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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS ENERGÉTICAS E

NUCLEARES

INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO GAMA SOBRE ASPERGILLUS, TEOR DE

FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO CHÁ VERDE

Aluna: Sloana Giesta Lemos Florêncio

Orientadora: Profa. Dra. Edvane Borges da Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Márcia Silva Nascimento

Recife/PE

FEVEREIRO/2012

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SLOANA GIESTA LEMOS FLORÊNCIO

INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO GAMA SOBRE ASPERGILLUS, TEOR DE

FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO CHÁ VERDE

Orientadora: Profa. Dra. Edvane Borges da Silva

Co-orientadora: Profa. Dra. Márcia Silva Nascimento

Recife/PE

FEVEREIRO/2012

Dissertação de mestrado submetida

ao Programa de Pós-graduação em

Tecnologias Energéticas e Nucleares

do Departamento de Energia Nuclear

da Universidade Federal de

Pernambuco, para obtenção do título

de Mestre em Ciências. Área de

concentração: Radioecologia.

3

Catalogação na fonte

Bibliotecário: Carlos Moura, CRB4-1502 (BDEN/UFPE)

F632i Florêncio, Sloana Giesta Lemos.

Influência da radiação gama sobre Aspergillus, teor de

fenólicos e atividade antioxidante do chá verde. / Sloana

Giesta Lemos Florêncio. - Recife: O Autor, 2012.

75 f. : il.

Orientadora: Profª. Drª. Edvane Borges da Silva.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em

Tecnologias Energéticas e Nucleares, 2012.

Inclui Referências Bibliográficas.

1. Camellia sinensis. 2. Componentes bioativos. 3. Irradiação de alimentos. 4. Radurização. 5. Sequestro de radicais livres. 6. Fungos aflatoxigênicos. I. Silva, Edvane Borges da. (orientadora). II. Título.

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INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO GAMA SOBRE ASPERGILLUS, TEOR DE

FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO CHÁ VERDE

Sloana Giesta Lemos Florêncio

APROVADA EM: 17.02.2012

ORIENTADORA: Profa. Dra. Edvane Borges da Silva

CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Márcia Silva Nascimento

COMISSÃO EXAMINADORA:

___________________________________________________________________

Prof. Dr. Emerson Peter da Silva Falcão – CAV/UFPE

___________________________________________________________________

Profa. Dra. Celiane Gomes da Silva – DCD/UFRPE

___________________________________________________________________

Profa. Dra. Cláudia Elizabete Pereira de Lima – PNPD- CNPq/CCB/UFPE

Visto e permitida a impressão

_______________________________________

Coordenador do PROTEN/DEN/UFPE

5

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalha as minhas três

mães: Emília, Lia e Ana, por vocês

serem as principais testemunhas

da minha vida. Conhecerem

minhas dores e as minhas

alegrias.

Eu as amo profundamente!

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela vida e ao Mestre Jesus, por ser nosso Modelo e Guia.

A minha família, minhas mães, meu marido, sogros, todos vocês foram meu porto seguro,

minha proteção, muito obrigada. A Gerusa, minha Gê! Que cuida de mim e da minha casa

desde sempre!

As minhas orientadoras Profa. Edvane Borges da Silva, pela grande oportunidade de seu

aceite e grande liberdade de escolhas, apesar de me ameaçar por numa camisa de forças

(risos), muito obrigada; à Profa. Márcia Silva Nascimento por sua disponibilidade e atenção,

muito obrigada por ser sempre otimista mesmo diante de dificuldades!

A minha grande Amiga Laury, que se tornou um grande exemplo de superação e força na

minha vida. Sem você dizendo que seria possível, talvez eu não tivesse acreditado.

A Daniela Cabral, que foi um anjo enviado por Deus que segurou em minhas mãos e me

salvou algumas vezes. Deus te abençoe! E ao LAPRONAT do Departamento de Farmácia da

UFPE, em especial a Profa. Elba Lúcia que me permitiu sob a orientação da Dani realizar

alguns experimentos.

As professoras Idjane Santana, do Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Centro

Acadêmico de Vitória/UFPE, e Vera Arroxelas do Laboratório de Análises Físico-Químicas

de Alimentos, Departamento de Ciências Domésticas da UFRPE, por suas tão preciosas

colaborações. Vocês são um exemplo de profissionalismo e comprometimento com a Ciência!

Aos colegas do GERAR do DEN-UFPE, Gustavo, Luanna, Nani, Marcela, Mariel, Carlos

pela companhia, amizade e conselhos no direcionamento deste trabalho. A Maria Helena por

seu carinho e atenção e ao professor Ademir Amaral.

Aos professores que compuseram minhas bancas examinadoras, Prof. Peter, sempre tão

atento, gentil, seus questionamentos sempre oportunos; Profa. Celiane, como a gente diz “uma

Mãe”, seu carinho é uma inspiração para fazer tudo melhor; Prof. André Ferraz, sua

contribuição indicou novos caminhos para nossas pesquisas, muito obrigado! Profa. Cláudia

Lima, parceira de viagens, acabou se tornando minha grande motivadora científica, quando

crescer quero ter um currículo igual ao seu!

Aos funcionários do DEN, em especial a Lia, Nilvânia, Magali, Karla, Renata, Josenildo,

senhor Edvaldo por serem sempre tão queridos e prestativos!!!

E ao CAPES pelo auxílio financeiro sem o qual não seria possível realizar todo este trabalho.

7

RESUMO

O uso de insumos vegetais vem aumentando no Brasil e em outras partes do mundo, o que é

comprovado pelo aumento do consumo de chás. Nesse contexto, Camellia sinensis,

popularmente conhecida como chá verde, vem se destacando em várias pesquisas por sua

composição rica em compostos fenólicos, os quais constituem potentes antioxidantes. Existem

riscos para a saúde pública devido ao aumento do consumo de chás contaminados por

manipulação e armazenamento inadequado, portanto este trabalho tem por objetivo avaliar o

efeito da radiação gama sobre a quantidade de fenólicos totais, atividade antioxidante e carga

fúngica do extrato aquoso de chá verde visando o tratamento sanitário deste alimento. Foram

analisadas alíquotas de amostra a granel adquirida na CEASA/PE, antes e após a irradiação

gama (doses de 0; 5; 7,5 e 10 kGy). O teor de fenólicos totais dos extratos aquosos foi

determinado utilizando o reagente Folin-Ciocalteu tendo a catequina como padrão de

referência e a absorbância determinada a 725nm. Os resultados foram expressos em mg de

fenólicos totais em equivalente de catequina por g de amostra. Os mesmos extratos acima

obtidos foram utilizados para avaliar sua capacidade de sequestrar o radical livre DPPH, e os

resultados expressos como percentual de sequestro de radical livre. As análises

microbiológicas foram realizadas a partir das amostras irradiadas e controle. O processamento

por radiação em diferentes doses (5; 7,5 e 10 kGy) não provocou perdas de compostos

fenólicos totais nem reduziu a capacidade antioxidante dos extratos aquosos do chá verde em

relação à amostra controle. Observou-se ainda, que a radiação pode ter provocado um efeito

catalisador, reduzindo o tempo necessário para se atingir a atividade máxima de sequestro de

DPPH. Paralelamente, a radiação gama foi eficaz na redução da carga fúngica do chá verde,

diminuindo o número de unidades formadoras de colônia por grama (UFC/g), conforme o

aumento da dose de radiação. Confirmando o efeito da radiação gama como um tratamento

alimentar eficaz, apesar não ter sido eficiente na eliminação de fungos aflatoxigênicos.

Palavras-chave: Camellia sinensis, componentes bioativos, irradiação de alimentos,

radurização, seqüestro de radicais livres, fungos aflatoxigênicos.

8

ABSTRACT

The use of raw plants has been increasing in Brazil and other parts of the world, which is

confirmed by the increasing tea consumption. In this context, Camellia sinensis, also known

as green tea, has been standing out in many researches for its rich composition in phenolic

compounds, which are powerful antioxidants. There are risks to public health in regards to the

contaminated tea consumption increase due to its unsuitable handling, therefore, the present

study aims to evaluate those risks and the effect of gamma irradiation over the total phenolics

amount, antioxidants and fungic activities of the green tea aqueous extract, yearning for the

health treatment of these foods. Aliquots of the bulk samples acquired at CEASA/PE been

analyzed before and after gamma irradiation (dosages of 0; 5; 7,5 and 10 kGy). The total

phenolics content of the aqueous extracts was determined by using the Folin-Ciocalteu

reagent having the catechin as the standard reference and the absorbance determined to

725nm. The results were expressed in mg of total phenolic in catechin’s equivalent for sample

in g. The same extracts above acquired were used to evaluate its DPPH free radical

scavenging, and the results expressed as free radical scavenging percentage. The

microbiological analyses were performed through irradiated samples and control. The process

using radiation in different doses (5; 7,5 and 10kGy) has not caused loss in the total phenolic

compounds or decreased the antioxidant ability of the green tea aqueous extracts in regards to

the control sample. Also, it has been observed that the radiation might have caused a catalytic

effect, decreasing the necessary time to reach the DPPH scavenging full activity. At the same

time, the gamma radiation has been effective on the reduction of fungal content, decreasing

the number of colony-forming unit per gram (CFU/p), as the radiation dose is increased,

confirming the gamma radiation effect as an efficient food treatment, although it has not been

effective on the aflatoxigenic fungi elimination.

