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I UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas no estipe de coqueiro (Cocos nucifera L.), utilizando as técnicas de MSPD e HPLC-DAD JORDANA ALVES FERREIRA São Cristóvão, SE 2012

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I

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas no estipe de coqueiro (Cocos nucifera L.), utilizando as técnicas de MSPD e HPLC-DAD

JORDANA ALVES FERREIRA

São Cristóvão, SE 2012

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II

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

JORDANA ALVES FERREIRA

Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas no estipe de coqueiro (Cocos nucifera L.), utilizando as técnicas de MSPD e HPLC-DAD

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, da Universidade Federal de Sergipe, como um dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene

São Cristóvão, SE 2012

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III

“Mesmo que só não se possa fazer muito, cada um possa pegar um pouco de sabedoria. Ainda que, modesto e insuficiente, desperto o sonho do homem de alcançar a verdade. Por essas pequenas luzes em nossas trevas são por onde veremos pouco a pouco, os esboços desse grande projeto que dá forma ao universo. Eu estou entre aqueles que pensam que por esse motivo, a ciência tem grande beleza e com sua força espiritual, limpará algum dia este mundo de seus males, sua ignorância, pobreza, doenças, guerras e mágoas. Procurem a clara luz da verdade. Procurem estradas novas e desconhecidas mesmo quando a vista dos homens veja mais longe que agora. A maravilha divina nunca nos falhará. Cada época tem seu próprio sonho. Deixe então, os sonhos de ontem. Você toma a tocha do conhecimento e construa o palácio do futuro”.

Marie Curie - Madame Curie, 1943.

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IV

“Nada no mundo se compara à persistência. Nem o talento; não há nada mais comum do que homens malsucedidos e com talento. Nem a genialidade; a

existência de gênios não recompensados é quase um provérbio. Nem a educação; o mundo está cheio de negligenciados educados. A persistência e determinação

são, por si sós, onipotentes. O slogan "não desista" já salvou e sempre salvará os problemas da raça humana.”

Calvin Coolidge

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V

Agradecimentos

A Deus por ser meu Refúgio e Fortaleza em todos os momentos de minha vida. Pelas grandes oportunidades que Ele me proporciona.

Ao orientador prof. Dr. Sandro Navickiene pela prestimosa orientação, pelo seu profundo amor ao trabalho e exemplo de profissional responsável. A paciência, conselhos, conversas, discussões e sugestões foram elementos fundamentais nesses dois anos de convivência. A “arte da cromatografia” foi me apresentada de forma tão agradável, que a cada ideia que nos surgiu no decorrer desta pesquisa, nos proporcionou através de nossos estudos e criatividade um trabalho inédito na literatura. Agradeço as horas de leituras gastas neste trabalho. E principalmente, gostaria de agradecer por sempre me estimular o exercício de leitura e estudo para o resto da vida. Sandro, muito obrigada!

A minha amiga carioca Dulce Reinoso, “swing sangue bom” que sempre me cativa e incentiva.

Aos professores doutores que dedicaram o tempo construindo conhecimento na pós-graduação Rennan Araújo, Elisângela Passos, Marcelo Alexandre, Ricardo Freire e Luciane Romão, Alberto Wisniewski e Lisiane Freitas. E principalmente, professor Dr. Haroldo Dórea pela simpatia e sorriso fácil sempre.

Aos colegas de pós-graduação Débora, Marcos, Hugo, Paloma e Tamires que foram importantes no convívio quanto às discussões e opiniões nos diversos trabalhos que apresentamos. E em especial, Michel que foi formidável quanto a minha adaptação na UFS e sempre disposto em ajudar! Obrigada!!

Aos colegas do LCP Luís Fabrício, Érica, Luana, Jandyson, Fernanda, Vitória foi muito bom e fácil conviver com vocês. Tornaram essa tarefa menos árdua. Não tenham dúvidas.

As colegas Nicaellen, Vanessa e Cibelle sem vocês o mestrado não teria sido tão humorado e produtivo. Vocês são imprescindíveis!!

Ao amigo Dr. Wilson Aragão pela apresentação aos pesquisadores da Embrapa. Aos pesquisadores da Embrapa Dra. Joana, Dra. Viviane e Dr. Frederico pela disposição e sugestões ao trabalho.

Aos funcionários, Carina (secretária) e Fábio (bibliotecário) pela competência e generosidade.

Aos meus pais Antonio e Marta pelo incentivo. Meu adorável primo Thiago que sempre está do meu lado. Não há distância que nos separam.

E por fim, Cristina, pela convivência, paciência e amor incondicional.

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VI

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. VIII

LISTA DE TABELAS ................................................................................................ X

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS ............................................................... XI

RESUMO............................................................................................................... XIII

ABSTRACT ........................................................................................................... XIV

1 INTRODUÇÃO. .................................................................................................... 15

2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 17

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 17

2.2 Objetivo Específico ............................................................................................ 17

3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 18

3.1 Importância da cultura do coqueiro ................................................................... 18

3.2 Coco - Características morfológicas e fisiológicas.......... .......... .......... ............21

3.2.1 Principais pragas em coqueiros .................................................................... 29

3.3 Pesticidas .......................................................................................................... 33

3.3.1 Posicionamento de pesticidas nas plantas ..................................................... 35

3.4 Pesticidas selecionados para o estudo ............................................................. 36

3.5 Técnicas de extração para determinação de pesticidas .................................... 39

3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência........................................................... 42

3.7 Trabalhos relacionados à extração de pesticidas em coco ............................... 43

4. PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................... 46

4.1 Material.............................................................................................................. 46

4.2 Padrões Analíticos e reagentes químicos ......................................................... 46

4.3 Equipamentos ................................................................................................... 46

4.4 Limpeza de vidraria ........................................................................................... 46

4.5 Preparo da solução padrão dos pesticidas para análise ................................... 47

4.6 Preparação do estipe ........................................................................................ 47

4.6.1 Fortificação das amostras e procedimento de extração por MSPD ......... 48

4.7 Condições cromatográficas de análise .............................................................. 48

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 50

5.1 Escolha dos pesticidas ...................................................................................... 50

5.2 Otimização das condições cromatográficas ...................................................... 50

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VII

5.3 Otimização das condições de extração ............................................................. 59

5.3.1 Ensaios para otimização das condições de extração de pesticida na matriz

estipe ....................................................................................................................... 59

5.4 Validação do método MSPD para o estipe por HPLC-DAD .............................. 65

5.4.1 Linearidade ..................................................................................................... 65

5.4.2 Seletividade .................................................................................................... 68

5.4.3 Exatidão e Precisão........................................................................................ 69

5.4.4 Limite de detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) ................................ 71

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 73

7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO ....................................................................... 74

8 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 75

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VIII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Coqueiro variedade Anão.................................................................. 19

Figura 2: Coqueiro variedade Gigante.............................................................. 19

Figura 3: Híbrido de Coqueiro Gigante e Anão................................................. 19

Figura 4: Representação esquemática do caule e raiz em monocotiledônea... 22

Figura 5: Secção transversal da parte basal do estipe do coqueiro................. 24

Figura 6: Corte transversal do estipe em três zonas......................................... 26

Figura 7: Esquema representando a densidade do estipe............................... 26

Figura 8: Estipe com resinose........................................................................... 31

Figura 9: Estipe com resinose e sob do Broca-do-olho.................................... 31

Figura 10: Representação das etapas do procedimento MSPD....................... 44

Figura 11: Esquema da estrutura da fase estacionária da coluna.................... 52

Figura 12: Cromatogramas referentes aos pesticidas analisados em três proporções de solventes (acetonitrila: água) na modalidade isocrática obtido por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1 ...............................................

53

Figura 13: Perfil cromatográfico do carbofurano............................................... 54

Figura 14: Perfil cromatográfico do carbofurano............................................... 54

Figura 15: Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina................................................. 55

Figura 16: Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina................................................. 55

Figura 17: Perfil cromatográfico do difenoconazol............................................ 56

Figura 18: Perfil cromatográfico do difenoconazol............................................ 56

Figura 19: Perfil cromatográfico do espirodiclofeno.......................................... 57

Figura 20: Perfil cromatográfico do espirodiclofeno.......................................... 57

Figura 21: Perfil cromatográfico do tiofanato metílico.......................................

58

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IX

Figura 22: Perfil cromatográfico do tiofanato metílico....................................... 58

Figura 23: Perfil cromatográfico obtido por HPLC-DAD referentes aos pesticidas selecionados em solvente acetonitrila:água (65:35 v/v)...................

59

Figura 24: Cromatogramas referentes à eficiência dos adsorventes homogeneizados com o estipe e eluídos em DCM por HPLC-DAD....................................................................................................................

60

Figura 25: Cromatogramas referentes aos pesticidas eluídos em ciclohexano-acetona (80:20 v/v) e analisados por HPLC-DAD....................................................................................................................

61 Figura 26: Avaliação dos diferentes volumes e utilização de coluna auxiliar na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).................................................................................................................

62

Figura 27: Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).........................................................................

63

Figura 28: Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 0,05 µg g-1).......................................................................

64 Figura 29: Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD.........................................................................................................

68

Figura 30: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD avaliando a seletividade........................................................................................................

70

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X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características entre as variedades anã, híbrida e gigante.............. 20

Tabela 2. Principais pragas e doenças em coqueiros....................................... 32

Tabela 3. Características gerais dos pesticidas selecionados para este estudo.................................................................................................................

37

Tabela 4. Propriedades físico-química dos pesticidas selecionados................ 38

Tabela 5. Pesticida e seus produtos de transformação..................................... 39

Tabela 6. Determinação de pesticidas na matriz de coco................................

43

Tabela 7. Diluição dos solventes utilizados na solubilização dos pesticidas..... Tabela 8. Programação da fase móvel no modo gradiente do HPLC-DAD......

47

50

Tabela 9. Fases estacionárias na otimização das condições de análise.......... 51

Tabela 10. Otimização para a extração de pesticida em estipe........................ 63 Tabela 11. Dados da equação da reta, linearidade, intervalo de concentração do método MSPD desenvolvido.........................................................................

66 Tabela 12. Eficiência da recuperação (n=3) e desvio padrão relativo (RSD%) em três níveis de concentrações dos pesticidas estudados em estipe.............

70 Tabela 13. Eficiência da precisão da metodologia intra-dias no nível de fortificação de 0,5 (µg g-1) dos pesticidas estudados em estipe........................

71 Tabela 14. Limite de detecção e quantificação dos pesticidas usando a técnica de extração MSPD e HPLC-DAD..........................................................

72

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XI

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

C18 – Fase sólida à base de sílica modificada com gupos octildecil

C8 – Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil

CV – Coeficiente de variação

DCM – Diclorometano

EMBRAPA/CPATC – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Tabuleiros

Costeiros

FAO – Organização das Nações Unidas de Agricultura e Alimentos

GC-ECD (Gas chromatograph with an electron-capture detector) – Cromatografia

a gás com detector de captura de elétrons.

GC-MS/SIM (Gas chromatograph-mass spectrometry with selected ion monitoring)

– Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas com íon monitorado

GC-TSD – Cromatografia a gás com detector termoiônico seletivo (Gas

chromatograph with thermionic sensitive detection)

HPLC-DAD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detector com arranjo de

diodos (High performance liquid chromatograph with diode array detector)

HPLC-UV – Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta

(High performance liquid chromatograph with an ultraviolet detector)

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Renováveis

IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (Internation Union of

Pure and Applied Chemistry)

Kow – Coeficiente de partição octanol:água

LD – Limite de detecção

LLE – Extração líquido-líquido (Liquid–Liquid Extraction)

LMR – Limite máximo de resíduos

LPME – Microextração fase líquida (Liquid-Phase Microextraction)

LQ – Limite de quantificação

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XII

MSPD – Dispersão de matriz em fase sólida (Matrix Solid Phase Dispersion)

P. D – Ponto de degradação

PARA - Programa Nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em

Alimentos

pKa – Constante de dissociação

PLE – Extração com líquido pressurizado (Pressurized Liquid Extraction)

RP-HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (reversed-

phase high-performance liquid chromatography)

RSD – Desvio padrão relativo

SBSE – Extração por agitação com barra de sorção (Stir Bar Sorptive Extraction)

SEM - Microscopia Eletrônica de Varredura (Scanning Electron Microscopy)

SINDAG - Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola

SPE – Extração em fase sólida (Solid Phase Exctration)

SPME - Microextração em fase sólida (Solid-Phase Microextraction)

UV-Vis – Ultravioleta visível

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XIII

RESUMO

A cultura do coqueiro está sujeita ao ataque de pragas e doenças causando

prejuízos aos produtores. Em função disso, a aplicação de pesticidas é ainda uma

das práticas mais utilizadas para o controle destas pragas. No entanto, não existem

trabalhos que comprovam a eficácia para este tipo de controle. Desta forma, este

trabalho propõe o desenvolvimento de metodologia utilizando a técnica de

dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) e cromatografia líquida de alta

eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD), para o estudo dos

pesticidas (carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato

metílico) aplicados no estipe que podem contaminar o fruto, o principal produto

consumido do coqueiro. A metodologia desenvolvida para o estipe por MSPD

utilizou Florisil® como adsorvente e 40 mL de ciclohexano:acetona na proporção

(80:20, v/v) como solvente de eluição. Para os níveis de concentração de 0,05; 0,5;

1,0 e 2,0 µg g-1, os valores médios de recuperação variaram na faixa de 57,5 a

114,3% e os coeficientes de variação de 1,2 a 19,2%. A linearidade variou de

0,9974 a 0,9996 considerando a faixa de 0,04 a 20 µg mL-1. E os valores de limites

de detecção e quantificação variaram entre 0,02 a 0,5 µg g-1. Assim, a metodologia

é eficiente para o estudo de pesticidas aplicados no estipe.

Palavras-chave: pesticidas; estipe; MSPD; Cocos nucifera L; HPLC-DAD.

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XIV

ABSTRACT

The coconut is subject to attack by pests and diseases causing losses to

producers. As a result, the application of pesticides is still one of the most

commonly used practices to control these pests. However, there are studies

that demonstrate the efficacy of this type of control. Therefore, this paper

proposes the development of methodology using the dispersion technique of

matrix solid phase (MSPD) and high performance liquid chromatography with

diode array detector (HPLC-DAD) for the study of pesticides (carbofuran, β-

cyfluthrin, difenoconazole, spirodiclofen and thiophanate methyl) applied in the

stem that can contaminate the fruit, the principal product of coconuts

consumed. The methodology developed by the stem MSPD used as Florisil®

adsorbent and 40 mL of cyclohexane: acetone in a proportion (80:20, v/v) as

eluting solvent. For concentrations of 0.05, 0.5, 1.0 and 2.0 µg g-1, the mean

recovery in a range from 57.5 to 114.3% and the coefficient of variation of a 2 to

19.2%. Linearity ranged from 0.9974 to 0.9996 considering the range 0.04 to 20

µg mL-1. And the threshold values for detection and quantification ranged from

0.02 to 0.5 µg g-1. Thus, the method is efficient for the study of pesticide applied

to the stem.

