UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA · certeza meus dias foram muito mais felizes com a...
248
Priscila Missio da Silva CARACTERIZAÇÃO E ESTABILIDADE DE COMPOSTOS QUÍMICOS EM MÉIS DE ABELHAS Apis mellifera L. PRODUZIDOS NO ESTADO DE SANTA CATARINA Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito final à obtenção do título de Doutor em Ciência dos Alimentos, sob orientação da Profª Drª Roseane Fett. Florianópolis 2016
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA · certeza meus dias foram muito mais felizes com a...
Priscila Missio da Silva
CARACTERIZAÇÃO E ESTABILIDADE DE COMPOSTOS QUÍMICOS EM MÉIS DE ABELHAS Apis mellifera L. PRODUZIDOS NO ESTADO DE SANTA CATARINA
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito final à obtenção do título de Doutor em Ciência dos Alimentos, sob orientação da Profª Drª Roseane Fett.
Florianópolis 2016
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
da UFSC.
Da Silva, Priscila Missio Caracterização e Estabilidade de Compostos Químicos em Méis de Abelhas Apis mellifera l. Produzidos no Estado de Santa Catarina / Priscila Missio da Silva ; orientadora, Roseane Fett. - Florianópolis, SC, 2016. 248 p. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. Inclui referências 1. Ciências dos Alimentos. 2. Mel. 3. Padrão de identidade e qualidade. 4. Atividade antioxidante. 5. Degradação. I. Fett, Roseane. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. III. Título.
CARACTERIZAÇÃO E ESTABILIDADE DE COMPOSTOS
QUÍMICOS EM MÉIS DE ABELHAS Apis mellifera L. PRODUZIDOS NO ESTADO DE SANTA CATARINA
Por
Priscila Missio da Silva
Esta tese foi julgada adequada para a obtenção do Título de “Doutorado em Ciência dos Alimentos”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciênica dos Alimentos.
Florianópolis, 02 de dezembro de 2016.
______________________________________ Prof. (a) Dr. (a) Ana Carolina de Oliveira Costa
Coordenadora Banca Examinadora:
____________________ Profª Drª Roseane Fett.
______________________________________ Prof. (a) Dr. (a) Maria Beatriz de Abreu Glória
Membro (UFMG) _______________________________________________ Prof. (a) Dr. (a) Regilda Saraiva dos Reis Moreira Araújo
Membro (UFPI) ________________________________ Prof. (a) Dr. (a) Edna Regina Amante
Membro (UFSC) ____________________________ Prof. (a) Dr. (a) Jane Mara Block
Membro (UFSC) __________________________________________ Prof. (a) Dr. (a) Marilde Terezinha Bordgnon Luiz
Membro (UFSC)
AGRADECIMENTS
A Deus por colocar em meu caminho oportunidades e me dar
força para alcançar meus objetivos. Aos meus pais, Nibalton e Arlete, ao meu irmão Wagner e a minha
cunhada Franciele pelo apoio, compreensão, dedicação e esforços que fizeram por mim. Amo vocês!
Aos meus avós e tios que sempre me deram força para seguir com meus estudos e nunca me abandonaram nos momentos em que mais precisei.
A Universidade Federal de Santa Catarina e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos pela estrutura física e profissional.
À profª Drª Roseane Fett, minha orientadora, por me proporcionar a oportunidade de participar do seu laboratório de pesquisas. Seu apoio e confiança foram muito importantes, pessoal e profissionalmente, sempre auxiliando, apoiando e buscando sempre o melhor para seus alunos.
Ao Luciano Gonzaga, pela atenção, colaboração e disponibilidade, sempre com paciência e calma, me orientou da melhor forma possível para a realização deste trabalho. Tenho grande admiração pela forma que trabalha, demonstrando entusiasmo e amor pela pesquisa.
As professoras Ana Carolina de Oliveira Costa e Graciele da Silva Campelo Borges por seus ensinamentos, experiência e amizade construídos ao longo destes anos.
À minha primeira família em Florianópolis, Fabíola e Fabiana, e as demais irmãs que fomos encontrando, Saionara, Roberta e Daniele. Obrigada pela amizade, companheirismo,confiança e solidariedade. Com certeza meus dias foram muito mais felizes com a presença de vocês. Amo-as!
Ao Julio, pelo carinho e apoio, que tornaram esta fase final um pouco mais leve e tranquila. Obrigada por vibrar comigo a cada etapa concluída do trabalho.
À Carol, pela força, amizade e apoio que foram indispensáveis nestes últimos meses de doutorado.
À Méri e ao Rodrigo, minha família de Rio Grande. Obrigada pela amizade, carinho e apoio, que mesmo distante, é mantida ao longo dos anos.
A todos os amigos do Laboratório de Química de Alimentos: Fabiana, Fabíola, Roberta, Andressa, Mônia, Greici, Bibiana, Mayara, Bruno, Franciele, Siluana, Patrícia e Gisele, em especial a Mônia e a
Mayara, pela amizade, conselhos e ensinamentos os quais contribuíram muito para minha vida pessoal e profissional.
As minhas ajudantes, Letícia, Laís, Bruna e Ana, obrigada pela amizade construída e por sempre estarem dispostas a ajudar na realização das análises.
Aos professores Gustavo Amadeu Micke e Luciano Vitali por disponibilizar o laboratório e auxiliar nas análises dos compostos fenólicos.
À profª Drª Maria Beatriz de Abreu Glória, por aceitar ser a relatora deste trabalho.
As professoras Regilda Saraiva dos Reis Moreira Araujo, Edna Regina Amante, Jane Mara Block, Marilde Terezinha Bordignon Luiz e Carmen Maria de Olivera Müller por aceitarem fazer parte da minha banca de defesa de doutorado.
Aos apicultores, pelas amostras de mel concedidas. Agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma maneira
para realização deste trabalho. "Cada um que passa na nossa vida passa sozinho, pois cada
pessoa é única. Mas não vai só, leva um pouco de nós e deixa um pouco de si. Esta é a maior responsabilidade de nossa vida e a prova evidente que duas almas não se encontram por acaso." (Antoine de Saint-Exupéry)
SILVA, P. M. da. Caracterização e estabilidade de compostos químicos em méis de abelhas Apis mellifera L. produzidos no estado de santa catarina. 2016. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. 244 p.
RESUMO O mel é um dos alimentos doces mais antigos e tradicionais do mundo. É composto majoritariamente por açúcares, como a glicose e a frutose; além de água, e outras substâncias, tais como proteínas, aminoácidos, ácidos orgânicos, vitaminas, minerais, ácidos fenólicos, flavonóides e uma grande variedade de compostos aromáticos e partículas sólidas provenientes sua colheita, sendo que, sua composição, cor, aroma e sabor dependem, principalmente, das floradas, das regiões geográficas de produção, do clima e da espécie de abelha. Estes compostos presentes nos méis podem sofrer alterações ao longo do tempo, transformando-se em hidrocarbonetos, compostos aromáticos, ácidos, terpenóides, cetonas, aldeídos, ésteres e álcoois. Considerando estas possibilidades de alterações, este estudo objetiva monitorar os compostos químicos presentes em amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. produzidas em 8 diferentes parques apícolas do estado de Santa Catarina, avaliando os padrões de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e individuais e compostos voláteis, avaliando a estabilidade química das amostras na busca de possíveis marcadores de degradação. Na primeira fase do estudo foi realizada análise prévia das amostras para seleção, e selecionadas amostras que atenderam aos parâmetros de identidade e qualidade. As amostras selecionadas seguiram para armazenamento doméstico simulado por um período de 540 dias, e, em intervalos de 90 dias, foram avaliados os parâmetros de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos e compostos voláteis, por meio da análise de componentes principais (PCA), para verificar possíveis agrupamentos das amostras quanto aos parâmetros monitorados ao final do armazenamento. Os resultados mostram que a análise prévia, para seleção das amostras, revelou que algumas delas apresentaram parâmetros, como umidade e acidez livre, em desacordo com o permitido pela legislação brasileira, Codex Alimentarius e União Europeia. Com relação ao comportamento das amostras selecionadas ao longo dos 540 dias de armazenamento, os açúcares, o pH, a condutividade elétrica, a atividade diastásica e a cor
diminuíram, contudo, a acidez e a umidade aumentaram em níveis baixos, com destaque apenas para a amostra B, com percentual de umidade acima do permitido pelas legislações brasileira e internacionais. Quanto aos compostos fenólicos totais e atividade antioxidante, os valores aumentaram durante o período estudado, em cerca de 100 % e 50 %, respectivamente. Foram identificados e quantificados, via cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas em tandem, 22 compostos fenólicos: 12 ácidos fenólicos, 1 cumarina e 9 flavonóides, sendo o ácido ρ-cumárico o composto fenólico encontrado em maior concentração, na maioria das amostras. No que se refere aos compostos voláteis, a maioria das amostras apresentou o mesmo comportamento durante o período de armazenamento, 23 destes foram considerados majoritários e monitorados ao longo do período, dentre eles, destacaram-se os terpenos óxidos de cis e trans linalol e hotrienol que podem ser indicados como marcadores de qualidade/degradação dos méis de Apis mellifera L. durante o armazenamento. A análise de PCA das amostras mostrou que as mesmas classificaram-se e diferenciaram-se quanto às regiões, sobressaindo em relação ao número de compostos fenólicos encontrados na amostra C e aos valores de abundância encontrados nos compostos voláteis da amostra G, não sendo possível diferenciá-las quanto ao tempo de armazenamento. Pode-se concluir que, o armazenamento doméstico simulado, durante 540 dias, alterou as concentrações dos compostos químicos presentes em todas as amostras seguindo o mesmo padrão de degradação, visto que as amostras não se separaram quanto ao tempo de armazenamento. Palavras-chave: Mel; Padrão de identidade e qualidade; Atividade antioxidante; Degradação; Compostos voláteis; Marcadores.
ABSTRACT
Honey is one of the oldest and most traditional sweet foods in the world. It is composed mostly of sugars, such as glucose and fructose, in addition to water, and other substances such as proteins, amino acids, organic acids, vitamins, minerals, phenolic acids, flavonoids and a wide variety of aromatic compounds and solid particles from their harvest; Mainly depend on flowering, geographic regions of production, climate and bee species. These compounds present in the honeys can undergo changes over time, transforming themselves into hydrocarbons, aromatic compounds, acids, terpenoids, ketones, aldehydes, esters and alcohols. Considering these possibilities of alterations, this study aims to monitor the chemical compounds present in honey samples of Apis mellifera L. bees produced in 8 different bee parks in the state of Santa Catarina, evaluating the patterns of identity and quality, antioxidant activity, total phenolic compounds and individual and volatile compounds, evaluating the chemical stability of the samples in the search for possible markers of degradation. In the first phase of the study, previous samples were analyzed for selection, and samples were selected that met the parameters of identity and quality. The selected samples were followed for simulated domestic storage for a period of 540 days, and at intervals of 90 days the parameters of identity and quality, antioxidant activity, phenolic compounds and volatile compounds were evaluated, which were evaluated through the analysis of components (PCA), to verify possible groupings of the samples for the parameters monitored at the end of storage. The results show that the previous analysis, for sample selection, revealed that some of them presented some parameters, such as moisture and free acidity, in disagreement with what is allowed by Brazilian legislation, Codex Alimentarius and European Union. Regarding the behavior of the selected samples during the 540 days of storage, sugars, pH, electrical conductivity, diastase activity and color decreased their concentrations, however, acidity and humidity increased at low levels, with emphasis only For the sample of region B, with humidity percentage higher than allowed by Brazilian and international legislation. As for total phenolic compounds and antioxidant activity, concentrations increased during the study period, by about 100 % and 50 %, respectively. Twenty-two phenolic compounds: 12 phenolic acids, 1 coumarin and 9 flavonoids were identified and quantified, coupled to tandem mass spectrometry. The ρ-cumaric acid was the phenolic compound found in the highest concentrations, in most samples. As for
volatile compounds, the majority of the samples presented the same behavior during the storage period, where 23 volatile compounds were considered major and monitored throughout the period, among them, the terpenes oxides of cis and trans linalol and hotrienol which may be indicated as degradation markers of Apis mellifera L. honeys during storage. The PCA analysis of the samples showed that they were classified and differentiated in terms of the regions, standing out in relation to the number of phenolic compounds found in the sample of region C and to the values of abundance found in the volatile compounds of the sample of region G, and it is not possible to differentiate them in terms of storage time. It can be concluded that simulated domestic storage for 540 days altered the concentrations of the chemical compounds present in all samples following the same degradation pattern as the samples did not separate for storage time. Keywords: Honey; Parameters of identity and quality; Antioxidant activity; Degradation; Volatile compounds; Markers.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Formação do HMF a partir da sacarose. ................................ 46 Figura 2. Formação de ácido glucônico a partir da glicose. .................. 51 Figura 3. Produção de ácidos a partir de hexoses. ................................. 54 Figura 4. Estrutura química dos ácidos fenólicos. ................................. 59 Figura 5. Estrutura química dos flavonoides. ........................................ 60 Figura 6. Esquema proposto para a formação de 5-hidroximetilfurfural. ............................................................................................................... 72 Figura 7. Relações entre terpenos. ......................................................... 73 Figura 8. Compostos derivados a partir do ácido chiquímico. .............. 75 Figura 9. Oxidação da D-glicose catalisada pela glicose oxidase ....... 113 Figura 10. Eletroferogramas do mel F, no tempo zero (a) e no tempo 6 (b) ........................................................................................................ 121 Figura 11. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra A, de mel de Apis mellifera L., do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 168 Figura 12. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra B de mel de Apis mellifera L., do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 171 Figura 13. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra C de mel de Apis mellifera L., do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 175 Figura 14. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra D de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 180 Figura 15. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra E de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 183 Figura 16. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra F de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 186 Figura 17. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra G de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo da armazenagem por 540 dias ..................... 189 Figura 18. Comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra H de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .................. 193
Figura 19. Comportamento do óxido de cis-linalol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina ................................................. 197 Figura 20. Comportamento do óxido de trans-linalol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina ................................................. 198 Figura 21. Comportamento do hotrienol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina ................................................................................ 198 Figura 22. Análise dos componentes principais para os compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. ............................... 201 Figura 23. Análise dos componentes principais para os padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L ........................................................................................... 204 Figura 24. Análise dos componentes principais para os compostos fenólicos e voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. durante armazenamento ................................................................................... 208
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Produção mundial de mel (toneladas) entre os anos de 2006 a 2012. ...................................................................................................... 31 Tabela 2. Produção de mel (toneladas) nas 5 regiões brasileiras no período de 2009 a 2015. ........................................................................ 33 Tabela 3. Composição de açúcares em méis de diferentes regiões. ...... 43 Tabela 4. Composição de aminoácidos em méis de diferentes regiões. 48 Tabela 5. Composição de ácidos orgânicos em méis de diferentes regiões. .................................................................................................. 53 Tabela 6. Composição de minerais em méis de diferentes regiões. ...... 57 Tabela 7. Composição de compostos fenólicos presentes em méis de diferentes regiões................................................................................... 62 Tabela 8. Descrição geográfica dos municípios catarinenses de origem das amostras de mel, selecionados após análise .................................... 87 Tabela 9. Parâmetros do espectrômetro de massas obtidos pela infusão dos padrões de compostos fenólicos individualmente ........................... 93 Tabela 10. Umidade, 5-HMF, acidez e data de coleta das amostras de mel de Apis mellifera L. antes da triagem e seleção .............................. 95 Tabela 11. Concentrações de sacarose, frutose e glicose (g 100 g-1) determinadas nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo .................................................................... 96 Tabela 12. Características físico-químicas de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo ................................................. 98 Tabela 13. Atividade diastásica e concentração de 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) em amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo ....................................................................................... 101 Tabela 14. Parâmetros referentes à cor, determinados nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L., selecionadas para o estudo ............. 103 Tabela 15. Concentrações de frutose, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ......................................................................................... 105 Tabela 16. Concentrações de glicose, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ......................................................................................... 106 Tabela 17. Soma das concentrações de frutose e glicose das amostras de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento ........................ 108 Tabela 18. Proporções entre as concentrações de frutose e glicose das amostras de mel de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento ................................................................................... 109
Tabela 19. Concentrações de sacarose (g 100 g-1) das amostras de mel de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento ................... 110 Tabela 20. Umidade, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ............. 112 Tabela 21. Acidez, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ............. 115 Tabela 22. pH, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ................. 117 Tabela 23. Atividade diastásica, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ...................................................................................................... 119 Tabela 24. Condutividade elétrica (µS cm-1), nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ............................................................... 123 Tabela 25. Parâmetro L* (Luminosidade), nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ......................................................................................... 125 Tabela 26. Parâmetro a*, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .. 128 Tabela 27. Parâmetro b*, nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ...................................................................................................... 130 Tabela 28. Concentrações dos compostos fenólicos totais, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ............................................................... 132 Tabela 29. Poder redutor, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias .. 133 Tabela 30. Capacidade de inibição do radical DPPH, nas amostras de mel Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias ............................................................... 134 Tabela 31. Compostos fenólicos identificados e quantificados no mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina .................................... 136 Tabela 32. Regressão linear, coeficiente de determinação (R2), limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ) utilizados para os compostos fenólicos previamente identificados .................................. 137 Tabela 33. Compostos fenólicos identificados e quantificados nas amostras de mel de Apis mellifera L. produzidas no estado de Santa Catarina ............................................................................................... 138 Tabela 34. Concentrações de compostos fenólicos (µg g-1) do mel de Apis mellifera L. de cada amostra do estado de Santa Catarina, ao longo de 450 dias de armazenamento quantificados no estudo ..................... 140
Tabela 35. Descrição geográfica dos municípios catarinenses de origem das amostras de mel, selecionados após análise .................................. 157 Tabela 36. Parâmetros do espectrômetro de massas obtidos pela infusão dos padrões de compostos fenólicos individualmente ......................... 162 Tabela 37. Tempo de retenção e índice de retenção dos compostos voláteis encontrados nas amostras de mel de Apis mellifera L. .......... 166 Tabela 38. Correlação entre os compostos voláteis do mel de Apis mellifera L. .......................................................................................... 199 Tabela 39. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos compostos voláteis das amostras de mel de Apis mellifera L.............. 202 Tabela 40. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. ...................................................................... 206 Tabela 41. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos compostos fenólicos e voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. ............................................................................................................. 210
LISTA DE ABREVIATURAS
aw Do inglês: Water activity (Atividade de água) BGE Do inglês: Background electrolyte (eletrólito de corrida) CE Do inglês: Capillary electrophoresis (Eletroforese
capilar) CEC Do inglês: Capillary electrochromatography
(Eletrocromatografia capilar) CIEF Do inglês: Capillary isoelectric focusing (Focalização
isoelétrica capilar) CITP Do inglês: Capillary isotachophoresis (Isotacoforese
capilar) CZE Do inglês: Capillary zone electrophoresis (Eletroforese
capilar de zona) DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila EAG Equivalentes a ácido gálico ENE Escurecimento não-enzimático FAAS Do inglês: Flame atomic absorption spectrometry
(Espectrometria de absorção atômica com chama) FAO Do inglês: Food and Agriculture Organization FRAP Do inglês: Ferric Reducing Antioxidant Potential G/A glicose e a água GC/MS Do inglês: Gas chromatography - mass spectrometry
(Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas)
GCE Do inglês: Capillary gel electrophoresis (Eletroforese capilar em gel)
HMF Hidroximetilfurfural HPAEC-PAD
Do ingles: High - performance anion exchange chromatography - pulsed amperometric detection (cromatografia de permuta aniônica de alta performance com detecção amperométrica pulsada)
HPLC Do inglês: High - performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta eficiência)
HPLC-RP Do inglês: High - performance liquid chromatography - reverse fase (cromatografia líquida de alta eficiência - fase reversa)
HPLC/PDA Do inglês: High - performance liquid chromatography - Photodiode array detector (Cromatografia líquida de alta eficiência com matriz de fotodiodo)
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ICP-MS Do inglês: Inductively coupled plasma mass
spectrometry (Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado)
ICP-OES Do inglês: Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (Espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado)
LDL Do inglês: Low - density lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade)
LC-MS/MS Do inglês: Liquid chromatography - tandem mass spectrometry (Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem)
ROS Do inglês: Reactive oxigen species (espécies reativas em oxigênio)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................23 2 OBJETIVOS......................................................................................27 2.1 Objetivo geral...................................................................................27 2.2 Objetivos específicos........................................................................27 CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................29 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................31 1.1 PRODUÇÃO DE MEL....................................................................31 1.2 DEFINIÇÃO, CLASSIFICAÇÃO E PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE DO MEL...........................................34 1.2.1 Definição e classificação do mel..................................................35 1.2.2 Parâmetros de identidade e qualidade do mel..........................36 1.3 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS PRESENTES NO MEL..........................................................................42 1.3.1 Açúcares.......................................................................................42 1.3.2 Proteínas.......................................................................................46 1.3.3 Ácidos orgânicos..........................................................................52 1.3.4 Vitaminas......................................................................................55 1.3.5 Minerais........................................................................................55 1.3.6 Compostos fenólicos....................................................................58 1.3.7 Compostos voláteis......................................................................65 1.4 ESTABILIDADE DOS COMPOSTOS PRESENTES NO MEL DURANTE O ARMAZENAMENTO...................................................67 1.4.1 Fatores que influenciam a degradação do mel..........................68 1.4.2 Possíveis compostos suscetíveis à degradação no mel..............71 1.5 POSSÍVEIS FORMAS DE EVITAR A DEGRADAÇÃO DO MEL........................................................................................................75 1.6 QUIMIOMETRIA............................................................................77 CAPÍTULO 2 – CARACTERIZAÇÃO, ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA DE AMOSTRAS DE MEL DE ABELHAS Apis mellifera L., AO LONGO DO ARMAZENAMENTO.........................................................................79 RESUMO...............................................................................................81 1 INTRODUÇÃO.................................................................................82 2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................85 2.1 MATERIAL.....................................................................................85 2.2 AMOSTRAS DE MEL.....................................................................86 2.3 PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE...................88 2.3.1 Açúcares.......................................................................................88 2.3.2 Umidade, pH, acidez livre e atividade diastásica......................88
2.3.3 Condutividade elétrica................................................................89 2.3.4 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF)................................................89 2.3.5 Cor................................................................................................90 2.4 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA...90 2.4.2.1 Preparação da amostra................................................................91 2.4.2.2 Separação e quantificação dos compostos por LC-ESI-MS/MS.92 2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................94 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................94 3.1 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA AO LONGO DO ARMAZENAMENTO...................................................104 3.1.1 Açúcares.....................................................................................104 3.1.1.1 Frutose e glicose.......................................................................104 3.1.1.2 Sacarose....................................................................................109 3.1.2 Umidade......................................................................................111 3.1.3 Acidez..........................................................................................114 3.1.4 pH................................................................................................116 3.1.5 Atividade diastásica..................................................................118 3.1.6 5-HMF........................................................................................120 3.1.7 Condutividade elétrica..............................................................122 3.1.8 Cor..............................................................................................124 3.1.6.1 Parâmetro L*............................................................................124 3.1.6.2 Parâmetro a*.............................................................................127 3.1.6.2 Parâmetro b*.............................................................................129 3.2 AVALIAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DURANTE ARMAZENAMENTO.131 3.1 AVALIAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS INDIVIDUAIS DURANTE ARMAZENAMENTO.....................................................135 4 CONCLUSÃO..................................................................................144 CAPÍTULO 3 – ESTABILIDADE QUÍMICA DE COMPOSTOS VOLÁTEIS E ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA PELO MÉTODO DE PCA PARA DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DE AMOSTRAS DE MEL DE Apis mellifera L., AO LONGO DO ARMAZENAMENTO.......................................................................147 RESUMO.............................................................................................149 1 INTRODUÇÃO...............................................................................150 2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................154 2.1 MATERIAL...................................................................................154 2.2 AMOSTRAS DE MEL...................................................................155 2.3 PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE.................158 2.3.1 Açúcares.....................................................................................158 2.3.2 Umidade, pH, acidez livre e atividade diastásica....................158
2.3.3 Condutividade elétrica..............................................................159 2.3.4 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF)..............................................159 2.3.5 Cor..............................................................................................160 2.3.6 Avaliação de compostos fenólicos totais e atividade antioxidante.........................................................................................160 2.3.7 Identificação e quantificação de compostos fenólicos............161 2.3.7.1 Preparação da amostra..............................................................161 2.3.7.2 Separação e quantificação dos compostos por LC-ESI-MS/MS.................................................................................................161 2.3.8 Determinação dos compostos voláteis......................................163 2.3.8.1 Extração (HS-SPME)...............................................................163 2.3.8.2 Identificação e quantificação (GC/MS)....................................163 2.3.8.3 Processamento de dados de espectro de massas.......................164 2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................164 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................165 3.1 COMPOSTOS VOLÁTEIS............................................................165 3.2 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS...........................200 4 CONCLUSÃO..................................................................................212 CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................215 REFERÊNCIAS..................................................................................217
1 INTRODUÇÃO
O mel é um alimento natural, composto principalmente por
açúcares (glicose, frutose e sacarose), além de outros constituintes como enzimas (invertase, α- e β-glicosidase, diastase, glicose oxidase), aminoácidos (prolina, ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina), ácidos orgânicos (ácidos: glucônico, oxálico, maleico, cítrico, succínico e fumárico), carotenóides, vitaminas (principalmente a vitamina B6, tiamina, niacina, riboflavina e ácido pantotênico), minerais (cálcio, cobre, ferro, magnésio, manganês, fósforo, potássio, sódio e zinco), substâncias aromáticas. É rico em ácidos fenólicos (ácidos benzoico, þ-cumárico, ferúlico, vanílico, cafeico) e flavonoides (quercetina, apigenina, kaempferol, crisina, miricetina) que exibem uma vasta gama de efeitos biológicos e atuam como antioxidantes naturais (BALTRUSAITYTE; VENSKUTONIS; CEKSTERYT, 2007; KÜÇÜK et al., 2007; ALJADI; KAMARUDDIN, 2004; AZEREDO et al., 2003). Sua composição, cor, aroma e sabor dependem, principalmente, das floradas, das regiões geográficas, do clima e da espécie de abelha, e são afetadas também, pelas condições climáticas, processamento, manipulação, embalagem e tempo de armazenamento (CONSONNI; CAGLIANI; COGLIATI, 2013; CHUDZINSKA; BARALKIEWICZ, 2011; TURHAN et al., 2008; GHELDOF; ENGESETH, 2002; ANKLAM, 1998).
A disponibilidade limitada e o alto preço do mel têm proporcionado grandes estímulos para a sua adulteração. Os parâmetros de identidade e qualidade são considerados úteis para detectar essas possíveis adulterações do produto, e também para confirmar as condições de higiene na manipulação e no armazenamento (ALVES et al., 2013; PUSCAS; HOSU; CIMPOIU, 2013). As formas mais comuns de adulteração são: adição de adoçantes de baixo custo, como o açúcar de cana e de beterraba refinado, xarope de milho de alta frutose e xarope de maltose e a alimentação das abelhas com sacarose (PUSCAS; HOSU; CIMPOIU, 2013; TOSUN, 2013; LI et al., 2012).
Além disso, o mel é um alimento que sofre muitas variações em sua composição durante o armazenamento, influenciadas por diversos fatores, dentre eles a fermentação, a oxidação e o processamento térmico (MOREIRA et al., 2010; KAŃKONIENÉ; VENSKUTONIS; CEKSTERYTÉ, 2008). Algumas técnicas analíticas modernas são empregadas nas análises dos compostos presentes no mel, que são
gerados durante o armazenamento, como as cromatográficas (LC-MS/MS do inglês Liquid chromatography - tandem mass spectrometry e GC-MS do inglês Gas chromatography - mass spectrometry) e eletroforese capilar (CE do inglês Capillary electrophoresis). Essas técnicas utilizam-se de instrumentos que permitem alta sensibilidade, velocidade e elevada frequência analítica (CECCHI, 2003; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; SUNTORNSUK, 2002).
Um dos compostos analisados pelas técnicas analíticas descritas é o 5-hidroximetilfurfural (5-HMF), que é um dos produtos da reação de Maillard. Este pode ser formado quando o mel é submetido a tratamento térmico ou longo tempo de armazenamento (TORNUK et al., 2013), ou ainda pela desidratação dos açúcares em ambiente ácido. É um composto volátil e tóxico, dependendo da concentração (CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; AJLOUNI; SUJIRAPINYOKUL, 2010; GOMES et al., 2010). Devido a estes fatores, o 5-HMF, juntamente com outro composto furânico, o furfural, têm sido utilizados como marcadores de tratamento térmico ou armazenamento prolongado do mel (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VÁZQUEZ et al., 2008). Além destes furanos, outros compostos tem sido utilizados como marcadores, como é o caso do álcool furfurílico, que também é indicador de tratamento térmico e condições de armazenamento (WON et al., 2014; BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; SANCHO et al., 1992), ou ainda marcadores de origem geográfica ou floral, como a hesperetina em méis cítricos (TRUCADO et al., 2008); kaempferol em méis de alecrim (GIL et al., 1995), ácido elágico em méis de heather (FERRERES et al., 1996), 3,9-epoxi-1-þ-mentadieno, t-8-þ-mentan-óxido de 1,2-diol e cis-rosa, em méis de limoeiro; dicetonas, alcanos e compostos de enxofre são característicos de méis de eucalipto, hexanal e heptanal em méis de lavanda (CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; RADOVIC et al., 2001; ROWLAND et al., 1995).
A análise quimiométrica constitui uma ferramenta muito útil na análise de dados variados e complexos, sendo adequada à avaliação de matrizes complexas como o mel, pois avalia a amostra como um todo e não apenas um único componente, a fim de melhor interpretar as interações entre os constituintes e seus efeitos sobre a matriz (CORREIA; FERREIRA, 2007; CORBELLA; COZZOLINO, 2006). Dentre as análises multivariadas existentes, a PCA (PCA - Do inglês: Principal component analysis) é uma das mais utilizadas para a
24
classificação e redução de grandes conjuntos de dados, oferecendo melhor interpretação dos mesmos, revelando a existência ou não de amostras atípicas, de relações entre as variáveis medidas e de relações ou agrupamentos entre amostras (YÜCEL; SULTANOGLU, 2013; LYRA et al., 2010; TERRAB; DIÉZA; HEREDIA, 2002).
A proposta de pesquisa deste trabalho foi apresentada, considerando-se as necessidades de estudos aprofundados sobre o mel em relação ao seu comportamento durante o armazenamento. Neste contexto, o presente estudo visou avaliar os compostos químicos presentes no mel de abelhas Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, buscando um possível marcador de degradação e estabilidade química do mel de Apis mellifera L..
25
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Monitorar os compostos químicos presentes em amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. produzidos no estado de Santa Catarina, avaliando os parâmetros de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos e compostos voláteis na busca de um possível marcador de degradação do mel de Apis mellifera L.. 2.2 Objetivos específicos
- Avaliar amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. provenientes de oito regiões do estado de Santa Catarina, Brasil, considerando os padrões de identidade e qualidade, para após, selecionadas as amostras, acompanhar a estabilidade durante simulação de armazenamento doméstico prolongado na busca possíveis marcadores de degradação;
- Monitorar a estabilidade dos padrões de identidade e qualidade, compostos fenólicos totais e atividade antioxidante de amostras de mel de abelhas Apis mellifera L., in natura, produzidos e coletados em diferentes regiões do estado de Santa Catarina, Brasil, ao longo de 540 dias em armazenagem doméstica;
- Identificar e quantificar compostos fenólicos individuais, por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem, em amostras de mel de Apis mellifera L. de diferentes regiões do estado de Santa Catarina, avaliando sua estabilidade química ao longo de 450 dias de armazenamento;
- Identificar e quantificar compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. produzidas em diferentes regiões do estado de Santa Catarina, empregando a técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, monitorando mudanças no perfil de compostos voláteis destas amostras armazenadas em um modelo doméstico, durante 540 dias, a temperatura ambiente, buscando definir possíveis marcadores químicos relacionados a degradação das amostras;
- Avaliar amostras de mel produzidas em 8 regiões apícolas do estado de Santa Catarina, através da análises de componentes principais, para a possibilidade de classificação e diferenciação das amostras, quanto ao comportamento químico e tempos de armazenamento.
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 PRODUÇÃO DE MEL
Nos últimos anos, a produção de mel vem aumentando, embora algumas regiões e países oscilem. Isto é resultado do aumento do número de colmeias e da produção por colônia. O consumo de mel in natura também aumentou nos últimos anos, devido ao aumento dos padrões de vida da população e um interesse maior por consumir produtos naturais e saudáveis. A média de consumo mundial atinge cerca de 300 g/hab/ano. Contudo, nos países da Comunidade Europeia o consumo é expressivamente maior, com cerca de 700 g/hab/ano (PEREIRA et al., 2003; VIEIRA, 2010).
Segundo a Food and Agriculture Organization (FAO) (2014) a produção mundial de mel em 2012 foi de 1 592 701 toneladas. A Tabela 1 ilustra os dados da produção mundial de mel dos anos últimos sete anos. Tabela 1. Produção mundial de mel (toneladas) entre os anos de 2006 a 2012.
Fonte: FAO (2014).
A China vem se destacando ao longo dos últimos anos como
maior produtora mundial de mel com 337.578 toneladas em 2006, passando para 461.600 toneladas em 2012, aumentando sua produção em 27 % ao longo destes anos (Tabela 1). Pode-se observar, também, que alguns países como a Rússia, a Turquia e a Índia aumentaram sua produção. Ao contrário, países como os Estados Unidos e Canadá,
diminuíram significativamente sua produção ao longo de 2006 a 2012, devido a fatores climáticos e a perda de enxames. No caso da Argentina, a produção de mel diminuiu devido à forte seca que se propagou pelo país por três anos consecutivos (FAO, 2014; SEBRAE, 2013). Em relação ao ano de 2012, após a China, a Turquia figura como segunda maior produtora mundial de mel, seguida pela Argentina, Ucrânia e Estados Unidos (FAO, 2014).
Apesar da alta produção em 2002, a Comunidade Europeia proibiu a entrada de mel da China e Argentina, por acreditar que o mel possuía resíduos de antibióticos, permitindo, assim, que países como o Brasil, entrassem na cadeia de exportação de mel. O mel, que até então era apenas destinado ao mercado interno, passou a ser direcionado a exportação, sendo uma nova alternativa aos produtores (CRESPAM; SCHERER, 2009).
O Brasil apresentou uma produção de 36.196 toneladas de mel em 2006, diminuindo em 2007, mas desde este ano em diante, foi aumentando sua produção, chegando a 37.815 toneladas em 2015. Neste mesmo ano, o país ficou entre os 12 maiores produtores de mel do mundo. Vale ressaltar a evolução da produção nacional no período entre 2006 a 2012 (Tabela 1) (IBGE, 2016; FAO, 2014; RANGEL, 2011).
O mel brasileiro, hoje, é desejado pelos principais mercados internacionais, por ser livre de agrotóxicos e pelo alto padrão de qualidade. Em dez anos, a produção aumentou de maneira expressiva e as exportações aumentaram em 9.000 %, de acordo com informações da CBA (Confederação Brasileira de Apicultura). Isso se deve a uma combinação de fatores, que vão desde o recente embargo do mel chinês no mercado mundial, até a crise que quase causou a destruição de colmeias americanas e europeias, passando por um crescente investimento governamental (RANGEL, 2011). O Brasil é um país privilegiado, pois possui muitas áreas disponíveis para aumentar a produção, enquanto em grande parte do mundo não há área nativa para a produção de mel (SEBRAE, 2012). Para garantir o aumento da produção brasileira de mel, é necessário tornar os segmentos da cadeia produtiva de mel mais atraentes e competitivos, melhorando, assim, a qualidade, produtividade, preço, investindo no desenvolvimento de tecnologia, inovação de processos, marketing e recursos humanos (VIEIRA, 2010).
Dentre as Regiões Brasileiras, a Nordeste e a Sul são as maiores produtoras de mel dos últimos anos. A Região Sul foi a que mais produziu mel entre 2009 a 2015, perdendo apenas em 2011 para o Nordeste. A Região Sul foi a que mais produziu mel em 2015, com
32
14.119 toneladas, seguida pelas Regiões Nordeste e Sudeste (Tabela 2) (IBGE, 2016).
Tabela 2. Produção de mel (toneladas) nas 5 regiões brasileiras no período de 2009 a 2015.
Fonte: IBGE (2016).
De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
(IBGE, 2016), em 2015, o Paraná representou 16,62 % da produção nacional de mel, seguido pelo Rio Grande do Sul (13,12 %) e pela Bahia (12,15 %). Santa Catarina ficou em 7º lugar, produzindo 2.869 toneladas, totalizando 7,59 % da produção nacional.
O estado de Santa Catarina é caracterizado por uma topografia acidentada com vegetação natural e variada, avaliada como de boa qualidade para a produção de mel, e um modelo fundiário fundamentado em pequenas propriedades rurais de agricultura familiar que apostam na apicultura como um aumento da renda e melhoria de qualidade de vida da família rural, sem afetar negativamente o ambiente natural, promovendo um desenvolvimento rural sustentável. As regiões em evidência na produção de mel são as mesorregiões Oeste, Sul e Serrana do estado (SOUZA, 2008).
O território catarinense tem mais de 30 mil famílias rurais dedicadas à apicultura, com um total de 350 mil colmeias instaladas e uma produção média de seis mil toneladas de mel por ano, de acordo com a Federação e Associação dos Apicultores do Estado de Santa Catarina (FAASC). A produção por colmeia gira em torno de 14 até 26 quilos. A diferença entre as produções das colmeias deve-se às condições climáticas como temperatura, umidade relativa, índice pluviométrico e de insolação; localização geográfica do apiário; disponibilidade e condições de uso da florada; dentre outros fatores que geralmente influenciam no trabalho das abelhas, na qualidade e no sabor do mel (VIEIRA, 2010).
33
Nas mesorregiões Sul Catarinense, Vale do Itajaí, Grande Florianópolis e Norte Catarinense encontram-se as maiores densidades de colmeias por apicultor, ao passo que, nas mesorregiões Sul Catarinense, Serrana e Vale do Itajaí encontram-se as maiores produtividades do Estado (VIEIRA, 2010).
No que diz respeito ao uso de florada para extração do néctar, na mesorregião Sul Catarinense predominam as flores de eucalipto; na Serrana e no Norte Catarinense, as flores silvestres, vassouras e bracatinga (flor e melato); no Alto Vale do Itajaí, as flores silvestres, e no Oeste Catarinense, as flores silvestres, a uva-do-japão e a laranjeira (VIEIRA, 2010).
Considerando as diferentes regiões e floradas que proporcionam diferentes tipos de méis, são necessárias normas para a padronização dos mesmos, garantindo a origem do mel e segurança alimentar ao consumidor. 1.2 DEFINIÇÃO, CLASSIFICAÇÃO E PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE DO MEL
O mel é um alimento viscoso, aromático, doce, apreciado e consumido em todo o mundo, para isto necessita de normas e padrões que garantam a sua identidade e qualidade e a segurança no consumo livre e o acesso ao mercado interno e externo. Além disso, cada vez mais, os apreciadores de mel se interessam em conhecer a origem geográfica e floral do mel, confirmando a identidade do produto (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
As legislações são elaboradas analisando a necessidade de padronizar o processamento dos produtos, dirigindo-se para assegurar condições igualitárias e total transparência na elaboração e comercialização dos mesmos. A autenticidade do mel é definida internacionalmente pelo Codex Alimentarius, União Europeia e algumas legislações nacionais que estabelecem a identidade e os requisitos essenciais de qualidade que o mel, destinado ao consumo humano direto, deve cumprir. As normas aplicam-se aos méis produzidos pelas abelhas e abrangem todos os estilos de apresentações de mel que são processados e, finalmente, destinados ao consumo direto (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) é o órgão responsável pelo regulamento técnico de identidade e qualidade do mel, através da Instrução Normativa no 11,
34
de 20 de outubro de 2000, que objetiva estabelecer a identidade e os requisitos mínimos de qualidade que deve cumprir o mel destinado ao consumo humano direto. Esta regulamentação, entre outros fatores, leva em consideração as características físico-químicas do mel, estabelecendo limites mínimos ou máximos para parâmetros relacionados à maturidade, pureza e deterioração das amostras (BRASIL, 2000).
1.2.1 Definição e classificação do mel
Entende-se por mel o produto alimentício produzido pelas abelhas melíferas, a partir do néctar das flores ou das secreções procedentes de partes vivas das plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com substâncias específicas próprias, armazenam e deixam madurar nos favos da colmeia (BRASIL, 2000).
De acordo com a Instrução Normativa nº 11, de 20 de outubro de 2000 (BRASIL, 2000), o mel pode ser classificado de acordo com a sua origem em: mel floral, que é o mel obtido dos néctares das flores, ou mel de melato (melato), que é o mel obtido principalmente a partir de secreções das partes vivas das plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que se encontram sobre elas.
O mel floral é dividido em mel unifloral ou monofloral, quando o produto procede principalmente de flores de uma mesma família, gênero ou espécie e possui características sensoriais, físico-químicas e microscópicas próprias; e mel multifloral ou polifloral, que é o mel obtido a partir de diferentes origens florais (BRASIL, 2000).
De acordo com o procedimento de obtenção de mel do favo, o mel pode ser classificado em mel escorrido, que é o mel obtido por escorrimento dos favos desoperculados, sem larvas; mel prensado, que é o mel obtido por prensagem dos favos, sem larvas; e mel centrifugado, que é o mel obtido por centrifugação dos favos desoperculados, sem larvas (BRASIL, 2000).
De acordo com a apresentação e/ou processamento, o mel pode apresentar-se líquido, cristalizado ou parcialmente cristalizado, e em favos ou mel em secções, que é o mel armazenado pelas abelhas em células operculadas de favos novos, construídos por elas mesmas, que não contenha larvas e comercializado em favos inteiros ou em secções de tais favos. Mel com pedaços de favo, que é o mel que contém um ou mais pedaços de favo com mel, isentos de larvas. Mel cristalizado ou
35
granulado, que é o mel que sofreu um processo natural de solidificação, como consequência da cristalização dos açúcares. Mel cremoso, que é o mel que tem uma estrutura cristalina fina e que pode ter sido submetido a um processo físico, que lhe confira essa estrutura e que o torne fácil de untar. E mel filtrado, que é o mel que foi submetido a um processo de filtração, sem alterar o seu valor nutritivo (BRASIL, 2000).
1.2.2 Parâmetros de identidade e qualidade do mel
Atualmente, a qualidade e a autenticidade dos alimentos desempenham um papel importante para os consumidores e produtores de todo o mundo. No caso do mel, a autenticidade está relacionada com as determinações de origem geográfica e floral, bem como à detecção de substâncias não permitidas. As origens geográfica e botânica são valorizadas economicamente de forma diferente e, portanto, sujeitas a fraudes, levando a rotulagem falsa ou duvidosa (CONSONNI; CAGLIANI; COGLIATI, 2013; CHUDZINSKA; BARALKIEWICZ, 2011).
Além de verificar possíveis adulterações no mel, as análises físico-químicas também são importantes no mercado mundial, pois o mel é utilizado cada vez mais como ingrediente em vários produtos alimentícios, por promover viscosidade, cor, higroscopicidade, espalhabilidade, miscibilidade, umectância, doçura e sabor próprio (BELAY et al., 2013).
Para os consumidores, os parâmetros sensoriais de cor e o estado de cristalização são as características com maior impacto sobre a qualidade do mel (AL et al., 2009), enquanto as principais características avaliadas pelas legislações como a do MAPA, Codex Alimentarius e Comunidade Europeia são: açúcares, umidade, acidez livre, cinzas, condutividade elétrica, cor, hidroximetilfurfural (HMF) e atividade diastásica. Açúcares
O mel é um alimento rico em açúcares. Produzido pelas abelhas a partir da sacarose presente no néctar, que é transformada pela ação de enzimas como a α e β-glicosidase, a α e β-amilase e a β-frutosidase. Os monossacarídeos são os principais carboidratos presentes no mel, que vão de 65 a 80% do total de sólidos solúveis. A frutose (cerca de 38,5 %) e a glicose (cerca de 31,0 %) são os compostos presentes em maior concentração no mel. A proporção média de frutose e glicose é de 1,2:1, mas esta proporção depende, em grande parte da fonte do néctar do qual o mel foi extraído. Esta relação é utilizada para avaliar a cristalização do
36
mel, devido à menor solubilidade da glicose em água em relação à frutose (ESCUREDO et al., 2014; TORNUK et al., 2013; FUENTE et al., 2011; ANKLAM, 1998).
De acordo com a Legislação Brasileira, o teor de açúcares redutores no mel, deve ser de no mínimo de 65 g 100 g-1 para mel floral (BRASIL, 2000). Contudo, para os padrões do Codex Alimentarius e da União Européia, o valor mínimo de açúcares redutores é 60 g 100 g-1 para o mel floral (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Em geral, a composição de açúcares do mel é afetada pelos tipos de flores utilizadas pelas abelhas, regiões e condições climáticas (TORNUK et al., 2013).
A sacarose é um parâmetro de maturidade muito importante avaliado no mel. Geralmente, o teor de sacarose não excede a 8 g 100 g-1
em amostras de méis autênticos (AZEREDO et al, 2003). O conteúdo de sacarose no mel é analisado com o intuito de identificar a manipulação indevida do mel, sendo que taxas altas podem indicar: adulteração, como a adição de adoçantes baratos, como o açúcar de cana e de beterraba refinado; colheita precoce, indicando que sacarose não foi totalmente transformada em glicose e frutose; ou alimentação artificial prolongada às abelhas com xaropes de sacarose, resultando em altos lucros comerciais (ESCUREDO et al., 2013; PUSCAS; HOSU; CIMPOIU, 2013; TORNUK et al., 2013; LI et al., 2012; GOMES et al., 2010).
A Legislação Brasileira preconiza que o mel floral deve conter no máximo 6 g 100 g-1 de sacarose aparente, enquanto para os padrões do Codex Alimentarius e da União Européia estipulam o valor máximo de 5 g 100 g-1 para o mel floral (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). Umidade e Aw (do inglês water activity)
A água é o segundo maior constituinte do mel. Seu conteúdo pode variar de 15 a 21 %, dependendo da origem botânica, nível de maturidade alcançado na colmeia, técnicas de processamento e condições de armazenamento (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b; LAZAREVIC et al., 2012; GALLINA; STOCCO; MUTINELLI, 2010; GOMES et al., 2010).
A Legislação Brasileira, o Codex Alimentarius e a União Européia estipulam que o teor de umidade no mel não deva ser superior a 20 g 100g-1 (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). O conteúdo de umidade é
37
uma das características mais importantes, pois influencia nas propriedades físicas do mel, como viscosidade e cristalização, bem como em outros parâmetros: cor, sabor, gosto, gravidade específica, solubilidade e conservação (ESCUREDO et al., 2013). A taxa à qual a cristalização ocorre no mel depende, também, da razão entre a glicose e a água (G/A). Dobre et al. (2012) indicam uma cristalização lenta no mel quando a razão G/A é inferior a 1,7, e quando a proporção é superior a 2,0, a cristalização é rápida e completa (ESCUREDO et al., 2014).
A cristalização da glicose no mel acarreta na diminuição dos sólidos solúveis resultando na diluição da solução amorfa e, em consequência, aumento da Aw. O mel possui Aw entre 0,5-0,65 e valores de Aw acima de 0,60 representam o limiar crítico para a estabilidade microbiana. Essa informação é de grande importância, pois os méis contêm leveduras osmofílicas, que podem causar a fermentação, formação de álcool etílico e dióxido de carbono (ESCUREDO et al., 2013; TORNUK et al., 2013; VENIR; SPAZIANI; MALTINI, 2010).
O percentual de umidade nos méis também pode variar em regiões com umidade relativa alta, e também em função da estação do ano; na estação chuvosa é mais provável que o mel sofra um processo de fermentação do que na estação de seca. A umidade do mel também pode aumentar durante as operações de processamento do produto, bem como em condições inadequadas de armazenamento, pois o mel é higroscópico e absorve a umidade do ambiente (KARABAGIAS et al., 2014; PIRES, 2011).
Apesar de não haver limites estipulados, nas normas dos diferentes países, para Aw e pH, conhecer esses valores se faz necessário, pois um mel com baixos valores de Aw e pH inibem a presença e o crescimento de micro-organismos (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b; GOMES et al., 2010).
Acidez livre e pH
A acidez do mel e o pH entre 3,2 e 4,5 inibem o crescimento de micro-organismos, uma vez que o pH ótimo para a maioria dos organismos situa-se entre 7,2 e 7,4 (KARABAGIAS et al., 2014; VANDAMME et al., 2013; SUÁREZ-LUQUE et al., 2002).