Keywords: Camellia sinensis, bioactive components, food irradiation, radurization, free

radical scavenging, aflatoxigenic fungi.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Radura: símbolo internacional que indica o processamento dos produtos por

irradiação...................................................................................................................................20

Figura 2 –Exemplos de espécies: (A) Camellia japônica, (B) Camellia sasanqua, (C)

Camellia vietnamensis .............................................................................................................22

Figura 3 – Plantio de Camellia sinesis ....................................................................................23

Figura 4 – Folhas e Flores de Camellia sinensis .....................................................................23

Figura 5 - Fruto de Camellia sinensis .....................................................................................23

Figura 6 - Núcleo fundamental dos flavonoides .....................................................................27

Figura 7 - Principais constituintes catequínicos do chá verde ................................................28

Figura 8 - Estrutura espacial da catequina e da epicatequina .................................................29

Figura 9 - Doenças associadas às espécies reativas de oxigênio – ROS ................................30

Figura 10 - Pedaços do caule da árvore e pecíolos de chá

verde..........................................................................................................................................34

Figura 11 – Contaminação cruzada entre alimentos de natureza e procedências diferentes

...................................................................................................................................................34

Figura 12 – alíquotas de 6g acondicionadas em frascos de vidro vedados por tampas de

borracha ....................................................................................................................................36

Figura 13 - alíquotas de 25g acondicionadas em sacos de polietileno de baixa densidade com

fecho tipo zíper .........................................................................................................................36

Figura 14- Irradiador com uma fonte Gammacell 60

Co, modelo 220 Excel-MDS Nordion, do

Departamento de Energia Nuclear da UFPE ............................................................................ 37

Figura 15 – Alíquotas após a irradiação por fonte de 60

Co, nas doses de 5 kGy; 7,5 kGy e 10

kGy............................................................................................................................................37

Figura 16 - Esquema geral de diluições ..................................................................................37

Figura 17 - Crescimento dos fungos em meio DRBC/glicerol (18%) e AFPA ......................40

10

Figura 18 - Aspergillus aflatoxigênicos em amostras de chá verde irradiadas com radiação γ

de 60

Co, nas doses de 5 e 10 kGy..............................................................................................47

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação científica ..........................................................................................22

Tabela 2 - Algumas espécies de radicais livres .......................................................................31

Tabela 3 - Teor de fenólicos totais em chá verde ....................................................................42

Tabela 4 - Capacidade antioxidante do radical DPPH (%) de extratos aquosos obtidos de

infusão de chá verde .................................................................................................................44

Tabela 5 - Contagem de UFC/g, originárias de amostras de chá verde irradiadas e não

irradiadas ..................................................................................................................................45

12

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Exemplos de estudos epidemiológicos envolvendo a administração de chá verde

na modulação de parâmetros fisiológicos associados a doenças crônicas não transmissíveis

...................................................................................................................................................25

13

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................15

2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 17

2.1 Principais métodos de conservação de alimentos ..............................................................17

2.1.2 Irradiação de alimentos .................................................................................................. 17

2.2 Camellia sinesis .................................................................................................................21

2.2.1 Características botânicas .................................................................................................21

2.2.2 Principais bioativos do chá verde ....................................................................................24

2.2.2.1 Flavonóides ..................................................................................................................26

2.2.2.2 Catequinas ....................................................................................................................28

2.3 Antioxidantes .................................................................................................................... 29

2.4 Contaminação alimentar.................................................................................................... 32

3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 36

3.1 Irradiação do material vegetal.............................................................................................36

3.2 Preparação dos extratos.......................................................................................................37

3.3 Determinação de fenólicos totais e análise da atividade antioxidante................................38

3.4 Análise microbiológica ......................................................................................................38

3.4.1 Preparação do material vegetal .......................................................................................38

3.4.2 Crescimento e contagem da microbiota fúngica presente em amostras de chá verde .....39

3.5 Tratamento estatístico dos dados ........................................................................................41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................42

4.1 Determinação de fenólicos totais........................................................................................42

14

4.2 Análise da atividade antioxidante.......................................................................................43

4.3 Crescimento e contagem da microbiota fúngica presente em amostras de chá verde.........45

5 CONCLUSÕES ....................................................................................................................50

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................51

ANEXO I - REGULAMENTO TÉCNICO PARA IRRADIAÇÃO DE ALIMENTOS ........65

ANEXO II - LEGISLAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO ...........................69

ANEXO III - MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NO EXPERIMENTO .......................75

15

1 INTRODUÇÃO

O uso de insumos vegetais vem aumentando em todo o mundo, seja por seu baixo

custo, aceitabilidade e disponibilidade, seja por atividades biológicas comprovadas. Uma

importante característica dos produtos desenvolvidos com materiais vegetais é que estes

atraem as diversas classes sociais (VARANDA, 2006).

No Brasil essa tendência também é percebida pelas várias espécies de plantas que

compartilham as prateleiras dos supermercados, comprovando o aumento do consumo de chás

no país (INMETRO, 1998). Os chás preto e verde, ambos provenientes da mesma planta

(Camellia sinensis) (diferem apenas quanto ao modo como suas folhas são processadas) são

um exemplo dos tipos mais procurados pelos consumidores (MATSUBARA, 2001).

Influências culturais, sociais e econômicas repercutem na intensificação de pesquisas

com extratos vegetais e seus componentes bioativos. Nesse contexto, Camellia sinensis,

popularmente conhecida como chá verde, vem se destacando em várias pesquisas por sua

composição rica em compostos fenólicos, os quais constituem potentes antioxidantes.

Camellia sinensis é muito popular na China, Índia e no Japão. Esta planta de

procedência oriental é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Segundo a Resolução

CNNPA nº 12/1978 (BRASIL, 1978), chá é o produto constituído pelas folhas novas e brotos

de várias espécies do gênero Thea, atualmente chamado Camellia. Camellia sinensis, como

uma espécie representante da família Theaceae, é um alimento, mas que possui seu maior

consumo pela população como planta medicinal, o que o torna para muitos um alimento

funcional (BRASIL, 1969).

Junto com o aumento do consumo de produtos vegetais, principalmente os chás,

aumenta também os casos de toxinfecções que se configuram como um problema de Saúde

Pública, devido à possibilidade de acesso a produtos com uma elevada carga microbiana e

sem condições adequadas de uso.

A grande contaminação microbiológica dos produtos vegetais pode ser justificada pelo

fato de as regiões produtoras desses insumos serem, em sua maioria, áreas subdesenvolvidas

em que as técnicas de plantio, colheita, processamento, transporte e armazenagem costumam

ser rudimentares e sem controle de qualidade, ocasionando a contaminação desses produtos.

Neste sentido o uso da radiação ionizante aparece como mais uma técnica de

processamento pós-colheita visando o tratamento sanitário destes alimentos, como também a

16

obtenção de um insumo agrícola com inocuidade e, sobretudo com as suas propriedades

sensoriais e fitoquímicas preservadas.

A utilização da radiação em alimentos proporciona uma dieta com uma carga de

agentes patogênicos reduzida, os quais costumam estar presentes na superfície ou no interior

dos alimentos devido à má higienização ou processo natural de decomposição dos mesmos

(ROCHA e SOUSA, 2007). No entanto, todo processamento alimentar possui uma

normatização embasada em diretrizes da ANVISA.

A seguinte Resolução de Diretoria Colegiada da ANVISA, RDC n. 21 de 2001,

contempla exatamente o tratamento por irradiação, em que preconiza “estabelecer os

requisitos gerais para o uso da irradiação de alimentos com vistas à qualidade sanitária do

produto final” (BRASIL, 2001).

No tocante a dose absorvida, a resolução indica que ela deve ser a mínima necessária

para alcançar a finalidade pretendida, e o seu limite será estabelecido pelas características

próprias de cada alimento, em virtude de apresentarem composições hídrica e química

particulares de modo que a radiação irá interagir especificamente com cada um, havendo,

portanto a necessidade de testá-los (BRASIL, 2001).

Deste modo, será possível identificar qual a dose limite de cada alimento analisado, ou

seja, a dose ideal que atinja a finalidade de eliminar agentes decompositores e patogênicos,

como também atuar no aumento do tempo de prateleira, aspecto que não se deve apenas a

exterminação de agentes decompositores, mas também da inativação de enzimas ligadas a

maturação de vegetais, e simultaneamente não provocar alterações neste insumo.

Também é de grande importância a identificação da microbiota presente em amostras

comerciais de chá verde, uma vez que esta permitirá avaliar o efeito da radiação sobre os

microorganismos existentes. Além disto, a identificação preliminar permitirá confirmar a

eficiência da técnica na redução da carga microbiana deste alimento após sua irradiação.

Desta maneira o presente estudo teve por objetivos avaliar o efeito da radiação gama

sobre a quantidade de fenólicos totais, atividade antioxidante e espécies de Aspergillus

aflatoxigênicos presentes no extrato aquoso de chá verde - Camellia sinensis.

17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Principais métodos de conservação de alimentos

As técnicas de conservação de alimentos são o conjunto de métodos que retardam a

deterioração dos alimentos durante certo período, que é comercialmente conhecido como

tempo de prateleira.

O tempo de prateleira está relacionado com o período de vida útil de um produto,

sendo atribuída a faixa de tempo em que o alimento apresenta e conserva suas principais

características de qualidades e sensoriais. Na sequência, serão pontuados alguns dos principais

métodos de conservação (EVANGELISTA, 2005):

Por calor: pasteurização, apertização, Ultra Alta Temperatura, defumação;

Por frio: refrigeração, congelamento, supercongelamento, liofilização;

Por secagem: natural (evaporação), artificial (desidratação);

Por fermentação: láctica e alcoólica;

Por osmose: sal e açúcar;

Por adição de substâncias: aditivos conservantes. Ácidos, revestimentos

graxos, nitratos, gases;

Por supressão de elementos: oxigênio e água;

Por radiação: radurização, radicidação, radioapertização;

Por embalamento: enlatados, embalagens submetidas à vácuo, impermeáveis

a agentes físicos e químicos.

2.1.2 Irradiação de alimentos

Há mais de três décadas, o processamento com radiação ionizante tem sido

reconhecido como um método exequível para a preservação de alimentos. Este tratamento é

empregado para aumentar o tempo de prateleira, a qualidade higiênica e destruir

contaminantes. É também utilizada em tratamento quarentenário, em barreiras fitossanitárias

(BERNARDES, 1996).

18

A radiação é um fenômeno físico em que acontece a emissão e propagação de energia

através do espaço ou da matéria (RADOMYSKI et al., 1994). A irradiação é um termo

utilizado para designar processos físicos de emissão e propagação de energia, seja por

intermédio de ondas eletromagnéticas, seja por meio de partículas dotadas de energia cinética

(AQUINO, 2003).

De acordo com seus efeitos, estas radiações são classificadas em duas categorias:

radiação ionizante (raios X, radiação gama, feixe de elétrons, etc.) as quais apresentam a

capacidade de ionizar átomos ou moléculas, ou seja, são capazes de converter átomos e

moléculas em íons pela remoção de elétrons de suas órbitas; e radiação não ionizante (ondas

de radio, microondas, radiação infravermelha, luz visível e luz ultravioleta) as quais não

possuem energia suficiente para arrancar elétrons dos átomos, sendo, portanto menos danosas

ao homem (RUSTOM, 1997).

As formas de radiações utilizadas no processamento alimentar por irradiação

provocam efeitos diretos e indiretos que resultem em efeitos químicos e biológicos, os quais

atuam em microrganismos decompositores, em enzimas e reações químicas as quais atuam

nos processos de decomposição dos alimentos.

As fontes de radiação mais usadas são os aceleradores de elétrons industriais e as de

fonte de 60

Co, tendo o uso das fontes de 137

Cs sido abandonadas em detrimento das outras que

emitem radiação gama (TAUHATA et al., 2003). Outra forma de irradiação peculiar ocorre

em ambientes hospitalares em que o uso de aceleradores de elétrons, empregados em

radioterapia, pode desempenhar eventualmente essa função, assim como a irradiação de

hemoderivados (ROCHA e SOUSA, 2007; CGEE, 2006).