Keywords: pesticides; stem; MSPD; Cocos nucifera L; HPLC-DAD

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1. INTRODUÇÃO

O coqueiro (Cocos Nucifera L.) é uma das principais frutíferas tropicais

cultivadas no mundo. De origem asiática, é cultivada em mais de 80 países. No

Brasil, a cocoicultura se concentra na região Nordeste, sendo a faixa litorânea

representante de quase toda a produção, pois apresenta condições climáticas

favoráveis ao desenvolvimento dessa palmácea. Além disso, é uma importante

fonte de renda e de alimento para a população, já que tudo é aproveitado: raízes,

folhas, estipe, inflorescência, seiva, palmito e principalmente, o fruto. Destaca-se

a produção de água-de-coco, leite de coco, fibras e coco ralado (SANTOS et al,

2003; VALE et al., 2004). A produção de cocos é liderada pela Bahia, seguida de

Sergipe e Ceará. Em 2009, Sergipe teve uma área de 42.000 hectares, com uma

produção de mais de 270.000 mil frutos, e uma produtividade de 6,64 mil

frutos/hectare (MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).

Em condições ideais agroecológicos, o coqueiro tipo gigante pode atingir

uma vida útil de aproximadamente 60 a 80 anos com uma produção de 60 a 80

frutos/pé/ano. Em todas as fases de desenvolvimento dos órgãos vitais dessa

planta (folhas, flores, fruto e estipe) podem ocorrer abortamento, atraso no

desenvolvimento, queda prematura, retardo na reprodução e baixa

produtividade/produção, em decorrência da ação de diferentes pragas, que se

não controladas podem levar a planta à morte (FERREIRA, 2009). Dentre elas

destacam-se a broco-do-estipe, traça das flores, lagarta-das-folhas, e doenças

como a resinose e o anel vermelho. Para manter sua rentabilidade elevada os

produtores que empregam práticas convencionais em seus coqueiros se utilizam

de um grande número de defensivos químicos no combate a essas pragas

(FERREIRA, 2002).

Os pesticidas podem permanecer na superfície das plantas após a

aplicação ou mesmo serem absorvidos ou translocados para tecidos distantes do

local da deposição (REIS & BRESOLIN, 2007). O consumo excessivo de

pesticidas gera preocupações com relação aos impactos ao meio ambiente e à

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saúde humana (ZELIGER, 2011). Para a cultura do coqueiro, a Agência de

Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece normas para garantir a qualidade dos

produtos, seus componentes e afins, tendo em vista, a saúde do consumidor

(COSTA, 2002). Adicionalmente Ferreira (2009), afirma que não há a fiscalização

no controle do uso apropriado de pesticidas na cocoicultura. Grandes partes

destas aplicações de pesticidas são feitos no estipe e não há estudos sobre a

eficiência deste emprego.

Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e

validação de um procedimento analítico utilizando MSPD e HPLC-DAD para a

determinação de resíduos de pesticidas em estipe. Logo, os parâmetros de

extração, como adsorvente e solvente de eluição foram testados a fim de

melhorar a recuperação e sensibilidade para os cinco pesticidas analisados. Os

resultados foram obtidos através da otimização que incluem escolha do

adsorvente, eluição do solvente, volume de eluição do solvente e proporção do

adsorvente e amostra.

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2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Desenvolver e validar uma metodologia para a determinação de resíduos

de pesticidas no estipe, utilizando as técnicas de dispersão de matriz em fase

sólida (MSPD) e cromatografia líquida com detector espectrofotométrico com

arranjo de diodos (HPLC-DAD).

2.2 - Objetivos Específicos

� Selecionar os pesticidas utilizados para o controle de pragas do

coqueiro;

� Obter as condições otimizadas de análise dos pesticidas

selecionados pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com

detector espectrofotométrico com arranjo de diodos (HPLC-DAD);

� Desenvolver metodologia analítica para determinação de resíduos

de pesticidas em amostras de estipe por MSPD;

� Validar a metodologia analítica.

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3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 – Importância da cultura do coqueiro

O coqueiro propagou-se na zona intertropical do globo terrestre e sua

origem ainda não é conhecida. No Brasil, dados históricos evidenciam que a

introdução do coqueiro gigante no Brasil foi efetuada pela colonização portuguesa

em 1553. Foram matrizes procedentes da Ilha de Cabo Verde, e distribuídas no

litoral baiano, daí a denominação de coco-da-baía. O coqueiro, variedade anã, foi

introduzido no Brasil por Artur Neiva e Miguel Calmon, quando regressavam em

1921, de uma viagem ao oriente. Noticiam ainda que em 1925, o coqueiro anão

foi introduzido no Brasil, com as primeiras mudas desembarcadas no Rio de

Janeiro. Já outros autores afirmam que a origem do coqueiro anão é

desconhecida. Estudos apontam que seu crescimento e precocidade decorrem de

uma mutação da variedade gigante, e que provavelmente surgiu pela primeira vez

em Java ou Sumatra, na Oceania (CABOIM NETO, 2002; RIBEIRO, 2009;

SIQUEIRA et al, 2002). No século XIX, com a chegada dos europeus no Pacífico,

o óleo do coco foi o primeiro óleo vegetal a ser comercializado no mundo (CHAN

& ELEVITCH, 2006).

O coqueiro é uma planta da divisão Espermatófita, classe Angiosperma,

sub-classe Monocotiledônea, de ordem Principes (Arecales), família Palmae, tribo

Cocoidae, gênero Cocos e espécie Cocos nucifera L. É uma planta arbórea com

copa densa e elegante, altura em torno de 25 m (variedade gigante). A planta é

monóica (órgãos masculinos e femininos na mesma planta). Com tufo de folhas

(30-35) bem verdes na extremidade, caule indiviso chamado estipe ou espique e

raiz fasciculada. Folha constituída de pecíolo curto e por vários pseudo-folíolos,

com 1-2 anos de vida e 6 m de comprimento. Inflorescência axilar em forma de

cacho com flores femininas globosas. O fruto é uma drupa com parte dura

(endocarpo), camada fibrosa (mesocarpo) e casca lisa (epiderme). Na sua parte

interna encontra-se a “água-de-coco e a amêndoa. O fruto também é conhecido

como noz-semente e semente. As variedades de coqueiro são anão –

representado por tipos com frutos verdes, vermelhos e amarelos, tem

autofecundação e frutos destinados ao consumo de água-de-coco; gigante –

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também chamado de típico, é predominante, tem altura, polinização cruzada, fruto

verde, cocos destinados à industrialização; e o híbrido – proveniente do

cruzamento natural ou artificial entre gigante e anão (SIQUEIRA et al., 2002;

SEAGRI, 2010; ARAGÃO, W., 2002; LOIOLA et al., 2008; SANTOS et al., 2003).

As Figuras 1, 2 e 3 apresentam os coqueiros mais destinados ao plantio, a

variedade Anão e variedade Gigante e Híbrido.

Figura 1 – Coqueiro variedade Anão Figura 2 – Coqueiro variedade Gigante Fonte:(Martins & Jesus Júnior, 2011) Fonte: (Martins & Jesus Júnior, 2011)

Figura 3 – Híbrido de Coqueiro Gigante e Anão

Fonte: (Martins & Jesus Júnior, 2011).

A Tabela 1 apresenta as principais características botânicas existentes

entres as variedades Anão, Gigante e Híbrido.

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Tabela 1 - Características entre as variedades anã, híbrida e gigante

Característica Anã Híbrida Gigante

Início Floração (anos) 2 a 3 3 a 4 5 a 7 Vida Útil (anos) 30 a 40 50 a 60 60 a 80 Tamanho do Fruto Pequeno Intermediário/Grande Grande Crescimento Lento Intermediário Rápido Altura (m) 8 a 10 20 35 Produção (fruto/ano) 130 a 150 120 a 150 60 a 80 Peso Fruto (g) 900 1200 1400 Peso Noz (g) 550 800 700

Peso Albúmen (g) 250 400 350 Exigência Edafoclimática

Muito Exigente Exigente Rústico

Destino Produção Água Agroindústria/ Culinária/Água

Agroindústria/ Culinária

Fonte: ARAGÃO et al., (2002)

Para o cultivo da palmácea, o coqueiro necessidade de certas exigências

climáticas, como (a) Temperatura, aproximadamente 27°C, demandando um clima

quente, sem grandes variações de temperatura para o melhor crescimento e

produção. (b) Umidade relativa superior a 60%. (c) Distribuição das chuvas é o

fator que mais importantes no desenvolvimento do coqueiro. (d) Planta altamente

exigente em luz. (e) Ventos fracos e moderados beneficiam o desenvolvimento do

coqueiro por aumentarem sua transpiração, e logo, a absorção de nutrientes e

água pelas raízes (FONTES et al., 2002).

O coqueiro é classificado como uma das plantas oleaginosas mais

importantes do mundo (LORENZI, 2002). Dentre os produtos de maior importância

comercial temos: polpa, fibra, óleo e água-de-coco (COSTA et al., 2005). Nota-se

que a exploração comercial do coqueiro tem crescido nos últimos anos, e em

concordância, há a evolução tecnológica e o avanço de técnicas de cultivo

adequadas possibilitaram em agroecossistemas frágeis, melhores condições de

trabalho aos pequenos produtores em diversas regiões do mundo. Haja vista que,

essas explorações restringem cerca de 90 países, devido às condições ideais

como solos arenosos, umidade adequada, boa precipitação e radiação solar

(MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).

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A estrutura botânica do coco é constituída por um fruto do coqueiro, seco

simples, classificado como drupa. Quando completamente desenvolvido apresenta

exocarpo ou epicarpo, mesocarpo, endocarpo, tegumento e albume. A água-de-

coco é conhecida como endosperma líquido, preenchendo toda parte interna do

fruto, com função de nutrir a nova planta quando germinada (FERREIRA NETO,

2005; GOMES & PRADO, 2007).

3.2 – Características morfológicas e fisiológicas

Após a germinação da semente, o coqueiro passará pelo novo estágio de

vida. O desenvolvimento do embrião se inicia com o processo de diferenciação dos

tecidos e definem suas formas e funções que os tornam resistente e nutritiva

(REIS, 2004). Os tecidos vegetais se originam dos meristemas que é o tecido que

origina novas células de qualquer tipo de célula especializada do corpo vegetal. Já

no início do desenvolvimento vegetal podem ser observados o meristema apical

caulinar (caule) e meristema apical radicular (raiz). Os tecidos vegetais formam três

importantes sistemas de tecido: (a) sistema de revestimento (epiderme, proteção);

(b) sistema vascular (condução de seiva, xilema e floema); (c) sistema fundamental

(sustentação, preenchimento, fotossíntese). O sistema vascular é envolvido pelo

sistema fundamental e o sistema dérmico reveste a planta. (GLÓRIA &

GUERREIRO, 2006).

(a) Sistema de revestimento: É a epiderme, e está em contato com o

ambiente, sujeita a modificações estruturais, impedindo a ação dos choques

mecânicos e a invasão de patógenos, restringindo a perda de água. Realiza trocas

gasosas, absorve água e sais minerais, protege contra a ação da radiação solar

(ALQUINI et al., 2006).

(b) Sistema vascular: Os feixes vasculares liberolenhosos são

distribuídos desordenadamente. São tecidos contínuos de todos os órgãos das

plantas vasculares responsáveis pelo: (1) xilema, transporte de água e solutos à

longa distância, armazenamento de nutrientes e suporte mecânico, formado

principalmente por elementos condutores, fibras e células parenquimáticas

(COSTA et al., 2006). (2) Floema é responsável pela condução de materiais

inorgânicos e orgânicas, como água, carboidratos na forma de sacarose,

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substâncias nitrogenada como aminoácidos e amidas, lipídios, ácidos orgânicos,

ácidos nucléicos, substâncias reguladoras de crescimento, vitaminas e íons

inorgânicos (MACHADO & GUERREIRO, 2006).

(c) Sistema fundamental: São representados pelos tecidos celulares

como: (1) parênquima que pode desempenhar atividades essenciais na planta

como fotossíntese, reserva, transporte, secreção e excreção. Suas células

compõem celulose, hemicelulose e substâncias pécticas e distingue em três

subdivisões: preenchimento, clorofiliano e de reserva. (2) Colênquima, possibilita o

crescimento de órgão ou do tecido e função de sustentação até atingir a

maturidade. É constituído por celulose, água (60% do peso) e substância pécticas.

(3) Esclerênquima é um tecido de sustentação presente nas camadas mais

internas e periféricas dos órgãos primários e secundários da planta. Pode funcionar

como camada protetora ao redor do caule, sementes e frutos imaturos evitando

que insetos e animais se alimentem. Na parte secundária é composta por celulose,

substâncias pécticas, hemicelulose e aproximadamente 35% de lignina (SCATENA

& DIAS, 2006). A Figura 4 apresenta um esquema das partes do estipe e raiz em

monocotiledôneas.

Figura 4 – Representação esquemática do caule e raiz em monocotiledônea. No caule, o floema (1) e o xilema (2) estão juntos formando feixes; na raiz, estão alternados formando cordões. Nas

monocotiledôneas, o caule possui os feixes vasculares desorganizados; a raiz apresenta medula (3). O periciclo (4) delimita externamente o cilindro vascular.

Fonte: (GLÓRIA & GUERREIRO, 2006).

Estipe, espique ou estípite é o caule ou tronco de diferentes espécies de

palmeiras que apresenta variadas formas, tamanhos, volumes e texturas,

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terminando em um meristema apical, onde ocorre o ponto de crescimento da

planta, que é responsável pelo surgimento das folhas. Diferente das árvores, o

estipe não engrossa com o passar do tempo, pois a maioria dessas espécies

alcança o diâmetro máximo antes que comece a crescer em altura. Os anéis

externos são cicatrizes provenientes do desprendimento das bainhas e permitem

calcular sua idade. A textura e forma do estipe define a característica marcante da

família (SODRÉ, 2005).

O estipe é tropicamente adaptado para sobreviver e resistir à ação de ventos

fortes que o flexiona ao invés de quebrar. Sua estrutura tubular resultante da

densidade de seu córtex e intercaladas fibras vasculares, formando uma espessa

barreira exterior em torno do núcleo que sofre uma compressão sem fraturar

quando o vento os flexiona. Além das propriedades vitais de conduzir seiva e sais

minerais para a planta, o estipe maduro torna-se uma madeira valiosa utilizada na

construção e no fabrico de materiais ornamentais (NAIR, 2010).

