams).

3.2.7.3 Análise quantitativa da composição da cadeia graxa dos peixes por CG-DIC

A quantificação dos ácidos graxos presentes em cada amostra de lipídeos de peixes

analisada foi realizada por meio da técnica de CG-DIC, empregando o método de

normalização de área, utilizando padrão interno, que consiste na construção de uma curva

analítica, a partir de soluções-padrão com concentrações conhecidas de um analito que não

contenha na matriz de análise. As curvas analíticas foram construídas baseadas em soluções-

padrão de FAME C19:0, nas concentrações na faixa de 0,0625-0,1 mg/mL (5 pontos), em

análise intradays (tres dias consecutivos). E a equação linear (y = ax + b; onde y é a área do

pico, x é a concentração em mg/mL) gerada pela curvas, possibilitou calcular pela regressão

linear as concentrações.

3.8 Determinação da qualidade nutricional dos lipídeos dos peixes

A qualidade nutricional de cada classe de lipídeos foi determinada através dos dados

obtidos do perfil lipídico de cada amostra de peixe, considerando tanto a razão entre os ácidos

graxos poliisaturados e saturados quanto os índices de aterogenicidade (IA) e

trombogenicidade (IT) (Ulbricht e Southgate, 1991). E ainda a razão entre os ácidos graxos

hipocolesterolêmicos e hipercolesterolêmicos-HH (Santos- Silva et al., 2002).

As equações referentes aos índices de aterogenicidade (IA) e trombogenicidade (IT), e a

razão entre os ácidos graxos hipocolesterolêmicos e hipercolesterolêmicos (HH) se encontram

a seguir:

47

IA= [(C 12:0 + (4 x C 14:0) + C 16:0]/( ΣAGMI + Σω6 + Σω3) (1)

IT = (C 14:0 + C 16:0 + C 18:0)/[(0,5 x ΣAGMI) + (0,5 x Σω6) + (3 x Σω3) + (Σω3/

Σω6)] (2)

HH = (C 18:1n9 + C 18:2n6 + C 20:4n6 + C 18:3n3 + C 20:5n3 + C 22:5n3 + C

22:6n3)/(C 14:0 + C 16:0) (3)

Onde:

ΣAGMI = somatório dos ácidos graxos monoinsaturados;

Σω6 = somatório dos ácidos graxos do tipo ômega 6;

Σω3 = somatório dos ácidos graxos do tipo ômega 3.

48

4. Resultados e Discussão

4.1. Seleção das espécies e coleta do material biológico

A seguir se encontram as fotos referentes aos peixes coletados.

Os peixes foram identificados comparando-se com a literatura Soares e colaboradores

(2007) e Santos e colaboradores (2009) como sendo jaraqui de escama grossa (Semal

Figura 13. Peixe jaraqui. Figura 14. Peixe sardinha.

Figura 15. Peixe pacu. Figura 16. Peixe curimatã.

Figura 17.

Peixe surubim.

Figura 18.

Peixe pescada.

49

prochilodus insignis Jardine & Schomburgk, 1841), curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz,

1829), pacu-comum ou pacu manteiga (Mylossoma duriventre Cuvier, 1817), sardinha papuda

(Triportheus angulatuss Spix & Agassiz, 1829), pescada branca (Plagioscion squamosissimus

Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766).

4.2 Extração de lipídeos totais

4.2.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais

Observou-se semelhante eficiência para os solventes alternativos quando comparados

com o clorofórmio ao se testar a mistura de padrões comerciais com rendimento de 100% de

extração. Optou-se por definir a mistura de solventes para a extração de lipídeos totais como

sendo MTBE:MeOH:água 4:2:2, pela baixa volatilidade do éter quando comparada com o éter

dietílico e igual eficiência.

Quando analisada o procedimento de extração usando a matriz biológica, observou-se

lipídeos totais de massa 2,3929 g, ou seja, um teor extrativo de 2% maior que o encontrado

para esse peixe na literatura (Inhamuns et al., 2009).

4.2.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo

Os valores de teor de lipídeos totais dos peixes em estudo se encontraram na faixa 0,4

– 3%, sendo os maiores valores apresentados para os peixes pacu e curimatã e valores

comuns para os demais peixes quando comparado com a literatura (Arbeláez-Rojas et al.,

2002; Blanchet et al., 2005; Almeida, et al., 2007; Almeida et al., 2008; Inhamuns et al.,

2009; Inhamuns e Franco, 2001).

Tabela 14. Rendimento percentual dos extratos de lipídeos totais (L.T.).

Peixe Extrato L.T.(g) Teor (%)

curimatã 11,062 1,8

pescada 3,370 0,6

sardinha 2,059 0,7

jaraqui 3,848 0,6

surubim 2,417 0,4

pacu 8,364 2,7

50

4.2.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais

A seguir se encontra a média das áreas resultantes das análises do padrão de éster

metílico do ácido nonandecanóico disposta em forma de tabela, onde se observa baixo erro

relativo para todas as concentrações.

Tabela 15. Áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do ácido

nonandecanóico.

Concentração (mg/mL) dia 1 dia 2 Media Desvio padrao Erro relativo (%)

0,125 241,5 244,5 243,0 2,16 0,89

0,1875 366,0 370,4 368,2 3,15 0,86

0,25 507,3 511,6 509,4 3,04 0,60

0,375 761,3 764,8 763,1 2,51 0,33

0,5 1035,4 1038 1037 1,94 0,19

0,75 1542,7 1550 1546 5,20 0,34

1 2051,4 2067 2059 10,82 0,52

A curva analítica do padrão interno obteve um bom coeficiente de linearidade, de

0,9999.

Gráfico 1. Curva analítica do fame C 19:0 em 7 concentrações.

Os padrões internos separados de seus respectivos lipídeos totais de peixes

apresentaram concentrações baixas em relação ao esperado de 1 mg/mL, indicando baixa

eficiência do método de extração de lipídeos totais. Porém como o processo de análise da

51

quantidade de padrão interno recuperado leva em consideração uma etapa de purificação,

considerou-se que o erro pode estar não no procedimento de extração de lipídeos totais e sim

no método em que se analisa esse padrão interno, ou seja, nesse processo de purificação, o

que pode não estar levando a uma extração total do cartucho de EFS, gerando um resultado

falso.

Tabela 16. Concentração e eficiência do método de extração de lipídeos totais.

Peixe área Conc (mg/mg) % eficiência

curimatã 327,2 0,164 16,43

pescada 920,3 0,450 44,96

sardinha 541,2 0,267 26,73

jaraqui 554,4 0,273 27,27

surubim 817,6 0,430 42,97

pacu 288,9 0,146 14,59

4.3 Separação em classes e de seus componentes

4.3.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos

Segundo os dados resultantes da comparação do método Johnston com EFS dispostos

na tabela 17 pode-se afirmar que é possível separar diferentes classes de lipídeos pelo método

EFS com maior praticidade, pois a quantidade de amostra empregada é reduzida pela metade

e o volume de solvente é 20 vezes menor, porém observou-se que era necessário ainda fazer

modificações para resultar em máxima eficiência de extração e separação.

Tabela 17. Rendimento das frações obtidas para separação de lipídeos, comparando-se o

método de Johnston e EFS.

Classe Rendimento (%)

Coluna (Johnston) EFS

Lipídeos neutros 76,62 77,57

Glicolípideos 8,830 1,960

Fosfolípideos 8,850 2,340

Analisando-se a substituição do solvente clorofórmio por um solvente não-halogenado

para extração dos lipídeos neutros observou-se semelhante eficiência para os solventes

alternativos quando comparado com o clorofórmio, com apresentação de substâncias a mais

52

quando feito o uso de MTBE, isso foi possível verificar pelo monitoramento realizado por

CCD (Figura 19), que para tal foram testados vários sistemas de eluição e reveladores,

definindo-se por usar o sistema clorofórmio:metanol:água (75:22:3) e o revelador 10% sulfato

de cúprico em ácido fosfórico 8% aquoso.

Figura 19. Perfil cromatográfico por CCD dos lipídeos neutros de sardinha extraídos com

diferentes solventes: clorofórmio, éter dietílico e MTBE.

E ainda o experimento com MTBE produziu valor de rendimento levemente superior

que os demais solventes testados até mesmo quando comparado com clorofórmio, solvente

usado no método de Johnston, conforme descriminado na tabela 18.

Tabela 18. Frações da EFS comparando-se solventes não-organoclorados e clorofórmio.

Fração Rendimento (%)

Clorofórmio 97,20

Éter dietilico 95,24

MTBE 98,00

Quando comparadas a extração de fosfolípideos usando os solventes metanol ou etanol

em mistura com água, métodos EFS 5 e 6 respectivamente, observou-se semelhantes

resultados de rendimento e de perfil cromatográfico, conforme mostrado na Tabela 19 e

Figura 20.

CHCL3 éter MTBE

dietilíco

53

Tabela 19. Rendimento em percentual das classes de lipídeos dos métodos diferentes

testados.

Método Rendimento (%)

Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.

EFS 5 86,04 0,340 4,630

EFS 6 87,00 9,200 3,750

EFS 7 74,31 - 12,03

EFS 8 95,62 0,300 -

Os resultados favoreceram a escolha do solvente etanol por conter toxicidade

altamente reduzida quando comparado ao metanol. Já quando analisado o volume do cartucho

de eluição foi apresentado valores distintos, sendo maior rendimento de fosfolípideos usando

um cartucho com diâmetro maior, método EFS 7. E ainda verificando o uso deste método,

com outros óleos de peixes observou-se boa separação das classes de lipídeos com lipídeos

totais de sardinha, método EFS 8.

Figura 20. Perfil cromatográfico de EFS 7, 8, 5 e 6.1 representando a fração referente a

MTBE, EFS 7, 8, 5 e 6.2 a fração de acetona e EFS 7, 8, 5 e 6.3 a última fração.

4.3.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo

Conforme nos mostra a Tabela 21 os lipídeos separados em suas classes apresentaram

diferenças para os lipídeos neutros entre os peixes com variações em seus valores de teores,

revelando a classe de lipídeos neutros como a classe marjoritária dos lipídeos totais,

representando uma faixa 67 – 97%. Esses resultados também nos mostraram que o surubim

quando comparado aos demais peixes em estudo obteve menor rendimento para os lipídeos

neutros que os demais, indicando que outras classes de lipídeos possuem contribuição mais

significativa para os lipídeos totais desse peixe que nos demais peixes.

7.1 8.1 5.1 6.1 7.2 8.2 5.2 6.2 7.3 8.3 5.3 6.3

54

Tabela 20. Rendimento em percentual de cada classe de lipídeos dos peixes em estudo.

Peixe Lipídeos neutros Glicolipídeos Fosfolipídeos

curimatã 92,90 1,68 5,62

pescada 93,24 0,740 3,858

sardinha 76,77 1,016 21,16

jaraqui 93,07 0,661 7,010

surubim 67,03 2,060 25,66

pacu 97,30 1,219 1,619

Já os valores de rendimento que representam a classe dos glicolipídeos foram variáveis

e em geral baixos, a ponto de não ser possível a pesagem para as amostras de dos peixes

pesca, jaraqui e pacu, indicando que a contribuição desta classe para os lipídeos que compõem

os peixes em estudo é pequena. Com relação aos fosfolipídeos também houve variação em

seus teores, com valores baixos em geral, com exceção para o peixe surubim, que apresentou

rendimento médio de 25,66% representando que os lipídeos deste peixe contêm uma

significativa contribuição de fosfolipídeos ou lipídeos de alta polaridade para seus lipídeos

totais.

4.4 Extração de lipídeos insaponificáveis

4.4.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis

A fração hexânica extraída do tratamento resultante da reação de saponificação dos

lipídeos neutros de sardinha obteve perfil cromatográfico bom, onde foi possível observar,

comparando-se com o padrão comercial de colesterol (esteróide) e de α-tocoferol (tocol), a

presença somente de esteróides. O teor resultante foi de 6,5% com massa proveitosa para se

processar a reação de sililação (derivatização).