A acidez livre constitui um importante parâmetro relacionado à deterioração do mel. Esta é caracterizada pela presença de ácidos orgânicos, em equilíbrio com as suas lactonas, ou ésteres internos e alguns íons inorgânicos, tais como fosfatos, cloretos e sulfatos, cujos ácidos correspondentes são componentes no mel (ALVES et al., 2013;
38
GOMES et al., 2010; MOREIRA et al., 2007). A Legislação Brasileira, o Codex Alimentarius e a União Européia permitem um valor máximo de 50,00 meq kg-1 para a acidez livre. Valores elevados de acidez podem ser indicativos de fermentação dos açúcares em ácidos orgânicos. A presença de diferentes ácidos orgânicos, origem geográfica e a época de colheita podem afetar os valores da acidez do mel (TORNUK et al., 2013; CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). Cinzas
O conteúdo de cinzas é uma medida de qualidade, que avalia o conteúdo mineral presente no mel. O teor de minerais pode ser indicativo de poluição ambiental e de origem geográfica, pois o conteúdo depende do tipo de solo no qual foi colhido o néctar das flores (KARABAGIAS et al., 2014; RIZELIO et al., 2012c; SUÁREZ-LUQUE et al., 2005). O teor médio de cinzas presentes no mel é de 0,17 % m/m, podendo variar entre 0,02-1,03 % m/m (CHAKIR et al., 2011). A Legislação Brasileira preconiza um valor máximo de cinzas de 0,60 g 100g-1 para mel floral (BRASIL, 2000). O Codex Alimentarius e a União Européia não estipulam um valor para este parâmetro (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Os teores de minerais estão relacionados com a cor e o sabor do mel, quanto maior a quantidade de minerais, mais escuro e mais forte é o sabor do mel (KARABAGIAS et al., 2014; KUS et al., 2014; ESCUREDO et al., 2013; GOMES et al., 2010). Normalmente, há uma correlação positiva entre a cor, teor de minerais e condutividade elétrica do mel (KARABAGIAS et al., 2014). Condutividade elétrica
A condutividade elétrica do mel está relacionada com o teor de cinzas (conteúdo mineral) e com a acidez, revelando a presença de íons, ácidos orgânicos e proteínas (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b). É um indicador muito utilizado no controle de qualidade do mel, podendo ser utilizado para distinguir méis florais de méis de melato (KARABAGIAS et al., 2014; LAZAREVIĆ et al., 2012). Este parâmetro foi recentemente incluído nas normas internacionais do Codex Alimentarius substituindo a determinação do teor de cinzas. O Codex Alimentarius e a União Européia preconizam o valor máximo de 800,00 µS cm-1. Contudo a Legislação Brasileira não estabelece um limite para a condutividade
39
elétrica (KASKONIENE; VENSKUTONIS; CEKSTERYTE, 2010; CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Cor
A cor é o primeiro atributo atrativo do mel, sendo também importante para a sua comercialização. É um parâmetro importante na qualidade, aceitação e preferência dos consumidores (TERRAB; GONZÁLEZ-MIRET; HEREDIA, 2004).
Os apreciadores de mel sabem que sua cor pode variar de tons claros a tons âmbar, quase preto, sendo as mais comuns a amarelo brilhante, a avermelhada ou a esverdeada. Em muitos países, o preço do mel está relacionado com a sua cor. Méis levemente coloridos, geralmente têm um valor mais elevado. Méis escuros são apreciados em determinadas regiões (TUBEROSO et al., 2014; GHORBANI; KHAJEHROSHANAEE, 2009), mostrando que a aceitação geral da cor do mel pelos consumidores pode ser muito variável (GÁMBARO et al., 2007).
A cor é uma das características mais variáveis e é principalmente determinada pela sua origem botânica, mas também depende do seu teor de cinzas, temperatura na qual o mel permanece na colmeia e tempo de armazenamento (GÁMBARO et al., 2007). A Legislação Brasileira e o Codex Alimentarius estipulam que a cor do mel deve ser de quase incolor a pardo-escuro. Contudo, a União Européia não estabelece parâmetros para este atributo (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
5-Hidroximetilfurfural (5-HMF)
O conteúdo de 5-HMF é apresentado como indicativo de deterioração do mel. Normalmente, é formado pela decomposição de monossacarídeos ou pela reação de Maillard, quando o mel é aquecido ou armazenado durante um tempo prolongado; à medida que a temperatura do tratamento térmico e o tempo de armazenamento aumentam, a concentração de HMF aumenta significativamente. No entanto, o HMF sozinho não pode ser utilizado para a determinação da severidade do tratamento térmico, pois outros fatores influenciam os níveis de HMF, como o perfil de açúcares, a presença de ácidos orgânicos, o pH, o teor de umidade, a Aw e a fonte floral. Portanto, o teor de HMF fornece apenas uma indicação de superaquecimento ou más condições de armazenamento. Além disso, o HMF também pode se formar em baixas temperaturas, mesmo em condições ácidas, por desidratação dos açúcares e reações subsequentes (TORNUK et al.,
40
2013; CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; AJLOUNI; SUJIRAPINYOKUL, 2010; GOMES et al., 2010).
Teor elevado de HMF em méis, também pode ser indicativo de falsificação por adição de xarope invertido, pois o HMF também pode ser produzido pelo aquecimento dos açúcares na presença de um ácido para a inversão da sacarose (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b; CAPUANO; FOGLIANO, 2011). A Legislação Brasileira estipula um valor máximo de 60,00 mg kg-1 (BRASIL, 2000). O Codex Alimentarius e a União Européia estabelecem como valor máximo 40,00 mg kg-1 para o mel processado ou mistura de méis e um valor máximo de 80,00 mg kg-1 se o mel e a misturas desses méis contiver origem declarada de regiões de clima tropical (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Atividade diastásica
As diastases (α- e β- amilases) são enzimas naturalmente presentes no mel, seu conteúdo depende da origem floral e geográfica. Tem como função digerir a molécula de amido em uma mistura de maltose (dissacarídeo) e maltotriose (trissacarídeo), são sensíveis ao calor (termolábil) e, em consequência, são capaz de indicar superaquecimento do produto e o grau de conservação (AHMED et al., 2013; PONTARA et al., 2012). Semelhante ao HMF, a atividade diastásica pode ser utilizada como indicativo de envelhecimento e aumento de temperatura, pois a atividade diastásica pode ser reduzida ao longo do armazenamento ou quando o produto é submetido ao aquecimento acima de 60 ºC (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b; GOMES et al., 2010).
A atividade diastásica corresponde à atividade da enzima presente em 1 g de mel, que pode hidrolisar 0,01 g de amido em 1 h a 40°C, expressa como o número de diastase em unidades Gothe (AHMED et al., 2013). As legislações vigentes estabelecem um valor mínimo de 8,00 unidades Gothe, contudo, méis com atividade diastásica naturalmente mais baixa, tolera-se um mínimo de 3 unidades Gothe, caso os méis possuam até 15 mg kg-1 de HMF (FALLICO et al., 2004; CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
41
1.3 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DOS COMPOSTOS PRESENTES NO MEL
O mel é um alimento que contém cerca de 200 substâncias (ESCUREDO et al., 2013; FERREIRA et al., 2009), e é composto majoritariamente por açúcares, além de água, e outras substâncias, tais como proteínas (enzimas), ácidos orgânicos, vitaminas (principalmente a vitamina B6, tiamina, niacina, riboflavina e ácido pantotênico), minerais (incluindo cálcio, cobre, ferro, magnésio, manganês, fósforo, potássio, sódio e zinco), pigmentos, compostos fenólicos, uma grande variedade de compostos de aroma, e partículas sólidas provenientes da sua colheita (ALQARNI et al., 2012; BENTABOL MANZANARES et al., 2011; CIULU et al., 2011; CAJKA et al., 2009; PONTES; MARQUES; CÂMARA, 2007).
1.3.1 Açúcares
O mel é composto por monossacarídeos que representam cerca de 75 % dos açúcares encontrados no mel, entre 10-15 % de dissacarídeos e pequenas quantidades de outros açúcares. Os açúcares presentes no mel são responsáveis por propriedades como valor energético, viscosidade, higroscopicidade e granulação (KAMAL; KLEIN, 2011; OUCHEMOUKH et al., 2010).
A composição de açúcares no mel depende principalmente da origem botânica, ou seja, dos tipos de flores usadas pelas abelhas; da origem geográfica, e em proporções menores, das condições climáticas, de processamento e de armazenamento (ESCUREDO et al., 2014; TORNUK et al., 2013). A concentração de frutose e glicose, bem como a sua proporção são indicadores úteis para a classificação dos méis monoflorais (KASKONIENE; VENSKUTONIS; CEKSTERYTE, 2010). Em quase todos os tipos de méis, a frutose é o carboidrato em maior proporção, exceto em alguns méis, como o de colza (Brassica napus) e dente de leão (Taraxacum officinale), onde a fração de glicose pode ser maior do que a fração de frutose (ESCUREDO et al., 2014; PERSANO-ODDO; PIRO, 2004), e em consequência estes méis, geralmente, têm uma rápida cristalização.
O perfil de açúcares de diferentes tipos de méis tem sido estudado por diversos cientistas. A Tabela 3 ilustra alguns destes estudos.
42
Tabe
la 3
. Com
posi
ção
de a
çúca
res e
m m
éis d
e di
fere
ntes
regi
ões.
(C
ontin
ua)
Aut
or/a
no
Orig
em d
o m
el
Met
odol
ogia
em
preg
ada
Com
post
os e
ncon
trado
s da
Cos
ta L
eite
et a
l. (2
000)
B
rasi
l H
PLC
Mal
tose
; Tur
anos
e; N
iger
ose;
Mel
ibio
se;
Saca
rose
; Iso
mal
tose
; Mal
totri
ose;
Pan
ose;
M
elez
itose
; Raf
inos
e.
Con
sonn
i; C
aglia
ni;
Cog
liati
(201
3)
Itália
, Hun
gria
, A
mér
ica
do S
ul e
C
hina
NM
R
Erlo
se; F
ruto
se; G
entio
bios
e; G
licos
e;
Isom
alto
se; I
som
alto
trios
e; K
ojib
iose
; Ces
tose
; M
alto
se; M
alto
tetra
ose;
Mal
totri
ose;
Mal
tulo
se;
Mel
ezito
se; M
elib
iose
; Nig
eros
e; P
alat
inos
e;
Raf
inos
e; S
acar
ose;
Tur
anos
e.
Cot
te e
t al.
(200
4)
Fran
ça
HPA
EC-P
AD
(glic
ose
e fr
utos
e)
GC
/FID
(out
ros a
çúca
res)
Frut
ose;
Glic
ose;
Sac
aros
e; M
alto
se; M
altu
lose
; Tu
rano
se; T
real
ose;
Pal
atin
ose;
Lam
inar
ibio
se;
Mel
ibio
se; I
som
alto
se; G
entib
iose
; Raf
inos
e;
Neo
-Ces
tose
; 1-C
esto
se; E
rlose
; Mel
ezito
se;
Mal
totri
ose;
Pan
ose.
Fu
ente
et a
l. (2
007)
Es
panh
a G
C/M
S Fr
utos
e; G
licos
e; S
acar
ose;
α, α
-Tre
alos
e; α
, β-
Trea
lose
; Cel
obio
se; L
amin
arib
iose
; Mal
tulo
se;
Nig
eros
e; T
uran
ose;
Mal
tose
; Koj
ibio
se;
Trea
lulo
se; P
alat
onis
e; G
entib
iose
; Iso
mal
tose
; M
elib
iose
; Raf
inos
e; C
esto
se; E
rlose
; Mel
ezito
se;
Tean
dero
se; M
alto
trios
e; P
anos
e.
Font
e: p
rópr
io a
utor
.
43
Tabe
la 3
. Com
posi
ção
de a
çúca
res e
m m
éis d
e di
fere
ntes
regi
ões.
(C
oncl
usão
)
Aut
or/a
no
Orig
em d
o m
el
Met
odol
ogia
em
preg
ada
Com
post
os e
ncon
trado
s Fu
ente
et a
l. (2
011)
Es
panh
a G
C/M
S Fr
utos
e; G
licos
e; S
acar
ose;
α, α
-Tre
alos
e; α
, β-
Trea
lose
; Cel
obio
se; L
amin
arib
iose
; Mal
tulo
se;
Nig
eros
e; T
uran
ose;
Mal
tose
; Koj
ibio
se;
Trea
lulo
se; P
alat
onis
e; G
entib
iose
; Iso
mal
tose
; R
afin
ose
+ 1-
cest
ose;
6-c
esto
se; N
eoce
tose
; Er
lose
; Mel
ezito
se; P
lant
eose
; Tea
nder
ose;
M
alto
trios
e; P
anos
e; Is
omal
totri
ose.
O
uche
mou
kh e
t al.
(201
0)
Arg
élia
H
PAEC
/PA
D
Frut
ose;
Glic
ose;
Mal
tose
; Sac
aros
e; T
uran
ose;
Is
omal
tose
; Erlo
se; M
elez
itose
; Raf
inos
e;
Trea
lose
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or.
44
Os açúcares, em maiores concentrações presentes no mel, são
os monossacarídeos glicose e frutose, os dissacarídeos sacarose, maltose, turanose, isomaltose, maltulose, trealose, nigerose, kojibiose e os trissacarídeos maltotriose e melezitoze. Os dissacarídeos e os trissacarídeos, como, por exemplo, a sacarose e a maltotriose, são hidrolisados enzimaticamente a monossacarídeos. A maltotriose, formada por três unidades de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas α-1,4, é hidrolisada através de enzimas à maltose. A maltose, também é hidrolisada por enzimas, mas neste caso, a enzima é a α-glicosidase, originando duas moléculas de glicose (SOLDATKIN et al., 2013; COTTE et al., 2004).
Os açúcares, bem como os outros constituintes do mel, podem sofrer alterações durante o armazenamento. Rybak-Chmielewska (2007) analisou méis não estabilizados e estabilizados (enzimas inativadas) que foram armazenados durante 24 semanas. A autora constatou que, para os méis não estabilizados, a concentração de sacarose diminuiu 14 % nos méis armazenados a 4 ºC, e cerca de 79 % nos méis armazenados em temperatura ambiente (20 ºC). Para os outros açúcares como trealose e isomaltose os percentuais não apresentaram grandes alterações ao longo do tempo de armazenamento. O conteúdo de frutose aumentou 4 % e o conteúdo de glicose aumentou 1,1 %, comparado ao valor inicial na temperatura de 4 ºC e contudo, na temperatura de 20 ºC, o conteúdo de frutose aumentou 7 % e o conteúdo de glicose aumentou 8,8 %. Em relação aos méis estabilizados, os percentuais dos açúcares variaram em 0,1 % para mais para sacarose, trealose e erlose + melezitose ou para menos para turanose. Comparando os méis nas diferentes temperaturas de 4 e 20 ºC, a variação nos percentuais dos açúcares individuais foi de 0,2%. Ao longo do tempo, além das mudanças químicas, há também as mudanças físicas nos méis, como cor mais escura e mudança no sabor.
Quando o mel é aquecido ou armazenado por longo tempo, as pentoses e as hexoses se decompõem, em uma lenta enolização e uma rápida β-eliminação de três moléculas de água, formando compostos indesejáveis como os furanos (CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; PEREIRA et al., 2011). Os principais furanos formados são o furfural que é proveniente de pentoses, e o HMF, proveniente de hexoses como a glicose e a frutose (Figura 1) (MOREIRA et al., 2010). Estes são os principais produtos de degradação de açúcares e sua ocorrência nos alimentos é geralmente relacionada a reações de escurecimento não enzimáticas, ou seja, reações do tipo Maillard, degradação do açúcar em meio ácido e caramelização. Atualmente, esses furanos têm sido
45
utilizados como marcadores de tratamento térmico de alimentos (PEREIRA et al., 2011; MOREIRA et al., 2010). O álcool furfurílico também é indicador de tratamento térmico e condições de armazenamento, sendo assim, estes compostos não são considerados bons marcadores de méis florais, pois podem indicar uma possível perda de frescor devido à exposição de temperaturas elevadas ou armazenamento prolongado (WON et al., 2014; BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; SANCHO et al., 1992). Figura 1. Formação do HMF a partir da sacarose.
Fonte: adaptado de Shi et al. (2013).
1.3.2 Proteínas
O teor de proteínas no mel pode variar de acordo com a espécie da abelha. O mel de Apis cerana contém entre 0,1 a 3,3 % de proteínas, enquanto o mel de Apis mellifera contém entre 0,2 a 1,6 % de proteínas (WON et al., 2009). As proteínas e os aminoácidos presentes nos méis são atribuídos tanto a fontes animais quanto vegetais, incluindo os fluidos do néctar e secreções das glândulas salivares e da faringe de abelhas (ESCUREDO et al., 2013; SAK-BOSNAR; SAKAC, 2012), mas a principal delas é o pólen. Sendo o pólen a principal fonte de aminoácidos no mel, o perfil de aminoácidos pode ser uma característica da origem botânica.
Para determinar a origem botânica do mel, a composição de aminoácidos livres é mais aceitável do que a composição de proteínas. A Tabela 4 ilustra a composição de aminoácidos presentes em méis de diferentes regiões. Observa-se a presença dos aminoácidos essenciais em quase todos os tipos de méis. Os aminoácidos presentes no mel são diferentes dependendo da origem geográfica. Alguns estudos relatam
46
que há diferença, quando se comparam méis da mesma região, com diferentes origens florais (HERMOSÍN; CHICÓN; CABEZUDO, 2003).
Os aminoácidos são responsáveis por 1 % (m/m) dos constituintes do mel e suas proporções relativas dependem da origem do mel (néctar ou melato) (HERMOSÍN; CHICÓN; CABEZUDO, 2003). O principal aminoácido, tanto para o mel quanto para o pólen é a prolina (IGLESIAS et al., 2006; PARAMÁS et al., 2006). Além da prolina, existem outros aminoácidos presentes nos méis, sendo os mais comuns o ácido glutâmico, a alanina, a fenilalanina, a tirosina, a leucina e a isoleucina (GIROLAMO; D'AMATO; RIGHETTI, 2012).
A prolina procede principalmente das secreções salivares de abelhas (Apis mellifera L.) durante a conversão do néctar em mel. No mel, representa de 50 a 85 % do total de aminoácidos (TRUZZI et al., 2014; JANISZEWSKA; ANIOŁOWSKA; NOWAKOWSKI, 2012; IGLESIAS et al., 2006; PARAMÁS et al., 2006). E tem sido utilizada como um critério de avaliação da maturação do mel e, em alguns casos, de adulteração com açúcar. Um valor mínimo de 180 mg kg-1 é aceito como valor limite para o mel puro (BENTABOL MANZANARES et al., 2014; HERMOSÍN; CHICÓN; CABEZUDO, 2003).
47
Tabela 4. Composição de aminoácidos em méis de diferentes regiões.
(Continua) Autor/ano Origem do
mel Metodologia empregada
Compostos encontrados
Hermosín; Chicón;
Cabezudo (2003)
Espanha HPLC/PDA Ácido glutâmico; Ácido aspártico; Asparagina +
Serina; Glutamina; Histidina; Glicina;
Treonina; β-alanina; Arginina; α-alanina; Ácido γ-aminobutírico; Prolina;
Tirosina; Valina; Metionina; Cisteína; Isoleucina; Leucina;
Triptofano; Fenilalanina; Ornitina; Lisina.
Janiszewska; Aniołowska; Nowakowski
(2012)
Polônia Analisador automático de aminoácidos
Ácido aspártico; Treonina; Serina; Asparagina; Ácido
glutâmico; Glutamina; Ácido α-aminoadípico;
Prolina; Glicina; Alanina; Ácido α-aminobutírico;
Valina; Metionina; Isoleucina; Leucina;
Tirosina; Fenilalanina; β-alanina; Ácido β-
aminobutírico; Ácido γ-aminobutírico; Etilamina;
Ornitina; Lisina; Histidina; Arginina.
Keckes et al. (2013)
Sérvia HPLC/DFL Alanina; Arginina; Asparagina; Glutamina;
Glicina; Histidina; Leucina; Lisina;
Fenilalanina; Prolina; Serina; Treonina; Tirosina;
Valina. Fonte: próprio autor.
48
Tabela 4. Composição de aminoácidos em méis de diferentes regiões.
(Continua) Autor/ano Origem do
mel Metodologia empregada
Compostos encontrados
Nozal et al. (2004)
Espanha GC/FID; GC/MS
Alanina; Sarcosina; Glicina; Ácido α-aminobutírico; Valina;
Ácido β-aminoisobutírico; Leucina; Allo isoleucina;
Isoleucina; Treonina; Serina; Prolina; Asparagina; Tiaprolina; Ácido aspártico; Metionina; 4-
hidroxiprolina; Ácido glutâmico; Fenilalanina; Ácido
α-aminoadípico; Ácido α-aminopimélico; Glutamina; Ortinina; Glicina-prolina;
Lisina; Histidina; Hidroxilisina; Tirosina; Prolina-
hidroxiprolina; Triptofano; Cistationina; Cistina.
Paramás et al. (2006)
Espanha HPLC/DFL Ácido aspártico; Ácido glutâmico, Asparagina; Serina;
Glutamina; Homoserina; Glicina; Treonina; Arginina; Alanina; Taurina; Ácido γ-
aminobutírico; Tirosina; Valina; Triptofano; Fenilalanina;
Isoleucina; Leucina; Ornitina; Lisina.
Fonte: próprio autor.
49
Tabela 4. Composição de aminoácidos presentes em méis de diferentes regiões.
(Conclusão) Autor/ano Origem do
mel Metodologia empregada
Compostos encontrados
Qamer et al. (2007)
Paquistão HPLC/DAD Arginina; Isoleucina; Leucina; Lisina;
Metionina; Fenilalanina; Triptofano; Valina;
Alanina; Ácido aspártico; Cisteína; Ácido
glutâmico; Glicina; Hidroxiprolina; Prolina;
Tirosina; Serina. Rebane; Herodes (2010)
Estônia LC/UV/MS Histidina; Arginina; Asparagina; Glutamina; Serina; Ácido aspártico;
Ácido glutâmico; Treonina; Glicina; β-
alanina; Ácido γ-aminobutírico; α-alanina;
Prolina; Tirosina; Metionina; Valina;
Cisteína; Triptofano; Ornitina; Fenilalanina; Isoleucina; Leucina;
Lisina. Sanz et al.
(2003) Espanha HPLC/DFL Prolina; Ácido aspártico;
Ácido glutâmico; Asparagina; Serina;
Glutamina; Arginina; β-alanina; Gaba;
Fenilalanina; Lisina. Fonte: próprio autor.
50
Uma pequena fração das proteínas presentes no mel são
enzimas, como a invertase, a α- e β-glicosidase, a catalase, a fosfatase ácida, a diastase, a glicose oxidase (SAK-BOSNAR, SAKAC, 2012; WON et al., 2008). As diastases são um grupo de enzimas amilolíticas que compreendem as α- e β-amilases. A α-amilase hidrolisa as cadeias de amilose e amilopectina nas ligações α-D-(1→4), produzindo dextrinas e a β-amilase hidrolisa a cadeia de amido na extremidade, levando à formação de maltose (SAKAC; SAK-BOSNAR, 2012; SAK-BOSNAR, SAKAC, 2012). Outra enzima presente nos méis é a glicose oxidase. Ela converte a glicose em δ-gluconolactona, que é hidrolisada a ácido glucônico (Figura 2). Além da δ-gluconolactona, a glicose oxidase também produz peróxido de hidrogênio, que tem ação bactericida (MOREIRA et al., 2007). Figura 2. Formação de ácido glucônico a partir da glicose.
Fonte: adaptado de Moreira et al. (2007).
A composição aminoacídica do mel é utilizada na determinação de sua origem botânica e floral, no entanto, as condições de armazenamento e processamento podem levar à formação de produtos devido à reação do grupo carboxílico da extremidade redutora de açúcares e os grupos amino livres de aminoácidos e proteínas (reação de Maillard) (IGLESIAS et al., 2006; PARAMÁS et al., 2006). A reação de Maillard ocorre como passo inicial à formação dos compostos de Amadori, formando, em seguida, as melanoidinas, durante o armazenamento de alimentos com alto teor de açúcares ou aminoácidos como o mel. Os compostos de Amadori derivam dos aminoácidos lisina, prolina, ácido γ-aminobutírico e arginina (IGLESIAS et al., 2006).
Iglesias e colaboradores (2006) analisaram os aminoácidos livres de diferentes méis de néctar, de melato e a mistura destes, armazenados em temperatura ambiente e não pasteurizados, ao longo de 24 meses de armazenamento. Os autores observaram que, o conteúdo dos aminoácidos, ácido aspártico, β-alanina e prolina aumentou durante
51
os primeiros 6 meses de armazenamento. A concentração de prolina diminuiu após 6 meses de armazenamento, enquanto a concentração de ácido aspártico diminui após 12 meses de armazenamento. A concentração de β-alanina não se alterou entre os 6 e 24 meses. Este resultado pode sugerir que, embora este aminoácido esteja envolvido na reação de Maillard, a sua reatividade é menor do que a de outros aminoácidos. O aumento do ácido aspártico e da prolina durante os primeiros meses de armazenamento pode ser explicado pela presença de enzimas como a protease e/ou peptidase nos méis, pois estes aminoácidos estão presentes no pólen. A concentração de aminoácidos livres diminuiu ao longo dos primeiros nove meses de armazenamento, enquanto diferença significativa não foi observada nos 15 meses seguintes de armazenamento.
Brudzynski, Sjaarda e Maldonado-Alvarez (2013) avaliaram as alterações quantitativas e qualitativas das proteínas de méis armazenados durante seis meses e em diferentes temperaturas e relacionaram essas mudanças com a formação de complexos proteína-polifenóis. Os autores acreditam que os polifenóis presentes no mel podem ser oxidados facilmente à quinonas, e desempenhar um papel chave na interação com as proteínas. As ligações entre as proteínas e as quinonas foram intensificadas pelo armazenamento do mel em temperaturas elevadas, e deram origem às alterações nas proteínas que mudaram sua carga líquida e massa molecular, indicando que as quinonas, derivadas de polifenóis oxidados, formaram ligações covalentes com as proteínas. 1.3.3 Ácidos orgânicos
Segundo Alves e colaboradores (2005) os méis apresentam leve acidez, possuindo 0,57 % de ácidos orgânicos em sua composição (KARABAGIAS et al., 2014; VANDAMME et al., 2013; SUÁREZ-LUQUE et al., 2002). Os ácidos são derivados de açúcares por enzimas secretadas pelas abelhas, a partir da transformação do néctar em mel e diretamente do néctar sugado pelas abelhas (CHERCHI, 1994).
Os ácidos orgânicos são utilizados para discriminar os méis de acordo com sua origem botânica e/ou geográfica. Estão relacionados com a cor e o sabor do mel e com propriedades físico-químicas como acidez, pH e condutividade elétrica (MATO et al., 2006). A Tabela 5 apresenta a composição de ácidos orgânicos presentes em méis de diferentes regiões.
52
Tabela 5. Composição de ácidos orgânicos em méis de diferentes regiões.
Autor/ano Origem do mel
Metodologia empregada
Compostos encontrados
Cherchi et al. (1994)
Itália HPLC/DAD Ácidos: aspártico, butírico, citramálico,
cítrico, dimetilglicérico, fórmico, fumárico,
galacturônico, glucárico, glucônico, glutâmico, glutárico, glicólico,
glioxílico, 2-hidroxibutírico, α-hidroxiglutárico,
isocítrico, α-cetoglutárico, lático,
málico, malônico, metilmalônico, 2-oxopentanóico,
propiônico, pirúvico, quínico, chiquímico, succínico, tartárico.
Nozal et al. (2003)
Espanha HPLC/DAD Ácidos: oxálico, glucorônico, cítrico,
galacturônico, propiônico, málico,
quínico, D-glucônico, fórmico, glutárico,
butírico. Mato et al.
(2006) Espanha CZE/UV-Vis Ácidos: oxálico, fórmico,
málico, succínico, pirúvico, acético, lático,
cítrico, glucônico.
Stinson et al. (1960)
Pensilvânia Cromatografias Ácidos: butírico, acético, fórmico, láctico,
succínico, piroglutâmico, málico, cítrico,
glucônico, oxálico. Fonte: próprio autor.
53
O ácido predominante no mel é o ácido glucônico, sua presença nos méis é originário da glicose oxidase, que as abelhas fornecem durante o amadurecimento do mel (KARABAGIAS et al., 2014; VANDAMME et al., 2013; SUÁREZ-LUQUE et al., 2002). Além do ácido glucônico, o ácido cítrico também está presente no mel, e sua concentração constitui um parâmetro confiável para diferenciar mel floral de mel de melato (SUÁREZ-LUQUE et al., 2002).
Os ácidos levulínico e fórmico também estão presentes no mel. Eles podem ser originados a partir do HMF que, em reações sucessivas, une-se a duas moléculas de água, produzindo uma molécula de ácido levulínico e outra de ácido fórmico (Figura 3), elevando a acidez livre do mel (CAVIA et al., 2007). Figura 3. Produção de ácidos a partir de hexoses.
Fonte: adaptado de Moura (2006).
Cavia e colaboradores (2007) avaliaram a acidez livre de 35
tipos de méis espanhóis, não aquecidos, ao longo de 30 meses. Todas as amostras foram armazenadas à temperatura ambiente e analisadas a cada 5 meses. A acidez livre manteve-se praticamente constante nos primeiros 15 meses de armazenamento, com uma ligeira tendência ao aumento. Entre 15 e 20 meses, a acidez livre de todas as amostras diminuiu. Após 20 meses, a maior parte das amostras de méis
54
apresentou um aumento constante da acidez livre, que no mel, é fornecida pelos ácidos livres e pode variar amplamente. Os autores relataram, ainda, que o aumento da acidez livre com o tempo, bem como durante a fermentação, pode advir dos açúcares e dos álcoois presentes no mel, que se transformam em ácidos pela ação das leveduras.
1.3.4 Vitaminas
O mel contém pequenas quantidades de vitaminas, principalmente vitaminas do complexo B, que são provenientes dos grãos de pólen em suspensão. As vitaminas encontradas são: tiamina (B1), riboflavina (B2), ácido nicotínico (B3), ácido pantotênico (B5), piridoxina (B6), biotina (B8; H) e ácido fólico B9. A vitamina C também está presente. As vitaminas presentes no mel são preservadas devido ao baio pH do mel (BONTÉ; DESMOULIÈRE, 2013).
A vitamina C é encontrada em vários tipos de méis e tem sido avaliada principalmente pelo seu efeito antioxidante (PERNA et al., 2013). A determinação da vitamina C é um indicador instável, pois ela é vulnerável a oxidação química e enzimática, e tem alteração acelerada por diversos fatores como a luz, o oxigênio e o calor (LEÓN-RUIZ et al., 2013).
O primeiro estudo sobre vitaminas em mel foi realizado, inicialmente, por meio de métodos de ensaio biológico. Somente a partir de 1940 é que foram introduzidos os métodos químicos para a determinação de ácido ascórbico (CIULU et al., 2011). Ciulu e colaboradores (2011) validaram um método rápido e simples em cromatografia líquida de alta eficiência-fase reversa (HPLC - RP) para determinar simultaneamente 5 vitaminas solúveis em água (vitamina B2: riboflavina, vitamina B3: ácido nicotínico; vitamina B5: ácido pantotênico, vitamina B9: ácido fólico e vitamina C: ácido ascórbico). O método foi efetivo na análise de 28 amostras de mel (principalmente de Sardenha, Itália), de 12 diferentes origens botânicas.
1.3.5 Minerais
O conteúdo mineral no mel varia entre 0,04 % para méis claros e 0,2 % para méis escuros (ALQARNI et al., 2012). O mel reflete os componentes químicos das plantas das quais as abelhas coletam seu alimento, sendo assim, o conteúdo de elementos traços presentes no mel depende do tipo de solo na qual a planta e o néctar originais foram localizados (ESCUREDO et al., 2013; MADEJCZYK; BARALKIEWICZ, 2008; ANKLAM, 1998), podendo indicar a origem
55
botânica de um mel específico (ALQARNI et al., 2012). Alguns autores classificaram botanicamente méis baseados na estimativa do seu conteúdo mineral. Nozal-Nalda e colaboradores (2005) identificaram os minerais de diferentes méis da Espanha e encontraram conteúdo maior de manganês nos méis das flores de ling e heather. Ajtony e colaboradores (2007) avaliaram o conteúdo mineral de amostras de méis da Hungria e verificaram que o menor conteúdo de cádmio, cromo, cobre e chumbo foi observado no mel de tília, enquanto para os outros méis, estes elementos apresentaram os maiores conteúdos.
O conteúdo de elementos minerais em amostras de mel, também pode fornecer uma indicação de poluição ambiental, e com isto, uma indicação da origem geográfica dos méis (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013a; ALDA-GARCILOPE et al., 2012; ANKLAM, 1998). As abelhas voam em um raio de até 3 km em busca de fontes de pólen, portanto, o mel pode fornecer informações valiosas sobre a área em que foi coletado (MADEJCZYK; BARALKIEWICZ, 2008).
A Tabela 6 ilustra a composição de minerais presentes em méis de diferentes regiões. O potássio é o elemento mais abundante, correspondendo, geralmente, a um terço do conteúdo total de minerais presentes no mel (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013a; ALQARNI et al., 2012; SILVA et al., 2009). Em menores quantidades, encontram-se sódio, ferro, cobre, silício, manganês, cálcio e magnésio (ALQARNI et al., 2012; CHAKIR et al., 2011). Macroelementos minerais, como o potássio, cálcio, sódio, e minerais traços, como ferro, cobre, zinco, manganês, desempenham um papel fundamental em sistemas biológicos, mantendo as reações fisiológicas normais, induzindo o metabolismo geral, sistema circulatório e influenciando a reprodução, como catalisadores de várias reações bioquímicas (ALQARNI et al., 2012). Segundo Anklam (1998), o aumento da concentração de elementos traços em amostras de mel próximas as áreas industriais, foi observado na maioria dos casos. Portanto, a quantificação de elementos minerais traços e tóxicos, em méis, torna-se importante, por motivos de segurança da saúde humana e efeitos de biomonitoramento ambiental (AJTONY et al., 2007).
Os elementos minerais, ao contrário das vitaminas e aminoácidos, não estão sujeitos à degradação por exposição ao calor, luz e agentes oxidantes, pHs extremos ou outros fatores que afetem nutrientes orgânicos (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
56
Tabela 6. Composição de minerais em méis de diferentes regiões.
Autor/ano Origem do mel
Metodologia empregada
Compostos encontrados
Alqarni et al. (2012)
Arábia Saudita
Espectrômetro de absorção atômica
Potássio, magnésio, cálcio, ferro, fósforo,
sódio, manganês, iodo, zinco, lítio, cobalto,
níquel, chumbo e cádmio.
Chakir et al. (2011)
Marrocos Espectrômetro de absorção atômica
e ICP-MS
Manganês, cobre, bário, níquel, cromo,
cobalto, selênio, arsênio, prata, berilo,
potássio, sódio, cálcio, magnésio, alumínio,
ferro, zinco, cádmio e chumbo.
Chudzinska; Baralkiewicz
(2011)
Polônia ICP-MS Alumínio, boro, bário, cálcio, cádmio, cromo,
cobre, potássio, magnésio, manganês,
sódio, níquel, chumbo, estrôncio e zinco.
Vanhanen; Emmertz;
Savage (2011)
Nova Zelândia
ICP-OES Alumínio, arsênio, bário, cálcio, cádmio, cromo, cobre, ferro, potássio, magnésio,
manganês, molibdênio, sódio, níquel, fósforo,
chumbo, enxofre e zinco.
Yücel; Sultanoglu,
(2013a)
Turquia ICP-OES Alumínio, boro, bário, cálcio, cádmio,
cobalto, cromo, cobre, ferro, potássio,
magnésio, manganês, sódio, níquel, chumbo,
estrôncio e zinco. Fonte: próprio autor.
57
1.3.6 Compostos fenólicos Os compostos fenólicos constituem um grupo quimicamente
heterogêneo, com aproximadamente 10.000 compostos, agrupados em diferentes classes de acordo com a sua estrutura química básica, podendo ser divididos em não flavonoides (ácidos fenólicos) e flavonoides (flavonas, flavonóis, flavanonas, flavanonais, flavanois, antocianidina, isoflavonas e chalconas) (ANDERSEN; MARKHAM, 2010). Esses compostos possuem um anel aromático com um ou mais grupos hidroxilas em suas estruturas, que podem variar desde uma molécula fenólica simples a um polímero complexo, de elevada massa molar (PALAFOX-CARLOS; YAHIA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2012; ROSA, 2012; PYRZYNSKA; BIESAGA, 2009; BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Os ácidos fenólicos constituem uma classe importante de compostos fenólicos, com funções bioativas, normalmente encontrados em produtos vegetais e alimentos, são metabólitos secundários, necessários para o funcionamento normal de plantas que ocorrem naturalmente. São compostos que atuam como antioxidantes, eliminando os radicais livres e inibindo a oxidação lipídica. Podem ser divididos em dois subgrupos de acordo com a estrutura: os ácidos hidroxibenzoicos e os hidroxicinâmicos (CHALLACOMBE et al., 2012; MARTINS et al., 2011).
Os ácidos hidroxibenzoicos apresentam uma estrutura geral C6-C1 (Figura 4), derivado do ácido benzoico. Variações na estrutura encontram-se nas hidroxilações e metilações do anel aromático (ROSA, 2012; TSAO, 2010). Originados do ácido hidroxibenzóico derivam os ácidos: þ-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico, salicílico (2-hidroxibenzoato), gálico e elágico. Esses compostos podem se apresentar nas células na forma solúvel, conjugado com açúcares ou com ácidos orgânicos, ou constituindo a parece celular juntamente com ligninas (ROSA, 2012; RICE-EVANS; PACKER, 2003).
Os ácidos hidroxicinâmicos apresentam estrutura geral C6-C3 (Figura 4) e as diferenças nos substituintes do anel originam os diferentes ácidos fenólicos como o þ-cumárico, cafeico, ferúlico e sinápico. Estes compostos ocorrem normalmente na forma conjugada como ésteres de hidroxiácidos, como o chiquímico e tártarico e também na forma pura (Figura 4) (MCCARTHY et al., 2013; RICE-EVANS; PACKER, 2003).
58
Figura 4. Estrutura química dos ácidos fenólicos.
a) ácidos hidroxibenzoicos: p-hidroxibenzoico, R1 = H, R2 = H; ácido gálico, R1 = OH, R2 = OH. b) ácidos hidroxicinâmicos: ácido þ-cumárico, R1 = H; ácido cafeico, R1 = OH; ácido ferúlico R1 = OCH3. Fonte: adaptado de Tsao (2010).
Os flavonoides possuem estrutura nuclear C6-C3-C6, envolvendo dois anéis benzênicos ligados por um anel pirano (Figura 5). As substituições nos anéis resultam nas principais classes de flavonoides. A Figura 5 ilustra exemplos de flavonoides comuns que ocorrem naturalmente (KO; CHEIGH; CHUNG, 2014; ROSA, 2012; BIESAGA, 2011; MARTINS et al., 2011; BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
59
Figura 5. Estrutura química dos flavonoides.
Fonte: Adaptado de Rosa (2012); de la Rosa; Alvarez-Parrilla; González-Aguilar (2010); Heim; Tagliaferro; Bobilya (2002).
Compondo o maior grupo de compostos fenólicos de plantas, os
flavonoides correspondem por mais da metade, dos oito mil compostos fenólicos naturais. Eles estão largamente distribuídos nas sementes, cascas, folhas, flores de plantas. Nas plantas, estes compostos
60
proporcionam uma proteção contra a radiação ultravioleta, patógenos e herbívoros. As plantas possuem vários derivados polifenólicos com alta diversidade estrutural e complexidade, e, quando as abelhas recolhem o néctar, estes compostos bioativos podem ser transferidos das plantas para o mel (SILICI; SAGDIC; EKICI, 2010).
Os compostos fenólicos, como ácidos fenólicos e polifenóis têm sido recentemente sugeridos como possíveis marcadores para a determinação da origem botânica do mel (ESCRICHE et al., 2011; ALISSANDRAKIS et al., 2009; CASTRO-VÁZQUEZ et al., 2009; IURLINA et al., 2009; DAHER; GÜLAÇAR, 2008; ARRÁEZ-ROMÁN et al., 2007; ANKLAM, 1998). Como a hesperetina para méis cítricos (TRUCHADO et al., 2008); mistura de miricetina, tricetina, quercetina, luteolina e kaempferol para méis de eucalipto (MARTOS et al., 2000); kaempferol para méis de alecrim (GIL et al., 1995) e ácido elágico para méis de heather (FERRERES et al., 1996). Maiores informações sobre a composição fenólica de méis de diferentes regiões podem ser observadas na Tabela 7.
61
Tabela 7. Composição de compostos fenólicos presentes em méis de diferentes regiões.
(continua) Autor/ano Origem do
mel Metodologia empregada
Compostos encontrados
Alvarez-Suarez et al.
(2012)
Cuba HPLC-DAD–ESI-MS/MS
Floroglucinol, ácido vanílico, ácido caféico, ácido siríngico, ácido þ-cumárico, ácido ferúlico, quercetina-O-
ramnoside, quercetina, kaempferol-7-0-ramnoside,
kaempferol, isoramnetina, 8-metoxikaempferol.
Arráez-Román et al.
(2006)
Espanha CZE-ESI-MS Kaempferid, quercetina 3‟,3'-dimetil-eter,
quercetina7,3'-dimetil-eter, Monogalloyl, miricetina, kaempferol, pinobanksin,
pinocembrin, crisina. Escuredo et al. (2012)
Espanha HPLC/DAD Ácido caféico, ácido þ-cumárico, ácido elágico,
crisina, galangina, pinocembrin, kaempferol e
tectocrisina. Jasicka-
Misiak et al. (2012)
Polônia HPLC/PDA Ácido 3-hidroxibenzóico, ácido clorogênico, ácido 4-
hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido caféico, ácido
siríngico, ácido ferúlico, ácido þ-cumárico, ácido
rosmarínico, ácido elágico, miricetina, quercetina, kaempferol, crisina e
galangina. Kassim et al.
(2010) Malásia HPLC/DAD Ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido caféico, ácido þ-cumárico, ácido ferúlico, ácido elágico, miricetina, quercetina,
hesperitina, kaempferol, crisina e luteolina.
Fonte: próprio autor.
62
Tabela 7. Composição de compostos fenólicos presentes em méis de diferentes regiões.
(conclusão) Autor/ano Origem do
mel Metodologia empregada
Compostos encontrados
Trautvetter, Koelling-
Speer, Speer (2009)
Alemanha UPLC-MS Ácidos: quínico, xiquímico, gálico, homogenístico,
protocatecuíco, 3,4-dihidroxifenilacético,
gentísico, 4-hidroxibenzóico, clorogênico, mandélico, 4-hidroxifenilacético, caféico,
vanílico, siríngico, 4-hidroxifenilpropiônico, þ-
cumárico, β-fenilacético, tr-ferúlico, tr-sinápico,
acetilsalicílico, fenilacético, elágico, benzoico, salicílico, p-
anísico, hidroxicinmico, abscísico, tr-cinâmico, 4-
metoxicinâmico. Floroglucinol, 4-
metilpirocatecol, miricetina, quercetina, kaempferol,
apigenina e crisina. Fonte: próprio autor.
Além da utilização dos compostos fenólicos como marcadores
florais, um interesse maior tem sido direcionado ao estudo da atividade antioxidante atribuída a esses compostos, devido à sua capacidade de reduzir ou sequestrar os radicais livres (espécies reativas de oxigênio - ROS). Alguns estudos mostraram que os flavonoides poderiam proteger os lipídeos da membrana celular contra oxidação (YANG; MU, 2013; GAVIN; DURACO, 2011; SGHAIER et al., 2011; HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002).
Os principais componentes funcionais do mel são os flavonoides. Eles podem contribuir significativamente na atividade antioxidante total do mel, trazendo efeitos benéficos à saúde humana (ALVAREZ-SUAREZ et al., 2012). A atividade antioxidante dos flavonoides, na maioria das vezes, depende do número e das posições dos grupos hidroxila e dos outros substituintes, e da glicosilação de moléculas de flavonoides. A presença de determinados grupos hidroxila nos anéis de flavonoides reforça a atividade antioxidante. Padrões de
63
substituição no anel A e no anel B, bem como a ligação dupla 2,3 (insaturação) e o grupo 4-oxo no anel C também influenciam na atividade antioxidante dos flavonóides. A glicosilação dos flavonoides diminui a sua atividade antioxidante quando comparados com as agliconas correspondentes (SGHAIER et al., 2011).
A capacidade antioxidante do mel depende da fonte floral utilizada pelas abelhas para coletar o néctar, bem como fatores ambientais e sazonais. Em consequência, a identificação destes compostos, por seu caráter bioativo, poderá dar ao mel um valor adicional como um alimento funcional, devido às suas conhecidas propriedades benéficas como redução do risco de doenças cardiovasculares, deficiência do sistema imunológico e processos inflamatórios (BIESAGA; PYRZYNSKA, 2013; ESCRICHE et al., 2011).
Os compostos fenólicos, assim como os demais compostos orgânicos já abordados, sofrem degradação dependendo das condições ambientais a que são submetidos. Escriche e colaboradores (2014) avaliaram o impacto do tratamento térmico industrial sobre os compostos fenólicos de méis espanhóis, submetidos à liquefação (45 ± 1 °C / 48 h) e liquefação + pasteurização (80 ± 0,05 °C / 4 min). Os compostos fenólicos encontrados nestes méis foram os ácidos caféico e þ-cumárico, e os flavonoides naringenina, hesperetina, pinocembrina, crisina, galangina, miricetina, quercetina e kaempferol. Uma diminuição significativa na concentração de galangina, kaempferol, miricetina e ácido þ-cumárico foi observada após o tratamento térmico, sendo mais relevante para a miricetina após a pasteurização.
Truchado e colaboradores (2008) avaliaram a estabilidade de flavonoides glicosilados em méis concluindo que a característica estrutural comum entre os flavonóides kaempferol-7-O-robinoside, kaempferol-7-O-rhamnoside e kaempferol-7-O-rhamnosyl (1→2) rhamnosyl (1→2) hexosyl (1→2) rhamnoside é a presença de uma hidroxila livre na posição 3, que confere certa instabilidade a estes compostos em condições alcalinas brandas e alta sensibilidade à oxidação na presença de oxidantes suaves, como o peróxido de hidrogênio, presente no mel, podendo ser responsável pela degradação verificada nos flavonoides analisados.
Os açúcares, ácidos orgânicos e compostos fenólicos podem sofrer alterações durante o armazenamento, levando à perda de seu aroma característico, devido ao aparecimento de compostos como álcoois superiores, quando ocorre contaminação microbiológica, e de compostos furânicos, relacionados à degradação de açúcares presentes
64
no mel (CHERCHI; SPANNEDA; TUBEROSO, 1997, JIMÉNEZ et al., 1994). Portanto, devido à formação destes novos compostos, a avaliação do perfil de voláteis no mel torna-se de grande importância para o conhecimento das novas características químicas do produto. 1.3.7 Compostos voláteis
O perfil de aroma é uma das principais características de um produto alimentar, tanto para a qualidade sensorial quanto para a autenticidade. O aroma do mel é produzido por misturas complexas de compostos voláteis, que podem variar dependendo do néctar, condições de processamento, origem e armazenamento. Méis uniflorais possuem aromas característicos da planta, devido à presença de determinados compostos orgânicos voláteis provenientes das fontes dos néctares do qual as abelhas coletaram o mel (CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; FUENTE et al., 2007).
Os compostos de aroma podem advir da transferência de constituintes voláteis da planta, por isso, o aroma tem uma origem floral; da conversão de constituintes da planta pela abelha; da produção de compostos pelas abelhas; da produção de compostos durante o processamento pós-colheita; e pela ação de micro-organismos (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; KAŃKONIENÉ; VENSKUTONIS; CEKSTERYTÉ, 2008; IGLESIAS et al., 2006; MARIA; MOREIRA, 2003).
Devido ao elevado número de componentes voláteis, o perfil de aroma representa uma impressão digital do produto, o que poderia ser utilizado para determinar suas diferentes origens botânicas e geográficas (RADOVIC et al., 2001), pois a natureza e a quantidade dos compostos voláteis dependem da fonte floral (BIANCHI et al., 2011).
Estudos indicam que uma análise cautelosa dos voláteis presentes no mel pode ser uma ferramenta útil para a caracterização de sua origem botânica. Ao descrever sobre a importância dos compostos voláteis na avaliação da origem floral do mel, alguns autores recomendam certos compostos específicos como sendo característicos para os méis de uma fonte floral específica (ALISSANDRAKIS et al., 2011; RADOVIC et al., 2001). Vários autores têm relatado os mesmos compostos voláteis ou seus metabólitos em mel como no néctar e as flores a partir do qual é obtida (ALIFERIS et al., 2010; BARONI et al., 2006; MOREIRA; MARIA, 2005; ALISSANDRAKIS et al., 2003).
Determinados compostos foram propostos como componentes característicos de mel de determinadas regiões geográficas. Por
65
exemplo, foi sugerido que os méis Ingleses poderiam ser identificados pela presença de 1-penten-3-ol, como um composto específico para esta região (RADOVIC et al., 2001).
Mais de 400 compostos foram identificados na fração volátil do mel (MONTENEGRO et al., 2009; KAŃKONIENÉ; VENSKUTONIS; CEKSTERYTÉ, 2008; BENTIVENGA et al., 2004), e alguns são utilizados como marcadores de méis comerciais como 3,9-epoxi-1-þ-mentadieno, t-8-þ-mentan-óxido de 1,2-diol e cis-rosa, foram propostos como marcadores de mel de limoeiro; dicetonas, alcanos e compostos de enxofre são característicos de méis de eucalipto, enquanto hexanal e heptanal são os compostos principais do aroma em méis de lavanda (CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; RADOVIC et al., 2001; ROWLAND et al., 1995).
Não são todos os compostos voláteis que têm um impacto expressivo sobre o aroma do mel. O impacto de um determinado composto depende da extensão das concentrações que devem ser superiores ao seu limiar de odor. Portanto, mesmo os compostos presentes em baixas concentrações podem contribuir fortemente para o aroma do mel (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007).
Misturas complexas de compostos aromáticos voláteis de famílias químicas diferentes estão presentes no mel em concentrações muito baixas, em geral pertencem a monoterpenos, C13-norisoprenóides, sesquiterpenos, derivados de benzeno e em menor conteúdo, álcoois superiores, ésteres, ácidos graxos, cetonas, terpenos e aldeídos (PONTES; MARQUES; CÂMARA, 2007; MARIA; MOREIRA, 2003; ZHOU et al , 2002; D‟ARCY et al., 1997).
