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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICA E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
ARIELLY ANDRADE VIEIRA
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DO EXTRATO HIDROETANÓLICO
DO FRUTO DE Vaccinium macrocarpon
SÃO CRISTOVÃO
2019
ARIELLY ANDRADE VIEIRA
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DO EXTRATO HIDROETANÓLICO
DO FRUTO DE Vaccinium macrocarpon
Trabalho de conclusão de curso de graduação apresentado ao curso de Farmácia da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo
SÃO CRISTOVÃO
2019
1
AGRADECIMENTOS
Não poderia iniciar sem agradecer a ele que me deu permissão para vivenciar
este momento e me presenteou com uma vida de paz, uma família incrível e bons
amigos, obrigada Deus, por tudo e por tanto.
A minha linda família, cada um a seu jeito foi essencial para essa conquista. Amo
vocês. Ao meu melhor amigo, companheiro de todas as horas e dono de uma
inesgotável paciência, meu Pedro Hugo, obrigada por tanto,te amo.
Os meus companheiros de jornada, de maneira especial Rayra (cabeça),
Elindayane (Nil), Bruno (O mais rilex do grupo), Marcelo (Dinosoor) e Gigi nossa
professora arretada pelo companheirismo no desespero pré e pós provas, pela
paciência, pelos ensinamentos, pelo carinho, enfim tantos momentos, que por falta de
espaço, não de histórias me detenho a dizer: não teria conseguido sem vocês.
Ao meu orientador Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo, que me fez entender o
verdadeiro significado das palavras humildade, maturidade, respeito e determinação.
Obrigada, por cada vez que subi aquela escada e fui recebida com atenção e
paciência (mesmo diante dos meus estados de crise existencial), pelos ensinamentos,
por ser além de um orientador, um amigo e dono dos melhores comentários nas
correções. O senhor sempre será um exemplo humano e profissional a seguir.
Aos meus mestres, que com calma e dedicação ensinaram, ouviram as
reclamações, responderam aos questionamentos, levo de cada um lições de coragem,
carinho, conhecimento e amor pelo ensino e pesquisa, “Se cheguei até aqui foi porque
me apoiei nos ombros de gigantes” (I. Newton).
Aos companheiros de pesquisa do Lafapi, Alan, Dani, Janaina, Betânia, Bruno,
Marilia, Fabiula, Jessica, Luiz André, Kamila, David, Julio, Pietro, pelas discussões
enriquecedoras, apoio, amizade e paciência.
A Liga de farmacologia (LIFAR) pelos ensinamentos e oportunidades.
Enfim a todos aqueles que direta ou indiretamente me honraram com o prazer
da convivência, tornando essa caminhada mais leve e enriquecedora, nada disso seria
assim tão marcante e feliz sem vocês.
Muito obrigada!
2
RESUMO
Atividade anti-inflamatória do extrato hidroetanólico do fruto de Vaccinium
macrocarpon. Vieira, Arielly Andrade, 2019. A inflamação é uma resposta natural
do organismo visando manter a integridade do mesmo. Porém, quando ocorre de
maneira exacerbada, pode levar a processos patológicos. Vários são os
medicamentos existentes para tratar tal condição, mas trazem consigo efeitos
indesejados. Nesse sentido, existe a necessidade de buscar outras alternativas
terapêuticas e as plantas medicinais são um caminho promissor visto que,
representam historicamente uma fonte de compostos para o tratamento da
inflamação. A Vaccinium macrocarpon é uma planta popularmente utilizada para tratar
processos inflamatórios e quadros infecciosos, neste contexto, o presente estudo teve
como objetivo investigar o efeito anti-inflamatório do extrato hidroetanólico do fruto da
Vaccinium macrocarpon (EHVm).Para isso, utilizou-se camundongos Swiss (20-30 g)
machos, após aprovação pelo Comitê de Ética da UFS (protocolo 66/17). Para todos
os ensaios in vivo, foram realizados edema de orelha induzido por 12-O-
tetradecanoilforbol acetato (TPA), no qual foram avaliados o edema, atividade de
mieloperoxidase (MPO), concentração de interleucina (IL)-1β, alterações histológicas
e marcadores de alterações oxidativas. Como resultado, na inflamação induzida na
orelha, a administração do EHVm (3 mg/orelha) concomitante ao TPA reduziu o
edema (p<0,001), a atividade da MPO (p<0,01) e a concentração de IL-1β (p<0,05)
quando comparado ao grupo veículo, o que corroborou a análise histológica, na qual
verificou-se menor presença de infiltrado inflamatório agudo e ausência desse
infiltrado em região perianexial na orelha de animais tratados com o EHVm. Houve
também diminuição da peroxidação lipídica com nas orelhas tratadas com o EHVm
(0,3; 1 e 3 mg/orelha; p<0,001) e nas doses de 1 e 3 mg/orelha de EHVm houve
aumento do poder antioxidante do tecido medido pelo potencial reducional de ferro
(p<0,01 ou p<0,001 respectivamente) quando comparado ao grupo veículo. Estes
resultados conduziram à conclusão de que o EHVm possui atividade anti-inflamatória
que pode estar parcialmente atrelado ao seu efeito antioxidante.
Descritores: Inflamação, Antioxidante, Vaccinium macrocarpon, Planta medicinal.
3
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EHVm Extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ERO Espécies reativas de oxigênio
FRAP Ensaio de potencial reducional de ferro
IL Interleucina
MPO Mieloperoxidase
OH• Radical hidroxila
TNF Fator de necrose tumoral
TPA 12-O-tetradecanoilforbol acetato
TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazina
4
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Vaccinium macrocarpon Aiton. Adaptado de: New England Wild Flower
Society. ......................................................................................................................11
Figura 2- Atividade do extrato hidroetanólico da vaccinium macrocarpon (EHvm) no
peso das orelhas induzidas por 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) em
camundongos.............................................................................................................18
Figura 3- Atividade do EHVm na atividade da mieloperoxidase em orelhas de
camundongos induzidas por TPA...............................................................................19
Figura 4 - Atividade do extrato hidroetanólico de Vaccinum macrocarpon na
concentração da IL-1β nas orelhas de camundongos estimuladas com
TPA................................ ............................................................................................20
Figura 5- Atividade do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon (EHVm) na
peroxidação lipídica (status oxidativo) em orelhas de camundongos submetidos a
inflamação por (TPA) .................................................................................................21
Figura 6- Atividade antioxidante do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon
(EHVm) pelo potencial reducional..............................................................................21
Figura 7- Imagens representativas de cortes histológicos (Aumento de 400x) das
orelhas de camundongos submetidas à aplicação de veículo
(acetona)....................................................................................................................22
Figura 8- Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, aumento de
400x) das orelhas de camundongos inflamadas com 12-O-tetradecanoiforbol-13-
acetato (TPA).............................................................................................................22
Figura 9 - Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, E, F, aumento
de 400x) das orelhas de camundongos inflamadas com 12-O-tetradecanoilforbol-13-
acetato (TPA).............................................................................................................23
Figura 10- . Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, aumento de
400x) das orelhas de camundongos inflamadas com 12-o-tetradecanoilforbol-13-
acetato (TPA) e submetidas ao tratamento concomitante com extrato hidroetanólico
da Vaccinium macrocarpon (EHVm)..........................................................................24
Figura 11- Imagens representativas de corte histológicos (A, B, C, D, aumento de
400x) das orelhas de camundongos inflamadas com 12-o-tetradecanoilforbol-13-
acetato (TPA) e submetidas ao tratamento concomitante com
dexametasona............................................................................................................25
5
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................6
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................7
2.1. Inflamação..........................................................................................................7
2.2. Plantas medicinais..............................................................................................9
2.3 Vaccinium macrocarpon....................................................................................10
3. OBJETIVO.............................................................................................................12
3.1. Objetivo geral...................................................................................................12
3.2. Objetivo específicos.........................................................................................13
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................13
4.1 Material vegetal................................................................................................13
4.2.Animais.............................................................................................................13
4.3.Edema de orelha induzido pelo 12-O-tetradecanoilforbol acetato (TPA)
....................................................................................................................................14
4.3.1. Massa das orelhas de camundongos estimuladas com TPA........................14
4.3.2. Atividade de mieloperoxidase (MPO) nas orelhas de camundongos
estimuladas com TPA ................................................................................................15