A característica primordial anatômica do estipe é a estrutura cônica lenhosa

consistindo numerosos feixes vasculares dispersos dentro do tecido. O diâmetro

dos feixes vasculares diminui a partir da base para o topo e para as partes

periféricas. A densidade dos feixes vasculares aumenta do núcleo para a periferia e

da base para a parte superior. A área dos feixes vasculares e da fibra são maiores

nas partes externas que nas partes internas no cilindro central. O número de

camadas da parede secundária nas fibras das células do tronco é menor que nas

fibras das células das posições correspondentes do núcleo do tronco estreito. E

neste processo de crescimento que é formado a célula do xilema em unidades e o

floema para fora. As fibras possuem o longo ciclo de vida da palmeira, tendo a

capacidade de produzir novas camadas de células da parede adicionais

secundárias à medida que o coqueiro amadurece. Esta é a explicação para a

rigidez e densidade do estipe. O padrão do espessamento lateral em

monocotiledôneas não é compreendido devido à grande variação dentro da sub-

classe (KUO-HUANG et al., 2004). Uma característica importante do coqueiro é o

comprimento do estipe, pois apresenta variabilidade genética em trabalhos de

melhoramento genético (LOILA et al., 2008).

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As fibras são encontradas nas formas de feixes em diferentes partes do

corpo primário da planta e tem como função principal sustentar as partes do

vegetal que não se alongam mais e podem fazer parte do xilema ou do floema.

Assim, podem armazenar amido, óleos, resinas e cristais, suprindo período de

eventuais estresses (SCATENA & DIAS, 2006). A Figura 5 apresenta uma secção

transversal da parte basal do estipe do coqueiro, destacando a densidade, os

feixes vasculares, a parte externa e interna do estipe e fibras das paredes

secundárias em camadas no córtex e a orientação dos feixes vasculares.

Figura 5. (a) Parte de secção transversal do estipe de coqueiro Cocos nucifera L.. (a) A densidade dos feixes vasculares aumentou significativamente a partir do núcleo para a periferia. (b) Os feixes

vasculares no córtex, (c) feixes vasculares na parte externa central do estipe, e (d) feixes vasculares na parte interna central do estipe. (e) Secção transversal de células de fibra por SEM (Scanning

Electron Microscopy) Microscopia Eletrônica de Varredura que mostram uma parede secundária em camadas das fibras no córtex. (f) Secção transversal das células da fibra por SEM (Microscopia

Eletrônica de Varredura) mostrando através dos pontos 3 e 4 camadas das paredes secundárias das fibras na parte exterior central do estipe. Escala = 0,3 mm (b, c, d), 6 mM (e), e 10 uM (F). (h)

Parte de uma prancha diametral radial do estipe mostrando a orientação de feixes vasculares. Fonte: Kuo-Huang et al. (2004).

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A Figura 6 mostra um corte transversal no estipe indicando três distintas

zonas. A Figura 7 ilustra um corte de uma secção transversal e ao longo da altura

da haste que o estipe é classificado sua densidade entre leve e pesada devido à

sua heterogeneidade.

Figura 6. Corte transversal em três zonas: Figura 7. Esquema representando a densidade (D) dérmica; (S)sub-cutânea e (C) zona central. do estipe. A: (baixa densidade); B: média Fonte: Oduor & Githiomi (2010) densidade e C: alta densidade. Fonte: Oduor & Githiomi (2010)

As propriedades físicas do estipe estão ligadas à umidade, densidade e

contração. A umidade está relacionada com o aumento da altura do caule e diminui

a partir do núcleo para o córtex. A densidade está vinculada ao peso e a contração

à estabilidade do teor de umidade do ponto de saturação da fibra do estipe

(ARANCON JUNIOR, 1997).

O estipe é um material de densidade heterogênea, e sua variabilidade

estrutural e química pode dificultar a extração de extrativos por solventes, devido

principalmente a sua permeabilidade e densidade. Além disso, sua complexidade

quanto à composição química podem dificultar a purificação e caracterização de

seus constituintes. Os principais elementos químicos existentes na composição

química do caule são: carbono, oxigênio, hidrogênio e o nitrogênio. Por sua vez, as

principais substâncias macromoleculares constituintes da parede celular são:

polioses (hemiceluloses), celuloses, extrativos e lignina (KLOCK et al., 2005). O

quadro esquemático abaixo apresenta a composição química da madeira:

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Fonte adaptada: (KLOCK et al.,2005).

A composição química do estipe do coqueiro é caracterizada por pentosanas

(22,9%), lignina (25,1%) e holocelulose (66,7%) (ARANCON JUNIOR, 1997). Já

para KHALIL et al., (2006) a composição química é distribuída nos seguintes

valores porcentuais: holocelulose (56,3%); �-celulose (44,2%), cinzas (2,2%),

lignina (32,8%) e extrativos (6,4%) (KHALIL et al., 2006). Os extrativos da madeira

são formados por compostos químicos que representam apenas uma pequena

parte da madeira. Pode ser removido por solventes ou ácidos as substâncias:

aromáticas, alifáticas, nitrogenadas, glicosídeos, terpenos, esteroides e

carboidratos entre outros. Porém, são fatores importantes para as propriedades

físicas das madeiras (KLOCK et al., 2005; SEBIO-PUÑAL et al., 2012).

A holocelulose é um dos componentes majoritários no estipe. É formado

pela soma de carboidratos presentes na fibra compostas por hemicelulose e

celulose. É constituída pela fração total de polissacarídeo de biomassas em

extratos livres. (RABEMANOLONTSOA & SAKA, 2012). Segundo Klock et al.,

(2005), holocelulose é o termo indicado para produto obtido depois da remoção da

lignina da madeira. Para Sebio-Puñal et al., (2012), a holocelulose é a combinação

de hemicelulose (misturas de polissacarídeos ou polioses) e celulose (polímero

glucano). A hemicelulose e lignina são amorfas, enquanto a celulose é altamente

cristalina. Conforme Tomczak et al., (2007), as fibras celulósicas possuem níveis

de orientação em que as moléculas se encaixam muito próximas, chamadas de

regiões cristalinas e são pontos que um solvente apresenta dificuldade de

Madeira

Matéria

Orgânica

Matéria Inorgânica Polissacarídeos Lignina

Celulose Polioses Cinzas Extrativos

Substâncias

macromoleculares

Substância de baixa

massa molecular

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penetração. Em contraste, em regiões amorfas são suscetível à penetração de

solvente.

Segundo Atkins & Jones (2006), o que mantêm as árvores de pé são as

fortes interações intermoleculares constituídas por ligações de hidrogênio

existentes entre as moléculas de celulose, em forma de fita. Caso isso não

ocorresse, as árvores cairiam. Para Tomczak et al., (2007), a celulose é composta

apenas de glicose, enquanto as hemicelulose são composta por açúcares que

formam várias estruturas poliméricas, podendo ligar a porção de lignina ou

celulose. As polioses são divididas em hexosanas e pentosanas. Adicionalmente

Marabezi (2009), as polioses são unidades de açúcares. Os polímeros formados

pela condensação de pentoses formam as pentosanas, que não apresenta

composto químico definido, mas uma classe de compostos poliméricos com

componentes contendo propriedades características. Segundo Scatena & Dias

(2006), a lignina fornece um revestimento estável, é inerte e evita os ataques

biológicos, químicos e físicos, formada pela polimerização de vários álcoois, como

o sinaptil, coniferil e p-coumaril. Conforme Klock et al., (2005), as ligninas são a

fração não-carboidrato da madeira livre de extrativos, difíceis de caracterizar e

extremamente complexas.

As propriedades dos materiais celulósicos são determinados pelo grau de

polimerização da celulose. Portanto, celuloses com cadeias longas são

denominadas de �-celulose. Celulose com graus de polimerização menores é

denominado de β-celulose, seguido pela hemicelulose (TOMCZAK et al., 2007).

Para Klock et al. (2005), �-celulose é um termo dado por Cross e Bevan em 1912

para a celulose da madeira que é insolúvel numa solução concentrada de NaOH.

O sistema radicular do coqueiro é fasciculado, e surge da base do seu

tronco. Possui raízes primárias (mais grossas) que são responsáveis pela

capacidade de absorção de nutrientes e água, e principalmente, a função de

fixação da planta no solo. As raízes secundárias partem das primárias, de onde

originam as terciárias e destas as radicelas, medindo de 1 a 3 mm de diâmetro e

são as principais raízes de absorção do coqueiro (MIRANDA et al., 2003). As folhas

formam a coroa da palmeira e são aspectos importantes, pois influencia a forma e

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o comportamento da coroa em diferentes fases da vida da palmeira. A folhagem

quando surge, também chamada de fronde, emerge verticalmente a partir do único

ponto de crescimento e quando compactada em conjunto há a falta de clorofila que

se transforma à medida que se as folhas se desdobram em ângulos de arranjo em

torno do eixe da haste (NAIR, 2010).

O produto mais comercializado do coqueiro é a fruto e tudo pode ser

aproveitado, principalmente a água-de-coco. É formada como uma estratégia

ecofisiológica do coqueiro, pois, em períodos de eventuais estresses ambientais, o

coqueiro armazena substâncias nutritivas para serem utilizadas como mecanismo

de sobrevivência da espécie na nutrição do embrião durante a germinação das

sementes ou da plântula (ARAGÃO et al., 2005).

A água-de-coco é um líquido rico em nutrientes, solução ligeiramente ácida,

contendo sais, proteínas, gorduras neutras, açúcares e vitaminas, além de ter

substâncias promotoras do crescimento (fitormônios) e algum fosfolipídeo (MA et

al., 2008; DEBMANDAL & MANDAL, 2011). É caracterizada por ser uma solução

estéril, contendo mais de 90% de água. A composição dos aminoácidos da água-

de-coco é semelhante à do leite. Em países que apresentam déficit nutricional

elevado, a água-de-coco é empregada para substituir proteínas, vitaminas e

minerais (CARVALHO et al., 2006; SILVA et al., 2006), utilizada como solução de

hidratação oral consumida diariamente como suplemento protéico. Em outras

situações, foi empregada como soro fisiológico através de uma reidratação por via

intravenosa e reposição eletrolítica (VIGLIAR et al., 2006).

Há pouco tempo, o consumo de água-de-coco era associado ao lazer e às

férias nas praias do litoral nordestino. Ultimamente, a esses conceitos foram

associados outros valores, como: saúde, vida saudável e atividade física (SILVA,

2008). Estudos compararam a composição química da água-de-coco aos chás,

refrigerantes com e sem gás, bebidas isotônicas e solução de reidratação oral. A

água-de-coco compete no mercado de bebidas isotônicas e de refrigerantes

(VIGLIAR, 2006).

Associado a essa ideia de consumo contribuíram também com a

descentralização do cultivo, processamento industrial, exportações e pelas

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alternativas disponíveis no mercado. Para o consumo da água-de-coco, é

necessária a extração do líquido localizado no interior do fruto. As opções de

consumo podem ser classificadas em dois grandes grupos: (a) “in natura” – a água-

de-coco é consumida diretamente no fruto e (b) envasado – a água-de-coco é

processada industrialmente e acondicionada em embalagem (SILVA, 2008). O

consumo de água-de-coco tem aumentado de forma expressiva, cerca de 500

milhões de litros, sendo que 7% são exportados. A grande dificuldade de

exportadores e envasadores é quanto à estocagem, o que implicou estudos

tecnológicos de engenharia e controle no processo quanto à qualidade (ABREU &

FARIA, 2007).

Na medicina, os pacientes desidratados ou os atletas com exaustão física

fazem uso da água-de-coco para reposição de potássio. Na Biotecnologia é usada

na conservação de sêmen de caprino, ovino, suíno e aves, na indução de

diferenciação de células entre outras aplicações (ARAGÃO et al., 2005). Ainda, há

o uso em outras áreas como a nutrição, que juntos totalizam de 100 a 350 milhões

de litros por ano, com taxa de crescimento anual de aproximadamente de 20%

(MARTINS & JESUS JÚNIOR, 2011).

3.2.1 – Principais pragas em coqueiros

No Brasil, a produtividade média do coqueiro é consequência de vários

fatores, como o plantio de variedades adequadas, distribuição regular de chuvas, o

manejo da cultura, e, também, ocorrência de pragas e doenças (GASPAROTTO et

al, 2005). O controle recomendado para a doença sugere a retirada das áreas

lecionadas do estipe, seguida de tratamento com o pesticida e a cobertura da área

tratada é realizada com alcatrão vegetal ou piche (FERREIRA et al., 2010).

Uma das doenças que afeta a produtividade do coqueiro é denominada

resinose, causada pelo fungo, o fitopatógeno Thielaviopsis paradoxa, cujo

anamorfo do ascomiceto é Ceratocystis paradoxa (De Seynes) Moreau. No Brasil,

em 2004 foi registrada a ocorrência deste fungo e a manifestação da doença tem

se disseminado aumentando o número de coqueiros infectados e de focos nas

propriedades a cada ano. No Brasil, pela observação da sintomatologia confirmada

pela exsudação da seiva que escorre pelo estipe do coqueiro, essa doença foi

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chamada de resinose. Em outros países esta doença é denominada “stem

bleedind”, que significa “sangramento do caule” (HARRISON & JONES, 2003). As

plantas doentes apresentam exsudação de seiva no estipe e encurtamento das

folhas novas. Através da dissecação do tecido vegetal foram examinadas lesões

necróticas nas raízes e a presença de lesões amarronzadas na região interna do

tronco e analisado no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Tabuleiros

Costeiros. Plantas sadias, quando inoculadas, tiveram desenvolvimento de lesões,

demonstrando a patogenicidade do fungo isolado (WARWICK et al., 2004;

WARWICK & PASSOS, 2009).

A partir de 2004, a produção brasileira de coco passa por dificuldades devido

à ocorrência da resinose no estipe, cuja ação está causando sérios prejuízos aos

produtores. O fungo envolvido com a resinose atua no bloqueio dos vasos

condutores de seiva, podendo sobreviver por longos períodos no solo e nos restos

de culturas em decomposição, causando infecção de ferimentos e das fissuras

naturais de crescimento do tronco. Atribui-se à ocorrência da resinose à fragilidade

da planta após fatores estressantes, tais como: severas chuvas seguidas de

estresse hídrico, desequilíbrio nutricional, excesso de salinidade, e ao oportunismo

devido à ocorrência de outras doenças ou pragas que enfraquecem as plantas e

permitem a ação do fungo. Os principais sintomas da doença é o aparecimento de

uma exsudação de um líquido marrom-avermelhado que escorre através de

rachaduras no tronco (ponto de infecção do patógeno), que com o tempo exposto

ao ar, pode secar o líquido da coloração avermelhado passando a escurecer. Além

do crescimento foliar reduzido, diminuição na produção e em alguns casos, após

quatros meses, à morte das plantas infectadas (CARVALHO et al., 2011; NELSON,

2005).