A principal diferença entre os raios gama provenientes de uma fonte de 60

Co e os

elétrons oriundos de um acelerador industrial, é o seu poder de penetração. A radiação gama

tem um poder de penetração maior, no entanto, é menor a taxa de dose e o feixe de elétrons

gerado por um acelerador que apresenta um poder de penetração menor, mas com uma taxa de

dose de radiação mais alta (DIEHL, 1995).

O alimento processado por irradiação não sofre nenhum tipo de contaminação

radioativa. Ele é exposto à radiação e esta exposição não é feita por contato, como também os

níveis de radiação utilizados no processamento não são suficientes para induzir radioatividade

19

nos alimentos (CARDOSO, 2003). A classificação dos processos de irradiação de alimentos é

apresentada da seguinte forma (FERREIRA, 1999; FELLOWS, 2006):

A radurização é a aplicação de uma dose de radiação inferior a 1 kGy aos

alimentos, este processo é considerado ideal para aplicação em produtos in

natura, devido ao seu teor de água, podendo ser também utilizado para

conservação de pescados e frutas secas;

A radiciação ou radiopasteurização age numa faixa de energia entre 1 a 10 kGy,

promovendo desinfestação de parasitas e a destruição de algumas bactérias e

fungos, porem não atua nas toxinas produzidas por estes microrganismos;

A radapertização ou esterilização é caracterizada como uma esterilização

comercial uma vez que a radiação pode chegar a doses acima de 10 kGy, embora

seja tecnicamente possível esterilizar um alimento, para destruição de certos

patógenos seriam necessários pelo menos 48 kGy para se obter uma redução de

Clostridium botulinum, por exemplo, o que tornaria o produto sensorialmente

inaceitável, refletindo no uso mais frequente desta técnica em temperos e

especiarias.

A irradiação de alimentos apresenta algumas vantagens sobre os métodos tradicionais,

como o fato de ser um processo em que o aumento da temperatura nos alimento pela

transferência de energia é muito pequeno, sendo considerado um tratamento a frio, também

conhecido como pasteurização a frio. Como a radiação γ apresenta elevado poder de

penetração, o processo pode ser usado para reduzir a manipulação dos alimentos na linha de

produção, possibilitando o tratamento do alimento já embalado (EVANGELISTA, 2005).

A irradiação de alimentos não elimina partículas contaminantes, assim como também

não recupera o alimento já deteriorado, o que reforça a importância da adoção das Boas

Práticas de Fabricação (BPF), as quais “abrangem um conjunto de medidas que devem ser

adotadas pelas indústrias de alimentos a fim de garantir a qualidade sanitária e a

conformidade dos produtos alimentícios com os regulamentos técnicos” (BRASIL, 2002).

As vantagens atribuídas ao uso das radiações ionizantes nos alimentos estão

relacionadas com os seguintes efeitos: inibição do brotamento em bulbos e tubérculos, retardo

20

da maturação de frutas e legumes, eliminação de parasitas, redução da carga microbiana

(fungos, bactérias), desinfestação de grãos, cereais e frutas (CORREIA et al., 2008).

No Brasil a RDC n° 21 de janeiro de 2001, regulamentada pela ANVISA, estabelece o

regulamento técnico para irradiação de alimentos (ANEXO I, Regulamento na íntegra).

Segundo a RDC n° 21, de modo geral, qualquer alimento pode ser irradiado desde que sejam

observadas as seguintes condições:

A dose máxima absorvida deve ser inferior àquela que comprometeria as

propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento;

A embalagem deve ter condições higiênicas aceitáveis para o processo de

irradiação.

Quando um produto irradiado é usado como ingrediente em outro alimento,

este fato deve ser mencionado na embalagem final com o símbolo Radura

(Figura 1) indicando que o alimento foi tratado por irradiação.

No âmbito internacional além das diretrizes que cada país implementa, a comissão do Codex

Alimentarius, estabelecida em 1963 pela Organização das Nações Unidas para a Agricultura e

a Alimentação - FAO, da Organização das Nações Unidas e a Organização Mundial da Saúde

(OMS), normatiza o uso da técnica.

Figura 1: Radura: símbolo internacional que indica o processamento dos produtos por

irradiação.

21

2.2 Camellia sinensis

2.2.1 Características botânicas

Camellia sinensis é uma planta da família das Theaceae (TSUNEKI, 2004;

PERALTA, 2009). C. sinensis apresenta em sua nomenclatura o epíteto sinensis, que

etiologicamente significa “da China”, indicando uma das origens da planta que tem como

característica peculiar folhagem rica em componentes aromáticos, diferentemente de outras

espécies (Figura 2), como Camellia japonica, Camellia sasanqua e Camellia vietnamensis.

As espécies de Camélia, sinensis e assamica, são cultivadas em todo o mundo, tendo

assamica um cultivar desenvolvido pela EMBRAPA, IAC-259, que se tornou o mais

cultivado no Brasil. Na China e no Japão, mercados tradicionais de chá, apenas sinensis é

cultivada com fins comerciais para a produção da bebida (SAITO, 2007).

C. sinensis é uma árvore perene que atinge uma altura de 10 a 15m na natureza e 0,6 a

1,5m quando cultivada, para conveniência da colheita das folhas, (Figura 3) (DALL’ORTO,

2011). As folhas são verde-escuras e espessas, lanceoladas, alternas, com margens seriadas,

variando de comprimento, 5 a 30cm e cerca de 4cm de largura, (Figura 3) (MAHMOOD et

al., 2010)..

As flores são brancas e perfumadas, sendo encontradas solitárias ou em grupos de

duas ou quatro, (Figura 4). A fruta, (Figura 5) é uma cápsula com três compartimentos

triangulares, achatados, lisos e arredondados, que contém sementes únicas em cada

compartimento, e do tamanho de uma pequena noz (MAHMOOD et al., 2010).

Camellia sinensis tem seu maior público consumidor nos países asiáticos, onde o

consumo maior é o de chá verde, enquanto que no ocidente é o de chá preto. Os chás de C.

sinensis podem ser classificados em três tipos básicos: verde, preto e oolong, diferenciando-se

pelo beneficiamento das folhas (PERALTA et al., 2009).

22

CLASSIFICAÇÃO CIENTÍFICA

Reino: Plantae

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordem: Ericales

Família: Theaceae

Gênero: Camellia

Espécie sinensis

Tabela 1 - Classificação científica

A B C

Figura 2 - Exemplos de espécies: (A) Camellia japonica, (B) Camellia

sasanqua, (C) Camellia vietnamensis.

23

O preparo do chá verde se dá inicialmente com o aquecimento das folhas para que haja

a inativação da enzima polifenoloxidase garantindo a preservação da sua cor (MATSUBARA,

Figura 4 - Folhas e flores de Camellia

sinensis. Fonte: Disponível em:

http://www.lookfordiagnosis.com/images.p

hp?term=Camellia%20sinensis&photo_id=

3469992403&lang=6. Acesso em

2.06.2011.

Figura 5 - Fruto de Camellia sinensis.

Fonte: Disponível em:

http://www.lookfordiagnosis.com/image

s.php?term=Camellia%20sinensis&phot

o_id=4551518054&lang=6, Acesso em

2.06.2011.

Figura 3 - Plantio de Camellia sinesis. Fonte: Disponível em:

http://www.geopium.org/Photos/Thailand2006/Photos-Thailand-2006-oolong-

tea.htm. Acesso em 1.08.2011.

24

2001). Para o preparo do chá preto a presença da enzima polifenoloxidase junto com o

oxigênio promove a oxidação das catequinas e teaflavinas, amenizando seu sabor e aroma.

Ambos os processos são interrompidos com a secagem e tostagem das folhas

(MATSUBARA, 2001).

Os chás oolong encontram-se numa categoria intermediária: passam por um processo

de oxidação mais brando e, por isso, têm aroma menos acentuado do que o preto. Dos três

tipos de chás, o chá verde é o mais rico em compostos com atividades funcionais (CHENG,

2006; PERALTA et al.,2009).

2.2.2 Principais bioativos do chá verde

As folhas não fermentadas do chá verde apresentam em sua constituição: proteínas (15

a 20%), glicídios (5%), ácido ascórbico, vitaminas do complexo B e K, bases púricas,

especialmente cafeína (2 a 4%), polifenóis (30%): monosídeos, flavionóis, flavonas, catecóis,

epicatecóis livres e esterificados pelo ácido gálico e produtos de condensação como taninos

(10 a 24%), minerais como flúor (130-160 mg/kg), potássio, magnésio, cálcio, ferro,

manganês, fósforo entre outros (BRUNETON, 1996; FERRARA et al., 2001; VIEIRA et al,

2008).

Os chás ingeridos na forma de infusão proporcionam a extração de muitas substâncias,

assim como compostos fenólicos (HINDON e FREI, 2003). Estes compostos ambiental e

biologicamente importantes possuem não só atividades biológica e farmacológica, mas

também influenciam atributos sensoriais dos alimentos de origem vegetal e de algumas

bebidas, sendo encontrados em plantas, frutas, sucos e vinhos (SCALBERT e

WILLIAMSON, 2000).

Os principais componentes químicos terapêuticos do chá verde são os flavonóides, os

quais são: potentes antioxidantes, “scavengers” de radicais livres, quelantes de metais e

inibidores da lipoperoxidação (SCHMITZ et al., 2008).

Schmitz et al., (2008), estudando o efeito antioxidante e anti-hemolítico de chá verde,

avaliou seus efeitos em eritrócitos humanos submetidos a estresse oxidativo. Os resultados

demonstraram que o extrato de chá verde é um importante e potente inibidor da hemólise

oxidativa in vitro, sugerindo que o consumo deste chá pode contribuir no tratamento de

25

doenças hemolíticas, doenças crônicas e na quimioterapia de câncer, e em doenças que pode

ocorrer hemólise oxidativa.

Neste sentido de acordo com BRASIL (2009) alimento funcional é “aquele alimento

ou ingrediente que, além das funções nutritivas básicas, quando consumido como parte da

dieta usual, produz efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde,

devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica”. Assim, as substâncias bioativas

devem possuir algumas características fundamentais:

Ação metabólica ou fisiológica específica;

Alegação de propriedade de saúde;

Relação entre o alimento ou ingrediente com doença ou condição relacionada à

saúde;

Alegação de propriedade funcional, relativa ao papel metabólico ou fisiológico

em funções normais do organismo humano.