4.3.3. Determinação de IL-1β na orelha de camundongos estimuladas com TPA.
....................................................................................................................................15
4.3.4. Determinação da concentração de TBARS na orelha de camundongos
estimulada com TPA..................................................................................................16
4.3.5. Avaliação da capacidade antioxidante do EHVm pelo FRAP na orelha de
camundongos estimulada com TPA..........................................................................16
4.4 Análise Histológica das orelhas........................................................................17
4.5 Análise estatística.............................................................................................17
5. RESULTADOS......................................................................................................18
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................25
7. CONCLUSÃO........................................................................................................31
8. REFERÊNCIAS......................................................................................................31
6
1. INTRODUÇÃO
A inflamação é um mecanismo multíplice e necessário à sobrevivência,
geralmente benéfica ao organismo e que busca restabelecer a estrutura e função do
tecido e/ ou órgão pela eliminação do agente inicial da lesão e a proteção do
organismo. É uma resposta mediada pelo sistema imune e caracterizada por uma
cascata de eventos fisiológicos que incluem alterações na microcirculação no local
inflamado (CHANDRASEKHARAN et al.,2015; CHAMUSCA et al., 2012). No entanto,
em condições em que a resposta inflamatória se perpetua, os produtos celulares como
as proteases neutras entre outros podem acometer o parênquima tecidual intacto
(LIMA et al, 2007; TENÓRIO, et al, 2012), levando a agressão aos tecidos saudáveis
e consequentes processos patológicos (LAWRENCE et al., 2007).
Neste sentido, muitas são as pesquisas e atenções voltadas para o
desenvolvimento de terapias que busquem tratar tais condições. Entre estas
destacam-se o uso dos glicocorticoides e dos anti-inflamatórios não esteroidais
(AINES). No entanto, o uso prolongado ou em altas doses desses fármacos produzem
efeitos indesejados, como lesão gástrica, nefrotocixidade, náusea e vômitos (BADRI
et al., 2016). Este fato leva a comunidade científica a buscar outras opções
terapêuticas que agreguem maior segurança, eficácia e economia.
Dentre estas outras alternativas destacam-se o uso de produtos derivados de
plantas medicinais, pois estas possuem compostos promissores, com possibilidade
de menos efeitos indesejados e menor custo (GHASEMIAN et al.,2016).
Aproximadamente 85% da população brasileira faz uso da medicina tradicional
(BRASIL,2006), embora muitos compostos ou preparações de plantas podem
apresentar toxicidade relevante, uma questão que precisa ser considerada durante o
screening de novas alternativas terapêuticas.
Neste interim, a Vaccinium macrocarpon Aiton, é uma pequena planta verde que
contem flores cor-de-rosa escuras, cujos frutos são popularmente conhecidos como
cranberry e são usados na forma de sucos em diversas regiões, faz parte da família
da Ericaceae e é desenvolvida em ambientes úmidos, como florestas e pântanos nos
países norte-americanos (SAONA et al., 2011). Estudos sugerem seu uso em uma
7
variedade de condições inflamatórias, nos quais observou-se efeito inibitório sobre IL-
6, IL-8 e prostaglandinas (BODET et al.,2007; XIAO et al., 2015).
É importante mencionar também que o cranberry foi utilizado em um estudo de
câncer de bexiga e foi demonstrada a redução no peso, indicando uma diminuição no
tamanho do tumor e na proliferação celular (PRASAIN et al.,2008). Também há relatos
de que preparações de cranberry possuam efeito hepatoprotetor (GLISAN et al.,
2016), cardioprotetor (NOVOTNY et al., 2015), adjuvante no tratamento da obesidade
(ANHÊ et al., 2015) e no tratamento de infecções do trato urinário (MUTLU et al, 2012).
Frente a tais dados, verifica-se que há estudos publicados sobre as diversas
possibilidades terapêuticas advindas do cranberry, inclusive as anti-inflamatórias,
porém está ainda é pouco referida em modelos de inflamação aguda, principalmente
após aplicação por via tópica. Neste sentido, o presente trabalho foi delineado
objetivando avaliar a atividade anti-inflamatória do extrato hidroetanólico da
V.macrocarpon (EHVm) em modelo de inflamação de orelha.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Inflamação
A inflamação é um mecanismo homeostático de defesa dos tecidos
vascularizados, com o objetivo de remover os agentes lesivos e restabelecer as
funções normais do organismo (RAHMATI et al.,2016). Tais agentes podem ser de
natureza física (trauma mecânico, radiação, calor, frio), química (substâncias irritantes
e álcalis) e biológica (fungos, bactérias, vírus e protozoários) (LIMA et al 2007). A
agressão advinda desse processo suscita mudanças vasculares, celulares e
imunológicas tais como vasodilatação, aumento da permeabilidade capilar e migração
celular, o que leva aos cinco sinais clínicos locais da inflamação: dor, calor, rubor,
edema e perda de função (MEDZHITOV,2010).
As descrições destas características clínicas foram encontradas em papiros
egípcios, datados de aproximadamente 3000 a.C., mas o primeiro autor a listar os
8
quatro sinais cardinais da inflamação foi Celsius, um escritor romano do século I d.C.,
sendo o quinto sinal acrescentado por Virchow no século XIX (LAPA et al., 2007).
Essa conjuntura demonstra o interesse desde os primórdios acerca dos fundamentos
e sinais desse processo, considerando sua importância na patologia e na
sobrevivência humana.
A inflamação como o processo complexo que se constitui, envolve alterações
vasculares caracterizadas por vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular e
eventos celulares caracterizados pela migração dos leucócitos da microcirculação
com acúmulo no foco de infecção, o que sinaliza recrutamento e ativação celular.
(BILATE, 2007). O processo atua destruindo (fagocitose e anticorpos), diluindo
(plasma extravasado) e isolando ou sequestrando (malha de fibrina) o agente
agressor, além de abrir caminho para os processos reparativos (cicatrização e
regeneração) do tecido afetado (FULLERTON et al., 2016).