No Platô de Neópolis, (Neópolis-SE), mais de 79% dos coqueirais são

formados pelo coqueiro anão-verde. Por se tratar de um material genético mais

homogêneo, tem demonstrado maior suscetibilidade às doenças em geral

(FONTES & WANDERLEY, 2006). Não existem relatos de produtos químicos

capazes de curar a resinose em plantas com sintomas avançados da doença ou

evitar sua dispersão na planta. Portanto, recomenda-se atualmente a erradicação

mecânica e, a queima para a destruição das plantas severamente infestadas,

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retirando o máximo de raízes, evitando a propagação da doença, principalmente

pelo vetor da doença, o inseto broco-do-olho (Rhynchophorus palmarum) (PARRA

et al., 2003). A broca-do-olho é hospedeiro natural nas palmeiras (Arecaceae), pois

é sua fonte de alimento e realiza seu ciclo de vida (FENWICK, 1962). As figuras 8

e 9 apresentam o estipe infectado com resinose e a infestação de outra praga,

Broca-do-olho.

Figura 8 – Estipe com resinose Figura 9 – Estipe com resinose e o Broca-do-olho do coqueiro. Fonte: Ferreira et al., (2007) Fonte: Ferreira et al., (2007)

Segundo Griffith (1968) (1987), na área da coroa do estipe os adultos são

frequentemente localizados e as fêmeas fazem perfurações na porção mais macia

para ovipositar e se alimentar. Já foi comprovado que a broca-do-olho está

envolvida na dispersão de outra doença letal ao coqueiro, denominada “anel-

vermelho” (GERBER & GIBLIN-DAVIS, 1990; MORALES & CHINCHILLA, 1990).

Em plantas que apresentam esses sintomas são frequentemente encontrados

outros coleópteros, como Xyleborus spp., Rhinostomus barbirostris e

Parisoschoenus obesulus, e carecem ser pesquisados em relação à

transmissibilidade do patógeno. As áreas de produção de cocoicultura de Sergipe,

Bahia e Paraíba estão severamente infectadas por T. Paradoxa e apresentam uma

alta infestação de R. Barbirostris. Isso indica uma possível interação praga x

patógeno quanto à propagação da doença (FERREIRA et al., 2007).

Com a implantação do projeto de fruticultura irrigada, a cultura do coco anão

foi fixada numa área de 7,5 m² em Platô de Neópolis, situado no Baixo São

Francisco em Sergipe. Em 2005, foram contabilizados 30.310 plantas, das quais

25.811 está em produção e 4.499 não produzem frutos, com 2.930,270 frutos/ano.

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Após, o ataque do patógeno T. paradoxa a produção caiu para 2.794,790

frutos/ano, uma perda considerável de 4% (CINTRA et al., 2009; MEDEIROS,

2010).

Os surtos de pragas em coqueiros em coqueiros são favorecidas por

múltiplos fatores, tais como: (a) emissão contínua e mensal de inflorescências que

dão origem aos cachos dos frutos; (b) produção contínua e mensal de folhas e a

permanência prolongada dessas estruturas vegetais na planta; (c) e o não

sincronismo das emissões florais dentro da plantação, o que torna o coqueiro

bastante suscetível à ação de diversas espécies-pragas. Associados a esses

fatores os surtos são também favorecidos pela utilização indiscriminada de um

grande número de pesticidas no combate as pragas (FERREIRA & MICHEREFF

FILHO, 2002). As principais pragas e doenças que atacam a cultura do coqueiro

estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Principais pragas e doenças em coqueiros

Pragas Nome científico Broca-do-olho-do-coqueiro ou bicudo Rhynchophorus palmarum Linnaeus Broca-do-estipe, broca-do-tronco rhina Rhinostomusbarbirostris Fabricius Broca-do-pecíolo ou broca-da-ráquis foliar

Amerrhinus ynca Sahlberg

Broca-da-coroa-foliar; broca-do-dendezeiro

Eupalamides daedalus Cramer

Lagarta-das-folhas Brassolis sophorae Linnaeus Barata-do-coqueiro ou falsa-barata-do-coqueiro

Coraliomela brunnea Thumberg

Traça das flores e frutos novos Hyalospila ptychis Dyar Gorgulho-das-flores-e-dos-cocos-novos Parisoschoenus obesulus Casey

Ácaro-da-necrose-do-coqueiro Aceria guerreronis Keifer Ácaro da mancha-anelar do coqueiro Amrineus cocofolius Flechtmann

Pragas secundárias

Cochonilha transparente Aspidiotus destructor Signoret Pulgão-preto-do-coqueiro Cerataphis lataniae Boisduval Raspador-do-folíolo Delocrania cossyphoides Guérin

Broca-do-bulbo Strategus aloeus Linnaeus

Doenças

Resinose Anel vermelho Rhadinaphelenchus cocophilus Helmintosporiose Drechslera incurvata Murcha de Fitomonas Protozoário Phitomonas sp. Lixa Sphaerodothis acrocomiae – Lixa grande

Phyllachora torrendiella – Lixa pequena Queima das folhas Botryosphaeria cocogena

Fonte: Ferreira & Michereff Filho (2002); Costa et al., (2005).

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Em todas as fases de desenvolvimento dos órgãos vitais do coqueiro, como

folhas, flores, fruto e estipe, podem ocorrer abortamento, atraso no

desenvolvimento, queda prematura, retardo na reprodução, baixa

produtividade/produção, sofrendo várias ações de diferentes espécies-pragas, que

se não tratadas levam à morte da planta (FERREIRA, 2009). Somam-se 37 países

que desenvolvem Pesquisa e Desenvolvimento (P&D) para o aprimoramento,

proteção e avanços nos processos tecnológicos da espécie, contendo instituições

governamentais, não-governamentais e sem fins lucrativos. No Brasil, destaca-se a

Embrapa Tabuleiros Costeiros (CPATC) em Aracaju/SE como referência e líder no

desenvolvimento para a cadeia produtiva do coqueiro (NAIR, 2010).

3.3 – Pesticidas

Segundo o Código Internacional de Conduta na Distribuição e Uso de

Pesticidas da FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2006):

“Pesticidas, qualquer substância ou mistura de substâncias destinadas a prevenir, destruir ou controlar qualquer praga, incluindo vetores de doença humana ou animal, as espécies não desejadas de plantas ou animais que causam danos durante ou interferindo com a produção, processamento, armazenamento, transporte ou comercialização de alimentar, produtos agrícolas, madeira e produtos de madeira ou alimentos para animais, ou substâncias que podem ser administrados a animais para controlo de insetos, aracnídeos ou outras pragas em ou sobre os seus corpos. O termo inclui substâncias destinadas para uso como um regulador de crescimento da planta, desfolhantes dessecante, ou o agente para o desbaste de frutos ou prevenir a queda prematura de frutos, e as substâncias aplicadas a culturas, quer antes ou depois da colheita para proteger o produto de degradação durante o armazenamento e transporte.”

“Resíduos significam quaisquer substâncias mencionadas ou em produtos alimentares, produtos agrícolas ou ração animal resultante da utilização de um pesticida. O termo inclui quaisquer derivados de um pesticida, tais como produtos de conversão, metabólitos, produtos de reação e impurezas considerados de importância toxicológica. O "resíduo de pesticidas" termo inclui resíduos de fontes desconhecidas ou inevitável (por exemplo, ambientais), bem como utilizações conhecidas da substância química.”

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Estes compostos podem ser classificados conforme o uso, modo de ação e

estrutura química (WARE & WHITACRE, 2004), indicando a sua eficiência no

controle de doenças e pragas que atacam as culturas agrícolas. Seu

comportamento é orientado por processos de transformação, retenção e transporte

(PESSOA et al., 2004).

O uso de pesticidas tem como meta o controle de doenças e pragas que

preocupam em decorrência dos impactos no meio ambiente e na saúde humana

(DEHGHANI et al., 2012). Desta forma, existem vários métodos de pulverizar o

pesticida, tais como: (a) Pulverizador costal (MOZAFFARI et al., 2010) (b) Trator

com pulverizador hidráulico (YASIN, 2012), (c) Avião pulverizador (WANG et al.,

2012). Com a eficiência dos métodos de pulverização, estudos são realizados para

a eficiência do tamanho, concentração de princípio ativo, que é a parte biológica

ativa do pesticida e, quantidade de gotas a serem pulverizadas (BRETTHAUER et

al., 2011). Essas pulverizações quando aplicados em grande quantidade, em áreas

bastante extensas, são dispersos e podem ter persistência no meio ambiente

(WANG et al., 2012). Os impactos ambientais trazem a contaminação do ar, a

percolação de resíduos de pesticidas nos lençois freáticos e aquíferos e confere

uma questão de saúde pública e interferência na cadeira alimentar (FOO &

HAMEED, 2010). Além de apresentar efeitos adversos de curto e longo prazo

sobre os trabalhadores agrícolas que fazem a exposição por contato dérmico,

ingestão e inalação de pesticidas (LESMES-FABIAN et al., 2012).

Os pesticidas químicos são compostos ativos e em concentração elevada

possuem toxicidade para espécies-alvo. Desta forma, os pesticidas incluem o

emprego químico: inseticidas, fungicidas, rodenticidas, conservantes de madeira,

herbicidas. É comum a exposição humana em níveis elevados de pesticida nos

ambientes profissionais e como resíduos em alimentos. Essa exposição pode

resultar efeitos agudos e tardios, incluindo: doença de Parkinson, leucemia,

linfomas e câncer no estômago, sarcomas de tecidos moles e do cérebro

(BOLOGNESI & MERLO, 2011). Para o domínio da exposição da saúde humana

frente aos resíduos de pesticidas presentes em alimentos, foi criada a agência com

programa monitoramento de resíduos que estabelecem os limites máximos de

resíduos (LMR) de pesticidas em alimentos. No Brasil, destaca-se a Agência

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Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que é responsável pelo Programa

Nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA)

(ANVISA, 2011; TIRADO et al., 2010). Conforme o Sindicato Nacional da Indústria

de Produtos para Defesa Agrícola (SINDAG) (2010), para que um defensivo seja

utilizado pelo agricultor é necessário que seja registrado. É um rigoroso processo,

envolvendo a aprovação pelos Ministérios da Agricultura, da Saúde (ANVISA) e do

Meio Ambiente (IBAMA).

A população tem se preocupado com a contaminação ambiental, exigindo

alimentos isentos de resíduos de pesticidas. O mercado vem oferecendo produtos

agrícolas com selo de produto orgânico que significa, sem o uso de pesticidas, ou

produzidos em sistemas em que os pesticidas foram utilizados corretamente

(FERREIRA, 2009). O Brasil carece de informações sobre intoxicações por

pesticidas, devido à ingestão acidental ou intencional e o uso seguro de pesticidas

durantes atividades ocupacionais (CALDAS, 2011). A falta de fiscalização, o

contrabando/falsificação e o comércio ilegal de pesticidas preocupam vários

segmentos da população brasileira. Produtores atraídos por economia adquirem

produtos genéricos oriundos de países como a China, Índia, tendo o Paraguai

como porta de entrada na América do Sul (DORFMAN & REKOWSKY, 2011).

Segundo o SINDAG (2010), o desenvolvimento de um novo pesticida, inicia-

se com 200.000 moléculas e um investimento de US$ 300 milhões. Para que um

novo pesticida seja lançado no mercado são necessários aproximadamente 12

anos de pesquisa, envolvendo as áreas de Química, Biologia, Agronomia,

Toxicologia e Meio Ambiente. De acordo com Bolognesi & Merlo (2011), antes da

comercialização, os pesticidas são regulamentados conforme suas propriedades de

comportamento físico-químicas, ecotoxicológicas, toxicológicas e são avaliados o

destino por agências internacionais e governamentais, de forma a certificar as

normas de segurança.

3.3.1 – Posicionamento de pesticidas nas plantas

Os pesticidas podem ser classificados com relação ao seu posicionamento

na planta. São considerados, como: (a) tópicos, imóveis ou não sistêmicos, os

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pesticidas que não são absorvidos ou translocados, permanecendo na superfície

da planta onde foram depositados. (b) Mesostêmicos são pesticidas que

apresentam afinidade com a superfície foliar podendo ser absorvidos e formar um

depósito na superfície do órgão suscetível. (c) Loco-sistêmicos, de profundidade ou

translaminares são pesticidas translocados a distâncias pequenas a partir do ponto

de deposição. (d) Sistêmicos ou móveis são pesticidas que são absorvidos e

translocados pelo sistema condutor da planta via xilema e/ou floema. Estes têm a

habilidade de serem redistribuídos dentro dos órgãos a serem tratados (REIS &

BRESOLIN, 2007).

3.4 – Pesticidas selecionados para o estudo

A seleção dos pesticidas para este trabalho foi feita em consonância com os

pesquisadores da Empresa Brasileira de Agricultura e Pecuária (EMBRAPA) -

Tabuleiros Costeiros, Aracaju-SE. Esta instituição trabalha com a cocoicultura e

está diretamente associada à pesquisa desta matriz e com produtores,

apresentando vários trabalhos no combate a pragas e doenças, que tem emprego

intensivo no cultivo de coco no Estado de Sergipe.

A Tabela 3 relaciona os pesticidas selecionados para este estudo,

apresentando uma classificação de acordo com o grupo químico, posicionamento

em planta, toxicidade, e limite máximo de resíduos (LMRs) para a cultura do

coqueiro, fórmula química e estrutura molecular dos pesticidas. As caracteristícas

gerais das propriedades fisico-químicas dos pesticidas selecionados relacionados

ao meio ambiente são apresentados na Tabela 4.

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Tabela 3. Características gerais dos pesticidas selecionados para este estudo Pesticida Emprego/

Grupo Químico Posicionamento

em plantas Toxici-dade1

LMR2

(µg g-1) Estrutura Química Fórmula

Química Absorção máxima UV-

Vis³ (L mol-1

cm-1

)

Carbofurano Inseticida, nematicida/ Carbamato

Sistêmico I -

O CH3

CH3

OCONHCH3

C12H15NO3 - Solução neutra: 276nm, 290 nm. - Solução básica e ácida: Não significa diferença no espectro.