O comprimento da cadeia carbônica dos ácidos carboxílicos proporciona diferentes aromas que podem variar de picante a rancificado. Os ácidos carboxílicos de cadeia curta, como o ácido acético, possuem sabor e aroma picantes, logo os ácidos butanoico e hexanoico presentes na manteiga proporcionam aroma de rancificado (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010).
Os álcoois representam uma grande e importante classe de compostos presentes no mel. Álcoois com grupos metila, como o 3-metil-3-buteno-1-ol e 2-metil-2-buten-1-ol proporcionam frescor ao mel (CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007). Há, também, estudos que mostram que os derivados de linalol originam-se das flores visitadas pelas abelhas, concluindo que estes compostos serão encontrados apenas em méis específicos (MOREIRA et al., 2010).
66
Plutowska e colaboradores (2011) elaboraram e otimizaram um
método de extração para a determinação de compostos voláteis em méis de diferentes origens utilizando as técnicas de microextração em fase sólida - headspace (SPME - HS) e cromatografia gasosa. A metodologia descreve o isolamento e a identificação de compostos voláteis a partir de frações presentes em méis poloneses, além de análises sobre a origem botânica e qualidade sensorial.
Radovic e colaboradores (2001) analisaram 43 amostras de méis de diferentes países dentre eles Dinamarca, Alemanha, Itália, França, Holanda, Espanha, Portugal e Inglaterra e encontraram na maior parte, ou em quase todos os méis, aldeídos lineares e ramificados, cetonas, álcoois de cadeia curta. Os principais compostos voláteis detectados por análise de headspace (HS) nestes méis foram furfural, acetona e benzaldeído.
Alguns trabalhos descrevem a alteração do perfil de compostos voláteis durante o período de armazenamento do mel, como descrito no estudo realizado por Moreira e colaboradores (2010), em que os compostos voláteis do mel foram avaliados durante 6 meses de armazenamento. Observou-se o desaparecimento do 17-pentatriacontano da amostra de mel de caju já no terceiro mês de monitoramento. Contudo, Kańkoniené, Venskutonis e Ceksteryté (2008) verificaram que a concentração de octano aumentou com o tempo de armazenamento. Estes estudos indicaram que a avaliação do perfil volátil de méis em função do tempo de armazenamento e/ou em função do procedimento industrial envolvido, deve ser realizada de maneira cuidadosa, buscando o monitoramento da formação ou perda de compostos voláteis característicos no mel avaliado.
1.4 ESTABILIDADE DOS COMPOSTOS PRESENTES NO MEL DURANTE O ARMAZENAMENTO
O mel é um alimento que contêm diversos compostos químicos, e a partir destes, espera-se que ocorram variações na sua composição durante o período de armazenamento. Algumas dessas mudanças podem ser positivas ou negativas, alterando as características nutricionais e sensoriais, que podem estar associadas a reações, como reação de Maillard, catalisada por aquecimento, em méis armazenados em países tropicais, como o Brasil. Além disso, devido aos aspectos comerciais,, o mel é armazenado por quase um ano antes do consumo. Um melhor conhecimento sobre as mudanças que ocorrem durante o armazenamento pode ser útil para o desenvolvimento de mecanismos
67
que garantam o frescor original desse tipo de alimento (MOREIRA et al., 2010; MOREIRA et al., 2007).
1.4.1 Fatores que influenciam a degradação do mel
Os alimentos frescos são reconhecidos em todo o mundo por serem fonte de nutrientes, vitaminas e fibras para os seres humanos. O consumo de alimentos frescos tem aumentado ao longo dos anos, devido ao fato dos consumidores preferirem comer saudável e corretamente (OLAIMAT; HOLLEY, 2012).
As principais reações que levam à deterioração, e que são, consequentemente, os principais alvos para a preservação e controle eficazes, incluem alguns parâmetros como físicos, químicos e microbiológicos (GOULD, 1996; LABUZA, 1984). A qualidade, em alimentos frescos, como o mel, pode ser alterada pelo crescimento de micro-organismos, aumento do teor de umidade, aumento da temperatura, aumento da acidez, resultando em possíveis alterações de pH e formação de possíveis compostos químicos, resultando em sabores e odores indesejáveis, além da alteração na composição dos constituintes do mel (VELD, 1996). Degradação microbiológica
A contaminação microbiana pode ocorrer em qualquer etapa de produção do alimento como colheita, processamento, transporte, armazenamento em atacado, comércio varejista ou manipulação doméstica. Essa contaminação pode surgir através do meio ambiente, de animais e de fontes humanas (OLAIMAT; HOLLEY, 2012).
Primeiramente, é necessário saber se o alimento tem potencial para o desenvolvimento de micro-organismos patógenos de origem alimentar. Deve-se para isso, conhecer o pH, a atividade de água (aw), o potencial redox, bem como a natureza química do alimento, pois estes fatores afetam o crescimento microbiano. Alguns processamentos realizados nos alimentos são, primeiramente, para reduzir a carga microbiana, e após, diminuir o crescimento microbiano no produto embalado ou armazenado (LABUZA, 1984).
Alimentos com alto teor de açúcar e baixa Aw, como o mel, raramente irão sofrer deterioração microbiana, desde que devidamente preparados, processados e armazenados, principalmente armazenados em local seco (JAY, 2005). Contudo, quando o teor de açúcar não estiver elevado, com alta Aw, o mel pode fermentar, transformando os açúcares em ácidos (CAVIA et al., 2007; BATH; SINGH, 2000).
68
Escurecimento não enzimático (ENE)
As reações de ENE são as reações químicas mais estudadas e mais comuns, que ocorrem nos alimentos durante o aquecimento ou ao longo do armazenamento. A intensidade destas reações nos alimentos depende da quantidade e do tipo de carboidratos presentes, e em menor extensão, das proteínas e dos aminoácidos. A taxa de ENE é conhecida por ser afetada por vários fatores físico-químicos, sendo os mais estudados: concentração, proporção e natureza química dos reagentes (tipo de amina e grupos carboxila envolvidos), pH, umidade relativa, temperatura e tempo de aquecimento (ACEVEDO; SCHEBOR; BUERA, 2006; OETTERER; REGITANO-D‟ARCE; SPOTO, 2006).
De modo geral, as reações de ENE são indesejáveis do ponto de vista estético e nutricional. Estético, pois o alimento torna-se escuro devido às melanoidinas formadas, e nutricional, devido à provável formação de furfural e 5-metilfurfural, produtos do ENE do mel e são indicativos da possível perda do frescor devido à armazenagem prolongada ou o aumento da temperatura (KARABAGIAS et al., 2014). A reação de ENE que pode ocorrer em méis é a reação de Maillard.
- Reação de Maillard
O escurecimento dos alimentos sob aquecimento ou durante a estocagem (em alimentos que contenham grupamentos reativos, como o NH2 e o C=O) é resultado de reações químicas entre um açúcar redutor e um grupo amino primário. Os sabores, os aromas e as cores formados podem ser desejáveis ou indesejáveis. Eles podem ser formados lentamente durante a estocagem, ou de forma mais acelerada, em altas temperaturas (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; ORDÓNEZ et al., 2005; LABUZA, 1984).
Os açúcares redutores reagem reversivelmente com uma amina para formar uma base de Schiff, a qual pode originar um anel para formar uma glicosamina. A isomerização de aldoses gera aldosilaminas, enquanto a isomerização de cetoses gera cetosilaminas. Em seguida, a base de Schiff sofre um rearranjo formando os produtos do rearranjo de Armadori para originar um composto de Armadori (reação chave para o escurecimento). Os compostos de Armadori são os primeiros intermediários da sequência de reações de escurecimento. As aldosilaminas sofrem reestruturação interna (rearranjo de Armadori) e convertem-se em cetosaminas, ao passo que as cetosilaminas transformam-se em aldosaminas (reestruturação de Heyns ou de Armadori inversa) (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010;
69
OETTERER; REGITANO-D‟ARCE; SPOTO, 2006; ORDÓNEZ et al., 2005).
As reações seguem, especialmente se o pH for ≤ 5, dando origem a um intermediário desidratado. Ocasionalmente, forma-se um derivado furano, originado de uma hexose, conhecido como HMF e/ou um composto originados de uma pentose, o furfural (DAMODARAM; PARKIN; FENNEMA, 2010; ORDÓNEZ et al., 2005).
A reação de Maillard promove uma diminuição do valor nutritivo dos alimentos, pois ocorre a destruição de aminoácidos essenciais, como a lisina, cujo grupo ε-amino reage com os açúcares e com outros aminoácidos, como a L-arginina e a L-histidina. A perda de ácido ascórbico e de vitamina K, quando estão presentes nestas reações, também contribuem para a queda do valor nutritivo (DAMODARAM; PARKIN; FENNEMA, 2010; ORDÓNEZ et al., 2005). Assim como na reação de Maillard, a degradação de Strecker contribui com a perda de aminoácidos, no entanto, sem que o alimento escureça (OETTERER; REGITANO-D‟ARCE; SPOTO, 2006).
A cor escura no mel pode se desenvolver durante o armazenamento, podendo, também, estar relacionada à temperatura de armazenamento e à composição do mel. Em alguns casos, o mel é submetido ao tratamento térmico, para evitar ou retardar o processo de cristalização, prevenir o desenvolvimento e crescimento de micro-organismos, como prevenção de contaminação no produto fresco, e também, durante a extração ou envase, pois é necessário que o mel tenha uma fluidez adequada (VAIKOUSI; KOUTSOUMANIS; BILIADERIS, 2009; FALLICO et al., 2004;).
A duas formas mais conhecidas de aquecimento do mel são: armazená-lo em câmaras com ventilação a 45-50 ºC durante 4 a 7 dias; ou imersão dos tambores de mel em água quente (VAIKOUSI; KOUTSOUMANIS; BILIADERIS, 2009; FALLICO et al., 2004). Ao submeter um alimento ao processo industrial necessário, deseja-se que o mesmo permaneça seguro e com vida útil adequada, ao passo que este processamento deve ser realizado minimizando as perdas de nutrientes, que irão existir, mesmo que em pequenas proporções (ORDÓNEZ et al., 2005). O conhecimento da composição química do produto é de extrema importância, pois orienta o profissional de alimentos no controle e monitoramento das possíveis alterações que possam ocorrer durante o seu processamento e armazenamento.
70
1.4.2 Possíveis compostos suscetíveis à degradação no mel
Os méis merecem maior precaução em países tropicais, como o Brasil, em que a temperatura média anual é superior a 20 ºC, pois podem ser armazenados por quase um ano antes do consumo, sendo importante avaliar possíveis alterações que possam ocorrer durante o armazenamento, garantindo assim, o frescor original (MOREIRA et al., 2010).
O HMF, por exemplo, é um composto furânico, que se forma como um produto intermediário da reação de Maillard e da desidratação direta de açúcares em condições ácidas, durante os tratamentos térmicos aplicados aos alimentos ou durante um tempo de armazenamento prolongado (WON et al., 2014; BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; WANG et al., 2009; CASTRO-VÁZQUEZ; DÍAZ-MAROTO; PÉREZ-COELLO, 2007; SANCHO et al., 1992). O composto 3-deoxyosone é conhecido como composto chave na formação do HMF. Este provém da 1,2 enolização e desidratação da glicose ou da frutose. A desidratação adicional e a ciclização de 3-deoxyosone aumentam o conteúdo de HMF. A Figura 6 ilustra um esquema alternativo para a formação de HMF, em alimentos, mostrando as principais vias, sob aquecimento e baixa umidade, além da reação que envolve a formação de um cátion frutofuranosil altamente reativo, que pode ser rapidamente convertido em HMF em pH baixo (pH < 5), como é o caso do mel (CAPUANO; FOGLIANO, 2011).
71
Figura 6. Esquema proposto para a formação de 5-hidroximetilfurfural.
Fonte: adaptado de Perez Locas e Yaylayan (2008).
Os hidrocarbonetos são compostos pouco reativos e a maior
parte deles sofre redução da concentração ao longo do tempo de armazenamento, possivelmente devido a processos de volatilização. Geralmente, a redução da concentração destes compostos diminui com o aumento das massas molares dos hidrocarbonetos. Os processos oxidativos que podem ocorrer durante o armazenamento, transformam hidrocarbonetos em moléculas menores como álcoois que podem ser volatilizados rapidamente. O aumento da concentração de álcoois, durante o armazenamento, pode ser devido à formação via degradação oxidativa lipídica ou por processos de redução de aldeídos catalisados
72
por redutases provenientes de abelhas ou de micro-organismos contaminantes (MOREIRA et al., 2010).
Kańkoniené, Venskutonis e Ceksteryté (2008) detectaram etanol em amostras de mel da Lituânia. A presença de etanol pode estar relacionada com o desenvolvimento de leveduras em alimentos ricos em carboidratos (FUENTE et al., 2007). O hotrienol (3,7-dimetil-1,5,7-octatrien-3-ol) pode ser gerado, em méis submetidos ao tratamento térmico, pelo precursor (E)-2,6-dimetil-6-acetoxi-2,7-octadienal (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CUEVAS-GLORY et al., 2007), ou por outros compostos como o terpendiol I, 8-hidroxilinalool e os lilac aldeídos podem ser formados pela isomerização do 8- hidroxilinalool a lilac álcoois seguida por oxidação (Figura 7) (KUS et al., 2013). Figura 7. Relações entre terpenos.
Fonte: Adaptado de KUS et al., 2013.
Kańkoniené, Venskutonis e Ceksteryté (2008) sugerem que vários aldeídos e cetonas podem ser formados pela oxidação de ácidos graxos no mel, particularmente os ácidos linoleico e linolênico, que podem desenvolver a ranço. O ácido hexadecanóico pode ser formado
73
devido à oxidação aldeídica do hexadecanal durante o armazenamento (Moreira et al., 2010).
Alguns dos ácidos orgânicos, cetonas e benzenos, tais como 2-hidroxi-2-propanona, ácido butanóico, álcool benzílico ou 2-fenil-etanol encontrados no mel fresco aumentam gradualmente a sua concentração com o aumento da temperatura e com o tempo de armazenamento (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010). Contudo, os ácidos de baixa massa molar como os ácidos propanóico e 2-metilpropanóico desapareceram durante 6 meses de armazenamento, provavelmente por serem de cadeias carbônicas curtas, facilitando a volatilização (MOREIRA et al., 2010).
Kańkoniené, Venskutonis e Ceksteryté (2008) relataram que apesar das amostras de mel da Lituânia apresentarem as mesmas classes químicas de compostos, as alterações qualitativas e quantitativas dos mesmos se tornaram evidentes apenas após 3 meses de armazenamento. Os compostos voláteis dos méis de cominho e trevo branco, analisados por headspace, diminuíram em cerca de 70 % após três meses de armazenamento, enquanto no mel de colza, o percentual de perda dos voláteis foi menos expressiva. Para os três méis monoflorais de canola analisados, o conteúdo de compostos voláteis aumentou de 14,7 para 29,8 %.
Kus e colaboradores (2013) avaliaram dois tipos de méis da Polônia e da Espanha quanto ao perfil de compostos voláteis. Eles observaram que o mel é caracterizado por conter alto percentual de compostos derivados da rota do ácido chiquímico, como terpenos, norisoprenóides e alguns compostos como coumaran e metil-1H-indole-acetato. A Figura 8 ilustra as possíveis relações entre os compostos derivados a partir do ácido chiquímico. O ácido benzóico é, possivelmente, formado pela clivagem da cadeia lateral do ácido cinâmico ou pela oxidação do benzaldeído via redução do álcool benzílico, contudo, o ácido 2-fenilacético pode ser formado pela descarboxilação de ácido fenilpirúvico ou pela oxidação de 2-feniletanol.
74
Figura 8. Compostos derivados a partir do ácido chiquímico.
OHO
HO
OH
OH
O
O OH
NH2
O OH O OH
ácido chiquímico *
ácido fenilpirúvico
transaminação - NH3
fenilalanina (E) - ácido cinâmico *
descarboxilação
O
OH
ácido fenilacético *
oxidaçãoredução
2-feniletanol *
OH
OHO
ácido benzóico *
oxidaçãoredução
benzaldeído *
H O
álcool benzílico *
HO O
redução
oxidação
clivagem da cadeia lateral
Fonte: Adaptado de Kus et al. (2013). 1.5 POSSÍVEIS FORMAS DE EVITAR A DEGRADAÇÃO DO MEL
A produção e as condições de armazenamento dos produtos afetam fortemente a sua qualidade, assim sendo, a produção e a distribuição são parâmetros decisivos. A vida útil dos alimentos e produtos alimentícios determina a sua distribuição. Após a abertura das fronteiras com a Comunidade Europeia, os percursos para os alimentos tornaram-se maiores, necessitando de uma maior vida útil para os alimentos, para que os mesmos não sofram alterações, levando a degradação e seu desperdício (ZWIETERING; ROMBOUTS; RIET, 1993).
Com o mel não é diferente, vários aspectos devem ser levados em consideração em todas as etapas desde a coleta, processamento, armazenamento e até o transporte. Com relação ao trabalho de coleta dos quadros de mel, deve-se impedir a exposição destes ao sol, pois o
75
aumento da temperatura do mel resulta na perda de sua qualidade, pela elevação dos teores de HMF (SEBRAE, 2009).
Após a coleta e extração, o mel é transportado ao entreposto para ser processado e envasado para comercialização. Durante o transporte dos quadros do apiário à unidade de extração, estes devem estar protegidos, para evitar a contaminação com poeira e outras sujidades. O ideal é que as melgueiras sejam transportadas em veículos fechados; caso isso não seja possível, estas devem ser protegidas (cobertas) com uma lona plástica de uso exclusivo para este fim. É importante que o transporte das melgueiras seja breve e que se evitem paradas ao sol com o veículo carregado, evitando a exposição prolongada das melgueiras ao sol durante o descarregamento e na recepção (SEBRAE, 2009).
De acordo com a legislação, os estabelecimentos destinados ao mel e à cera de abelhas são classificados em apiários e entrepostos de mel e cera de abelhas. Apiário é o estabelecimento destinado à produção, industrialização e classificação de mel e seus derivados. Entreposto de mel e cera de abelhas é o estabelecimento destinado ao recebimento, classificação e industrialização do mel e da cera de abelhas (SEBRAE, 2009; BRASIL, 1952).
As instalações dos entrepostos de produtos de origem animal, como o mel, devem seguir as normas indicadas pelo Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (BRASIL, 1952).
O processamento do mel no entreposto, normalmente, segue as etapas de recebimento, descristalização (opcional), filtração, secagem (opcional), homogeneização (para formação do lote), envase, armazenamento e expedição. Na recepção da matéria prima são realizadas anotações referentes à procedência e características do mel recebido. Na descristalização, o mel é aquecido até uma temperatura de 40 ºC. Na filtração, o mel é forçado a passar por um filtro de camisa dupla, onde as sujidades ficam retidas. A desumidificação é realizada dependendo do teor de umidade do mel e da exigência do mercado a qual se destina o produto. Na homogeneização, ocorre a mistura de méis de procedências distintas para a formação de lotes homogêneos. O processo de envase do produto pode ser fracionado ou a granel. O mel envasado deverá ser armazenado em local específico, seco, fresco, mantido ao abrigo da luz e sobre estrados, onde permanecerá até a comercialização, por um período que não comprometa sua qualidade. Deve-se evitar o armazenamento do mel por um longo período de tempo, em regiões muito quentes, onde não seja possível assegurar
76
temperaturas médias de 22 a 24 ºC. A expedição deve ocorrer em área coberta, evitando-se a exposição direta dos produtos ao sol e calor excessivo (SEBRAE, 2009).
A comercialização do mel pode ser realizada para o mercado interno e externo. O mel destinado ao mercado interno pode ser vendido fracionado em potes, bisnagas ou garrafas de plástico ou vidro, podendo ainda ser comercializado a granel em baldes ou tambores para indústrias (alimentícias, cosméticos, farmacêutica) e envazadoras (SEBRAE, 2009; BRASIL, 2000).
Segundo Costa (2007) a condição ideal de armazenamento do mel é, de preferência sob resfriamento, à temperaturas entre 4 a 8 ºC, após o mesmo ter sido acondicionado em vidros limpos e esterilizados. Recomenda-se consumir o mel em até seis meses após a extração, quando o mel for acondicionado e armazenado em condições ótimas de temperatura e higiene. Contudo, de acordo com Chel, Nayak e Kaushik (2008) o mel possui vida útil de 2 anos, quando armazenado em temperaturas entre 18 e 30 °C, e em recipientes herméticos esterilizados e selados.
Diante do fato de não haver uma faixa de temperatura e de tempo específicos de armazenamento do mel, são necessários padrões que possam regulamentar condições ideais de armazenamento para que não ocorram alterações no produto e para que se que tenha um alimento seguro. 1.6 QUIMIOMETRIA
A quimiometria surgiu como uma nova disciplina em química, devido ao aumento expressivo no número de equipamentos analíticos que geram dados multivariados, ou seja, metodologias que fornecem mais de uma medida para uma mesma amostra. Teoricamente, a quimiometria é a aplicação de quaisquer métodos matemáticos e estatísticos para o tratamento de dados químicos. Entre as áreas tradicionais da química, a química analítica é, atualmente, a que mais aplica a quimiometria (TEÓFILO, 2013).
Um dos métodos mais utilizados para abordar as diferentes análises das amostras de méis é a análise de componentes principais (PCA). As aplicações do PCA auxiliam na redução da complexidade de grandes conjuntos de dados e oferecem uma melhor interpretação e compreensão dos resultados (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013a,b; BERTONCELJ et al., 2011) e, ainda, permitem a fácil identificação de dados atípicos e grupos similares (LAZAREVIC et al., 2012). A PCA
77
tem sido utilizada para identificar marcadores em méis e para diferenciar os tipos de méis.
Yücel e Sultanoglu (2013b) avaliaram as características físico-químicas de méis da Turquia, por meio da análise de PCA, para estabelecer as diferenças entre oito tipos de méis (Citrus, Flower, Gossypium, Calluna, Pinus, Capparis, Eucalipto e Petroselinum crispum), e observaram que o mel Citrus, por exemplo, apresentou características diferenciadas comparadas a outros tipos de mel, com relação à baixa concentração de açúcares, refletindo na diminuição da viscosidade, assim como alto valor de pH, matéria insolúvel e protéinas, o que leva ao aumento da condutividade elétrica. Essas observações foram possíveis, pois o mel Citrus foi correlacionado positivamente no CP2 (Componente Principal 2) com a condutividade elétrica, a matéria insolúvel, o pH e o teor de proteína e correlacionado negativamente no CP2 com a glicose, a frutose e a viscosidade. Analisando os resultados obtidos, os autores concluíram que a análise por PCA dos parâmetros físico-químicos avaliados neste estudo foi útil na diferenciação das oito classes méis.
Soria, Martínez-Castro e Sanz (2008) avaliaram méis de Alecrim, Eucalipto, Citrus, Tomilho, Heather, Lavanda, Melato e Multifloral através da análise de PCA. Os autores verificaram que os méis de Eucalipto são perfeitamente distintos do restante dos méis analisados, por seus altos coeficientes de CP3. O CP3 foi associado, principalmente, com altas concentrações de 2,3-butanodiona (diacetil) e octano e baixas concentrações de heptano, dimetilsulfureto e 2-metil-3-buten-2-ol nos méis de Eucalipto. Os autores concluíram que a aplicação de análise estatística multivariada mostrou-se muito próspera para classificar as amostras de acordo com sua origem botânica.
78
CAPÍTULO 2 – CARACTERIZAÇÃO, ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA DE AMOSTRAS DE MEL DE
ABELHAS Apis mellifera L., AO LONGO DO ARMAZENAMENTO
RESUMO
O mel de abelhas Apis mellifera L. é formado por uma mistura complexa de compostos, contendo açúcares, proteínas, enzimas, aminoácidos, ácidos orgânicos, polifenóis, carotenoides, vitaminas e minerais, em concentrações, que podem variar sob influência de diferentes fatores. Sendo muito apreciado como alimento e de elevado valor comercial, é um produto passível de adulterações e transformações químicas, para o qual se fazem necessárias análises de verificação da sua identidade e qualidade, bem como a verificação da manutenção destes parâmetros e possível formação de compostos de degradação ao longo do armazenamento. Sendo o estado de Santa Catarina, um dos maiores produtores nacionais e com o intuito de avaliar a identidade e qualidade dos méis produzidos no estado, foram realizadas a coleta de 33 amostras, provenientes de 8 regiões do estado de Santa Catarina, as quais foram submetidas a verificação dos níveis de umidade, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e acidez livre, como requisitos prévios à seleção de amostras a serem utilizadas em estudo de estabilidade química durante o armazenamento. Após estas análises prévias, foram selecionadas 8 amostras, consideradas adequadas quanto aos parâmetros avaliados, e submetidas a análises complementares de identidade e qualidade. Logo após, estas amostras foram monitoradas ao longo do armazenamento, quanto aos parâmetros de identidade e qualidade: açúcares, umidade, acidez, pH, condutividade elétrica, atividade diastásica, hidroximetilfurfural (5-HMF), cor, atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e individuais. Quantos às avaliações iniciais, as amostras apresentaram os seguintes resultados: sacarose: <LOD a 3,11 (LOD = 0,074 g L−1); frutose: 39,74 a 43,94 g 100 g-1; e glicose: 29,74 a 31,89 g 100 g-1; umidade: 16,20 a 18,60 g 100 g-1; condutividade elétrica: 209,57 a 626,03 mS cm-1; pH: 3,79 e 4,55; acidez livre: 17,55 a 31,83 meq kg-1; atividade diastásica: 11,14 a 22,69 unidades Göthe, 5-HMF: <LOQ (LOQ: 0,31 mg L-1) e cor (L*: 42,79 a 52,37; a*: -1,45 a 8,29; b*: 31,88 a 43,51). Com relação ao armazenamento ao longo do tempo, os açúcares, o pH, a condutividade elétrica, a atividade diastásica e a cor diminuíram suas concentrações, contudo, a acidez e a umidade aumentaram, porém apenas a amostra B, apresentou teor de umidade acima do permitido pelas legislações. As concentrações dos compostos fenólicos totais e atividade antioxidante aumentaram. Foram identificados e quantificados 22 compostos fenólicos sendo 12 ácidos
81
fenólicos, 1 cumarina e 9 flavonóides, sendo o ácido ρ-cumárico o composto com maior concentração na maioria das amostras. A análise prévia, para seleção das amostras, mostrou que algumas amostras apresentaram valores acima do permitido pela legislação brasileira, Codex Alimentarius e União Europeia, fixando a extrema importância de garantir a qualidade do produto apresentado ao mercado. O armazenamento doméstico alterou as concentrações dos compostos químicos presentes nas amostras de mel de Apis mellifera L, contudo, apenas a amostra B apresentou o teor de umidade acima do permitido pelas legislações brasileira e internacionais, podendo, as demais amostras de mel serem consumidas após 540 dias de armazenamento considerando estes parâmetros avaliados. E os compostos fenólicos individuais apresentaram comportamento linear ao longo do armazenamento, em sua totalidade. Palavras-chave: Mel; Apis mellifera L.; Parâmetros de identidade e qualidade; Autenticidade. 1 INTRODUÇÃO
O mel é um dos alimentos mais consumidos no mundo, e nos últimos anos seu consumo tem aumentado rapidamente, impulsionado principalmente, por suas propriedades medicinais e nutricionais (SIMSEK; BILSEL; GOREN, 2012). Constituído por uma mistura de carboidratos: frutose (30 – 44 %), glicose (22 - 40%), sacarose (0,25 - 7,7 %), e em menores quantidades, água, ácidos orgânicos, vitaminas, minerais, compostos fenólicos e compostos voláteis (ALQARNI et al., 2012; CIULU et al., 2011; BENTABOL MANZANARES et al., 2011; CAJKA et al., 2009; PADOVAN et al., 2007; PONTES; MARQUES; CÂMARA, 2007).
Sua composição química é influenciada por fatores bióticos e abióticos em torno da colônia de abelhas, ou seja, pela origem floral, composição do solo no qual as plantas estavam localizadas, tipos de néctar utilizados pelas abelhas para produzi-lo, práticas de manuseio pós-colheita. Portanto, para garantir a identidade e qualidade do mel de Apis mellifera L., parâmetros físico-químicos como glicose, frutose, sacarose, teor de água, sólidos insolúveis em água, cinzas, acidez, pH, condutividade elétrica, cor, conteúdo de HMF, atividade diastásica, características microbiológicas e sensoriais devem ser avaliados (BELAY, et al., 2013; ALQARNI; OWAYSS; MAHMOUD, 2012; AL et al., 2009).
82
As análises físico-químicas são realizadas com o intuito de
verificar sua autenticidade, apontando a possível presença de componentes artificiais ou adulterações (CANTARELLI, et al., 2008), como adição de água e açúcar e/ou xaropes; abelhas alimentadas com açúcares e/ou xaropes ou mel artificial e rotulagem inadequada como resultado da mistura dos méis provenientes de diferentes origens florais e geográficas (CAJKA et al., 2009).
A autenticidade do mel é definida internacionalmente pelo Codex Alimentarius, União Europeia e algumas legislações nacionais que estabelecem a identidade e os requisitos essenciais de qualidade que o mel, destinado ao consumo humano direto, deve cumprir. As normas aplicam-se aos méis produzidos pelas abelhas e abrangem todos os estilos de apresentações de mel que são finalmente, destinados ao consumo (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), regulamentou a Instrução Normativa nº 11, de 20 de outubro de 2000, que estabelece a identidade e os requisitos mínimos de qualidade que deve cumprir o mel destinado ao consumo humano direto. Esta regulamentação estabelece os limites mínimos e máximos para parâmetros físico-químicos relacionados à pureza, deterioração e maturidade (BRASIL, 2000).
Além de verificar a autenticidade dos méis, é muito importante acompanhar as alterações que podem ocorrer durante o armazenamento, pois por questões comerciais, o mel, muitas vezes é armazenado até um ano antes do seu consumo (MOREIRA et al., 2007).
Os açúcares presentes no mel podem se degradar, quando armazenados por longo período, através de enzimas e pela Reação de Maillard, transformando-se em novos compostos, tendo os furanos como exemplo, sendo o 5-HMF o mais conhecido e estudado (SOLDATKIN et al., 2013; CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; PEREIRA et al., 2011; MOREIRA et al., 2010; COTTE et al., 2004).
Além dos açúcares, outros constituintes são passíveis de degradação ao longo do armazenamento, alterando as características iniciais do mel, como a acidez encontrada no mel, resultado da presença de ácidos orgânicos e de íons inorgânicos, como fosfatos, sulfatos e cloretos. Avaliar a acidez ao longo do tempo é importante ferramenta para verificar a possível fermentação (ALVES et al., 2013; BELAY et al., 2013; ALQARNI et al., 2012; CHAKIR et al., 2011), visto que altos
83
valores de acidez podem indicar a metabolização dos açúcares e conversão em ácidos orgânicos (TORNUK et al., 2013).
O pH, assim como a acidez, é outro parâmetro importante a ser avaliado durante o armazenamento do mel, podendo ser utilizado como indicador de possível desenvolvimento microbiano, devendo ser monitorado durante o armazenamento do mel por influenciarem na textura e estabilidade (CORBELLA; COZZOLINO, 2006; TERRAB et al., 2002).
A atividade diastásica também pode ser utilizada como indicativo de envelhecimento do mel, pois a atividade enzimática pode ser reduzida ou inativada ao longo do armazenamento (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013b; GOMES et al., 2010). Juntamente com a atividade diastásica, os teores de 5-HMF também são apresentados como fator importante na avaliação do armazenamento, pois méis frescos não devem conter ou contém apenas traços, garantindo que o mel não foi processado pelo calor nem armazenado por longos períodos de tempo (BOUSSAID et al., 2014; BELAY et al., 2013; ANKLAM, 1998).
A cor é destacada como critério importante na aquisição de méis para consumo direto, no entanto, o armazenamento pode conferir escurecimento ao mel e juntamente com outras alterações sensoriais, podem ter efeitos prejudiciais na aparência e qualidade, modificando inclusive o sabor original (PIOTRASZEWSKA-PAJĄK; GLISZCZYŃSKA-ŚWIGŁO, 2015; GONZALES; BURIN; BUERA, 1999).
Além das alterações nas características físico-químicas, os compostos fenólicos também podem sofrer reações de degradação durante o processamento ou armazenamento dos alimentos. Nestas reações são incluídos processos químicos e bioquímicos. Apesar de a oxidação enzimática ser o mecanismo mais importante de degradação de polifenóis, outras razões também podem catalisar transformações e degradação, como reações químicas, fermentações, processamento e armazenamento (de la ROSA; ALVAREZ-PARRILLA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010).
O objetivo deste estudo foi avaliar amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. provenientes de oito regiões do estado de Santa Catarina, Brasil, considerando os padrões de identidade e qualidade, para, após, avaliados estes parâmetros, selecionar amostras que atendam aos parâmetros recomendados pelas legislações nacionais e internacionais, a fim de acompanhar a estabilidade das amostras selecionadas durante simulação de armazenamento doméstico
84
prolongado e possível definição de marcadores de degradação. Na primeira etapa, os méis foram avaliados com o intuito de verificar a autenticidade e, em uma segunda etapa, as amostras de mel íntegras, foram submetidas a armazenamento doméstico, por um período de 540 dias, avaliadas em intervalos de 90 dias, quanto aos padrões de identidade e qualidade, o potencial bioativo (através dos níveis de atividade antioxidante), e a estabilidade de compostos fenólicos e compostos voláteis com o intuito de definir marcadores químicos de degradação e indicadores de qualidade e estabilidade durante a armazenagem. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MATERIAL
Todos os reagentes utilizados, nacional ou importados, foram de grau analítico. O TBS, SDS, ácido sórbico, CTAB, cafeína, 5-HMF, fosfato de monossódio monohidratado, fosfato dissódico anidro foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA), o hidróxido de sódio, cloreto de sódio, acetato de sódio, amido solúvel, iodo, ácido ascórbico, cloreto férrico, sulfato ferroso, ácido gálico, carbonato de sódio, frutose, glicose, sacarose e sulfato de sódio anidro foram adquiridos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e o metanol e o ácido fórmico foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA).
Os padrões ácido 4-aminobenzóico, ácido salicílico, ácido cinâmico, ácido p-anísico, ácido mandélico, vanilina, ácido 4-hidroximetilbenzóico, protocatecuico, umbeliferona, 4-hidroxicinâmico, ácido p-cumárico, ácido metoxifenilacético, ácido vanílico, ácido gálico, 4-metilumbeliferona, coniferaldeído, ácido caféico, siringaldeído, escopoletina, ácido trans ferúlico, ácido siríngico, sinapaldeído, ácido sinápico, resveratrol, crisina, pinocembrina, apigenina, galangina, naringenina, kaempferol, eriodictiol, aromadendrina, fustina, catequina, epicatequina, hispidulina, ácido elágico, quercetina, taxifolina, miricetina, carnosol, ácido clorogênico, ácido rosmarínico, isoquercetrina, naringina, rutina foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA) e da Fluka Chemie AG (Buchs, Suíça). A água utilizada foi filtrada por sistema de desionização (18.2 MΩ cm) (desionizador Milli-Q, Millipore, Bedford, EUA) e os capilares Polymicro (Polymicro Technologies, Phoenix, EUA).
Os principais equipamentos utilizados foram: refratômetro Tropenmodell I (Carl Zeiss Jena, Alemanha), condutivímetro modelo Tec-4MP (TECNAL, Brasil), pH-metro MD-20 (Digimed, Brasil),
85
colorímetro (Minolta Chroma Meter CR-400, Osaka, Japão), espectrofotômetro (Spectro Vision UV-Vis, 1810-S Beijing, China), agitador magnético (Fisatom 752A, Minas Gerais, Brasil), eletroforese capilar modelo 7100 (Agilent Technologies, Palo Alto, EUA), centrífuga modelo 280R (Fanem, São Paulo, Brasil), banho termostático Deprom dbm120 (São Paulo, Brasil), mini spin Eppendorf AG 5453 (Hamburgo, Alemanha), cromatógrafo líquido Agilent Technologies (Alemanha) 1200 Series acoplado a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo e íon trap linear, modelo Q Trap 3200 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canada) que foi utilizado em conjunto com ionização por eletrospray (ESI) Turbo Ion Spray TM (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canada), centrífuga Micro Centrifuga mini spin Eppendorf AG 5453 (Hamburgo, Alemanha) e rotaevaporador Fisatom 802 (São Paulo, Brasil).
2.2 AMOSTRAS DE MEL
As amostras foram adquiridas através de parceria com apicultores do estado de Santa Catarina, considerando regiões de maior potencial produtivo de mel no estado. Foram coletadas amostras de mel desoperculadas, centrifugadas, decantadas e embaladas nos entrepostos e imediatamente enviadas ao Laboratório de Química de Alimentos/UFSC. As coletas totalizaram 33 amostras de mel de abelhas de Apis mellifera L., as quais foram analisadas quanto aos parâmetros de identidade e qualidade, servindo como etapa de triagem e seleção de amostras aptas ao estudo de estabilidade durante armazenamento prolongado.
A Tabela 8 ilustra a descrição geográfica dos municípios de origem das amostras.
86
Tabe
la 8
. Des
criç
ão g
eogr
áfic
a do
s mun
icíp
ios c
atar
inen
ses d
e or
igem
das
am
ostra
s de
mel
, sel
ecio
nado
s apó
s aná
lise
Cód
igo
Am
ostr
a M
unic
ípio
L
atitu
de
Lon
gitu
de
Alti
tude
(m
) D
ata
da
cole
ta
Flor
ada
pr
edom
inan
te
1 A
Ita
iópo
lis
26º 2
0' 1
1" S
49
º 54'
23"
W
925
12/2
013
Car
ne d
e va
ca (C
leth
ra
scab
ra P
ers.)
e o
utra
s flo
res
5 B
Fl
oria
nópo
lis
27º 3
5' 4
8" S
48
º 32'
57"
W
3 02
/04/
2014
Si
lves
tre
13
C
São
Joaq
uim
28
º 17'
38"
S
49º 5
5' 5
4" W
13
53
18/0
3/20
14
Vas
sour
a B
ranc
a (B
acch
aris
le
ucoc
epha
la D
usén
) 12
D
O
rlean
s 28
º18,
14.1
7” S
49
º15,
44.5
5” O
22
0 12
/201
3 U
va d
o ja
pão
(Hov
enia
du
lcis
) 30
E
Vid
al R
amos
27
º22‟
36.1
94”
49º1
9‟1.
481”
57
0 06
/05/
2014
Si
lves
tre
25
F Sã
o M
igue
l do
Oes
te
26º 4
3' 3
1" S
53
º 31'
05"
W
645
12/2
013
Silv
estre
17
G
Vid
eira
27
º 00'
30"
S
51º 0
9' 0
6" W
75
0 08
/04/
2014
Si
lves
tre
28
H
Vito
r Mei
rele
s 27
º49‟
32,9
3” S
49
º55‟
28,2
1” O
37
0 24
/12/
2013
Si
lves
tre
Font
e: p
rópr
io a
utor
87
2.3 PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE 2.3.1 Açúcares
As determinações dos açúcares: frutose, glicose e sacarose, foram realizadas de acordo com Rizelio e colaboradores (2012a), através de método indireto por CE.
Massas de 2,5 g de mel foram dissolvidas em água desionizada, transferidas para balões volumétricos e aferidos para 50 mL. As soluções das amostras foram centrifugadas por 4 minutos a 14000 RPM, após, dissolvidas na proporção de 1:10 (v/v) com água desionizada. Estas soluções foram injetadas diretamente no equipamento de CE. Para as curvas padrão, foram preparadas soluções estoque dos padrões de frutose, glicose e sacarose, todas na concentração de 50 mmol L-1 em água desionizada e estocadas a -18 ºC até o momento das análises.
O eletrólito de corrida foi composto por 20 mmol L-1 de ácido sórbico, 0,2 mmol L-1 de CTAB e 40 mmol L-1 de NaOH, em pH 12,2. O capilar utilizado foi de 60 cm de comprimento total, 8,5 cm de comprimento efetivo e 50 μm de diâmetro interno. As injeções foram realizadas no modo hidrodinâmico (-50 mbar, 3 s), e a voltagem aplicada foi de 25 kV. A temperatura, nas separações, foi mantida a 25 ºC, e as detecções realizadas no modo indireto em 254 nm. Os resultados foram expressos em g 100 g-1.
2.3.2 Umidade, pH, acidez livre e atividade diastásica
A umidade, o pH, a acidez e a atividade diastásica foram determinados de acordo com a AOAC (2005), seguindo os métodos 969.38, 962.19 e 920.180, respectivamente.
A umidade das amostras foi determinada por refratômetria, onde os índices de refração foram verificados à temperatura ambiente, utilizando um refratômetro de Abbé, e as leituras obtidas, foram corrigidas para a temperatura padrão, de 20 ºC, através do uso de um fator de correção de 0,00023 por grau acima ou abaixo do padrão. Os teores de umidade foram determinados correspondentes aos índices de refrações corrigidos usando a tabela de Wedmore para a obtenção dos resultados, e expressos em g 100 g-1 de mel (AOAC, 2005).
Para a determinação da acidez livre, massas de 10 g das amostras foram diluídas em 75 mL de água destilada descarbonatada com agitação magnética. Após a verificação do pH inicial, a solução foi titulada com NaOH 0,1 mol L-1 até atingir pH 8,5. O valor da acidez livre foi calculado de acordo com a equação:
88
( )
sendo: v corresponde ao volume (mL) de NaOH 0,1 mol L-1 gasto na titulação da amostra, f corresponde a correção da molalidade da solução de NaOH 0,1 mol L-1 e m corresponde a massa da amostra (g) utilizada. Os valores de acidez foram expressos em mEq kg-1 (AOAC, 2005).
A atividade diastásica foi determinada de acordo com AOAC
(2005). Massas de 5 g de mel foram diluídas em 10 mL de água desionizada, tamponadas com 2,5 mL de tampão acetato 1,59 mol L-1 (pH 5,3), em balão volumétrico de 25 mL contendo 1,5 mL de NaCl 0,5 mol L-1 e aferidos com água desionizada. A solução foi transferida para um tubo de ensaio e acondicionada em banho-maria a 40 ºC juntamente com um segundo tubo de ensaio contendo solução de amido 1 %. Após 15 minutos, 2,5 mL da solução de amido foram transferidos para o tubo contendo 5 mL da solução de mel, com agitação e cronometragem do tempo. Após 1 minuto, 0,25 mL da mistura foi combinada com 2,5 mL de solução de iodo 0,00035 mol/L, e volume de água destilada requerido para que uma absorbância inicial, a 660 nm, de 0,760 ± 0,02, de acordo com o padrão de amido. A reação foi repetida a cada minuto até que a absorbância atingisse valor igual ou inferior a 0,235. Com os valores obtidos, foram construídos gráficos da absorbância versus tempo, para o cálculo de tx, que é o tempo (minutos) necessário para redução da absorbância a 0,235. O quociente 300/tx resultou na atividade diastásica, expressa em mL de solução de amido 1 % (m/v) hidrolisada por 1 hora pela enzima presente em 1 g de mel, e os resultados expressos em unidades Göthe (AOAC, 2005; KÜÇÜK et al., 2005).
2.3.3 Condutividade elétrica
A condutividade elétrica das soluções de mel diluídas em água desionizada (20 % m/v) foi determinada por condutivimetria a 25 ºC, e os resultados expressos em mS cm-1 (BOGDANOV, 1999).
2.3.4 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF)
As concentrações de 5-HMF foram determinadas por metodologia descrita segundo Rizelio e colaboradores (2012b), utilizando método de MECK (Do inglês: Micellar electrokinetic chromatography) com detecção por DAD (Do inglês: Diode array detector), e os resultados expressos em mg kg-1.
89
Para a quantificação, massas de 5 g das amostras foram dissolvidas com água desionizada e transferidas para balão volumétrico de 10 mL, adicionados 2 mL de cafeína (1000 mg L-1) como padrão interno, aferido o volume para 10 mL com água desionizada. As soluções das amostras foram centrifugadas por 4 minutos a 14000 RPM. As soluções das amostras foram injetadas diretamente no equipamento de CE de acordo com o descrito na metodologia aplicada. Para a curva padrão foi preparada uma solução estoque do padrão de HMF na concentração de 1000 mg L-1 em metanol e estocada a -4 ºC até a realização das análises.
As condições de separação utilizadas no método foram: eletrólito composto de tetraborato de sódio (TBS) 5 mmol L-1, dodecil sulfato de sódio (SDS) 120 mmol L-1, em pH 9,3; capilar de 32 cm de comprimento total, 8,5 cm de comprimento efetivo e 50 μm de diâmetro interno; injeção hidrodinâmica a -50 mbar por 3 segundos; voltagem de -15 kV; temperatura de 25 ºC; e detecção direta em 284 nm. 2.3.5 Cor
Para determinação da cor das amostras foi utilizado o método CIE L*a*b*, com o colorímetro ajustado para operar com iluminante D65 e ângulo de observação de 10º, previamente calibrado. As amostras de mel foram colocadas em cubetas de poliestireno que continham 14 mL de volume e, posteriormente, realizadas as leituras dos parâmetros L*, a* e b*, diretamente do equipamento. O parâmetro L* (luminosidade) varia de 0 (preto) a 100 (branco). O parâmetro a* indica o grau de cor vermelha (+a*) ou verde (-a*), enquanto o parâmetro b* mede a grau de cor azul (-b*) ou amarela (+b*). Foram realizadas três medições para cada amostra. Nas amostras que exibiram cristalização, foi utilizado aquecimento, em banho-d‟água, a 45 ºC por tempo suficiente para dissolução completa dos cristais (BERTONCELJ et al., 2007).
2.4 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA
As amostras de mel selecionadas, com comprovado atendimento aos parâmetros de identidade e qualidade exigidos pela Instrução Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000 do MAPA, Codex Alimentarius (CODEX STAN 12-1981) e União Europeia (Council Directive 2001/11), foram avaliadas considerando a estabilidade em ambiente domestico simulado, de acordo com Moreira et al. (2010), com adaptações. Massas de 63 g, das respectivas amostras foram mantidas em frascos de polietileno próprios para envase comercial de mel,
90
fechados de maneira adequada, garantindo o isolamento completo das amostras com o ambiente externo e mantidos a temperatura ambiente (20 ± 4 ºC), ao abrigo da luz. As avaliações das amostras foram realizadas em um período de 540 dias de armazenamento, com intervalos analíticos de 90 dias, considerando as determinações de açúcares (glicose, frutose e sacarose), umidade, pH, acidez, atividade diastásica, cor, condutividade elétrica, HMF, conforme descrito no item 2.3, avaliação da atividade antioxidante e compostos fenólicos totais no tempo zero (quando as amostras chegaram ao Laboratório de Química de Alimentos CCA/UFSC) e em 6 intervalos de tempo, totalizando 7 avaliações. Os compostos fenólicos individuais foram analisados nos tempos zero (T0), 270 dias de armazenamento (tempo 3 = T3) e 450 dias de armazenamento (tempo 5 = T5), totalizando 3 avaliações.
2.4.1 Avaliação de compostos fenólicos totais e atividade antioxidante
O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado através do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (SINGLETON; ROSSI, 1965), e os resultados foram expressos em miligramas de equivalente a ácido gálico (mg EAG 100 g-1) de mel.
A avaliação da atividade antioxidante das amostras foi realizada através de dois métodos baseados em diferentes princípios e condições experimentais: o método de sequestro de radicais do DPPH, de acordo com Brand-Williams, Cuverlier e Berset (1995), sendo os resultados expressos em miligramas equivalentes a ácido ascórbico (mg EAA 100 g-1 de mel) e o método do poder redutor de FRAP, descrito por Benzie e Strain (1996), modificado por Bertoncelj et al. (2007), com seus resultados expressos em μmols equivalentes a Fe (II) 100 g-1 de mel.
2.4.2 Identificação e quantificação de compostos fenólicos 2.4.2.1 Preparação da amostra
O processo de extração foi realizado de acordo com Trautvetter, Koelling-Speer e Karl Speer (2009), com adaptações, onde massas de 1 g das amostras foram adicionadas de 1 mL de solução aquosa de cloreto de sódio 2% (m/v), mantidas sob agitação constante por 1 minuto, seguidas de cinco extrações sequenciais com volumes de 2 mL de acetato de etila. As fases orgânicas foram combinadas e secas com sulfato de sódio anidro durante 15 minutos, seguidos por filtração e concentração em evaporador rotativo (40 ± 2 ºC). Os extratos resultantes suspensos em 1 mL de água: metanol (70:30), centrifugados a por 4
91
minutos a 14000 rpm e injetados em sistema de cromatografia liquida acoplado ao detector de massas em tandem (LC-ESI-MS/MS). 2.4.2.2 Separação e quantificação dos compostos por LC-ESI-MS/MS
A avaliação dos compostos foi executada em sistema cromatográfico acoplado a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo e íon trap linear, que foi utilizado em conjunto com ionização por eletrospray em modo negativo.