O delineamento destas ações dependerá da intensidade, natureza e duração do
estímulo lesivo. Em casos onde este for de curta duração, ou rapidamente anulado
pelos mecanismos de defesa do organismo, as alterações inflamatórias sofrerão
rápida resolução, sendo denominadas de agudas (REUTER et al., 2010). Entretanto
em condições em que o estimulo nocivo é de duração mais longa e a lesão tissular é
perpetuado, há um retardo no processo de reparação tecidual e tem-se a inflamação
crônica.
Caracteriza-se como inflamação aguda, aquela na qual há uma progressão de
horas a dias, sendo caracterizada por vasodilatação, exsudação plasmática e
migração de células para o sítio lesado, com a participação de células leucocitárias,
como os macrófagos, neutrófilos, mastócitos e basófilos que agem mediante a
liberação de citocinas, como as interleucinas (IL)-1 e 6 e o fator de necrose tumoral
(TNF)-α ou mediadores inflamatórios como as prostaglandinas e leucotrienos e a
produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN) (SAH; DAWRA;
SALUJA, 2013). Diversos sistemas bioquímicos, como o sistema complemento e de
coagulação, são ativados e auxiliam no estabelecimento e resolução do processo
inflamatório (CRUVINEL et al 2010).
9
As desordens crônicas por sua vez são caracterizadas por longa duração
(semanas, meses ou anos) com inflamação ativa, destruição tecidual e tentativa de
reparo ocorrendo simultaneamente, mas de forma insuficiente. Infiltração de células
mononucleares, neoangiogênese e fibrose são características histológicas típicas de
inflamação crônica (NORLING, 2010), além da presença de produtos celulares como
as proteases neutras, metaloproteinases e elastases que podem levar a degradação
de colágeno, elastina e fibrina do parênquima tecidual intacto, o que ocasiona uma
agressão aos tecidos saudáveis do hospedeiro (LIMA et al, 2007; TENÓRIO, et al,
2012).
Para tratar o quadro inflamatório a estratégia principal consiste em reduzir a formação dos
mediadores da inflamação. Os anti-inflamatórios não esteroidias (AINES) são
amplamente empregados na terapêutica, sendo representados por medicamentos
como diclofenaco e ibuprofeno, possuem atividade na inibição específica da ciclo-
oxigenase (COX-1 e COX-2) e levam a consequente redução da conversão do ácido
araquidônico (AA) em prostaglandinas (JÚNIOR et al.,2007). No entanto, o uso
prolongado ou em altas doses desses fármacos produzem efeitos indesejados, como
lesão gástrica, nefrotoxidade, náusea e vômitos (BADRI et al., 2016), o que contribui
para uma busca por novas alternativas terapêuticas.
2.2 Plantas Medicinais
Historicamente, as plantas medicinais se constituíram como uma ferramenta
primordial na terapêutica clínica. Compreende-se que desde os tempos mais antigos
até os dias atuais, as mais diversas patologias têm sido tratadas com chás e infusões,
obtidas a partir deste âmbito terapêutico (HARVEY, 2015). Dados da OMS demostram
que pelo menos 80% da população mundial faz uso de algum tipo de planta para fins
medicinais, o que valida o papel fundamental do estudo das plantas medicinais na
saúde.
São inúmeros os benefícios relatados para a terapia com fitoterápicos, como
menor custo com pesquisas, vantagens culturais, e eficácia no tratamento de
malefícios, além de apresentarem vários componentes com ações similares aos já
10
existentes no mercado, mas com relativa diminuição dos riscos de efeitos colaterais
(ASADI et al., 2015).
O Ministério da Saúde, reconhecendo o potencial terapêutico das plantas
medicinais e com o objetivo de promover o maior aproveitamento de recursos pela
população brasileira, aprovou a RENISUS, que inclui 71 espécies vegetais
selecionadas pelo amplo uso popular. Isso reitera a importância da medicina
tradicional e medicina complementar (HARVEY, 2015) e corrobora para o processo
de busca por espécies vegetais que possam ser utilizadas na fabricação de novos
compostos de interesse médico e farmacêutico (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006;
DE FREITAS et al., 2017).
Entretanto, se faz necessário ressaltar o temor frente ao uso incorreto de plantas
medicinais pela população, sendo fundamental o apoio ao estudo etnobotânico e
etnofarmacológico, pelo do aporte à pesquisa científica e o estreitamento de laços
entre a academia, a sociedade e a indústria, para assim incrementar os
conhecimentos relacionados à eficácia e segurança dessas plantas, oferecendo
alternativas terapêuticas seguras e acessíveis a comunidade e aos profissionais de
saúde (DUTRA et al., 2016).
2.3 Vaccinium macrocarpon
Entre as plantas medicinais com importantes atividades terapêuticas, temos a
Vaccinium macrocarpon Aiton, conhecida popularmente como cranberry, encontrada
em grande escala na América do Norte (SKROVANKOVA, SUMCZYNSKI, MLCEK,
JURIKOVA, SOCHOR, 2015). A Vaccinium macrocarpon é um arbusto perene, da
família Ericaceae e do gênero Vaccinium, com folhas pequenas e flores de cor rosa
escura, sendo seu fruto inicialmente uma baga de cor branca, mas que se torna
vermelho escuro (Figura 1) quando completamente maduro, sendo comestível, de
sabor adocicado e levemente ácido (DINH et al., 2014).É descrito seu consumo de
várias formas, desde a baga fresca ao seu sumo concentrado, baga desidratada, chás
e até mesmo em suplementos alimentares (comprimidos/cápsulas) (PARDO-MATES
11
et al., 2017), no entanto os principais achados estão relacionados ao uso de seus
frutos sobretudo em forma de suco (BÁRTÍKOVÁ et al., 2014).
Diversos estudos foram realizados a fim de caracterizar as atividades
farmacológicas do cranberry, entre elas o uso no tratamento de infecções, de
condições inflamatórias e suas propriedades antioxidantes e anticancerígenas
(KRESTY et al., 2011). BÁRTÍKOVÁ et al. (2014) e HAMILTON et al. (2014)
demonstram, por exemplo, o uso dos frutos do cranberry em processos inflamatórios
relacionadas ao trato urinário, como também foi demonstrado por VALENTOVAÃ et
al. (2007), que avaliaram a efetividade do consumo de 400 e 1200 mg de extrato de
cranberry no quadro de infecção do trato urinário em 65 mulheres com idade de 19 à
28 anos, durante 8 semanas. Estes autores concluíram que doses de 1200 mg de
extrato de cranberry podem reduzir significativamente a oxidação protéica e a
aderência da E. coli no tecido. Resultado semelhante também encontrado por
STOTHERS (2002). Ademais, existem relatos científicos sugerindo seu uso em uma
variedade de condições inflamatórias, nas quais observa-se efeito inibitório sobre IL-
6, IL-8 e prostaglandinas (BODET et al.,2007; XIAO et al., 2015).
É importante destacar também o papel do cranberry em pesquisas relacionadas
ao câncer, como a realizada por PRASAIN et al. (2008), com um grupo de 344 ratos
durante 6 semanas, com a dose de 1 mL de suco de cranberry ao dia. Os autores
observaram que houve uma redução no peso da bexiga, indicando uma diminuição
no tamanho do tumor e na proliferação celular. O uso clínico do cranberry está voltado
Figura 1 - Vaccinium macrocarpon Aiton. Adaptado de: New
England Wild Flower Society
12
principalmente para o tratamento de doenças do trato urinário e inflamação vascular
(DURHAM; STAMM; EILAND, 2015; HISANO et al., 2012).