β-Ciflutrina Inseticida/ Piretróide

Não sistêmico II -

C22H18Cl2FNO3 Não absorve acima

de 290nm

Difenoconazol Fungicida/ Triazol Sistêmico I 0,1

O

OCH 3

ClO

Cl

CH 2

N

N

N

C19H17Cl2N3O3 - Ácido: 215nm, 235nm, 275nm;

-Neutro: 215nm, 235nm, 275nm;

-Alcalina: 220nm, 235nm, 275nm

Espirodiclofeno Acaricida/ Cetoenol

Não sistêmico III 0,05

Cl

Cl

O

OO

C

O

C

CH3

CH3

CH2CH3

C21H24Cl2O4

- Solução neutra 201nm

- Não absorve 300-

400nm;

Tiofanato metílico Fungicida/ Benzimidazol

Sistêmico III - NHCSNHCO 2CH 3

NHCSNHCO 2CH 3

C12H14N4O4S2 305nm

1Classe toxicológica: I – extremamente tóxico, faixa vermelha; II – altamente tóxico, faixa amarela; III – medianamente tóxico, faixa azul; IV – pouco tóxico, faixa verde. 2Limite Máximo de Resíduos em coco. Fonte: ANVISA (2011); ³IUPAC (2011).

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Tabela 4. Propriedades físico-química dos pesticidas selecionados Pesticida Massa

molecular (g mol-1)

P.D.1 (°C)

V.P.2 (mPa)

Lei Constante de Henry

Pa (m³ mol-1)

Log Kow3

pKa4 (25°C)

Solubilidade em

água (mg L-1)

Solubilidade em solventes orgânicos

20oC (mg L-1)

Carbofurano 221,2

276

8,0x10-2

5,0x10-5

1,8

- 322

N-Heptano – 110 Metanol – 71.700 Acetato de etila – 61.500 Acetona – 105.200

β-Ciflutrina 432,2 210 5,6x10-5 8,10 x 10-3 5,9 - 0,006 Tolueno – 2.000.000 N-Hexano – 10.000 Diclorometano – 200.000

Difenoconazol 406,2 337 3,3x10-5 9,0x10-7 4,36 1,07 15,0 Etanol – 330.000 Acetona – 610.000 Tolueno – 500.000 N-Hexano – 3.400

Espirodiclofeno 411,3

-

3,0x10-4

2,00x10-2

5,83

- 0,05

N-Heptano – 20.000 Acetato de etila – 250.000 Xileno – 250.000 Diclorometano – 250.000

Tiofanato metílico 342,3

165

8,8x10-3

8,1x10-5

1,45

7,28

20

Acetato de etila – 8.400 N-hexano 0,47 Metanol – 7.800 Xileno – 110

1 – Ponto de Degradação; 2 – Vapor de Pressão ; 3 – Log Kow: Logaritmo do coeficiente de partição octanol:água, pH 7 e 20°C (< 2,7 = Baixa bioacumulação; 2,7 – 3 = Moderada; > 3,0 = Alta); 4 – Constante de Dissociação; Constante de Henry: > 100 = Volátil; 0,1 - 100 = Moderamente Volátil; Solubilidade em água: <= 50 = Baixa 50 - 500 = Moderada > 500 = Alta;

Fonte: IUPAC (2011).

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Os pesticidas podem sofrer metabolização realizados em estudos animal,

vegetal e destino ambiental, podendo formar compostos mais tóxicos e mais

persistentes (VIDAL et al., 2009). O β-ciflutrina é uma mistura de quatro

diastereômeros. E o tempo de retenção em HPLC aumenta do diastereômero I a

IV, e suas porcentagens são expressas como soma em (FAO, 1999). A Tabela 5

apresenta os pesticidas selecionados para este trabalho destacados em negrito

que sofrem e os seus produtos de transformação.

Tabela 5. Pesticida e seus produtos de transformação

Pesticida Produto de transformação

Carbofurano 3-hidroxicarbofurano 3-cetocarbofurano 3-hidroxicarbofurano

β-ciflutrina Diastereômeros I (1R,3R,αR + 1S,3S,αS = 1:1; cis) Diastereômeros II (1R,3R,αS + 1S,3S,αR = 1:1; cis) Diastereômeros III (1R,3S,αR + 1S,3R,αS = 1:1; trans) Diastereômeros IV (1R,3S,αR + 1S,3R,αS = 1:1; trans)

Difenoconazol 1,2,4-triazol 2-amino-3-(1,2,4]triazol)-1-il-propionico 1,2,4-trizol-1-il-acético 1,2,4-triazol-1-il-lactico 2-cloro-4-(4-clorofenoxi-)benzoico 2-cloro-4-(4-cloro-fenoxi)-ácido benzoico éster metílico 1 - (2-cloro-4-(4-cloro-fenoxi)-fenil) -2 - (1,2,4-triazol)-1-il-etanona 2-cloro-4-(4-clorofenoxi)-fenil-hidroxiacético hidroxi-difenoconazol

Espirodiclofeno 2,4-dicloro-mandélico éster glucosil-ciclo-hexil 2,4-dicloro-mandélico éster glucosil-ciclo-hexil 2,4-dicloro-mandélico glucósido ácido 2,4-dicloro-mandélico ciclohexilo éster 2,4-diclorobenzóico

Tiofanato-metílico 2-aminobenzimidazol Carbendazim

Fonte: (VIDAL et al, 2009; FAO, 2007).

3.5 - Técnicas de extração para determinação de pesticidas

A extração de pesticidas é uma etapa crítica, pois a seleção da técnica de

extração na etapa de análise de resíduos de pesticidas e seus produtos de

degradação dependem tanto do analito, como da natureza da amostra (GILBERT-

LÓPEZ et al., 2009). Para a análise desses compostos podem ser empregadas

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técnicas de extração envolvendo etapas de amostragem, extração e clean-up

(SANTOS et al., 2012). Porém, recentemente a escolha de técnicas de extração

tem sido efetuada no sentido de diminuir os efeitos de impactos de resíduos

ambientais. Por sua vez, têm-se selecionado métodos que permitem a

miniaturização, a redução de consumo de solvente e adsorvente, eliminando

etapas de limpeza e pré-concentração, bem como, a melhoria na eficiência de

extração e seletividade, diminuindo o tempo e o custo da análise (DAWIDOWICZ &

RADO, 2010).

O procedimento analítico para determinação de resíduos de pesticidas pode

se resumir em três etapas básicas: (a) Amostragem, que deve representar a matriz;

(b) Preparo da amostra, extração dos analitos da matriz e remoção de

interferentes; e (c) Análise instrumental dos analitos (RIDGWAY et al., 2007). Em

alguns casos, o isolamento de analitos pode tornar extremamente difícil para o

analista em caráter de complexidade de algumas matrizes (ORACZ et al., 2011).

Desta forma, existem várias técnicas de extração para análise de pesticidas,

como: extração líquido-líquido (LLE, Liquid–Liquid Extraction), extração com líquido

pressurizado (PLE, Pressurized Liquid Extraction) (LEE et al., 2008), extração por

agitação com barra de sorção (SBSE - Stir Bar Sorptive Extraction) (LI et al., 2012),

microextração fase líquida (LPME, Liquid-Phase Microextraction)

(LAMBROPOULOU & ALBANIS, 2007), extração em fase sólida (SPE, Solid Phase

Exctration) (XANG et al., 2011), microextração em fase sólida (SPME, Solid-Phase

Microextraction) (RIANAWATI & BALASUBRAMANIAN, 2009), e dispersão de

matriz em fase sólida (MSPD - Matrix Solid Phase Dispersion) (QI, 2010).

Desenvolvida em 1989 por Barker e seus colaboradores, a Dispersão de

Matriz em Fase Sólida contribuiu para a extração de analitos de matrizes sólidas ou

semi-sólidas. No procedimento, é utilizado um suporte sólido com várias funções:

(a) abrasivo; (b) adsorvente de compostos da matriz; (c) facilitar o empacotamento

do material homogeneizado na coluna ou cartucho e (d) permitir o fracionamento

da amostra (CAPRIOTTI et al., 2010). As principais vantagens deste método são:

(1) o protocolo analítico é simples e rápido, (2) a formação de emulsão é eliminada,

(3) o consumo de solvente é reduzido, (4) a eficiência da extração do analito é

conduzida quando a amostra é exposta ao solvente. E a principal desvantagem é a

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dificuldade em automatizar a técnica (GILBERT-LÓPEZ et al., 2009). Para

Wilkowska & Biziuk (2011), as vantagens associadas a esta técnica são: análise

relativamente de baixo custo; equipamento simples; pequena quantidade de

solvente de eluição.

A técnica utiliza o adsorvente como um abrasivo através de uma força

mecânica empregada na homogeneização com a ruptura da estrutura da amostra.

E o solvente auxilia na interrupção completa dos analitos na extração (JIN et al.,

2012). Esta técnica é uma tentativa de minimizar a formação de emulsão, e reduzir

a quantidade de solventes, comparativamente às técnicas clássicas como extração

líquido-líquido (LLE), que utiliza maiores quantidades de amostra e solventes

(GAUJAC et al., 2012). As etapas operacionais durante o processo de extração em

MSPD são condicionados por fatores como: estado físico das amostras,

concentração e propriedades dos analitos, interferências da amostra, combinação

adequada de adsorvente e solvente (RUBERT et al., 2011).

MSPD pode ser utilizada como técnica alternativa de extração, remoção de

interferentes e eluição da amostra numa mesma etapa, reduzindo a contaminação

da amostra. Já foi aplicada para o isolamento de uma variedade de analitos, como:

drogas, pesticidas, bifenilas policloradas, surfactantes em diferentes matrizes de

alimentos, amostras ambientais e biológicas (TURIEL & MARTÍN-ESTEBAN,

2010). A Figura 10 representa as principais etapas do procedimento MSPD.

Figura 10 – Representação das etapas do procedimento MSPD Fonte adaptada: (Liu et al., 2011).

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3.6 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Na cromatografia, a amostra é distribuída entre duas fases. Uma fase é

estacionária enquanto a outra fase é móvel. A fase estacionária é um material

sólido poroso de superfície-ativa. Um equipamento de cromatografia líquida é

composto por um reservatório de solvente, linha de transferência com filtro, sistema

de bombeamento, sistema de injeção, coluna, detector e registrador de dados. A

coluna é uma das partes mais importantes, pois é onde se realiza a separação. É

bastante comum utilizar mais de um solvente na fase móvel, sendo necessário um

controlador e um misturador. Para o gerenciamento do sistema, um computador

com um software apropriado pode ser usado para a obtenção dos dados (MEYER,

2004).

Em cromatografia líquida em fase reversa (RP-HPLC), a fase estacionária é

apolar como C8 e C18. Os solventes mais usados são água, metanol ou

acetonitrila (PERES, 2002). Alterando a composição da fase móvel, os coeficientes

de distribuição são afetados, alterando os fatores de retenção dos analitos. Um dos

principais desafios é efetuar a melhor escolha de fase móvel em função dos

compostos a serem separados. É essencial que os solventes não absorvam na

faixa de trabalho do detector UV-Vis, pois pode influenciar a intensidade da

absorção das espécies detectadas (ROUESSAC & ROUESSAC, 2007).

O detector de ultra-violeta (UV) é o detector mais comum em HPLC devido

sua boa seletividade, sensibilidade e faixa linear. Não é destrutivo e pode empregar

em sistema de análise em modo gradiente. Opera numa faixa de 190 a 350 nm e

na faixa do visível (Vis) 350 a 700 nm, recebendo o nome de detector UV/Vis

(GILBY, 2007). O detector de arranjo de diodos (DAD, Diode Array Detector) é um

detector espectrofotométrico, e apresenta como ferramenta alto desempenho na

determinação e identificação de compostos, uma vez que detêm a aquisição on-line

de varredura dos espectros UV simultaneamente. Esta é a grande vantagem de um

sistema de detecção com DAD em relação ao UV/Vis, que limita a análise em um

único comprimento de onda. Desta forma, é possível escolher o espectro com a

melhor separação e identificação do analito pelo seu tempo de retenção e máxima

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absorbância (YU et al., 2012). Além da possibilidade de obter a pureza dos picos e

de sobreposição de cromatogramas (COLLINS et al., 2006).

3.7 – Trabalhos relacionados à extração de pesticida em coco

Não existem relatos na literatura de métodos para extração de pesticida em

estipe ou outro tipo de caule. Porém, existem alguns trabalhos na literatura que

descrevem métodos para determinação de resíduos de pesticidas em derivados do

coco, e estão apresentados na Tabela 6.

Tabela 6. Determinação de pesticidas na matriz de coco

Técnica de Extração

Técnica Instrumental

Matriz Fase Sólida/

Extração

Fase Sólida/ Separação

Pesticida LMRs1

(mg kg-1) Referência

SPE

HPLC-UV

Água-de-coco

C18

Sílica gel esférica com C18

Captana 0,02

Brito et al., (2002)

Clorotalonil 0,01

Carbendazim 0,1

Lufenuron -

Diafentiuron -

LLE GC – TSD

GC-ECD

-

ZB-1701 (14%

cianopropil-fenil 86% dimetilpolisiloxano)

Endossulfan 0,05

Captana 0,02

Tetradifona -

Triclorfon -

DB-5 (5% fenil 95%

dimetilpolisiloxano)

Malationa -

Paration metílico 0,02

Monocrotofós -

SPE HPLC-UV Água-de-

coco

C18 C18

Carbofurano - Ogawa et al.,

(2006) 3-Hidroxicarbofurano -

MSPD GC-MS,SIM

Polpa de coco

(Albumen sólido)

C18 e Florisil®

como coluna auxiliar

DB-5ms (5%fenil:95% polidimetilsiloxano)

Dimetoato 0,02

Silva et al., (2008)

Malationa -

Lufenuron -

Carbofurano -

3-Hidroxicarbofurano -

Tiabendazol 0,05

Difenoconazol -

Triclorfon -

MSPD HPLC-UV Água-de-

coco liofilizada

C18 C18 com um grupo

fenila

Lufenuron -

Santos et al., (2012)4 Bifentrina 0,05

Teflubenzuron

-

1. LMR – Limite máximo de resíduos em coco. Fonte: IUPAC (2011).

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Brito et al., (2002), utilizaram dois métodos de extração, SPE e LLE, e três

técnicas instrumentais, HPLC-UV, GC–TSD e GC-ECD para determinar 12

pesticidas em água-de-coco. No primeiro procedimento foi utilizado um cartucho de

SPE contendo fase estacionária C18 e metanol como solvente de eluição para os

pesticidas: captana, carbendazim, clorotalonil, lufenuron e diafentiuron. A técnica

instrumental utilizada foi o HPLC usando um detector UV em 254 nm, empregando

metanol e água como fase móvel na proporção (70:30, v/v) num fluxo de 0,7 mL

min-1, com uma coluna RP18 conectada à coluna de guarda com a mesma fase,

numa corrida de 38 min. As amostras foram fortificadas em diferentes níveis de

concentração que variaram entre 0,5-12,0 mg kg-1. As recuperações variaram entre

70-105% e o desvio padrão relativo (RSD%), 6,9-11.0%. Para a segunda técnica

de extração (LLE) foi utilizada 10 mL de hexano-diclorometano (1:1 v/v) e 2 g de

cloreto de sódio, adicionados a 10 mL de água-de-coco, extraídos durante 15 min

num agitador mecânico. O extrato concentrado foi dissolvido em acetado de etila e

uma alíquota de 1 mL analisou 7 pesticidas (endosulfan, captana, tetradifona,

triclorfon, malationa, parationa metílico e monocrotofós em GC-ECD e CG-TSD. As

amostras fortificadas variaram em níveis de concentração de 0,01-2,0 mg kg-1. As

recuperações variaram 71-109% e o RSD variou 1,4-11,5%. A precisão e exatidão

para os dois métodos foram consideradas adequadas para a validação do método,

assim como, o método apresentou boa linearidade e coeficiente de correlação foi

satisfatório para os pesticidas.