55

4.4.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo

Os rendimentos das frações dos lipídeos insaponificaveis foram cerca de 4-9%, sendo

o maior valor para o peixe surubim e o menor para o curimatã. Quando comparado com a

literatura encontramos altos valores em relação aos peixes de água doce e valores próximos

aos correspondentes de tubarão (Belitz et al., 2004).

Tabela 21. Rendimentos percentuais dos lipídeos insaponificáveis dos peixes.

Peixe Rendimento (%)

curimatã 3,89

pescada 8,94

sardinha 7,85

jaraqui 4,92

surubim 9,16

pacu 5,55

4.4.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis

A seguir se encontra as áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol disposta

em forma de tabela.

Tabela 22. Áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol.

Concentração (mg/mL) Área

0,05 155,5

0,025 64,70

0,0125 25,90

0,00625 6,600

A curva analítica do padrão interno obteve um coeficiente de linearidade, de 0,9984.

56

Gráfico 2. Curva analítica do esteróide sitosterol em 4 concentrações.

O padrão interno quantificado na análise de esteróides dos peixes em estudo

apresentou uma variação de eficiência de 13 - 79 %.

Tabela 23. Quantidade em mg/mg de β-sitosterol nos lipídeos insaponificáveis dos peixes.

Peixe Real Esperado % eficiência

curimatã 0,001 0,009 12,65

pescada 0,002 0,004 53,8

sardinha 0,004 0,005 78,8

jaraqui 0,009 0,007 100,0

surubim 0,002 0,005 43,4

pacu 0,003 0,006 49,2

57

4.5 Preparação de amostras para análise de esteróides

4.5.1 Verificação do método de reação de sililação

Conforme perfil cromatográfico usando padrão comercial de colesterol e tocoferol

sililados (Figura 21) foi possível observar boa conversão tanto dos padrões quanto da

amostra do peixe sardinha como matriz teste.

Figura 21. Perfil cromatográfico, onde 1= material insaponificável sililado, 2= padrão de

colesterol e 3= tocoferol.

4.6 Análise de esteróides por cromatografia gasosa

4.6.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-

DIC e CG-EM)

Os cromatogramas referentes ao desenvolvimento do método de análise de esteróides

se encontram descriminados a seguir.

1 2 3

58

RT: 0.00 - 30.67

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

17.83

2.63 3.10 5.34 7.10 18.437.43 20.90 21.58 24.819.31 29.0727.0510.99 11.86 17.0115.13

NL:5.14E7

TIC MS tocoferol

Cromatograma 1. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados

na condição Hidalgo.

Partindo do primeiro método apresentado na tabela de otimização de métodos para

análise de esteróides observou-se ao se analisar uma mistura de colesterol e alfa-tocoferol que

tais padrões não se separavam entre si, o que poderia comprometer a quantificação de cada

substância se as contivessem nas amostras de peixe em estudo. Optou-se então por fazer a

última rampa de temperatura da programação de forno do equipamento mais lenta.

59

RT: 0.00 - 32.33

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

19.34

19.45

19.8518.22 20.752.63 8.706.453.27 9.92 30.1322.94 29.2627.98 31.9226.2811.82 16.8712.944.96 14.26

NL:1.63E9

TIC MS col+toc_1


na condição ColToc1.

Foi possível observar uma leve separação nos constituintes da mistura, e buscando a

melhor resolução decidiu-se adicionar uma rampa na temperatura de 280°C.

RT: 12.89 - 21.06

13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

17.94

17.58 18.38 18.9717.00 19.23 19.72 20.10 20.4415.98 16.7315.4514.52 15.1013.63 14.2712.94

NL:1.01E9

TIC MS col+toc_4



60

Porém, houve uma piora na resolução dos componentes. Optando-se por diminuir a

temperatura da rampa adicional em 10°C.

RT: 0.00 - 28.32

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

19.68

19.54

19.0120.162.60 3.02 4.07 20.9518.276.31 28.267.08 22.8116.86 23.957.89 26.859.36 10.19 11.88 12.96 14.91

NL:4.24E8

TIC MS col+toc_6_120817150127


na condição ColToc 6.

Observou-se novamente uma leve separação dos componentes. Então, uma menor

temperatura na rampa adicional foi testada.

61

RT: 0.00 - 24.67

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

21.53

21.28

20.53 21.922.67 3.07 22.673.96 19.625.51 6.32 7.43 8.43 17.609.36 10.19 11.89 13.03 16.7114.07 15.27

NL:4.90E8

TIC MS col+toc_11



Houve uma melhora na separação dos constituintes da mistura em teste, optando-se

para melhor resolução o retorno das duas rampas iniciais, porém mantendo uma condição

isoterma à 250 C.

RT: 0.00 - 50.70

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

25.85

25.12

23.78

22.644.98 28.216.31 50.6410.19 19.6011.96 48.2930.3615.11 46.0432.5817.72 43.7634.86 37.49

NL:4.77E9

TIC MS col+toc_23



62

Com boa separação do esteróide colesterol e do tocol α-tocoferol o método col+toc 23

com programação do forno do equipamento 120 ºC, mantendo por 2 min, subindo 15 ºC/min

até 250 ºC, mantendo por 30 min, subindo 5 ºC/min até 300ºC, analisado em espectrômetro de

massas foi escolhido como o melhor método para as análises de lipídeos insaponificáveis. Ao

ser analisada a mesma mistura no cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chamas

observou-se que a reprodução do método não era possível, visto que as dimensões da coluna

usada eram diferentes, então a otimização do método para o uso desse equipamento foi

necessária.

m i n0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

p A

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

F I D 2 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ E S T E R O ~ 1 \ C O L T O C _ 3 . D )

33.04

2 33

.670

36.62

3 37

.299

38.71

4


na condição Silil_II.

No geral as condições de métodos desenvolvidos revelaram que o melhor método

desenvolvido, com boa resolução de cromatograma, foi o ColToc 23 para o CG-EM e para o

CG- DIC foi o Silil_II.

α-tocoferol TMS

Colesterol TMS

63

Tabela 24. Observação da resolução dos cromatogramas obtidos durante o desenvolvimento

do método para análise de lipídeos insaponificáveis.

Método Tempo de retenção (min) Observação

TMS-colesterol TMS-tocoferol

Hidalgo 17,83 13,83 s/ resolução, 1 pico

col+toc 1 19,45 19,34 2 picos,não resolvidos

col+toc 4 17,94 17,94 s/ resolução, 1 pico



col+toc 23 25,85 25,12 2 picos, resolvidos

silil_ii 37,24 38,71 2 picos, resolvidos

O método escolhido para o CG-DIC consistiu do uso fluxo 2.1 mL/min, injeção no

modo split 2:1 a 280°C, com temperatura do forno iniciando em 120°C e mantendo essa

temperatura por 2 min, aumentando numa rampa de 15°C/min até 240°C, mantendo por 45

min, subindo 5°C/min até 300°C e mantendo por 3 min, usando coluna HP-5.

Foi possível verificar através da análise de uma mistura de padrões de esteróides a boa

separação no método desenvolvido para CG-DIC.

Cromatograma 8. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de

esteróides analisado nas condições do método Silil_II.

m i n0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F I D 2 B , ( B A N N Y \ S T E R O I D S . D )

33.69

1

37.18

3 44.32

8

45.79

9

49.03

4

55.06

6Colesterol TMS

Ergoesterol

TMS

Campesterol

TMS

Estigmaesterol

TMS Sitosterol

TMS

64

E também para o método desenvolvido para CG-EM.

RT: 0.00 - 50.66

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

23.74

30.86

34.23

28.62

24.8331.343.60 6.31 34.757.42 50.6249.269.36 13.25 36.54 47.0415.07 44.6917.63 39.1621.31

NL:1.38E8

TIC MS steroids

Cromatograma 9. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de

esteróides analisado nas condições do método ColToc 23.

E pela análise individual dos esteróides contidos na mistura usada para otimização do

método e através dos seus respectivos espectros de massas, o tempo de retenção desses

esteróides tanto no método desenvolvido para o CG-DIC quanto para o CG-EM (Anexo 1)

foram identificados.

Tabela 25. Identificação do tempo de retenção (min) de cada componente na mistura usada

para otimização do método de análise de esteróides.

Padrões CG-DIC CG-EM

colesterol TMS 37,183 24,83

ergoesterol TMS 44,328 28,62

campesterol tms 45,799 29,73

estigmasterol tms 49,066 30,86

sitosterolTMS 55,066 34,23

Colesterol TMS

Ergoesterol TMS

Campesterol TMS

Estigmaesterol TMS

Sitosterol TMS

65

4.6.1 Análise qualitativa dos esteróides dos peixes em estudo por CG-EM

Observou-se a presença de colesterol, campesterol e do sitosterol, apresentando

identificação por espectrometria de massas coerentes. Como exemplo de como foi possível

obter tais resultados, temos o cromatograma de esteróides do peixe curimatã.

RT: 0.00 - 50.66

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

8.6724.97

8.43

5.29

9.729.80

10.77

6.663.30

10.95

11.93

13.2715.09

29.4916.33 49.0446.7721.38 34.2126.64 29.80 43.5739.2134.71

NL:8.84E7

TIC MS 1tms_1


curimatã por CG-EM.

Cada pico a partir de 23 min, corresponde a um esteróide (derivatizado) e seus

respectivos tempos de retenção foram comparados com o tempo de retenção da mistura de

padrões disponíveis de esteróides resultantes de análises por GC-EM. E também seus

espectros de massas gerados para cada pico foram comparados com a biblioteca de espectros

disponível, bem como a coerência dos fragmentos padrões de esteróides sililados foi

analisada. Exemplicando, temos o pico no tempo de retenção do cromatograma 10, em

24,95 min.

66

1tms_2 #874 RT: 24.95 AV: 1 NL: 3.99E7T: + c Full ms [40.00-800.00]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

368.12

128.95

329.55

144.96

159.00 457.82118.9872.99

212.98247.37

254.41173.35 443.48275.53

429.92 550.78503.84 624.69 789.19744.30707.47667.05

Espectro 1. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de

lipídeos neutros do peixe curimatã.

O seu espectro de massas, espectro 1, apresentou os sinais de fragmentos em m/z

368,12 e 129, bem como a presença do fragmento em sinal m/z 73, característico de

esteróides sililados e o íon molecular em sinal de m/z 458, confirmando o tamanho da cadeia,

sendo este referente ao espectro do colesterol.

A seguir se encontram os cromatogramas referentes as amostras sililadas dos peixes

em estudo.

67

RT: 0.00 - 50.70

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

5.34

6.77

10.2524.94

9.22 10.413.33 15.28 47.7912.49 19.09 23.66 45.8842.9725.63 29.39 34.2331.61 41.8336.25

NL:5.50E8

TIC MS 2tms_1


pescada.

Na amostra do peixe pescada (cromatograma 11) é visível a presença do pico em

24,94 min, referente ao colesterol, se sobresaindo na área do cromatograma relacionada aos

esteróides.

68

RT: 0.00 - 50.68

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

24.98

8.43

9.55

9.71

5.27

2.9510.31

5.56 10.75 12.4523.6814.91 49.7547.6725.6316.51 19.70 46.6929.54 34.2833.07 43.5736.67 38.74

NL:9.60E7

TIC MS 3tms_1


sardinha.

Na amostra do peixe sardinha (cromatograma 12) o pico em 24,98 min, referente ao

colesterol, também se sobresai na área do cromatograma relacionada aos esteróides.