O cranberry possui em sua composição diversas substâncias biologicamente
ativas de origem inorgânica e orgânica. Entre os inorgânicos destacam-se: água,
potássio, cálcio, sódio, fósforo, magnésio, ferro e iodo. Em relação aos constituintes
orgânicos, o cranberry apresenta: glucose, frutose, proteínas, ceras, pectinas,
vitaminas C, A, B1 e B2, ácidos orgânicos (ácido málico, quínico, cítrico e benzóico) e
compostos fenólicos, tais como, antocianinas, flavonóides, proantocianidinas e
taninos condensados (SKROVANKOVA et al., 2015). Estudos evidenciam que as
propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas e antibacterianas que
o cranberry possui é em significativa parte conferida por estes compostos fenólicos .
(PARDO-MATES et al., 2017; MARTÍN, M et al., 2015). Tais compostos são
predominantemente os flavanois (flavano-3-ol), flavonois, proantocianidinas tipo A
(PAC-A), antocianinas e ácido ursólico (KOWALSKA, K et al.,2016)
Neste interim, verifica-se que há estudos publicados sobre as diversas
possibilidades terapêuticas advindas do cranberry, inclusive as anti-inflamatórias,
porém está ainda é demonstrada de maneira incipiente, principalmente em modelos
de avaliação tópica no contexto da inflamação aguda. Tal fato associado a
potencialidade do uso de plantas na terapêutica motivaram a realização deste trabalho
que visou avaliar a atividade anti-inflamatória do extrato hidroetanólico dos frutos da
Vaccinium macrocarpon em modelo tópico de inflamação aguda.
3. OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Investigar o efeito do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon
Ainton (EHVm) na inflamação tópica em orelhas de camundongos.
13
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito do EHVm sobre alterações vasculares e celulares no
edema de orelha;
Investigar se o tratamento com EHVm altera a concentração de IL-1β na
inflamação na orelha;
Avaliar se o tratamento com EHvm afeta as alterações histológicas nas
orelhas inflamadas;
Avaliar o efeito do EHVm sobre a peroxidação lipídica e o potencial
reducional de ferro em orelhas inflamadas.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
O extrato hidroetanólico dos frutos de Vaccinium macrocarpon (EHVm) foi
adquirido comercialmente da Fagron BV (São Paulo – São Paulo, Brasil), lote
14083757D, com certificado de análise de controle de qualidade e cedido pela Dose
Certa Farmácia de Manipulação sob a responsabilidade do Me. Farm. Leandro de
Oliveira Porfírio. Este extrato foi caracterizado em estudo recente do Laboratório de
Farmacologia do Processo Inflamatório, no Departamento de Fisiologia da UFS
(SANTANA et al., 2018). Neste estudo foram identificados sete compostos pela
técnica de cromatografia líquida de alta performance acoplada a espectrometria de
massa, sendo três flavan-3-ols que constituíram 93,3% do total de flavonoides
(catequina, epicatequina e epicatequina galato); um flavonol (quercetina-3-O-
rutinosídeo) que contribuiu com 4,3% deste total e três antocianinas (cianidina-3-O-
galactosídeo; cianidina-3-O-glucosídeo e cianidina-cumaroil-hexosídeo) que
contribuíram com 2,4% do mesmo.
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos (20-30 g) provenientes do Biotério
Setorial do Departamento de Fisiologia da UFS. Esses animais foram alocados em
grupos de cinco, com livre acesso à comida e água, e foram mantidos em ciclo
14
claro/escuro de 12/12h, a uma temperatura de 22ºC ± 2ºC. Os animais foram
distribuídos nos grupos experimentais de forma randomizada e os experimentos foram
conduzidos de forma encoberta, isto é, os experimentadores observadores não
conheciam a identidade dos grupos em estudo. Os protocolos foram realizados de
acordo com os princípios éticos de experimentação animal e foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS sob o número 66/17 (Anexo A). Ao
término dos experimentos foi realizada a eutanásia dos animais com dose excessiva
de isoflurano (Cristália, Itapira-SP) inalatório. As carcaças foram acondicionadas em
sacos plásticos e guardadas em freezer específico até o descarte definitivo de acordo
com a rotina do Departamento de Fisiologia, pelo serviço de coleta seletiva de lixo
biológico da UFS.
4.3 Edema de orelha induzido pelo 12-O-tetradecanoilforbol acetato
(TPA)
O edema de orelha foi realizado de acordo com a metodologia revisada por
Young et al. (1989). Para tanto, os animais (n=6-8) foram anestesiados com isoflurano
inalatório para aplicação de 20 μL de TPA (1 μg/orelha, dissolvido em acetona) nas
superfícies interna e externa da orelha direita, com o auxílio de uma ponteira de
polipropileno, na ausência ou presença simultânea de EHVm (0,3, 1,0 ou 3,0 mg/
orelha) ou dexametasona (0,05 mg/orelha). Foi administrado acetona (20 μL)
topicamente na orelha esquerda dos animais de todos os grupos e cada animal serviu
como seu controle. A eutanásia foi realizada por excesso de isoflurano inalatório, 6
horas após a indução da inflamação (BOMFIM et al, 2014).
4.3.1 Massa das orelhas de camundongos estimuladas com TPA
Após eutanásia, sítios das orelhas foram recortados com um punch de 8 mm de
diâmetro e as orelhas foram pesadas em uma balança digital. Os valores foram
15
expressos em mg e representaram a subtração da massa das orelhas direita em
relação a esquerda de cada animal (OLIVEIRA et al., 2017).
4.3.2 Atividade de mieloperoxidase (MPO) nas orelhas de
camundongos estimuladas com TPA
A atividade da enzima MPO foi utilizada como um marcador de infiltrado
neutrofílico em todos os grupos experimentais. Amostras da orelha dos animais foram
coletadas, pesadas e mantidas em tubos teste na presença de tampão fosfato [50
mmol/L, pH 6,0 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB)]. Cada
amostra foi homogeneizada e alíquotas do homogenato foram centrifugadas. Em
placa de 96 poços, alíquotas do sobrenadante foram adicionados à solução de di-
hidrocloreto de o-dianisidina (0,167 mg/mL em tampão fosfato 50 mmol/L contendo
0,005% de H2O2). As alterações nos valores de absorbância (460 nm) foram
registradas durante 180 segundos e os resultados foram expressos como unidades
de MPO (UMPO)/sítio de orelha, considerando-se que 1 UMPO se refere à quantidade
de enzima que degradada 1 µmol de H2O2/minuto (BRADLEY et al, 1982; CAMARGO
et al, 2008).
4.3.3 Determinação de IL-1β na orelha de camundongos estimuladas
com TPA.
As concentrações de IL-1β foram determinadas no homogenato das orelhas
(n=4-5) de camundongos estimuladas com TPA usando kit comercial
imunoenzimáticos (ELISA), segundo as instruções do fabricante (R&D systems). Os
valores foram expressos como pg de citocinas/mg de proteína.