Os compostos fenólicos foram separados em coluna Synergi TM (4.0 μm, 2.0 x 150 mm d.i.; Phenomenex, USA). A fase móvel consistiu de uma solução de metanol 95 % e água 5 % (A) e ácido fórmico 0,1 % (B). A separação foi realizada a 30 °C utilizando eluição por gradiente, segmentado de acordo com as seguintes etapas: 0 – 5 min, 10 % A; 5 – 7 min, 90 % A; 7 – 10 min, 90 % A; 10 – 17 min, 10 % A. O fluxo utilizado foi de 250 µl min-1 e volume de injeção de 10 μL. Os compostos foram monitorados utilizando monitoramento de reações múltiplas (MRM). A identificação dos compostos foi realizada com base no tempo de retenção, íon precursor e seus fragmentos através da comparação com os respectivos padrões disponíveis comercialmente. A otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas foi realizada por infusão direta de soluções contendo os compostos de interesse individualmente, apresentados na Tabela 9. O software Analyst versão 1.6.2 foi utilizado para aquisição e tratamento dos dados. A quantificação foi realizada monitorando um íon quantitativo selecionado para cada composto e utilizando curvas de calibração construídas em razão dos compostos previamente identificados com os valores da área do pico do analito versus a concentração. Os LOD (limite de detecção) e LOQ (limite de quantificação), foram obtidos a partir da relação sinal ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente (RIBANI et al., 2004). As concentrações dos compostos nas amostras foram expressas em µg por g-1 de mel.
92
Tabela 9. Parâmetros do espectrômetro de massas obtidos pela infusão dos padrões de compostos fenólicos individualmente
Compostos fenólicos DP EP CEP CE CXP 4-aminobenzóico -20,00 -9,50 -10,00 -16,00 -2,00 Ácido salicílico -25,00 -2,50 -10,00 -24,00 -2,00 Ácido cinâmico -25,00 -9,00 -10,00 -16,00 -2,00 Ácido gálico -25,00 -11,00 -12,00 -20,00 -4,00 Ácido protocatecuico -26,00 -9,00 -17,32 -17,00 -4,00 Ácido ρ-cumárico -21,00 -4,00 -17,69 -13,00 -6,00 Taxifolina -95,00 -10,50 -16,00 -30,00 -2,00 Rutina -31,00 -5,00 -34,19 -27,00 -6,00 Quercetina -80,00 -6,00 -14,00 -32,00 0,00 Resveratrol -50,00 -8,50 -18,00 -24,00 -4,00 Miricetina -65,00 -4,50 -18,00 -34,00 -2,00 Aromadendrina -45,00 -4,00 -16,00 -32,00 -2,00 Hispidulina -50,00 -7,00 -22,00 -14,00 -4,00 Campferol -75,00 -4,50 -16,00 -62,00 -2,00 Ácido ρ-anísico -25,00 -5,00 -10,00 -18,00 -2,00 Ácido mandélico -20,00 -7,50 -10,00 -12,00 -2,00 Vanilina -25,00 -3,00 -14,00 -14,00 -2,00 Ácido 4– hidroximetilbenzoico
-30,00 -6,50 -10,00 -18,00 -2,00
Ácido 3,4 hidroximetilbenzoico
-30,00 -7,00 -10,00 -20,00 -2,00
Umbeliferona -55,00 -4,50 -10,00 -22,00 -4,00 Ácido 4-hidroxicinâmico -25,00 -10,50 -12,00 -20,00 -2,00 Ácido metoxifenilacético -10,00 -10,00 -10,00 -6,00 -2,00 Ácido vanílico -30,00 -7,00 -10,00 -18,00 -2,00 4-metilumbeliferona -45,00 -10,50 -10,00 -28,00 -2,00 Coniferaldeído -25,00 -10,00 -12,00 -20,00 -2,00 Ácido cafeico -30,00 -11,00 -10,00 -22,00 -2,0 Siringaldeído -25,00 -4,50 -10,00 -20,00 -4,00 Escopoletina -35,00 -4,00 -12,00 -14,00 -2,00 Ácido ferúlico -40,00 -7,00 -10,00 -24,00 -2,00 Ácido siríngico -30,00 -10,50 -12,00 -28,00 -2,00 Sinalpadeído -30,00 -3,00 -12,00 -22,00 -2,00 Ácido sinápico -30,00 -12,00 -16,00 -22,00 0,00 Crisina -65,00 -10,00 -20,00 -52,00 -2,00 Pinocembrina -60,00 -12,00 -22,00 -54,00 -2,00 Apigenina -75,00 -9,00 -14,00 -46,00 -2,00 Galangina -75,00 -8,50 -16,00 -64,00 -10,00 Naringenina -60,00 -4,50 -12,00 -28,00 -2,00 Carnosol -75,00 -5,00 -16,00 -16,00 -4,00 Ácido clorogênico -25,00 -5,00 -24,00 -28,00 -2,00
93
Ácido rosmarínico -50,00 -3,00 -18,00 -28,00 -4,00 Isoquercetina -245,00 -3,00 -48,00 -44,00 -2,00 Naringina -250,00 -4,00 -36,00 -52,00 -2,00 Eriodictiol -75,00 -9,50 -16,00 -36,00 -4,00 Fustina -45,00 -4,00 -14,00 -38,00 -2,00 Catequina -55,00 -4,50 -14,00 -34,00 -4,00 Epicatequina -290,00 -4,00 -16,00 -40,00 -2,00 Ácido elágico -50,00 -10,50 -16,00 -58,00 0,00 DP - Potencial de desagregação; EP – Potencial de entrada; CEP – Potencial de entrada da célula de colisão; CE – Energia de colisão; CXP - Potencial de saída da célula de colisão. Fonte: próprio autor
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O pacote estatístico STATISTICA versão 7.0 para Windows (Statsoft) foi utilizado para as análises, que foram realizadas em triplicata de preparo e os dados apresentados como média ± desvio padrão das amostras. Os resultados analíticos das médias de cada amostra foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de Tukey para avaliar diferenças entre as médias, sendo consideradas diferenças significativas para p < 0,05 para um nível de confiança de 95 %.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na primeira etapa do estudo, todas as amostras de mel, que chegaram ao Laboratório de Química de Alimentos/UFSC, foram codificadas com números de 1 a 33 e receberam letras de A a H para diferenciar as regiões de origem das amostras. Em seguida, todos os méis foram analisados quanto aos parâmetros, umidade, 5-HMF e acidez livre, e os resultados estão apresentados na Tabela 10. Foram selecionadas as amostras, dentre as mesmas regiões, que apresentassem os teores para umidade, 5-HMF e acidez livre, considerando os índices estabelecidos pelas legislações brasileira e internacionais em vigor, além de considerar a data de coleta.
94
Tabela 10. Umidade, 5-HMF, acidez e data de coleta das amostras de mel de Apis mellifera L. antes da triagem e seleção Código Município de
coleta das amostras/Amostra
Umidade (g 100 g-1)
5-HMF (mg kg-
1)
Acidez (meq kg-1)
Data da coleta
1 Itaiópolis/A 17,00 <LOQ 31,83 12/13 2 Itaiópolis/A 17,80 <LOQ 22,15 11/13 3 Santa Terezinha/A 17,80 <LOQ 24,40 11/12/13 4 Itaiópolis/A 18,40 <LOQ 32,72 01/14 5 Major Gercino/B 17,40 <LOQ 31,42 02/04/14 6 Águas Mornas/B 18,20 <LOQ 27,51 01/14 7 Anitápolis/B 19,40 <LOQ 19,03 28/10/13 8 Anitápolis/B 18,20 <LOQ 16,11 01/14 9 Anitápolis/B 18,20 <LOQ 23,12 28/12/13
10 Anitápolis/B 18,60 <LOQ 24,93 25/10/13 11 Jaguaruna/D 17,40 <LOQ 51,51 04/14 12 Orleans/D 17,00 <LOQ 17,55 12/13 13 São Joaquim/C 16,20 <LOQ 27,96 18/03/14 14 São Joaquim/C 18,20 <LOQ 14,05 18/03/14 15 São Joaquim/C 17,40 <LOQ 29,04 14/02/14 16 Videira/C 19,00 <LOQ 26,88 30/11/2013 17 Tangará/G 17,00 <LOQ 31,13 08/04/2014 18 Videira/G 18,60 <LOQ 27,05 10/04/14 19 Videira/G 17,80 <LOQ 25,16 10/04/14 20 Videira/G 17,40 <LOQ 24,51 10/04/14 21 Fraiburgo/G 18,20 <LOQ 27,15 03/04/14 22 Fraiburgo/G 18,20 <LOQ 30,19 03/04/14 23 São Miguel do
Oeste/F 18,47 <LOQ 22,17 11/13
24 Itaiópolis/A 18,07 <LOQ 23,10 05/01/14 25 Descanso/F 17,40 <LOQ 19,45 12/13 26 São Miguel do
Oeste/F 18,47 <LOQ 15,92 2012
27 Taió/H 16,93 <LOQ 49,43 06/05/14 28 Vitor Meireles/H 17,40 <LOQ 24,71 24/12/13 29 Vitor Meireles/H 19,80 <LOQ 42,95 02/05/14 30 Vidal Ramos/E 18,60 <LOQ 24,92 06/05/14 31 Vidal Ramos/E 18,20 <LOQ 32,31 06/05/14 32 Vidal Ramos/E 17,40 <LOQ 23,88 06/05/14 33 Vidal Ramos/E 18,53 <LOQ 40,82 06/05/14
Fonte: próprio autor Depois de avaliados os requisitos de umidade, 5-HMF e acidez
livre, foram consideradas adequadas para o estudo de vida útil, as 8
95
amostras de mel correspondentes às 8 regiões do estado de Santa Catarina, apresentadas na Tabela 8.
Após a triagem das amostras, realizaram-se as determinações analíticas para avaliação dos padrões de identidade e qualidade nas amostras selecionadas para o estudo de vida útil, a fim de verificar se as mesmas atendiam a todos os padrões estabelecidos pelas legislações nacionais e internacionais, conforme os dados ilustrados nas Tabelas 11; 12; 13 e 14.
A Tabela 11 ilustra as concentrações de sacarose, frutose e glicose nas amostras de mel de Apis mellifera L. selecionadas para o estudo.
Tabela 11. Concentrações de sacarose, frutose e glicose (g 100 g-1) determinadas nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo
Amostra Sacarose Frutose Glicose F + G F/G A <LOQ 41,42 ± 1,28ab 29,77 ± 0,78b 71,19 1,39 B <LOQ 39,74 ± 0,95b 30,01 ± 0,65b 69,75 1,32 C <LOQ 41,96 ± 0,89ab 31,89 ± 0,58a 73,85 1,32 D 3,11 ± 0,04 43,07 ± 1,03a 29,94 ± 0,62b 73,02 1,44 E <LOQ 42,33 ± 0,94ab 30,43 ± 0,60ab 72,76 1,39 F <LOQ 43,94 ± 0,96a 29,74 ± 0,53b 73,68 1,48 G <LOQ 43,17 ± 0,71a 30,92 ± 0,41ab 74,10 1,40 H <LOQ 43,74 ± 0,76a 30,79 ± 0,46ab 74,53 1,42
Valores expressos como média ± desvio padrão (n = 3 para cada amostra). a-b Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05). F + G = soma dos conteúdos de frutose e glicose. F/G = proporção entre os conteúdos de frutose e glicose. LOD = Limite de quantificação (0,074 g L−1) na curva de calibração. Fonte: próprio autor
De acordo com o ilustrado na Tabela 11, a sacarose foi
detectada em apenas uma das amostras, no entanto em concentração inferior a estipulada pela legislação brasileira, a qual preconizada para o mel floral, a concentração máxima de 6 g 100 g-1 de sacarose aparente (BRASIL, 2000). Escuredo et al. (2013) avaliaram cento e oitenta e sete amostras de méis coletadas no Noroeste da Espanha e todos os valores encontrados foram menores do que o permitido pelo Codex Alimentarius e pela União Européia, que estabelecem o máximo de 5 g 100 g-1 para o mel floral. Estes valores indicam méis maduros e manejados adequadamente (PUSCAS; HOSU; CIMPOIU, 2013; TORNUK et al.,
96
2013; LI et al., 2012; GOMES et al., 2010). Al et al. (2009) avaliaram vinte e quatro amostras de méis de diferentes regiões da Romênia e observaram concentrações de sacarose de até 0,81 g 100 g-1. A concentração de sacarose também foi avaliada em onze amostras de méis produzidos em diferentes regiões da Argélia, em que foram observados valores entre 0,08 a 8,31 g 100 g-1 (OUCHEMOUKH; LOUAILECHE; SCHWEITZER, 2007). Méis coletados no Rio de Janeiro e Minas Gerais, Brasil, foram avaliados por Ribeiro et al. (2014), cujos teores de sacarose variaram entre 2,2 a 3,9 g 100 g-1 nas oitenta amostras de mel estudadas.
As concentrações de frutose nas amostras estudadas variaram entre 39,74 e 43,94 g 100 g-1 (Tabela 11) e glicose entre 29,74 e 31,89 g 100 g-1 (Tabela 11). As concentrações de açúcares redutores (frutose + glicose) analisados variaram entre 69,75 g 100 g-1 e 74,53 g 100 g-1
(Tabela 11), com a menor concentração entre a amostra B e a maior apresentada pela H. Os resultados (Tabela 11) indicam que as amostras estão de acordo com a Legislação Brasileira, a qual preconiza concentração de açúcares redutores, mínima de 65 g 100 g-1 para mel floral (BRASIL, 2000) e também atendem aos padrões do Codex Alimentarius e da União Européia, estabelecidos como mínimo de 60 g 100 g-1 para o mel floral (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Resultados similares (67,7 e 73,5 g 100 g-1)
foram encontrados por Isla et al. (2011) ao avaliar o conteúdo de açúcares redutores (frutose e glicose) de treze amostras de méis de Apis mellifera L. na Argentina. Can et al. (2015) avaliaram vinte amostras de méis de diferentes regiões da Turquia e verificaram que os teores de açúcares redutores (frutose e glicose) variaram entre 54,84 a 76,18 g 100 g-1, levemente abaixo do preconizado pela legislação. Escuredo et al. (2014) avaliaram cento e trinta e seis amostras de méis do noroeste de Espanha e diferentes regiões da Romênia, das safras 2008, 2009 e 2010, e concluíram que todas as amostras apresentaram concentrações de açúcares redutores (frutose e glicose) superiores a 60 g 100 g-1. Enquanto, oitenta e cinco amostras de mel pertencentes a nove tipos de méis monoflorais produzidos em Tenerife, Espanha, durante os anos de 2005 a 2009 foram avaliados por Bentabol-Manzanares et al. (2014), os quais observaram valores para açúcares redutores entre 68,64 a 75,89 g 100 g-1.
Na relação frutose/glicose (F/G), todas as amostras apresentaram valores maiores do que 1 (Tabela 11), indicando a fluidez das amostras, devido à maior solubilidade da frutose em água
97
comparada à glicose. A proporção média de frutose e glicose, normalmente, é de 1,2:1, sendo utilizada para estimar a cristalização do mel, pois quanto maior o conteúdo de frutose, mais fluído será o mel. A proporção F/G é dependente, em grande parte, da fonte de néctar do qual o mel foi produzido (ESCUREDO et al., 2014; TORNUK et al., 2013; FUENTE et al., 2011; ANKLAM, 1998).
A Tabela 12 ilustra os teores de umidade, condutividade elétrica, acidez livre e pH para as amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo.
Tabela 12. Características físico-químicas de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo
Amostra Umidade (g 100 g-1)
Condutividade elétrica (mS cm-1)
pH Acidez livre (meq kg-1)
A 17,00c ± 0,00 257,17g ± 0,40 3,86f ± 0,02 31,83a ± 1,53 B 17,40b ± 0,00 270,63f ± 1,14 3,79g ± 0,03 31,42a ± 0,79 C 16,20d ± 0,00 626,03a ± 2,40 4,55a ± 0,01 27,96b ± 1,15 D 17,00c ± 0,00 209,57h ± 0,95 4,08e ± 0,02 17,55d ± 0,70 E 18,60a ± 0,00 341,17d ± 2,78 4,18d ± 0,01 24,92c ± 0,86 F 17,40b ± 0,00 327,30e ± 1,45 4,15d ± 0,02 19,45d ± 0,55
G 17,00c ± 0,00 543,93b ± 3,00 4,27c ± 0,01 31,13a ± 0,95 H 17,40b ± 0,00 496,80c ± 0,69 4,41b ± 0,02 24,71c ± 0,29
Valores expressos como média ± desvio padrão obtidos em triplicata (n = 3 para cada amostra). a-hLetras diferentes na mesma coluna diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05). Fonte: próprio autor
A umidade nas amostras de mel variou entre 16,20 e 18,60 g
100 g-1 (Tabela 12), onde a amostra E apresentou a maior umidade comparada às demais. Os resultados de umidade, encontrados no estudo, mostram que todas as amostras estavam de acordo com as legislações brasileira e internacionais, as quais estipulam valor máximo de 20 g 100 g-1 de umidade para amostras de mel (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). A umidade é um dos parâmetros com maior influencia nas características físicas e químicas dos méis, e está quase sempre relacionada ao nível de maturidade alcançado na colmeia, técnicas de processamento empregados, condições de armazenamento e origem botânica (YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013; LAZAREVIC et al., 2012; GALLINA; STOCCO; MUTINELLI, 2010; GOMES et al., 2010). Lazarevic et al. (2012) encontraram resultados similares aos estudados, avaliando a
98
umidade de duzentos e uma amostras de mel de Apis mellifera L. produzidos na Sérvia. Belay et al. (2013) avaliaram o teor de umidade de dezesseis amostras de mel de Apis mellifera L. produzidos em Bale, Etiópia, e verificaram que os méis continham umidade entre 15,87 a 19,35 g 100 g-1. A umidade também foi estudada por Gomes et al. (2010) reportando valores entre 15,9 a 17,2 g 100 g-1 para cinco méis comerciais de Portugal. Isla et al. (2011) avaliaram treze amostras de mel de Apis mellifera L. produzidos na Argentina e relatam teores entre 14,1 a 18,8 g 100 g-1. No entanto, Serem, Bester (2012) apresentam valores entre 10,09 a 20,73 g 100 g-1 ao determinarem os teores de umidade de treze amostras de mel de Apis mellifera produzidos no sul da África.
Com relação à condutividade elétrica, todas as amostras de mel, das 8 amostras analisadas, apresentaram resultados significativamente diferentes, variando entre 209,57 a 626,03 mS cm-1 (Tabela 12), atendendo ao limite estabelecido pelo Codex Alimentarius e pela Comunidade Européia (800 mS cm-1), contudo a legislação brasileira não estabelece limite para este parâmetro (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). A condutividade está relacionada ao conteúdo de proteínas, ácidos orgânicos e minerais, e este último depende do tipo de solo no qual foi colhido o néctar das flores, podendo indicar a origem geográfica do mel (KARABAGIAS et al., 2014; BELAY et al., 2013; YÜCEL; SULTANOĞLU, 2013; LAZAREVIĆ et al., 2012; SUÁREZ-LUQUE et al., 2005). Rizelio et al. (2012) avaliaram amostras de mel de diferentes regiões do estado de Santa Catarina e concluíram que, considerando a origem geográfica, o local onde o mel é produzido afeta o perfil mineral. Fato também avaliado e comprovado por Alda-Garcilope et al. (2012) ao avaliar oito méis espanhóis. Os autores verificaram que o teor de metais presentes nas amostras de mel é afetado pela composição do solo (origem geográfica) e tipo floral (origem botânica). Resultados semelhantes (0,39 a 0,89 mS cm-1) ao estudo foram encontrados por Boussaid et al. (2014) ao avaliarem a condutividade elétrica de seis amostras de mel da Tunísia. Oitenta e cinco amostras de mel produzidos na Espanha (2005-2009) apresentaram valores de condutividade elétrica variando entre 0,24 a 0,99 mS cm-1 (BENTABOL-MANZANARES et al., 2014), enquanto na Argélia valores na faixa entre 0,21 a 1,61 mS cm-1 foram encontrados nas onze amostras de méis avaliadas por Ouchemoukh, Louaileche, Schweitzer (2007).
99
Os valores de pH das amostras de mel do estado de Santa Catarina diferiram estatisticamente e variaram entre 3,79 e 4,55 (Tabela 12). Normalmente, o mel é ácido, independente da sua origem geográfica, e o pH pode ser influenciado por diferentes fontes de néctar, solo (RIBEIRO et al., 2014; BELAY et al., 2013). A Legislação Brasileira, o Codex Alimentarius e a União Européia não estabelecem limites em relação ao pH, no entanto, o mesmo deve ser baixo para evitar a contaminação microbiológica (ALVES et al., 2013; CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). Gomes e colaboradores (2010) avaliaram o pH de cinco méis comerciais de Portugal e encontraram valores semelhantes ao descrito neste estudo, entre 3,70 e 4,30. O pH também foi avaliado por Alves e colaboradores (2013), onde os valores encontrados permaneceram entre 3,30 e 4,40 para trinta e nove amostras de mel Portugueses. Ribeiro et al. (2014) também mediram o pH de oitenta amostras de mel, coletados no Rio de Janeiro e Minas Gerais (Brasil), e observaram que os valores variaram entre 2,97 a 4,13. Sete méis comerciais produzidos na Índia foram avaliados quanto ao pH, e apresentaram valores que variaram entre 3,7 a 4,4 (SAXENA; GAUTAM; SHARMA, 2010). Serem, Bester (2012) também mediram o pH de treze amostras de mel do sul da África e observaram valores entre 3,87 a 5,12.
Considerando os valores de acidez (Tabela 12), as amostras de mel do estado Catarinense apresentaram valores diferentes estatisticamente (17,55 a 31,83 meq kg-1), no entanto, todas atenderam ao permitido pelas legislações brasileira e internacionais, as quais estipulam valor máximo de 50,00 meq kg-1 (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). A acidez livre, presente nas amostras de mel, é caracterizada pela presença de ácidos orgânicos provenientes das diferentes fontes de néctar, que estão em equilíbrio com as suas lactonas, ou ésteres internos e alguns íons inorgânicos, tais como fosfatos, cloretos e sulfatos, cujos ácidos correspondentes estão presentes no mel (ALVES et al., 2013; PONTARA et al., 2012; GOMES et al., 2010; FINOLA, LASAGNO; MARIOLI, 2007; MOREIRA et al., 2007). Alves et al. (2013) avaliaram a acidez de vinte e uma amostras de mel Portugueses e encontraram valores entre 17,20 a 61,10 meq kg-1. Finola, Lasagno, Marioli (2007) também avaliaram a acidez livre de vinte e três amostras de mel cedidas por apicultores de Córdoba, na Argentina, e verificaram que as concentrações variaram entre 11,90 a 29,40 meq kg-1. Contudo, Lazarevic et al. (2012) encontraram valores entre 7,80 a 42,70 meq kg-1
100
ao avaliar as concentrações de acidez livre de duzentas e uma amostras de mel de Apis mellifera L. da Sérvia.
A Tabela 13 ilustra a atividade diastásica e a concentração de 5-HMF determinados nas 8 amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo. Tabela 13. Atividade diastásica e concentração de 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) em amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. selecionadas para o estudo
Amostra Atividade diastásica
(unidades Göthe)
HMF (mg kg-1)
A 16,78c ± 0,35 <LOQ B 14,97d ± 0,03 <LOQ C 19,06b ± 0,61 <LOQ D 11,55e ± 0,56 <LOQ E 11,14e ± 0,18 <LOQ F 22,69a ± 0,43 <LOQ G 19,55b ± 0,56 <LOQ H 14,75d ± 0,17 <LOQ
Valores expressos como média ± desvio padrão obtidos em triplicata (n = 3 para cada amostra). a-e Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05), com relação às análises de uma mesma safra. LOQ = Limite de quantificação (0,31 mg L-1) na curva de calibração. Fonte: próprio autor
Os valores de atividade diastásica variaram entre 11,14 a 22,69
(Tabela 13) unidades Göthe (Tabela 13), atendendo aos limites exigidos pelas legislações brasileira e internacionais, que estabelecem valor mínimo de 8,00 unidades Göthe, com ressalva para méis com baixo conteúdo enzimático, onde o mínimo proposto é 3 unidades Göthe, quando a concentração de 5-HMF não exceda a 15 mg kg-1 (FALLICO et al., 2004; CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). As enzimas presentes nos méis, como diastases, são provenientes de fluidos do néctar e secreções das glândulas salivares e da faringe de abelhas (ESCUREDO et al., 2013; SAK-BOSNAR; SAKAC, 2012; WON et al., 2008), bem como do pólen, indicando que os valores de atividade diastásica presente nas amostras de mel dependem da fonte floral e geográfica, justificando os diferentes valores para cada amostra de mel avaliada. Serrano et al. (2007) avaliaram a
101
atividade diastásica de quarenta e nove amostras de mel não aquecidos da região da Andaluzia, Espanha, e encontraram valores entre 3,99 a 49,42 unidades Göthe. A maioria das amostras deste estudo, está dentro dos limites da União Européia, visto que os méis com menor atividade diastásica apresentaram valores de 5-HMF menores do que 15 mg kg-1, portanto, permaneceram dentro da legislação. Gomes et al. (2010) estudaram a atividade diastásica de cinco méis comerciais de diferentes fontes florais e origens geográficas de Portugal. Os autores encontraram valores entre 8,7 a 16,1 unidades Göthe. Amostras de mel da região de Tenerife (Espanha) apresentaram valores de atividade diastásica entre 11,5 a 43,8 unidades Göthe.
As concentrações de 5-HMF estavam abaixo do limite de quantificação do método aplicado (LOQ = 11,24 mg kg-1) em todas as amostras analisadas, atestando o frescor das mesmas e consequente atendimento às legislações vigentes (Tabela 13). A legislação brasileira estipula valor máximo de 60,00 mg kg-1 (BRASIL, 2000), enquanto o Codex Alimentarius e a União Européia estabelecem 40,00 mg kg-1; com restrição a méis processados ou mistura de méis, onde são aceitas concentrações máximas de 80,00 mg kg-1 se o produto for declarado originário de regiões de clima tropical (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001). Alqarni, Owayss e Mahmoud (2012) avaliaram vinte e três tipos de méis da Arábia Saudita e de outros seis países (Egito, Nova Zelândia, Alemanha, Austrália, Malásia, Iémen) e verificaram valores de 5-HMF entre 2,21 a 168,97 mg kg-1. Finola, Lasagno e Marioli (2007) verificaram a concentração de 5-HMF de vinte e três amostras de méis da Argentina, e observaram que as concentrações variaram de 1,1 a 44,8 mg kg-1, enquanto na Turquia, valores entre 0 a 4,12 mg kg-1 de 5-HMF foram encontrados em vinte amostras analisadas por Tornuk et al. (2013). Ajlouni e Sujirapinyokul (2010) avaliaram sete méis australianos quanto ao 5-HMF e, observaram que os valores variaram entre 0,36 a 74,9 mg kg-1.
A Tabela 14 ilustra os valores dos parâmetros de cor das 8 amostras de méis selecionadas para o estudo.
102
Tabela 14. Parâmetros referentes à cor, determinados nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L., selecionadas para o estudo
Amostra L* a* b*
A 49,51b ± 0,08 0,03g ± 0,01 31,91e ± 0,09 B 48,53bc ± 0,41 1,34f ± 0,03 35,91d ± 0,39 C 42,79e ± 0,68 7,09b ± 0,08 42,04b ± 0,75 D 52,37a ± 0,58 -1,45h ± 0,05 31,88e ± 0,27 E 47,74c ± 0,05 3,70d ± 0,11 40,36c ± 0,03 F 48,45bc ± 0,48 2,92e ± 0,08 36,53d ± 0,61 G 43,41e ± 0,09 5,48c ± 0,04 39,68c ± 0,04 H 44,71d ± 0,12 8,29a ± 0,04 43,51a ± 0,07
Valores expressos como média ± desvio padrão obtidos em triplicata (n = 3 para cada amostra). a-h Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05). Fonte: próprio autor
A cor do mel é um dos atributos mais valiosos e relevantes, pois está diretamente relacionada com sua aceitação pelos consumidores, que, na maioria dos casos, escolhem o mel visualmente pela cor, logo, considerando este atributo representar o sabor do mel (VISQUERT; VARGAS; ESCRICHE, 2014). Avaliando os dados (Tabela 14), a maioria dos méis do estado Catarinense podem ser considerados escuros (com exceção da amostra D), pois segundo Saxena, Gautam e Sharma (2010) méis com valor de L* > 50 são considerados claros e com L* < 50 são considerados escuros. A cor das amostras avaliadas se apresenta dentro das legislações, visto que a legislação brasileira e o Codex Alimentarius estipulam que a cor do mel deva ser de quase incolor a pardo-escura. Contudo, a União Européia não estabelece parâmetros para este atributo (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
Com relação aos valores de a*, os mesmos apresentaram grandes oscilações permanecendo entre -1,45 a 8,29 (Tabela 14). O mesmo foi observado para a tonalidade amarela, b*, onde os valores, variaram entre 31,88 e 43,51 (Tabela 14). Pode-se observar, através dos valores da Tabela 5, que os méis com valores mais altos de b*, ou seja, mais amarelos, são os méis localizados no centro do estado, pertencentes às amostras C, E e H, podendo assim, distinguir os méis da região central do estado Catarinense como méis com maior tonalidade amarela em relação aos méis pertencentes às demais regiões do estado.
Boussaid et al. (2014) avaliaram a cor de seis amostras de mel de diferentes regiões da Tunísia, e também encontraram valores
103
semelhantes ao estudo para L*, entre 36,64 e 51,37. Contudo, para os valores de a* e b*, os autores observaram valores entre -0,67 a 4,41 e 6,06 a 17,67, respectivamente. Vinte amostras de mel produzidos na Turquia foram avaliadas quanto à cor por Can et al. (2015), que encontraram valores de L* entre 42,85 a 88,50, valores de a* entre -1,55 a 42,56 e valores de b* entre 5,11 a 89,45. Kus et al. (2014) também avaliaram a cor de vinte e oito amostras de seis tipos de méis poloneses, coletados entre 2009 e 2011. Os autores observaram que os valores de L* permaneceram entre 37,3 a 88,3, os valores de a* entre -1,9 a 33,6, e os valores de b* entre 16,9 a 74,5. Juán-Borrás et al. (2014) mediram a luminosidade (L*) de oitenta amostras de méis de diferentes origens botânicas: acácia (Robinia Pseudoacacia), girassol (Helianthus annuus) e tilia (Tilia sp.) e, coletadas em diferentes países (Espanha, Romênia e República Checa). Os méis de acácia e de girassol eram provenientes dos três países. Os autores observaram que os valores variaram entre 50,5 a 56,6, 43,6 a 48,1 e 48,3 a 49,6, para os méis de acácia, girassol e tília, respectivamente.3.1 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE QUÍMICA E BIOATIVA AO LONGO DO ARMAZENAMENTO 3.1.1 Açúcares 3.1.1.1 Frutose e glicose
As Tabelas 15 e 16, ilustram as concentrações de frutose e glicose, respectivamente, nas amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. ao longo da armazenamento doméstico simulado por 540 dias.
104
Tabe
la 1
5. C
once
ntra
ções
de
fruto
se, n
as a
mos
tras d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a Ca
tarin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
dia
s A
mos
tra
Frut
ose
(g 1
00g-1
) T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
41
,42
± 1,
28bc
39
,99
± 0,
13c
43,0
8 ±
0,58
ab
44,8
6 ±
0,33
a 45
,17
± 1,
59a
41,8
6 ±
0,73
bc
41,4
4 ±
1,57
bc
B
39,7
4 ±
0,95
ab
36,6
6 ±
0,13
b 40
,66
± 0,
48a
39,0
2 ±
2,73
ab
40,0
5 ±
0,26
ab
38,7
8 ±
0,30
ab
40,9
9 ±
1,79
a C
41
,96
± 0,
89a
41,9
9 ±
0,33
a 42
,43
± 0,
45a
44,3
0 ±
2,64
a 41
,73
± 1,
17a
42,2
8 ±
0,73
a 43
,53
± 1,
84a
D
43,0
7 ±
1,03
ab
39,6
4 ±
0,16
c 43
,05
± 0,
29ab
44
,30
± 0,
11ab
44
,91
± 0,
89a
42,3
6 ±
0,54
b 43
,89
± 1,
70ab
E
42,3
3 ±
0,94
ab
39,7
2 ±
0,23
c 42
,68
± 0,
78ab
44
,80
± 0,
14a
37,2
9 ±
1,00
d 41
,42
± 0,
41bc
43
,23
± 1,
12ab
F
43,9
4 ±
0,96
ab
40,8
4 ±
0,35
c 45
,69
± 1,
41a
44,9
8 ±
1,29
ab
45,1
4 ±
1,42
ab
42,5
9 ±
0,67
bc
42,8
2 ±
1,20
abc
G
43,1
7 ±
0,71
ab
38,9
0 ±
0,03
de
42,2
9 ±
0,12
bc
44,9
8 ±
1,29
a 44
,34
± 1,
16ab
40
,71
± 0,
33cd
38
,04
± 0,
81e
H
43,7
4 ±
0,76
a 42
,62
± 0,
18a
42,9
6 ±
0,20
a 43
,67
± 0,
95a
44,2
3 ±
0,38
a 42
,30
± 0,
52a
43,2
2 ±
1,17
a
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es
expr
esso
s co
mo
méd
ia
± de
svio
pa
drão
(n
=
3 pa
ra
cada
am
ostra
). a-
e Letra
s di
fere
ntes
na
s lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
105
Tabe
la 1
6. C
once
ntra
ções
de
glic
ose,
nas
am
ostra
s de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cata
rina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
Am
ostr
a G
licos
e (g
100
g-1)
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
A
29,7
7 ±
0,78
d 32
,16
± 0,
06bc
d 29
,92
± 0,
29cd
29
,61
± 1,
75d
35,8
9 ±
1,51
a 33
,89
± 0,
85ab
32
,92
± 1,
26ab
c B
30
,01
± 0,
65b
31,0
3 ±
0,16
b 31
,17
± 0,
28b
31,0
6 ±
2,03
b 36
,85
± 0,
24a
39,4
2 ±
0,92
a 35
,14
± 1,
58a
C
31,8
9 ±
0,58
b 35
,93
± 0,
30a
31,9
7 ±
0,28
b 32
,96
± 1,
94ab
34
,00
± 1,
89ab
35
,26
± 0,
99ab
36
,03
± 1,
62a
D
29,9
4 ±
0,62
c 30
,91
± 0,
09bc
29
,37
± 0,
16c
29,6
7 ±
0,49
c 34
,15
± 0,
72a
32,2
3 ±
0,99
b 31
,98
± 0,
69b
E
30,4
3 ±
0,60
cd
32,3
2 ±
0,16
b 30
,56
± 0,
49cd
31
,58
± 0,
97bc
29
,89
± 0,
72d
33,1
0 ±
0,18
ab
34,2
1 ±
0,23
a F
29,7
4 ±
0,53
b 30
,73
± 0,
21b
29,7
2 ±
0,83
b 27
,61
± 0,
37c
32,4
2 ±
0,95
a 29
,83
± 0,
21b
29,2
1 ±
0,16
bc
G
30,9
2 ±
0,41
bc
31,3
3 ±
0,03
bc
30,3
5 ±
0,06
cd
30,1
8 ±
0,65
cd
35,1
8 ±
0,53
a 32
,03
± 0,
88b
29,1
0 ±
0,62
d H
30
,79
± 0,
46cd
33
,10
± 0,
15ab
29
,26
± 0,
14de
28
,55
± 0,
40e
33,6
9 ±
0,26
a 31
,57
± 1,
34bc
32
,28
± 0,
85ab
c
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es
expr
esso
s co
mo
méd
ia
± de
svio
pa
drão
(n
=
3 pa
ra
cada
am
ostra
). a-
e Letra
s di
fere
ntes
na
s lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
106
Nas Tabelas 15 e 16, pode-se observar que o comportamento
das amostras de mel, para as concentrações dos açúcares frutose e glicose, apresentou semelhanças ao longo do período de armazenamento, aumentando durante os primeiros meses e diminuindo nos meses seguintes ao estudo da vida útil. Isso ocorreu, provavelmente, considerando a diversidade de açúcares como mono, oligo e polissacarídeos presentes nos méis, e os oligossacarídeos e polissacarídeos podendo ser hidrolisados pelas enzimas invertase e α-glicosidase à monossacarídeos (SOLDATKIN et al., 2013; KAMAL; KLEIN, 2011; COTTE et al., 2004), aumentando, assim, o conteúdo dos monossacarídeos frutose e glicose nos primeiros meses de armazenamento. Rybak-Chmielewska (2007) avaliaram o conteúdo de frutose e glicose de méis armazenados durante 24 meses e também observaram um aumento de 7 % (m/m) no conteúdo de frutose e de 8,8 % (m/m) no conteúdo de glicose durante o período avaliado. Com o decorrer do estudo de armazenamento, as concentrações de frutose e glicose diminuíram. Este fato pode ser explicado pela provável transformação destes açúcares em compostos de degradação, como o 5-HMF (PEREIRA et al., 2011; MOREIRA et al., 2010), considerando que com o longo período de armazenamento dos méis , as pentoses e hexoses podem se decompor, formando compostos furânicos (CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; PEREIRA et al., 2011).
White, Riethof e Kushnir (1961) avaliaram amostras de mel durante 2 anos de armazenamento, em temperatura variando entre 23 e 28 ºC, e observaram uma diminuição da concentração média de frutose em 5,5 % (m/m) e da concentração de glicose em 13 % (m/m). Cavia e colaboradores (2009) também avaliaram as concentrações dos monossacarídeos frutose e glicose durante, aproximadamente, trinta meses, em sessenta amostras de mel frescas e sem aquecimento, armazenadas em temperatura ambiente, coletadas na Espanha. Os autores observaram que as concentrações de frutose e glicose diminuíram no período estudado, sendo estes açúcares dependentes do pH inicial das amostras, avaliando que, quanto menor o pH inicial, maior será a redução da concentração dos monossacarídeos.
Apenas as amostras C e H não apresentaram diferenças significativas, quanto ao teor de frutose, ao longo dos 540 dias de armazenamento.
A Tabela 17 ilustra a soma dos conteúdos de frutose e glicose das amostras de méis de abelhas Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento doméstico e a Tabela 18 apresenta a proporção entre o
107
conteúdo de frutose e glicose das amostras durante o período de armazenamento doméstico. Tabela 17. Soma das concentrações de frutose e glicose das amostras de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento
Amostra Frutose + Glicose (g 100g-1) To T1 T2 T3 T4 T5 T6
A 71,19 72,15 72,99 74,47 81,06 75,75 74,36 B 69,75 67,69 71,83 70,08 76,90 73,69 76,13 C 73,85 77,92 74,40 77,26 75,72 77,54 79,56 D 73,02 70,56 72,41 73,97 79,05 74,59 75,87 E 72,76 72,04 73,24 75,38 67,18 74,52 77,44 F 73,68 71,57 75,42 72,60 77,56 72,42 72,03 G 74,10 70,23 72,63 73,21 79,52 72,74 67,15 H 74,53 75,72 72,22 72,22 77,92 73,87 75,50
T0 = Início das análises; T1 = 90 dias de armazenamento; T2 = 180 dias de armazenamento; T3 = 270 dias de armazenamento; T4 = 360 dias de armazenamento; T5 = 450 dias de armazenamento; T6 = 540 dias de armazenamento. Frutose + Glicose = soma dos conteúdos de frutose e glicose. Fonte: próprio autor
Observa-se, pelos dados avaliados na Tabela 17, que a soma dos conteúdos de frutose e glicose das amostras de mel de abelhas Apis mellifera L. foi superior a 60 g 100 g-1 limite mínimo estabelecido pelos padrões do Codex Alimentarius e da União Européia (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001) e 65 g 100 g-1, limite mínimo estabelecido pelos padrões da legislação brasileira para o conteúdo de açúcares redutores (BRASIL, 2000). Ao avaliar as concentrações de frutose + glicose ao longo do período de armazenamento verifica-se que a soma destes monossacarídeos aumentou até determinado período e, em seguida, diminuiu. O mesmo comportamento foi apresentado pela proporção de frutose e glicose ao longo dos 540 dias de armazenamento (Tabela 18). Este fato deve-se, provavelmente, ao rompimento das ligações dos oligo e polissacarídeos, dando origem a compostos menores como frutose e glicose (monossacarídeos) pela ação das enzimas presentes no mel (SOLDATKIN et al., 2013; KAMAL; KLEIN, 2011; COTTE et al., 2004), aumentando o teor destes compostos. E a diminuição dos conteúdos de frutose + glicose e frutose/glicose pode ser explicada pela provável formação de compostos de degradação destes açúcares
108
(CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; PEREIRA et al., 2011; MOREIRA et al., 2010). Tabela 18. Proporções entre as concentrações de frutose e glicose das amostras de mel de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento
Amostra Frutose / Glicose To T1 T2 T3 T4 T5 T6
A 1,39 1,24 1,44 1,52 1,26 1,24 1,26 B 1,32 1,18 1,30 1,26 1,09 1,11 1,17 C 1,32 1,17 1,33 1,34 1,23 1,20 1,21 D 1,44 1,28 1,47 1,49 1,32 1,31 1,37 E 1,39 1,23 1,40 1,39 1,25 1,25 1,26 F 1,48 1,33 1,54 1,63 1,39 1,43 1,47 G 1,40 1,24 1,39 1,43 1,26 1,27 1,31 H 1,42 1,29 1,47 1,53 1,31 1,34 1,34
T0 = Início das análises; T1 = 90 dias de armazenamento; T2 = 180 dias de armazenamento; T3 = 270 dias de armazenamento; T4 = 360 dias de armazenamento; T5 = 450 dias de armazenamento; T6 = 540 dias de armazenamento. Fonte: próprio autor
3.1.1.2 Sacarose
A Tabela 19 ilustra as concentrações de sacarose (g 100 g-1) das amostras de mel de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento.
109
Tabela 19. Concentrações de sacarose (g 100 g-1) das amostras de mel de Apis mellifera L. durante 540 dias de armazenamento
Amotra Sacarose (g 100g-1)
To T1 T2 T3 T4 T5 T6 A <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ B <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ C <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ D 3,11 ± 0,04 2,53 ± 0,05 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ E <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ F <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ G <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ H <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
T0 = Início das análises; T1 = 90 dias de armazenamento; T2 = 180 dias de armazenamento; T3 = 270 dias de armazenamento; T4 = 360 dias de armazenamento; T5 = 450 dias de armazenamento; T6 = 540 dias de armazenamento. LOQ = Limite de quantificação (0,074 g L−1) na curva de calibração. Fonte: próprio autor
Na Tabela 19, apenas a amostra D apresentou sacarose nos
tempos zero e 1 e, posteriormente, diminuiu ao longo do tempo de armazenamento, indicando que, provavelmente, enzimas como a invertase, as α e β-glicosidase, as α e β-amilase e a β-fructosidase presentes no mel podem ter reduzido este composto a açúcares de menor massa molecular (SHI et al. 2013; KAMAL; KLEIN, 2011; COTTE et al., 2004). As demais amostras apresentaram valores abaixo do LOQ determinado pelo método. Observa-se, então, que todas as amostras estão dentro do valor estipulado pela legislação brasileira e legislações internacionais (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000) e foram manipuladas corretamente (ESCUREDO et al., 2013; PUSCAS; HOSU; CIMPOIU, 2013; TORNUK et al., 2013; LI et al., 2012; GOMES et al., 2010). Porém, o contrário do avaliado no presente estudo foi observado por White, Riethof e Kushnir (1961) ao avaliarem os teores de sacarose de amostras de mel durante 2 anos de amazenamento em temperatura ambiente (23 a 28 ºC). Os autores verificaram que houve um aumento da concentração de sacarose durante o período de armazenamento avaliado.
110
3.1.2 Umidade
A Tabela 20 ilustra os teores de umidade, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
111
Tabe
la 2
0. U
mid
ade,
nas
am
ostra
s de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
di
as Am
ostr
a U
mid
ade
(g 1
00g-1
) T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
17
,00
± 0,
00d
17,5
3 ±
0,23
c 17
,60
± 0,
00c
17,2
7 ±
0,12
cd
17,4
7 ±
0,23
c 18
,20
± 0,
00b
18,6
0 ±
0,00
a B
17
,40
± 0,
00f
19,2
7 ±
0,23
d 18
,40
± 0,
00e
18,6
7 ±
0,23
e 20
,20
± 0,
00c
20,8
7 ±
0,23
b 21
,70
± 0,
00a
C
16,2
0 ±
0,00
e 15
,20
± 0,
40f
17,6
7 ±
0,23
b 16
,80
± 0,
00d
17,0
0 ±
0,00
cd
17,4
0 ±
0,00
bc
18,2
0 ±
0,00
a D
17
,00
± 0,
00e
17,2
0 ±
0,00
e 17
,80
± 0,
00c
16,6
0 ±
0,00
f 17
,40
± 0,
00d
18,2
0 ±
0,00
b 18
,60
± 0,
00a
E
18,6
0 ±
0,00
a 17
,73
± 0,
23c
17,2
7 ±
0,23
d 17
,13
± 0,
23d
17,8
0 ±
0,00
bc
18,2
0 ±
0,00
ab
18,6
0 ±
0,00
a F
17,4
0 ±
0,00
b 17
,20
± 0,
00b
16,7
3 ±
0,23
c 16
,60
± 0,
00c
17,8
0 ±
0,00
a 17
,93
± 0,
23a
17,8
0 ±
0,00
a G
17
,00
± 0,
00c
17,7
3 ±
0,23
a 17
,00
± 0,
00c
16,4
0 ±
0,00
d 17
,40
± 0,
00b
17,8
0 ±
0,00
a 17
,00
± 0,
00c
H
17,4
0 ±
0,00
e 18
,00
± 0,
00b
17,6
0 ±
0,00
d 16
,80
± 0,
00f
17,8
0 ±
0,00
c 18
,20
± 0,
00a
17,4
0 ±
0,00
e T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
exp
ress
os c
omo
méd
ia ±
des
vio
padr
ão (
n =
3 pa
ra c
ada
amos
tra).
a-g L
etra
s di
fere
ntes
nas
lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
112
Na Tabela 20, pode-se verificar que os teores de umidade das
amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina diminuíram e, posteriormente, aumentaram o seu teor ao longo dos 540 dias de armazenamento. No tempo zero, as amostras de mel continham, em média, 17,00 g 100g-1 de umidade, e com o armazenamento os percentuais foram aumentando. Fato que pode ser observado mais atentamente para as amostras B e C que continham 17,4 e 16,20 g 100g-
1 de umidade no tempo zero, e no tempo 6, após 540 dias, apresentaram teores de 21,70 e 18,20 g 100g-1, respectivamente. O aumento no teor de umidade, das amostras de mel utilizadas no estudo, provavelmente, pode ter ocorrido devido às diversas reações metabólicas que podem ocorrer no mel ao longo do armazenamento. Dentre elas, pode-se destacar a formação de água a partir do peróxido de hidrogênio. A oxidação da glicose pela enzima glicose oxidase forma ácido glicônico e peróxido de hidrogênio (Figura 9) (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; TAO et al., 2009; FRANCHINI et al., 2008;). O peróxido de hidrogênio formado pode, ainda, decompor-se em água e oxigênio. Esse processo pode ser acelerado se houver a presença de catalisadores metálicos, como o ferro e o manganês (minerais presentes no mel), e a enzima catalase, acelerando a produção de peróxido de hidrogênio (TAO et al., 2009) e consequentemente, de água. Figura 9. Oxidação da D-glicose catalisada pela glicose oxidase
Fonte: adaptado de Damodaran; Parkin; Fennema, 2010; Tao et al., 2009.
Fe(III)-catalase + H2O2 O = Fe(IV)-catalase + H2O
H2O2 + O = Fe(IV)-catalase Fe(III)-catalase + H2O + O2
Fonte: adaptado de Tao et al., 2009.
113
Outra possibilidade, para o aumento no conteúdo de água dos méis, é a de que a água ligada aos açúcares, se torne livre após ocorrência de reações químicas ao longo do armazenamento, verificando, assim, que a amostra B apresentou valor de umidade acima do estipulado pelas legislações brasileira e internacionais, após 540 dias de armazenamento doméstico simulado (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). 3.1.3 Acidez
A Tabela 21 ilustra a acidez, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
114
Tabe
la 2
1. A
cide
z, n
as a
mos
tras
de m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40
dias
A
mos
tra
Aci
dez
(mE
q kg
-1)
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
A
31,8
3 ±
1,53
c 24
,56
± 0,
93e
27,9
9 ±
0,67
d 28
,77
± 0,
59d
36,4
9 ±
0,68
b 39
,11
± 0,
54a
40,3
0 ±
0,72
a B
31
,42
± 0,
79d
25,9
7 ±
0,27
e 38
,44
± 1,
08c
41,6
2 ±
0,33
b 46
,81
± 1,
77a
47,5
3 ±
1,20
a 49
,18
± 0,
49a
C
27,9
3 ±
1,15
c 32
,90
± 0,
58b
29,9
6 ±
0,51
c 33
,65
± 0,
74b
38,4
2 ±
0,03
a 37
,20
± 0,
51a
39,3
3 ±
0,26
a D
17
,55
± 0,
70d
15,4
6 ±
0,83
e 19
,38
± 0,
47d
22,1
8 ±
0,50
c 27
,96
± 0,
49b
29,0
1 ±
0,81
ab
30,8
2 ±
0,80
a E
24
,92
± 0,
86bc
26
,21
± 0,
58ab
c 27
,84
± 0,
37a
26,5
7 ±
0,70
ab
26,0
8 ±
0,59
bc
24,7
6 ±
1,03
c 27
,95
± 0,
32a
F 19
,45
± 0,
55e
18,9
5 ±
0,59
e 26
,14
± 0,
40d
25,1
0 ±
0,70
d 37
,49
± 0,
97c
39,4
4 ±
0,54
b 43
,80
± 0,
79a
G
31,1
3 ±
0,95
b 33
,35
± 1,
01b
38,2
0 ±
0,91
a 39
,63
± 0,
34a
39,8
7 ±
0,50
a 37
,79
± 1,
55a
39,2
3 ±
0,61
a H
24
,71
± 0,
29c
27,0
4 ±
1,45
b 27
,47
± 0,
26b
28,4
6 ±
0,70
ab
27,8
5 ±
0,27
b 28
,65
± 0,
40ab
29
,75
± 0,
22a
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es e
xpre
ssos
com
o m
édia
± d
esvi
o pa
drão
(n
= 3
para
cad
a am
ostra
). a-
g Let
ras
dife
rent
es n
as l
inha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
115
Na Tabela 21, observa-se que os valores de acidez variaram de 17,55 a 31,83 mEq kg-1 no tempo zero a 27,95 a 49,18 mEq kg-1 no tempo 6. Apesar da acidez aumentar com o armazenamento, todas as amostras de mel, avaliadas ao longo dos 540 dias, permanecem dentro dos padrões estipulados pelas legislações brasileira e internacionais, que preconizam um valor máximo de 50,00 meq kg-1 (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000). Contudo, com o tempo de armazenamento, a acidez das amostras aumentou indicando que a água e os açúcares presentes no mel, podem aumentar a acidez durante o armazenamento prolongado.