69

RT: 0.00 - 50.67

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

8.685.28

9.71

8.42 24.98

10.32

10.74

5.0310.92

8.29 16.29 23.6512.46 29.3817.91 34.19 50.3129.0023.41 48.8729.90 47.0134.55 43.5138.10

NL:2.43E8

TIC MS 4tms_2


jaraqui.

Já no peixe jaraqui (cromatograma 13), além do colesterol, outro pico se sobresai na

região é 29,38 min, que refere ao campesterol.

70

RT: 0.00 - 50.69

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

5.32

24.96

10.24

4.95 10.409.19

8.6423.6815.2613.06 16.31 50.3317.93 49.2725.78 29.42 46.1131.02 34.25 36.79 43.8138.82

NL:2.35E8

TIC MS 5tms_1


surubim.

O peixe surubim tem como destacado na região de esteróides a presença de colesterol,

pico em 24,96 min (cromatograma 14).

71

RT: 0.00 - 50.70

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

5.28 9.72

9.57

24.938.44

2.76

10.923.32

5.56 12.4513.06 16.31 23.67

50.3649.3125.4417.30 47.0234.2727.58 30.36 44.6935.28 39.04

NL:7.98E7

TIC MS 6tms_1


pacu.

Assim como o peixe pacu também (cromatograma 15).

O tempo de retenção obtido para os esteróides identificados nas amostras de peixes

por espectrometria de massas foi similar ao disposto na mistura de padrões comerciais no

desenvolvimento do método de análise, o que possibilitou usar o tempo de retenção como

parâmetro de identificação de esteróides (tabela 26) além das análises dos espectros de

massas.

Tabela 26. Identificação pelo tempo de retenção (min) de esteróides nos peixes estudado.

Padrões Peixes

curimatã pescada sardinha jaraqui surubim pacu

Colesterol TMS 24,95 24,94 24,98 24,87 24,91 24,88

Campesterol TMS 29,37 29,39 29,51 29,38 29,42 29,49

Β-sitosterol TMS 34,21 34,23 34,28 34,16 34,25 34,27

72

4.6.2 Análise quantitativa dos esteróides dos peixes em estudo por CG-DIC

A curva analítica usada do padrão interno foi a mesma do ítem 4.4.3. E através dessa

curva foi possível quantificar os esteróides nos peixes em estudo, onde foi observado a

presença de colesterol e campesterol, sendo o colesterol, em quantidade de mg/g (tabela 27),

o componente marjoritário em todos os peixes analisados, com a maior quantidade para a

sardinha e o surubim e a menor para o curimatã.

Tabela 27. Quantidade em mg de esteróides/g de peixe.

Esteróides Peixes

Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu

colesterol 15,067 171,385 324,923 195,231 282,462 79,846

campesterol 2,133 2,000 2,923 21,231 4,462 2,000

β-sitosterol 1,067 2,154 3,692 8,769 1,846 2,615

total 18,267 175,538 331,538 225,231 288,769 84,462

Esse resultado é melhor observado quando analisamos o teor em percentual de cada

esteróide em relação a massa inicial de peixe utilizada, onde os peixes sardinha e surubim

apresentaram valores de 32 e 28%, respectivamente, e o curimatã de 1,5% (tabela 28).

Tabela 28. Percentual de esteróides por grama de peixe.

Esteróides Peixes


colesterol 1,507 17,138 32,492 19,523 28,246 7,985

campesterol 0,213 0,200 0,292 2,123 0,446 0,200

β-sitosterol 0,107 0,215 0,369 0,877 0,185 0,262

total 1,827 17,554 33,154 22,523 28,877 8,446

No geral a relação percentual total dos esteróides nos peixes foram na faixa de 2-33%,

valores esses maiores que aqueles encontrados em plantas (Belitz et al., 2004).

73

4.7 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa

4.7.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres

metílicos

Para otimização do método de derivatização de ácidos graxos foram obtidos

rendimentos diferenciados para as condições testadas, conforme tabela 29, onde se

observaram valores acima de 85% para os experimentos Barbosa et al. (2009), Exp. II, Exp.

III, Exp. VII, Exp. Exp. VIII, Exp. X e Exp. XIII; o que necessariamente não indicam que

estes experimentos obtiveram melhores resultados, visto que não representam somente o

produto desejado quando analisados por CCD.

Tabela 29. Rendimento em percentual para a reação de derivatização.

Método Rendimento da reação (%)


Barbosa et al. 2009 85,0 100,0 9,6

exp. I 83,2 6,7 2,62

exp. II 44,73 100,0 26,13

exp. III 100,0 - -

exp. IV - - -

exp. VI 82,6 18,0 28,0

exp. VII 100,0 - -

exp. VIII 93,03 - -

exp. IX 76,6 - -

exp. X 94,12 - -

exp. XI 72,2 - -

exp. XIII 85,4 - -

exp. XIV 79,2 - -

exp. XV 65,4 - -

exp. XVI 73,4 - -

exp. XVII 69,6 - -

exp. XVIII 76,6 - -

exp. XIX 76,2 - -

exp XX 77,8 0,0 0,0

Analisando os produtos da reação de derivatização em cada condição testada por

CCD, mostrados na tabela 30, foi possível identificar através de comparação com padrões

comerciais de diferentes lipídeos quase todos os resíduos de classe que não estavam obtendo

sucesso em conversão de ácidos graxos em seus respectivos ésteres metílicos, dentro de cada

74

experimento analisando assim qual a etapa da reação deveria ser modificada e qual a melhor

condição de cada etapa.

Tabela 30. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de

filtrados por fase sólida.

Método Componentes por CCD


Barbosa et al. 2009 EMAG+TAG MP EMAG

exp. I EMAG+TAG MP EMAG+AP

exp. II EMAG+TAG+DAG+colest. MP AP

exp. III - - -

exp. IV - - -

exp. VI EMAG+MAG+colest. EMAG+AP EMAG+AP

exp. VII EMAG+TAG+AP - -

exp. VIII EMAG+TAG+AP - -

exp. IX EMAG+TAG+colesterol - -

exp. X EMAG+TAG+colest+AP - -

exp. XI EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XIII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XIV EMAG+colest+DAG+AP - -

exp. XV EMAG+FFA+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XVI EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XVII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XVIII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -

exp. XIX EMAG+colest+AP - -

exp. XX EMAG+colest EMAG+AP EMAG+AP

Quando analisamos a tabela 30, observamos que os experimentos onde se testava a

concentração do catalisador na etapa de transesterificação na primeira etapa de reação, que

são os métodos Barbosa et al. 2009 (0,2 M), Exp. VI (0,3 M), Exp. XI (0,5 M), Exp. X (0,7

M), Exp XVI (1 M), e Exp. II (5 M) apresentaram presença de ésteres metílicos de ácidos

graxos, mas também a presença de triacilglicerídeo e diacilglicerídeo, estes dois últimos em

menor concentração, em relação aos ésteres, a medida que se aumentava a concentração do

catalisador até 0,7 M, sendo observado em concentração maior que essa o surgimento

novamente de triacilglicerídeo e diacilglicerídeo. Em todos os experimentos observou-se a

presença de esteróides e componentes de polaridade alta que podem ser componentes que

assim como os esteróides não contenham cadeias graxas e, portanto não reagirão no processo

de transesterificação e esterificação.

75

Comparando a eficiência do trifluoreto de boro com o cloreto de amônia como

reagentes esterificantes nos experimentos Barbosa et al. 2009 (BF3) e Exp. I (NH4Cl),

observou-se resultados semelhantes para todas as classes de lipídeos testadas, não

apresentando ácido graxo livre nas análise por CCD (tabela 30), indicando a conversão

destes em seus respectivos éster metilicos. Testando a via de reação com relação ao solvente

durante os processos, observou-se melhor resultado para aquela com uso abundante do álcool

metanol (exp. XIX), como já conhecido na literatura, onde para haver a reação de

transesterificação ou a de esterificação é necessária a presença de um álcool de preferência de

cadeia curta, pois este age como nucleófilo; as demais com uso de DMSO, um solvente

aprótico a fim de favorecer a reação do tipo SN1 não obteve reação favorável nem quando

adicionado metanol no meio (Exp. XVIII) nem quando somente com o metanol do reagente

de transesterificação (Exp. XVII), que é 30% em metanol, apresentando estes dois últimos

experimentos a presença marjoritária de TG, DG e pouca quantidade em relação a esses

componentes de ésteres metílicos de ácidos graxos.

Concordando que a melhor via é a metílica para a reação de transesterificação testou-

se a adição desse álcool em etapas, distribuído com o catalisador no processo de reação.

Quando feita em duas partes iguais a adição de metanol (Exp. VII) observou-se semelhante

resultado comparando com a adição feita em uma única etapa (Exp. VI), mesmo quando

aumentada a concentração do catalisador na reação (Exp.X e XIX). Quando a adição em duas

partes de álcool com a segunda sendo de maior volume houve semelhança nos resultados

também (Exp. VIII e Exp. I).

Analisando se o tipo de reação convencional, transesterificação seguida de

esterificação, seria a mais apropriada, observou-se através da comparação do experimento IV

com o exp. VI que apenas o uso de uma única reação, a transesterificação, seria inviável e que

a reação de esterificação como primeira etapa poderia ser feita (Exp. XIII), mas esta não

apresentou resultados satisfatórios (Exp. XIV) quando comparada com a reação convencional

(Exp. VI).

Diante do perfil cromatográfico por CCD dos experimentos discutidos acima, obteve-

se melhores resultados para os experimentos XIX e XX, os quais foram oriundos dos

experimentos anteriores à eles testados e entre si comparavam-se a temperatura envolvida nas

etapas de transesterificação e esterificação, sendo o experimento com a temperatura de 50°C o

melhor sucedido e escolhido para aplicação nas amostras de peixes.

76

Tabela 31. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de

filtrados por fase sólida.

Método Rend. Tratamento (%)


Barbosa et al. 2009 64,0 sem massa sem massa

Exp. I 76,6 sem massa sem massa

Exp. II - sem massa sem massa

Exp. III 100,0 - -

Exp. IV - - -

Exp. VI 64,4 2,2 4,8

Exp. VII 68,8 - -

Exp. VIII 73,8 - -

Exp. IX 51,8 - -

Exp. X 72,2 - -

Exp. XI 46,6 - -

Exp. XIII 2,63 - -

exp. XIV - - -

exp. XV 48,6 - -

exp. XVI 52,2 - -

exp. XVII 52,8 - -

exp. XVIII 57,4 - -

exp. XIX 69,4 - -

exp. XX 67,8 0,0 0,0

Com relação aos rendimentos reais das reações testadas (tabela 31), isto é depois de

filtrados em extrator por fase sólida obtendo somente os ésteres metílicos, produto da reação,

apresentou valor de 68% para o experimento com melhor resultado verificado por CCD (exp.

XX).

4.7.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo

Os rendimentos (tabela 32) para a derivatização dos peixes em estudos foram

satisfatórios para todas as classes com valores acima de 50%, com exceção para a amostra de

fosfolipídeo de sardinha e surubim.

77

Tabela 32. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados

por fase sólida.

Peixe Rendimento (%) depois de EFS


curimatã 64,00 100,00 85,18

pescada 71,17 89,19 55,88

sardinha 72,82 100,00 15,60

jaraqui 71,19 100,00 74,45

surubim 58,66 100,00 30,20

pacu 64,53 60,66 97,22

4.7.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos

neutros

A seguir se encontram as áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do

ácido nonandecanóico disposta na tabela 33.

Tabela 33. Áreas resultantes das análises do padrão de EMAG C 19:0.

conc (mg/ml) área

dia 1 dia 2 dia 3 media desvio padrão erro relativo (%)

0,00625 10,0 9,0 9,1 9,367 0,551 5,880

0,0125 20,4 19,9 18,0 19,433 1,266 6,516

0,025 41,0 41,1 38,1 40,067 1,704 4,253

0,05 83,2 87,6 78,9 83,233 4,350 5,226

0,1 170,0 179,0 166,7 171,900 6,366 3,704

1 1685,7 1807,3 1702,2 1731,733 65,961 3,809

A curva analítica do padrão interno obteve um bom coeficiente de linearidade, de

0,9998.