Ogawa et al., (2006), desenvolveram um método para determinar 3-

hidroxicarbofurano e carbofurano em água-de-coco. Foi utilizado o procedimento

de extração SPE contendo C18 e acetonitrila como solvente de eluição. A análise

instrumental foi HPLC-UV em 275 nm, numa corrida de 25 min, usando

água:acetonitrila em modo gradiente, com um fluxo de 1,0 mL min-1. As amostras

foram fortificadas em diferentes níveis de concentração (0,01-2,5 mg mL-1). As

recuperações variaram de 81 a 95% e RSD variou entre 1,6-12,5%. Os limite de

detecção variaram de 0,008-0,01 mg mL-1.

Silva et al., (2008), desenvolveram uma metodologia para a polpa-do-coco

(albúmen sólido) para 8 pesticidas (dimetoato, malationa, lufenuro, carbofurano, 3-

hidroxicarbofurano, tiabendazol, difenoconazol, triclorfon). Foi empregado a técnica

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45

de dispersão de matriz em fase sólida (MSPD) usando C18 como adsorvente e

Florisil® co-coluna e acetonitrila com n-hexano como solvente de eluição. As

condições cromatográficas foram seguidas por GC/MS (SIM) numa corrida de 50

min. O método foi validado usando diferentes níveis de concentração (0,25-1,0 mg

kg-1). As recuperações variaram entre 70,1-98,7%, com exceção o lufenuron e

difenoconazol que variaram respectivamente, 47,2% e 48,2%. O desvio padrão

relativo variou entre 2,7-14,7%. Os limites de detecção variaram 0,02-0,17 mg kg-1

e os limites de quantificação variou entre 0,15-0,25 mg kg-1.

Santos et al., (2012) desenvolveram um método para a água-de-coco

liofilizada, usando como técnica de extração (MSPD) para 3 pesticidas

(teflubenzuron, lufenuron e bifentrila), empregando 0,5 g de amostra, 2,5 g de C18

como adsorvente dispersante e 20 mL de acetonitrila como solvente para eluição.

O método validado utilizando 3 níveis de concentração (0,25; 0,5 e 1,0 mg kg-1). As

recuperações variaram entre 74-116% e o RSD variou 0,4-9,4%. Os limites de

detecção variaram 0,04-0,05 mg kg-1 e o limite de quantificação foi de 0,1 mg kg-1.

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46

4 – PARTE EXPERIMENTAL 4.1 – Material

Béquer (100 mL), balão volumétrico (1; 5; 10 e 25 mL), proveta (10 a 25 mL),

vial (1;5;10 e 50 mL), balão de fundo redondo (50 mL), seringa de polietileno (20

mL), papel filtro quantitativo filtração média, (Merck, Alemanha), membrana filtrante

nylon-66, 0,45 µm (Varian, Walnut Creck, CA, EUA), micropipetas de volumes 100-

1000 µL (Boeco Pipette), lã de vidro, vidro de relógio, bastão de vidro, espátula,

pinça, cadinho, pistilo, seringa de vidro, pipeta Pasteur e filtro de seringa (0,45 µm

– nylon).

4.2 – Padrões Analíticos e reagentes químicos

Acetonitrila, diclorometano, acetona e ciclohexano grau HPLC foram

adquiridos da Tedia (Fairfield, OH, EUA); Florisil® (100–200 Mesh; J.T.Baker,

Phillipsburg, NJ, USA), alumina neutra (Macherey-Nagel, Alemanha); C18 (Agilent

Technologies, USA) e Sílica (70-230 Mesh; Silica Flash® G60, (Silicycle, Quebec,

Canadá). Padrões certificados com pureza superior a 95%.

4.3 – Equipamentos

Balança analítica (Sartorius TE214S), evaporador rotatório (Fisatom 802D),

sistema para SPE Vacuum Manifold (Varian, Walnut Creck, CA, EUA),

cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com

arranjo de fotodiodos modelo Prominence (Shimadzu, Quioto, Japão), Milli-Q SP

Reagent Water System (Millipore, Bedford, MA, EUA), MA – 80 Macro moinho de

rotor vertical com facas móveis e fixas, tipo Wiley (Marconi, Piracicaba, SP,

Brasil).

4.4 – Limpeza da vidraria

A limpeza das vidrarias utilizadas no procedimento de extração e na

preparação das soluções padrão consistiu em deixar de molho em detergente

Extran 10% por 24 horas. Depois foi enxaguada em água corrente para retirar o

excesso de detergente e foram novamente enxaguadas com água destilada e

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47

secas em estufa. Em seguida, as vidrarias foram tampadas com papel alumínio e

guardadas em armário.

4.5 – Preparo das soluções padrão dos pesticidas para análise

Inicialmente, preparou-se as soluções estoques a partir da dissolução de

quantidade do padrão certificado de cada pesticida em acetonitrila ou metanol em

concentração acima de 100 µg mL-1 e, posteriormente, foram armazenadas em

freezer a -17°C. A partir das soluções padrões estoque foram preparadas as

soluções intermediárias em acetonitrila, resultando em concentrações de 10 µg mL-

1 e alíquotas de cada solução intermediária foram diluídas em acetonitrila. Os

pesticidas diluídos em diclorometano foram secos em um leve fluxo de nitrogênio e

o resíduo retomado em 1 mL de acetonitrila. A Tabela 7 apresenta a diluição dos

solventes utilizados na solubilização dos pesticidas.

Tabela 7. Diluição dos solventes utilizados na solubilização dos pesticidas

Pesticida Solvente de Diluição

Carbofurano Metanol β-Ciflutrina Diclorometano

Difenoconazol Metanol Espirodiclofeno Diclorometano

Tiofanato metílico Metanol

4.6 – Coleta e Preparação das amostras

As amostras foram provenientes da EMBRAPA – Tabuleiros Costeiros

(Aracaju/SE) em coqueiros sem sintomas de pragas e doenças. A amostra de

estipe foram obtidas a partir de uma incisão superficial em forma de “V”, feita

com o auxílio de um facão, na altura de 1 metro do solo. Em seguida, foram

misturadas, até obter uma quantidade de 400 g, e encaminhadas ao laboratório

e secar ao ar livre. A amostra foi triturada utilizando um moinho de facas de aço

inoxidável, tipo Wiley e peneirada. Após a homogeneização foi armazenada em

frasco de vidro com tampa rosqueável de polietileno, e utilizada no período de

abril de 2011 a maio de 2012.

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48

4.6.1 – Fortificação das Amostras e Procedimento de extração por MSPD

Nos ensaios de recuperação foi realizada com 2,0 g de estipe e fortificada na

concentração de 0,05 µg g-1, considerando a possibilidade de que a matriz nesta

concentração de fortificação não seja homogênea e levaria problemas na

recuperação. Para o procedimento de extração para as concentrações de 0,5; 1,0 e

2,0 µg g-1 foram utilizados 0,5 g de estipe. As amostras foram fortificadas com 500

µL da solução dos pesticidas e repousaram por 30 min. Esse tempo foi necessário

para a evaporação total do solvente e fixação dos pesticidas no estipe. As análises

foram feitas em quintuplicata para cada nível de fortificação.

Foram pesados 2,0 g de estipe e homogeneizados com 1,6 g de Florisil®, e

proporcionalmente para as demais concentrações (0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1) foram

pesados 0,5 g de estipe e homogeneizados com 0,4 g de Florisil® durante 2 min. A

coluna de MSPD utilizada foi uma seringa de polietileno de 20 mL, que foi

empacotada com lã de vidro, que serviu como base de sustentação. O

homogeneizado foi transferido para coluna, e colocado outra superfície de lã de

vidro. A eluição foi realizada sob vácuo com 40 mL de ciclohexano-acetona (4:1v/v)

para os ensaios de concentração de 0,05 µg g-1 e 20 mL de ciclohexano-acetona

(4:1v/v) para as demais concentrações. O eluato foi concentrado em 2 mL num

evaporador rotatório (100 rpm, 55 ºC), e seco em fluxo de nitrogênio. O resíduo foi

retomado em acetonitrila e levado ao ultrassom para a homogeneização por

aproximadamente 30 s. O extrato foi filtrado e uma alíquota de 20 µL foi analisada

por HPLC-DAD.

4.7 – Condições Cromatográficas de Análise

As condições cromatográficas foram otimizadas em um cromatógrafo líquido

modelo Prominence da marca Shimadzu (Quioto, Japão) constituído pelos

seguintes módulos: desgaseificador (modelo DGU-20A3), detector UV-Visível com

arranjo de fotodiodos (modelo SPD-M20A), sistema binário de bombeamento

(modelo LC-20AT), injetor automático (modelo SIL-20A) e um módulo de

comunicação (CBM-20A), utilizando uma coluna analítica Synergi 4 µ RP-80A (250

x 4,60 mm) com as características polar, conectada a uma coluna de guarda (4

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49

µm/4x3,0 mm) com mesmas características, marca Phenomenex (Torrance, CA,

EUA) e software de gerenciamento LCSolution.

A fase móvel foi composta por eluição isocrática acetonitrila:água (65:35,

v/v). O volume de injeção foi de 20 µL (extrato) e temperatura de análise foi

ambiente, o fluxo de injeção foi de 0,8 mL min-1 e comprimento de onda

selecionado para o monitoramento dos pesticidas foi de 200 nm.

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50

5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

A metodologia para a extração de pesticidas foi desenvolvida utilizando a

técnica de dispersão de matriz em fase sólida considerando o estado físico sólido

da matriz. O procedimento consistiu em homogeneizar a matriz com o adsorvente,

transferindo-o para uma coluna de polietileno e eluindo os resíduos com solvente

apropriado. O eluato das extrações foi analisado em HPLC-DAD.

5.1 – Escolha dos pesticidas

O critério para a seleção dos pesticidas foi a pesquisa de campo realizada

pelos pesquisadores da Embrapa que foram informados pelos agricultores da

utilização destes pesticidas (carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol,

espirodiclofeno e tiofanato metílico) na cultura do coqueiro.

5.2 – Otimização das condições cromatográficas

Foram realizados testes com as soluções padrão individuais dos pesticidas,

as quais foram analisadas no HPLC-DAD para a avaliação da resposta dos

pesticidas, a fim de avaliar os tempos de retenção dos analitos, e a adequação da

fase estacionária e fase móvel.

As soluções dos padrões individuais dos pesticidas foram testadas em

diferentes fases estacionárias, considerando eluição em modo gradiente descrita

na Tabela 8. Foram utilizados os solventes acetonitrila e água.

Tabela 8. Programação da fase móvel no modo gradiente do HPLC-DAD

Tempo (min) Acetonitrila (%) 0,01 90

5 90 15 85 25 80 30 75 32 70 34 60 36 70 40 80 45 85 50 90 60 90

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51

O propósito inicial da programação da fase móvel em modo gradiente foi um

teste inicial para obtenção do processo de otimização. Essa etapa da otimização

tem como objetivo obter informações com relação a: (a) comportamento e resposta

de cada pesticida frente ao sistema cromatográfico, (b) obtenção do tempo de

retenção para viabilizar a análise simultânea dos pesticidas e (c) obtenção de pico

simétrico para cada analito. A Tabela 9 corresponde às fases estacionárias

testadas neste trabalho.

Tabela 9. Fases estacionárias na otimização das condições de análise Coluna Marca Tamanho da

partícula/Dimensão da coluna

Luna C18(2) 100A Phenomenex 3 µm /100x3,00 mm

Synergi – RP-80A Coluna de Guarda Polar-RP

Phenomenex 4 µm/250x4,6 mm 4 µm/4x3,0 mm

Microsorb-MV 100-5/C18 Varian 5 µm/250x4,6 mm Microsorb-MV 100-5/C8 Varian 5 µm/250x4,6 mm

A partícula empregada como fase estacionária possui grande área

superficial. O tamanho da partícula está relacionado com a velocidade de

transferência entre as fases móvel e estacionária, resultando na eficiência de fluxos

e velocidades. As dimensões da coluna são dadas pelo comprimento e o diâmetro

interno. Atualmente, com o desenvolvimento de colunas eficientes há uma

tendência de diminuição do tamanho da partícula, menor comprimento e diminuição

do diâmetro interno da coluna caracterizando melhor economia na fase móvel, uma

vez que os fluxos ideais diminuem e queda de pressão na coluna (LANÇAS, 2009).

A coluna selecionada foi a Synergi– RP-80A. Esta coluna possui em sua

estrutura um grupo fenil ligado ao éter em uma cadeia alquila ligada a superfície da

sílica, contendo um recobrimento final de característica polar, sendo adequado

para analisar compostos de caráter polar e aromáticos, como representa a Figura

11.

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52

Figura 11 – Esquema da estrutura da fase estacionária da coluna

Fonte: Catálogo Phenomenex

A coluna Synergi– RP-80A respondeu de forma satisfatória para todos os

pesticidas. A fim de estabelecer uma proporção ideal entre a água e acetonitrila

foram realizados testes na modalidade isocrática. O objetivo foi avaliar a

possibilidade do uso do modo isocrático na análise simultânea dos pesticidas em

um tempo razoável de análise. Para tanto, foram testadas três possibilidades de

mistura acetonitrila e água: (a) 70:30; (b) 65:35 e (c) 60:40 (v/v). Após os testes, foi

constatado que os pesticidas responderam satisfatoriamente a proporção 65:35,

pois em 70:30 houve co-eluição do tiofanato-metílico e carbofurano e em 60:40 não

foi satisfatório. A acetonitrila é um solvente muito usado para desenvolvimento de

métodos de cromatografia de fase reversa, pois não absorve na região de 195 a

220 nm do espectro, apresenta menor viscosidade em relação à água, sendo

miscível (PATTO et al., 2009).