16
4.3.4 Determinação da concentração de TBARS na orelha de
camundongos estimulada com TPA
Amostras de orelha de todos os grupos experimentais foram pesadas e
homogeneizadas em 10 volumes de solução de fosfato de potássio (50 mmol/L, pH
7,4) contendo butil-hidroxitolueno (BHT, 12,6 mmol/L). A seguir, alíquotas do
homogenato foram incubadas a 90°C durante 45 min com solução contendo TBA a
0,37%, em meio ácido (ácido tricloroacético a 15% e HCl a 0,25 mol/L). Após
incubação e posterior centrifugação (5 min, 8000xg), alíquotas dos sobrenadantes
foram extraídas com n-butanol e solução saturada de NaCl, seguido de centrifugação
(2 min a 8000xg). Logo após, alíquotas foram pipetadas em microplaca para leitura
dos valores de absorbância em leitor a 535 nm (corrigidos pelos valores de
absorbância a 572 nm). Os resultados foram expressos como nmol de MDA por mg
de tecido, utilizando-se para o cálculo o coeficiente de extinção molar de 1,55 x 105
L.mol-1.cm-1 (BOSE; SUTHERLAND; PINSKY, 1989).
4.3.5 Avaliação da capacidade antioxidante do EHVm pelo FRAP na
orelha de camundongos estimulada com TPA
Para avaliação da capacidade antioxidante do EHVm pelo potencial reducional
de ferro, a metodologia descrita por Benzie e Strain (1996) foi utilizada com pequenas
modificações. Amostras de orelha de todos os grupos experimentais foram pesadas e
homogeneizadas em 10 volumes de solução de fosfato de potássio (50 mmol/L, pH
7,4). Em placa de 96 poços foram adicionados alíquotas do homogenato, 9 µL de
EHVm (1, 3, 10, 30 ou 100 µg/mL), 27 µL de água destilada e uma solução contendo
tampão acetato (0,3 mol/L; pH 3,6), 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ; 10 mmol/L) e
cloreto férrico (Fe3Cl; 20 mmol/L). Durante 30 min a mistura reacional foi incubada a
37ºC por 30 min e posteriormente a absorbância foi mensurada a 595 nm. Para
calcular o FRAP do extrato foi gerada uma curva padrão de sulfato ferroso (FeSO4) e
usada a equação linear. O trolox (100 µg/mL) foi usado como controle positivo. Os
17
valores foram comparados como o meio reacional sem adição de extrato ou controle
positivo (sistema).
4.4 Análise Histológica de orelhas
A análise histológica das orelhas (n=8) foi realizada em colaboração com a Profa.
Dra. Rosilene Calazans Soares (Departamento de Morfologia da UFS). Para análise
histológica, o edema foi induzido conforme o item 4.3. Esta etapa foi realizada com
orelhas tratadas com a maior dose do EHVm (3,0 mg/orelha) ou do controle positivo
(dexametasona, 0,05 mg/orelha). Após a indução, o tecido da orelha foi
cuidadosamente retirado e fixado em solução de etanol (70%) por um período de 24
horas. Após este período, os tecidos foram retirados e conservados em formol (10%)
até o momento da realização dos cortes histológicos. Posteriormente, as orelhas
foram desidratadas, incluídas em parafina e em seguida seccionadas
transversalmente num micrótomo em cortes de 5 µm de espessura. Estes cortes foram
fixados em lâminas e corados com hematoxilina e eosina. As lâminas foram
visualizadas em microscópio óptico (Nikon, Tóquio, Japão) com aumento de 40x e
então fotografadas com o auxílio de uma câmera fotográfica (Nikon, Tóquio, Japão)
acoplada ao microscópio para análise de infiltrado inflamatório. Foram selecionadas 4
fotografias para os grupos Acetona e os grupos tratados com Dexametosa ou EHVm
e 10 fotografias para o grupo Veículo (CHIBLI et al., 2014).
4.5 Análise Estatística
Os dados foram expressos como média erro padrão da média. Estes foram
analisados quanto a normalidade de sua distribuição pelo teste de Shapiro-Wilk. Como
não houve impedimento para aplicação de testes paramétricos, os dados foram
analisados por análise da variância (ANOVA) de uma via, seguida pelo teste de Tukey.
Valores de p0,05 foram considerados significativos.
18
5. RESULTADOS
A ação tópica do EHVm foi testada utilizando o modelo de edema de orelha
induzido por TPA. Na figura 2 pode ser observado que a variação de massa da orelha
foi diminuída (p<0,001) pela coadministração de 3 mg/orelha de EHVm, bem como
com a coadministração de dexametasona (p<0,001) quando comparado aos animais
que receberam somente veículo. Também pode ser verificado que o tratamento com
as doses de 0,3 e 1 mg/orelha de EHVm não alterou a variação de massa da orelha
quando comparado ao grupo veículo.
p
es
o d
a o
re
lha
(m
g)
0
5
1 0
1 5
2 0
***
***
V e íc u lo 0 ,3 1 ,0 3 D e x a
E H V m (m g /o re lh a )
Figura 2. Efeito do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon (EHVm) na massa das
orelhas de camundongos. Os camundongos foram submetidos a inflamação da orelha induzida por
12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato, concomitantemente ao tratamento com EHVm ou dexametasona
(Dexa). A variação () do peso da orelha (n=6-8), mensurada 6 horas após a indução. ANOVA de uma
via F(4, 32) = 16,71, p<0,001, seguido do teste de Tukey ***p<0,001 vs. grupo tratado com veículo).
O efeito anti-inflamatório também foi analisado verificando-se a atividade da
enzima mieloperoxidase (MPO). A figura 3 mostra o aumento da atividade de MPO
após a administração de TPA (p<0,001) quando comparado as orelhas que receberam
19
apenas acetona. O tratamento com a dose de 3 mg/orelha do EHVm (p<0,01) ou 0,05
mg/orelha de dexametasona (p<0,001) diminuiu este parâmetro quando comparado
ao grupo veículo. Também pode ser verificado que o tratamento com as doses de 0,3
e 1 mg/orelha de EHVm não alterou a atividade de MPO nas orelhas quando
comparado ao grupo veículo. M
PO
(U
/sít
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0
1 0
2 0
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4 0
5 0
###
* *
* * *
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E H V m (m g /o re lh a )
T P A
Figura 3. Efeito do extrato hidroetanólico de Vaccinum macrocarpon (EHVm) na atividade da
mieloperoxidase (MPO) em orelhas de camundongos. Os camundongos foram submetidos a
inflamação da orelha induzida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), concomitantemente ao
tratamento com EHVm ou dexametasona (Dexa). A atividade de mieloperoxidase (MPO) (n=6-8) foi
mensurada 6 horas após a indução. ANOVA de uma via (F(5, 39) = 13,41, p<0,001) seguido do teste de
Tukey (###p<0,001 vs. grupo tratado com acetona; **p<0,01 ou ***p<0,001 vs. grupo tratado com
veículo).
Verificou-se também que a administração de TPA na orelha aumentou a
concentração de IL-1β (p<0,01) em comparação ao grupo acetona. A coadministração
de 3 mg/orelha de EHVm (p<0,05) ou dexametasona diminuiu a concentração desta
citocina (p<0,05), quando comparado ao grupo que recebeu veículo, como
demonstrado na figura 4.