78

Gráfico 3. Curva analítica do EMAG C19:0 em 5 concentrações.

O padrão interno quantificado na análise de ácidos graxos dos lipídeos neutros dos

peixes em estudo apresentou uma variação de eficiência de 38 - 89%.

Tabela 34. Quantidade em mg/mg de EMAG C 19:0 nos lipídeos neutros dos peixes.

Peixe área conc conc esperada % eficiência

curimatã 14,7 0,0099 0,0174 57,126

pescada 45,1 0,0274 0,0570 48,115

sardinha 28,0 0,0176 0,0466 37,705

jaraqui 30,8 0,0192 0,0499 38,465

surubim 120,0 0,0705 0,0793 88,882

pacu 10,4 0,0074 0,0115 64,888

79

4.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa

4.8.1 Otimização da metodologia da análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa

(CG-DIC e CG- EM)

Na tentativa de se desenvolver um método o primeiro cromatograma como resultado

apresentou algumas regiões não resolvidas.

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

3

4

5

6

FID1 A, (BANNY\BB1.D)

3.4

91

4.6

16

5.8

32

5.9

37

7.5

94

10.

051

13.

254

13.

851

19.

840

27.

379

29.

406

64.

314

65.

329

65.

871

69.

201

69.

802

70.

422

71.

100

71.

168

71.

357

71.

906

73.

920

74.

167

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

3

4

5

6

FID2 B, (BANNY\BB1.D)

2.4

03

3.0

59

3.9

28

4.9

85

5.5

94

6.1

84

7.7

09

9.8

77

10.

869

13.

039

17.

742

19.

155

24.

797

65.

781

66.

114

66.

848

69.

018

69.

588

71.

970

72.

269

73.

811

Cromatograma 16. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de

ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB1.

No decorrer da primeira análise na coluna apolar (cromatograma 16 A), obteve-se em

geral boa separação de picos, com exceção dos picos depois de 60 min. Então na análise

seguinte o objetivo foi aumentar o tempo em que sai os picos mal resolvidos, através da

rampa de temperatura e reduzir o tempo entre 20 e 60 min aproveitando mais o espaço do

cromatograma. O perfil cromatográfico no cromatograma B confirmou o cromatograma A,

onde foi possível observar regiões do cromatograma semelhantes, diferenciando somente pela

ordem de interações entre a amostra e a fase.

A

B

80

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


2.8

92

3.8

74

5.1

12

6.4

11 6

.521

8.1

74

10.

569

13.

653

14.

228

19.

960

27.

131

29.

040

40.

799

44.

118 4

4.45

8

44.

781

44.

906

45.

590

46.

115

46.

386

48.

608

49.

185

49.

685

50.

310

50.

479

50.

964 5

2.96

7

53.

270

54.

274

54.

750

56.

384

57.

526

57.

911

59.

890

62.

443

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


2.6

19

3.3

70

4.3

40

5.4

89

6.1

38

6.7

58

8.2

64

10.

369

11.

329 1

3.41

7

17.

921

19.

266

24.

645

36.

522

38.

184

40.

497

42.

772

44.

816

45.

179 46.

391

46.

628

47.

060

48.

019

48.

613

48.

969

49.

091

51.

070 5

1.38

5

52.

077

52.

887

54.

295

54.

530

54.

697

54.

837

56.

334

59.

134

60.

253

63.

245



Os picos do perfil cromatográfico antes mal resolvidos, foram separados em mais

regiões distintas, depois de 45 min e o espaço de tempo do cromatograma foi melhor

aproveitado, ou seja, os picos foram mais distribuídos ao longo do cromatograma quando

comparado com o cromatograma anterior. E apesar de ter melhorado em relação à primeira

análise, a primeira região mal resolvida continuou demonstrando a necessidade de uma

melhor resolução.

A

B

81

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


3.5

32

4.4

95

5.7

04

7.1

24

7.2

61

9.5

21

12.

956

13.

569

17.

494

18.

328

26.

772

32.

462

32.

817

33.

814

38.

748

41.

406

41.

690

41.

977

42.

108

42.

752

43.

346

43.

630

46.

220

47.

061

47.

682

48.

405 4

8.48

9

48.

703

49.

342

52.

221

52.

731

54.

196

54.

909

57.

456

59.

275

59.

890

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


2.1

27

3.2

43

3.9

83

4.9

31

6.0

61

6.7

77

7.5

37

9.6

03

12.

594

13.

999

17.

020

23.

632 2

5.62

6

31.

082 3

6.16

1

36.

850

36.

990

37.

214

37.

443

38.

679

38.

965

40.

184

42.

022

42.

404

43.

614

43.

951

44.

416

45.

567 4

6.33

6

46.

672

46.

959

49.

465

49.

954

52.

075

54.

538

54.

846

55.

022

57.

426

60.

604

63.

733



Nas condições do método BB3, os perfis cromatográficos, antes mal resolvidos, foram

obtidos na região entre 40 e 60 min., na coluna apolar e entre 35 e 60 min. na coluna polar,

com melhor resolução. Porém ainda insuficiente e foi verificada a necessidade de uma melhor

resolução.

A

B

82

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


3.5

32

4.4

95

5.7

04

7.1

25

7.2

61

9.5

23

12.

960

13.

567 1

7.02

5

17.

644

22.

551

26.

335

26.

603

27.

413

32.

121

35.

082

35.

414

35.

731

35.

891

36.

643

37.

371

37.

718

40.

979

42.

063

42.

880

43.

853 4

3.96

5

44.

256

45.

130 4

9.10

7

49.

767

51.

888

52.

931

56.

615

59.

242

60.

167

min0 10 20 30 40 50 60 70

pA

2

4

6

8

10

12


2.6

67 3

.243

3.9

83

4.9

31

6.0

61

6.7

77

7.5

36

9.6

03

12.

595

13.

997

16.

652

20.

966

22.

016

22.

846

25.

308

29.

575

30.

272

30.

383

30.

613

30.

851

32.

128

32.

403

33.

706

35.

822

36.

264

37.

716

38.

136

38.

699

40.

152 41.

125

41.

563

41.

936

45.

285

45.

936

48.

874

52.

370

52.

712

53.

024



Nas condições do método BB4, os picos dos perfis cromatográficos antes mal

resolvidos foram obtidos na região entre 35 e 45 min na coluna apolar e entre 30 e 40 min na

coluna polar, com uma resolução melhorada. Entretanto ainda foi verificada a necessidade de

aumentar a separação, aumentando o tempo de análise na rampa em que se encontra essa

região do decorrer da análise posterior.

min0 20 40 60 80 100

pA

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

22.5


5.6

35

7.2

26

9.5

75

12.

556

13.

079

17.

709

21.

986

22.

337

23.

379

29.

879

34.

268

34.

832 3

5.63

4

36.

929

38.

020

38.

608

44.

259

45.

787

47.

318

49.

423

49.

975

51.

689 5

9.08

3

59.

750

64.

156

66.

344

73.

442

78.

334

min0 20 40 60 80 100

pA

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

22.5


4.7

19

5.2

95

5.8

55

7.3

04

9.3

57

10.

304

12.

308

16.

147

17.

184

17.

985

20.

832

26.

264

27.

160

27.

656 2

7.97

1

29.

747

32.

248

35.

427

36.

127

38.

611

39.

173

40.

142

42.

489 44.

079

45.

183

51.

792

52.

785

58.

400

65.

002

66.

003



A

B

83

No método BB5, houve um aumento do tempo total de análise sem uma significante

melhora na resolução mesmo com uma rampa final lenta. Então optou-se por diminuir a

temperatura da ultima rampa seguida por outra rampa rápida final.

min0 5 10 15 20 25 30 35

pA

10

20

30

40

50

60


2.0

66

2.7

90

3.3

08

3.5

75

3.8

86

4.0

76

4.2

79

4.3

65

4.4

80

4.7

18

5.1

61

5.5

28 5.6

29

5.7

88

6.0

35

6.7

16

7.2

20

7.5

48

7.7

70

8.7

64

9.5

74

9.9

72 1

2.13

3

12.

490

13.

235

15.

084

16.

913

17.

036

17.

408

18.

244

19.

524

20.

891

21.

051

21.

211

21.

292

21.

682

21.

883

22.

100

22.

299

22.

972

23.

258

24.

497

25.

423

26.

117

27.

046

27.

132

27.

428

28.

329

32.

718

33.

016

33.

253

33.

514

34.

565

34.

967

35.

729

36.

587

38.

070

38.

444

39.

548

min0 5 10 15 20 25 30 35

pA

10

20

30

40

50

60


2.0

28

2.7

56 2

.899

3.2

36

3.7

03

4.0

04

4.4

78

4.7

00

5.1

40

5.2

80

5.4

54

5.8

44

5.9

84

6.3

60

6.8

39

7.2

97

7.9

99

9.3

57

10.

296

11.

950

14.

318

14.

855

15.

273

16.

462

18.

438

18.

789

18.

909

19.

021

19.

595

19.

696

20.

274

21.

322

21.

549

21.

999

22.

359

22.

650

23.

000

23.

996

24.

738

25.

046

25.

403

28.

577 29.

341

32.

525

32.

952

33.

476

33.

808

34.

361

34.

931

35.

312

35.

547

35.

778

36.

171

38.

931



Ainda com uma rampa adicional não obteve-se boa resolução, então diminui-se a

temperatura da rampa da região problemática (depois dos 16 min na coluna polar) e uma

isoterma depois dessa rampa, mantendo uma rampa rápida no final, para ser trabalhada

depois.

A

B

84

min0 5 10 15 20 25 30 35

pA

10

20

30

40

50

60


2.2

13

3.0

74

3.1

49

3.3

09

3.5

73

3.6

90

3.8

15

4.0

78

4.1

82

4.2

79

4.3

67

4.4

90

4.6

33

4.7

23

5.1

87

5.5

30 5.6

31

5.7

93

6.1

08

6.6

40

7.0

49

7.2

99

7.4

59

8.1

09

8.5

77

8.7

98

9.9

62

10.

158

10.

391

10.

612

10.

834

10.

980

11.

361

11.

751

13.

201

13.

308

13.

653

14.

577

16.

266

18.

255

18.

455

18.

642

18.

737

19.

172

19.

608

19.

806

20.

421

20.

672

21.

603

22.

215

22.

628

23.

162

23.

313

23.

729

25.

637

25.

820

25.

984

26.

107

26.

612

26.

692

26.

930

27.

388

29.

018

min0 5 10 15 20 25 30 35

pA

10

20

30

40

50

60


2.1

80

2.9

04

3.0

06

3.0

45

3.1

21

3.7

06

4.0

88

4.2

67

4.5

28

4.7

01

5.1

57

5.2

83

5.4

58

5.6

35

5.8

45

5.9

82

6.3

30

7.1

08

7.6

29

8.4

61

8.9

67

9.8

61

11.

276

11.

630

11.

951

12.

815

14.

821

15.

282

15.

430

15.

588

16.

424

17.

434

18.

777

19.

037

19.

869

20.

137

20.

448

21.

244 21.

774

21.

970

22.

211 2

3.85

4

24.

191

24.

494

25.

019

25.

578

25.

858

26.

117

26.

323

26.

622

26.

956

27.

171

27.

385

27.

488

28.

971



Várias tentativas modificando somente rampas de temperaturas foram realizadas e

decidiu-se de a partir do método BB9 continuar a desenvolver o método no cromatográfo

gasoso com espectrometria de massas a fim de se identificar por espectrometria de massas se

todos os padrões da mistura estavam sendo separados, e todos os ácidos graxos da mistura

foram identificados, com dificuldade somente na série de 18 carbonos e 20 carbonos, regiões

problemas do método.