A Figura 12 apresenta os cromatogramas nas três proporções de solvente

(acetonitrila:água) na modalidade isocrática. As Figuras 13 à 22 apresentam os

cromatogramas dos pesticidas, referente a: a) representação individual, b) gráfico

3D, c) pureza do pico e d) perfil do pico em diferentes comprimentos de onda e os

respectivos tempos de retenção.

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53

Proporção modalidade isocrática (v/v)

Cromatogramas

70:30

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min-50

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

mAU254nm,4nm (1.00)

2.59

2/166

4

3.68

4/327

09

3.969

/879

1

5.506

/551

1

7.491

/593

9

8.214

/334

8

8.97

5/391

446

7

18.849

/580

4

20.651/11

637

21.309

/274

783

24.830/96

90

25.425/10

91

29.910

/209

7

30.882/16

051

31.372/69

008

4

32.30

1/249

3

33.366/19

962

94

34.629/49

707

35.157/50

0835

.392

/396

9 35.58

6/85

56

36.300/95

137

37.131/16

702

37.569/59

076

38.232/15

256

38.544

/339

66

39.45

4/116

68

40.036/332

3

40.342/763

8

42.070

/152

9

65:35

7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

mAU200nm4nm (1.00)

5.52

65.80

9

11.270

22.93

7

28.482

29.761

60:40

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

mAU254nm,4nm (1.00)

2.62

2/279

76

2.73

9/97

367

4.62

7/59

544

4.86

5/45

966

6.41

5/39

7174

36.68

9/27

988

7.61

3/240

56

11.815

/199

701

12.445

/866

2412

.747

/521

99

13.419

/100

95

15.467

/276

323

37.458/71

106

0

40.588

/133

58

Figura 12. Cromatogramas referentes aos pesticidas analisados em três proporções de solventes (acetonitrila: água) na modalidade isocrática obtido por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1.

Não foi possível concluir o desenvolvimento e validação do método para o

carbosulfano neste trabalho, pois houve a degradação deste composto.

Co-eluição – Tiofanato metílico e Carbofurano

Tiofanato-metílico

Carbofurano

Espirodiclofeno

Carbosulfano

Β-Ciflutrina

Difenoconazol

Espirodiclofeno

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54

a)

5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

mAU200nm,4nm (1.00)

5.79

5

b) Figura 13 – Perfil cromatográfico do carbofurano a) individual, tempo de retenção: 5,795 min; b) gráfico 3D;

5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 min

-0.025

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100

0.125

0.150

0.175

0.200

0.225

0.250

0.275

0.300

0.325

0.350

0.375

0.400

0.425

0.450

0.475

0.500

0.525

0.550

0.575

0.600

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

mAUPeak

Zero LinePurity Curve

5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 min-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

mAU

225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm

c) d)

Figura 14 - Perfil cromatográfico do carbofurano d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas .

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55

28.5 29.0 29.5 30.0 30.5 31.0 31.5 32.0 32.5 33.0 33.5 34.0 34.5 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

mAU200nm,4nm (1.00)

31.5

99

a)

b)

Figura 15 – Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina a) individual, tempo de retenção: 31,599 min; b) gráfico 3D;

25.25 25.50 25.75 26.00 26.25 26.50 26.75 27.00 27.25 27.50 27.75 28.00 28.25 min-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

50.0

52.5

55.0

57.5

mAUPeak

Zero LinePurity Curve

25.25 25.50 25.75 26.00 26.25 26.50 26.75 27.00 27.25 27.50 27.75 28.00 28.25 min

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

mAU

225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm

c) d)

Figura 16 - Perfil cromatográfico do β-Ciflutrina: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.

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56

10.75 11.00 11.25 11.50 11.75 12.00 12.25 12.50 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225mAU

200nm,4nm (1.00)

11.2

49

a) b)

Figura 17 – Perfil cromatográfico do difenoconazol: a) individual, tempo de retenção: 11,249min; b) gráfico 3D;

10.8 10.9 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 12.0 12.1 min

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

mAUPeak

Zero LinePurity Curve

10.8 10.9 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 12.0 12.1 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

mAU

225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm

c) d)

Figura 18 - Perfil cromatográfico do difenoconazol: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.

Page 57: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · grande beleza e com sua força espiritual, limpará algum dia este mundo de seus ... 63 Figura 28: ... Eficiência da precisão

57

21.50 21.75 22.00 22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 24.00 24.25 24.50min

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

mAU200nm,4nm (1.00)

22.8

00

a) b)

Figura 19 – Perfil cromatográfico do espirodiclofeno: a) individual, tempo de retenção: 22,800 min; b) gráfico 3D;

22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 min

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

mAUPeak

Zero LinePurity Curve

22.25 22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 min

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

mAU

225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm

c) d)

Figura 20 - c) Perfil cromatográfico do espirodiclofeno: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.

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58

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

mAU200nm,4nm (1.00)

5.51

1

a) b)

Figura 21 – Perfil cromatográfico do tiofanato metílico: a) individual, tempo de retenção: 5,511 min; b) gráfico 3D;

5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 min

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

mAUPeak

Zero LinePurity Curve

5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

mAU

225nm220nm215nm210nm205nm200nm195nm190nm

c) d) Figura 22 - Perfil cromatográfico do tiofanato metílico: d) pureza do pico; d) picos em diferentes comprimentos de ondas.

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59

A Figura 23 apresenta o conjunto dos perfis cromatográficos dos pesticidas

selecionados em acetonitrila:água (65:35 v/v).

Figura 23 – Perfil cromatográfico obtido por HPLC-DAD referentes aos pesticidas selecionados em solvente acetonitrila:água (65:35 v/v).

5.3 – Otimização das Condições de Extração 5.3.1 – Ensaios para otimização das condições de extração de pesticida na

matriz estipe

No desenvolvimento da metodologia utilizando a técnica de dispersão da

matriz em fase sólida para determinação de pesticidas em estipe, foram testados

os adsorventes C18, Florisil®, alumina neutra e sílica. Partindo-se de uma

quantidade de 0,5 g de estipe, 0,5 g de adsorvente, o homogeneizado foi eluído

com 20 mL de diclorometano (DCM), que foi o solvente escolhido para o teste

inicial, porque foi utilizado como solvente de diluição do espirodiclofeno e β-

ciflutrina. Na execução do procedimento houve a preocupação em se padronizar a

aplicação de força manual na homogeneização, forma de empacotamento na

coluna de polietileno e vazão na eluição.

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60

De acordo com os resultados apresentados na Figura 24, é possível

verificar que os ensaios realizados foram satisfatórios com Florisil®, pois permite

a extração dos 5 compostos.

Adsorvente Cromatogramas

Florisil®

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5-7.5

-5.0

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

mAU254nm,4nm (1.00)

2.252/11255 2.478/2398

3.052/2773

3.312/3826

4.198/2527

4.973/2178 5.825/76430 6.235/4403

6.614/3995

8.398/2203

9.207/4914

13.219/16412

19.963/7399

24.612/9617

26.087/15463

28.343/26901

30.321/58818

30.837/3738

31.484/18880

33.746/171887

34.425/24690

34.962/17384

37.491/8453

38.235/9728

38.860/3753

39.733/1011

40.679/15236

41.077/1242

41.683/701195

Sílica

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

mAU254nm,4nm (1.00)

2.637/214

542.933/506

0

3.302

/38273.488/2004

3.79

8/42

153.974/2257

4.104/1469 4

.267/1308

5.029/220

8

5.337/10545

7.374/46287

7.69

1/48

59

11.911/24

77

20.168/6207

21.033

/384

7

27.934/4175

30.004/2073

33.200/4238

34.960/6613

36.665

/473

71

37.655/495

42

38.240

/8480

39.194/19418

2

40.260/656

287

41.632/14595

42.053/2639

C18

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

mAU254nm,4nm (1.00)

2.830/17569 2.997/6126

3.232/1367

4.189/2697

4.351/3871

4.632/2140

5.489/5141

7.002/3550

8.139/37799

8.401/69842

9.403/4522

10.424/13323

13.181/18456

24.325/12479

25.902/22941

28.296/11188

29.136/27511

34.055/12667

34.408/9458

35.180/236209

35.622/42500

37.280/1120

37.848/11566

38.570/7942

39.891/131013

40.990/28522

41.488/8694

41.919/3027

42.474/41690

42.718/30565

Alumina

Neutra

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

mAU254nm,4nm (1.00)

2.894/1005 3.

097/5280

3.661/1492

4.469/1057

5.022/1373

5.129/26995.269/1452

5.359/4045

5.925/14096.037/1411

6.261/1429

6.712/5431

8.858/2339

10.353/25166

10.803/54821

14.453/1132

14.651/2864

33.792/8467

34.087/16478

38.629/2144

39.683/2289

40.203/11057

40.655/20333

41.484/94584

42.656/9244

Figura 24. Cromatogramas referentes à eficiência dos adsorventes homogeneizados com o estipe e eluídos em DCM por HPLC-DAD na concentração de 10 µg mL-1

Tiofanato-metílico

Carbofurano

Difenoconazol

Espirodiclofeno β-Ciflutrina

Tiofanato-metílico

Difenoconazol

Espirodiclofeno Carbosulfano

Carbofurano

Difenoconazol B-Ciflutrina

Carbofurano

Difenoconazol

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61

A utilização de Florisil® como adsorvente foi satisfatória e nos testes de

fortificação, foram homogeneizados 0,5 g de estipe e 0,5 g de Florisil®. Nesta

etapa, foram testadas duas possibilidades de solvente (a) DCM e (b)

ciclohexano:acetona (80:20 v/v), considerando um volume de 20 mL para cada

teste de eluição dos pesticidas. Em função dos resultados apresentados na

Figura 25, o ciclohexano-acetona (80:20) foi selecionado como solvente de

eluição, pois eluiu satisfatoriamente os pesticidas. Porém o perfil do extrato

branco apresentou interferentes nos tempos de retenção de todos pesticidas,

diferentemente do DCM que co-eluiu o carbofurano e tiofanato metílico. Além

disso, o DCM não reportou os experimentos, como apresentou os resultados de

ciclohexano:acetona (80:20 v/v).

Extratos Cromatograma

Extrato do

Branco

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

mAU270nm,4nm (1.00)

1.545

/4411

2.12

9/579

2

2.52

0/2

963

3.08

3/222

9 3.39

0/120

53

3.63

2/402

16 3.

841/2

7782

4.03

7/2

5138

4.32

5/514

684.455

/787

50

4.71

5/306

05

5.23

0/265

555.55

1/281

98

5.847

/2038

2 6.09

7/790

56.34

7/651

46.

601/288

03

7.03

9/3

3976

7.69

8/398

54

8.06

9/2

1248

8.743

/157

28

9.52

5/477

18

9.93

5/2

2744

10.853/149

958

11.232/12

154

11.999

/519

93

12.967/19

529

13.877/16

019

14.843/

3943

15.279/526

7

16.402/26

05

22.766/

70884

28.583/

3696

Extrato do

Fortificado

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

mAU270nm,4nm (1.00)

2.14

1/8683

2.53

8/339

42.639

/126

7

3.115

/650

03.39

4/38

626

3.634

/114

692

3.84

4/8001

34.035

/496

49

4.33

4/9247

5

4.459

/106

424

4.725

/636

25

5.06

0/518

38

5.45

8/2340

715.75

0/107

078

6.05

9/41

079

6.602

/661

97

7.02

9/6397

4

7.47

7/133

05

7.82

3/8186

98.094

/400

91

8.74

8/3978

9

9.56

6/8546

4

10.388

/902

20

10.901/21

546

8

12.054/53

627

12.988

/326

0

13.925/101

89

14.880/35

50

15.387/21

230

15.947/23

92

16.442/16

44

20.754/34

499

4

22.062/184

85

22.828/13

531

9

24.561/40

756

27.39

6/34

931

28.633/24

901

Figura 25. Cromatogramas referentes aos pesticidas eluídos em ciclohexano-acetona (80:20 v/v) e analisados por HPLC-DAD.

1.Tiofanato metílico

2.Carbofurano 3.Difenoconazol

4.Espirodiclofeno

5.β-Ciflutrina

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62

A partir deste resultado, a Figura 26 apresenta uma avaliação da

alteração na otimização no volume de solvente (20 e 15 mL), juntamente com a

adição de uma coluna auxiliar com 1 g de alumina neutra. Este teste de limpeza

do extrato foi baseado na estimativa de reduzir a quantidade de interferentes.

0

20

40

60

80

100

120

15 mL

20 mL

1 g Alumina

neutra

Figura 26 - Avaliação dos diferentes volumes e utilização de coluna auxiliar na extração

de pesticidas utilizando a técnica MSPD (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).

No teste da diminuição de volume de solvente (15 mL), os resultados de

recuperação foram baixos para os pesticidas. A utilização da alumina neutra como

coluna auxiliar também não foi satisfatório, pois apresentou baixos valores de

recuperação, além de não extrair o tiofanato metílico. Desta forma, o volume de 20

mL para a determinação dos cinco pesticidas foi adequado, o qual permitiu valores

de recuperação na faixa de 63-112%.

Na otimização foram avaliados três parâmetros: (a) quantidade de estipe, (b)

quantidade de adsorvente Florisil® e (c) volume de solvente (ciclohexano:acetona)

de forma a obter uma extração eficiente com um menor consumo de solvente, sem

a etapa de limpeza dos extratos. A Figura 27 apresenta o gráfico com os valores de

recuperação percentual dos pesticidas considerando os da Tabela 10.

Re

cup

era

ção

(%

)

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63

Tabela 10. Otimização para a extração de pesticida em estipe

Massa de estipe (g)

Massa de adsorvente (g)

Volume de solvente (mL)

Experimento

0,5

0,5 20 1

0,4 20 2

0,4 15 3

0

20

40

60

80

100

120

1

2

3

Figura 27 – Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e

matriz na extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 2,0 µg g-1).

Os resultados dos testes de recuperações apresentados na Figura 27

evidenciaram que os valores de recuperação obtidos para a condição 2, com 0,5 g

de estipe, 0,4 g de adsorvente e 20 mL de solvente, corresponderam aos

percentuais de recuperação mais satisfatórios (63-108%). Para Ribani et al., (2004)

a ANVISA estabelece recuperações satisfatórias no intervalo de 50-120% para

amostras complexas.