Alguns autores relatam que os elevados valores de acidez livre podem indicar a fermentação dos açúcares do mel por leveduras osmotolerantes. Durante a fermentação, os monossacarídeos, glicose e frutose são convertidos em dióxido de carbono e álcool etílico. O álcool é adicionalmente hidrolisado, na presença de oxigênio e convertido em ácido acético e água. Isto, obviamente, contribui muito para o nível de acidez livre no mel (BOUSSAID et al., 2014; AJLOUNI; SUJIRAPINYOKUL, 2010; CHIRIFE; ZAMORA; MOTTO, 2006).
Em um estudo realizado por Cavia e colaboradores (2007) mostrou comportamento semelhante ao apresentado neste estudo. Os autores avaliaram a acidez livre de 35 tipos de méis espanhóis, não aquecidos, armazenados à temperatura ambiente e ao longo de 30 meses, e os resultados mostraram que, após 20 meses de armazenamento, a maior parte das amostras de méis apresentou um aumento constante da acidez livre. 3.1.4 pH
A Tabela 22 ilustra o pH, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
116
Tabe
la 2
2. p
H, n
as a
mos
tras d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
Am
ostr
a pH
T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
3,
86 ±
0,0
2a 3,
89 ±
0,0
1a 3,
83 ±
0,0
1a 3,
68 ±
0,0
4b 3,
55 ±
0,0
6c 3,
66 ±
0,0
3b 3,
50 ±
0,0
5c B
3,
79 ±
0,0
3ab
3,80
± 0
,05ab
3,
82 ±
0,0
4a 3,
72 ±
0,0
4bc
3,44
± 0
,03d
3,63
± 0
,02c
3,40
± 0
,02d
C
4,55
± 0
,01a
4,58
± 0
,02a
4,53
± 0
,00a
4,38
± 0
,06b
4,31
± 0
,03bc
4,
33 ±
0,0
1bc
4,30
± 0
,02c
D
4,08
± 0
,02a
4,00
± 0
,01b
3,99
± 0
,00b
3,79
± 0
,05c
3,61
± 0
,03d
3,62
± 0
,02d
3,60
± 0
,02d
E
4,18
± 0
,01a
4,12
± 0
,02b
4,17
± 0
,02a
4,01
± 0
,04c
3,94
± 0
,02d
3,92
± 0
,03de
3,
87 ±
0,0
2e F
4,15
± 0
,02ab
4,
00 ±
0,0
2b 4,
21 ±
0,0
1a 4,
08 ±
0,1
1ab
3,70
± 0
,05c
3,65
± 0
,06c
3,61
± 0
,04c
G
4,27
± 0
,01a
4,15
± 0
,01b
4,19
± 0
,01b
4,20
± 0
,00b
4,00
± 0
,05c
4,00
± 0
,03c
4,05
± 0
,01c
H
4,41
± 0
,02c
4,44
± 0
,02c
4,50
± 0
,00b
4,65
± 0
,00a
4,27
± 0
,01e
4,31
± 0
,02d
4,26
± 0
,02e
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es e
xpre
ssos
com
o m
édia
± d
esvi
o pa
drão
(n
= 3
para
cad
a am
ostra
). a-
g Let
ras
dife
rent
es n
as l
inha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
117
A Tabela 22 ilustra que os valores de pH variaram entre 3,79 a 4,55 no tempo zero e 3,40 a 4,30 no tempo 6. Os valores de pH são influenciados pela presença de ácidos formados via fermentação de açúcares (KARABAGIAS et al., 2014; VANDAMME et al., 2013; TORNUK et al., 2013; SUÁREZ-LUQUE et al., 2002). Os valores de acidez dos méis analisados no presente estudo aumentaram, consequentemente os valores de pH diminuíram. As legislações brasileira e internacionais não estabelecem limites para o pH dos méis (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
Cavia e colaboradores (2002) armazenaram, durante doze meses, trinta méis provenientes da Espanha e avaliaram o pH. Os autores verificaram que o pH dos méis permaneceu constante ao longo do tempo de armazenamento. Contudo, Cavia e colaboradores (2007) realizaram estudo ao longo de trinta meses, com trinta e cinco amostras de méis espanhóis, e observaram que o pH se manteve constante durante os 15 primeiros meses e depois apresentou redução de 5 %.
3.1.5 Atividade diastásica
A Tabela 23 ilustra os índices de atividade diastásica, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo d armazenamento por 540 dias.
118
Tabe
la 2
3. A
tivid
ade
dias
tásic
a, n
as a
mos
tras
de m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
ar
maz
enam
ento
por
540
dia
s A
mos
tra
Dia
stas
e (u
nida
de G
öthe
) T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
16
,78
± 0,
35b
19,7
0 ±
0,47
a 13
,58
± 0,
26de
14
,22
± 0,
12cd
13
,41
± 0,
29e
14,5
3 ±
0,28
c 11
,53
± 0,
09f
B
14,9
7 ±
0,03
a 13
,75
± 0,
36b
11,0
8 ±
0,23
c 10
,63
± 0,
21c
9,15
± 0
,01d
8,82
± 0
,20d
6,95
± 0
,07e
C
19,0
6 ±
0,61
a 13
,84
± 0,
34b
10,6
5 ±
0,21
c 11
,09
± 0,
18c
9,32
± 0
,34d
8,29
± 0
,20e
8,46
± 0
,10e
D
11,5
5 ±
0,56
b 13
,06
± 0,
21a
9,30
± 0
,08c
8,85
± 0
,13c
5,97
± 0
,10e
7,25
± 0
,23d
6,95
± 0
,15d
E
11,1
4 ±
0,18
a 8,
37 ±
0,1
8b 7,
68 ±
0,0
1c 6,
33 ±
0,0
3e 7,
05 ±
0,3
2d 7,
20 ±
0,0
4d 6,
28 ±
0,2
2e F
22,6
9 ±
0,43
a -
15,3
3 ±
0,22
b 13
,22
± 0,
30d
14,4
7 ±
0,21
c 13
,13
± 0,
39d
12,3
0 ±
0,17
e G
19
,55
± 0,
56cd
23
,12
± 0,
56a
23,8
4 ±
0,14
a 21
,75
± 0,
44b
21,3
7 ±
0,65
b 20
,65
± 0,
37bc
19
,21
± 0,
20d
H
14,7
5 ±
0,17
a 1
1,50
± 0
,35c
12,6
5 ±
0,10
b 10
,42
± 0,
08d
10,9
1 ±
0,39
cd
10,7
5 ±
0,34
cd
10,4
8 ±
0,32
d T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
exp
ress
os c
omo
méd
ia ±
des
vio
padr
ão (
n =
3 pa
ra c
ada
amos
tra).
a-g L
etra
s di
fere
ntes
nas
lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
119
Os índices de atividade diastásica diminuíram ao longo do período estudado, para todas as amostras (Tabela 23). Pode-se observar que os méis apresentaram maior atividade diastásica nos pH's mais elevados, próximos a 5, que é o pH no qual a enzima tem maior atividade (KOBLITZ, 2008). As enzimas são biocatalisadores sensíveis e instáveis a determinadas temperaturas e pH's, mas também podem perder sua atividade em temperatura ambiente (VEESAR; SOLANGI; MEMON, 2015; SENYAY-ONCEL; YESIL-CELIKTAS, 2013; KOBLITZ, 2008).
Na Tabela 23, pode-se verificar que, no tempo 6, os méis B, D e E, apresentaram valores abaixo de 8 unidades Göthe, e, portanto, estariam fora dos parâmetros exigidos legislação, mas, como o conteúdo de 5-HMF permaneceu abaixo de 15,00 meq kg-1, as amostras estão de acordo com a legislação, e podem ser consumidas, após 540 de armazenamento, de acordo com estes dois parâmetros.
Sahinler (2007) avaliando a atividade diastásica de diferentes méis produzidos na Turquia, durante nove meses de armazenamento, observou que a atividade enzimática também diminuiu, para todas as amostras, ao longo do período analisado. Quarenta e cinco méis canadenses foram armazenados sem controle de temperatura e avaliados quanto à atividade diastásica por Aldcorn, Wandler e Sporns (1985). Os autores verificaram que a atividade diastásica diminuiu após um ano de armazenamento. White, Riethof e Kushnir (1961) também avaliaram a atividade diastásica de amostras de méis durante 2 anos de armazenamento em temperatura ambiente (23 a 28 ºC) e verificaram que a atividade enzimática diminui cerca de 2,95 % ao mês. Veesar, Solangi e Memon (2015) avaliaram a atividade enzimática de α-amilase e verificaram que a enzima livre perdeu, completamente a sua atividade em 15 dias, e a enzima imobilizada perdeu 30 % da atividade durante o mesmo período.
3.1.6 5-HMF
As concentrações de 5-HMF não foram quantificadas com exatidão e precisão em nenhuma das amostras de mel do estado de Santa Catarina ao longo dos 540 dias de armazenamento simulado, pois os valores encontrados estavam abaixo do LOQ (0,31 mg L-1), no entanto, para a maioria dos méis analisados, as concentrações de 5-HMF aumentaram ao longo do período estudado, como demonstrado pelos eletroferogramas da amostra F no tempo zero (Figura 10a) e no tempo 6 (Figura 10b).
120
Figura 10. Eletroferogramas do mel F, no tempo zero (a) e no tempo 6 (b)
Fonte: próprio autor.
Apesar de ter aumentando ao longo do tempo, os resultados indicam que as concentrações de 5-HMF dos méis encontram-se abaixo do valor estipulado pela legislação brasileira e legislações internacionais, que determinam um valor máximo de 60,00 e 40,00 mg kg-1, respectivamente (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000), podendo o mel, ser consumido, após 540 dias de armazenagem doméstica, quanto a este parâmetro de deterioração. O aumento no conteúdo de 5-HMF, ao longo do armazenamento, deve-se ao fato do mel possuir, em sua composição, monossacarídeos e ser um alimento ácido, pois mesmo em baixas de temperaturas, e em condições ácidas, o 5-HMF é formado pela desidratação dos açúcares (TORNUK et al., 2013; CHERNETSOVA; MORLOCK, 2012; AJLOUNI; SUJIRAPINYOKUL, 2010; GOMES et al., 2010). O nível de 5-HMF é um fator importante na qualidade do
(a)
(b)
121
mel. Méis frescos naturalmente não têm conteúdo de 5-HMF, mas pode ser formado ou aumentar sua concentração, dependendo do pH e das condições de temperatura de armazenamento (ALQARNI; OWAYSS; MAHMOUD, 2012).
Hasan (2013) armazenou três amostras de mel do Iraque, durante seis meses à temperatura ambiente (20 - 23 ºC), e também observou que a concentração inicial de 5-HMF foi baixa nas três amostras analisadas e foi aumentando durante os meses seguintes de estudo. Yilmaz e Frevüoúlu (2001) também avaliaram as concentrações de 5-HMF de quarenta e cinco amostras de mel, coletadas na Turquia, durante um ano de armazenamento (20 ± 5 ºC). Os autores observaram que o conteúdo de 5-HMF aumentou de 3,3 para 19,1 mg kg-1.
3.1.7 Condutividade elétrica
A Tabela 24 ilustra os valores de condutividade elétrica, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
122
Tabe
la 2
4. C
ondu
tivid
ade
elét
rica
(µS
cm-1
), na
s am
ostra
s de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
Am
ostr
a C
ondu
tivid
ade
(mS
cm-1
) T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
0,
26 ±
0,0
0a 0,
24 ±
0,0
0ab
0,24
± 0
,00ab
0,
24 ±
0,0
0ab
0,24
± 0
,00ab
0,
24 ±
0,0
0ab
0,23
± 0
,02b
B
0,27
± 0
,00ab
0,
26 ±
0,0
0abc
0,25
± 0
,00d
0,25
± 0
,00d
0,26
± 0
,00cd
0,
26 ±
0,0
0bc
0,27
± 0
,00a
C
0,63
± 0
,00a
0,59
± 0
,00b
0,57
± 0
,00c
0,57
± 0
,00c
0,41
± 0
,00e
0,57
± 0
,00c
0,45
± 0
,02d
D
0,21
± 0
,00a
0,19
± 0
,00c
0,20
± 0
,00c
0,20
± 0,
00bc
0,
21 ±
0,0
0ab
0,21
± 0
,00ab
0,
20 ±
0,0
1abc
E
0,34
± 0
,00a
0,31
± 0
,00b
0,31
± 0
,00b
0,29
± 0
,00c
0,31
± 0
,00b
0,31
± 0
,00b
0,29
± 0
,00c
F 0,
33 ±
0,0
0a 0,
31 ±
0,0
0c 0,
30 ±
0,0
0d 0,
30 ±
0,0
0d 0,
31 ±
0,0
0b 0,
32 ±
0,0
0b 0,
31 ±
0,0
0c G
0,
53 ±
0,0
0a 0,
49 ±
0,0
0b 0,
47 ±
0,0
0d 0,
48 ±
0,0
0cd
0,48
± 0
,00bc
0,
48 ±
0,0
0bc
0,47
± 0
,01d
H
0,50
± 0
,00a
0,49
± 0
,00a
0,46
± 0
,00c
0,45
± 0
,00d
0,47
± 0
,00b
0,46
± 0
,00cd
0,
45 ±
0,0
1cd
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es e
xpre
ssos
com
o m
édia
± d
esvi
o pa
drão
(n
= 3
para
cad
a am
ostra
). a-
g Let
ras
dife
rent
es n
as l
inha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
123
A condutividade elétrica diminuiu ao longo do tempo de armazenamento (Tabela 24), verificando-se que os valores encontrados estão dentro do estipulado pelo Codex Alimentarius e pela União Européia que preconizam o valor máximo de 800,00 µS cm-1. A legislação brasileira não estabelece limite para condutividade elétrica em amostras de mel (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001).
Ainda não foram relatados estudos que avaliem a condutividade elétrica ao longo do armazenamento do mel.
3.1.8 Cor 3.1.6.1 Parâmetro L*
A Tabela 25 ilustra o parâmetro L* (Luminosidade), nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
124
Tabe
la 2
5. P
arâm
etro
L*
(Lum
inos
idad
e), n
as a
mos
tras
de m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
ar
maz
enam
ento
por
540
dia
s A
mos
tra
L*
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
A
49,5
1 ±
0,08
c 52
,30
± 0,
09a
51,9
8 ±
0,10
b 46
,42
± 0,
12g
48,2
7 ±
0,15
e 47
,71
± 0,
04f
48,8
7 ±
0,04
d B
48
,53
± 0,
41c
51,4
0 ±
0,05
a 50
,12
± 0,
27b
48,3
7 ±
0,08
c 44
,33
± 0,
42e
45,1
8 ±
0,06
d 44
,11
± 0,
04e
C
42,7
9 ±
0,68
a 39
,51
± 0,
08b
38,9
8 ±
0,04
b 33
,17
± 0,
14d
33,9
7 ±
0,18
c 31
,38
± 0,
09e
33,8
5 ±
0,02
cd
D
52,3
7 ±
0,58
bc
55,1
4 ±
0,14
a 53
,15
± 0,
57b
51,4
3 ±
0,14
d 51
,97
± 0,
02cd
51
,84
± 0,
05cd
49
,66
± 0,
26e
E
47,7
4 ±
0,05
a 45
,88
± 0,
18b
38,1
9 ±
0,26
f 40
,04
± 0,
64e
38,7
1 ±
0,19
f 41
,47
± 0,
07d
42,3
3 ±
0,01
c F
48,4
5 ±
0,48
b 49
,84
± 0,
17a
49,3
9 ±
0,20
a 47
,33
± 0,
24c
45,1
4 ±
0,03
d 44
,10
± 0,
04e
43,7
8 ±
0,03
e G
43
,41
± 0,
09a
43,5
5 ±
0,06
a 36
,31
± 0,
03c
37,9
7 ±
0,08
b 28
,91
± 0,
16e
29,6
6 ±
0,05
d 28
,25
± 0,
18f
H
44,7
1 ±
0,12
a 44
,82
± 0,
22a
35,2
7 ±
0,05
d 38
,32
± 0,
08b
35,3
9 ±
0,06
d 37
,63
± 0,
05c
32,8
6 ±
0,05
e T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-g Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
125
A luminosidade de todas as amostras do estado de Santa Catarina apresentaram o mesmo comportamento ao longo do tempo de armazenamento (Tabela 25), diminuíram com o tempo, ou seja, os méis ficaram mais escuros, pois o parâmetro L* (luminosidade) varia de 0 (preto) a 100 (branco) (CAN et al., 2015). Mesmo que os méis tenham ficado mais escuros, eles se encontram dentro dos parâmetros da legislação brasileira e do Codex Alimentarius, as quais estipulam que a cor do mel deva se apresentar de quase incolor a pardo-escuro. Apenas a União Europeia não estabelece limites para este atributo (CODEX STAN 12, 2001; EUROPEAN COMMUNITIES, 2001; BRASIL, 2000).
A cor do mel está relacionada com o teor de minerais, pólen e compostos fenólicos, e é característica de origem floral (BERTONCELJ et al., 2007). O escurecimento do mel tem sido relacionado com a temperatura de armazenamento e com seus constituintes/componentes. No caso do presente estudo, a proporção de frutose/glicose, aminoácidos livres, conteúdo de umidade e conteúdo de nitrogênio, podem ser citados como possíveis causadores da diminuição dos valores de L*. Diversos autores sugerem que as principais causas de escurecimento no mel possam ser a reação de Maillard, combinação de taninos e outros polifenóis oxidados com sais de ferro e a instabilidade da frutose em soluções ácidas (caramelização) (BRUDZYNSKI; KIM, 2011; GONZALES; BURIN; BUERA, 1999).
Piotraszewska-Pajak e Gliszczynska-Swiglo (2015) armazenaram dezoito amostras de méis, de diferentes origens botânicas da Polônia, durante nove meses. Os autores observaram que o armazenamento dos méis, à temperatura ambiente, no escuro, não alterou significativamente os valores de luminosidade dos méis, com a exceção dos méis de acácia e tília, em que os valores L* aumentaram significativamente durante os 9 meses de armazenamento. Gonzales, Burin e Buera (1999) avaliaram, através de medidas espectrofotométricas, a cor de dezesseis méis florais de diferentes regiões da Argentina. Os autores observaram que a maioria das amostras encontrou-se em uma linha correspondente a 575 nm, que vai do amarelo ao castanho-claro. E, após 90 dias (a 37 ºC) houve um deslocamento do comprimento de onda dominante, para a zona vermelha, em todos os méis, ressaltando que os mesmos ficaram mais escuros com o período de armazenamento.
126
3.1.6.2 Parâmetro a*
A Tabela 26 ilustra o parâmetro a*, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
127
Tabe
la 2
6. P
arâm
etro
a*,
nas
am
ostra
s de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
54
0 di
as
Am
ostr
a a*
T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
0,
03 ±
0,0
1f -0
,15
± 0,
02g
0,64
± 0
,01e
2,46
± 0
,01d
4,53
± 0
,04c
6,20
± 0
,02b
7,02
± 0
,09a
B
1,34
± 0
,03g
1,68
± 0
,03f
2,68
± 0
,03e
4,62
± 0
,05d
6,70
± 0
,05c
8,83
± 0
,03b
11,5
9 ±
0,02
a C
7,
09 ±
0,0
8f 8,
65 ±
0,1
2e 8,
90 ±
0,1
0e 9,
81 ±
0,1
3d 13
,36
± 0,
06c
14,6
7 ±
0,10
b 18
,10
± 0,
09a
D
-1,4
5 ±
0,05
e -2
,00
± 0,
03f
-1,3
7 ±
0,05
e -0
,05
± 0,
04d
1,25
± 0
,02c
2,38
± 0
,00b
3,61
± 0
,03a
E
3,70
± 0
,11g
4,10
± 0
,02f
4,31
± 0
,04e
7,07
± 0
,12d
8,79
± 0
,03c
11,6
6 ±
0,04
b 13
,24
± 0,
04a
F 2,
92 ±
0,0
8f 2,
39 ±
0,0
2g 3,
33 ±
0,0
6e 5,
32 ±
0,0
5d 7,
08 ±
0,0
4c 10
,07
± 0,
02b
11,7
6 ±
0,14
a G
5,
48 ±
0,0
4g 7,
09 ±
0,0
6f 8,
42 ±
0,0
9e 13
,57
± 0,
01c
11,9
6 ±
0,12
d 15
,65
± 0,
26b
16,7
6 ±
0,26
a H
8,
29 ±
0,0
4e 8,
29 ±
0,0
4e 7,
86 ±
0,0
7f 12
,04
± 0,
07d
12,8
6 ±
0,09
c 17
,59
± 0,
09a
16,7
9 ±
0,08
b T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
560
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-g Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
128
A Tabela 26 ilustra o perfil da tonalidade a* do mel Catarinense
ao longo de 540 dias de armazenamento, onde pode-se observar que os méis, aumentaram sua coloração no intervalo do verde (-a*) ao vermelho (+a*), indicando que, ao longo do armazenamento, os méis tenderam a cor vermelha. Este parâmetro específico de cor não é estabelecido pelas legislações brasileira e internacionais.
Segundo estudos, alguns autores observaram que a cor vermelha é característica de antocianinas e outros flavonoides, e estes compostos estão presentes no néctar e são transferidos para o mel (PIOTRASZEWSKA-PAJAK; GLISZCZYNSKA-SWIGLO, 2015; ALVAREZ-SUAREZ et al., 2010).
Piotraszewska-Pajak e Gliszczynska-Swiglo (2015) avaliaram a cor de dezoito amostras de mel da Polônia, durante nove meses, e observaram que os méis armazenados no escuro, à temperatura ambiente, aumentaram sua tonalidade vermelha, concordando com o encontrado no presente estudo. Dentre as condições avaliadas, as amostras mantidas à temperatura ambiente e no escuro, foram as que mais aumentaram a tonalidade vermelha.
3.1.6.2 Parâmetro b*
A Tabela 27 ilustra o parâmetro b*, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
129
Tabe
la 2
7. P
arâm
etro
b*,
nas
am
ostra
s de
mel
de
abel
has
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
Am
ostr
a b*
T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
31
,91
± 0,
09e
35,4
0 ±
0,09
d 38
,01
± 0,
08c
37,7
1 ±
0,38
c 42
,31
± 0,
19a
37,8
0 ±
0,08
c 39
,22
± 0,
08b
B
35,9
1 ±
0,39
e 40
,33
± 0,
06c
40,9
3 ±
0,07
bc
42,5
2 ±
0,10
a 41
,52
± 0,
72b
37,7
7 ±
0,15
d 37
,52
± 0,
11d
C
42,0
4 ±
0,75
a 39
,96
± 0,
15b
38,4
3 ±
0,12
c 29
,94
± 0,
88e
33,2
5 ±
0,47
d 22
,25
± 0,
10g
25,6
0 ±
0,14
f D
31
,88
± 0,
27e
33,9
6 ±
0,04
d 34
,23
± 0,
18d
36,7
4 ±
0,20
b 38
,94
± 0,
56a
36,0
4 ±
0,11
bc
35,8
9 ±
0,13
c E
40
,36
± 0,
03a
39,8
3 ±
0,26
a 31
,22
± 0,
23d
36,4
5 ±
0,44
c 37
,52
± 0,
24b
35,9
0 ±
0,11
c 36
,24
± 0,
09c
F 36
,53
± 0,
61d
39,4
1 ±
0,14
c 40
,78
± 0,
17b
41,8
0 ±
0,62
ab
42,5
3 ±
0,71
a 37
,37
± 0,
05d
37,0
8 ±
0,05
d G
39
,68
± 0,
04b
42,3
8 ±
0,15
a 33
,71
± 0,
09d
37,6
2 ±
0,22
c 24
,78
± 0,
46e
20,0
4 ±
0,12
f 17
,57
± 0,
31g
H
43,5
1 ±
0,07
b 45
,08
± 0,
20a
31,7
0 ±
0,10
f 37
,68
± 0,
17c
35,2
4 ±
0,22
d 32
,95
± 0,
10e
25,2
2 ±
0,24
g T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-g Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
130
Com relação ao perfil da tonalidade b*, a maioria dos méis do
estado Catarinense manteve comportamento semelhante ao longo dos 540 dias de armazenamento (Tabela 27), verificando-se que, para todos os tipos de méis, o parâmetro b* diminuiu ao longo do tempo, contudo, manteve valores positivos, indicando o predomínio da tonalidade amarela. As legislações brasileira e internacionais não estabelecem valor para este parâmetro de cor.
Piotraszewska-Pajak e Gliszczynska-Swiglo (2015), ao contrário do presente estudo, observaram que, para a maioria dos méis avaliados, os valores de b* não foram significativamente diferentes. O mel rape foi aumentando a cor amarela com o tempo de armazenamento em temperatura ambiente, no escuro. As variações nos valores de b* para os méis de acácia, durante os 9 meses, resultou em uma saturação de cor maior quando comparado aos méis frescos.
3.2 AVALIAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DURANTE ARMAZENAMENTO
As Tabelas 28, 29 e 30 ilustram as concentrações dos compostos fenólicos totais, poder redutor e capacidade inibição do radical DPPH, respectivamente, nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, ao longo do armazenamento por 540 dias.
131
Tabe
la 2
8. C
once
ntra
ções
dos
com
post
os fe
nólic
os to
tais
, nas
am
ostra
s de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a,
ao lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
dia
s A
mos
tra
Fenó
licos
tota
is (m
g E
AG
100
g-1
) T
o T
1 T
2 T
3 T
4 T
5 T
6 A
22
,50
± 0,
13c
27,9
7 ±
0,76
b 32
,56
± 0,
77b
31,0
8 ±
0,57
a 34
,67
± 1,
86a
31,1
6 ±
1,27
ab
34,3
1 ±
0,78
a B
21
,72
± 0,
87c
31,1
5 ±
0,60
b 31
,32
± 1,
75b
37,1
3 ±
2,12
a 36
,78
± 1,
83a
34,2
9 ±
0,85
ab
37,7
3 ±
1,64
a C
33
,15±
0,6
5d 40
,67
± 1,
08c
42,8
6 ±
1,92
c 53
,23
± 0,
88a
49,1
3 ±
1,04
b 49
,42
± 0,
47b
53,8
4 ±
1,18
a D
18
,95
± 0,
13d
24,7
5 ±
0,54
c 23
,96
± 0,
44c
28,4
9 ±
0,58
ab
27,8
5 ±
1,26
b 28
,29
±0,8
3ab
30,3
1 ±
1,52
a E
23
,73
± 0,
26d
29,9
4 ±
0,87
c 31
,18
± 0,
65c
39,7
6 ±
0,94
b 39
,70
± 0,
29b
47,1
2 ±
1,92
a 41
,83
± 1,
40b
F 32
,13
± 0,
68e
38,4
0 ±
0,00
d 44
,14
± 2,
17c
49,5
8 ±
1,52
b 45
,83
± 0,
83c
53,5
4 ±
1,69
a 47
,19
± 0,
96bc
G
53
,96
± 1,
21e
63,7
3 ±
1,03
d 73
,38
± 1,
36c
85,7
2 ±
0,78
ab
75,9
7 ±
2,35
c 88
,72
± 2,
23a
84,6
7 ±
0,79
b H
35
,40
± 1,
03e
44,6
1 ±
0,75
d 43
,52
± 0,
78d
51,4
9 ±
1,54
bc
49,8
1 ±
1,89
c 59
,57
± 1,
03a
54,1
2 ±
0,27
b T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
exp
ress
os c
omo
méd
ia ±
des
vio
padr
ão (
n =
3 pa
ra c
ada
amos
tra).
a-e L
etra
s di
fere
ntes
nas
lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
132
Tabe
la 2
9. P
oder
redu
tor,
nas
amos
tras
de m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or
540
dias
A
mos
tra
FRA
P (μ
mol
Fe
II 1
00 g
-1)
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
A
92,2
5 ±
0,64
f 14
0,66
± 0
,61b
115,
89 ±
1,1
0e 12
1,48
± 1
,85cd
12
3,03
± 1
,29c
118,
78 ±
1,0
0de
147,
28 ±
2,3
9a B
10
9,08
± 0
,81f
143,
55 ±
3,1
2c 13
6,96
± 1
,31d
124,
10 ±
1,3
3e 15
0,70
± 1
,85b
148,
32 ±
1,5
1bc
161,
68 ±
2,6
6a C
23
9,64
± 0
,58g
325,
73 ±
3,2
0b 27
0,30
± 0
,29f
285,
57 ±
2,7
4e 31
6,28
± 0
,00c
309,
80 ±
1,8
2d 36
6,16
± 2
,65a
D
82,5
4 ±
0,94
g 11
9,79
± 1
,46c
106,
35 ±
1,6
2e 85
,82
± 1,
61f
227,
80 ±
0,6
1a 11
1,55
± 0
,44d
127,
70 ±
0,7
5b E
15
3,75
± 0
,68e
221,
65 ±
1,7
7b 19
0,28
± 1
,87d
200,
89 ±
2,5
8c 22
2,62
± 0
,00b
220,
11 ±
1,5
0b 26
4,31
± 0
,88a
F 13
0,02
± 1
,36f
183,
15 ±
0,1
4c 14
7,05
± 0
,99e
171,
47 ±
0,7
2d 18
0,41
± 2
,38c
192,
80 ±
1,7
9b 21
8,36
± 3
,95a
G
195,
33 ±
1,2
5f 27
3,30
± 0
,29d
239,
77 ±
1,7
3e 27
0,62
± 1
,01d
301,
28 ±
0,3
1c 33
0,44
± 5
,98b
391,
58 ±
2,7
5a H
22
6,75
± 1
,35g
320,
77 ±
0,5
8c 26
3,69
± 0
,29f
298,
19 ±
3,5
0e 30
7,68
± 0
,61d
335,
85 ±
2,5
6b 41
3,61
± 0
,31a
T0 =
Iníc
io d
as a
nális
es; T
1 =
90 d
ias d
e ar
maz
enam
ento
; T2
= 18
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T3
= 27
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T4
= 36
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T5
= 45
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
; T6
= 54
0 di
as d
e ar
maz
enam
ento
. V
alor
es
expr
esso
s co
mo
méd
ia
± de
svio
pa
drão
(n
=
3 pa
ra
cada
am
ostra
). a-
g Letra
s di
fere
ntes
na
s lin
has
dife
rem
si
gnifi
cativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fo
nte:
pró
prio
aut
or
133
Tabe
la 3
0. C
apac
idad
e de
inib
ição
do
radi
cal D
PPH
, nas
am
ostra
s de
mel
Api
s m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
Sant
a C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
Am
ostr
a D
PPH
(mg
EA
A 1
00 g
-1)
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
A
7,80
± 0
,07a
5,93
± 0
,29c
5,70
± 0
,16cd
5,
39 ±
0,1
4d 6,
81 ±
0,1
7b 7,
57 ±
0,1
0a 5,
69 ±
0,2
1cd
B
8,18
± 0
,22a
8,07
± 0
,35a
6,14
± 0
,03c
5,89
± 0
,33c
7,31
± 0
,26b
8,32
± 0
,41a
6,52
± 0
,13c
C
16,4
7 ±
0,02
a 16
,47
± 0,
40a
13,7
2 ±
0,46
b 10
,80
± 0,
08c
17,1
7 ±
0,39
a 16
,64
± 0,
71a
13,1
4 ±
0,13
b D
6,
95 ±
0,0
3a 6,
42 ±
0,5
1a 3,
46 ±
0,1
3c 4,
10 ±
0,5
6c 5,
46 ±
0,0
1b 6,
91 ±
0,2
3a 6,
20 ±
0,4
0ab
E
8,25
± 0
,23c
10,2
5 ±
0,36
ab
9,16
± 0
,23ab
c 8,
57 ±
0,0
5bc
10,2
6 ±
0,54
ab
10,4
8 ±
1,60
a 10
,40
± 0,
30ab
F
6,35
± 0
,23c
7,45
± 0
,68bc
7,
13 ±
0,4
9bc
6,55
± 0
,11c
6,86
± 0
,25c
8,26
± 0
,44ab
9,
28 ±
0,4
1a G
9,
33 ±
0,3
1e 11
,92
± 0,
75cd
11
,51
± 0,
23d
10,0
3 ±
0,14
e 12
,97
± 0,
45bc
14
,13
± 0,
43ab
14
,56
± 0,
54a
H
9,82
± 0
,10c
11,8
2 ±
0,28
b 10
,26
± 0,
21c
8,73
± 0
,54d
13,0
1 ±
0,24
a 13
,66
± 0,
35a
13,3
5 ±
0,29
a T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
134
Analisando as Tabelas 28, 29 e 30, pode-se observar que os
compostos fenólicos totais bem como a atividade antioxidante aumentaram ao longo dos 540 dias de armazenamento. Observa-se que a atividade antioxidante (DPPH e FRAP) aumentou ao longo do tempo de armazenamento e os méis ficaram mais escuros com o armazenamento. As funções biológicas do mel como a atividade antioxidante, têm sido relacionadas com a cor. Estudos relatam que a cor tem sido correlacionada com a atividade antioxidante, ou seja, méis de cor mais escura possuem maior atividade antioxidante (SARIC et al., 2012; BRUDZYNSKI; KIM, 2011; AL et al., 2009). A cor de méis resulta da presença e concentração de compostos com várias ligações duplas conjugadas, como flavonóides, terpenos, carotenos, polifenóis, que absorvem a luz na gama do visível (400 - 700 nm). Além disso, os produtos da reação de Maillard também contribuem para a cor de mel (TURKMEN et al., 2006). A reação de Maillard ou escurecimento não enzimático é uma consequência comum de méis armazenados por longo tempo. Os produtos finais da reação de Maillard tem um máximo de absorção entre 420 e 450 nm. Os polifenóis, nas fases intermediária e final dos produtos da reação de Maillard também absorvem fortemente a luz na faixa do UV 250-380 nm (BRUDZYNSKI; KIM, 2011).
Saric et al. (2012) avaliaram o conteúdo de compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante (FRAP e DPPH) durante um ano de armazenamento, de 40 amostras de mel da Croácia. Os méis foram armazenados em frascos de vidro transparentes, em prateleiras, expostos à luz natural e em temperatura ambiente e no escuro durante a noite. Os autores observaram que o conteúdo fenólico total diminuiu 88,6 % no mel multifloral, porém, houve um aumento de 37,1 % nos valores de IC 50 no mesmo tipo de mel. Também foi observada uma diminuição em 72,5 % da atividade antioxidante (FRAP) para o mel multifloral. 3.1 AVALIAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS INDIVIDUAIS DURANTE ARMAZENAMENTO
Com os dados obtidos a partir dos espectros de massas e dos tempos de retenção dos padrões listados na Tabela 9 e das amostras, foi possível identificar e quantificar 23 compostos fenólicos nas amostras de mel de Apis mellifera L. analisadas, sendo 12 da classe dos ácidos fenólicos: 4-aminobenzóico, salicílico, ρ-anísico, mandélico, 4-hidroximetilbenzóico, vanílico, protocatecuíco, ρ-cumárico, metoxifenilacético, caféico, trans-ferúlico, siríngico, 10 flavonoides: crisina, pinocembrina, naringenina, aromadendrina, hispidulina,
135
quercetina, taxifolina, miricetina, isoquercetina e rutina, e uma cumarina: escopoletina. O tempo de retenção e os íons precursores (Q1 e Q3) utilizados para a identificação e quantificação dos compostos estão descritos na Tabela 31. Tabela 31. Compostos fenólicos identificados e quantificados no mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina
Tempo de retenção
(min)
Íon precursor (m/z) Q1
Íon precursor
(m/z) Q3
Composto fenólico
10,47 135,990 91,900 Ácido 4-aminobenzóico 10,99 136,900 93,000 Ácido salicílico 11,34 150,947 107,000 Ácido ρ-anísico 7,86 150,875 107,000 Ácido mandélico 8,84 150,967 107,000 Ácido 4-hidroximetilbenzóico 9,65 166,923 152,000 Ácido vanílico 6,95 152,921 109,000 Protocatecuíco 10,46 162,926 119,100 Ácido ρ-cumárico 10,51 164,976 121,100 Ácido metoxifenilacético 9,45 178.927 135.000 Ácido caféico 10,99 190.972 176.000 Escopoletina 10,73 192,957 176,000 Ácido trans-ferúlico 10,01 196.939 182.000 Ácido siríngico 13,88 252,988 62,900 Crisina 13,59 255,051 65,000 Pinocembrina 12,37 270,985 119,100 Naringenina 11,29 287,004 125,000 Aromadendrina 12,72 298,957 284,000 Hispidulina 10,84 300,968 151,000 Quercetina 10,70 303,815 285,000 Taxifolina 11,24 316,995 151,000 Miricetina 10,83 463,155 300,000 Isoquercetina 10,72 609,147 300,100 Rutina
Fonte: próprio autor A Tabela 32 ilustra os parâmetros utilizados para a identificação
e quantificação dos compostos fenólicos estudados nas amostras de mel de Apis mellifera L. avaliadas, obtidos a partir dos dados de calibração dos padrões.
136
Tabela 32. Regressão linear, coeficiente de determinação (R2), limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ) utilizados para os compostos fenólicos previamente identificados Composto fenólico
Regressão linear R2 LOD (mg L-1)
LOQ (mg L-1)
Ácido 4-aminobenzóico
y = 88770x + 1366 0,9986 0,039 0,187
Ácido salicílico y = 10000000x + 30715 0,9976 0,002 0,005 Ácido
ρ-anísico y = 147705x + 10954 0,9972 0,038 0,127
Ácido mandélico
y = 517466x - 11457 0,9966 0,041 0,147
Ácido 4-hidroximetil
benzóico
y = 771866x + 2675,5 0,9987 0,020 0,070
Ácido vanílico y = 225184x + 1268,8 0,9979 0,011 0,022 Protocatecuíco y = 2000000x - 85897 0,9992 0,010 0,037
Ácido ρ-cumárico
y = 8000000x + 18265 0,9997 0,001 0,004
Ácido metoxifenil
acético
y = 337503x + 820,68 0,9942 0,040 0,133
Ácido caféico y = 6000000x + 3902,9 0,9991 0,008 0,020 Escopoletina y = 2000000x + 848,7 0,9882 0,001 0,004 Ácido trans-
ferúlico y = 975501x + 1750,9 0,9929 0,002 0,006
Ácido siríngico y = 295436x + 2131,4 0,9908 0,006 0,019 Crisina y = 2000000x + 14569 0,9911 0,003 0,009
Pinocembrina y = 2000000x + 1160,6 0,9940 0,006 0,010 Naringenina y = 3000000x + 3832,8 0,9963 0,001 0,004
Aromadendrina y = 3000000x + 3832,8 0,9970 0,002 0,007 Hispidulina y = 4000000x + 20708 0,9922 0,001 0,004 Quercetina y = 2000000x - 13464 0,9938 0,001 0,004 Taxifolina y = 880909x + 622,4 0,9993 0,003 0,010 Miricetina y = 537004x - 27853 0,9832 0,003 0,008
Isoquercetina y = 704465x + 247,3 0,9985 0,002 0,008 Rutina y = 501495x – 640,2 0,9992 0,004 0,012
Fonte: próprio autor A Tabela 33 ilustra os compostos fenólicos identificados e quantificados nas amostras de mel de Apis mellifera L..
137
Tabela 33. Compostos fenólicos identificados e quantificados nas amostras de mel de Apis mellifera L. produzidas no estado de Santa Catarina Amostra Compostos fenólicos
Identificados e não quantificados
Quantificados
A Ácido caféico, ácido siríngico, naringenina, aromadendrin, isoquercetrina, rutina.
Ácido salicílico, protocatecuico, ácido ρ-cumárico, ácido vanílico, escopoletina, pinocembrim, quercetina.
B Ácido mandélico, ácido 4-hidróximetilbenzóico, ácido cafeico, naringenina.
Ácido salicílico, protocatecuíco, ácido p-cumárico, escopoletina, aromadendrin, rutina.
C Ácido 4-hidroximetilbenzóico, aromadendrin, isoquercetrina.
Ácido 4- aminobenzóico, ácido salicílico, ácido ρ-anísico, ácido mandélico, protocatecuíco, ácido ρ-cumárico, ácido metoxifenilacético, ácido vanílico, ácido cafeico, ácido siríngico, crisina, pinocembrina, naringenina, hispidulina, quercetina, taxifolina, rutina.
D Escopoletina, naringenina, rutina.
Ácido salicílico, ácido ρ-cumárico, quercetina, miricetina.
E Ácido 4-hidroximetilbenzóico, ácido siríngico, aromadendrin, rutina.
Ácido salicílico, protocatecuíco, ácido ρ-cumárico, ácido vanílico, escopoletina.
F Aromadendrin, rutina. Ácido salicílico, protocatecuico, ácido ρ-cumárico, ácido vanílico, escopoletina, ácido siríngico, naringenina, hispidulina, quercetina.
G Ácido 4-aminobenzóico, escopoletina, rutina.
Ácido salicílico, protocatecuico, ácido ρ-cumárico, ácido cafeico, ácido trans-ferúlico, crisina, pinocembrina, naringenina, hispidulina.
H Ácido 4-hidroximetilbenzóico, ácido cafeico.
Ácido salicílico, protocatecuico, ácido ρ-cumárico, escopoletina, ácido siríngico, hispidulina.
Fonte: próprio autor
O ácido salicílico e o ácido ρ-cumárico foram quantificados em todas as amostras estudadas (Tabela 33). O ácido metoxifenilacético e a taxifolina foram encontrados apenas na amostra C (florada de vassoura
138
branca - Baccharis leucocephala), a miricetina foi encontrada apenas na amostra D (florara de uva do Japão - Hovenia dulcis), e o ácido trans-ferúlico foi encontrado apenas na amostra G.
A Tabela 34 ilustra as concentrações dos compostos fenólicos de cada amostra do estado de Santa Catarina, ao longo do tempo de armazenamento do mel de Apis mellifera L.
139
Tabela 34. Concentrações de compostos fenólicos (µg g-1) do mel de Apis mellifera L. de cada amostra do estado de Santa Catarina, ao longo de 450 dias de armazenamento quantificados no estudo
Composto fenólico Amostra/Tempo de armazenamento A/T0 A/T3 A/T5
Ácido salicílico 0,23 ± 0,02Da 0,12 ± 0,01b 0,12 ± 0,01b Protocatecuico 0,85 ± 0,08Ba 0,72 ± 0,05b 0,63 ± 0,05b Ácido ρ-cumárico 1,43 ± 0,03Ab 1,78 ± 0,19a 1,35 ± 0,13b Ácido vanílico 0,84 ± 0,08Ba 0,34 ± 0,06b 0,31 ± 0,04b Escopoletina 0,24 ± 0,02Da 0,08 ± 0,02b 0,12 ± 0,03b Pinocembrina 0,33 ± 0,01Ca 0,13 ± 0,02b 0,12 ± 0,01b Quercetina 0,15 ± 0,02Db 0,19 ± 0,01a 0,15 ± 0,01b B/T0 B/T3 B/T5 Ácido salicílico 0,08 ± 0,01Cb 0,15 ± 0,02a 0,14 ± 0,03a Protocatecuico 0,55 ± 0,01Bb 1,19 ± 0,29a 0,96 ± 0,05ab Ácido ρ-cumárico 0,65 ± 0,04Aa 0,61 ± 0,08a 0,44 ± 0,05b Escopoletina 0,10 ± 0,03Ca 0,08 ± 0,01a 0,07 ± 0,01a Aromadendrina 0,10 ± 0,01Ca 0,12 ± 0,01a 0,13 ± 0,01a Rutina 0,13 ± 0,02Ca 0,13 ± 0,01a 0,12 ± 0,02a C/T0 C/T3 C/T5 Ácido 4-aminobenzóico 5,89 ± 0,21Aa 4,88 ± 0,46b 4,71 ± 0,45b Ácido salicílico 1,83 ± 0,13BCa 1,75 ± 0,17a 1,75 ± 0,06a Ácido ρ-anísico 5,74 ± 0,27Aa 5,33 ± 0,32ab 5,03 ± 0,11b Ácido mandélico 2,16 ± 0,07Bb 2,44 ± 0,23ab 2,65 ± 0,18a Protocatecuíco 1,21 ± 0,09DEa 1,34 ± 0,09a 1,31 ± 0,12a Ácido ρ-cumárico 0,24 ± 0,02Fa 0,25 ± 0,02a 0,24 ± 0,04a Ácido metoxifenilacético 1,82 ± 0,12BCa 1,94 ± 0,10a 1,58 ± 0,22a Ácido vanílico 0,90 ± 0,11Ea 0,92 ± 0,24a 0,72 ± 0,03a Ácido cafeico 0,46 ± 0,07Fa 0,28 ± 0,04b 0,33 ± 0,08ab Ácido siríngico 0,24 ± 0,05Fa 0,21 ± 0,01a 0,20 ± 0,01a Crisina 0,29 ± 0,06Fa 0,27 ± 0,02a 0,23 ± 0,03a Pinocembrina 1,00 ± 0,03Ea 0,83 ± 0,02b 0,69 ± 0,02c Naringenina 0,49 ± 0,03Fa 0,46 ± 0,03a 0,42 ± 0,02a Hispidulina 0,11 ± 0,02Fa 0,08 ± 0,01b 0,11 ± 0,01a Quercetina 1,58 ± 0,36CDa 0,58 ± 0,11b 0,59 ± 0,09b Taxifolina 0,19 ± 0,01Fa 0,14 ± 0,01b 0,15 ± 0,02b Rutina 0,26 ± 0,02Fa 0,17 ± 0,01b 0,17 ± 0,01b D/T0 D/T3 D/T5 Ácido salicílico 0,14 ± 0,01Cb 0,14 ± 0,04b 0,23 ± 0,02a Ácido ρ-cumárico 1,39 ± 0,20Aa 1,93 ± 0,25a 1,54 ± 0,32a Quercetina 0,20 ± 0,03Ca 0,16 ± 0,02a 0,19 ± 0,02a Miricetina 0,77 ± 0,04Ba 0,57 ± 0,01b x E/T0 E/T3 E/T5 Ácido salicílico 0,13 ± 0,04Db 0,34 ± 0,07a 0,19 ± 0,02b
140
Protocatecuíco 1,47 ± 0,04Aa 1,95 ± 0,30a 1,74 ± 0,44a Ácido ρ-cumárico 0,96 ± 0,13Ba 0,69 ± 0,04b 0,45 ± 0,03c Ácido vanílico 0,38 ± 0,09Cb 0,77 ± 0,12a 0,60 ± 0,05a Escopoletina 0,08 ± 0,01Db 0,14 ± 0,01a 0,07 ± 0,06c F/T0 F/T3 F/T5 Ácido salicílico 0,18 ± 0,03CDEa 0,17 ± 0,03a 0,19 ± 0,04a Protocatecuíco 0,60 ± 0,02Ba 0,59 ± 0,06a 0,62 ± 0,01a Ácido ρ-cumárico 1,07 ± 0,11Ab 1,44 ± 0,15a 1,29 ± 0,15b Ácido vanílico 0,53 ± 0,11Ba 0,51 ± 0,01a 0,49 ± 0,05a Escopoletina 0,04 ± 0,01Ea 0,03 ± 0,01a 0,04 ± 0,01a Ácido siríngico 0,30 ± 0,03Ca 0,23 ± 0,03a 0,23 ± 0,05a Naringenina 0,07 ± 0,01DEb 0,09 ± 0,01a 0,08 ± 0,01ab Hispidulina 0,10 ± 0,02DEa 0,11 ± 0,01a 0,10 ± 0,01a Quercetina 0,21 ± 0,03CDa 0,16 ± 0,01b 0,19 ± 0,01ab G/T0 G/T3 G/T5 Ácido salicílico 0,67 ± 0,05Aa 0,67 ± 0,10a 0,76 ± 0,14a Protocatecuíco 0,61 ± 0,06Ab 0,95 ± 0,07a 1,06 ± 0,13a Ácido ρ-cumárico 0,27 ± 0,03Ba 0,36 ± 0,01a 0,32 ± 0,10a Ácido cafeico 0,22 ± 0,01BCb 0,28 ± 0,02a 0,22 ± 0,04a Ácido trans-ferúlico 0,26 ± 0,11Ba 0,18 ± 0,02a 0,18 ± 0,04a Crisina 0,12 ± 0,03BCa 0,14 ± 0,01a 0,15 ± 0,02a Pinocembrina 0,74 ± 0,08Aa 0,64 ± 0,03ab 0,58 ± 0,05b Naringenina 0,07 ± 0,01Ca 0,09 ± 0,01a 0,08 ± 0,01a Hispidulina 0,72 ± 0,10Ab 0,81 ± 0,04ab 0,91 ± 0,03a H/T0 H/T3 H/T5 Ácido salicílico 0,31 ± 0,04Ba 0,34 ± 0,07a 0,32 ± 0,05a Protocatecuíco 2,30 ± 0,28Ab 1,28 ± 0,10c 3,34 ± 0,34a Ácido ρ-cumárico 0,22 ± 0,02Ba 0,24 ± 0,01a 0,21 ± 0,03a Escopoletina 0,13 ± 0,02Ba 0,15 ± 0,01a 0,15 ± 0,01a Ácido siríngico 0,24 ± 0,04Ba 0,24 ± 0,02a 0,32 ± 0,01a Hispidulina 0,12 ± 0,01Ba 0,10 ± 0,01ab 0,07 ± 0,02b T0 = Início das análises; T3 = 270 dias de armazenamento e T5 = 450 dias de armazenamento. Valores expressos como média ± desvio padrão (n = 3 para cada amostra). A-FLetras maiúsculas diferentes na mesma coluna, da mesma amostra, diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05). a-c Letras minúsculas diferentes na mesma linha, da mesma amostra, diferem significativamente de acordo com teste de Tukey (p < 0,05).Fonte: próprio autor
Observando os dados da Tabela 34, pode-se verificar que o
ácido ρ-cumárico foi o composto fenólico encontrado em maior concentração nas amostras A, B, D e F. Para a amostra C, as maiores concentrações foram do ácido 4-aminobenzóico e do ácido ρ-anísico,
141
para as amostras E e H, protocatecuíco e para a amostra G, os ácidos salicílico e protocatecuíco e os flavonoides, pinocembrina e hispidulina.