85

RT: 0,00 - 37,42

0 5 10 15 20 25 30 35

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

7,15

8,52

9,935,87 11,73

4,74

15,51

12,95

27,67

15,0431,1329,17

2,93 27,30

24,9622,1615,86

22,70

17,84

37,1221,68 25,31 36,2734,06

24,7220,23

NL:6,82E8

TIC MS data_110305131908


ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB11.

No método BB11 observaram-se poucas mudanças no cromatograma quando

comparado com o método BB9, possuindo ainda regiões mal resolvidas, indicando que um

aumento de 5 min na isoterma do método não é o sufiente. Por isso decidiu-se mudar

brucamente o método iniciando com uma temperatura 60°C inferior, com uma rampa rápida

até a temperatura que corresponderiam às regiões problemas e mantendo uma isoterma curta.

86

RT: 0.00 - 35.52

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

7.35

7.66

7.95

8.63

9.47

10.57

22.1612.58

12.09 23.786.732.59 14.23 28.9825.8617.95

18.296.0919.83

17.26

31.602.7435.435.40

15.49

NL:1.96E9

TIC MS bb32


ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB32.

Ainda assim não observou-se significativa melhora na resolução das séries de ácidos

graxos de 18 carbonos e 20. De volta ao CG-DIC continuou-se o desenvolvimento do método,

com o uso de uma coluna de 60 m especifica para ácidos graxos, com rampas simples e

isotermas de curto tempo no final da análise para garantir que compostos não ficariam retidos

na coluna, prejudicando-a e comprometendo análises posteriores.

m i n5 7 . 5 1 0 1 2 . 5 1 5 1 7 . 5 2 0 2 2 . 5

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

F I D 1 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 1 8 . D )

2.796

2.876

2.969

3.042

3.104

3.210

3.248

3.335

3.555 3.896 4.3

54 4.6

72 4.9

40 5.3

22 5.6

56 5.9

47

6.489

7.412

7.751

7.815

8.397

9.416 9.7

07

10.15

3 10

.446 11.47

4 11

.737

11.78

7 11.87

8

12.28

4 12.58

2

13.35

6 13

.494

13.85

0 14

.128

14.20

1 14

.320

14.96

1 15

.348

15.45

9 15.90

5 17.16

0 17.69

1

19.39

8

21.18

2

22.15

3

22.91

5 23

.171


ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX18.

87

Como não observou-se melhora significativa, decidiu-se por realizar rampas lentas a

fim de se aumentar o tempo em que os componentes ficavam retidos na coluna, buscando

melhor separação.

m i n5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

p A

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5


4.935

5.097

5.280

5.626

7.991

9.037

9.689

10.24

7 10

.723

11.58

1

12.99

2 13

.498 13

.595

14.47

9

16.11

9 16

.619

17.96

0

20.06

3 20

.631

20.73

7 20

.936

21.82

3 22

.487

24.18

0 24

.491

25.28

0 25

.814 25.87

9 26

.026

26.28

3

27.64

0

28.47

8 28

.662 29

.554 32

.088 33.05

8

36.09

2

40.45

7

41.67

8 42

.068



Ainda não resolvidas as regiões problemas, optou-se por uma condição de uma única

rampa lenta 0,5°C/min.

m i n6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 1 1 0

p A

1 . 5

2

2 . 5

3

3 . 5

4

4 . 5

5


69.04

0

150.0

34 15

0.892



88

Foi possível observar a separação dos ácidos graxos da série de 18 carbonos

monoinsaturados em quatro picos (em torno de 70 min) e também o desdobramento do que

era antes dos picos em quatro em torno de 80 min (referentes ao ácido conjugado linoléico,

indicado pelo fabricante como uma mistura de dois). Porém, como demanda um tempo de

análise grande e outras regioes precisavam ainda serem melhores resolvidas outras condiçoes

foram testadas. Não obtendo resultados satisfatorios somados a dúvida a respeito da

identidade dos picos maus resolvidos e se os mesmos eram isômeros que não poderiam ser

separados na coluna usada na análise, utilizou-se o CG-EM para identificar os componentes

em condições diferentes, observando a identificação com probabilidade maior a medida que

os picos eram melhores separados.

m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 4 A .D )

3.9

80

8.5

36

9.4

38

12

.00

0

15

.66

9

17

.35

2

20

.43

6

27

.00

3

29

.07

4

31

.58

8

36

.45

3

46

.07

1

50

.13

0

53

.01

3 5

3.5

25

54

.43

0 5

5.4

75

61

.07

2

65

.20

5

67

.22

4 71

.45

9 7

2.0

58

72

.37

1 7

2.8

88

77

.06

2

82

.07

7 8

2.9

65

86

.52

5

90

.60

0 9

1.4

93

m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 5 A .D )

3.9

80

8.3

51

14

.45

4

15

.96

9

18

.88

8

25

.29

0

27

.33

7

29

.85

4

34

.59

8

48

.14

9

50

.74

7 5

1.1

06

51

.70

6 5

2.3

45

55

.14

3

57

.65

8

59

.19

0

63

.33

7 6

4.0

61

64

.40

6 6

4.9

67

69

.14

5

74

.16

3 7

5.0

68

78

.63

3

82

.73

4 8

3.6

35

m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 6 A .D )

3.9

78

8.5

29

11

.99

2

15

.65

9

17

.34

2 20

.42

5

26

.98

8

29

.05

9

31

.56

7

35

.76

5 3

6.4

37

50

.11

1

52

.98

9 5

3.5

02

54

.41

0 5

5.4

53

61

.05

3

65

.19

6

67

.21

5

71

.76

3 7

2.4

63

72

.83

1 7

3.4

41

78

.12

2

83

.52

6 8

4.4

58

88

.22

0

92

.46

1 9

3.3

74


ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 14A.

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 2 8 A .D )

5.7

69 7

.07

9

9.0

15

11

.87

2 1

3.3

19

16

.08

1

22

.26

7

24

.27

1

26

.78

1

31

.34

6

44

.63

7

47

.50

7 4

7.9

89

48

.86

6 4

9.9

05

55

.81

8

62

.33

4

64

.10

6

65

.74

6 67

.12

2 6

7.5

63

68

.16

3

71

.28

5

76

.16

0 7

7.1

51

81

.00

9

85

.41

6 8

6.3

82

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 0 A .D )

5.7

62

6.4

14 7

.07

1

9.0

05

11

.86

1 1

3.3

07

16

.06

9

22

.25

2

24

.25

6

31

.32

9

44

.61

9

47

.48

3 4

7.9

68

48

.84

5 4

9.8

80

55

.78

8

62

.50

7

64

.84

3

72

.22

0 7

3.4

01

73

.99

0 7

4.9

64

81

.46

2

88

.11

2 8

9.1

95

94

.45

4

99

.21

4 1

00

.04

8

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 1 A .D )

5.7

49

6.4

01

7.0

55

8.9

84

11

.82

9 1

3.2

70

16

.02

3

22

.18

9

24

.18

9

31

.24

2

44

.49

9

47

.35

2 4

7.8

36

48

.72

2 4

9.7

61

55

.66

8

62

.44

2

67

.74

6 6

8.1

13

68

.59

2

70

.66

0

72

.97

2 7

3.4

16

75

.17

2

77

.47

9 7

8.0

71

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 2 A .D )

5.7

64

6.4

16

7.0

73

9.0

07

11

.86

1 1

3.3

06

16

.06

6

22

.24

4

24

.24

7

31

.31

2

44

.58

5

47

.44

3 4

7.9

28

48

.80

7 4

9.8

46

55

.77

1

62

.59

1

64

.78

9

69

.91

4 7

0.7

39

71

.17

0 7

1.8

94

77

.21

3

82

.01

8 8

2.9

25

86

.87

1

91

.84

4 9

2.9

63



89

Pensando-se que as regioes que antes eram problemas poderiam melhorar optou-se por

diminuir a temperatura inicial em 5°C.

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F ID 2 B , (B A N N Y \2 4 _ 1 B B .D )

10

5.6

62

m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 9 A .D )

7.0

08

7.8

05

10

.16

2

13

.67

6

15

.43

7

18

.91

0

26

.68

5

29

.17

5

38

.22

8

55

.31

4

58

.81

6 5

9.5

07

60

.67

8 6

1.9

59

65

.76

3

68

.18

2

69

.81

2

74

.84

2 7

5.6

58

76

.08

7 7

6.7

99

82

.52

9

90

.00

5 9

1.3

46

97

.20

8

10

4.1

85

10

5.2

60

10

5.6

50



m i n0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p A

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

F I D 2 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 4 3 A . D )

4.09

6 4.

351

4.52

0 5.

314

5.84

9 6.

279 7.

065

7.87

0 9.

149

10.24

4 13.78

5 15

.560

16.33

0

19.05

4

26.87

8

29.37

9

32.39

4

38.46

3

55.62

7

59.12

7 59

.824

60.99

8 62

.278

65.87

0 68.26

3 69

.893

72.35

4 72

.498

74.93

5 75

.770

76.18

0 76

.897 81

.541

88.76

6 90

.302

97.91

4

109.7

68 11

1.620

112.6

77



O método escolhido foi o método MIX 43A que consistiu do uso de gás de arraste

hélio, injector no modo split 10:1 a temperature de 250°C, volume de injeção de 1µL, fluxo

90

de 1,8 mL/min, com temperature do forno iniciando em 160°C, mantendo por 62 min,

aumentando numa rampa de 8°C/min até 200°C, mantendo por 10 min, subindo 10°C/min até

210°C e finalmente mantendo por 42 min, coluna ZB-FFAP (zebron), de 60 m comprimento,

0,25 mm de diâmetro interno e espessura de filme de 0,25 µm.

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

82.18100.77

69.35

75.99

98.6489.40

6.01

10.43

14.39

83.3270.88

20.2628.9022.10

41.76101.5790.66 106.8944.38 81.58

24.43 44.9368.5930.38 32.67 60.69

52.47

NL:6.92E6

TIC MS mixpg47+24_1+22_6_III


ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43 A no

espectrometro de massas.

E nessa condição os padrões de ésteres metílicos dos ácidos graxos na mistura foram

identificados por espectrometria de massas (anexo 2) e os seus respectivos tempos de retenção

das análises tanto no CG-DIC quanto no CG-EM estão dispostos na tabela a seguir.

91

Tabela 35. Tempos de retenção em min da mistura dos padrões comerciais de ésteres

metílicos de ácidos graxos disponíveis no método MIX 43A.

Cadeia Tempo EM (min) Tempo dic (min)

C 6:0 - 4,10

C 7:0 - 4,35

C 8:0 - 4,52

C 9:0 - 5,31

C 10:0 - 5,85

C 11:0 - 6,28

C 11:1 - 7,06

C 12:0 6,01 7,87

C 13:0 7,77 10,24

C 14:0 10,43 13,78

C 14:1 11,80 15,56

C 15:0 14,39 19,05

C 16:0 20,26 26,88

C 16:1 c 22,10 29,38

C 16:1 t 24,43 32,39

C 17:0 28,90 38,46

C 18:0 41,76 55,63

C 18:1 c9 44,38 59,13

C 18:1 c6 44,93 59,82

C 18:1 c11 45,78 60,10

C 18:1 c 12 46,81 62,28

C 18:2 c 9,12 52,47 65,87

C 19:0 60,69 68,26

C 18:3 c 6,9,12 63,70 68,82

C 18:3 c 9,12,15 64,72 69,89

C 18:4 66,85 -

C 18:2 conj 1 68,59 72,35

C 18:2 conj 2 68,61 72,50

C 20:0 69,35 74,94

C 20:1 c13 69,93 75,77

C 20:1 c11 70,28 76,18

C 20:1 c8 70,86 76,90

C 20:1 c 5 70,90 76,92

C 20:2 c12,14 73,38 78,04

C 20:3 75,25 78,62

C 21:0 75,99 81,54

C 20:4 76,81 85,28

C 20:5 80,80 86,96

C 22:0 82,18 88,77

C 22:1 c13 83,32 90,30

C 22:2 c13,16 85,00 92,00

C 22:2 c11,14 85,15 92,30

92

Continuação da Tabela 35

C 22:3 87,00 94,24

C 23:0 89,40 97,91

C 22:4 90,81 99,51

C 24:0 98,64 109,77

C 22:6 99,94 111,62

C 24:1 100,77 112,68

4.8.2 Análise da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo

4.8.2.1 Lipídeos neutros

Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos lipídeos neutros por

espectrometria de massas e quantificá-los pela relação com os cromatogramas gerados no CG-

DIC. Seus cromatogramas mostraram uma boa aplicação do método desenvolvido para

análise de ácidos graxos. Como exemplo de como foi possível obter tais resultados, temos o

cromatograma de lipídeos neutros do peixe curimatã.