Senger et al. (2010) assinalaram que de acordo com os compostos bioativos do chá

verde e a sua potencial capacidade de promover benefícios a saúde, diversos estudos

demonstram que o mesmo deve ser considerado um alimento funcional. Portanto os autores

reuniram alguns artigos sobre as propriedades funcionais do chá verde nas doenças crônicas

não transmissíveis, elaborando o Quadro 1 apresentado a seguir, no qual são listados os

principais resultados pesquisados:

REFERÊNCIA

TIPO DE

ESTUDO POPULAÇÃO

PERÍODO DE

INTERVENÇÃO E

DOSAGEM

PRINCIPAIS RESULTADOS

DOENÇAS CARDIOVASCULARES

Wang et al., 2010 Caso controle

520 pacientes

(379 homens e

141 mulheres)

1 mês (125-249 g/mês

de folhas secas)

Redução do risco de doença arterial coronariana em

homens, odds ratio de 0.62 (95%Ci 0.38-1.01)

comparados com aqueles que não bebiam o chá

verde (p < 0.001). Nas mulheres não foi encontrado

o efeito protetor

Quadro 1 - Exemplos de estudos epidemiológicos envolvendo a administração de chá verde na

modulação de parâmetros fisiológicos associados a doenças crônicas não transmissíveis. Fonte:

SENGER et al. (2010).

26

Yang et al., 2004 Estudo

transversal

711 homens e

796 mulheres com

histórico de

hipertensão

Consumo regular de

chá verde

O consumo diário de 120-599 mL de chá verde por

dia durante pelo menos um ano reduziu em 46% o

risco de desenvolver hipertensão e o consumo de

mais de 600 mL por dia reduziu o risco em 65%

CÂNCER

Jian et al., 2004 Caso controle

130 casos de

câncer de próstata e

274 controles

Consumo habitual

de chá verde a longo

prazo

O risco de câncer de próstata foi inversamente

proporcional ao consumo de chá verde. A odds

ratio, em relação aos não consumidores de chá, foi

0,28 (iC 95%=0,17-0,47) para consumidores, 0,12

(iC 95%=0,06-0,26), para consumo h mais de 40

anos e 0,09 (iC 95%=0,04-0,21) para os que

consumiam mais de 1,5 kg de folhas por ano.

Wu Ah et al.,

2003 Caso controle

501 casos de câncer

de mama e 594

controles

Consumo regular de

chá verde

Redução significativa do risco de câncer de mama

em consumidoras do chá verde, mantida após o

ajuste de potenciais fatores de confusão.

PESO CORPORAL

Wu Ch et al.,

2003

Estudo

transversal 1103 indivíduos

adultos

Consumo habitual

de chá verde a longo

do prazo (10 anos ou

mais)

O hábito de consumo de chá verde em longo prazo

mostrou relação direta com a diminuição da

gordura corporal e da relação cintura-quadril.

DECLÍNIO COGNITIVO

Kuriyama et al.,

2006

Estudo

transversal

1003 japoneses

idosos

Consumo habitual de

chá verde

Alto consumo de chá verde foi associado com

menor prevalência de declínio cognitivo.

2.2.2.1 Flavonóides

Os flavonóides (Figura 6) representam um dos grupos fenólicos mais importantes e

diversificados entre os produtos de origem natural e cuja síntese não ocorre na espécie

humana. No entanto, estes compostos apresentam propriedades farmacológicas que os fazem

atuar sobre sistemas biológicos, de forma benéfica para a saúde humana (MARTINEZ-

FLORES et al, 2002; TAPAS; SAKARKAR; KARDE, 2008 ).

Estruturalmente, os flavonóides constituem substâncias aromáticas com pelo menos 15

átomos de carbono no seu esqueleto básico sendo, portanto, componentes de baixo peso

molecular. Apresentando estrutura base C6-C3-C6 (dois anéis fenil - A e - B, ligados através

de um anel pirano, - C), estes compostos derivam da condensação de uma molécula de ácido

cinâmico com 3 grupos malonil-CoA (LIMA et al., 2009).

27

Os flavonóides encontram-se amplamente distribuídos no reino vegetal. Em sua

maioria, são responsáveis pela coloração de flores e de alguns frutos e estão presentes no

mesófilo e na epiderme das folhas, assim como na cutícula epidérmica dos frutos. Em geral,

concentram-se mais em estruturas jovens das plantas (BRUNETON, 1991).

Agentes redutores da dieta, como a vitamina C, vitamina E e os carotenóides,

protegem os tecidos corporais contra o estresse oxidativo (SCALBERT, 2000). Quando

ingeridos, os flavonóides interferem em alguns processos fisiológicos do organismo, como a

absorção de ferro e de vitaminas, e estimulam a cicatrização (VIEIRA, 2008). Alguns

flavonóides são antioxidantes por quelação de metais, outros são inibidores enzimáticos ou

ainda desempenham mecanismos de proteção frente a radiações nocivas (BRUNETON,

1991).

O interesse econômico pelos flavonóides se deve as suas diversificadas propriedades.

Alguns apresentam cor e podem ser usados como pigmentos, outros atuam na fermentação do

chá preto, na indústria do cacau e ainda agregam valor nutricional a alguns alimentos, além de

possuírem também valor farmacêutico devido a algumas propriedades atribuídas, como, por

exemplo: antitumoral, antiinflamatória, antioxidante, antiviral entre outras (SIMÕES et al.,

2001).

2.2.2.2 Catequinas

Segundo Yanagimoto et al. (2003) o extrato de chá verde contém diversos

componentes polifenólicos com atividade antioxidante, contudo, a classe de compostos

Figura 6 - Núcleo fundamental dos flavonoides. Fonte: MALINOWSKI (2010).

28

bioativos mais importantes são as catequinas e incluem a: catequina (C), a galocatequina

(GC), a epicatequina (EC), a epigalocatequina (EGC), a galato-3-epicatequina (ECG) e a

galato-3-epigalocatequina (EGCG), (Figura 7).

As catequinas são uma classe de flavonóides de baixo peso molecular, incolores,

hidrossolúveis, que conferem o amargor e a adstringência do chá verde (MATSUBARA e

RODRIGUEZ-AMAYA, 2006). Neste chá as catequinas representam 90% do total dos

flavonoides, a EGCG corresponde a mais abundante catequina do chá verde (50-60%)

(YANAGIMOTO et al. 2003), sendo que de 20 a 30% destas catequinas podem estar na

forma oxidada e 10% na forma de flavonóis (HIGDON e FREI, 2003).

O teor de catequinas no vegetal depende de alguns fatores externos, tais como forma

do processamento das folhas antes da secagem, localização geográfica do plantio e condições

de cultivo (YANAGIMOTO et al., 2003).

Figura 7 - Principais constituintes catequínicos do chá verde. Fonte: CHEN e YU ZHANG,

2009.

29

2.3 Antioxidantes

Os chás são bebidas populares e fontes significativas de compostos fenólicos, sendo

considerados importantes integrantes das dietas devido às suas propriedades antioxidantes

(MORAIS et al., 2009). Segundo Salvador et al. (2005) antioxidantes são compostos que

atuam inibindo e/ou diminuindo os efeitos desencadeados pelos radicais livres e compostos

oxidantes.

Qualquer antioxidante para usufruir de tal status deve possuir certas características

como, por exemplo, ser capaz de inibir a oxidação mesmo em baixas concentrações e por

outro lado, sua forma oxidada deve ser suficientemente estável para não desencadear novas

reações de oxidação (PORTO, 2002). A capacidade antioxidante dos compostos fenólicos é

determinada por sua estrutura, em particular por hidroxilas que podem doar elétrons e

suportar como resultado a deslocalização em torno da estrutura aromática (NAGEM et al.,

2007).

As catequinas, compostos fenólicos, neutralizam os radicais livres oxigenados (R*)

cedendo átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila localizados preferencialmente no anel B,

(Figura 8) devido à acessibilidade estereoquímica destes e à posição orto dos dois grupos

hidroxila que favorece a deslocalização eletrônica do elétron e confere uma grande

estabilidade quando a molécula passa à forma radicalar (PORTO, 2002).

Figura 8 - Estrutura espacial da catequina e da epicatequina. Fonte: Porto, 2002.

30

Os radicais livres são moléculas instáveis, que possuem um ou mais elétrons

desemparelhados, quimicamente muito reativos, e, conseqüentemente, possuem meia-vida

curtíssima (SCHMITZ et al., 2008). Podem ser gerados no citoplasma das células, em

organelas como as mitocôndrias ou ainda na membrana celular, e sua ação ocorrerá sobre os

componentes (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) relacionados com o sítio de sua

formação (Figura 9).

O termo radical livre não é o ideal para indicar os agentes reativos patogênicos, tendo

em vista que alguns deles não apresentam elétrons desemparelhados em sua última camada. A

maioria dos radicais livres é derivada do metabolismo do O2, sendo, portanto as formas

indicadas neste trabalho na Tabela 2. As espécies reativas de oxigênio (ROS) são encontradas

em todos os sistemas biológicos. Nesse contexto fisiológico do metabolismo celular aeróbio,

o O2 sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando em um radicalar

de alta reatividade (FERREIRA, 1997).

Figura 9 - Doenças associadas às espécies reativas de oxigênio – ROS. Fonte: RENZ, 2003.

31

1O2 Oxigênio singlete

O2• Radical superóxido

OH• Radical hidroxila

NO• Óxido nítrico

ONOO- Peroxinitrito

Assim, se um radical hidroxila for produzido próximo ao DNA e a esta estrutura

estiver ligado um metal, poderão ocorrer modificações de bases púricas e pirimídicas, levando

à inativação ou mutação do DNA. Além disso, o radical hidroxila pode inativar várias

proteínas, enzimas e componentes da membrana celular, ao oxidar seus grupos sulfidrilas (-

SH) a pontes dissulfeto (-SS) (FERREIRA, 1997).

Os antioxidantes são, portanto, agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões

que podem ser causadas pelos radicais livres nas células (BIANCHI e ANTUNES, 1999),

agindo “em baixas concentrações quando comparadas as do substrato oxidável, atrasando ou

inibindo a oxidação deste substrato de maneira eficaz” (SIES e STAHL, 1995).

Toit et al. (2001) apud Saito (2007) compararam a atividade antioxidante de frutas

vegetais e chás e observaram que a atividade antioxidante de duas xícaras de chá verde, na

concentração de 120-140 µg/ml de catequinas, equivale à capacidade antioxidante de 400mg

de vitamina C. O consumo de 4 a 6 xícaras de chá verde por dia reduz o risco de câncer

gástrico e esofágico segundo American Diabetes Association – ADA, (1999) apud Torres

(2004) o que indica o efeito preventivo do chá sobre doenças que aumentam o metabolismo

oxidativo no organismo.