Escuredo et al. (2012) avaliaram o conteúdo de compostos fenólicos de vinte e três amostras de mel do noroeste da Espanha. Os autores utilizaram como preparo de amostra a extração em fase sólida (SPE) seguida por identificação e quantificação em HPLC/DAD. Os compostos fenólicos identificados foram os ácidos fenólicos: cafeico, ρ-cumárico e elágico, e os flavonoides: pinocembrina, crisina, galangina, tectocrisina e campferol). O ácido ρ-cumárico foi um dos principais constituintes da fração fenólica, dos méis espanhóis. O conteúdo fenólico de doze amostras de mel também foi avaliado por Sergiel, Pohl, Biesaga (2014) utilizando Strata X como fase extratora e HPLC-ESI-MS/MS para a identificação e quantificação dos compostos. Os compostos identificados foram os ácidos cafeico, clorogênico, ρ-cumárico, ferúlico, homogenístico, ρ-hidroxibenzóico, vanílico e os flavonoides apigenina, hesperetina, campferol, luteolina, ramnetina, rutina e quercetina, sendo os ácidos ρ-cumárico, ferúlico e ρ-hidroxibenzóico encontrados em todas as amostras de mel analisadas. Quarenta e quatro amostras de mel sérvios foram avaliados quanto ao perfil fenólico por Keckes et al. (2013) utilizando extração líquido-líquido e UHPLC–HESI–MS/MS na identificação e quantificação dos compostos. Os autores encontraram 43 polifenóis (31 flavonoides e 12 não flavonoides), em todas as amostras de mel. Dentre os flavonoides, foram encontradas quantidades relativamente altas de crisina, pinocembrina e galangina. O ácido gálico foi o ácido encontrado em maior concentração, 1,45 mg Kg-1, em mel de girassol. Tenore et al. (2012) avaliou os compostos fenólicos de amostras de mel italiano utilizando Amberlite XAD-2 e LC–ESI/MS/MS e encontraram 7 ácidos fenólicos e 9 flavonóides. Dentre os ácidos fenólicos, o gálico foi o encontrado em maior concentração (98,43 mg 100g-1) no mel de nespereira, contudo, em relação aos flavonoides, a miricetina foi encontrada em maior concentração (6,65 mg 100g-1) no mel de amendoeira. Os componentes fenólicos de méis poloneses também foram estudados por Jasicka-Misiak et al. (2012) utilizando SPE com Amberlite XAD-2 e HPLC/DAD para identificação e quantificação. Foram identificados 15 compostos fenólicos, dez ácidos fenólicos: ácido 3-hidroxibenzóico, ácido clorogênico, 4-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido cafeico, ácido siríngico, ácido ferúlico, ρ-cumárico, ácido rosmarínico, ácido elágico e cinco flavonóides: miricetina, quercetina, campferol, crisina e galangina. Considerando os ácidos fenólicos, o ácido ρ-cumárico foi um dos ácidos encontrados em maior
142
concentração (2,8 a 19 %), em relação aos ácidos fenólicos presentes nas amostras de mel. Entretanto, em relação aos flavonoides, a miricetina foi a predominante, 0,9 a 8,5 %, do conteúdo fenólico total.
Com relação aos compostos fenólicos individuais ao longo do armazenamento, foram quantificados 7 compostos fenólicos na amostra de mel A, 4 ácidos fenólicos, 2 flavonoides e uma cumarina (Tabela 34). A maioria dos compostos fenólicos diminuiu sua concentração ao longo do tempo de armazenamento, apenas o ácido ρ-cumárico e a quercetina aumentaram e, em seguida, também diminuíram suas concentrações. Na amostra B, foram quantificados 7 compostos fenólicos, 3 ácidos fenólicos, 1 cumarina e 2 flavonoides. A maioria dos compostos fenólicos diminuiu seu conteúdo com o armazenamento (Tabela 34), contudo, o ácido salicílico aumentou sua concentração, que pode ter se elevado em função do ácido 3,4-dihidroxibenzóico, que diminuiu sua concentração dando origem a mais ácido salicílico. Na amostra de mel C, foram quantificados 17 compostos fenólicos, 10 ácidos fenólicos e 7 flavonoides. Em sua maioria os compostos fenólicos mantiveram suas concentrações ao longo do armazenamento (Tabela 34), com exceção da hispidulina a qual apresentou redução inicialmente, seguida de elevação ao final da armazenagem, podendo estar relacionada a processo de oxidação e redução da quercetina durante o armazenamento. Na amostra D, foram quantificados 4 compostos fenólicos, 2 ácidos fenólicos e 2 flavonoides. Na Tabela 34, pode-se observar que a concentração de ácido salicílico aumentou, no entanto, o ácido p-cumárico e a quercetina mantiveram suas concentrações, e a miricetina diminuiu ao longo do armazenamento. Na amostra E, foram quantificados 5 compostos fenólicos, dentre elas o ácido vanílico (forma oxidada da vanilina) aumentou sua concentração ao longo do armazenamento (Tabela 34). Na amostra de mel F, foram quantificados 9 compostos fenólicos, 5 ácidos fenólicos, 1 cumarina e 3 flavonoides, e, pode-se observar que a maioria dos compostos fenólicos manteve suas concentrações ao longo do tempo de armazenamento (Tabela 34). Na amostra G, foram quantificados 9 compostos fenólicos, 5 ácidos fenólicos e 4 flavonoides. A maioria dos compostos fenólicos manteve sua concentração com o armazenamento (Tabela 34). Em relação aos flavonoides, a hispidulina aumentou sua concentração, provavelmente por reações de degradação da pinocembrina. E na amostra H, foram quantificados 6 compostos fenólicos, 4 ácidos fenólicos, 1 cumarina e 1 flavonoide, podendo observar que a maioria dos compostos fenólicos manteve sua
143
concentração com o armazenamento, apenas o ácido ρ-cumárico diminiu e a hispidulina aumentou (Tabela 34).
Avaliando o comportamento dos compostos fenólicos estudados ao longo do tempo, nas amostras do estado de Santa Catarina, pode-se observar que os ácidos ρ-cumárico (ácido 4-hidroxicinâmico) e protocatecuíco (3,4-dihidroxibenzóico) apresentaram comportamentos antagônicos em algumas amostras de mel (Tabela 34). Ambos os ácidos ρ-cumárico e protocatecuíco derivam do ácido cinâmico. O ácido ρ-cumárico é obtido após a redução do ácido cinâmico. Contudo, o ácido protocatecuíco é um metabólito do ácido benzóico (CUEVA et al., 2010), que é derivado do ácido cinâmico, após clivagem da cadeia lateral. O acido cinâmico é precursor destes dois ácidos fenólicos, então, pode-se concluir que, à medida que ele se degrada à ácido ρ-cumárico aumentando sua concentração, provavelmente não forma ácido protocatecuíco, ou diminua a sua concentração (KUS et al., 2013).
As diferentes concentrações de compostos fenólicos nos diferentes tipos de méis de mesma florada, podem ter resultado das diferentes condições de maturação das floradas e dos méis, bem como diferenças no metabolismo das plantas. As fontes florais diferentes, entre as regiões, podem ser os fatores que contribuem diretamente para a variabilidade dos compostos fenólicos de região para região de coleta (KUS et al., 2013).
4 CONCLUSÃO
Ao avaliar os parâmetros de identidade e qualidade das amostras de mel de Apis mellifera L., coletados para seleção e aplicação do estudo seguinte, pode-se concluir que, após triagem por região, selecionou-se 8 amostras de méis, garantindo que a coleta e a manipulação das amostras selecionadas foram eficientes, resultando na conformidade com a legislação brasileira e internacional, tornando estas amostras aptas ao estudo de avaliação/monitoramento de sua estabilidade química durante estocagem doméstica, visando definir possíveis marcadores químicos de degradação para os méis de Apis mellifera L.
O tempo de armazenamento influenciou nas características físico-químicas e nos compostos bioativos das amostras de mel de Apis mellifera L. armazenadas por 540 dias. Monossacarídeos como frutose e glicose, o pH, a condutividade elétrica, a atividade diastásica e a cor diminuíram ao longo do tempo de armazenamento. A umidade aumentou, mas apenas a amostra B ultrapassou os limites estabelecidos pelas legislações, brasileira, Codex Alimentarius e Comunidade
144
Europeia, não estando, portanto, própria para consumo após os 540 dias de armazenamento. A acidez aumentou, porém, permaneceu dentro dos limites estabelecidos pelas legislações.
Com relação aos compostos bioativos, os compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante aumentaram ao longo do armazenamento. A maior concentração de compostos fenólicos individuais foi dada a presença de ácidos fenólicos, sendo identificados e quantificados 12. Destacando-se o ácido ρ-cumárico, que foi o composto fenólico encontrado em maior concentração na maioria dos méis. Os demais compostos fenólicos detectados foram 1 cumarina e 9 flavonóides, totalizando 22 compostos fenólicos presentes nas amostras de mel do estado de Santa Catarina. Em relação ao comportamento dos compostos fenólicos individuais durante o armazenamento, a maioria dos compostos analisados permaneceram estáveis ao longo dos 450 dias, pois mantiveram suas concentrações ao longo do período avaliado. Fato de extrema importância, pois se o mel mantem as suas características bioativas ao longo do tempo, fornece benefícios a saúde mesmo após 450 dias de armazenamento.
145
CAPÍTULO 3 – ESTABILIDADE QUÍMICA DE COMPOSTOS VOLÁTEIS E ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA PELO MÉTODO
DE PCA PARA DIAGNÓSTICO DA QUALIDADE DE AMOSTRAS DE MEL DE Apis mellifera L., AO LONGO DO
ARMAZENAMENTO
RESUMO
O mel é um produto natural, de composição química complexa, largamente consumido em todo o mundo. Composto de açúcares, água e nutrientes importantes, como vitaminas, minerais, enzimas, aminoácidos livres, compostos fenólicos e diversos compostos voláteis, os quais conferem ao mel seu perfil aromático distinto, relacionado principalmente à fonte utilizada pelas abelhas para sua produção, compostos gerados durante a maturação ainda nas colmeias e armazenagem. Alguns estudos tem os apresentado como marcadores de origem geográfica, floral, e também como marcadores de processamento térmico, na qual a análise quimiométrica tem sido utilizada para avaliar esses grandes conjuntos de dados, principalmente da química analítica, sendo a análise de componentes principais (PCA) a mais utilizada para analisar amostras de mel, identificando estes marcadores. Neste contexto, o estudo objetiva identificar compostos voláteis de amostras de mel de Apis mellifera L. coletadas e produzidas em 8 regiões potencialmente produtoras do estado de Santa Catarina, monitorando estabilidade e formação de compostos voláteis após a colheita e ao longo do ciclo de armazenamento de 540 dias, em condição doméstica, buscando identificar e quantificar possíveis marcadores químicos de degradação e estabilidade do méis, através da extração por SPME e análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Além disso, avaliar a evolução dos parâmetros de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e individuais, e compostos voláteis através da análise de componentes principais, de 8 amostras de mel de abelhas de Apis mellifera L. coletadas no estado de Santa Catarina e armazenadas por 540 dias, verificando a possibilidade de diferenciação e classificação destas amostras quanto a região de coleta e comportamento dos componentes químicos durante armazenamento. Os resultados das análises iniciais mostraram a presença de 23 compostos majoritários, os quais passaram a ser monitorados ao longo do armazenamento. Ao final pode-se constatar que os terpenos óxidos de cis e trans linalol e o hotrienol, estão presentes em todas as amostras avaliadas, apresentado perfil químico e matemático que os definem como possíveis indicadores de qualidade e degradação dos méis durante o armazenamento e possíveis marcadores químicos de degradação. Ao realizar as análises de componentes principais dos compostos voláteis; parâmetros de identidade e qualidade,
149
atividade antioxidante e compostos voláteis; compostos fenólicos totais e individuais e compostos voláteis foi possível observar que as amostras de mel foram diferenciadas quanto às regiões, destacando as amostras C e G, porém não foram distinguidas quanto ao tempo de armazenamento, comprovando que o comportamento de degradação dos compostos químicos presentes nas amostras de mel de Apis mellifera L. é similar para todas as amostras das diferentes regiões apícolas do estado de Santa Catarina. Palavras-chave: Compostos voláteis; Degradação; Armazenamento; Terpenos; Análise de componentes principais; Marcadores. 1 INTRODUÇÃO
Os néctares e exsudados, possuem constituintes que atraem e são recolhidos por abelhas, as quais os transformam, juntamente com enzimas e outros componentes, e como resultado, produzem o que chamamos de "mel" (ALISSANDRAKIS et al, 2010). Alimento altamente complexo, contendo muitos compostos de diferentes estruturas e funções químicas, nas mais variadas concentrações, sendo majoritários os monossacarídeos glicose e frutose (CASTRO-VAZQUEZ et al., 2008).
Grande parte dos compostos voláteis encontrados em méis de abelhas pertence a diferentes grupos químicos e são originados a partir de várias rotas metabólicas biossintéticas, como hidrocarbonetos, aldeídos, álcoois, ácidos, cetonas, ésteres e terpenos, responsáveis pelo sabor e aroma dos méis (TAHIR et al. 2016; CACHO et al., 2015; KARABAGIAS et al., 2014; MANYI-LOH; NDIP; CLARKE, 2011; KASKONIENE; VENSKUTONIS, 2010; ZHOU et al., 2002). O aroma e sabor são atributos apreciados pelos consumidores, e na maioria das vezes definem o valor comercial dos méis. No entanto, os compostos que o constituem não estão limitados a transferência direta da fonte floral, e podem ser alterados pelo processamento e condições de armazenamento (JERKOVIC; KUS, 2014; ALISSANDRAKIS et al, 2011; ALISSANDRAKIS et al., 2010; BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VAZQUEZ et al., 2008; CASTRO-VAZQUEZ et al., 2007).
No armazenamento, os parâmetros físicos, químicos e microbiológicos conduzem à reações que podem levar à deterioração dos alimentos, e são, consequentemente, os principais alvos para a preservação e controle eficazes (GOULD, 1996; LABUZA, 1984). O crescimento de micro-organismos, aumento no teor de água, aumento da
150
temperatura e aumento da acidez, influenciam na qualidade de alimentos frescos como o mel, resultando em sabores e odores indesejáveis, com consequente alteração na composição química (VELD, 1996). Alguns compostos como o furfural e o 5-hidroximetilfurfural (HMF), são utilizados como marcadores de processo de aquecimento ou condição de armazenamento de méis, mas ambos, também, podem ser formados através da reação de Maillard quando os méis são armazenados a temperaturas indesejadas ou por longos períodos (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CASTRO-VÁZQUEZ et al., 2008). Outros compostos voláteis também foram relatados como marcadores florais e geográficos de méis, como a α-isoforona em méis de girassol e eucalipto (JERKOVIC; KUS, 2014), 3-careno em méis Turcos (TANANAKI et al., 2007), linalol, óxido de linalol, α-terpineol, terpineol, isômeros de aldeídos lilac's e aldeídos álcoois, antranilato de metila e isômeros do sinensal em méis citrus (CASTRO-VASQUEZ et al., 2007; ALISSANDRAKIS et al., 2005).
A formação de compostos voláteis nos méis durante o armazenamento, são advindos de diferentes rotas metabólicas, onde estes compostos são degradados transformando-se em compostos secundários e terciários provenientes do processo de degradação. Alguns hidrocarbonetos são transformados em moléculas menores como álcoois (MOREIRA et al., 2010), o hotrienol (3,7-dimetil-1,5,7-octatrien-3-ol) pode ser gerado pelo (E)-2,6-dimetil-6-acetoxi-2,7-octadienal (BARRA; PONCE-DÍAZ; VENEGAS-GALLEGOS, 2010; CUEVAS-GLORY et al., 2007), ou por outros compostos como o terpendiol I e o 8-hidroxilinalool (KUS et al., 2013), alguns aldeídos e cetonas podem ser formados pela oxidação dos ácidos linoleico e linolênico (KAŃKONIENÉ; VENSKUTONIS; CEKSTERYTÉ, 2008). Os lilac aldeídos podem ser formados pela isomerização do 8-hidroxilinalool a lilac álcoois (KUS et al., 2013), o ácido hexadecanóico pode ser formado a partir da oxidação aldeídica do hexadecanal durante o armazenamento (MOREIRA et al., 2010).
Além das alterações dos compostos voláteis descritas anteriormente, outras modificações também podem promover mudanças de cor e sabor dos méis. A reação de Maillard, por exemplo, pode promover a redução do valor nutritivo destruindo aminoácidos essenciais e também alterando a cor (VAIKOUSI; KOUTSOUMANIS; BILIADERIS, 2009; FALLICO et al., 2004). A perda de ácido ascórbico e de vitamina K, quando presentes nestas reações, também contribuem para a queda do valor nutritivo (DAMODARAN; PARKIN;
151
FENNEMA, 2010; ORDÓÑEZ et al., 2005). Outra reação que contribui com a perda de aminoácidos é a degradação de Strecker (OETTERER; REGITANO-D‟ARCE; SPOTO, 2006).
A maioria dos estudos relatados na literatura sobre as alterações que ocorrem durante o armazenamento dos méis, descrevem sobre as características físico-químicas, sendo de extrema relevância estudos que monitorem os compostos voláteis (CASTRO-VÁZQUEZ et al., 2012; ALISSANDRAKIS et al, 2011; MOREIRA et al., 2007; SANCHO et al., 1992). De acordo com Castro-Vázquez et al. (2012), se o mel for armazenado em condições inadequadas, poderá produzir odores e sabores diferentes dos encontrados para o produto recém colhido, além da possibilidade de produzir compostos que possam ser tóxicos ao organismo humano, como o 5-HMF. Para o qual alguns estudos mostram que, em concentrações elevadas , é citotóxico, irritante para os olhos, vias respiratórias superiores, pele e mucosas (CAPUANO; FOGLIANO, 2011). Como mostra o estudo realizado com roedores, relatado por Ulbricht, Northup e Thomas (1984) onde calcularam um DL50 oral, do 5-HMF, de 3,1 g kg-1 em peso corporal em ratos.
A análise quimiométrica utiliza a matemática e técnicas estatísticas para extrair informações de conjuntos de dados complexos, avaliar a amostra como um todo, e não apenas um único componente, para melhor compreender as interações entre os constituintes e seus efeitos sobre a matriz (CORREIA; FERREIRA, 2007; CORBELLA; COZZOLINO, 2006). Existem diversas técnicas quimiométricas que são utilizadas para classificar e discriminar as amostras, dentre elas encontram-se a análise discriminante linear, análise de cluster, regressão por mínimos quadrados parciais e a análise de componentes principais.
A PCA (PCA - Do inglês: Principal component analysis) é uma das análises quimiométricas mais utilizadas para a classificação dos dados, pois auxilia na redução da complexidade de grandes conjuntos de dados, oferece melhor interpretação e compreensão dos dados (YÜCEL; SULTANOGLU, 2013; TERRAB; DIÉZA; HEREDIA, 2002), além de revelar a existência ou não de amostras anômalas, de relações entre as variáveis medidas e de relações ou agrupamentos entre amostras (LYRA et al., 2010). A redução do conjunto de dados original é obtida estabelecendo novas variáveis ortogonais entre si, denominadas de componentes principais (PC - Do inglês: Principal component), que são organizadas de forma decrescente de importância. Os gráficos obtidos representam as amostras em um sistema cartesiano onde os eixos são as PC's (CORREIA; FERREIRA, 2007).
152
Algumas amostras tem sido classificadas e discriminadas pela
análise de PCA e descritas por diversos autores, como amostras de pimentas nativas peruanas (PATEL et al., 2016), uvas vermelhas e brancas em sua composição química, especialmente perfis fenólicos (SAMOTICHA; WOJDYŁO; GOLIS, 2017), amostras de café verdes, quanto ao tipo de café e a origem geográfica (MEHARI et al., 2016), amostras de azeite de oliva, com base na composição de ácidos graxos (Köseoglu; Sevim; Kadiroglu, 2016) e 14 variedades de mirtilo, quanto à atividade antioxidante e compostos fenólicos totais (WANG et al., 2017).
O mel também possui diversos constituintes químicos, passíveis de degradação, e com necessidades de avaliação quanto às suas características físico-químicas e de qualidade, de forma eficaz, visto que são vários os parâmetros que o definem como produto alimentício. Por esse motivo, também são necessárias ferramentas que possam garantir respostas mais adequadas para a grande variabilidade de compostos presentes e suas estabilidades (CORBELLA; COZZOLINO, 2006). Neste contexto, a PCA tem sido utilizada como uma ferramenta para extrair informações valiosas de conjuntos de dados complexos (YI et al., 2016; YÜCEL; SULTANOGLU, 2013; CORBELLA; COZZOLINO, 2006; GREEF; SMILDE, 2005), como em 77 amostras de mel que foram classificadas quanto às diferentes regiões da China ao serem avaliados os compostos fenólicos (ZHAO et al., 2016), 4 tipos de méis do vale da Caxemira, também foram diferenciados quanto ao conteúdo de minerais, cor e propriedades antioxidantes (NAYIK; NANDA, 2016), 89 amostras de mel rape e 98 amostras de mel chaste foram perfeitamente distinguidas quanto a autenticação floral (ZHOU et al., 2014) e 40 amostras de mel brasileiras foram discriminadas quanto à origem geográfica levando em consideração o conteúdo de cátions (RIZÉLIO et al., 2012).
Ao considerar as possibilidades de degradação e formação de compostos voláteis nos méis, objetivou-se identificar e quantificar compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. produzidas em diferentes regiões apícolas do estado de Santa Catarina, empregando a técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, monitorando mudanças no perfil de compostos voláteis destas amostras armazenadas em um modelo doméstico, durante 540 dias, a temperatura ambiente, buscando definir possíveis marcadores químicos relacionados a degradação e estabilidade das amostras. Além disso, utilizar a análise de componentes principais (PCA) como ferramenta, para auxiliar na
153
avaliação da estabilidade de méis de abelhas Apis mellifera L., considerando as variações dos parâmetros de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e individuais, e compostos voláteis, para a possibilidade de classificação e diferenciação das amostras, de acordo com a região de coleta e ou tempos de armazenamento.
2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MATERIAL
Todos os reagentes utilizados, nacional ou importados, foram de grau analítico. O TBS, SDS, ácido sórbico, CTAB, cafeína, 5-HMF, fosfato de monossódio monohidratado, fosfato dissódico anidro foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA), o hidróxido de sódio, cloreto de sódio, acetato de sódio, amido solúvel, iodo, ácido ascórbico, cloreto férrico, sulfato ferroso, ácido gálico, carbonato de sódio, frutose, glicose, sacarose e sulfato de sódio anidro foram adquiridos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e o metanol e o ácido fórmico foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA).
Os padrões ácido 4-aminobenzóico, ácido salicílico, ácido cinâmico, ácido p-anísico, ácido mandélico, vanilina, ácido 4-hidroximetilbenzóico, protocatecuico, umbeliferona, 4-hidroxicinâmico, ácido p-cumárico, ácido metoxifenilacético, ácido vanílico, ácido gálico, 4-metilumbeliferona, coniferaldeído, ácido caféico, siringaldeído, escopoletina, ácido trans ferúlico, ácido siríngico, sinapaldeído, ácido sinápico, resveratrol, crisina, pinocembrina, apigenina, galangina, naringenina, kaempferol, eriodictiol, aromadendrina, fustina, catequina, epicatequina, hispidulina, ácido elágico, quercetina, taxifolina, miricetina, carnosol, ácido clorogênico, ácido rosmarínico, isoquercetrina, naringina, rutina foram obtidos da Sigma Aldrich (Santa Ana, EUA) e da Fluka Chemie AG (Buchs, Suíça). A água utilizada foi filtrada por sistema de desionização (18.2 MΩ cm) (desionizador Milli-Q, Millipore, Bedford, EUA) e os capilares Polymicro (Polymicro Technologies, Phoenix, EUA).
Os padrões de n-alcanos C8-C40 foram adquiridos da Supelco Analytical (Bellefonte, PA). O reagente cloreto de sódio e o solvente hexano foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil). A coluna capilar HP-5MS, Agilent Technologies (Santa Clara, CA). As fibras de extração CAR/DVB/PDMS 50/30 µm da Supelco (Bellefont, PA). O gás utilizado foi hélio tipo 5.0, pureza 99,9999%, adquirido da Air Liquid Brasil Ltda, Bela Vista, Palhoça, SC, BR.
154
Os principais equipamentos utilizados foram: refratômetro
Tropenmodell I (Carl Zeiss Jena, Alemanha), condutivímetro modelo Tec-4MP (TECNAL, Brasil), pH-metro MD-20 (Digimed, Brasil), colorímetro (Minolta Chroma Meter CR-400, Osaka, Japão), espectrofotômetro (Spectro Vision UV-Vis, 1810-S Beijing, China), agitador magnético (Fisatom 752A, Minas Gerais, Brasil), eletroforese capilar modelo 7100 (Agilent Technologies, Palo Alto, EUA), centrífuga modelo 280R (Fanem, São Paulo, Brasil), banho termostático Deprom dbm120 (São Paulo, Brasil), mini spin Eppendorf AG 5453 (Hamburgo, Alemanha), cromatógrafo líquido Agilent Technologies (Alemanha) 1200 Series acoplado a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo e íon trap linear, modelo Q Trap 3200 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canada) que foi utilizado em conjunto com ionização por eletrospray (ESI) Turbo Ion Spray TM (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canada), centrífuga Micro Centrifuga mini spin Eppendorf AG 5453 (Hamburgo, Alemanha) e rotaevaporador Fisatom 802 (São Paulo, Brasil), banho termostático Prufgerate-Werk Medingen, Dresden, Alemanha; agitador magnético Fisaton modelo 752A, Perdizes, SP, BR; Cromatógrafo a Gás (7890A) acoplado à um Espectrômetro de Massas (5975C), ambos adquiridos da Agilent Technologies, Santa Clara, CA 95051, EUA.
2.2 AMOSTRAS DE MEL 2.2.1 Avaliação da estabilidade química e bioativa
As amostras de mel selecionadas, com comprovado atendimento aos parâmetros de identidade e qualidade exigidos pela Instrução Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000 do MAPA, Codex Alimentarius (CODEX STAN 12-1981) e União Europeia (Council Directive 2001/11), foram avaliadas considerando a estabilidade em ambiente domestico simulado, de acordo com Moreira et al. (2010), com adaptações. Massas de 63 g, das respectivas amostras foram mantidas em frascos de polietileno próprios para envase comercial de mel, fechados de maneira adequada, garantindo o isolamento completo das amostras com o ambiente externo e mantidos a temperatura ambiente (20 ± 4 ºC), ao abrigo da luz. As avaliações das amostras foram realizadas em um período de 540 dias de armazenamento, com intervalos analíticos de 90 dias, considerando as determinações de açúcares (glicose, frutose e sacarose), umidade, pH, acidez, atividade diastásica, cor, condutividade elétrica, HMF, avaliação da atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e compostos voláteis no tempo
155
zero (quando as amostras chegaram ao Laboratório de Química de Alimentos CCA/UFSC) e em 6 intervalos de tempo, totalizando 7 avaliações. Os compostos fenólicos individuais foram analisados nos tempos zero (T0), 270 dias de armazenamento (tempo 3 = T3) e 450 dias de armazenamento (tempo 5 = T5), totalizando 3 avaliações.
A Tabela 35 ilustra a descrição geográfica dos municípios de
origem das amostras.
156
Tabe
la 3
5. D
escr
ição
geo
gráf
ica
dos m
unic
ípio
s cat
arin
ense
s de
orig
em d
as a
mos
tras d
e m
el, s
elec
iona
dos a
pós a
nális
e
Cód
igo
Am
ostr
a M
unic
ípio
L
atitu
de
Lon
gitu
de
Alti
tude
(m
) D
ata
da
cole
ta
Flor
ada
pr
edom
inan
te
1 A
Ita
iópo
lis
26º 2
0' 1
1" S
49
º 54'
23"
W
925
12/2
013
Car
ne d
e va
ca (C
leth
ra
scab
ra P
ers.)
e o
utra
s flo
res
5 B
Fl
oria
nópo
lis
27º 3
5' 4
8" S
48
º 32'
57"
W
3 02
/04/
2014
Si
lves
tre
13
C
São
Joaq
uim
28
º 17'
38"
S
49º 5
5' 5
4" W
13
53
18/0
3/20
14
Vas
sour
a B
ranc
a (B
acch
aris
le
ucoc
epha
la D
usén
) 12
D
O
rlean
s 28
º18,
14.1
7” S
49
º15,
44.5
5” O
22
0 12
/201
3 U
va d
o ja
pão
(Hov
enia
du
lcis
) 30
E
Vid
al R
amos
27
º22‟
36.1
94”
49º1
9‟1.
481”
57
0 06
/05/
2014
Si
lves
tre
25
F Sã
o M
igue
l do
Oes
te
26º 4
3' 3
1" S
53
º 31'
05"
W
645
12/2
013
Silv
estre
17
G
Vid
eira
27
º 00'
30"
S
51º 0
9' 0
6" W
75
0 08
/04/
2014
Si
lves
tre
28
H
Vito
r Mei
rele
s 27
º49‟
32,9
3” S
49
º55‟
28,2
1” O
37
0 24
/12/
2013
Si
lves
tre
Font
e: p
rópr
io a
utor
157
2.3 PARÂMETROS DE IDENTIDADE E QUALIDADE 2.3.1 Açúcares
As determinações dos açúcares: frutose, glicose e sacarose, foram realizadas de acordo com Rizelio e colaboradores (2012a), através de método indireto por CE.
Massas de 2,5 g de mel foram dissolvidas em água desionizada, transferidas para balões volumétricos e aferidos para 50 mL. As soluções das amostras foram centrifugadas por 4 minutos a 14000 RPM, após, dissolvidas na proporção de 1:10 (v/v) com água desionizada. Estas soluções foram injetadas diretamente no equipamento de CE. Para as curvas padrão, foram preparadas soluções estoque dos padrões de frutose, glicose e sacarose, todas na concentração de 50 mmol L-1 em água desionizada e estocadas a -18 ºC até o momento das análises.
O eletrólito de corrida foi composto por 20 mmol L-1 de ácido sórbico, 0,2 mmol L-1 de CTAB e 40 mmol L-1 de NaOH, em pH 12,2. O capilar utilizado foi de 60 cm de comprimento total, 8,5 cm de comprimento efetivo e 50 μm de diâmetro interno. As injeções foram realizadas no modo hidrodinâmico (-50 mbar, 3 s), e a voltagem aplicada foi de 25 kV. A temperatura, nas separações, foi mantida a 25 ºC, e as detecções realizadas no modo indireto em 254 nm. Os resultados foram expressos em g 100 g-1.
2.3.2 Umidade, pH, acidez livre e atividade diastásica
A umidade, o pH, a acidez e a atividade diastásica foram determinados de acordo com a AOAC (2005), seguindo os métodos 969.38, 962.19 e 920.180, respectivamente.
A umidade das amostras foi determinada por refratômetria, onde os índices de refração foram verificados à temperatura ambiente, utilizando um refratômetro de Abbé, e as leituras obtidas, foram corrigidas para a temperatura padrão, de 20 ºC, através do uso de um fator de correção de 0,00023 por grau acima ou abaixo do padrão. Os teores de umidade foram determinados correspondentes aos índices de refrações corrigidos usando a tabela de Wedmore para a obtenção dos resultados, e expressos em g 100 g-1 de mel (AOAC, 2005).
Para a determinação da acidez livre, massas de 10 g das amostras foram diluídas em 75 mL de água destilada descarbonatada com agitação magnética. Após a verificação do pH inicial, a solução foi titulada com NaOH 0,1 mol L-1 até atingir pH 8,5. O valor da acidez livre foi calculado de acordo com a equação:
158
( )
sendo: v corresponde ao volume (mL) de NaOH 0,1 mol L-1 gasto na titulação da amostra, f corresponde a correção da molalidade da solução de NaOH 0,1 mol L-1 e m corresponde a massa da amostra (g) utilizada. Os valores de acidez foram expressos em mEq kg-1 (AOAC, 2005).
A atividade diastásica foi determinada de acordo com AOAC
(2005). Massas de 5 g de mel foram diluídas em 10 mL de água desionizada, tamponadas com 2,5 mL de tampão acetato 1,59 mol L-1 (pH 5,3), em balão volumétrico de 25 mL contendo 1,5 mL de NaCl 0,5 mol L-1 e aferidos com água desionizada. A solução foi transferida para um tubo de ensaio e acondicionada em banho-maria a 40 ºC juntamente com um segundo tubo de ensaio contendo solução de amido 1 %. Após 15 minutos, 2,5 mL da solução de amido foram transferidos para o tubo contendo 5 mL da solução de mel, com agitação e cronometragem do tempo. Após 1 minuto, 0,25 mL da mistura foi combinada com 2,5 mL de solução de iodo 0,00035 mol/L, e volume de água destilada requerido para que uma absorbância inicial, a 660 nm, de 0,760 ± 0,02, de acordo com o padrão de amido. A reação foi repetida a cada minuto até que a absorbância atingisse valor igual ou inferior a 0,235. Com os valores obtidos, foram construídos gráficos da absorbância versus tempo, para o cálculo de tx, que é o tempo (minutos) necessário para redução da absorbância a 0,235. O quociente 300/tx resultou na atividade diastásica, expressa em mL de solução de amido 1 % (m/v) hidrolisada por 1 hora pela enzima presente em 1 g de mel, e os resultados expressos em unidades Göthe (AOAC, 2005; KÜÇÜK et al., 2005).
2.3.3 Condutividade elétrica
A condutividade elétrica das soluções de mel diluídas em água desionizada (20 % m/v) foi determinada por condutivimetria a 25 ºC, e os resultados expressos em mS cm-1 (BOGDANOV, 1999).
2.3.4 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF)
As concentrações de 5-HMF foram determinadas por metodologia descrita segundo Rizelio e colaboradores (2012b), utilizando método de MECK (Do inglês: Micellar electrokinetic chromatography) com detecção por DAD (Do inglês: Diode array detector), e os resultados expressos em mg kg-1.
159
Para a quantificação, massas de 5 g das amostras foram dissolvidas com água desionizada e transferidas para balão volumétrico de 10 mL, adicionados 2 mL de cafeína (1000 mg L-1) como padrão interno, aferido o volume para 10 mL com água desionizada. As soluções das amostras foram centrifugadas por 4 minutos a 14000 RPM. As soluções das amostras foram injetadas diretamente no equipamento de CE de acordo com o descrito na metodologia aplicada. Para a curva padrão foi preparada uma solução estoque do padrão de HMF na concentração de 1000 mg L-1 em metanol e estocada a -4 ºC até a realização das análises.
As condições de separação utilizadas no método foram: eletrólito composto de tetraborato de sódio (TBS) 5 mmol L-1, dodecil sulfato de sódio (SDS) 120 mmol L-1, em pH 9,3; capilar de 32 cm de comprimento total, 8,5 cm de comprimento efetivo e 50 μm de diâmetro interno; injeção hidrodinâmica a -50 mbar por 3 segundos; voltagem de -15 kV; temperatura de 25 ºC; e detecção direta em 284 nm. 2.3.5 Cor
Para determinação da cor das amostras foi utilizado o método CIE L*a*b*, com o colorímetro ajustado para operar com iluminante D65 e ângulo de observação de 10º, previamente calibrado. As amostras de mel foram colocadas em cubetas de poliestireno que continham 14 mL de volume e, posteriormente, realizadas as leituras dos parâmetros L*, a* e b*, diretamente do equipamento. O parâmetro L* (luminosidade) varia de 0 (preto) a 100 (branco). O parâmetro a* indica o grau de cor vermelha (+a*) ou verde (-a*), enquanto o parâmetro b* mede a grau de cor azul (-b*) ou amarela (+b*). Foram realizadas três medições para cada amostra. Nas amostras que exibiram cristalização, foi utilizado aquecimento, em banho-d‟água, a 45 ºC por tempo suficiente para dissolução completa dos cristais (BERTONCELJ et al., 2007).
2.3.6 Avaliação de compostos fenólicos totais e atividade antioxidante
O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado através do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (SINGLETON; ROSSI, 1965), e os resultados foram expressos em miligramas de equivalente a ácido gálico (mg EAG 100 g-1) de mel.
A avaliação da atividade antioxidante das amostras foi realizada através de dois métodos baseados em diferentes princípios e condições experimentais: o método de sequestro de radicais do DPPH, de acordo
160
com Brand-Williams, Cuverlier e Berset (1995), sendo os resultados expressos em miligramas equivalentes a ácido ascórbico (mg EAA 100 g-1 de mel) e o método do poder redutor de FRAP, descrito por Benzie e Strain (1996), modificado por Bertoncelj et al. (2007), com seus resultados expressos em μmols equivalentes a Fe (II) 100 g-1 de mel.
2.3.7 Identificação e quantificação de compostos fenólicos 2.3.7.1 Preparação da amostra
O processo de extração foi realizado de acordo com Trautvetter, Koelling-Speer e Karl Speer (2009), com adaptações, onde massas de 1 g das amostras foram adicionadas de 1 mL de solução aquosa de cloreto de sódio 2% (m/v), mantidas sob agitação constante por 1 minuto, seguidas de cinco extrações sequenciais com volumes de 2 mL de acetato de etila. As fases orgânicas foram combinadas e secas com sulfato de sódio anidro durante 15 minutos, seguidos por filtração e concentração em evaporador rotativo (40 ± 2 ºC). Os extratos resultantes suspensos em 1 mL de água: metanol (70:30), centrifugados a por 4 minutos a 14000 rpm e injetados em sistema de cromatografia liquida acoplado ao detector de massas em tandem (LC-ESI-MS/MS). 2.3.7.2 Separação e quantificação dos compostos por LC-ESI-MS/MS
A avaliação dos compostos foi executada em sistema cromatográfico acoplado a um espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolo e íon trap linear, que foi utilizado em conjunto com ionização por eletrospray em modo negativo.
Os compostos fenólicos foram separados em coluna Synergi TM (4.0 μm, 2.0 x 150 mm d.i.; Phenomenex, USA). A fase móvel consistiu de uma solução de metanol 95 % e água 5 % (A) e ácido fórmico 0,1 % (B). A separação foi realizada a 30 °C utilizando eluição por gradiente, segmentado de acordo com as seguintes etapas: 0 – 5 min, 10 % A; 5 – 7 min, 90 % A; 7 – 10 min, 90 % A; 10 – 17 min, 10 % A. O fluxo utilizado foi de 250 µl min-1 e volume de injeção de 10 μL. Os compostos foram monitorados utilizando monitoramento de reações múltiplas (MRM). A identificação dos compostos foi realizada com base no tempo de retenção, íon precursor e seus fragmentos através da comparação com os respectivos padrões disponíveis comercialmente. A otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas foi realizada por infusão direta de soluções contendo os compostos de interesse individualmente, apresentados na Tabela 36. O software Analyst versão 1.6.2 foi utilizado para aquisição e tratamento dos dados. A
161
quantificação foi realizada monitorando um íon quantitativo selecionado para cada composto e utilizando curvas de calibração construídas em razão dos compostos previamente identificados com os valores da área do pico do analito versus a concentração. Os LOD (limite de detecção) e LOQ (limite de quantificação), foram obtidos a partir da relação sinal ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente (RIBANI et al., 2004). As concentrações dos compostos nas amostras foram expressas em µg por g-1 de mel. Tabela 36. Parâmetros do espectrômetro de massas obtidos pela infusão dos padrões de compostos fenólicos individualmente
Compostos fenólicos DP EP CEP CE CXP 4-aminobenzóico -20,00 -9,50 -10,00 -16,00 -2,00 Ácido salicílico -25,00 -2,50 -10,00 -24,00 -2,00 Ácido cinâmico -25,00 -9,00 -10,00 -16,00 -2,00 Ácido gálico -25,00 -11,00 -12,00 -20,00 -4,00 Ácido protocatecuico -26,00 -9,00 -17,32 -17,00 -4,00 Ácido ρ-cumárico -21,00 -4,00 -17,69 -13,00 -6,00 Taxifolina -95,00 -10,50 -16,00 -30,00 -2,00 Rutina -31,00 -5,00 -34,19 -27,00 -6,00 Quercetina -80,00 -6,00 -14,00 -32,00 0,00 Resveratrol -50,00 -8,50 -18,00 -24,00 -4,00 Miricetina -65,00 -4,50 -18,00 -34,00 -2,00 Aromadendrina -45,00 -4,00 -16,00 -32,00 -2,00 Hispidulina -50,00 -7,00 -22,00 -14,00 -4,00 Campferol -75,00 -4,50 -16,00 -62,00 -2,00 Ácido ρ-anísico -25,00 -5,00 -10,00 -18,00 -2,00 Ácido mandélico -20,00 -7,50 -10,00 -12,00 -2,00 Vanilina -25,00 -3,00 -14,00 -14,00 -2,00 Ácido 4– hidroximetilbenzoico
-30,00 -6,50 -10,00 -18,00 -2,00
Ácido 3,4 hidroximetilbenzoico
-30,00 -7,00 -10,00 -20,00 -2,00
Umbeliferona -55,00 -4,50 -10,00 -22,00 -4,00 Ácido 4-hidroxicinâmico
-25,00 -10,50 -12,00 -20,00 -2,00
Ácido metoxifenilacético
-10,00 -10,00 -10,00 -6,00 -2,00
Ácido vanílico -30,00 -7,00 -10,00 -18,00 -2,00 4-metilumbeliferona -45,00 -10,50 -10,00 -28,00 -2,00 Coniferaldeído -25,00 -10,00 -12,00 -20,00 -2,00 Ácido cafeico -30,00 -11,00 -10,00 -22,00 -2,0 Siringaldeído -25,00 -4,50 -10,00 -20,00 -4,00 Escopoletina -35,00 -4,00 -12,00 -14,00 -2,00
162
Ácido ferúlico -40,00 -7,00 -10,00 -24,00 -2,00 Ácido siríngico -30,00 -10,50 -12,00 -28,00 -2,00 Sinalpadeído -30,00 -3,00 -12,00 -22,00 -2,00 Ácido sinápico -30,00 -12,00 -16,00 -22,00 0,00 Crisina -65,00 -10,00 -20,00 -52,00 -2,00 Pinocembrina -60,00 -12,00 -22,00 -54,00 -2,00 Apigenina -75,00 -9,00 -14,00 -46,00 -2,00 Galangina -75,00 -8,50 -16,00 -64,00 -10,00 Naringenina -60,00 -4,50 -12,00 -28,00 -2,00 Carnosol -75,00 -5,00 -16,00 -16,00 -4,00 Ácido clorogênico -25,00 -5,00 -24,00 -28,00 -2,00 Ácido rosmarínico -50,00 -3,00 -18,00 -28,00 -4,00 Isoquercetina -245,00 -3,00 -48,00 -44,00 -2,00 Naringina -250,00 -4,00 -36,00 -52,00 -2,00 Eriodictiol -75,00 -9,50 -16,00 -36,00 -4,00 Fustina -45,00 -4,00 -14,00 -38,00 -2,00 Catequina -55,00 -4,50 -14,00 -34,00 -4,00 Epicatequina -290,00 -4,00 -16,00 -40,00 -2,00 Ácido elágico -50,00 -10,50 -16,00 -58,00 0,00
DP - Potencial de desagregação; EP – Potencial de entrada; CEP – Potencial de entrada da célula de colisão; CE – Energia de colisão; CXP - Potencial de saída da célula de colisão. Fonte: próprio autor
2.3.8 Determinação dos compostos voláteis
2.3.8.1 Extração (HS-SPME) A extração de compostos voláteis foi realizada segundo
Bianchin e colaboradores (2014), com adaptações. Para a adsorção dos compostos voláteis foi utilizada uma fibra de CAR/DVB/PDMS (50/30 µm), expondo a mesma ao headspace da amostra, em frascos de 15 mL específicos para SPME, agitação magnética constante com as seguintes condições de extração: proporção 1:1 mel/solução saturada de NaCl (1 g/1 mL), acondicionamento: 5 min, tempo de exposição da fibra: 45 min a 45 ºC. 2.3.8.2 Identificação e quantificação (GC/MS)
Para avaliar o perfil de compostos voláteis foi utilizado um Cromatógrafo a Gás acoplado à um Espectrômetro de Massas equipado com Coluna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio ultrapuro com fluxo de 1 mL min-1, como gás de arraste. O programa de temperatura do forno foi: 40 °C (durante 10 min), a 5 °C
163
min-1 até 300 °C (mantido durante 20 min). A temperatura do injetor ajustada para 260 °C, limitada pela temperatura de dessorção indicado pelo fabricante de fibra SPME. A temperatura do detector também ajustada para 260 °C, temperatura de interface: 260 °C, fonte de ionização: 200 °C e o modo de ionização por impacto de elétrons, com a energia de elétrons de 70 eV. O tempo da dessorção do analito da fibra de SPME foi fixado em 10 min. A injeção foi efetuada no modo splitless durante 10 min. Os cromatogramas dos padrões e das amostras foram registrados utilizando o Software MSD ChemStation E.02.02.1431.
2.3.8.3 Processamento de dados de espectro de massas
A identificação dos compostos foi realizada por comparação dos espectros obtidos com os espectros contidos na biblioteca Nist Mass Spectral Library 2011.
O índice de retenção (LRI) de cada composto na amostra, foi calculado, a partir de padrão de n-alcanos (C8-C40), onde 1 µL do padrão diluído (10 ppm) foi injetado no sistema GC/MS operando nas condições descritas acima, e seus respectivos tempos de retenção foram usados como padrão externo de referência para o cálculo do LRI, juntamente com os tempos de retenção de cada composto de interesse. O LRI de cada componente foi calculado conforme a Equação abaixo:
Sendo: LRI: índice de retenção linear; tc: tempo de retenção do
composto de interesse; tn+1: tempo de retenção do hidrocarboneto posterior; n: nº de carbonos do hidrocarboneto anterior.
Para auxiliar na identificação e caracterização dos compostos
voláteis, os valores de índice de retenção linear calculados foram comparados com a Biblioteca Nist Mass Spectral Library 2011. 2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O programa estatístico STATISTICA versão 7.0 para Windows (Statsoft) foi utilizado para as análises estatísticas.
A quimiometria foi realizada, por aplicação da análise de componentes principais (PCA), buscando demonstrar os agrupamentos das amostras de mel e suas variáveis (padrões de identidade e qualidade, atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e individuais e compostos voláteis).
164
Todas as análises foram realizadas em triplicata de preparo e
os dados apresentados como média ± desvio padrão de cada amostra. Os resultados analíticos das médias foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste HSD de Tukey para avaliar diferenças entre as médias, sendo consideradas diferenças significativas para p < 0,05 para um nível de confiança de 95 %.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 COMPOSTOS VOLÁTEIS
Após análise dos espectros de massas, foi possível identificar 32 compostos voláteis nas amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina.
A Tabela 37 ilustra o tempo de retenção e índice de retenção experimental e os obtidos na Biblioteca NIST 2011 dos compostos voláteis encontrados nas amostras de mel do estado Catarinense.
165
Tabela 37. Tempo de retenção e índice de retenção dos compostos voláteis encontrados nas amostras de mel de Apis mellifera L.