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

20.47

22.28

44.75

10.47 42.02

80.8264.75 70.3845.87

14.444.94 52.7227.34 100.0329.06 75.22 97.0193.32 117.30108.2660.9751.26

NL:8.94E7

TIC MS 1_1fame3III

Cromatograma 33. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de

curimatã por CG-EM.

Cada pico corresponde a um ácido graxo (derivatizado) e seus respectivos tempos de

retenção foram comaparados com o tempo de retenção da mistura de padrões disponíveis de

ácidos graxos resultantes de análises tanto por GC-EM quanto por CG-DIC, bem como com a

comparação dos espectros de massas gerados para cada pico com a biblioteca de espectros

93

disponivel e análise da coerência dos fragmentos padrões de ácidos graxos (Vetter et al.,

2007). Exemplicando temos o pico no tempo de retenção da análise no CG-EM 42,02 min,

que apresentou os sinais de fragmentos em m/z 74 e 87 altos (espectro 2), caracterização de

ácido graxo saturado e o íon molecular em sinal de m/z 298, confirmando o tamanho da

cadeia, sendo este referente ao espectro do éster metilico do ácido esteárico (C18:0), que

nesse caso tem ionização desencadeada em um dos pares de eletrons do oxigenio carbonilico,

e a partir desse ponto o rearranjo de fragmentação bem conhecido de McLafferty leva ao ion

base em m/z 74. Esse íon é caracteristico para todos os ácidos graxos saturados e mono

insaturados, assim como o fragmento em m/z 87, que se refere a quebra entre os carbono C3 e

C4.

1_1fame1III_130107122236 #2376 RT: 41.09 AV: 1 SB: 66 30.05-30.40 , 31.02-31.68 NL: 4.43E5T: + c Full ms [40.00-500.00]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

74.11

87.12

143.12

43.13

199.21

255.32101.16129.17

157.32 213.27171.17 298.29241.28111.20 267.32

279.64 392.83 435.94328.51 457.48369.73 490.69

Espectro 2. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de

lipídeos neutros do peixe curimatã.

A seguir se encontram os cromatogramas dos lipídeos neutros dos demais peixes em

estudo.

94

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

20.43

44.85

42.0422.26

76.80

52.7910.48 70.38 100.0864.784.99

61.06 90.8129.0714.44 80.80 97.046.00 75.22 100.94 112.9731.34 48.34 53.65

NL:4.37E7

TIC MS 2_1fame3III


pescada.

Para o peixe pescada observou-se uma variedade grande de componentes, já que o

espaço do cromatograma foi bem aproveitado dentro do método, com maior quantidade do

pico em 20,43 min.

RT: 0.00 - 120.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

20.44

22.2544.79

42.09

10.46

45.92

14.41

28.9860.90

70.344.95 17.19 52.56 82.2131.28 98.6173.35 89.40 100.21 116.3135.03 66.66

NL:7.96E7

TIC MS 3_1fame2III


sardinha.

95

Para o peixe sardinha observou-se também uma variedade grande de componentes,

sendo marjoritário o pico em 20,44 min.

RT: 0.00 - 119.99

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

20.38

22.28

44.7242.06

10.41 76.8545.98

64.814.94 14.46

80.8270.4252.8425.16 100.1093.3729.11 90.8761.12 101.96 112.8551.3631.98 58.85

NL:2.96E7

TIC MS 4_1fame3III


jaraqui.

Da mesma forma se processo para o peixe jaraqui, sendo marjoritário o pico em 20,38

min.

96

RT: 0.00 - 120.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

20.38

44.65

41.9722.2210.47

60.9614.43 76.79

64.70 100.0170.3745.86 79.464.95

93.3280.7852.6329.0175.19 82.19 101.8831.29 117.04110.5148.2535.47 53.66

NL:4.32E7

TIC MS 5_1fame2III


surubim.

Igualmente para o peixe surubim e pacu, sendo encontrado neste último uma grande

quantidade de outro componente, o referente ao pico em 44,87 min.

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

20.40

44.87

42.06 52.80

22.224.96 70.3564.70

45.8610.4776.76 99.9382.2110.90 93.26 105.94 116.9890.2060.8722.73 29.05 37.13 47.04

NL:4.21E7

TIC MS 6_1fame2III_130105011422

Cromatograma 38. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de pacu.

Foi identificado e quantificado uma grande variedade de ácidos graxos para os lipídeos

neutros nos peixes em estudo (tabela 36), sendo marjoritário para todos os peixes a presença

de ácido palmítico (C16:0), o que referia ao pico em 20 min, seguido por ácidos da série de 18

carbonos (entre 42 e 45 min), os ácidos oléico (C 18:1 ω 9), esteárico (C 18:0) e cis-12-

97

octadecenóico (C 18:1 ω 6). E ainda foi observada a presence dos ácidos graxos EPA

(eicosapentaenóico) e DHA (docosahexaenóico), importantes ácidos graxos do tipo ômega 3

que são considerados valiosos de um ponto de vista nutricional e fisiológico (Belitz et al.,

2004). Os ácidos graxos cis 6-octadecenóico (C 18:1 ω 12) e nervônico (C 24:1 ω 9)

encontrados nas especies de peixe sardinha, jaraqui, surubim e pacu não foram encontrados

nos lipídeos neutros de outros peixes amazônicos que já foram estudados, como o tucunaré e

matrinxã (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002; Almeida et al., 2007; Almeida et

al., 2008).

Tabela 36. Quantidade em mg de ácido graxo/g de peixe nos lipídeos neutros.

Cadeia Peixe

curimatã pescada sardinha jaraqui surumbi pacu

C 12:0 1,987 2,148 2,493 3,932 2,435 2,896

C 13:0 2,205 - 3,299 3,299 4,162 -

C 14:0 20,909 11,586 25,571 23,614 23,557 6,522

C 14:1 c 9 ω5 1,941 - 2,781 - - -

C 15:0 9,860 6,752 12,046 13,658 19,988 -

C 16:0 261,874 210,596 143,953 196,611 190,281 183,490

C 16:1 c 11ω5 5,313 6,752 17,514 4,507 6,004 4,507

C 16:1 c 9ω7 3,011 - - - - -

C 16:1 t 11 ω5 3,702 9,111 10,895 8,018 7,385 -

C 16:2 c 7,10 ω6 3,817 - - 3,356 - -

C 16:2 t7,11 ω5 3,241 3,471 4,162 2,896 2,953 -

C 17:0 11,644 11,126 12,219 10,780 13,600 3,126

C 16:3 ω1 5,198 - - - - -

C 17:1c10 ω7 5,255 4,910 4,047 4,910 6,234 1,457

C 18:0 64,935 74,028 71,209 60,447 73,280 127,666

C 18:1 c9 ω9 101,768 177,735 117,364 63,554 117,767 331,568

C 18:1 c6 ω12 - - 10,493 - - -

C 18:1 c11 ω7 36,793 29,772 - - - -

C 18:1 c 12 ω6 - - 51,181 38,520 29,081 17,399

C 18:1 t11 ω7 2,608 3,644 8,018 - 4,220 -

C 18:1 t9 ω9 4,392 - 3,874 9,975 - -

C 18:2 c 9,12 ω6 25,341 46,232 20,506 25,743 25,743 136,644

C 18:2 t 9,13 9,226 - - - - 3,471

C 19:0 9,917 27,412 17,571 19,183 70,518 7,442

C 18:3 c 6,9,12 ω6 7,442 - - 2,551 2,551 -

C 18:3 c 9,12,15 ω3 28,448 17,111 20,219 24,477 24,938 16,823

C 18:2 conj 1 ω6 2,953 - - - - -

C 18:2 conj 2 ω6 - - 4,910 3,241 3,414 3,011

C 20:0 3,874 5,140 4,795 4,910 5,198 10,953

98

C 20:1 c13 ω7 3,011 3,874 2,781 3,471 3,759 -

C 20:1 c11 ω9 19,240 10,953 5,198 9,572 15,039 12,680

C 20:1 c8 ω12 2,205 - - 3,644 2,493 -

C 20:2 c12,14 ω6 6,176 - 3,817 - 2,551 2,551

C 20:3 5,11,14 ω6 3,184 - 2,723 2,608 - -

C 20:3 c 11,14,17 ω3 6,349 4,738 2,953 3,989 5,371 6,004

C 21:0 2,090 - - - - -

C 20:4 c5,8,11,14 ω6 7,442 2,666 7,327 5,946 10,723 3,759

C 20:5ω3 19,298 5,716 9,860 8,306 8,363 -

C 22:0 2,378 3,759 3,932 3,069 3,414 -

C 22:1 c13 ω9 2,781 7,903 - 2,608 - -

C 22:4 ω6 4,392 - - 4,392 7,442 -

C 24:0 5,831 5,773 6,522 6,176 12,219 -

C 22:6 ω3 8,709 6,234 6,291 5,831 10,262 -

C 24:1ω9 9,399 13,946 22,463 8,018 22,233 3,471

Total 740,140 713,088 642,986 595,813 737,178 885,439

Foi observada uma maior quantidade de ácido graxo saturado para os lipídeos neutros

que insaturados, com exceção dos peixes sardinha e pacu (tabela 37); resultado coerente,

porque os lipídeos neutros sao formados principalmente por glicerideos, que tem função de

armazenar energia na saúde humana, sendo necessário ácidos graxos saturados (Gurr et al.,

2002). Porém de qualquer forma os ácidos graxos insaturados mostraram participação

significativa para os lipídeos neutros com uma variação para os peixes estudados entre 25-

54%, observando valores percentuais altos, principalmente para o peixe pacu, tanto com

monoinsaturados quanto de poliinsaturados, quando comparados à outros peixes amazônicos

(Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002; Almeida et al., 2007; Almeida et al.,

2008).

Tabela 37. Relação percentual de tipos de ácidos graxos presents nos lipídeos neutros.


ΣAGS 39,750 35,832 30,361 34,568 41,865 34,209

ΣAGMI 20,142 26,860 25,661 15,680 21,421 37,108

ΣAGPI 14,122 8,617 8,277 9,334 10,431 17,226

Σω6 6,075 4,890 9,046 8,636 8,151 16,336

Σω3 6,280 3,380 3,932 4,260 4,893 2,283

ΣAGI 34,264 35,477 33,938 25,013 31,853 54,334

99

4.8.2.2 Glicolipídeos

Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos glicolipídeos por

espectrometria de massas.

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

5.01 5.396.05

7.01

4.028.23

8.76

9.52 20.46

11.10

12.41

13.21 113.58110.95100.3394.3992.3914.47 87.74

82.49

79.12

22.31 78.02

77.80

77.3923.16 70.42

68.3225.3027.60 66.8744.70

30.89 66.2837.17 46.04 64.8249.46

62.64

NL:1.89E6

TIC MS 1_2fame2

Cromatograma 39. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de curimatã.