Deve-se destacar ainda, que a concentração de catequinas na bebida varia de acordo

com a preparação do chá, mas de forma geral o chá verde preparado em uma proporção de 1

grama de folhas para 100 mL de água, por 3 minutos de fervura, contém cerca de 35-45

mg/100 mL de catequinas e 6 mg/100 mL de cafeína, dentre outros constituintes

(BALENTINE et al., 1997).

Tabela 2: Algumas espécies de radicais livres.

Fonte: adaptado de BIANCHI & ANTUNES, (1999).

32

2.4 Contaminação alimentar

A contaminação alimentar se caracteriza pela presença de qualquer elemento

indesejável no alimento, que possa apresentar potencial patogênico, de lesão a integridade

bucal ou de alterar a qualidade sensorial deste. Os alimentos podem sofrer contaminação por

substâncias tóxicas, sujidades de diversas procedências e pela presença de microrganismos,

podendo, portanto, ser de origem física, química ou biológica. A seguir exemplos de

contaminantes segundo KOSALEC et al., 2009; FIGUEIREDO e COSTA NETO, 2001:

CONTAMINAÇÃO QUÍMICA - resíduos de agrotóxicos: pesticidas, e

fertilizantes; fumigantes; micotoxinas: aflatoxinas, ocratoxina, entre outras;

endotoxinas bacterianas; resíduos de solventes, compostos de material de

embalagem, detergentes, desinfetantes. Resíduos de substâncias de uso

veterinário (medicamentos, suplementos e aditivos usados em rações);

ADULTERAÇÃO E NÃO DECLARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS -

plantas tóxicas; espécies de ervas não identificadas; substâncias tais como

corticosteróides, anti-inflamatórios não esteroides (AINE), benzodiazepínicos,

etc;

CONTAMINANTES BIOLÓGICOS - bactérias, fungos filamentosos e

leveduriformes, vírus; protozoários - amebas, helmintos - nematóides, insetos,

ácaros, minhocas entre outros;

CONTAMINAÇÃO DE ORIGEM FÍSICA - objetos introduzidos acidentalmente

durante o processamento, ou durante a manipulação dos alimentos. Metais,

pedaços de madeira, cabelos, pedras, areia, e outros elementos que podem cair

nos alimentos;

ELEMENTOS TÓXICOS METÁLICOS E NÃO METÁLICOS - chumbo,

cádmio, cromo, mercúrio, cobre, arsênico, nitrato e nitrito;

CONTAMINANTES RADIOATIVOS - 134

Cs, 137

Cs.

Dentre as contaminações biológicas a atividade tóxica microbiana poder ser atribuída,

entre outras, às enterotoxinas produzidas por bactérias. Estes compostos são em sua maioria

proteínas com atividade antigênica e apresentam alta toxicidade. A presença destes

microrganismos nos alimentos de forma geral podem causar sérias intoxicações,

33

gastroenterites e até morte, principalmente em crianças, idosos, gestantes e pessoas

imunossuprimidas (SILVA JR. et al., 2005).

Na literatura há relatos de isolamento de Staphylococcus aureus, coliformes totais e

fecais em plantas medicinais e drogas vegetais usadas em fitoterapia (SALVADOR et al.,

2011). Abba et al. (2009) identificaram uma contaminação de 65,33% por S. aureus em pós

preparados a base de plantas medicinais.

Além das bactérias alguns fungos filamentosos podem produzir toxinas, as quais

podem estar presentes em alimentos de origem vegetal, como milho, sorgo, cevada,

amendoim e derivados. Os fungos estão presentes em todos os ambientes e repercutem

intensamente na medicina, na indústria, e na fitopatologia, além de serem importantes

decompositores nas cadeias tróficas (RAVEN, 2001). Eles podem, entretanto, contaminar

alimentos, causando sua deterioração, reduzindo seu valor nutricional, alterando suas

características sensoriais e gerar grandes prejuízos tanto à saúde quanto à economia

(VECCHIA e CASTILHOS-FORTES, 2007).

Alguns gêneros deste grupo de microrganismos são responsáveis pela produção de

micotoxinas, as quais são metabólitos secundários naturais produzidos por estes organismos.

Dentre as micotoxinas que apresentam alta toxicidade destacam-se: a aflatoxina, ocratoxina

A, zearalenona, patulina, fumonisina, tricoteceno e citrinina (RODRIGUEZ-AMAYA e

SABINO, 2002).

Aspergillus é um dos principais gêneros de fungos micotoxigênicos relacionados aos

alimentos. Dentre as micotoxinas, as aflatoxinas são risco frequente a saúde pública por serem

encontradas em diversos alimentos. As aflatoxinas são consideradas contaminantes naturais,

metabólitos secundários hepatotóxicos, mutagênicos, imunossupressores e neoplásicos, sendo

as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, as mais críticas (MONTEIRO et al., 2006).

O Aspergillus flavus, um fungo comum de solo, e a outra espécie imediata relacionada,

A. parasiticus são identificadas como os principais contaminantes de produtos agrícolas.

Algumas cepas de A. flavus produzem as aflatoxinas, que são toxinas neoplásicas capazes de

induzir câncer no fígado.

A constatação de contaminação fúngica em chá verde vendido a granel pode ser

consequência de vários fatores como a contaminação por resíduos de solo, de microrganismos

da filosfera, e por processamento de secagem inadequado. Neste último caso, os fragmentos

maiores, como pedaços do caule e pecíolos da planta (Figura 10), permanecem com alto teor

de umidade, permitindo o desenvolvimento dos microrganismos contaminantes (SCHIFFL,

1997).

34

É importante salientar que o tipo de armazenamento pós-colheita em depósitos como

armazéns, barracões, além da manipulação inadequada pode favorecer a contaminação

cruzada entre alimentos de natureza e procedências diferentes (Figura 11), além de propiciar

um habitat favorável para o crescimento fúngico (DARINI et al., 2003).

Na saúde pública, as aflatoxinas são as principais responsáveis pelo aumento da

incidência de câncer hepático no homem, como consequência da ingestão contínua de

alimentos contaminados por seus fungos produtores, especialmente dos gêneros Aspergillus,

Fusarium e Penicillium. A contaminação por fungos produtores de micotoxinas pode ocorrer

Figura 10 - Pedaços do caule e pecíolos de Camellia sinensis.

Figura 11 - Contaminação cruzada entre alimentos de natureza e

procedências diferentes.

35

no campo ou durante toda a cadeia produtiva: coleta, secagem, transporte e armazenamento e

comercialização do produto (OLIVEIRA e GERMANO, 1997).

O tipo de substrato e as condições do ambiente são fatores determinantes para a sua

produção (SANTURIO et al., 2011). O crescimento fúngico é influenciado por vários

aspectos, entre os quais, destacam-se: a atividade de água, a temperatura e a umidade

ambiental, a oxigenação do meio, ação de insetos e ácaros, e tempo de armazenagem

(MARCIA e LAZZARI, 1998.).

A ocorrência de micotoxicoses, as quais são doenças produzidas pela ingestão de

alimento contaminado por toxinas produzidas por fungos, não estão restritas a um

determinado clima, região geográfica ou país (JOBIM et al., 2001). Ainda, segundo Jobim et

al. (2001), é difícil avaliar a extensão dos males causados pelas micotoxinas por diversas

razões, dentre as quais se podem destacar:

As toxinas podem ocorrer em baixas concentrações dificultando sua detecção;

Frequentemente o produto contaminado já foi totalmente consumido quando os

sinais de micotoxicoses são aparentes;

Os sinais de micotoxinas podem ser confundidos com outras doenças dificultando

a sua caracterização;

Médicos e técnicos não são treinados ou não estão familiarizados com os sinais de

micotoxicose.

Os sinais clínicos e lesões provocadas por micotoxicoses estão diretamente

relacionados a cada tipo de micotoxina, concentração e dose ingeridas, período de exposição e

espécie fúngica envolvida. No caso de uma aflatoxicose aguda os primeiros sintomas podem

iniciar 6 horas após a ingestão do alimento contaminado, expressando-se por austera

depressão, inapetência, presença de sangue nas fezes, tremores musculares, incoordenação

motora com hipertermia, podendo alcançar os 41º C, infarto hepático, chegando a levar a

morte nas 12-24 horas seguintes. Nas intoxicações subclínicas, os sinais clínicos são de

evolução mais lenta, observando-se pelos eriçados, hiporexia, letargia e depressão. Alguns

dos efeitos a longas exposições são cirrose e cânceres hepáticos (DILKIN, P. e MALLMANN

C.A., 2004).

36

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Irradiação do material vegetal

O chá verde utilizado foi adquirido no Centro de Abastecimento Alimentar de

Pernambuco – CEASA/PE. A amostra primária, adquirida a granel, pesava 500g e foi mantida

conservada em lugar seco e ao abrigo da luz até o início dos experimentos.

Uma quantidade desta amostra de chá verde foi retirada e após um cuidadoso processo

de catação, foram separadas apenas as folhas, as quais foram mantidas numa estufa a 50ºC por

24 horas.

A partir da secagem, as folhas de chá verde foram trituradas em um moinho de facas e

divididas em duas partes (Figura 12 e Figura 13):

Os dois grupos de amostras foram irradiados por uma fonte de 60

Co Gammacell

(Figura 14), nas doses de 5 kGy; 7,5 kGy e 10 kGy, com taxa de dose de 6,476 kGy/h,

pertencente ao Departamento de Energia Nuclear/UFPE.

Figura 13 - Alíquotas de 25g acondicionadas em

sacos de polietileno de baixa densidade com

fecho tipo zíper.

Figura 12 - Alíquotas de 6g

acondicionadas em frascos de vidro

vedados por tampas de borracha.

2 - Amostras relacionadas

ao experimento da análise

microbiológica.

1 - Amostras relacionadas

aos experimentos para

análise de fenóis totais e

atividade antioxidante.

37

3.2 Preparação dos extratos

Os extratos foram obtidos a partir de folhas secas e trituradas de C. sinensis cujo

delineamento experimental consistiu do formato 3X4, utilizando-se triplicatas de 0,5g para

cada dose de radiação (5; 7,5 e 10 kGy) e também a controle (não irradiada), totalizando 12

amostras.

80 mL de água destilada foram aquecidos à 80ºC (variação de ± 2oC) e sob agitação

constante as folhas trituradas foram adicionadas. Esta extração ocorreu durante 5 min em

ausência de luz.

O extrato aquoso foi filtrado, e após resfriamento à temperatura ambiente (25 ± 1 ºC) o

volume foi aferido para 100 mL com água destilada.

Figura 14 - Irradiador com uma fonte Gammacell 60

Co, modelo 220 Excel-MDS

Nordion, do Departamento de Energia Nuclear da UFPE.

