Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Centro de...
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Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Centro de Ciências BiológicasPrograma de Bolsas REUNI
Florianópolis, 23 de novembro de 2010
Proteômica
Proteômica
A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.
Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico.
Tempo
Espaço
Núcleo
Citoplasma
Membrana
Proteômica
Proteômica
Proteômica sistemática: mapa protéico
Tecidos
Células
Compartimentos celulares
Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência
Desenvolvimento
Interações entre microorganismos e hospedeiros
Tratamentos
Proteômica
Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer
1999 Proteoma do cérebro de camundongo
2006 Proteoma do hipocampo de camundongo
2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos
2005 Proteoma do cérebro de rato
2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício
2004 Proteoma de hipocampo humano
2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas
Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano
2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo
Revistas
Etapas metodológicas
Tratamento do animal
Extração das proteínas
Espectrometria de massa
Digestão in gel
Focalização isoelétrica
Principais etapas metodológicas
Eletroforese em gel 2-DE
Isolamento de proteinas
Extração da amostra
Tampão de lise:
25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS 0,5 M NaCl 5% glicerol (v/v) 1 mM PMSF
Lise mecânica da célula
Centrifugação 30 min a 12000 x g a 4º C
Proteínas nucleares
Proteínas citoplasmáticas
Proteínas membranares
Precipitado é re-extraído
SN1+ SN2
Homogenato de ptns em gelo por 20 min
Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento.
Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para evitar perda protéica.
Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit
Solução com Íon cúprico (Cu+1)
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Agente colorimétrico
Cu+1
Cu+1 480 nm
Proteínas totais
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA.
Limpeza da amostra com Clean up Kit
100 ug /ul de proteína
Solução precipitante
Centrifugação
Baseada na precipitação por TCA
Diversas moléculas são eliminadas:
-DNA, lipídeos
- Sais, detergentes
Pellet de Proteína pura
Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação:
7 M Uréia
2 M Tiuréia
2%(p/v) CHAPS
0.5% de IPG buffer pH 3-10
18 mM DTT
0,001% azul de bromofeno
MÉTODOS BCA:
Agentes redutores: DTT
Solubilização da amostra
Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia
Agentes Surfactantes: CHAPS
Hidratação do strip
Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10
Strips foram removidos
Cerâmica IEF Strips foram posicionados
Paper Pads umedecidos
Total: 15500 V/h e 25 uA/strip
Ettan IPGphor 3 Ajuste dos eletrodos
Focalicalização isoelétrica (IEF)
Separação das proteínas por pI
Gel poliacrilamida 12,5%
Cuba vertical Hoefer SE Ruby
Separação das ptns por massa
Proteínas separadas por pI e massa
1º DTT
2º Iodoacetamida
Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h
Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora
Eletroforese em gel bidimensional (2D)
Análise simultânea de diversas proteínas. Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.
Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D
Análise das imagens no gel
Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)
Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa
Presença ou Ausência de spots
Digestão in gel
Descoloração:
25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila
Tripsinização
(entre os resíduos de lisina e arginina)
Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético
Peptídeos são secos à vácuo
Estocagem a -20ºC
Excisão dos spots
Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.
Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.
Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.
Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa
Amostras 2-DE
Fonte de ionização
Analisador de massa
Detector
Sistema à vácuo
Peptídios são ionizados
Os íons são dessorvidos
Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos
Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4-hidroxicinâmico
Espectômetro de Massa
Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética
Colisão dos íons ao detector
Espectômetro de Massa
As massas dos fragmentos são separadas e detectadas
As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo
Espectômetro de Massa
Identificação de cada proteína do mapa proteômico
Proteômica
Array-based protein interaction detection
Array-based protein interaction detection
Protein microarrays
Proteomicworld.com