Para o peixe curimatã, apesar da baixíssima quantidade de componentes, foi possível

observar assim como nos lipídeos neutros a predominância do pico em 20,46 min.

100

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.33

44.57

10.44 41.976.16

112.2722.224.48 100.6294.3111.63 93.37 101.1269.38 113.0670.34 82.1667.12

22.89 29.06 45.81 52.6164.6832.20

46.91 56.41

NL:6.36E6

TIC MS 2_2fame1III

Cromatograma 40. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pescada.

Para o peixe pescada, além do pico mais abundante em torno de 20 min, observou-se

os picos com relativa quantidade em relação ao cromatograma total, em 42 e 44 min.

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

4.93

20.25

5.67

6.89

8.019.12 99.81

10.74 111.12105.0912.45 93.1441.75 91.5714.41 87.0980.6922.09

44.3822.52 75.1272.56

25.77 45.5766.7831.07

52.4363.10

NL:2.90E6

TIC MS 3_2fame2III_130103164224

Cromatograma 41. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de sardinha.

101

Já para o peixe sardinha, observou-se a presença em quantidade abundante do pico em

100 min.

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.36

44.59

41.9422.19

10.46

45.734.93 14.4069.3652.5328.94 76.73 81.644.49 64.6418.07 88.2360.76 94.84 99.93 112.2131.23

NL:5.85E7

TIC MS 4_2fame2III

Cromatograma 42. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de jaraqui.

O jaraqui obteve uma boa quantidade de componentes para uma fração de glicolipídeos,

quando comparado com os demais peixes em estudo.

102

RT: 0.00 - 120.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.19

5.92 6.19 41.6844.318.23

10.41

11.68109.70 113.61102.76100.1592.7287.1280.2322.09

78.1124.27 70.1845.53 67.0931.21 60.5634.48

46.08

NL:3.57E6

TIC MS 5_2fame1III

Cromatograma 43. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de surubim.

Os peixes surubim e pacu, apesar da baixa concentração das amostras, também foi

possivel observar maior quantidade do pico em torno de 20 min, com um diferencial para o

ultimo peixe, que paresentou uma quantidade quase equivalente ao pico citado de picos em 42

e 44 min.

103

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.24

44.34

6.006.33

7.05

7.58

8.238.64

9.854.49

11.60

12.25

12.83 112.21108.24

100.5714.07 93.4041.73 90.2887.20

82.14

81.59

78.3620.84 78.08

22.4570.27

69.3224.7967.0727.04

31.04 52.4536.17 66.55

47.49 53.10 63.41

NL:1.17E6

TIC MS 6_2fame1III

Cromatograma 44. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pacu.

Também foi possivel identificar e quantificar uma variação grande de ácidos graxos

para os glicolipídeos dos peixes em estudo (tabela 38), sendo marjoritária a presence do ácido

palmitico (C16:0) para os peixes jaraqui e surubim e a presença do ácido 12-octadecenoico

(C 18:1 ω 6) para os peixes pacu e pescada, e do ácido esteárico para os demais peixes. E

ainda foi observada a presença do ácido DHA para o peixe sardinha.

104

Tabela 38. Quantidade em mg de ácidos graxos presentes /g de peixe nos glicolipídeos.

Cadeia Peixe


C 6:0 - - - - - -

C 10:0 - 2,666 - 1,998 1,636 -

C 14:0 20,506 2,320 2,551 2,320 2,781 -

C 15:0 2,148 3,644 - - 3,356 -

C 16:0 - - - 20,506 40,534 12,392

C 16:1 c 9 ω7 6,349 6,924 - 7,500 3,702 -

C 16:1 t 9 ω7 1,912 - - - - -

C 17:0 2,263 3,529 - - - -

C 18:0 11,528 26,722 14,003 12,162 23,672 12,046

C 18:1 c9 ω 9 12,392 47,555 8,766 14,118 21,542 23,154

C 18:1 c11 ω 7 5,658 7,557 - 5,601 - -

C 18:2 c 9,12 ω 6 3,644 10,147 3,299 3,644 4,450 5,198

C 18:2 t 9,13 ω 5 4,392 2,608 - - - -

C 19:0 4,680 4,795 2,263 3,414 6,176 2,320

C 18:3 c 9,12,15 2,205 3,702 2,608 2,666 - -

C 18:2 conj 1 ω6 4,565 5,255 2,838 4,507 - -

C 20:0 1,797 5,601 - - - -

C 20:1 c11 2,263 2,781 - - 2,493 -

C 20:3 c 11,14,17 ω3 2,263 2,551 - - - -

C 21:0 2,263 - - - - -

C 20:4 c5,8,11,14 ω6 2,148 2,781 - - - -

C 22:0 2,148 2,896 - - - -

C 22:3 c8,11,14 ω8 2,263 - - - - -

C 22:4 ω6 - 3,069 - - - -

C 24:0 2,435 4,680 - - - -

C 22:6 ω3 - - 4,047 - - -

C 24:1ω9 - 4,277 - - - -

Total 99,822 156,060 40,375 78,436 110,341 55,110

Foi observada uma maior quantidade de ácidos graxos insaturados do que saturados

para os glicolipídeos dos peixes em estudo, com exceção para o surubim (tabela 39) e maior

participação de ácidos graxos monoinsaturados que poliinsaturados, com exceção do peixe

sardinha.

105

Tabela 39. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos nos glicolipídeos.


ΣAGS 8,212 9,375 6,297 6,644 13,006 8,749

ΣAGMI 4,715 11,394 2,934 4,476 4,616 7,570

ΣAGPI 3,544 4,966 4,281 1,779 0,740 1,699

Σω6 1,709 3,505 2,054 1,341 0,740 1,699

Σω3 0,373 0,001 0,002 0,000 0,000 0,000

ΣAGI 8,260 16,360 7,214 6,255 5,356 9,269

4.8.2.3 Fosfolipídeos

Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos fosfolipídeos por

espectrometria de massas.

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.44

42.30

44.82

18.13

45.99

76.8022.26

70.38

37.04 52.74 75.224.95 29.0614.45 93.3580.79 100.0290.8164.734.04 60.9931.35 111.1748.09

NL:6.25E7

TIC MS 1_3fame2III

Cromatograma 45. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de curimatã.

Para os fosfolipídeos do peixe curimatã observou-se uma varição de componentes, e

assim como nas demais frações de seus lipídeos, a predominância do pico em 20 min.

106

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.35

76.82

100.044.96

6.057.08 93.35

44.609.08 90.8296.9980.8210.94

102.6913.14 41.97 113.7990.07

23.11 75.2252.7423.63 73.5170.1536.9627.54

64.7250.57 53.65

NL:4.33E6

TIC MS 2_3fame3III

Cromatograma 46. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pescada.

Para o peixe pescada observou-se uma quantidade relativamente alta dos picos em

torno de 77 e outro em trono de 100 min.

107

RT: 0.00 - 120.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

20.47

42.28

44.81

76.82

46.0022.25

18.1014.41 29.0310.47 93.35 100.0436.99 75.2252.71 90.7981.706.06 70.3564.72 101.88 112.87

NL:9.40E7

TIC MS 3_3fame2III

Cromatograma 47. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de sardinha.

Para o peixe sardinhaobservou-se como marjoritario o pico em torno de 20 min

também.

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.44

42.23

45.9518.15

22.26

76.8029.094.96 14.46 52.74 75.2037.02 70.3724.49 93.3077.98 99.9661.03 111.0187.1051.17

NL:6.19E7

TIC MS 4_3fame2III

Cromatograma 48. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de jaraqui.

108

Bem como para os peixes jaraqui, surubim e pacu.

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.55

42.28

44.79

45.9514.46

22.26 29.06 70.3510.47 76.7452.6937.014.95 69.39 93.2790.7180.07 115.0098.61 108.3860.92

NL:1.17E8

TIC MS 5_3fame2III

Cromatograma 49. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de surubim.

RT: 0.00 - 120.01

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.24

41.72

44.32

76.635.76 7.00

14.35 52.33 93.1699.73 112.4087.01 110.6775.0867.04 82.0822.09 45.5628.90 31.32 66.3256.88

NL:9.96E6

TIC MS 6_3fame1III

Cromatograma 50. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pacu.

109

Foi identificado como marjoritária a presence do ácido palmitico (C16:0) seguido

pelos ácidos graxos da série de 18 carbonos, os ácidos esteárico (C18:0) e 12-octadecenoico

(C 18:1 ω 6), para a classe de fosfolipídeos dos peixes em estudo (tabela 40). Os ácidos EPA

e DHA, entre outros ácidos graxos foram encontrados para os fosfolipídeos também. Os

fosfolipídeos dos peixes também apresentaram muitos ácidos graxos insaturados da série

ômega 6 (12-octadecenoico, 18:3 e 20:2) que nao foram encontrados em fosfolipídeos de

outros peixes amazonicos já estudados (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002;

Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008).

Tabela 40. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos fosfolipídeos.

Cadeia Peixe


C 9:0 - - - - - 1,820

C 10:0 - - - - - 2,608

C 12:0 2,551 - 1,992 - - -

C 14:0 6,637 - 12,449 4,162 10,205 16,478

C 14:1 9,284 - 4,738 - - -

C 15:0 8,421 - 17,974 7,845 24,650 9,802

C 16:0 321,381 47,613 385,320 190,684 650,283 179,461

C 16:1 c 9 ω7 15,557 - 18,262 8,651 7,212 -

C 16:1 t 9 ω7 7,442 - 12,737 5,083 10,723 -

C 17:0 16,535 - 22,463 13,773 24,823 6,809

C 18:0 327,251 17,744 269,183 192,238 342,848 162,311

C 18:1 c 9 ω 9 150,801 23,959 154,312 56,130 172,900 104,185

C 18:1 c 6 ω 12 - - 9,744 - - -

C 18:1 c 11 ω 7 90,833 4,910 96,128 58,720 63,612 17,744

C 18:1 c 12 ω 6 - - 6,349 - - -

C 18:2 c 9,12 ω 6 35,815 11,586 20,967 17,514 26,952 49,224

C 18:2 t 9,13 ω 5 3,529 - 5,658 - 2,896 -

C 19:0 11,644 - 11,874 9,860 10,493 4,335

C 18:3 c 6,9,12 ω6 3,586 - 2,953 2,608 5,198 -

C 18:3 c 9,12,15 ω3 8,824 2,608 6,119 4,335 4,507 2,263

C 18:2 conj 1 ω6 - - - - - 2,493

C 20:0 4,680 - 4,622 3,702 4,968 3,471

C 20:1 c13 ω7 - - - - 3,471 -

C 20:1 c11 ω9 22,290 - 4,047 4,738 12,967 4,853

C 20:1 c8 ω 12 - - 2,263 2,953 - -

C 20:2 c12,14 ω6 2,378 - 3,299 - - -

C 22:3 c8,11,14 ω8 8,593 - 5,255 3,644 5,486 8,651

C 21:0 13,658 4,162 10,723 5,946 6,349 9,514

C 22:4 ω6 3,126 - 3,299 - - -

110

C 20:5 ω3 5,946 5,198 5,025 - - 2,666

C 22:0 2,953 - 5,313 - - -

C 22:6 ω3 7,327 6,579 6,809 - 3,529 3,586

C 24:1ω9 7,730 28,736 13,658 - - 7,442

Total 1098,774 153,096 1123,535 592,584 1394,071 599,717

Foi observado uma maior quantidade de ácido graxo saturado que insaturado para os

fosfolipídeos, com execeção da pescada (tabela 41), porém mesmo sendo menor o somatorio

dos acidos graxos insaturados, estes foram maiores nos peixes curimatã, sardinha e surubim

que para seus respectivos lipídeos neutros, confirmando que em geral os fosfolipídeos

possuem maior quantidade de insaturados que lipídeos neutros por serem componentes de

membrana (Gurr et al., 2002). Os valores encontrados foram na faixa dos encontrados para

outros peixes amazônicos já estudados (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002;

Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008).