20
p
es
o d
a o
re
lha
(m
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E H V m (m g /o re lh a )
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* *
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T P A
Figura 4. Efeito do extrato hidroetanólico de Vaccinum macrocarpon (EHVm) na concentração
de IL-1β nas orelhas de camundongos. Os camundongos foram submetidos a inflamação da orelha
induzida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), concomitantemente ao tratamento com EHVm
ou dexametasona (Dexa). A variação da concentração de IL-1β (n=4-5) foi mensurada 6 horas após a
indução. ANOVA de uma via (F(3, 15) = 8,34, p=0,0017), seguido do teste de Tukey (##p<0,01 vs. grupo
tratado com acetona; *p<0,05 vs. grupo tratado com veículo).
Complementarmente, foi realizada a análise histológica nas orelhas dos animais
dos diferentes grupos. No corte histológico do grupo acetona foi observado tecido sem
alterações morfológicas (Figura 5). Por sua vez, a aplicação de TPA nas orelhas
permitiu observar a presença de intenso infiltrado inflamatório rico em leucócitos
invadindo o tecido epitelial pavimentoso estratificado queratinizado de revestimento,
tecido conjuntivo e em região perianexial, caracterizando inflamação aguda além da
presença de tecido conjuntivo fibroso dérmico exibindo intenso edema intersticial e
grande quantidade de vasos sanguíneos capilares dilatados e congestos
(hiperemiados) (Figura 6 e Figura 7).
Nos animais em que houve a aplicação do TPA na presença de EHVm foi
observada a presença de infiltrado inflamatório, no entanto em menor intensidade em
tecido conjuntivo e ausência de infiltrado em região perianexial, com preservação dos
anexos cutâneos (Figura 8). No grupo tratado com dexametasona foi possível
evidenciar tecido epidémico exibindo características histomorfológicas usuais (Figura
9).
21
Figura 5. Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, aumento de 400x) das
orelhas de camundongos submetidas à aplicação de veículo (acetona). Tecido epidémico exibindo
características histomorfológicas normais mostrando anexos cutâneos, como glândulas sebáceas e
folículos pilosos bem preservados. GIS indica glândula sebácea, TcF indica tecido conjuntivo fibroso,
Cart representa o tecido cartilaginoso.
Figura 6. Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, aumento de 400x) das
orelhas de camundongos inflamadas com 12-O-tetradecanoiforbol-13-acetato (TPA). Em todas
as imagens é possível evidenciar intenso infiltrado inflamatório rico em polimorfonucleares (neutrófilos),
caracterizando inflamação aguda.
22
Figura 7. Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, E, F, aumento de 400x) das
orelhas de camundongos inflamadas com 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). A: intenso
infiltrado inflamatório agudo invadindo o tecido epitelial pavimentoso estratificado queratinizado de
revestimento, caracterizando exocitose neutrofílica; B: infiltrado inflamatório exibindo distribuição
perianexial; C: arteríola exibindo sinais morfológicos de vasculite, com acúmulo de neutrófilos na sua
luz; em destaque neutrófilo fazendo diapedese (transmigração); D: tecido conjuntivo fibroso dérmico
exibindo intenso edema intersticial; E: capilares dilatados e congestos (hiperemiados) e neutrófilos
viáveis (seta negra) e F: piócitos exibindo fragmentação nuclear (seta vermelha).
Figura 8. Imagens representativas de cortes histológicos (A, B, C, D, aumento de 400x) das
orelhas de camundongos inflamadas com 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e
submetidas ao tratamento concomitante com extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon
(EHVm). A, B e C: presença de infiltrado inflamatório agudo de menor intensidade no tecido conjuntivo;
D: ausência de infiltrado inflamatório em região perianexial.
23
Figura 9. Imagens representativas de corte histológicos (A, B, C, D, aumento de 400x) das
orelhas de camundongos inflamadas com 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e
submetidas ao tratamento concomitante com dexametasona. A e B: tecido epidémico exibindo
características histomorfológicas usuais. C e D: mostrando anexos cutâneos, como glândulas sebáceas
e folículos pilosos bem preservados, tecido conjuntivo fibroso rico em fibroblastos maduros, com
núcleos delgados e alongados e de cromatina densa (fibrócitos).
Também foi avaliado o efeito do extrato hidroetanólico da Vaccinium
macrocarpon (EHVm) nas alterações oxidativas em orelhas de camundongos
submetidos a inflamação por TPA. A figura 10 mostra que a administração de TPA
aumentou a peroxidação lipídica na orelha (p<0,001) quando comparado ao grupo
acetona. Além disso, a administração concomitante do EHVm, em todas as doses
testadas, diminuiu a lipoperoxidação (p<0,001) quando comparado ao grupo veículo
24
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A c e to n a V e íc u lo 0 ,3 1 ,0 3
E H V m (m g /o re lh a )
T P A
Figura 10. Efeito do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon (EHVm) na peroxidação
lipídica em orelhas de camundongos. Os camundongos foram submetidos a administração de 12-
O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), concomitantemente ao tratamento com EHVm. A formação do
malondialdeído (MDA) foi mensurada 6 horas após a indução (n=6 animais/grupo). ANOVA de uma via
( F(4, 25) = 18,28, p<0,001), seguido do teste de Tukey (###p<0.001 vs. grupo acetona; ***p<0.001 vs.
grupo tratado com veículo).
Na figura 11 está demonstrado que a administração do TPA diminuiu (p<0,001)
o poder antioxidante (FRAP) do tecido quando comparado ao grupo acetona. A
administração de EHVm, nas doses de 1 e 3 mg/orelha, aumentou o poder
antioxidante no tecido (p<0,01 ou p<0,001 respectivamente, quando comparado ao
grupo veículo).
25
FR
AP
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A c e to n a V e íc u lo 0 ,3 1 ,0 3
E H V m (m g /o re lh a )
T P A
Figura 11. Atividade antioxidante do extrato hidroetanólico da Vaccinium macrocarpon (EHVm)
pelo potencial reducional de ferro (FRAP). Os camundongos foram submetidos a administração de
12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), concomitantemente ao tratamento com EHVm. O potencial
reducional de ferro (FRAP) foi mensurado 6 horas após a indução (n=6 animais/grupo). ANOVA de uma
via (F(4, 25) = 96,14, p<0,001), seguido do teste de Tukey (###p<0.001 vs. grupo acetona; **p<0.01 ou
***p<0.001 vs. grupo tratado com veículo).
6. DISCUSSÃO
No presente estudo foram apresentados resultados acerca do efeito anti-
inflamatório do EHVm. O modelo escolhido para obter estes resultados foi a
inflamação de orelha induzida por TPA, que é um modelo útil para a avaliação de
compostos com potencial eficácia na terapia anti-inflamatória por via tópica. Esse
potente agente flogístico e promotor de tumor é capaz de induzir a inflamação cutânea
e hiperproliferação celular em animais, pela formação de produtos da ciclo-oxigenase
e lipoxigenase, bem como de histamina e serotonina, dentre outros mediadores
(BADILLA, B et al., 2007; FERREIRA, F et al., 2010). Estes mediadores contribuem
para a infiltração de neutrófilos, o aumento da permeabilidade vascular e a agregação
plaquetária na orelha, que se inicia dentro de 2 horas e se agrava nos tempos
posteriores (ZHANG et al., 2007). Uma vantagem deste modelo é a possibilidade de
aplicação das substâncias testes por via tópica, o que é importante para o screening
26
de substâncias com atividade anti-inflamatória (BOLLER, 2007). A aplicação por esta
via foi utilizada no presente estudo e permitiu observar a modulação da resposta
inflamatória pelo EHVm.