A legislação brasileira (ANVISA) estabelece que o LMR para o

espirodiclofeno é de 0,05 µg g-1 na matriz de coco. Para o desenvolvimento desta

metodologia, o estipe foi forticada com solução padrão contendo os pesticidas

nesta concentração. Como a concentração é baixa, foi aumentada

proporcionalmente a massa do estipe de 0,5 g e de adsorvente de 0,4 g para 2,0 g

de estipe e 1,6 g de adsorvente. O resultado deste teste está representado na

Figura 28.

Re

cup

era

ção

(%

)

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64

0

20

40

60

80

100

120

140

Carbofurano Difenoconazol Espirodiclofeno

20 mL

40mL

Figura 28. Avaliação da otimização dos diferentes volumes e massa de adsorvente e matriz na

extração de pesticidas utilizando a técnica MSPD. (Nível de fortificação 0,05 µg g-1).

Para este nível de concentração foram obtidos resultados satisfatórios para

apenas para o carbofurano, difenoconazol e espirodiclofeno, os demais pesticidas

não foram detectados para este nível de fortificação. Foram testados dois volumes

(20 mL e 40 mL) para a eluição dos pesticidas na proporção 80:20 de

ciclohexano:acetona. Por sua vez, o volume de 40 mL apresentou melhores valores

de recuperação (68-120%).

Dos pesticidas selecionados para o desenvolvimento desta metodologia, o

espirodiclofeno apresenta o menor nível de concentração que a legislação exige

em relação aos demais pesticidas deste trabalho. Desta forma, os ensaios

realizados para a otimização da extração por MSPD ficou determinada com 40 mL

de ciclohexano:acetona na proporção (80:20 v/v) e 2,0 g de estipe e 1,6 g de

Florisil®.

As polaridades do adsorvente e do solvente são fatores importantes na

eficiência do procedimento de extração pela técnica de dispersão de matriz em

fase sólida (SANTOS et al., 2012). O Florisil® é um adsorvente com características

polares (CAPRIOTTI et al., 2010), é um silicato de magnésio com propriedades

básicas que permitem eluição seletiva de compostos baseados em força de

eluição. O ciclohexano é apolar e a acetona é um solvente polar aprótico, seja

mistura na proporção 4:1, permitiu extrair os pesticidas da amostra de estipe

(LANÇAS, 2009).

Re

cup

era

ção

(%

)

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65

Por estas razões, o Florisil® e o ciclohexano:acetona na proporção (80:20

v/v) foi um sistema adequado para a determinação de carbofurano, β-ciflutrina,

difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato-metílico em estipe.

5.4. VALIDAÇÃO DO MÉTODO MSPD PARA O ESTIPE POR HPLC-DAD

A etapa de validação de uma metodologia indica que os resultados obtidos

com a metodologia são confiáveis e desta forma, pode ser adotado na rotina do

laboratório, com os parâmetros de exatidão, precisão, linearidade e limites de

detecção e quantificação (RIBANI et al., 2004; BRITO et al., 2003).

5.4.1 – Linearidade

A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a

qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado (LANÇAS,

2009). A linearidade proporciona uma faixa de aplicação capaz de fornecer

resultados referentes relacionando a área e a concentração de um analito, sendo

expressa com uma equação da reta (y = ax + b) chamada de curva analítica.

Através de uma regressão linear, os coeficientes de regressão (a e b) permitem

calcular o coeficiente de correlação (r). Estes cálculos estimam a qualidade da

curva seja valores mais próximo a 1,0, garantindo uma menor incerteza dos

coeficientes e menor dispersão dos pontos experimentais (RIBANI et al., 2004).

A linearidade foi comprovada nos resultados da curva analítica com valores

que variaram de sete a nove níveis de concentração dos pesticidas em acetonitrila,

como mostram as Figuras 29 e 30. A linearidade foi avaliada pela curva analítica

preparada no solvente acetonitrila nas concentrações de 0,04; 0,1; 0,2; 0,4 e 1,0;

2,0; 10, 15 e 20 µg mL-1 em triplicata (Brito et al., 2003). A Tabela 11 apresenta as

equações de reta, coeficientes de correlação e o intervalo de concentração dos

pesticidas. E as Figura 29 apresentam as curvas analíticas dos pesticidas

estudados.

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66

Tabela 11. Dados da equação da reta, linearidade, intervalo de concentração do método MSPD

Pesticidas Equação da reta Coeficiente de correlação

(r)

Intervalo de concentração

(µg mL-1) Carbofurano y=5,5x + 388193,1 0,9993 0,04-15

β-Ciflutrina y=3,1x – 123516,2 0,9974 0,1-15

Difenoconazol y=1,7x + 349040,9 0,9989 0,04-15

Espirodiclofeno y=188443,8x - 24681,5 0,9996 0,04-20

Tiofanato metílico y=3,6x – 98005,1 0,9991 0,04-20

Figura 29 – Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD: a) Carbofurano e b) β-ciflutrina.

a)

b)

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67

Continuação Figura 29 - Curvas analíticas obtidas no solvente acetonitrila e analisados por HPLC-DAD: a) difenoconazol; b) espirodiclofeno; c) tiofanato-metílico.

a)

b)

c)

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68

5.4.2 –Seletividade

A seletividade é a capacidade de análise de compostos em presença de

interferentes (RIBANI et al., 2004). A seletividade foi realizada através da

detecção de compostos avaliados por cromatogramas do extrato controle e do

extrato fortificado (BRITO et al., 2003). A Figura 30 mostra a seletividade para os

cinco pesticidas selecionados em cromatogramas por HPLC-DAD.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000uV

Solução Fortificada 0,5 µg g-1 Solução de comparação 0,5 µg g-1 Branco do extrato

Figura 30. Cromatogramas obtidos por HPLC-UV/DAD avaliando a seletividade por de 1 –Tiofanato metílico; 2 –Carbofurano e 3 –.Difenoconazol; 4 – Espirodiclofeno; 5 – β-Ciflutrina. A, B, C e D – regiões de registro dos pesticidas.

A seletividade foi avaliada comparando-se a presença de compostos no

cromatograma do branco do estipe com um padrão. Desta forma, foi possível

verificar que no cromatograma do branco da amostra do estipe é uma amostra com

compostos interferentes nos tempos de retenção dos analitos, com essa avaliação

mostra que as condições não foram totalmente seletivas. O pesticida pode ser

influenciado pela natureza de amostras complexas, como frutas, óleos, vegetais e

tipo de co-extrativos (polaridade, volatilidade, tamanho das moléculas, lipídios,

1

2

3

5

4

A

B

C

D

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69

pigmentos, resina da planta), e pode originar o efeito de matriz ou dificuldades na

extração com baixa recuperação em análises cromatográficas (PINHO et al., 2009).

5.4.3. Exatidão e Precisão

A exatidão estima o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência. Uma das formas

de avaliar a exatidão de um método é através dos ensaios de recuperação. A

exatidão está sempre associada aos valores de precisão. A precisão de um método

representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de

uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas e

pode ser expressa por expressa como desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente

de variação (CV%) (BANDARKAR & KHATTAB, 2012; RIBANI et al., 2004;

LANÇAS, 2004).

A exatidão foi avaliada pelo estudo de recuperação realizado com a

fortificação da amostra de estipe. As respostas das áreas foram comparadas

com a solução de comparação. A precisão foi expressa como a estimativa do

desvio padrão relativo (RSD). Para Ribani et al. ( 2004) em metodologias de

análise traço, os intervalos aceitáveis de recuperação geralmente estão entre 70

e 120%, com precisão (RSD) de até ± 20%. Contudo, dependendo da

complexidade da amostra, este valor pode ser de 50 a 120% com precisão de

até ± 15%.

Foi verificada a precisão intra-dia nas concentrações de 0,5 µg g-1 feita

por análise de amostras e verificado a precisão em inter-dias consecutivos.

A Tabela 12 apresenta a eficiência da recuperação e desvio padrão relativo

entre 3 e 4 níveis de concentração (0,05; 0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1) dos pesticidas

estudados em estipe.

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70

Tabela 12. Eficiência da recuperação (n=3) e desvio padrão relativo (RSD%) em diferentes níveis de concentração dos pesticidas estudados em estipe

Pesticida Nível de Fortificação (µg g-1)

Recuperação média (%)

RSD (%)

Carbofurano 0,05 0,5 1,0 2,0

103,5 89,7 114,3 100,3

6,1 9,5 10,9 8,6

β-Ciflutrina 0,5 1,0 2,0

75,0 88,4 87,0

13,4 11,0 14,6

Difenoconazol 0,05 0,5 1,0 2,0

64,7 80,3 82,6 100,0

11,5 13,2 12,5 16,5

Espirodiclofeno 0,05 0,5 1,0 2,0

94,6 77,0 84,6 88,0

19,2 14,1 13,5 15,9

Tiofanato metílico

0,5 1,0 2,0

70,4 84,5 57,5

10,6 9,3 1,2

A variação dos valores da recuperação média dos pesticidas em amostras de

estipe nas concentrações de 0,05; 0,5; 1,0 e 2,0 µg g-1 variam de 57,5 a 114,3% e o

desvio padrão relativo variaram de 1,2 a 19,2%. A concentração de 0,05 µg g-1 foi

satisfatória para os pesticidas difenoconazol, espirodiclofeno e carbofurano, pois

apresentou recuperações aceitáveis. A tabela 13 apresenta a precisão entre dias no

nível de concentração 0,5 µg g-1.

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Tabela 13. Eficiência da precisão da metodologia intra-dias no nível de fortificação de 0,5 (µg g-1) dos pesticidas estudados em estipe Pesticida Nível de

Fortificação (µg g-1) Dias Recuperação

média (%) RSD (%)

CV (%)

Carbofurano 0,5

1 2 3 4

84 87 85 85

1,7 0,8 3,3 4,5

2,1 0,9 3,9 5,3

β-Ciflutrina 0,5

1 2 3 4

95 84 88 88

15,0 7,2 1,4 1,2

15,8 8,6 1,6 1,4

Difenoconazol 0,5

1 2 3 4

88 81 88 82

6,1 7,3 1,7 9,0

6,9 9,0 1,9 11,0

Espirodiclofeno 0,5

1 2 3 4

108 92

109 91

11,0 4,5 15,0 9,6

10,2 4,9 13,7 10,5

Tiofanato metílico

0,5

1 2 3 4

73 69 64 61

2,2 1,0 2,4 2,6

3,0 1,5 3,7 4,3

A variação dos valores da recuperação média dos pesticidas em amostras de

estipe no nível de concentração de 0,5 µg g-1 variaram de 61 a 109%, o desvio

padrão relativo variaram de 0,8 a 15% e o coeficiente de variação variou de 0,9 a

15,8 %. Os valores encontrados de precisão e exatidão são consideravéis aceitáveis

para matriz complexa.

5.4.4 – Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)

O limite de detecção é a menor concentração que o analito pode ser

detectado, mas não necessariamente quantificado (BRITO et al., 2003).

Adicionalmente Thier & Zeumer (1987), o limite de detecção é considerado quando

o valor da concentração do composto encontrado na matriz é menor ou igual ao

valor do limite de quantificação. Para IMOTO & FREITAS (2008) os LD e LQ

obedecem a testes limites que especificam se o pesticida na amostra está no valor

determinado expresso em mg kg-1. No procedimento de validação da metodologia

de qualquer pesticida, os níveis de LQ e LD exigem um número de amostras

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fortificadas devam ser analisados próximo ao nível de concentração desejado, em

que seja possível quantificá-los.

O limite de quantificação corresponde à menor quantidade de um analito que

pode ser quantificada com exatidão e com fidelidade determinada (LANÇAS, 2009).

Ainda segundo Thier & Zeumer (1987), o limite de quantificação representa o

menor valor da concentração de um composto nas amostras desde que atenda aos

seguintes requisitos: 1) os valores de recuperação forem iguais ou maiores do que

70%; 1) LQ ser maior do que ou igual ao LD; 3) o coeficiente de variação ser igual

ou menor que 20%.

Desta forma, o limite de detecção foi calculado pelos menores níveis de

concentração (0,05 e 0,5 µg g-1), assim como o limite de quantificação. Na Tabela

14 encontram os valores dos limites de detecção e limite de quantificação da

metodologia para a matriz.

Tabela 14. Limite de detecção e quantificação dos pesticidas usando a

técnica de extração MSPD e HPLC-DAD Pesticida LD (µg g-1) LQ (µg g-1)

Carbofurano 0,03 0,05

β-Ciflutrina 0,3 0,5

Difenoconazol 0,03 0,05

Espirodiclofeno 0,02 0,05

Tiofanato metílico 0,2 0,5

Os limites de detecção obtidos para os pesticidas carbofurano, β-ciflutrina,

difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato metílico no desenvolvimento da

metodologia variaram entre 0,02 a 0,3 µg g-1. Não há relatos na literatura de LD e

LQ que utilizaram o emprego das técnicas de MSPD e HPLC-DAD em estipe.

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste trabalho foi desenvolvido uma metodologia eficiente para a

determinação simultânea dos pesticidas: carbofurano, β-ciflutrina, difenoconazol,

espirodiclofeno e tiofanato metílico em estipe, utilizando as técnicas de MSPD e

HPLC-DAD.

A metodologia proposta por MSPD com a utilização de 1,6 g de Florisil®

como dispersante em 2,0 g de amostra de estipe, utilizando 40 mL de ciclohexano-

acetona (80:20 v/v) mostrou-se eficiente na extração dos resíduos de carbofurano,

β-ciflutrina, difenoconazol, espirodiclofeno e tiofanato metílico, sem a etapa de

limpeza.

Após a otimização do procedimento de extração, foi efetuada a validação de

metodologia para análise de pesticidas no estipe. Para tanto, foram avaliados os

parâmetros: linearidade da curva analítica, seletividade, precisão, exatidão, limite

de detecção e limite de quantificação. Os valores de recuperação variaram de 57,5

a 114,3% com precisão entre 1,2 a 19,2% para os valores de concentração entre

0,05-2,0 µg g-1. A linearidade 0,9951 a 0,9999 num intervalo de concentração de

0,04-20 µg mL-1. Os limites de detecção foram de 0,02 a 0,3 µg g-1 e limite de

quantificação foi de 0,05 e 0,5 µg g-1.

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7. PERSPECTIVAS DO TRABALHO

Realizar testes em condições de campo para estudar a translocação dos

respectivos pesticidas no estipe do coqueiro.

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