Tabela 41. Relação percentual dos tipos ácidos graxos nos fosfolipídeos.


ΣAGS 118,102 11,464 248,281 70,422 178,826 129,670

ΣAGMI 50,154 9,500 107,836 22,411 45,078 43,884

ΣAGPI 13,057 4,283 19,873 4,621 8,082 22,521

Σω6 7,410 1,911 12,337 3,309 5,350 16,909

Σω3 3,646 2,372 6,008 0,713 1,337 2,784

ΣAGI 63,211 13,782 127,710 27,033 53,160 66,405

4.8 Qualidade Nutricional dos lipídeos em classe

4.9.1 Lipídeos neutros

Observou-se que os acidos graxos do tipo ômega 3 e 6 presentes, importantes

mediadores farmacologicos, constitui em 8-18% dos ácidos graxos insaturados, sendo o

somatorio dos ácidos graxos EPA e DHA até 5% para a fração de lipídeos neutros, resultado

esse maior que aqueles encontrados no matrinxã (Almeida et al., 2007). No entanto houve

uma grande contribuição dos ácidos graxos do tipo ômega 6, através dos altos valores da

razão entre eles (ω6/ω3). E a razão entre os ácidos graxos poliinsaturados e saturados mostrou

valor recomendado para consumo para o peixe pacu, maiores que 0,45 (Department of

healthy, 1994). Porém, atualmente a qualidade nutricional é medida pelos indices de

aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos

111

hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, que mostraram valores 1 - 2 para IA, 2-3 para IT e

0,1-0,8 para HH.

Table 42. Qualidade nutricional dos lipídeos neutros dos peixes.


AGPI/AGS 0,355 0,240 0,273 0,270 0,249 0,504

ω6/ω3 0,967 1,447 2,301 2,027 1,666 7,157

Σω3+Σω6 12,355 8,270 12,979 12,896 13,044 18,619

EPA + DHA 4,621 1,971 5,405 2,325 3,099 0,000

IA 1,765 1,216 2,154 1,698 1,385 1,247

IT 1,740 1,829 2,723 1,815 1,589 3,081

HH 0,111 0,190 0,358 0,100 0,154 0,841

4.9.2 Glicolipídeos

Dos ácidos graxos insaturados, os ácidos do tipo ômega 3 e 6 constituintes da fração

de glicolipídeos para os peixes em estudo foram cerca de 1-3% e a razão de entre eles (ω6/ω3)

indicou uma maior contribuição dos ácidos graxos ômega 6. A razão entre poliinsaturados e

saturados apresentaram valores recomendados para consumo (Department of healthy, 1994).

E os índices de aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos

hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, mostraram valores 0,1–2 para IA, 0,6-4 para IT e

0,1-5 para HH.

Table 43. Qualidade nutricional dos glicolipídeos dos peixes.


AGPI/AGS 0,432 0,530 0,680 0,268 0,057 0,194

ω6/ω3 4,577 3399,142 922,171 0,000 0,000 0,000

Σω3+Σω6 2,082 3,506 2,056 1,341 0,740 1,699

EPA + DHA 0,000 0,000 1,354 0,000 0,000 0,000

IA 1,991 0,103 0,684 0,842 1,605 0,437

IT 1,162 0,643 2,215 1,977 4,162 1,724

HH 0,164 4,562 2,456 0,147 0,100 0,748

4.9.3 Fosfolipídeos

Quando observamos os ácidos graxos do tipo ômega 3 e 6, que desenvolvem papel

como importantes mediadores farmacológicos, podemos verificar que estes constituem 4-20%

dos ácidos graxos insaturados e a relação entre eles (ω6/ω3) indicou uma maior contribuição

112

dos ácidos graxos ômega 6. A razão entre poliinsaturados e saturados da fração de

fosfolipídeos apresentaram valores levemente menores que o recomendado para consumo

(Department of healthy, 1994). Porém, atualmente a qualidade nutricional é feita pelos

indices de aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos

hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, que mostraram altos valores para a HH do peixe

pescada e pacu, considerando-o bom para a saúde humana.

Table 44. Qualidade nutricional dos fosfolipídeos dos peixes.


AGPI/AGS 0,111 0,374 0,080 0,066 0,045 0,174

ω6/ω3 2,032 0,805 2,053 4,642 4,001 6,074

Σω3+Σω6 11,056 4,283 18,345 4,022 6,687 19,693

EPA + DHA 2,190 1,942 3,960 0,000 0,587 2,044

IA 0,945 0,570 1,159 1,290 2,222 1,262

IT 2,689 0,766 2,840 4,184 5,664 3,010

HH 0,105 0,173 0,163 0,066 0,052 0,270

4.9.4 Lipídeos no total

Quando somamos os valores das classes de lipídeos, levando em consideração suas

respectivas contribuições para os lipídeos totais, encontramos valores entre 1-2 para IA, 2–3

para IT e 0,1-1 para HH. Esses valores foram coerentes com os encontrados na literatura

(Ulbricht et al., 1991 e Bentes et al., 2009). Os peixes sardinha e pacu apresentaram elevados

valores para a razão HH, confirmando a razão entre ácidos graxos poliinsaturados e saturados

e ainda uma boa quantidade de ácidos do tipo ômega 3 e 6 conferindo a estes uma qualidade

nutricional destacada.

Tabela 45. Constituintes dos lipídeos totais dos peixes (% em g de peixe).


AGPI/AGS 0,343 0,243 0,233 0,258 0,180 0,495

ω6/ω3 1,090 26,534 11,570 2,212 2,143 7,062

Σω3+Σω6 12,134 7,902 13,867 12,293 10,475 18,456

EPA + DHA 4,416 1,912 5,001 2,164 2,228 0,033

IA 1,726 1,157 1,906 1,676 1,532 1,239

IT 1,787 1,740 2,714 1,996 2,604 3,068

HH 0,112 0,217 0,335 0,099 0,119 0,832

colesterol 1,400 15,980 24,944 18,170 18,933 7,769

113

5. CONCLUSÃO

Esse trabalho resultou em metodologia desenvolvida para análise quanti- e qualitativa

de ácidos graxos e de esteróides por cromatografia gasosa usando detector de ionização de

chamas e espectrometria de massas; indicou que as espécies de peixes curimatã, pescada,

sardinha, jaraqui, surubim e pacu possuem teores de lipídeos interessantes, sendo que as

maiores quantidade de lipídeos totais estão nos peixes curimatã e pacu.

Verificou-se que os peixes estudados possuem ácidos graxos insaturados essenciais

para a saúde humana (ômega 3 e 6), constituindo a maior quantidade para os peixes curimatã,

pescada, jaraqui e surubim em suas frações de lipídeos neutros e para os peixes sardinha e

pacu em suas frações de fosfolipídeos. E observou-se os melhores índices de aterogenecidade

e de trombogenecidade, bem como elevada quantidade de ácidos graxos

hipocolesterolêmicos, para os glicolipídeos dos peixes, com exceção para o peixe surubim que

foi melhor contemplado nos lipídeos neutros. Quando levado em consideração a contribuição

de cada classe de lipídeos para os lipídeos totais, e avaliados como parâmetros de qualidade

nutricional lipidíca, a relação de ácidos graxos poliinsaturados e saturados, e ainda a soma de

ácidos graxos do tipo ômega 3 e 6, destacou-se o peixe pacu, porém ao se avaliar os índices

de aterogenecidade e trombogenecidade, o peixe em destaque foi a pescada.

114

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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633.

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119

ANEXO 1

Espectros de massas dos tempos de retenção do cromatograma obtido da análise da mistura

de padrões comerciais esteróides disponíveis.

Colesterol TMS

steroids #966 RT: 24.83 AV: 1 SB: 73 25.36-26.27 , 26.56-27.19 NL: 2.41E5T: + c Full ms [40.00-650.00]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

129.26

329.48

74.99 368.01

73.00

105.12

81.07144.82

57.06

213.23 353.68247.46

458.20255.46

173.27

199.39

274.57228.66 443.36301.34

385.76 428.40 565.80527.26503.34 607.77 638.18

Ergoesterol TMS


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

363.18

337.09

69.04

252.62

72.99 157.16

119.0255.03

211.34

197.20142.73

81.06

171.18

378.5683.03

468.05237.58

279.38326.37 452.97

424.91 479.13 613.60566.46528.61 641.66

120

Campesterol TMS


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

128.97

74.94

342.4273.01

119.10 382.2181.0243.04

145.29159.29 213.09

71.07 367.52255.29

472.72260.91172.69

202.68 217.34457.66

289.52 315.62394.19 430.49 521.62503.96 562.81 633.71586.14

Estigmsterol TMS


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

82.80

128.79

74.92255.34132.9455.03

159.17

119.04

394.6192.97

484.72

213.38172.72379.47

354.54227.43

282.37199.42

343.15295.39 469.62

329.45441.32 499.62 561.72 621.80

121

Sitosterol TMS


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

128.98

357.48

74.98

158.9972.98 396.79

95.01

43.05

381.63254.64173.21275.43213.41 485.68

202.66 471.56302.63228.44

329.19456.97428.69 549.58 622.88509.63 603.18

ANEXO 2

Espectros de massas dos tempos de retenção do cromatograma obtido da análise da mistura de

padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos.

EMAG C12:0

mixpg47+24_1+22_6_III #102 RT: 6.01 AV: 1 SB: 58 5.49-5.81 , 6.18-7.07 NL: 1.64E5T: + c Full ms [40.00-650.00]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.03

87.07

43.09

55.07 143.07

171.48129.07

213.94262.97 281.15 355.20 525.00335.00 566.36479.58 613.14 649.43426.34404.40

122

EMAG C13:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.00

87.05

41.07

143.09

55.09

185.33129.02

157.02197.18

228.20 293.10 389.92268.14 358.44 502.54458.69315.22 573.89548.38415.67 631.18

EMAG C14:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.03

87.06

143.07

43.07

199.4555.11

157.05129.16

211.26101.06

242.26

296.41269.27 428.30 520.87 596.93340.37 562.09393.67 484.75 643.03

123

EMAG C15:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.02

87.02

143.07

43.09

55.03212.96

157.26101.19

199.27

225.18256.58

383.13 553.36280.58 498.50326.47 577.18427.93 461.74 640.76

EMAG C16:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.10

87.05

143.07

55.03

226.94185.10

129.12170.86100.90

239.05269.84

558.53299.18 373.56 517.07452.37 486.77325.12 412.33 645.28595.81

124

EMAG C16:1 cis


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

69.07

55.10

81.09 97.11

98.06

109.41

152.27

194.47236.17

165.10

206.58

250.84

287.22 441.28309.67 388.72344.68 593.75 647.82574.18492.27 536.18

EMAG C16:1 trans


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

57.09

89.24

69.04

99.06132.46

148.11123.22

175.03477.42

203.99 269.44224.95 354.09297.31 643.99357.35 601.83487.02452.33 549.96329.81 402.79

125

EMAG C17:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.02

87.05

143.11

43.09

129.11240.97

185.19

284.34157.24

253.05227.19

532.29351.56 618.98563.95314.18 371.15 442.32 479.38405.57

EMAG C18:0


50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

74.03

87.08

143.09

43.10

55.13 198.94 255.19

213.09101.04 185.02

241.25157.31 269.25 298.11

401.31 502.79365.05324.60 426.47 622.59580.27461.01 545.93

126

EMAG C18:1 cis 12


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127

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128

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129

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131

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM INSTITUTO … Silva Barbosa.pdf · À FINEP e CNPq por...

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