Dessa forma, com o uso deste modelo foi possível demonstrar que o EHvm
produziu efeito antiedematogênico (Figura 2), mensurado pela redução da massa dos
sítios da orelha o que corrobora estudo anterior demonstrando que o tratamento
sistêmico com o EHVm diminui o edema pancreático na dose de 200 mg/kg
(SANTANA et al.,2018). Concordantemente, foi demonstrado que o tratamento oral
com o extrato de frutos de Vaccinium macrocarpon reduziu a produção de
prostaglandinas in vitro e inibiu o edema da pata de camundongos induzido por
carragenina (NARDI et al., 2016) e que as frações de extrato de Vaccinium
macrocarpon com diferentes conteúdos de polifenóis (polifenóis de massa molecular
baixa, média ou alta) reduziram a expressão de TNF-α e IL-6 em células de
adenocarcinoma de cólon humano (Caco-2) (DENIS et al., 2015).
O edema está relacionado ao aumento da permeabilidade vascular e o
extravasamento de plasma para a região tecidual, fatores que envolvem a modulação
da produção de óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio, bradicinina,
prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias (AKINOSOGLOU; GOGOS, 2014). O
EHVm possui em sua composição uma expressiva concentração de flavonoides que
atuam modulando células envolvidas com a inflamação, inibindo a proliferação de
linfócitos T, inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α e
IL-1), modulando a atividade das enzimas da via do ácido araquidônico, tais como
fosfolipase A2, ciclo-oxigenase e lipoxigenase, além de modularem a enzima
formadora de óxido nítrico, a óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (LÓPEZ R.,et al
2008 ; KIM P., et al 2004). Assim, o efeito antiedematogênico do EHVm certamente é
dependente da redução da geração de mediadores inflamatórios como citocinas pró-
inflamatórias e pode ser atribuído, ao menos em parte, à ação dos compostos
fenólicos presentes neste extrato.
As citocinas também estão envolvidas na migração de leucócitos. Este
parâmetro foi avaliado pela medida da atividade de MPO nas orelhas, que foi reduzida
pela coadministração do EHVm. Este é um indicativo de inibição da migração de
neutrófilos para este tecido, pois a mieloperoxidase é uma enzima presente nos
27
grânulos azurófilos desta célula e é descrito que os polimorfonucleares podem ser
visualizados aderindo-se à parede do vaso em até 6 horas após a aplicação de TPA
(DE YOUNG et al, 1989).
Por conseguinte, o tratamento com 1,5% de pó de extrato seco de frutos de V.
macrocarpon (incorporado na dieta) reduziu a atividade de MPO no cólon de
camundongos submetidos a colite induzida por dextrano sulfato de sódio (XIAO et al.,
2015), bem como um tratamento profilático com cranberry (100 mg/kg) diminuiu a
atividade de MPO no coração de ratos submetidos à cardiotoxicidade induzida pela
doxorrubicina (ELBERRY et al., 2010). Este efeito antiquimiotático do EHVm poderia
resultar da modulação de moléculas de adesão que são representadas pelas
selectinas (E, P e L), imunoglobulinas, integrinas e glicoproteínas. As selectinas
participam do processo de rolagem, as integrinas do processo de aderência firme e a
a transmigração depende de imunoglobulinas como a PECAM-1 (ROBBINS et
al.,2000). A expressão dessas moléculas é regulada por fatores como as citocinas
pró-inflamatórias (CORLESS J., 2003), fazendo possível que a redução da atividade
de MPO esteja correlacionado a inibição da produção de citocinas.
Dentre os diversos mediadores pró-inflamatórios que coordenam a migração
celular para o sítio inflamatório inclui-se a IL-1β (GARIN et al, 2011; XIAO et al., 2015).
Interessantemente, foi observada menor concentração de IL-1β na orelha dos animais
estimulados com TPA na presença de EHVm. Infere-se desta maneira, que a
administração tópica do extrato de Vaccinum macrocarpon tem atuação inibitória
sobre a síntese ou liberação desse mediador, liberada por células como macrófagos
e linfócitos B. As concentrações séricas de IL-1β e interferon-γ e a expressão de RNA
mensageiro para TNF-α e IL-1β no cólon foram reduzidas pelo tratamento oral com
cranberry em camundongos submetidos a colite induzida por dextrano sulfato de sódio
(XIAO et al., 2015). Além disso, estudos na doença periodontal mostram redução de
parâmetros inflamatórios mediados por tais citocinas no tratamento com cranberry
(BODET et al., 2006).
Os resultados mostrando efeitos antiedematogênico, antiquimiotático e de
redução de IL-1β são indicativos do efeito anti-inflamatório do EHVm após aplicação
tópica. Para amparar estes resultados, foi conduzida a análise histológica. Esta
análise corroborou principalmente a redução da resposta inflamatória, uma vez que
28
como demonstrado na figura 8, a aplicação do TPA concomitante ao EHVm, levou a
um infiltrado inflamatório agudo de menor intensidade no tecido conjuntivo e a
ausência de infiltrado inflamatório em região perianexial, quando comparado ao grupo
tratado apenas com TPA (figura 6 e 7).Os resultados apresentados estão de acordo
com os achados do MPO e do edema de orelha aqui demonstrados, uma vez que
verificou-se em ambos um menor infiltrado neutrofílico após tratamento com EHVm.
Assim, pode-se inferir que o EHVm diminui características aguda da resposta
inflamatória na orelha dos animais, mas os mecanismos envolvidos nestes efeitos
precisam ser melhor elucidados. Neste sentido, considerando-se que o EHVm possui
compostos com atividade antioxidante (SANTANA et al., 2018), foi proposto que o
efeito anti-inflamatório estivesse associado ao efeito antioxidante deste extrato. Em
relação a este efeito, o extrato utilizado no presente estudo foi avaliado quanto ao seu
efeito antioxidante in vitro.
SANTANA et al. (2018) demonstraram que o tratamento com o EHVm nas doses
de 50, 100 e 200 mg/kg reduziu os produtos de peroxidação lipídica, em particular o
MDA, em modelo de pancreatite (tecido pancreático), o que também ocorreu no tecido
pulmonar. No presente estudo também foi verificado o efeito do EHvm em parâmetros
que inferem sobre as alterações oxidativas, para correlaciona-las com o efeito anti-
inflamatório. O tratamento concomitante com EHVm levou a diminuição da
peroxidação lipídica (figura 10) e aumento do potencial redutor do ferro (figura 11). É
interessante observar que apesar das doses de 0,3 e 1 mg/orelha não terem reduzido
o edema e a atividade de MPO, estas produziram efeito significativo na peroxidação
lipídica (ambas) ou no potencial reducional de ferro (apenas 1 mg/orelha). As razões
para estas diferenças não são claras, mas as mesmas indicam que a relação entre as
alterações oxidativas e inflamatórias induzidas pelo TPA na orelha podem não ocorrer
na mesma magnitude, ou seja, apesar das doses menores diminuírem a
lipoperoxidação e o FRAP, isso não resultou em efeito anti-inflamatório mensurável
pelos desfechos utilizados neste estudo.