Composto Tempo de retenção
Índice de retenção
experimental
Índice de retenção
NIST 2011 3-pentanol 1,770 528 681 Acetato de etila 2,267 545 586 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolane 3,755 596 761 1-butanol, 3-metil 3,961 603 697 1-pentanol 4,013 604 761 Ácido 3-metil-butanoico 8,642 764 811 Ácido 2-metil-butanoico 9,626 795 811 Benzaldeído 15,525 996 982 2-etil hexanol 18,672 1103 995 Benzeno acetaldeído 19,571 1134 1081 Acetofenona 20,336 1160 1029 Óxido de cis-linalol 20,606 1169 1164 Óxido de trans-linalol 21,253 1191 1164 Linalol (3,7-dimetil-octa-1,6-dien-3-ol)
21,173 1188 1082
Hotrienol (1,5,7-octatrien-3-ol-3,7-dimetil)
21,739 1202 1072
Álcool fenetílico 21,785 1209 1136 Isoforona 21,180 1223 1097 Aldeído lilac (α,5-dimetil-5-etenil-2-tetrahidrofuranacetaldeído)
22,935 1248 1197
2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona
23,078 1253 1268
Benzoato de etila 23,587 1270 1160 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil
23,977 1284 1255
Dietil succinato 24,011 1285 1151 2,6-dimetilbenzaldeído 25,338 1330 1208 2,3,4,5-Tetrahidropiridazina 25,516 1336 969 Fenil acetato de etila 26,100 1356 1259 Etanoato de etil fenila 26,460 1368 1259 2,4,6-trimetilfenol 28,228 1428 1241 1-(2,6,6-trimetil-1,3-ciclohexadien-1-il)-2-buten-1-ona
29,687 1478 1362
2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-(1-acetopropil) fenol
35,793 1686 2003
Ácido salicílico, terc butil ester 39,426 1809 1495 Salicilato de etilhexila 39,781 1821 1913 Homosalato 41,417 1877 2037 Fonte: próprio autor
166
Os valores calculados para os índices de retenção avaliados no
presente estudo, são semelhantes aos índices de retenção obtidos da biblioteca NIST 2011 (Tabela 37). Entre os compostos voláteis presentes nas amostras de mel de Apis mellifera L. avaliadas no estudo, encontram-se álcoois, cetonas, aldeídos, ésteres, terpenos e compostos terpênicos.
Dos 32 compostos voláteis identificados nas amostras de mel, 24 apresentaram maior área, sendo estes, selecionados para a avaliação do comportamento ao longo dos 540 dias de armazenamento.
A Figura 11 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários identificados na amostra A de mel de Apis mellifera L. ao longo da armazenagem por 540 dias.
167
Figu
ra 1
1. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis
maj
oritá
rios,
iden
tific
ados
na
amos
tra A
, de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
, do
esta
do d
e Sa
nta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
dia
s
168
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
169
Dentre os compostos voláteis avaliados ao longo dos 540 dias de armazenamento, 6 variaram significativamente na amostra A (Figura 11). Foram avaliados o comportamento do acetato de etila, 2-etil hexanol, benzeno acetaldeído e de três terpenos: óxidos de cis e trans linalol e hotrienol, e constatou-se que as áreas dos compostos aumentaram ao longo do armazenamento.
A Figura 12 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados nas amostras de mel de Apis mellifera L. da amostra B, ao longo do armazenamento por 540 dias.
170
Figu
ra 1
2. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis m
ajor
itário
s, id
entif
icad
os n
a am
ostra
B d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L., d
o es
tado
de
San
ta C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
171
172
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
173
Na Figura 12, 9 compostos variaram significativamente na amostra de mel B. Acetato de etila; 1-butanol, 3-metil; 2-etil hexanol; óxidos de cis e trans linalol; hotrienol; ácido benzóico etil éster; ácido benzeno acético etil ester e β-fenetil acetato. A maioria dos compostos aumentou a área ao longo do armazenamento, contudo, o 1-butanol, 3-metil e o 2-etil hexanol diminuíram no mesmo período. Wootton, Edwards e Faraji-Haremi, (1978) ao armazenar méis durante um ano, à temperatura ambiente, também observaram a presença do 1-butanol, 3-metil, e sugerem que estes compostos possam ter origem a partir de aminoácidos correspondentes como a norleucina, isoleucina, leucina, ácido RZ-aminobutírico.
A Figura 13 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra C de mel de Apis mellifera L., ao longo do armazenamento por 540 dias.
174
Figu
ra 1
3. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis m
ajor
itário
s, id
entif
icad
os n
a am
ostra
C d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L., d
o es
tado
de
San
ta C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
175
176
177
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
178
Na Figura 13 encontram-se os 13 compostos voláteis que
variaram significativamente na amostra de mel C. Os compostos são os ácidos 3-metil butanóico, 2-metil butanóico e benzeno acético etil ester, o álcool 2-etil hexanol, as cetonas: acetofenona, isoforona e 2,6,6-trimetil-2-ciclohexene-1,4-diona, os terpenos: óxidos de cis e trans linalol, hotrienol e os compostos benzênicos benzaldeído, benzeno acetaldeído e 2,4,6-trimetilfenol.
A maioria dos compostos voláteis diminuíram as áreas ao longo do período de armazenamento, contudo os terpenos óxidos de cis e trans linalol, hotrienol, o ácido benzeno acético etil ester e o composto benzênico 2,4,6-trimetilfenol aumentaram as áreas. Os ácidos 2-metil butanóico e o 3-metil butanóico diminuíram as áreas ao longo do tempo de armazenamento, provavelmente por serem de cadeias curtas, facilitando a volatilização. Moreira et al. (2010), também avaliaram méis durante 6 meses, e observaram que ácidos de baixa massa molar desapareceram durante o armazenamento.
A acetofenona foi encontrada apenas na amostra de mel C. Segundo Alissandrakis et al. (2011), a acetofenona é um produto da redução do 1-feniletanol, ambos derivados da rota do ácido chiquímico.
A Isoforona é derivada da degradação de carotenóides, pertencente a classe dos " norisoprenoids". Normalmente é encontrada em frutas, vinho e mel (KUS et al., 2013).
A Figura 14 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra D de mel de Apis mellifera L. ao longo do armazenamento por 540 dias.
179
Figu
ra 1
4. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis m
ajor
itário
s, id
entif
icad
os n
a am
ostra
D d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
San
ta C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
180
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
181
Na Figura 14, verifica-se que 5 compostos voláteis variaram significativamente na amostra D. Dentre eles estão o 2-etil hexanol, benzeno acetaldeído, óxidos de cis e trans linalol e hotrienol. O 2-etil hexanol e o benzeno acetaldeído diminuíram as áreas, contudo, os terpenos óxidos de cis e trans linalol e o hotrienol apresentaram comportamento antagônico.
A Figura 15 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra E de mel de Apis mellifera L., ao longo do armazenamento por 540 dias.
182
Figu
ra 1
5. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis
maj
oritá
rios,
iden
tific
ados
na
amos
tra E
de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do
de S
anta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
dia
s
183
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
exp
ress
os c
omo
méd
ia ±
des
vio
padr
ão (
n =
3 pa
ra c
ada
amos
tra).
a-e L
etra
s di
fere
ntes
dife
rem
sig
nific
ativ
amen
te d
e ac
ordo
com
test
e de
Tuk
ey (p
< 0
,05)
. Fon
te: p
rópr
io a
utor
184
Na Figura 15, observa-se que o mel E apresenta 6 compostos
voláteis que variaram significativamente ao longo do tempo de armazenamento. Todos os compostos voláteis aumentaram as áreas ao longo do período de armazenamento.
A Figura 16 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra F de mel de Apis mellifera L., ao longo do armazenamento por 540 dias.
185
Figu
ra 1
6. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis
maj
oritá
rios,
iden
tific
ados
na
amos
tra F
de
mel
de
Apis
mel
lifer
a L.
do
esta
do
de S
anta
Cat
arin
a, a
o lo
ngo
do a
rmaz
enam
ento
por
540
dia
s
186
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
exp
ress
os c
omo
méd
ia ±
des
vio
padr
ão (
n =
3 pa
ra c
ada
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es n
as c
olun
as d
ifere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5).
Font
e: p
rópr
io a
utor
187
Observa-se através da Figura 16, que o mel F apresentou 5 compostos voláteis que variaram significativamente ao longo dos 540 dias de armazenamento. Os compostos benzênicos benzaldeído e benzeno acetaldeído apresentaram comportamento semelhante ao longo do tempo de armazenamento, aumentaram e depois diminuíram as áreas, não havendo diferença significativa entre o T0 e o T6 para ambos os compostos. Contudo, os terpenos, óxidos de cis e trans linalol, e o hotrienol aumentaram as áreas no mesmo período analisado.
A Figura 17 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra G de mel de Apis mellifera L., ao longo do armazenamento por 540 dias.
188
Figu
ra 1
7. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis m
ajor
itário
s, id
entif
icad
os n
a am
ostra
G d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
San
ta C
atar
ina,
ao
long
o da
arm
azen
agem
por
540
dia
s
189
190
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
540
dias
de
arm
azen
amen
to.
Val
ores
ex
pres
sos
com
o m
édia
±
desv
io
padr
ão
(n
= 3
para
ca
da
amos
tra).
a-e Le
tras
dife
rent
es
nas
linha
s di
fere
m
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de T
ukey
(p <
0,0
5). F
onte
: pró
prio
aut
or.
191
A Figura 17, ilustra os 11 compostos voláteis, do mel G, que variaram significativamente ao longo dos 540 dias de armazenamento. Dentre os compostos, estão os compostos benzênicos, benzaldeído e benzeno acetaldeído, os terpenos óxidos de cis e trans linalol, linalol, hotrienol, aldeídos lilac's (isômeros I, II e III) e 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil e o fenil acetato de etila. Os compostos benzênicos benzaldeído e benzeno acetaldeído diminuíram as áreas ao longo do tempo de armazenamento. Entretanto, os demais terpenos, com exceção do epoxilinalol, aumentaram as áreas durante o armazenamento.
Castro-Vazquez et al. (2008) armazenaram a 10, 20 e 40 ºC, durante o 12 meses, mel de heater e observaram que os aldeído lilac's isômeros diminuíram as áreas no período em quaisquer das temperaturas de estocagem. No entanto, o linalol manteve suas concentrações a 20 ºC, fato observado no presente estudo.
De acordo com Alissandrakis et al. (2003), os aldeídos lilac's são produzidos a partir do acetato de linalila.
A Figura 18 ilustra o comportamento dos compostos voláteis majoritários, identificados na amostra H de mel de Apis mellifera L., ao longo do armazenamento por 540 dias.
192
Figu
ra 1
8. C
ompo
rtam
ento
dos
com
post
os v
olát
eis m
ajor
itário
s, id
entif
icad
os n
a am
ostra
H d
e m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L. d
o es
tado
de
San
ta C
atar
ina,
ao
long
o do
arm
azen
amen
to p
or 5
40 d
ias
193
T0
= In
ício
das
aná
lises
; T1
= 90
dia
s de
arm
azen
amen
to; T
2 =
180
dias
de
arm
azen
amen
to; T
3 =
270
dias
de
arm
azen
amen
to; T
4 =
360
dias
de
arm
azen
amen
to; T
5 =
450
dias
de
arm
azen
amen
to; T
6 =
560
dias
de
arm
azen
amen
to. V
alor
es e
xpre
ssos
com
o m
édia
± d
esvi
o pa
drão
(n =
3 p
ara
cada
am
ostra
). a-
e Letra
s dife
rent
es n
as li
nhas
dife
rem
sign
ifica
tivam
ente
de
acor
do c
om te
ste
de
Tuke
y (p
< 0
,05)
. Fon
te: p
rópr
io a
utor
194
Na Figura 18, pode-se obsevar que, a amostra H, apresenta 8
compostos voláteis que variaram significativamente ao longo dos 540 dias de armazenamento. Avaliou-se a presença dos compostos benzaldeído, 2-etil hexanol, benzeno acetaldeído, óxidos de cis e trans linalol, hotrienol, fenil acetato de etila e ácido salicílico, terc butil ester. A maioria dos compostos analisados diminuiu a área durante o período avaliado.
Castro-Vazquez et al. (2012) avaliaram mel de heather e verificaram que os compostos derivados de terpenos diminuíram suas concentrações após um ano de armazenamento. Alguns destes compostos também foram encontrados no presente estudo, como o aldeído lilac e o hotrienol, mas ambos aumentaram suas abundâncias ao longo dos 540 dias de armazenamento.
Alguns grupos de compostos voláteis, foram encontrados em mais de uma das amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina analisadas. Abaixo destacam-se eles:
Aldeídos aromáticos
Os aldeídos aromáticos, benzaldeído e o benzeno acetaldeído, foram encontrados, na maioria das amostras. Acredita-se que o benzaldeído possa ter vindo do catabolismo microbiano de um aminoácido, segundo Dong et al. (2013). Contudo, com relação ao benzeno acetaldeído, os mesmos autores consideram que ele é formado a partir da enzimólise da fenilanalina. E, ainda, Jerkovic e Kus (2014) acreditam que ele seja produzido na degradação de Strecker. Ambos os aldeídos aromáticos diminuíram suas abundâncias ao longo dos 540 dias de armazenamento (Figuras 11, 13, 14, 16, 17 e 18). E eles também estão relacionados ao odor característico de mel fresco (CASTRO-VÁZQUEZ et al., 2012), e este fato pode explicar a diminuição destes compostos ao longo do armazenamento avaliado.
Castro-Vázquez et al. (2012) avaliaram os compostos voláteis de mel de "heather" armazenados a 10, 20 e 40 ºC, e verificaram que houve uma redução significativa na concentração dos compostos benzênicos, benzaldeído e benzeno acetaldeído, após um ano de armazenamento. No mel armazenado a temperatura ambiente, houve uma redução de 80,6 - 94,4 % destes compostos, quando comparado com o mel fresco. Ácidos orgânicos
195
Com relação aos ácidos orgânicos, Castro-Vázquez et al. (2012), também observaram aumento nas abundâncias, como no presente estudo, para os compostos voláteis benzoato de etila; fenil acetato de etila; ácido salicílico, tert-butil ester. O autor relata que estes compostos podem estar relacionados a pureza microbiológica, podendo, assim afetar a qualidade do mel, proporcionando perda do frescor.
Terpenos
Pode-se observar, através das Figuras 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18 que há 3 compostos voláteis em comum em todas as amostras de méis. São os terpenos óxidos de cis e trans linalol e o hotrienol. Estes compostos podem ser indicados como marcadores de degradação, visto que, aparecem em todos os méis analisados.
Os óxidos de cis e trans linalol, presentes em todas as amostras de mel analisadas no estudo, podem ser gerados a partir do 6,7-epoxilinalol (KUS et al., 2013), uma vez que o mel é um alimento ácido, favorecendo, assim, a formação destes óxidos, e consequente, progressão das abundâncias ao longo dos 540 dias de armazenamento. Estes dois compostos foram os que apresentaram maior abundância quando comparado aos demais compostos voláteis presentes nas amostras de mel do estado Catarinense.
O hotrienol (3,7-dimetil-1,5,7-octatrien-3-ol), também presente em todas as amostras de mel analisadas, pode ser gerado a partir de três precursores, o 2,6-dimetil-3,7-octadien-2,6-diol e/ou o terpendiol I e/ou 8-hidroxilinalool. Com relação ao 2,6-dimetil-3,7- octadien-2,6-diol, Barra, Ponce-Díaz e Venegas-Gallegos (2010) e Cuevas-Glory et al. (2007), afirmam que ele é parcialmente desidratado dentro da colmeia ou durante o processo de formação do hotrienol, comprovando sua identificação nos méis frescos. Quanto aos compostos terpendiol I e 8-hidroxilinalool, Kus et al. (2013) descrevem a formação do hotrienol a partir destes 2 compostos. Como o mel é um alimento ácido e não foi aquecido durante o período de armazenamento, provavelmente, o hotrienol identificado nas amostras de mel analisadas seja oriundo do terpendiol I.
Os terpenos e seus derivados promovem ao mel um sabor fresco, segundo Castro-Vázquez et al. (2008) e, também, estão relacionados à méis cítricos. Neste mesmo estudo, os autores avaliaram uma amostra de mel "citrus" armazenada a 10, 20 e 40 ºC, durante 12 meses e verificaram que os terpenos e componentes derivados foram os compostos que sofreram maior variabilidade. Foram encontrados 31 terpenos e derivados na amostra de mel fresca, mas apenas 11 foram
196
encontrados após um ano de armazenamento, os demais aumentaram ou diminuíram suas concentrações. No caso do mel armazenado 40 ºC (temperatura na qual os méis são aquecidos para que fiquem liquefeitos), os terpenos e derivados de terpenos aumentaram suas concentrações. No presente estudo, estes compostos aumentaram suas concentrações ao longo do tempo, mesmo não sendo armazenados a 40 ºC ou a altas temperaturas.
As Figuras 19, 20 e 21 ilustram os comportamentos dos marcadores de degradação, óxidos de cis e trans-linalol e do hotrienol, durante os 540 dias de armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina. Pode-se avaliar, que estes marcadores de degradação apresentaram comportamentos semelhantes ao longo do período, com aumento nas abundâncias. Fato que pode ser confirmado avaliando os dados da Tabela 38, onde são apresentados os valores de correlação dos marcadores de degradação em relação ao armazenamento.
Figura 19. Comportamento do óxido de cis-linalol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
0
2000000
4000000
6000000
8000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
Óxido de cis-linalol
Tempo de armazenamento
A
B
C
D
E
F
G
H
197
Figura 20. Comportamento do óxido de trans-linalol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina
Figura 21. Comportamento do hotrienol, durante o armazenamento, das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes amostras do estado de Santa Catarina
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
0
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
5000000
6000000
7000000
8000000
Óxido de trans-linalol
Tempo de armazenamento
A
B
C
D
E
F
G
H
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
Hotrienol
Tempo de armazenamento
A
B
C
D
E
F
G
H
198
Tabe
la 3
8. C
orre
laçã
o en
tre o
s com
post
os v
olát
eis d
o m
el d
e Ap
is m
ellif
era
L.
Com
post
o A
mos
tra
Equ
ação
R
2 V
alor
de
p
Óxi
do d
e
cis-
linal
ol
A
Y =
6,8
161.
105 x
+ 1,
1527
.106
0,90
89
0,00
09
B
Y =
4,3
703.
105 x
+ 2,
9776
.106
0,90
02
0,00
11
C
Y =
1,5
596.
105 x
+ 8,
8380
.105
0,30
41
0,19
94
D
Y =
4,0
578.
105 x
+ 1,
4435
.106
0,69
15
0,02
04
E Y
= 7
,161
7.10
4 x +
7,36
12.1
05 0,
4855
0,
0819
F
Y =
2,5
385.
105 x
+ 1,
7097
.106
0,63
44
0,03
21
G
Y =
2,3
614.
106 x
+ 1,
5656
.107
0,71
99
0,01
58
H
Y =
-1,3
914.
105 x
+ 3,
8880
.106
0,43
11
0,10
91
Óxi
do d
e tr
ans-
linal
ol
A
Y =
1,7
193.
105 x
+ 2,
1964
.105
0,83
43
0,00
40
B
Y =
1,4
153.
105 x
+ 6,
1788
.105
0,86
20
0,00
25
C
Y =
4,4
786.
104 x
+ 5,
5134
.104
0,83
61
0,00
39
D
Y =
1,0
817.
105 x
+ 1,
4163
.105
0,69
57
0,01
96
E Y
= 3
,063
7.10
4 x +
1,52
78.1
05 0,
6011
0,
0405
F
Y =
5,5
181.
104 x
+ 1,
7626
.105
0,69
37
0,83
29
G
Y =
-1,0
855.
105 x
+ 7,
0380
.106
0,07
10
0,56
35
H
Y =
-5,0
767.
104 x
+ 8,
8023
.105
0,94
30
0,00
03
Hot
rien
ol
A
Y =
7,3
288.
104 x
+ 3,
1208
.105
0,49
38
0,07
82
B
Y
= 1
,819
5.10
4 x +
2,81
87.1
05 0,
3625
0,
1526
C
Y =
1,6
124.
104 x
+ 1,
1399
.105
0,21
39
0,29
61
D
Y
= 2
,793
9.10
5 x +
4,68
76.1
04 0,
9690
0,
0000
6
E Y
= 1
,509
7.10
4 x +
2,96
41.1
04 0,
8638
0,
0024
F Y
= 2
,177
9.10
5 x +
6,90
12.1
05 0,
5285
0,
0642
G
Y =
4,3
394.
106 x
+ 2,
0068
.106
0,87
41
0,00
20
H
Y
= 5
,655
3.10
4 x +
1,87
73.1
05 0,
7794
0,
0085
Fo
nte:
pró
prio
aut
or.
199
A análise de regressão mostrou que os 3 marcadores de degradação avaliados durante 540 dias de armazenamento apresentaram correlação positiva e significativa (p<0,05) na maioria das amostras de coleta do mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina (Tabela 38).
O composto volátil óxido de cis-linalol apresentou correlação positiva e significativa (p<0,05) nas amostras A, B, D, F e G. Destacando as amostras A e B, onde o composto apresenta correlação muito forte, com valores de R2 acima de 0,9 (Tabela 38). O mesmo ocorreu para o composto volátil óxido de trans-linalol, o qual apresentou correlação positiva e significativa (p<0,05) para a maioria das amostras, com correlação muito forte apenas para a amostra H, contudo as amostras A, B e C, apresentaram correlação forte (R2>0,7) (Tabela 38). Para o hotrienol, a análise de regressão mostrou que este composto apresentou correlação positiva e significativa (p<0,05) durante o armazenamento, com correlação muito forte para a amostra D e forte para as amostras E, G e H (Tabela 38).
Avaliação da toxicidade
O Material Safety Data Sheet relata que a DL50 oral do composto óxido de linalol é de 1,150 mg Kg-1 em ratos. No presente estudo, calculou-se a provável concentração de óxido de linalol presente nas amostras de mel e observou-se que a concentração calculada (0,18 mg Kg-1) é relativamente menor que a proposta pela referência.
3.2 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS
Os conjuntos de dados foram submetidos à análise de componentes principais (PCA) a fim de verificar tendências de agrupamentos dos compostos voláteis; padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis; e compostos fenólicos e voláteis.
200
3.2.1 Compostos voláteis
A Figura 22 ilustra a PCA para os compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina. Figura 22. Análise dos componentes principais para os compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L.
AT0BT0
CT0
DT0ET0FT0
GT0
HT0
AT1BT1
CT1
DT1ET1FT1
GT1
HT1AT2BT2
CT2
DT2ET2FT2
GT2
HT2AT3BT3
CT3
DT3ET3FT3
GT3
HT3AT4
BT4
CT4
DT4ET4
FT4
GT4
HT4AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5AT6
BT6
CT6
DT6ET6
FT6
GT6
HT6
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6
PC 1: 35,41%
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
PC 2
: 23,
46%
AT0BT0
CT0
DT0ET0FT0
GT0
HT0
AT1BT1
CT1
DT1ET1FT1
GT1
HT1AT2BT2
CT2
DT2ET2FT2
GT2
HT2AT3BT3
CT3
DT3ET3FT3
GT3
HT3AT4
BT4
CT4
DT4ET4
FT4
GT4
HT4AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5AT6
BT6
CT6
DT6ET6
FT6
GT6
HT6
AT0BT0
CT0
DT0ET0FT0
GT0
HT0AT1BT1
CT1
DT1ET1FT1
GT1
HT1AT2BT2CT2
DT2ET2FT2
GT2
HT2AT3BT3CT3
DT3ET3FT3
GT3
HT3AT4
BT4
CT4
DT4ET4FT4
GT4HT4
AT5
BT5
CT5
DT5ET5FT5
GT5
HT5
AT6
BT6
CT6
DT6ET6
FT6
GT6
HT6
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6
PC 1: 35,41%
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
PC 3
: 14,
42%
AT0BT0
CT0
DT0ET0FT0
GT0
HT0AT1BT1
CT1
DT1ET1FT1
GT1
HT1AT2BT2CT2
DT2ET2FT2
GT2
HT2AT3BT3CT3
DT3ET3FT3
GT3
HT3AT4
BT4
CT4
DT4ET4FT4
GT4HT4
AT5
BT5
CT5
DT5ET5FT5
GT5
HT5
AT6
BT6
CT6
DT6ET6
FT6
GT6
HT6
Fonte: próprio autor.
201
A PCA dos compostos voláteis mostrou que 73,28 % das informações podem ser representadas por três componentes principais. Observando-se a distribuição das amostras, no espaço das PC's (Figura 22), nota-se que PC1 (com 35,41 % da variância), PC2 (com 23,46 % da variância) e PC3 (com 14,42 % da variância) separam as amostras de mel C e G, do estado de Santa Catarina das demais, independente do tempo de armazenamento. A amostra G se agrupou no quadrante negativo da PC1 e as demais no quadrante positivo, enquanto que na PC2 as amostras G e C agruparam-se no quadrante positivo e as demais no quadrante negativo (Figura 22).
A Tabela 39 apresenta os pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina.
Tabela 39. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos compostos voláteis das amostras de mel de Apis mellifera L.
Variável PC1 PC2 PC3 Acetato de etila 0,15 -0,30 0,91
1-butanol, 3-metil 0,10 -0,22 0,69 Ácido 3-metil-butanoico 0,15 0,66 0,16 Ácido 2-metil-butanoico 0,16 0,69 0,18
Benzaldeído 0,02 0,92 0,12 2-etil hexanol 0,15 -0,03 0,45
Benzeno acetaldeído -0,55 0,57 -0,22 Acetofenona 0,21 0,85 0,09
Óxido de cis-linalol -0,97 0,02 0,14 Óxido de trans-linalol -0,96 0,03 0,14
Linalol (3,7-dimetil-octa-1,6-dien-3-ol) -0,96 0,08 0,06 Hotrienol -0,93 0,05 0,05 Isoforona 0,22 0,80 0,05
Aldeído "lilac" isômero I -0,98 0,09 0,05 Aldeído "lilac" isômero II -0,98 0,09 0,06 Aldeído "lilac" isômero III -0,98 0,10 0,05
2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona 0,24 0,89 0,10 Benzoato de etila 0,99 -0,22 0,86
2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil -0,93 0,11 0,04 Fenil acetato de etila 0,10 -0,12 0,91
Etanoato de etil fenila 0,06 -0,10 -0,09 2,4,6-trimetilfenol 0,24 0,90 0,14
Ácido salicílico, terc butil ester 0,11 -0,14 -0,06 Fonte: próprio autor.
202
As variáveis dominantes para PC1 foram o benzeno
acetaldeído; óxido de cis-linalol; óxido de trans-linalol; linalol; hotrienol; aldeído lilac isômero I; aldeído lilac isômero II; aldeído lilac isômero III; benzoato de etila; 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil, as quais apresentaram valores de r<0,5 ou >0,5 (Tabela 39). Esses dados confirmam que a amostra de mel da amostra G, possui maior área dos compostos voláteis benzeno acetaldeído; óxido de cis-linalol; óxido de trans-linalol; linalol; hotrienol; aldeído lilac isômero I; aldeído lilac isômero II; aldeído lilac isômero III; 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil por apresentarem valores de r>0,5 e menor área do composto volátil benzoato de etila que apresentou valor de r<0,5, confirmando a separação desta amostra das demais.
As variáveis dominantes para PC2 foram ácido 3-metil-butanoico; ácido 2-metil-butanoico; benzaldeído; benzeno acetaldeído; acetofenona; isoforona; 2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona; 2,4,6-trimetilfenol (Tabela 39), que mostram que os méis C e G, apresentam maior área destes compostos voláteis, pois apresentaram valores de r>0,5. 3.2.2 Padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis
A Figura 23 ilustra a análise dos componentes principais para os padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina.
203
Figura 23. Análise dos componentes principais para os padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L.
AT0BT0CT0
DT0
ET0
FT0
GT0 HT0AT1
BT1CT1
DT1
ET1FT1
GT1 HT1
AT2
BT2CT2
DT2
ET2
FT2
GT2HT2
AT3
BT3
CT3
DT3
ET3
FT3
GT3
HT3
AT4
BT4
CT4
DT4ET4FT4
GT4HT4
AT5
BT5
CT5
DT5
ET5
FT5
GT5HT5
AT6
BT6
CT6
DT6
ET6
FT6
GT6HT6
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
PC 1: 31,15%
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
PC 3
: 14,
77%
AT0BT0CT0
DT0
ET0
FT0
GT0 HT0AT1
BT1CT1
DT1
ET1FT1
GT1 HT1
AT2
BT2CT2
DT2
ET2
FT2
GT2HT2
AT3
BT3
CT3
DT3
ET3
FT3
GT3
HT3
AT4
BT4
CT4
DT4ET4FT4
GT4HT4
AT5
BT5
CT5
DT5
ET5
FT5
GT5HT5
AT6
BT6
CT6
DT6
ET6
FT6
GT6HT6
204
AT0BT0
CT0
DT0ET0
FT0
GT0
HT0
AT1BT1CT1
DT1
ET1FT1
GT1
HT1
AT2BT2
CT2 DT2
ET2
FT2
GT2
HT2
AT3
BT3
CT3
DT3
ET3
FT3
GT3
HT3
AT4BT4
CT4
DT4
ET4
FT4GT4
HT4
AT5BT5
CT5
DT5
ET5
FT5GT5
HT5
AT6BT6
CT6
DT6
ET6
FT6GT6
HT6
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
PC 1: 31,15%
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8PC
4:
6,59
% AT0BT0
CT0
DT0ET0
FT0
GT0
HT0
AT1BT1CT1
DT1
ET1FT1
GT1
HT1
AT2BT2
CT2 DT2
ET2
FT2
GT2
HT2
AT3
BT3
CT3
DT3
ET3
FT3
GT3
HT3
AT4BT4
CT4
DT4
ET4
FT4GT4
HT4
AT5BT5
CT5
DT5
ET5
FT5GT5
HT5
AT6BT6
CT6
DT6
ET6
FT6GT6
HT6
Fonte: próprio autor.
A PCA dos padrões de identidade e qualidade e dos compostos
voláteis mostrou que 73,05 % das informações podem ser representadas por quatro componentes principais. Analisando a distribuição das amostras, no espaço das PCs (Figura 23), observa-se que PC1 (com 31,15 % da variância), PC2 (com 20,55 % da variância), PC3 (com 14,77 % da variância) e PC4 (com 6,59 % da variância) também separam as amostras de mel de Apis mellifera L. de acordo com as regiões de coleta. Em todos os gráficos, as amostras de mel C e G, em todos os tempos de armazenamento, bem como a amostra de mel H, em praticamente todos os tempos de armazenamento, foram agrupadas no quadrante negativo da PC1. Considerando que as variáveis L*; a*; b*; condutividade elétrica; atividade diastásica; fenólicos totais; DPPH; FRAP; benzeno acetaldeído; óxido de cis-linalol; óxido de trans-linalol; linalol; hotrienol; aldeído lilac isômero I; aldeído lilac isômero II; aldeído lilac isômero III; 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil,
205
foram as variáveis de maior peso (Tabela 40), as amostras C, G bem como a amostra de mel H, apresentaram maiores valores para estas variáveis, com exceção de L* e b*, as quais foram superiores nas demais amostras estudadas, por apresentarem r>0,5.
Avaliando a PC2, é possível separar as amostras C e H das demais, visto que as primeiras estão agrupadas no quadrante negativo da PC2, enquanto as demais no quadrante positivo desta PC. Considerando estes agrupamentos e os pesos das variáveis descritos na Tabela 40, as amostras C e H apresentam maiores valores de pH, DPPH, ácido 3-metil-butanoico, ácido 2-metil-butanoico, benzaldeído, acetofenona, isoforona, 2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona, 2,4,6-trimetilfenol e menor área de óxido de cis-linalol. Tabela 40. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L.
Variável PC1 PC2 PC3 PC4 Umidade 0,33 0,28 0,78 -0,05 Acidez -0,31 0,07 0,72 0,16
pH -0,44 -0,55 -0,38 -0,14 L* 0,76 0,30 -0,23 0,39 a* -0,61 -0,28 0,42 -0,50 b* 0,51 0,05 -0,11 0,38
Condutividade elétrica -0,73 -0,48 -0,03 -0,04 Frutose 0,01 -0,16 -0,31 -0,16 Glicose -0,02 -0,27 0,72 0,04
Atividade diastásica -0,59 0,27 -0,25 0,38 Fenólicos totais -0,89 0,11 0,10 -0,24
DPPH -0,69 -0,58 0,12 -0,18 FRAP -0,70 -0,39 0,11 -0,46
Acetato de etila 0,23 0,17 0,88 0,10 1-butanol, 3-metil 0,17 0,13 0,68 0,15
Ácido 3-metil-butanoico -0,18 -0,59 0,19 0,03 Ácido 2-metil-butanoico -0,19 -0,62 0,22 0,01
Benzaldeído -0,42 -0,75 0,05 0,33 2-etil hexanol 0,11 -0,04 0,49 0,02
Benzeno acetaldeído -0,73 -0,18 -0,12 0,23 Acetofenona -0,21 -0,79 0,02 0,36
Óxido de cis-linalol -0,83 0,51 0,09 0,12 Óxido de trans-linalol -0,80 0,50 0,08 0,19
Linalol (3,7-dimetil-octa-1,6-dien-3-ol)
-0,85 0,43 0,01 0,07
Hotrienol -0,82 0,44 0,02 0,02
206
Isoforona -0,20 -0,78 -0,01 0,32
Aldeído "lilac" isômero I -0,87 0,44 0,00 0,10 Aldeído "lilac" isômero II -0,87 0,44 0,00 0,09 Aldeído "lilac" isômero III -0,87 0,44 -0,00 0,11
2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona
-0,23 -0,85 0,03 0,33
Benzoato de etila 0,15 0,13 0,77 0,11 2H-piran-3-ol, 6-
eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil
-0,81 0,42 -0,04 0,19
Fenil acetato de etila 0,08 0,03 0,88 0,02 Etanoato de etil fenila 0,14 0,10 0,01 0,15
2,4,6-trimetilfenol -0,25 -0,87 0,13 0,17 Ácido salicílico, terc butil
ester 0,01 -0,07 0,07 -0,71
Fonte: próprio autor.
3.2.3 Compostos fenólicos e compostos voláteis As variáveis dominantes para PC1, PC2 e PC3 para os
compostos fenólicos e voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina durante armazenamento representaram 73,35 % da variabilidade total dos dados, sendo que a PC1 explica 37,12 % dos dados, enquanto que PC2 25,41 % e PC3 10,83 % (Figura 24).
207
Figura 24. Análise dos componentes principais para os compostos fenólicos e voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L. durante armazenamento
AT0BT0 CT0DT0ET0FT0
GT0
HT0AT3BT3 CT3DT3ET3
FT3
GT3
HT3AT5BT5
CT5DT5ET5
FT5
GT5
HT5
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
PC 1: 37,12%
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
PC 2
: 25,
41%
AT0BT0 CT0DT0ET0FT0
GT0
HT0AT3BT3 CT3DT3ET3
FT3
GT3
HT3AT5BT5
CT5DT5ET5
FT5
GT5
HT5
AT0
BT0
CT0DT0ET0
FT0
GT0
HT0AT3
BT3
CT3DT3ET3
FT3
GT3
HT3
AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
PC 1: 37,12%
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
PC 3
: 10,
83%
AT0
BT0
CT0DT0ET0
FT0
GT0
HT0AT3
BT3
CT3DT3ET3
FT3
GT3
HT3
AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5
208
AT0
BT0
CT0DT0ET0FT0
GT0
HT0AT3
BT3
CT3DT3ET3FT3
GT3
HT3
AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14
PC 2: 25,41%
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
PC 3
: 10,
83%
AT0
BT0
CT0DT0ET0FT0
GT0
HT0AT3
BT3
CT3DT3ET3FT3
GT3
HT3
AT5
BT5
CT5
DT5ET5
FT5
GT5
HT5
Fonte: próprio autor.
A Figura 24 ilustra que as amostras de mel de Apis mellifera L.
C e G se agruparam no quadrante positivo da PC1 e as demais amostras no quadrante negativo. Na PC2, a amostra G se agrupou no quadrante positivo, enquanto que todas as demais no quadrante negativo.
Na Tabela 41, é possível observar que as variáveis dominantes para a PC1 foram ácido 4-aminobenzóico; ácido salicílico; ácido ρ-anísico; ácido mandélico; ácido vanílico; ácido metoxifenilacético; ácido caféico; crisina; pinocembrina; naringenina; quercetina; taxifolina; rutina; ácido 3-metil-butanoico; ácido 2-metil-butanoico; benzaldeído; acetofenona; isoforona; 2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona; 2,4,6-trimetilfenol. Para a PC2, as variáveis, ácido trans-ferúlico, hispidulina; benzeno acetaldeído; óxido de cis-linalol; óxido de trans-linalol; linalol; hotrienol; aldeído lilac isômero I; aldeído lilac isômero II; aldeído lilac isômero III; 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil; foram dominantes. Desta forma, as amostras C e G apresentaram maiores valores para os compostos citados acima por apresentarem valores de r>0,5, separando estas duas das demais, em função da maior concentração destes compostos nestas amostras de mel. A amostra G também se destacou pelos maiores valores de ácido trans-ferúlico; hispidulina; benzeno acetaldeído; óxido de cis-linalol; óxido de trans-
209
linalol; linalol; hotrienol; aldeído lilac isômero I; aldeído lilac isômero II; aldeído lilac isômero III; 2H-piran-3-ol, 6-eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil.
Tabela 41. Pesos das variáveis para cada componente principal (PC) dos compostos fenólicos e voláteis em amostras de mel de Apis mellifera L.
Variável PC1 PC2 PC3 Ácido 4-aminobenzóico 0,98 -0,15 0,02
Ácido salicílico 0,97 0,15 0,01 Ácido ρ-anísico 0,97 -0,15 0,02
Ácido mandélico 0,95 -0,15 0,04 Ácido vanílico 0,57 -0,36 -0,22 Protocatecuíco 0,11 -0,09 0,00
Ácido ρ-cumárico -0,43 -0,30 -0,29 Ácido metoxifenilacético 0,96 -0,15 0,01
Ácido caféico 0,88 0,44 0,04 Escopoletina -0,41 -0,36 -0,03
Ácido trans-ferúlico 0,02 0,95 0,03 Ácido siríngico 0,39 -0,26 -0,23
Crisina 0,92 0,33 0,03 Pinocembrina 0,82 0,48 0,00 Naringenina 0,98 -0,01 -0,01
Aromadendrina -0,19 -0,16 0,71 Hispidulina 0,10 0,98 0,01 Quercetina 0,87 -0,21 -0,10 Taxifolina 0,98 -0,15 0,02 Miricetina -0,15 -0,10 -0,16
Rutina 0,79 -0,23 0,36 Acetato de etila -0,16 -0,15 0,89
1-butanol, 3-metil -0,11 -0,11 0,92 Ácido 3-metil-butanoico 0,51 -0,09 0,16 Ácido 2-metil-butanoico 0,51 -0,09 0,16
Benzaldeído 0,85 0,09 -0,01 2-etil hexanol 0,07 -0,19 0,57
Benzeno acetaldeído 0,45 0,62 -0,11 Acetofenona 0,88 -0,13 -0,03
Óxido de cis-linalol -0,04 0,96 0,14 Óxido de trans-linalol -0,05 0,95 0,13
Linalol (3,7-dimetil-octa-1,6-dien-3-ol)
0,01 0,91 0,05
Hotrienol -0,01 0,91 0,04 Isoforona 0,92 -0,14 -0,03
Aldeído "lilac" isômero I 0,01 0,99 0,04 Aldeído "lilac" isômero II 0,01 0,98 0,04
210
Aldeído "lilac" isômero III 0,01 0,99 0,04
2,6,6-trimetil-2-ciclohexen-1,4-diona
0,96 -0,14 -0,00
Benzoato de etila -0,11 -0,11 0,92 2H-piran-3-ol, 6-
eteniltetrahidro-2,2,6-trimetil 0,01 0,96 0,03
Fenil acetato de etila 0,04 -0,10 0,95 Etanoato de etil fenila -0,10 -0,08 0,11
2,4,6-trimetilfenol 0,95 -0,15 0,05 Ácido salicílico, terc butil ester -0,12 -0,12 -0,05 Fonte: próprio autor.
211
4 CONCLUSÃO Foram identificados e avaliados, ao longo de 540 dias de
armazenamento doméstico, 23 compostos voláteis nas amostras de mel das 8 regiões do estado de Santa Catarina.
Pode-se concluir que, a maioria dos méis produzidos nas distintas regiões, com florada predominantemente silvestre, apresentaram o mesmo comportamento em relação aos compostos voláteis durante o período de armazenamento.
O armazenamento dos méis, na condição avaliada, formou álcoois, cetonas e ácidos por reações de oxidação e redução de compostos presentes, comprovando que os compostos voláteis encontrados são passíveis de degradação ao longo do armazenamento, dando origem a novos compostos.
As amostras, que apresentaram o maior número de compostos voláteis, foram as C e G. Apenas a amostra G apresentou os isômeros aldeídos lilac's, e a amostra de mel C apresentou os compostos acetofenona e isoforona.
Os terpenos, óxidos de cis e trans linalol e hotrienol, podem ser indicados como marcadores de degradação, para as amostras de mel de Apis mellifera L., se considerarmos o comportamento matemático representado pelas áreas durante o armazenamento.
A partir da análise de componentes principais, dos compostos voláteis, padrões de identidade e qualidade e compostos fenólicos individuais e compostos voláteis, foi possível classificar e diferenciar as amostras de mel de Apis mellifera L. do estado de Santa Catarina, de acordo com as regiões de coleta, separando as amostras C e G das demais, no entanto, não foi possível diferenciá-las de acordo com o tempo de armazenamento.
As amostras C e G, diferenciaram-se das demais, considerando que os compostos fenólicos individuais e os compostos voláteis foram as variáveis de maior peso, ou seja, essas amostras de mel apresentaram as maiores áreas para estes componentes químicos quando comparadas às demais amostras de mel.
Ao avaliar as PCA's dos compostos voláteis, padrões de identidade e qualidade e compostos voláteis, compostos fenólicos individuais e compostos voláteis, pode-se concluir que estes parâmetros, apesar de apresentarem variações ao longo do tempo, os mesmos evoluem de maneira similar, quando as amostras avaliadas são
212
comparadas, não permitindo a diferenciação das mesmas ao longo do armazenamento.
213
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A análise prévia das amostras de mel de Apis mellifera L. das diferentes regiões apícolas do estado de Santa Catarina, para posterior estudo de vida útil, mostrou que, verificar a autenticidade dos méis é de extrema importância, visto que algumas das amostras apresentaram parâmetros em desacordo com os permitidos pela legislação brasileira, Codex Alimentarius e União Europeia.
Ao avaliar a estabilidade química dos compostos não voláteis presentes nos méis de Apis mellifera L., observou-se variações nas concentrações de alguns compostos. Os monossacarídeos, frutose e glicose, pH, condutividade elétrica, atividade diastásica e cor tiveram suas concentrações reduzidas ao longo dos 540 dias de armazenamento, contudo, os parâmetros acidez e umidade apresentaram aumento. A amostra B apresentou teor de umidade acima do permitido pelas legislações brasileira e internacional, após os 540 dias de armazenamento. Em relação aos compostos fenólicos totais e atividade antioxidante, ocorreu elevação com o armazenamento.
Com relação aos compostos fenólicos, foi possível identificar e quantificar 22 compostos fenólicos aplicando cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem. Dos 22 compostos fenólicos detectados, 12 são ácidos fenólicos, 1 cumarina e 9 são flavonóides. O ácido ρ-cumárico foi o composto fenólico encontrado em maior concentração, na maioria das amostras de mel do estado Catarinense. A maioria dos compostos fenólicos manteve sua concentração ao longo da estocagem.
Avaliando o comportamento da atividade antioxidante, e os compostos fenólicos individuais presentes nas amostras, pode-se observar que, várias reações de oxidação e redução ocorrem, gerando novos compostos fenólicos, capazes de promover maior atividade antioxidante, conforme comprovado pelo comportamento das amostras de mel ao longo do tempo, com o aumento da capacidade antioxidante das mesmas ao longo da armazenagem.
Quanto aos compostos voláteis, dos compostos detectados via CG-MS, 23 foram considerados majoritários e monitorados ao longo dos 540 dias de armazenamento, e observou-se que os mesmos apresentaram variações nas abundâncias em sua maioria, porém com incrementos e decrementos similares para as distintas amostras. Os terpenos óxidos de cis e trans linalol e hotrienol, avaliando ao longo da armazenagem, apresentam comportamento matemático na evolução de suas concentrações que podem indicar possíveis marcadores de
degradação dos méis de Apis mellifera L durante o armazenamento prolongado.
A análise de componentes principais (PCA) classificou e diferenciou as amostras de mel quanto às regiões de coleta do estado Catarinense avaliando os compostos voláteis, padrões de identidade e qualidade, atividade antioxidante e compostos voláteis, e compostos fenólicos individuais e compostos voláteis, não sendo possível diferenciá-las quanto ao tempo de armazenamento, provando que, mesmo o mel tendo apresentando transformações químicas dos compostos ao longo do tempo, estes evoluíram de maneira similar, visto que mantém as características de degradação, não podendo ser diferenciados quanto ao tempo de armazenamento.
Como perspectivas de trabalho são necessários mais estudos com diferentes temperaturas de armazenamento, luminosidade e tipos de embalagem com o intuito de verificar como estes parâmetros influenciam no comportamento dos compostos químicos presentes nos méis, postulando assim, um possível modelo de vida útil, com embalagem e temperatura adequadas ao armazenamento de méis de Apis mellifera L..
216
REFERÊNCIAS
ACEVEDO, N.; SCHEBOR, C.; BUERA, M. P. Water–solids interactions, matrix structural properties and the rate of non-enzymatic browning. Journal of Food Engineering. v. 77, p. 1108–1115, 2006. ACHOUR, M. A new method to assess the quality degradation of food products during storage. Journal of Food Engineering. v. 75, p. 560-564, 2006. AHMED, M. et al. In vitro activity of natural honey alone and in combination with curcuma starch against Rhodotorula mucilaginosa in correlation with bioactive compounds and diastase activity. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. v. 3, p. 816-821, 2013. AJLOUNI, S.; SUJIRAPINYOKUL, P. Hydroxymethylfurfuraldehyde and amylase contents in Australian honey. Food Chemistry. v. 119, p. 1000–1005, 2010. AJTONY, Z. et al. Study on the simultaneous determination of some essential and toxic trace elements in honey by multi-element graphite furnace atomic absorption spectrometry. Talanta. v. 71, p. 683–690, 2007. AL, M. L. et al. Physico-chemical and bioactive properties of different floral origin honeys from Romania. Food Chemistry. v. 112, p. 863–867, 2009. ALDA-GARCILOPE, C. et al. Characterization of Spanish honeys with protected designation of origin „„Miel de Granada‟‟ according to their mineral content. Food Chemistry. v. 135, p. 1785–1788, 2012. ALDCORN, D. L.; WANDLER, E.; SPORNS, P. Diastase (α- and β-amylase) and a-glucosidase (sucrase) activity in western canadian honeys. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal. v. 18, p. 268-270, 1985. ALIFERIS, K. A. et al. Botanical discrimination and classification of honey samples applying gas chromatography/mass spectrometry
fingerprint of headspace volatile compounds. Food Chemistry. v. 121, p.856–862, 2010. ALISSANDRAKIS, E. et al. Aroma investigation of unifloral Greek citrus honey using solid-phase microextraction coupled to gas chromatographic–mass spectrometric analysis. Food Chemistry. v. 100, p. 396–404, 2007. ALISSANDRAKIS, E. et al. Evaluation of four isolation techniques for honey aroma compounds. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 85, p. 91-97, 2005. ALISSANDRAKIS, E. et al. Generation of linalool derivatives in an artificial honey produced from bees fed with linalool-enriched sugar syrup. European Food Research and Technology. v. 231, p. 21–25, 2010. ALISSANDRAKIS, E. et al. Investigation of organic extractives from unifloral chestnut (Castanea sativa L.) and eucalyptus (Eucalyptus globulus Labill.) honeys and flowers to identification of botanical marker compounds. Food Science and Technology. v. 44, p. 1042-1051, 2011. ALISSANDRAKIS, E. et al. Ultrasound-assisted extraction gas chromatography–mass spectrometry analysis of volatile compounds in unifloral thyme honey from Greece. European Food Research and Technology. v. 229, p. 365–373, 2009. ALISSANDRAKIS, E. et al. Ultrasound-assisted extraction of volatile compounds from citrus flowers and citrus honey. Food Chemistry. v. 82, p. 575–582, 2003. ALJADI, A. M.; M. Y. KAMARUDDIN. Evaluation of the phenolic contents and antioxidant capacities of two Malaysian floral honeys. Food Chemistry. v. 85, p. 513-518, 2004. ALQARNI, A. S. et al. Mineral content and physical properties of local and imported honeys in Saudi Arabia. Journal of Saudi Chemical Society. v. 18, p. 618–625, 2012.