Figura 15 - Alíquotas após a irradiação por fonte de 60

Co, nas doses de 5 kGy; 7,5

kGy e 10 kGy.

38

3.3 Determinação de fenólicos totais e análise da atividade antioxidante

O teor de fenólicos totais dos extratos aquosos de chá verde foi determinado utilizando

o reagente Folin-Ciocalteu tendo a catequina como padrão de referência (WETTASINGHE;

SHAHIDI, 1999). A absorbância foi determinada a 725nm e os resultados foram expressos

em mg de fenólicos totais em equivalente de catequina por g de amostra.

Os mesmos extratos acima obtidos foram utilizados para avaliar a capacidade de

sequestrar radical livre utilizando DPPH (1, 1-difenil-2-picrilhidrazil). A redução do DPPH

pelo composto antioxidante resulta na perda de absorbância e o grau de descoloração da

solução, da cor violeta-escuro para amarelo-claro, indica a eficácia do composto ou extrato

testado, a qual foi avaliada de acordo com o método descrito por Brand-Williams, Cuvelier,

Berset (1995).

Os resultados foram calculados pela seguinte fórmula e expressos como percentual de

sequestro de radical livre (MILIAUSKAS; VENSKUTONIS; van BEEK, 2004):

Onde: AB = absorção do branco (t = 0 min); AA = absorção dos extratos (t = diferentes

intervalos de tempo).

3.4 Análise microbiológica

3.4.1 Preparo das diluições

As amostras irradiadas e controle contendo cada uma 25g de folhas secas e trituradas

de Camellia sinensis, foram levadas ao Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Centro

Acadêmico de Vitória/UFPE, onde foram mantidas conservadas em lugar seco e ao abrigo da

luz até o início dos experimentos.

Os extratos foram preparados através de suspensões utilizando-se os 25g de cada

amostra irradiada e controle (não irradiada) para 225 ml de solução de água peptonada estéril,

compondo as amostras matrizes. Esta proporção segue o método para obtenção de diluições

iniciais de 1:10 (10-1

) descrita por Silva et al., (2007).

% DE SEQUESTRO DE RADICAL LIVRE = [(AB - AA)/AB] x 100

39

Ainda segundo Silva et al. (2007) a preparação e inoculação de diluições seriadas da

amostra matriz é requerida nos ensaios quantitativos, para reduzir o número de

microrganismos por unidade de volume, permitindo a contagem. Essa série de diluições

geralmente é decimal, para facilitar o posterior cálculo dos resultados. Portanto, o

experimento segue com diluições seriadas de 10-2

, 10-3

e 10-4

da solução matriz, levando-se

em consideração o nível de contaminação esperado, baseado em testes preliminares.

A partir de cada amostra matriz foi retirado 1 mL da solução com o auxílio de uma

micropipeta, tendo-se o cuidado de remover o extrato mais ao fundo do tubo para não obstruir

a ponteira com partículas vegetais, para adicioná-lo a 9 mL de água peptonada estéril. Este

procedimento foi repetido em quintuplicata e na sequência, os recipientes foram agitados em

vórtex por 1 minuto.

3.4.2 Crescimento e contagem da microbiota fúngica presente em amostras de chá verde

O bioensaio foi realizado no Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Centro

Acadêmico de Vitória/UFPE. O nível de contaminação das amostras irradiadas e da amostra

controle foi avaliado a partir do semeio das diluições dos extratos de chá verde em meio de

cultura próprio para crescimento fúngico. Após crescimento, as colônias foram quantificadas

com auxílio de um contador de colônias.

Foram utilizados os meios de cultura Ágar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol

(DRBC) acrescido de glicerol a 18% para técnica de semeadura direta e Ágar aspergillus

flavus - parasiticus (AFPA) para isolamento de cepas de fungos produtores de aflatoxinas,

Aspergillus flavus e A. parasiticus. (ANEXO III).

Para cada diluição (10-2

, 10-3

e 10-4

), foram semeadas quintuplicatas com 0,1 ml da

amostra diluída do extrato, em placas de Petri, contendo cada uma 15 ml de meio de cultura

específico, empregando–se a técnica de semeadura por espalhamento em superfície com

auxilio de alça de Drigalsky. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente

casualizado em fatorial 4 X 3, sendo quatro doses de radiação (0; 5; 7,5 e 10 kGy) e três

diluições (10-2

, 10-3

e 10-4

), com cinco repetições. Esse processo foi realizado para cada dose

de irradiação aplicada, assim como para a amostra não irradiada. Abaixo, a Figura 16 ilustra o

esquema geral de diluições.

40

O crescimento dos fungos nos meios DRBC/glicerol (18%) e AFPA ocorreu em

condições de alternância de luminosidade (12h de claro e escuro) a uma temperatura ambiente

com variação de 22 a 25°C (Figura 17), durante cinco dias. Após esse período as colônias

fúngicas foram quantificadas para cada tratamento.

Figura 16 - Esquema geral de diluições. Adaptado de SILVA et al.(2007).

Figura 17 - Crescimento dos fungos em meio DRBC/glicerol (18%) e AFPA.

41

3.5 Tratamento estatístico dos dados

Todas as determinações foram efetuadas em triplicata e as médias dos valores

encontrados foram submetidas à Análise de Variância (ANOVA) e Teste de Tukey ao nível

de 5% de probabilidade utilizando o programa Statistica 6.0 - 2001.

42

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Determinação de fenólicos totais

Os teores de fenólicos totais, expresso em equivalente de catequina, encontrados neste

estudo (Tabela 3) variaram de 70,02 a 72,81 mg.g-1

da amostra. O teste de Tukey, (p-valor <

0,05), mostrou que não ocorreu diferença significativa entre os tratamentos aplicados, ou seja,

a radiação não alterou expressivamente os teores de fenólicos totais nas amostras de chá verde

irradiados.

TRATAMENTOS* Fenólicos totais **

C 71,23 a

T1 70,02 a

T2 72,81 a

T3 72,62 a

* C: Amostra não irradiada; T1: Amostra irradiada com 5 kGy; T2: Amostra irradiada

com 7,5 kGy; T3: Amostra irradiada com 10 kGy

** mg em equivalente de catequina.g-1

de amostra. Médias nas colunas seguidas por

letras minúsculas iguais não apresentam diferença significativa pelo Teste de Tukey ao

nível de 5% de probabilidade.

Os resultados do presente trabalho corroboram com os encontrados por Koseki et al.

(2002), os quais observaram que a radiação gama não influenciou nos teores de fenóis totais e

taninos em extratos de alecrim (Rosmarinus officinalis Linné), Agrião (Nasturtium officinale

R. Br), Alcachofra (Cynara scolymus Linné) e manjericão (Ocimum basilicum Linné),

irradiados a 10, 20 e 30 kGy.

Resultados semelhantes também foram obtidos por Mishra et al. (2006) os quais

utilizaram radiação em doses de até 10kGy em folhas de chá verde e observaram que não

houve diferenças significativas entre as amostras irradiadas e o controle (não irradiado) nas

determinações de fenóis totais. Outros estudos que avaliaram fenólicos totais em vegetais

irradiados, também não demonstraram perda significativa desses compostos (HARRISON &

WERE, 2007; LEE et al., 2009; VILLAVICENCIO et al., 2000).

Mechi et al. (2005), Brigide & Canniatti-Brazaca (2006) apud Santos (2008),

Tabela 3 - Teor de fenólicos totais em chá verde.

43

apresentam o processo da irradiação gama interagindo em materiais crus ou cozidos de

vegetais com percentuais consideráveis de umidade, o que favorece a predominância do

efeito indireto da radiação. Porém, no presente estudo, foram utilizadas folhas secas, sendo,

portanto, predominante à interação da radiação gama a partir do efeito direto.

A energia da radiação que incide sobre o material vegetal dissipa-se de maneira

distinta segundo a natureza da radiação incidente. Os raios gama têm, em geral, uma baixa

transferência linear de energia, logo, penetram profundamente gerando poucos íons ao longo

de seu trajeto (OKUNO et al., 1986).

Sabendo-se, portanto da importância das condições empregadas para obtenção do

efeito final da irradiação, e de mudanças fitoquímicas mais sutis, há a necessidade de se

avaliar o perfil fitoquímico antes e após a irradiação objetivando identificar se ocorreram

alterações estruturais nas moléculas orgânicas componentes dos princípios bioativos mais

significantes do chá verde para as diferentes doses.

4.2 Análise da atividade antioxidante

Na Tabela 4 estão apresentados os resultados encontrados no presente trabalho.

Observa-se, considerando o mesmo tempo de reação, que os valores da capacidade

antioxidante, tanto para o controle quanto para os tratamentos realizados, não apresentaram

diferenças estatisticamente significativas.

Avaliando agora diferentes tempos de reação, os valores do percentual de sequestro,

no controle e nos tratamentos, foram mais elevados, sugerindo que a radiação possa ter

provocado um efeito catalisador, reduzindo assim o tempo necessário para se atingir a

atividade máxima de sequestro de DPPH. Ainda em relação ao controle, houve diferença

estatisticamente significativa entre os diferentes tempos de reação.

No entanto, com relação aos tratamentos, independente da dose de irradiação, observa-

se que os resultados encontrados em 3 e 5 min de reação, não diferiram estatisticamente

indicando que a radiação provocou um aumento na ação antioxidante do chá verde

44

Tratamentos Tempo de reação* (min)

1 3 5

C 77,93 aC

88,39 aB

91,34 aA

T1 78,06 aB

89,20 aA

91,13 aA

T2 77,05 aB

89,18 aA

91,22 aA

T3 77,13 aB

90,04 aA

91,62 aA

*Médias nas colunas seguidas por letras minúsculas iguais indicam que não

ocorreu diferença significativa pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade. Médias nas linhas seguidas por letras maiúsculas iguais não

apresentam diferença significativa pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade.

MISHRA et al. (2006) utilizou radiação em doses de até 10kGy em folhas de chá

verde e não obteve diferença significativa entre as amostras analisadas, resultado semelhante

ao apresentado no extrato do tererê encontrados por Furgeri (2009). Por outro lado, JO et al.

(2008), obteve diferença significativa na capacidade de sequestro do radical DPPH, irradiando

chá verde na dose de 20kGy.

Furgeri (2009), em estudo sobre o efeito do processamento de erva-mate por radiação

de 60

Co, observou que a atividade antioxidante do chimarrão apresentou uma pequena perda

na capacidade de inibição do DPPH nas doses de 7 e 10kGy em relação a amostra controle.

Porém, o mesmo autor desconsidera o fato argumentando que esta perda é insignificante

diante da elevada atividade antioxidante apresentada pela erva mate. Na análise do tererê não

houve perda de atividade antioxidante entre as amostras irradiadas e a amostra controle.