As membranas e organelas celulares contém grande quantidade de lipídios poli-
insaturados que podem ser alvos de reações de oxidação, podendo levar a processos
de morte celular e inflamação (PIZZIMENTI et al 2010). Não apenas a aplicação de
TPA induziu estes processos, mas também a aplicação de EHVm impediu que
29
peroxidação ocorresse nas orelhas. Os dados encontrados no presente trabalho
concordam com trabalhos da literatura, o qual demonstra que o extrato aquoso do
cranberry apresentou inibição na produção das espécies reativas ao ácido tiobarturico
in vitro (ABEYWICKRAMA et al., 2016). In vivo, observa-se que a administração
durante 10 dias do extrato metanólico de cranberry nas doses de 50 e 200 mg/kg
reduziu a peroxidação lipídica no fígado e que a dose de 200 mg/kg reduziu a
lipoperoxidação na pata após injeção de carragenina (NARDI et al., 2016).
A capacidade redutora do ferro, uma avaliação baseada na produção do íon Fe2+
(forma ferrosa) a partir da redução do íon Fe3+ (forma férrica) presente no complexo
2,4,6- tripiridil-s-triazina (TPTZ) (THAIPONG, et al., 2006), é um parâmetro de
importância, pois os íons ferro são muito ativos em reações de óxido-redução, o que
os caracteriza como potentes catalisadores das reações de geração de radicais livres,
em condições de estresse oxidativo. A participação desses metais se dá, de maneira
especial, por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss. A primeira é referente à
geração de radical OH•, por meio da reação do H2O2 com os íons em questão, em
seguinte, estes íons catalisam a reação entre o H2O2 e o radical O2•, a fim de gerar,
da mesma forma, o radical OH•, que por sua vez reage rapidamente com moléculas
como lipídeos, proteínas ou bases de DNA (SONEJA et al.,2005). Sendo assim,
quanto maior a redução do ferro, menor será o potencial para ocasionar danos
celulares.
Em conjunto, os dados que mostram a reversão total (lipoperoxidação) ou parcial
(potencial reducional) de alterações oxidativas pelo EHVm indicam que a redução do
estresse oxidativo pode ter contribuído para a redução do processo inflamatório. Neste
sentido infere-se que os efeitos acima mencionados possam estar associados aos
compostos presentes no EHVm. Como demonstrado por PAREDES et al., 2010, o
cranberry possui em sua composição diversos compostos, entre eles vitaminas,
ácidos orgânicos como o ácido málico, quínico, cítrico e benzoico e compostos
fenólicos, sendo que a Vaccinium macrocarpon é uma das espécies com maior
quantidade de compostos fenólicos na sua composição (Szajdek & Borowska, 2008).
No EHVm utilizado no presente estudo foram identificados
sete compostos (três flavan-3-ols, um flavonol e três antocianinas). Os principais
compostos foram catequina e epicatequina. As principais antocianinas foram
30
cianidina-3-O-glicosídeo, seguido por cianidina-coumaroil-hexosídeo, ambos com
íons moleculares característicos de cianidina. O conteúdo total de flavonóides foi de
875,65 mg / 100 g, onde o flavan-3-ol contribuiu com 93,3%, seguido do flavonol
(4,3%) e antocianinas (2,4%) (SANTANA et al., 2018).
Tais compostos são considerados responsáveis por conferir as propriedades que
o EHVm possui, principalmente as antocianidinas, as proantocianidinas e os flavonóis
(Pardo et al., 2017). É mostrado na literatura que este último apresenta significativa
ação anti-inflamatória, que pode ser atribuída a sua capacidade de inibir as vias de
ciclo-oxigenase e lipoxigenase, as quais desempenham um papel importante na
geração de mediadores inflamatórios (YOON et al., 2005). Ademais relata-se também
o potencial das antocianinas de inibirem a liberação e síntese de substâncias
endógenas, que promovem inflamação como a histamina, TNF-α, IL-1β e IL-6, entre
outras, principalmente pela inibição da ativação da via do NF-κB (KARLSEN et al.,
2007; ABED et al., 2012) e sua capacidade antioxidante, uma vez que estas podem
participar na doação de hidrogênio ou elétrons, e também possui radicais
intermediários estáveis, que impedem a oxidação (GOBBO. et al., 2007).
De Melo et al. (2009) avaliaram alguns flavonóis individualmente quanto à
atividade anti-inflamatória em camundongos (10 mg/kg, via oral) no teste de migração
leucocitária induzida por carragenina. Na dose testada, esses flavonoides inibiram a
migração leucocitária em até 49,7%. Concomitantemente verificou-se que alguns
flavonoides encontrados na planta medicinal Eleusine indica (Poaceae), conhecida
popularmente como capim pé-de-galinha na dose de 400 µg/kg reduziram em até 80%
o influxo de neutrófilos pulmonares em camundongos expostos a aerossóis de
lipopolissacarideo (LPS), em um modelo que mimetiza a inflamação pulmonar (DE
MELO et al., 2005).
Conjuntamente, os resultados obtidos corroboram dados da literatura e sugerem
que o extrato da Vaccinum macrocarpon possui ação anti-inflamatória por via tópica,
derivada provavelmente de sua capacidade em diminuir a migração celular e reduzir
a formação de mediadores inflamatórios e atuação na redução das alterações
oxidativas. Sendo necessário estudos complementares de toxicidade e possíveis vias
alternativas de ação.
31
7. CONCLUSÃO
Diante dos resultados apresentados foi possível concluir que o EHVm possui
atividade anti-inflamatória e atenua alterações oxidativas em orelhas de
camundongos.
Este fato sugere que o EHVm pode ser uma possível alternativa terapêutica
futura no tratamento tópico da inflamação, a medida em que novos estudos forem
sendo delineados para avaliar a toxicidade deste extrato e mecanismos subjacentes
ao seu efeito anti-inflamatório.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
COORDENAÇÃO DE PESQUISA
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS (CEPA)
CERTIFICADO (2º VIA)
Certificamos que a proposta intitulada “Avaliação da atividade anti-inflamatória,
antinociceptiva e antioxidante do extrato de cranberry (vaccinium macrocarpon)",
registrada com o nº 66/2017, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Enilton Aparecido
Camargo que envolve a produção, manutenção ou utilização de animais pertencentes ao filo
Chordata, subfilo Vertebrata (exceto humanos), para fins de pesquisa científica encontra-se de
acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, do Decreto nº 6.899, de
15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovada pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS (CEUA) da Universidade Federal de Sergipe, em reunião de 15/01/2018.
Finalidade ( ) Ensino (X ) Pesquisa Científica
Vigência da autorização Início:02/2018, Término: 12/2019
Espécie/linhagem/raça Camundongo heterogênico
Nº de animais 704
Peso/Idade 20-30g / 2-3 meses
Sexo M
Origem
Biotério Setorial do Departamento de
Fisiologia
Prof. Dr. JOSEMAR SENA
BATISTA
Coordenador do CEPA/UFS
Cidade Universitária “Prof. Aloísio de
Campos” Jardim Rosa Elze – São
Cristóvão – SE 49100-000
ANEXO A