218
ALVAREZ-SUAREZ, J. M. et al. Antioxidant and antimicrobial capacity of several monofloral Cuban honeys and their correlation with color, polyphenol content and other chemical compounds. Food and Chemical Toxicology. v. 48, p. 2490–2499, 2010. ALVAREZ-SUAREZ, J. M. et al. Phenolics from monofloral honeys protect human erythrocyte membranes against oxidative damage. Food and Chemical Toxicology. v. 50, p. 1508–1516, 2012. ALVES, A. et al. Antioxidant activity, quality parameters and mineral content of Portuguese monofloral honeys. Journal of Food Composition and Analysis. v. 30, p. 130–138, 2013. ALVES, R. M. O. et al. Características físico-químicas de amostras de mel de melipona mandacaia smith (hymenoptera: apidae). Ciência e Tecnologia de Alimentos. v. 25, p. 644-650, 2005. ANDERSEN, Ø. M., MARKHAM, K. R. Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications. In: Separation and Quantification of Flavonoids. New York: Taylor e Francis, 2006. p. 1-37. ANKLAM, E. A review of the analytical methods to determine the geographical and botanical origin of honey. Food Chemistry. v. 63, p. 549–562, 1998. AOAC. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, Washington. 2005. ARRÁEZ-ROMÁN, D. et al. Identification of phenolic compounds from pollen extracts using capillary electrophoresis–electrospray time-of-flight mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 389, p. 1909–1917, 2007. ARRÁEZ-ROMÁN, D. et al. Identification of phenolic compounds in rosemary honey using solid-phase extraction by capillary electrophoresis–electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 41, p. 1648–1656, 2006. ASIKIN, Y., KAMIYA, A., MIZU, M., TAKARA, K., TAMAKI, H., WADA, K. Changes in the physicochemical characteristics, including
219
flavor components and Maillard reaction products, of non-centrifugal cane brown sugar during storage. Food Chemistry. v. 149, p. 170–177, 2014. ASTILL, B. D.; TERHAAR, C. J.; FASSETT, D. W. The toxicology and fate of 2,2,4-trimethyl-1,3- pentanediol diisobutyratel. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 22, p. 387-399, 1972. AZEREDO, L. C. et al. Protein contents and physicochemical properties in honey samples of Apis mellifera of different floral origins. Food Chemistry. v. 80, p. 249–254, 2003. BALASUNDRAM, N.; SUNDRAM, K.; SAMMAN, S. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. Food Chemistry. v. 99, p. 191-203, 2006. BALTRUSAITYTE, V.; VENSKUTONIS, P. R.; CEKSTERYTE, C. Radical scavenging activity of different floral origin honey and beebread phenolic extracts. Food Chemistry. v. 101, p. 502–514, 2007. BARONI, M. V. et al. Determination of volatile organic compound patterns characteristic of five unifloral honey by solid-phase microextraction–gas chromatography–mass spectrometry coupled to chemometrics. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 54, p. 7235–7241, 2006. BARRA; M. P. G.; PONCE-DÍAZ, M. C.; VENEGAS-GALLEGOS, C. Volatile compounds in honey produced in the central valley of Ñuble Province, Chile. Chilean Journal of Agricultural Research. v. 70, p. 75-84, 2010. BATH, P. K. ; SINGH, N. A research note chemical changes in Helianthus annus and Eucalyptus lanceolatus honey during storage. Journal of Food Quality. v. 23, p. 443–451, 2000. BELAY, A. et al. Physicochemical properties of the Harenna forest honey, Bale, Ethiopia. Food Chemistry. v. 141, p. 3386–3392, 2013. BENTABOL MANZANARES, A. et al. Differentiation of blossom and honeydew honeys using multivariate analysis on the physicochemical
220
parameters and sugar composition. Food Chemistry. v. 126, p. 664–672, 2011. BENTABOL MANZANARES, A. et al. Physicochemical characteristics of minor monofloral honeys from Tenerife, Spain. Food Science and Technology. v. 55, p. 572-578, 2014. BENTIVENGA, G. et al. SPME–GC–MS analysis of volatile organic compounds in honey from Basilicata. Evidence for the presence of pollutants from anthropogenic activities. International Journal of Food Science and Technology. v. 39, p. 1079–1086, 2004. BENZIE, I. F. F.; STRAIN, J. J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “Antioxidant Power”: The FRAP assay. Analytical Biochemistry. v. 239, p. 70-76, 1996. BERTONCELJ, J. et al. Evaluation of the phenolic content, antioxidant activity and colour of Slovenian honey. Food Chemistry. v. 105, p. 822-828, 2007. BERTONCELJ, J. et al. LC-DAD-ESI/MS analysis of flavonoids and abscisic acid with chemometric approach for the classification of Slovenian honey. Food Chemistry. v. 127, p. 296–302, 2011. BIANCHI, F. et al. Characterization of the volatile profile of thistle honey using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry. Food Chemistry. v. 129, p. 1030–1036, 2011. BIANCHIN, J. N. et al. Screening of volatile compounds in honey using a new sampling strategy combining multiple extraction temperatures in a single assay by HS-SPME–GC–MS. Food Chemistry. v. 145, p. 1061–1065, 2014. BIESAGA, M. Influence of extraction methods on stability of flavonoids. Journal of Chromatography A. v. 1218, p. 2505–2512, 2011.
221
BIESAGA, M.; PYRZYNSKA, K. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry studies of the phenolic compounds in honey. Journal of Chromatography A. v. 1216, p. 6620–6626, 2009. BIESAGA, M.; PYRZYNSKA, K. Stability of bioactive polyphenols from honey during different extraction methods. Food Chemistry. v. 136, p. 46–54, 2013. BOGDANOV, S. Honey quality and internacional regulatory standards: Review by the Internacional Honey Comission. Bee World. v. 90, p. 61-69, 1999. BONTÉ, F.; DESMOULIÈRE, A. Le miel: origine et composition. Actualités pharmaceutiques. n° 531, p. 18-21, 2013. BOUSSAID, A. et al. Physicochemical and bioactive properties of six honey samples from various floral origins from Tunisia. Arabian Journal of Chemistry. Article in press. 2014. BRAND-WILLIAMNS, W.; CUVERLIER, M. E.; BERSET, C. Use of a free radicalmethod to evaluate antioxidant activity. Food Science and Technology. v. 28, p. 25-30, 1995. BRASIL, Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Regulamento de inspeção industrial e sanitária de produtos de origem animal (RIISPOA). 29 de março de 1952. Brasília, 1952. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n. 11, de 20 de outubro de 2000. Regulamento técnico de identidade e Qualidade do mel. MAPA, Brasília, 2000. BRATU, I.; GEORGESCU, C. Chemical contamination of bee honey – identifying sensor of the environment pollution. Journal of Central European Agriculture. v. 6, p. 95-98, 2005. BRUDZYNSKI, K.; KIM, L. Storage-induced chemical changes in active components of honey de-regulate its antibacterial activity. Food Chemistry, v. 126, p. 1155-1163, 2011. BRUDZYNSKI, K.; SJAARDA, C.; MALDONADO-ALVAREZ, L. A new look on protein-polyphenol complexation during honey storage: is
222
this a random or organized event with the help of dirigent-like proteins? Plos One. v. 8, p. 1-9, 2013. CACHO, J. I. et al. Evaluation of three headspace sorptive extraction coatings for the determination of volatile terpenes in honey using gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1399, p. 18-24, 2015. CAJKA, T. et al. Traceability of honey origin based on volatiles pattern processing by artificial neural networks. Journal of Chromatography A. v. 1216, p. 1458–1462, 2009. CAN, Z. et al. An investigation of Turkish honeys: Their physico-chemical properties, antioxidant capacities and phenolic profiles. Food Chemistry. v. 180, p. 133–141, 2015. CANTARELLI, M. A. et al. Quality of honey from Argentina: study of chemical composition and trace elements. The Journal of the Argentine Chemical Society. v. 96, p. 33-41, 2008. CAPUANO, E.; FOGLIANO, V. Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies. Food Science and Technology. v. 44, p. 793-810, 2011. CASTRO-VÁZQUEZ, L. et al. Changes in the volatile fractions and sensory properties of heather honey during storage under different temperatures. European Food Research and Technology. v. 235, p. 185–193, 2012. CASTRO-VÁZQUEZ, L. et al. Differentiation of monofloral citrus, rosemary, eucalyptus, lavender, thyme and heather honeys based on volatile composition and sensory descriptive analysis. Food Chemistry. v. 112, p. 1022–1030, 2009. CASTRO-VÁZQUEZ, L. et al. Influence of storage conditions on chemical composition and sensory properties of citrus honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 56, p. 1999–2006, 2008.
223
CASTRO-VÁZQUEZ, L.; DÍAZ-MAROTO, M. C.; PÉREZ-COELLO, M. S. Aroma composition and new chemical markers of Spanish citrus honeys. Food Chemistry. v. 103, p. 601–606, 2007. CAVIA, M. M. et al. Evolution of acidity of honeys from continental climates: Influence of induced granulation. Food Chemistry. v. 100, p. 1728–1733, 2007. CAVIA, M. M. et al. Evolution of fructose and glucose in honey over one year: influence of induced granulation. Food Chemistry. v. 78, p. 157–161, 2002. CAVIA, M. M. et al. Evolution of monosaccharides of honey over 3 years: influence of induced granulation. International journal of food science & technology, v. 44, p. 623-628, 2009. CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. Ed. 2ª. Editora da Unicamp, 2003. 207p. CHAKIR, A. et al. Major and trace elements in different types of Moroccan honeys. Australian Journal of Basic and Applied Sciences. v. 5, p. 223–231, 2011. CHALLACOMBE, C. A. et al. Influence of phenolic acid content on sensory perception of bread and crackers made from red or white wheat. Journal of Cereal Science. v. 56, p. 181-188, 2012. CHEL, A.; NAYAK, J. K.; KAUSHIK, G. Energy conservation in honey storage building using Trombe wall. Energy and Buildings. v. 40, p. 1643–1650, 2008. CHERCHI, A. et al. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of organic acids in honey. Journal of Chromatography A. v. 669, p. 59-64, 1994. CHERCHI, A; SPANNEDA, L.; TUBEROSO, C. I. G. Influence of aging on the quality of honey. Industria Conservi. v.78, p. 266-271, 1997. CHERNETSOVA, E. S.; MORLOCK, G. E. Assessing the capabilities of direct analysis in real time mass spectrometry for 5-
224
hydroxymethylfurfural quantitation in honey. International Journal of Mass Spectrometry. v. 314, p. 22–32, 2012. CHIARADIA, M. C.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F. O estado da arte da cromatografia associada à espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas na análise de compostos tóxicos em alimentos. Química Nova. v. 31, p. 623-636, 2008. CHIRIFE, J.; ZAMORA, M. C.; MOTTO, A. The correlation between water activity and% moisture in honey: Fundamental aspects and application to Argentine honeys. Journal of Food Engineering, v. 72, p. 287-292, 2006. CHUDZINSKA, M.; BARALKIEWICZ, D. Application of ICP-MS method of determination of 15 elements in honey with chemometric approach for the verification of their authenticity. Food and Chemical Toxicology. v. 49, p. 2741–2749, 2011. CIULU, M. et al. RP-HPLC determination of water-soluble vitamins in honey. Talanta. v. 83, p. 924–929, 2011. CODEX STAN 12. Codex Alimentarius Comission. Codex Standard for Honey, n. 12, v. 11, rev. 2, p. 1-8, 2001. Disponível em: <http://www.codexalimentarius.net/web /more_info.jsp? id_sta=310>. Acesso em: 20 set 2013. COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de cromatografia. Editora da Unicamp, 2006. 453p. CONFORTI, F. et al. Comparative chemical composition, free radical-scavenging and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from different regions of the Mediterranean Area. Food Chemistry, v. 116, p. 898-905, 2009. CONSONNI, R.; CAGLIANI, R. L.; COGLIATI, C. Geographical discrimination of honeys by saccharides analysis. Food Control. v. 32, p. 543-548, 2013.
225
CORBELLA, E.; COZZOLINO, D. Classification of the floral origin of Uruguayan honeys by chemical and physical characteristics combined with chemometrics. Food Science and Technology. v. 39, p. 534–539, 2006. CORREIA, P. R. M.; FERREIRA, M. M. C. Reconhecimento de padrões por métodos não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de dados analíticos. Química Nova. v. 30, p. 481-487, 2007. COSTA, P. S. C. Processamento de mel puro e composto. Centro de Produções Técnicas. 2007, 204p. COTTE, J. F. et al. Chromatographic analysis of sugars applied to the characterization of monofloral honey. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 380, p. 698–705, 2004. CRESPAM, C. C.; SCHERER, F. L. Nem tudo são flores na produção e na exportação de mel: barreiras técnicas em foco. 5èmecolloque de I'IFBAE, p. 1-17, 2009. CUEVA, C. et al. Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Research in microbiology, v. 161, p. 372-382, 2010. CUEVAS-GLORY, L. F. A review of volatile analytical methods for determining the botanical origin of honey. Food Chemistry. v. 103, p. 1032–1043, 2007. D‟ARCY, B. R. et al. Composition of Australian honey extractives. 1. Norisoprenoids, Monoterpenes, and Other Natural Volatiles from Blue Gum (Eucalyptus leucoxylon) and Yellow Box (Eucalyptus melliodora) Honeys. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 45, p. 1834-1843, 1997. da COSTA LEITE, J. M. et al. Determination of oligosaccharides in Brazilian honeys of different botanical origin. Food Chemistry. v. 70, p. 93-98, 2000. DAHER, S.; GÜLAÇAR, F. O. Analysis of phenolic and other aromatic compounds in honeys by solid-phase microextraction followed by gas
226
chromatography-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 56, p. 5775–5780, 2008. DAMODARAN, S.; PARKIN, K. L.; FENNEMA, O. R.; Química de Alimentos de Fennema. 4ª Ed. Editora: Artmed, 2010, 900p. de la ROSA, L. A., ALVAREZ-PARRILLA, E., GONZÁLEZ-AGUILAR, G. A. Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry, Nutritional Value, and Stability. In: TSAO, R., MCCALLUM, J. Chemistry of Flavonoids. Wiley-Blackwell, EUA, 2010. p. 131-154. DOBRE, I. et al. Rheological behavior of different honey types from Romania. Food Research International. v. 49, p. 126-132, 2012. DONG, L. et al. Analysis of volatile compounds from a malting process using headspace solid-phase micro-extraction and GC–MS. Food research international, v. 51, p. 783-789, 2013. ESCRICHE, I. et al. Suitability of antioxidant capacity, flavonoids and phenolic acids for floral authentication of honey. Impact of industrial thermal treatment. Food Chemistry. v. 142, p. 135–143, 2014. ESCRICHE, I. et al. Using flavonoids, phenolic compounds and headspace volatile profile for botanical authentication of lemon and orange honeys. Food Research International. v. 44, p. 1504–1513, 2011. ESCUREDO, O. et al. Assessing Rubus honey value: pollen and phenolic compounds content and antibacterial capacity. Food Chemistry. v. 130, p. 671–678, 2012. ESCUREDO, O. et al. Contribution of botanical origin and sugar composition of honeys on the crystallization phenomenon. Food Chemistry. v. 149, p. 84-90, 2014. ESCUREDO, O. et al. Nutritional value and antioxidant activity of honeys produced in a European Atlantic area. Food Chemistry. v. 138, p. 851–856, 2013.
227
FALLICO, B. et al. Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys. Food Chemistry. v. 85, p. 305–313, 2004. FAO. Faostat Database, 2002. Disponível em: <http://www.fao.org>. Acessado em: out. 2013. FERREIRA, I. C. F. R. et al. Antioxidant activity of Portuguese honey samples: Different contributions of the entire honey and phenolic extract. Food Chemistry. v. 114, p. 1438-1443, 2009. FERRERES, F. et al. Floral nectar phenolics as biochemical markers for the botanical origin of heather honey. Z lebensm unters forsch journal. v. 202, p. 40–44, 1996. FINOLA, M. S.; LASAGNO, M. C.; MARIOLI, J. M. Microbiological and chemical characterization of honeys from central Argentina. Food Chemistry. v. 100, p. 1649–1653, 2007. FRANCHINI, R. A. A. et al. Differential amperometric determination of hydrogen peroxide in honeys using flow-injection analysis with enzymatic reactor. Talanta, v. 75, p. 301-306, 2008. FU, B.; LABUZA, T. P. Shelf-life prediction: theory and application. Food Control. v. 4, p. 125-133, 1993. FUENTE, E. et al. Carbohydrate composition of Spanish unifloral honeys. Food Chemistry, v. 129, p. 1483-1489, 2011. FUENTE, E. et al. Volatile and carbohydrate composition of rare unifloral honeys from Spain. Food Chemistry. v. 105, p. 84–93, 2007. GALLINA, A.; STOCCO, N.; MUTINELLI, F. Karl Fischer Titration to determine moisture in honey: a new simplified approach. Food Control. v. 21, p. 942–944, 2010. GÁMBARO, A. et al. Preference mapping of color of Uruguayan honeys. Journal of Sensory Studies. v. 22, p. 507–519, 2007. GAVIN, N. M.; DURAKO, M. J. Localization and antioxidant capacity of flavonoids from intertidal and subtidal Halophila johnsonii and Halophila decipiens. Aquatic Botany. v. 95, p. 242– 247, 2011.
228
GHELDOF, N.; ENGESETH, N. J Antioxidant capacity of honeys from various floral sources based on the determination of oxygen radical absorbance capacity and inhibition of in vitro lipoprotein oxidation in human serum samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 50, p. 3050-3055, 2002. GHORBANI; M.; KHAJEHROSHANAEE, N. The study of qualitative factors influencing on honey consumers demand: application of hedonic pricing model in Khorasan Razavi Province. Journal of Applied Sciences. v. 9, p1597-1600, 2009. GIL, M. I. et al. Plant phenolic metabolites and floral origin of rosemary honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 43, p. 2833–2838, 1995. GIORGI, A. et al. Secondary metabolites and antioxidant capacities of Waldheimia glabra (Decne.) Regel from Nepal. Journal of the Science of Food and Agriculture . v. 93, p. 1026–1034, 2013. GIROLAMO, F. D.; D'AMATO, A.; RIGHETTI, P. G. Assessment of the floral origin of honey via proteomic tools. Journal of proteomics. v. 75, p. 3688–3693, 2012. GOMES, S. et al. Physicochemical, microbiological and antimicrobial properties of commercial honeys from Portugal. Food and Chemical Toxicology. v. 48, p. 544–548, 2010. GONZALES, A. P.; BURIN, L.; DEL PILAR BUERA, M. Color changes during storage of honeys in relation to their composition and initial color. Food Research International, v. 32, p. 185-191, 1999. GOULD, G. W. Methods for preservation and extension of shelf life. International Journal of Food Microbiology. v. 33, p. 51-64, 1996. GREEF, J. D.; SMILDE, A. K. Symbiosis of chemometrics and metabolomics: past, present, and future. Journal of Chemometrics. v. 19, p. 376–386, 2005.
229
GUO, W. et al. Sugar and water contents of honey with dielectric property sensing. Journal of Food Engineering. v. 97, p. 275–281, 2010. HÄKKINEN, S. Flavonols and phenolic acids in berries and berry products. 2000. Tese de Doutorado. University of Kuopio. HASAN, S. H. Effect of storage and processing temperature on honey quality. Journal of Babylon University/Pure and Applied Sciences, v. 21, p. 2244-2253, 2013. HEIM, K. E.; TAGLIAFERRO, A. R.; BOBILYA, D. J. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. v. 13, p. 572–584, 2002. HERMOSÍN, I.; CHICÓN, R. M.; CABEZUDO, M. D. Free amino acid composition and botanical origin of honey. Food Chemistry. v. 83, p. 263–268, 2003. HOSSAIN, M. A.; RAHMAN, S. M. M. Total phenolics, flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple. Food Research International, v. 44, p. 672-676, 2011. IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Disponível em: http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp?c=74&z=t&o=24&i=P. Acesso em: 09 set 2016. IGLESIAS, M. T. et al. Changes in the free amino acid contents of honeys during storage at ambient temperature. Journal Agricultural and Food Chemistry. v. 54, p. 9099–9104, 2006. IGNAT, I.; VOLF, I.; POPA, V. I. A critical review of methods for characterization of polyphenolic compounds in fruits and vegetables. Food Chemistry. v. 126, p. 1821–1835, 2011. ISLA, M. A. et al. Physico chemical and bioactive properties of honeys from Northwestern Argentina. Food Science and Technology. v. 44, p. 1922-1930, 2011. IURLINA, M. O. et al. Major flavonoids of Argentinean honeys. Optimisation of the extraction method and analysis of their content in
230
relationship to the geographical source of honeys. Food Chemistry. v. 115, p. 1141–1149, 2009. JANISZEWSKA, K.; ANIOŁOWSKA, M.; NOWAKOWSKI, P. Free amino acids content of honeys from Poland. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences. v. 62, p. 85-89, 2012. JASICKA-MISIAK, I. et al. Phenolic compounds and abscisic acid as potential markers for the floral origin of two Polish unifloral honeys. Food Chemistry. v. 131, p. 1149–1156, 2012. JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6ª Ed. Editora Artmed, 2005. 711p. JELEN, H. Food flavours: chemical, sensory and technological properties. Taylor & Francis Group. Disponível em: http://books.google.com.br/books?id=LPKQuJLzn5MC&pg= PA99&lpg=PA99&dq=1,2+eneaminol&source=bl&ots=XvEJnzf_zF&sig=1baQMgbjZ5x_mnfsx_YvmDV_ehQ&hl=pt-BR&sa=X&ei=8gelUsTSD47qkAfqj4D4DQ&ved=0CDQQ 6AEwAQ#v=onepage&q=1%2C2%20eneaminol&f=true. Acesso em: 10 set 2013. 2012. JERKOVIC, I. et al. Contribution to the characterisation of honey-based Sardinian product abbamele: Volatile aroma composition, honey marker compounds and antioxidant activity. Food Chemistry. v. 124, p. 401–410, 2011. JERKOVIĆ, I.; KUŚ, P. M. Terpenes in honey: occurrence, origin and their role as chemical biomarkers. RSC Advances, v. 4, p. 31710-31728, 2014. JERKOVIC, I. Headspace, volatile and semi-volatile patterns of Paliurus spina-christi unifloral honey as markers of botanical origin. Food Chemistry. v. 112, p. 239–245, 2009. JIMÉNEZ, J. P. et al. Effects of grape antioxidant dietary fiber in cardiovascular disease risk factors. Nutrition, v. 24, p. 646-653, 2008.
231
JIMÉNEZ, M. et al. Influence of the storage conditions on some physicochemical and mycological parameters of honey. Journal of the Science of Food and Agriculture. v. 64, p. 67-74, 1994. JIN, B. et al. Multi-residue detection of pesticides in juice and fruit wine: A review of extraction and detection methods. Food Research International. v. 46, p. 399–409, 2012. JUAN-BORRÁS, M. et. al. Effect of country origin on physicochemical, sugar and volatile composition of acacia, sunflower and tilia honeys. Food Research International. v. 60, p. 86–94, 2014. JURADO-SÁNCHEZ, B.; BALLESTEROS, E.; GALLEGO, M. Gas chromatographic determination of 29 organic acids in foodstuffs after continuous solid-phase extraction. Talanta v. 84, p. 924–930, 2011. KAMAL, M. A.; KLEIN, P. Determination of sugars in honey by liquid chromatography. Saudi Journal of Biological Sciences. v.18, p. 17-21, 2011. KARABAGIAS, I. K. et al. Characterisation and classification of Greek pine honeys according to their geographical origin based on volatiles, physicochemical parameters and chemometrics. Food Chemistry. v. 146, p. 548–557, 2014. KASKONIENE, V.; VENSKUTONIS, P. R. Floral markers in honey of various botanical and geographic origins: a review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. v. 9, p. 620-634, 2010. KASKONIENE, V.; VENSKUTONIS, P. R.; CEKSTERYTE, V. Carbohydrate composition and electrical conductivity of different origin honeys from Lithuania. Food Science and Technology. v. 43, p. 801–807, 2010. KASKONIENE, V.; VENSKUTONIS, P. R.; CEKSTERYTÉ, V. Composition of volatile compounds of honey of various floral origin and beebread collected in Lithuania. Food Chemistry. v. 111, p. 988–997, 2008.
232
KASSIM, M. et al. Ellagic acid, phenolic acids, and flavonoids in Malaysian honey extracts demonstrate in vitro anti-inflammatory activity. Nutrition Research. v. 30, p. 650–659, 2009. KATAOKA, H.; LORD, H. L.; PAWLISZYN, J. Applications of solid-phase microextraction in food analysis. Journal of Chromatography A. v. 880, p. 35–62, 2000. KECKES, J. et al. Amino acids profile of Serbian unifloral honeys. Journal of the Science of Food and Agriculture. v. 93, p. 3368–3376, 2013. KIM, G.; SHIN, J.; JANG, H. Antioxidant and antidiabetic activity of Dangyuja (Citrus grandis Osbeck) extract treated with Aspergillus saitoi. Food Chemistry, v. 117, p. 35-41, 2009. KO, M.; CHEIGH, C.; CHUNG, M. Relationship analysis between flavonoids structure and subcritical water extraction (SWE). Food Chemistry. v. 143, p. 147–155, 2014. KOBLITZ, M. G. B. Bioquímica de Alimentos: Teoria e aplicações práticas. 1ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. KORT, B. J.; JONG, G. J.; SOMSEN, G. W. Native fluorescence detection of biomolecular and pharmaceutical compounds in capillary electrophoresis: Detector designs, performance and applications: A review. Analytica Chimica Acta. v. 766, p. 13– 33, 2013. KRIS-ETHERTON, P. M. et al. Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. The American journal of medicine. v. 113, p. 71-88, 2002. KÜÇÜK, M. et al. Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia. Food Chemistry. v. 100, p. 526–534, 2007. KUS, P. M. et al. Antioxidant activity, color characteristics, total phenol content and general HPLC fingerprints of six Polish unifloral honey types. Food Science and Technology. v. 55, p. 124-130, 2014.
233
KUS, P. M. et al. The volatile profiles of a rare apple (Malus domestica BORKH.) honey: shikimic acid-pathway derivatives, terpenes, and others. Chemistry & Biodiversity. v. 10, p. 1638-1652, 2013. LABUZA, T. P. Application of chemical kinetics to deterioration of foods. Journal of Chemical Education. v. 61, p. 348-358, 1984. LAGUERRE, M.; LECOMTE, J.; VILLENEUVE, P. Evaluation of the ability of antioxidants to counteract lipid oxidation: existing methods, new trends and challenges. Progress in Lipid Research. v. 46, p. 244–282, 2007. LANÇAS, F. M. Extração em fase sólida (SPE). Editora: RiMa, 2004. 96p. LAZAREVIC, K. B. et al. Characterisation of Serbian unifloral honeys according to their physicochemical parameters. Food Chemistry. v. 132, p. 2060–2064, 2012. LEÓN-RUIZ, V. et al. Analysis of water-soluble vitamins in honey by isocratic RP-HPLC. Food Analytical Methods. v. 6, p. 488–496, 2013. LI, S. et al. Detection of honey adulteration by high fructose corn syrup and maltose syrup using Raman spectroscopy. Journal of Food Composition and Analysis. v. 28, p. 69–74, 2012. LYRA, W. S. et al. Classificação periódica: um exemplo didático para ensinar análise de componentes principais. Química Nova. v. 33, p. 1594-1597, 2010. MADEJCZYK, M.; BARALKIEWICZ, D. Characterization of Polish rape and honeydew honey according to their mineral contents using ICP-MS and F-AAS/AES. Analytica Chimica Acta. v. 617, p. 11–17, 2008. MANYI-LOH, C. E.; NDIP, R. N.; CLARKE, A. M. Volatile compounds in honey: a review on their involvement in aroma, botanical origin determination and potential biomedical activities. International journal of molecular sciences, v. 12, p. 9514-9532, 2011.
234
MARIA, C. S.; MOREIRA, R. F. A. Compostos voláteis em méis florais. Química Nova. v. 26, p. 90-96, 2003. MARTINS, S. et al. Bioactive phenolic compounds: Production and extraction by solid-state fermentation. A review. Biotechnology Advances. v. 29, p. 365–373, 2011. MARTOS, I. et al. Flavonoids in monospecific Eucalyptus honeys from Australia. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 48, p. 4744–4748, 2000. MATO, I. et al. Rapid determination of nonaromatic organic acids in honey by capillary zone electrophoresis with direct ultraviolet detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 54, p. 1541-1550, 2006. MCCARTHY, A. L. et al. The hydroxycinnamic acid content of barley and brewers‟ spent grain (BSG) and the potential to incorporate phenolic extracts of BSG as antioxidants into fruit beverages. Food Chemistry. v. 141 p. 2567–2574, 2013. MITRA, S. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. Hoboken: John Wiley & Sons, 2003. MONTENEGRO, G. et al. Analysis of volatile compounds in three unifloral native Chilean honeys. International Journal of Experimental Botany. v. 78, p. 61-65, 2009. MOREIRA, R. F. A. et al. Chemical changes in the non-volatile fraction of Brazilian honeys during storage under tropical conditions. Food Chemistry. v. 104, p. 1236–1241, 2007. MOREIRA, R. F. A. et al. Chemical changes in the volatile fractions of Brazilian honeys during storage under tropical conditions. Food Chemistry. v. 121, p. 697–704, 2010. MOREIRA, R. F. A.; MARIA, C. A. B. Investigation of the aroma compounds from headspace and aqueous solution from the cambara (Gochnatia Velutina) honey. Flavour and Fragances. v. 20, p. 13–17, 2005.
235
MOURA, S. G. Qualidade do mel de abelhas (Apis mellifera L.) em função do ambiente e do tempo de armazenamento. 2006. 64p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal do Piauí, Piauí, 2006. NAYIK, G. A.; NANDA, V. A chemometric approach to evaluate the phenolic compounds, antioxidant activity and mineral content of different unifloral honey types from Kashmir, India. Food Science and Technology. v. 74, p. 504-513, 2016. NOZAL NALDA, M. J. et al. Classifying honeys from the Soria Province of Spain via multivariate analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 382, p. 311-319, 2005. NOZAL, M. J. et al. Determination of oxalic acid and other organic acids in honey and in some anatomic structures of bees. Apidologie. v. 34, p. 181–188, 2003. NOZAL, Mª. J. et al. Rapid and sensitive method for determining free amino acids in honey by gas chromatography with flame ionization or mass spectrometric detection. Journal of Chromatography A. v. 1047, p. 137–146, 2004. ODEH, I. et al. A variety of volatile compounds as markers in Palestinian honey from Thymus capitatus, Thymelaea hirsuta, and Tolpis virgata. Food Chemistry. v. 101, p. 1393–1397, 2007. OETTERER, M.; REGITANO-D‟ARCE, M. A. B.; SPOTO, M. H. F. Fundamentos de Ciência e Tecnologia de Alimentos. Editora Manole. Barueri/SP, 1ª Ed. 2006. 612p. OLAIMAT, A. N.; HOLLEY, R. A. Factors influencing the microbial safety of fresh produce: a review. Food Microbiology. v. 32, p. 1-19, 2012. ORDÓÑEZ, J. A. Tecnologia de Alimentos - Componentes de Alimentos e Processos. vol. 1. Editora: Artmed. Porto Alegre. 2005. 294p.
236
OTA, M.; KOHMURA, M.; KAWAGUCHI, H. Characterization of a new maillard type reaction product generated by heating 1-deoxymaltulosyl-glycine in the presence of cysteine. Journal of Agricultural of Food Chemistry. v. 54, p. 5127-5131, 2006. OUCHEMOUKH, S. et al. HPLC sugar profiles of Algerian honeys. Food Chemistry. v. 121, p. 561–568, 2010. OUCHEMOUKH, S.; LOUAILECHE, H.; SCHWEITZER, P. Physicochemical characteristics and pollen spectrum of some Algerian honeys. Food Control. v. 18, p. 52–58, 2007. PADOVAN, G, J. et al. Presence of C4 sugars in honey samples detected by the carbon isotope ratio measured by IRMS. Eurasian Journal of Analytical Chemistry. v. 2, p. 134-141, 2007. PALAFOX-CARLOS, H.; YAHIA, E. M.; GONZÁLEZ-AGUILAR, G. A. Identification and quantification of major phenolic compounds from mango (Mangifera indica, cv. Ataulfo) fruit by HPLC–DAD–MS/MS-ESI and their individual contribution to the antioxidant activity during ripening. Food Chemistry. v. 135, p. 105–111, 2012. PARAMÁS, A. M. G. et al. HPLC-fluorimetric method for analysis of amino acids in products of the hive (honey and bee-pollen). Food Chemistry. v. 95, p. 148–156, 2006. PEDERSEN-BJERGAARD, S.; RASMUSSEN, K. E.; HALVORSEN, T. G. Liquid–liquid extraction procedures for sample enrichment in capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. v. 902, p. 91–105, 2000. PEREIRA, F. M. et al. Comercialização. Embrapa. Disponível em: http://sistemasdeproducao .cnptia.embrap a.br/FontesHTML/Mel/SPMel/comercializacao.htm. Acesso em: 09 set 2016. PEREIRA, V. et al. Evolution of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural (F) in fortified wines submitted to overheating conditions. Food Research International. v. 44, p. 71–76, 2011.
237
PÉREZ, R. et al. Analysis of volatiles from Spanish honeys by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 50, p. 2633-2637, 2002. PEREZ LOCAS, C.; YAYLAYAN, V. A. Isotope labeling studies on the formation of 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde (HMF) from sucrose by pyrolysis-GC/MS. Journal of agricultural and food chemistry. v. 56, p. 6717-6723, 2008. PERNA, A. et al. A comparative study on phenolic profile, vitamin C content and antioxidant activity of Italian honeys of different botanical origin. International Journal of Food Science and Technology. v. 48, p. 1899–1908, 2013. PERSANO-ODDO, L.; PIRO, R. Main European unifloral honeys: Descriptive sheets. Apidologie. v. 35, p. 38–81, 2004. PIOTRASZEWSKA-PAJĄK, A.; GLISZCZYŃSKA-ŚWIGŁO, A. Directions of colour changes of nectar honeys depending on honey type and storage conditions. Journal of Apicultural Science, v. 59, p. 51-61, 2015. PIRES, R. M. C. Qualidade do mel de abelhas Apis mellifera Linnaeus, 1758 produzido no Piauí. 2011. 94p. Dissertação (Mestrado em Alimentos e Nutrição). Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Piauí. 2011. PLUTOWSKA, B. et al. A headspace solid-phase microextraction method development and its application in the determination of volatiles in honeys by gas chromatography. Food Chemistry. v. 126, p. 1288–1298, 2011. PONTARA, L. P. M. et al. Physicochemical and microbiological characterization of cassava flower honey samples produced by africanized honeybees. Ciência e Tecnologia de Alimentos. v. 32, p. 547-552, 2012. PONTES, M.; MARQUES, J. C.; CÂMARA, J. S. Screening of volatile composition from Portuguese multifloral honeys using headspace solid-
238
phase microextraction-gas chromatography–quadrupole mass spectrometry. Talanta. v. 74, p. 91–103, 2007. PRASAIN, J. K. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Disponível em: http://library.umac.mo/ebooks/b28050848.pdf. 2012. 788p. PUSCAS, A.; HOSU, A.; CIMPOIU, C. Application of a newly developed and validated high-performance thin-layer chromatographic method to control honey adulteration. Journal of Chromatography A. v. 1272 p. 132– 135, 2013. PYRZYNSKA, K.; BIESAGA, M. Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey. Trends in Analytical Chemistry. v. 28, p. 893-902, 2009. QAMER, S. et al. Free amino acids content of Pakistani unifloral honey produced by Apis mellifera. Pakistan Journal of Zoology. v. 39, p. 99-102, 2007. QUEIROZ, S. C. N.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F. Métodos de extração e/ou concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos para posterior determinação cromatográfica. Química Nova. v. 24, p. 68-76, 2001. QUEIROZ, S. C. N.; FERRACINI, V. L.; ROSA, M. A. Validação de método multirresíduo para determinação de pesticidas em alimentos empregando QuEChERS e UPLC-MS/MS. Química Nova. v. 35, p. 185-192, 2012. RADOVIC, B. S. et al. Contribution of dynamic headspace GC–MS analysis of aroma compounds to authenticity testing of honey. Food Chemistry. v. 72, p. 511–520, 2001. RANGEL, R. Mel brasileiro conquista o mercado externo. Disponível em: http://www.finep.gov.br/imprensa/revista/edicao10/inovacao_em_pauta_10_apicultura.pdf. Acesso em: 08 out 2016.
239
REBANE, R.; HERODES, K. A sensitive method for free amino acids analysis by liquid chromatography with ultraviolet and mass spectrometric detection using precolumn derivatization with diethyl ethoxymethylenemalonate: Application to the honey analysis. Analytica Chimica Acta. v. 672, p. 79–84, 2010. RIBANI, M. et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova. v. 27, p. 771-780, 2004. RIBEIRO, R. O. R. Classification of Brazilian honeys by physical and chemical analytical methods and low field nuclear magnetic resonance (LF 1H NMR). Food Science and Technology. v. 55, p. 90-95, 2014. RICE-EVANS, C. A.; PACKER, L. Flavonoids in Health and Disease. In: Annie Fleuriet. A., Macheix. J-J. Phenolic Acids in Fruits and Vegetables. New York: Marcel Dekker. 2003. 1-43 p. RIZELIO, V. M. Caracterização química do mel catarinense: composição, atividade antioxidante e o uso da eletroforese capilar como alternativa na avaliação da qualidade. 2011. 125p. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos). Programa de Pós Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2011. RIZELIO, V. M. et al. Development of a fast capillary electrophoresis method for determination of carbohydrates in honey samples. Talanta. v. 93, p. 62-66, 2012a. RIZELIO, V. M. et al. Development of a fast MECK method for determination of 5-HMF in honey samples. Food Chemistry. v. 133, p. 1640-1645, 2012b. RIZELIO, V. M. et al. Fast determination of cations in honey by capillary electrophoresis: A possible method for geographic origin discrimination. Talanta, v. 99, p. 450-456, 2012c. ROSA, C. G. Microencapsulação de extratos metanólicos de amora-preta (rubus fruticosus) e ácido gálico. 2012. 112f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Agroindustrial) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. 2012.
240
ROWLAND, C. Y. et al. Comparison of organic extractives found in leatherwood (Eucriphia lucida) honey and leatherwood flowers and leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 43, p. 753–763, 1995. RYBAK-CHMIELEWSKA, H. Changes in the carbohydrate composition of honey undergoing during storage. Journal of Apicultural Science. v. 51, p. 39-48, 2007. SAHINLER, N. Effects of heating and storage on hydroxy methylfurfural and diastase activity of different Turkish honeys. Journal of Apicultural Research. v. 46, p. 34–39, 2007. SAKAC, N.; SAK-BOSNAR, M. A rapid method for the determination of honey diastase activity. Talanta. v. 93, p. 135–138, 2012. SAK-BOSNAR, M.; SAKAC, N. Direct potentiometric determination of diastase activity in honey. Food Chemistry. v. 135 p. 827–831, 2012. SANCHO, M. T. et al. Aging of Honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 40, p.134-138, 1992. SANZ, M. L. et al. 2-furoylmethyl amino acids and hydroxymethylfurfural as indicators of honey quality. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 51, p. 4278-4283, 2003. ŃARIĆ, G. et al. Changes of antioxidant activity and phenolic content in acacia and multifloral honey during storage. Food Technology and Biotechnology, v. 50, p. 434-441, 2012. SAXENA, S.; GAUTAM, S.; SHARMA, A. Physical, biochemical and antioxidant properties of some Indian honeys. Food Chemistry. v. 118, p. 391–397, 2010. SEBRAE. Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas (2012). Disponível em: http://www.agenciasebrae.com.br/noticia/11526220/agronegocios/ exportacao-de-mel-registra-us-38-milhoes-em-janeiro/?indice=200. Acesso em: 08 set 2016.
241
SENYAY-ONCEL, D.; YESIL-CELIKTAS, O. Treatment of immobilized α-amylase under supercritical CO2 conditions: Can activity be enhanced after consecutive enzymatic reactions? Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 91, p. 72-76, 2013. SEREM, J. C.; BESTER, M. J. Physicochemical properties, antioxidant activity and cellular protective effects of honeys from southern Africa. Food Chemistry. v. 133, p. 1544–1550, 2012. SERGIEL, I.; POHL, P.; BIESAGA, M. Characterisation of honeys according to their content of phenolic compounds using high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Food chemistry, v. 145, p. 404-408, 2014. SERRANO, S. et al. Diastase and invertase activities in Andalusian honeys. International Journal of Food Science and Technology. v. 42, p. 76–79, 2007. SGHAIER, M. B. et al. Flavonoids and sesquiterpenes from Tecurium ramosissimum promote antiproliferation of human cancer cells and enhance antioxidant activity: A structure–activity relationship study. Environmental Toxicology and Pharmacology. v. 32, p. 336–348, 2011. SHI, J. et al. Catalytic conversion of fructose and sucrose to 5-hydroxymethylfurfural using simple ionic liquid/DMF binary reaction media. Catalysis Communications. v. 42, p. 89–92, 2013. SILICI, S.; SAGDIC, O.; EKICI, L. Total phenolic content, antiradical, antioxidant and antimicrobial activities of Rhododendron honeys. Food Chemistry. v. 121, p. 238–243, 2010. SILVA, L. R. et al. Honey from Luso region (Portugal): Physicochemical characteristics and mineral contents. Microchemical Journal. v. 93, p. 73–77, 2009. SIMSEK, A.; BILSEL, M.; GOREN, A. C. 13C/12C pattern of honey from Turkey and determination of adulteration in commercially available honey samples using EA-IRMS. Food Chemistry. v. 130, p. 1115–1121, 2012.
242
SINGH, R.S. G.; NEGI, P. S.; RADHA, C. Phenolic composition, antioxidant and antimicrobial activities of free and bound phenolic extracts of Moringa oleifera seed flour. Journal of Functional Foods. v. 5, p. 1883–1891, 2013. SINGLETON, V. L.; ROSSI, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. v. 16, p. 144-158, 1965. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. Ed. 5ª. Editora: Bookman, 2002. 836p. SOLDATKIN, O. O. et al. Development of conductometric biosensor array for simultaneous determination of maltose, lactose, sucrose and glucose. Talanta. v. 115, p. 200–207, 2013. SORIA, A. C. ; MARTINEZ-CASTRO, I. ; SANZ, J. Some aspects of dynamic headspace analysis of volatile components in honey. Food Research International. v. 41, p. 838–848, 2008. SOUZA, L. S. Estudo da competitividade da cadeia apícola de Santa Catarina a partir dos impactos dos ambientes institucional organizacional, e tecnológico. Monografia (Departamento de Ciências Econômicas da Universidade Federal de Santa Catarina). 2008. 75p. STINSON, E. E. et al. The composition of honey. V. Separation and identification of the organic acids. Archives of biochemistry and biophysics. v. 89, p. 6-12, 1960. SUÁREZ-LUQUE, S. et al. Capillary zone electrophoresis method for the simultaneous determination of cations in honey. Journal of Chromatography A. v. 1083, p. 193–198, 2005. SUÁREZ-LUQUE, S. et al. Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A. v. 955, p. 207–214, 2002.
243
SUNTORNSUK, L. Capillary electrophoresis of phytochemical substances. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 27, p. 679–698, 2002. TAHIR, H. E. et al. Discrimination of honeys using colorimetric sensor arrays, sensory analysis and gas chromatography techniques. Food chemistry, v. 206, p. 37-43, 2016. TANANAKI, C. et al. Determination of volatile characteristics of Greek and Turkish pine honey samples and their classification by using Kohonen self organising maps. Food Chemistry, v. 101, p. 1687-1693, 2007. TAO, Z. et al. Kinetic studies on enzyme-catalyzed reactions: oxidation of glucose, decomposition of hydrogen peroxide and their combination. Biophysical journal, v. 96, p. 2977-2988, 2009. TAVARES, M. F. M. Eletroforese capilar: conceitos básicos. Química Nova. v. 19, p. 173-181, 1996. TAVARES, M. Mecanismos de separação em eletroforese capilar. Química Nova. v. 20, p. 493-511, 1997. TEÓFILO, R. F. Métodos Quimiométricos: Uma Visão Geral - Conceitos básicos de quimiometria. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa. vol. 1, 2013. TENORE, G. C. et al. Nutraceutical potential of monofloral honeys produced by the Sicilian black honeybees (Apis mellifera ssp. sicula). Food and chemical toxicology, v. 50, p. 1955-1961, 2012. TERRAB, A. et al. Colour characteristics of honeys as influenced by pollen grain content: a multivariate study. Journal of the Science of Food and Agriculture. v. 84, p. 380–386, 2004. TERRAB, A.; DIEZ, M. J.; HEREDIA, F. J. Characterisation of Moroccan unifloral honeys by their physicochemical characteristics. Food Chemistry. v. 79, p. 373–379, 2002. TORNUK, F. et al. Quality characterization of artisanal and retail Turkish blossom honeys: determination of physicochemical,
244
microbiological, bioactive properties and aroma profile. Industrial Crops and Products. v. 46, p. 124– 131, 2013. TOSUN, M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C/12C isotope ratio analysis method. Food Chemistry. v. 138, p. 1629–1632, 2013. TRAUTVETTER, S.; KOELLING-SPEER, I.; SPEER, K. Confirmation of phenolic acids and flavonoids in honeys by UPLC-MS. Apidologie. v. 40, p. 140–150, 2009. TRUCHADO, P. et al. Nectar flavonol rhamnosides are floral markers of acacia (Robinia pseudacacia) honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 56, 8815–8824, 2008. TRUZZI, C. et al. Determination of proline in honey: Comparison between official methods, optimization and validation of the analytical methodology. Food Chemistry. v. 150, p. 477–481, 2014. TSAO, R. Chemistry and biochemistry of dietary polyphenols. Review. Nutrients. v. 2, p. 1231-1246, 2010. TUBEROSO, C. I. G. et al. Color evaluation of seventeen European unifloral honey types by means of spectrophotometrically determined CIE L* C*ab Hºab chromaticity coordinates. Food Chemistry. v. 145, p. 284–291, 2014. TURHAN, I. et al. Quality of honeys influenced by thermal treatment. Food Science and Technology. v. 41, 1396–1399, 2008. TURKMEN, N.; SARI, F.; POYRAZOGLU, E. S.; VELIOGLU, Y. S. (2006). Effects of prolonged using simple ionic liquid/DMF binary reaction media. Catalysis Communications. v. 42, p. 89–92, 2013. ULBRICHT, R. J.; NORTHUP, S. J.; THOMAS, J. A. A review of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) in parenteral solutios. Fundamental and applied toxicology. v. 4, p. 843-853, 1984. VAIKOUSI, H.; KOUTSOUMANIS, K.; BILIADERIS, C. G. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey
245
systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering. v. 95, p 541–550, 2009. VALENTE, A. L. P.; AUGUSTO, F. Microextração por fase sólida. Química Nova. v. 23, p. 523-530, 2000. VANDAMME, L. et al. Honey in modern wound care: a systematic review. Burns. Article in press. 2013. VANHANEN, L. P.; EMMERTZ, A.; SAVAGE, G. P. Mineral analysis of mono-floral New Zealand honey. Food Chemistry. v. 128, p. 236–240, 2011. VEESAR, I. A.; SOLANGI, I. B.; MEMON, S. Immobilization of α-amylase onto a calix [4] arene derivative: Evaluation of its enzymatic activity. Bioorganic chemistry. v. 60, p. 58-63, 2015. VELD, J. H. J. H. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview. International Journal of Food Microbiology. v. 33, p. 1-18, 1996. VENIR, E.; SPAZIANI, M.; MALTINI, E. Crystallization in „„Tarassaco” Italian honey studied by DSC. Food Chemistry. v. 122, p. 410–415, 2010. VIEIRA, L. M. Mel. Parte I. Síntese Anual da Agricultura de Santa Catarina 2009-2010. p. 225-235, 2010. VISQUERT, M.; VARGAS, M.; ESCRICHE, I. Effect of postharvest storage conditions on the colour and freshness parameters of raw honey. International Journal of Food Science and Technology. v. 49, p. 181–187, 2014. VISSER, F. R.; ALLEN, J. M.; SHAW, G. J. The effect of heat on the volatile flavor fraction from a unifloral honey. Journal of Apicultural Research. v. 27, p. 175–181, 1988. WANG , Y. et al. Amino acid-dependent formation pathways of 2-acetylfuran and 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in the Maillard reaction. Food Chemistry. v. 115, p. 233–237, 2009.
246
WHITE, J. W.; RIETHOF, M. L.; KUSHNIR, I. Composition of honey. VI. The effect of storage on carbohydrates, acidity and diastase content. Journal of Food Science, v. 26, p. 63-71, 1961. WON, S. et al. Honey major protein characterization and its application to adulteration detection. Food Research International. v. 41, p. 952–956, 2008. WON, S. et al. Immunological characterization of honey major protein and its application. Food Chemistry. v. 113, p. 1334–1338, 2009. WON, T. H. et al. Simultaneous analysis of furfural metabolites from Rehmanniae radix preparata by HPLC-DAD–ESI-MS. Food Chemistry. v. 142, p. 107–113, 2014. WOOTTON, M.; EDWARDS, R. A.; FARAJI-HAREMI, R. Effect of accelerated storage conditions on the chemical composition and properties of Australian honeys. 3. Changes in volatile components. Journal of Apicultural Research. v. 17, p. 167–172, 1978. YANG, Y.; MU, S. Antioxidant activities and radical scavenging activities of flavonoids studied by the electrochemical methods and ESR technique based on the novel paramagnetic properties of poly (aniline-co-5-aminosalicylicacid). Electrochimica Acta. v. 109, p. 663-670, 2013. YI, L. et al. Chemometric methods in data processing of mass spectrometry-based metabolomics: A review. Analytica Chimica Acta. v. 914, p. 17-34, 2016. YILMAZ, H.; KÜFREVİOĞLU, Ö. İ. Composition of honeys collected from eastern and south-eastern Anatolia and effect of storage on hydroxymethylfurfural content and diastase activity. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, v. 25, p. 347-349, 2001. YÜCEL, Y.; SULTANOGLU, P. Characterization of Hatay honeys according to their multi-element analysis using ICP-OES combined with chemometrics. Food Chemistry. v. 140, p. 231–237, 2013a.
247
YÜCEL, Y.; SULTANOGLU, P. Characterization of honeys from Hatay region by their physicochemical properties combined with chemometrics. Food Bioscience I. v. 1, p. 16–25, 2013b. ZHAO, J. et al. Identification of monofloral honeys using HPLC–ECD and chemometrics. Food Chemistry . v. 194, p. 167–174, 2016. ZHOU, J. et al. Floral classification of honey using liquid chromatography–diode array detection–tandem mass spectrometry and chemometric analysis. Food Chemistry. v. 145, p. 941–949, 2014. ZHOU, Q. et al. Identification and quantification of aroma-active components that contribute to the distinct malty flavor of buckwheat honey. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 50, p. 2016-2021, 2002. ZWIETERING, M. H.; ROMBOUTS, F. M.; RIET, K. V. Some aspects of modeling microbial quality of food. Food Control, v. 4, p. 89-96, 1993.
248