Štajner (2007) verificou que a irradiação gama de grãos de soja provocou alterações

muito pequenas na peroxidação lipídica e no teor de proteínas solúveis, enquanto que a

intensidade da oxidação proteica diminuiu significativamente quando a dose de 10 kGy foi

aplicada. Seus resultados mostraram que o desempenho da capacidade antioxidante e a

estabilidade proteica dos grãos de soja foram aumentados depois da aplicação da irradiação

gama.

Segundo Furgeri (2009), em face das várias funções biológicas atribuídas aos

compostos fenólicos, além do grau de hidroxilação e a posição dos grupos hidroxila em suas

Tabela 4 – Capacidade antioxidante do radical DPPH (%) de

extratos aquosos obtidos de infusão de chá verde.

45

moléculas estes estão entre as mais importantes substâncias na determinação da atividade

antioxidante do chá verde. Desta forma, os resultados aqui apresentados demonstram que o

chá verde é uma excelente fonte de compostos fenólicos e consequentemente apresenta uma

relevante atividade antioxidante, mesmo após a irradiação, em diferentes doses, das folhas

trituradas.

É preciso sempre levar em consideração que todo processamento alimentar promove

perdas que vão variar de acordo com características intrínsecas do produto, além dos fatores

extrínsecos que podem alterar a estabilidade de alguns componentes influenciando na

qualidade nutricional e sensorial (FELLOWS, 2006).

4.3 Crescimento e contagem da microbiota fúngica presente em amostras de chá verde

A contagem de colônias no meio DRBC para cada amostra mostrou que a irradiação

diminuiu consideravelmente (100x) a quantidade de colônias fúngicas nas amostras de chá

verde, a saber: não irradiada (1,34 x 10-6

UFC/g), 5 kGy (1,2 x 10-4

UFC/g), 7,5 kGy (5,6 x

10-4

UFC/g) e 10 kGy (2,6 x 10-4

UFC/g).

Tabela 5 – Contagem de colônias fúngicas (UFC/ml), originárias de amostras de chá verde

irradiadas e não irradiadas.

Doses de radiação

(kGy)

UFC

10-2

* 10-3

* 10-4

*

0 159 36 6

5,0 11 2 1

7,5 53 3 7

10,0 1 2 3

* Sequencias de diluições (ml). UFC/g.

Aziz et al. (1997), apud Aquino et al. (2011) em seu trabalho com plantas medicinais,

mostraram que as contagens de micoflora viável diminuiram quase que exponencialmente

com o aumento das doses de radiação, e a dose efetiva na eliminação de fungos foi de 5 kGy

para todas as plantas usadas.

46

Das amostras não irradiadas de chá verde, foram observados além de Aspergillus

outros fungos usualmente contaminantes de alimentos, mas que não foram objetos de estudo.

Por outro lado não foi observada em nenhuma das diluições, a presença da cor laranja

indicativa da produção de aflatoxinas.

O meio AFPA apresenta grandes vantagens, sobretudo por permitir a visualização da

aflatoxina, no reverso da placa de Petri, que tem sua cor acentuada pela presença do citrato

férrico amoniacal, e sua produção aumentada pela adição de extrato de levedura, na

composição do meio (COSTA, 2011).

No entanto, nas matrizes que receberam tratamentos com irradiação nas doses de 5;

7,5 e 10 kGy, foi visualizada a presença de Aspergillus aflatoxigênicos, indicados pela

presença da cor laranja no verso da placa com meio AFPA. Nas amostras irradiada pela dose

de 5 kGy, foram encontradas as presenças de aflatoxinas (indicadas pela presença de pontos

de cor laranja) , em duas repetições na diluição de 10-2

e em duas repetições na diluição de

10-3

.

Na amostra irradiada com a dose de 7,5 kGy, foram encontrados fungos produtores de

aflatoxinas em uma repetição para as diluições de 10-2

e para 10-3

. Assim como nas doses de 5

e 7,5, a dose de 10 kGy, também apresentou fungos produtores de aflatoxinas, sendo

observados os pontos laranja em uma repetição na diluição de 10-2

e em três repetições na

diluição de 10-4

(Figura 18).

A presença de Aspergillus aflatoxigênicos em amostras irradiadas com 5 e 10 kGy

demonstra a radioresistência do gênero Aspergillus em chá verde, assim como a necessidade

de se ampliar os estudos sobre a contaminação por este gênero em alimentos não usualmente

indicados como de risco toxigênico. A presença de fungos toxigênicos em chá verde

representa um risco potencial na formação de micotoxinas neste insumo, em condições

inadequadas de armazenamento.

Aquino (2007), em estudo da microbiota fúngica e da presença de micotoxinas em

amostras de plantas medicinais irradiadas adquiridas no comércio varejista e atacadista

observou contaminação fúngica em amostras de Boldo, tratadas pelo processo de irradiação,

com a dose de 5 kGy de 15%. Sendo A. flavus o fungo que apresentou crescimento em todas

as placas, após os tratamentos. Em relação às amostras de Espinheira santa a contaminação foi

de 15% e A. flavus foi o fungo mais resistente ao tratamento. Quanto ao Sene, após a

irradiação, observou-se que 25% e 30 % das amostras tratadas com a dose de 5 kGy

47

apresentaram crescimento fúngico, respectivamente Phoma spp. (20%), A. niger (5%), e após

30 dias (10%) de A. flavus, (AQUINO, 2007).

Ainda segundo Aquino (2007), em relação ao tratamento com 10 kGy, as amostras de

Boldo, Guaraná em pó e chá-verde apresentaram completa eliminação da contaminação

inicial, com exceção do Sene, em que 5% apresentou a microbiota fúngica presente nas

amostras analisadas no mesmo dia do tratamento pela radiação ionizante.

Os resultados podem indicar ainda que o meio utilizado pode ter estimulado o

desenvolvimento fúngico por ser uma fonte de energia mais eficiente além de trazer em sua

composição um micronutriente que estimularia um aumento do nível de expressão dos genes

relacionados à produção de aflatoxina, o citrato férrico amoniacal (PEREIRA et. al. 2002).

Além de que o estímulo gerado pela radiação pode ter alterado importantes vias

metabólicas, assim como possíveis alterações morfolócicas ocasionadas pelo estresse do

tratamento feito nas amostras de chá verde, gerando uma resposta de auto preservação

estimulando seu crescimento.

Figura 18 - Aspergillus aflatoxigênicos, em amostras de chá verde irradiadas com radiação γ

de 60

Co, nas doses de 5 e 10 kGy. As setas indicam os pontos laranja dos metabólitos

produzidos pelo fungo.

48

Mironenko et al.( 2000) analisando o fungo Alternaria alternata, conhecido por se

desenvolver em ambientes com elevada radiação e já fora estudado como modelo para

investigações genéticas a fim de explicar o fenômeno da radioresistência; destacou a sua

presença em localidades poluídas com radioisótopos como o reator Nº4 ChNPP em

Chernobyl.

Segundo Pointing (1996), apud Aquino et al. (2011), esse fungo é também conhecido

por produzir e armazenar melanina, um pigmento negro, dentro de seu micélio, como um

mecanismo de resistência.

Existem indicações de que a radioresistência destes microrganismos pode resultar da

melanização de suas células POINTING (1996) apud Aquino et al. (2011). Os mecanismos de

reparo do DNA são predominantemente responsáveis pela resistência à radiação e pode ter um

papel importante na sobrevivência de fungos BOREHAM (1994) apud Aquino et al. (2011).

Quanto a radiorresistênciancia do gênero Aspergillus, Rogovschi (2009), observou que

culturas fúngicas de cepas de Aspergillus aflatoxigênicos irradiados com acelerador de

elétrons apresentaram uma degradação ligeiramente superior às irradiadas com radiação gama

de 60

Co. Observando-se reduções de 29,93 %, 34,50 %, 52,63 % e 72,30 % para as doses de

2,5, 5,0, 10 e 20 kGy, respectivamente. A microscopia eletrônica de varredura demonstrou

que as doses de 2,5 até 10 kGy não causaram danos nestes fungos, porém com a dose de 20

kGy pode-se observar danos nas estruturas fúngicas.

Apesar de a comunidade científica, e órgãos internacionais como a FAO, OMS, e o

Codex Alimentarius, liberarem o uso e garantirem a inocuidade dos alimentos tratados por

radiações ionizantes, a sua aplicação em escala industrial continua limitada. Uma das questões

está relacionada ao fato de que mesmo com o uso apropriado da técnica, ainda assim, ela não

substitui a aplicação das Boas Práticas de Fabricação (BPF), (ANEXO II), as quais são regras

que, quando praticadas, ajudam a evitar ou reduzir os perigos ou contaminação de alimentos.

Segundo Jouve (1998), apud Luiz (2008), as Boas Práticas de Fabricação são

requeridas como pré-requisito para a implementação de APPCC (Análise de Perigos e Pontos

Críticos de Controle), sendo o APPCC um método que se baseia na aplicação de princípios

técnicos e científicos de prevenção, objetivando a inocuidade dos processos de produção,

manipulação, transporte, distribuição e consumo dos alimentos que possam afetar a sua

segurança.

49

É possível que o uso das radiações ionizantes nos chás os torne aptos ao consumo do

produto pela população, fato comprovado pela não alteração dos fenóis totais e atividade

antioxidante das amostras irradiadas em contraponto com o controle (não irradiado).

Paralelamente, verifica-se a necessidade da adoção de boas práticas de manipulação e

produção. Isto envolve um controle mais abrangente desde o plantio, colheita,

armazenamento, transporte e beneficiamento para assegurar a inocuidade do alimento já que a

técnica de irradiação utilizada não exclui que tais medidas sejam tomadas pelos produtores,

distribuidores e comerciantes.

50

5 CONCLUSÕES

O processamento por radiação em diferentes doses (5; 7,5 e 10 kGy) não provocou

perdas de compostos fenólicos totais nos extratos aquosos do chá verde em relação

à amostra controle.

Com relação à atividade antioxidante, os resultados sugerem que a radiação nas

doses de 5, 7,5 e 10 kGy não promoveu alterações quando as doses empregadas

foram comparadas. Porém, observou-se que a radiação pode ter provocado um

efeito catalisador, reduzindo o tempo necessário para se atingir a atividade máxima

de sequestro de DPPH. Entretanto, a variação observada, embora significativa, não

deve ser considerada importante.

Paralelamente, a radiação gama foi eficaz na redução da carga fúngica do chá

verde, diminuindo o número de unidades formadoras de colônia por grama

(UFC/g), conforme o aumento da dose de radiação. Confirmando o efeito da

radiação gama como um tratamento alimentar eficaz, apesar não ter sido eficiente

na eliminação de fungos aflatoxigênicos.

51

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ANEXO I

REGULAMENTO TÉCNICO PARA IRRADIAÇÃO DE ALIMENTOS

Resolução - RDC nº 21, De 26 de janeiro de 2001

1. ALCANCE

1.1. Objetivo:

Estabelecer os requisitos gerais para o uso da irradiação de alimentos com vistas à qualidade

sanitária do produto final.

1.2. Âmbito de aplicação

Este Regulamento se aplica a todos os alimentos tratados por irradiação.

2. DESCRIÇÃO

2.1. Definições

2.1.1. Irradiação de alimentos

Processo físico de tratamento que consiste em submeter o alimento, já embalado ou a granel, a

doses controladas de radiação ionizante, com finalidades sanitária, fitossanitária e ou

tecnológica.

2.1.2. Alimento irradiado

É todo alimento que tenha sido intencionalmente submetido ao processo de irradiação com

radiação ionizante.

2.1.3. Radiação ionizante

Qualquer radiação que ioniza átomos de materiais a ela submetidos. Para efeito deste

Regulamento Técnico serão consideradas radiações ionizantes apenas aquelas de energia

inferior ao limiar das reações nucleares que poderiam induzir radioatividade no alimento

irradiado.

2.1.4. Dose absorvida

Quantidade de energia absorvida pelo alimento por unidade de massa.

2.1.5. Irradiadores

Equipamentos utilizados para irradiar alimentos.

2.2. Designação

66

A denominação dos alimentos tratados por irradiação é a designação do alimento

convencional de acordo com a legislação específica.

3. REFERÊNCIAS

3.1. BRASIL, Decreto n.º 72.718, de 29 de agosto de 1973, publicada no Diário Oficial da

União de 30 de agosto de 1973.

3.2. BRASIL, Lei nº 7.394, de 29 de outubro de 1985, publicada no Diário Oficial da União

de 30 de outubro de 1985.

3.3. BRASIL, Portaria SVS/MS n.º 326, de 30 de julho de 1997, publicada no Diário Oficial

da União de 01 de agosto de 1997.

3.4. Codex STAN 106-1983 Normas Gerais do Codex para Alimentos Irradiados.

3.5. Codex CAC/RCP 19-1979 Código Internacional de Práticas recomendadas para o

funcionamento de instalações utilizadas para o tratamento de alimentos

3.6. Relatório n.º 890 da Série de relatórios da Organização Mundial da Saúde Irradiação com

altas doses: salubridade de alimentos irradiados com doses acima de 10 kGy, Genebra, 1999.

3.7. Documento preliminar de Norma para Boas Práticas de Irradiação de Alimentos ICGFI -

International Consultative Group on Food Irradiation.

4. REQUISITOS

4.1. Instalações e controle do processo

4.1.1. O tratamento dos alimentos por irradiação deve ser realizado em instalações licenciadas

pela autoridade competente estadual ou municipal ou do Distrito Federal mediante expedição

de Alvará Sanitário, após autorização da Comissão Nacional de Energia Nuclear e

cadastramento no órgão competente do Ministério da Saúde.

4.1.2. Estabelecer e implementar as Boas Práticas de Irradiação de acordo com o que

determina a legislação e apresentar o Manual de Boas Práticas de Irradiação às autoridades

sanitárias, no momento da inspeção e ou quando solicitado.

4.1.3. As instalações devem ser projetadas de modo a cumprir os requisitos de segurança

radiológica, eficácia e boas práticas de manuseio.

4.1.4. As instalações devem ser dotadas de pessoal qualificado que possua capacitação e

67

formação profissional apropriada, e atender às exigências da legislação vigente.

4.1.5. Para aferição do nível de radiação nas instalações e dependências em que se processe o

tratamento de alimentos por irradiação é obrigatória a adoção de registro dosimétrico

quantitativo, sem prejuízo de outras medidas de controle estabelecidas pela Comissão

Nacional de Energia Nuclear.

4.1.6. Os locais e registros são inspecionados pelas autoridades competentes.

4.1.7. A irradiação, assim como qualquer outro processo de tratamento de alimentos, não deve

ser utilizada em substituição as boas práticas de fabricação e ou agrícolas.

4.2. Fontes de radiação

As fontes de radiação são aquelas autorizadas pela Comissão Nacional de Energia Nuclear, na

conformidade das normas pertinentes, a saber:

a) Isótopos radioativos emissores de radiação gama: Cobalto 60 e Césio - 137;

b) Raios X gerados por máquinas que trabalham com energias de até 5 MeV;

c) Elétrons gerados por máquinas que trabalham com energias de até 10 MeV.

4.3. Dose absorvida

Qualquer alimento poderá ser tratado por radiação desde que sejam observadas as seguintes

condições:

a) A dose mínima absorvida deve ser suficiente para alcançar a finalidade pretendida;

b) A dose máxima absorvida deve ser inferior àquela que comprometeria as propriedades

funcionais e ou os atributos sensoriais do alimento.

4.4. A embalagem deve ter condições higiênicas aceitáveis, ser apropriada para o

procedimento de irradiação, estar de acordo com a legislação vigente e aprovada pela

autoridade sanitária competente.

4.4.1. Nos casos em que não estejam previstas em legislação nacional, as embalagens em

contato direto com o alimento devem ser aquelas relacionadas pela Organização Mundial da

Saúde, em documento próprio da OMS e submeter-se previamente aos critérios de inclusão de

nova embalagem na legislação brasileira.

4.5. Na rotulagem dos Alimentos Irradiados, além dos dizeres exigidos para os alimentos em

geral e específico do alimento, deve constar no painel principal: "ALIMENTO TRATADO

POR PROCESSO DE IRRADIAÇÃO", com as letras de tamanho não inferior a um terço

(1/3) do da letra de maior tamanho nos dizeres de rotulagem.

4.5.1. quando um produto irradiado é utilizado como ingrediente em outro alimento, deve

declarar essa circunstância na lista de ingredientes, entre parênteses, após o nome do mesmo.

68

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS

5.1. A indústria que irradiar alimentos deve fazer constar ou garantir que conste a indicação

de que o alimento foi tratado pelo processo de irradiação:

5.1.1 Nas Notas Fiscais quando os alimentos estiverem a granel;

5.1.2 Nas Notas Fiscais e nas embalagens quando os alimentos já estiverem embalados, de

acordo com o item 4.5 Rotulagem.

5.2. Nos locais de exposição à venda de produtos a granel irradiados deve ser afixado cartaz,

placa ou assemelhado com a seguinte informação: "ALIMENTO TRATADO POR

PROCESSO DE IRRADIAÇÃO".

5.3. Exceto para os alimentos de baixo conteúdo hídrico irradiados com objetivo de combater

a re-infestação de insetos, os alimentos irradiados não devem ser submetidos a re-irradiação.

5.4. Para efeitos desse Regulamento, não se consideram alimentos submetidos a re-irradiação

quando:

a) se irradia com outra finalidade tecnológica alimentos preparados a partir de materiais que

foram irradiados;

b) se irradia alimentos com conteúdo de ingredientes já irradiados anteriormente em

quantidade inferior a 5%do conteúdo total em massa;

c) a dose total de radiação ionizante requerida para conseguir o efeito desejado se aplica nos

alimentos de modo fracionado como parte de um processo destinado a obter um fim

tecnológico específico.

5.5. Em situações especiais, como nos casos de surtos, visando assegurar a inocuidade do

alimento sob o ponto de vista de saúde pública, a autoridade competente do Ministério da

Saúde pode definir a dose mínima utilizada para irradiação de um determinado alimento.

5.6. Nas situações de controle fitosanitário e zoosanitário, poderão ser estabelecidos pela

autoridade federal competente níveis (doses) mínimas de radiação ionizante considerando o

tipo de produto, a finalidade e objetivo(s) pretendido(s).

5.7. Qualquer outra situação que não se enquadre nas disposições deste Regulamento Técnico

deve obrigatoriamente ser submetida à análise da Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

(Of. El. nº 33/2001)

Acessado em 31/01/2011, em: http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/21_01rdc.htm

69

ANEXO II

LEGISLAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO

As Boas Práticas de Fabricação (BPF) abrangem um conjunto de medidas que devem ser

adotadas pelas indústrias de alimentos a fim de garantir a qualidade sanitária e a

conformidade dos produtos alimentícios com os regulamentos técnicos. A legislação sanitária

federal regulamenta essas medidas em caráter geral, aplicável a todo o tipo de indústria de

alimentos e específico, voltadas às indústrias que processam determinadas categorias de

alimentos.

REGULAMENTO TÉCNICO DE PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS

PADRONIZADOS APLICADOS AOS ESTABELECIMENTOS

PRODUTORES/INDUSTRIALIZADORES DE ALIMENTOS

1. ALCANCE

1.1. Objetivo

Estabelecer Procedimentos Operacionais Padronizados que contribuam para a garantia das

condições higiênicosanitárias necessárias ao processamento/industrialização de alimentos,

complementando as Boas Práticas de Fabricação.

1.2. Âmbito de Aplicação

Aplica-se aos estabelecimentos processadores/industrializadores nos quais sejam realizadas

algumas das seguintes atividades: produção/industrialização, fracionamento, armazenamento

e transporte de alimentos industrializados.

2. DEFINIÇÕES

Para efeito deste Regulamento, considera-se:

2.1. Procedimento Operacional Padronizado - POP: procedimento escrito de forma objetiva

que estabelece instruções sequenciais para a realização de operações rotineiras e específicas

na produção, armazenamento e transporte de alimentos. Este Procedimento pode apresentar

outras nomenclaturas desde que obedeça ao conteúdo estabelecido nesta Resolução.

2.2. Limpeza: operação de remoção de terra, resíduos de alimentos, sujidades e ou outras

substâncias indesejáveis.

70

2.3. Desinfecção: operação de redução, por método físico e ou agente químico, do número de

microrganismos a um nível que não comprometa a segurança do alimento.

2.4. Higienização: operação que se divide em duas etapas, limpeza e desinfecção.

2.5. Antissepsia: operação destinada à redução de microrganismos presentes na pele, por meio

de agente químico, após lavagem, enxágue e secagem das mãos.

2.6. Controle Integrado de Pragas: sistema que incorpora ações preventivas e corretivas

destinadas a impedir a atração, o abrigo, o acesso e ou proliferação de vetores e pragas

urbanas que comprometam a segurança do alimento.

2.7. Programa de recolhimento de alimentos: procedimentos que permitem efetivo

recolhimento e apropriado destino final de lote de alimentos exposto à comercialização com

suspeita ou constatação de causar dano à saúde.

2.8. Resíduos: materiais a serem descartados, oriundos da área de produção e das demais áreas

do estabelecimento.

2.9. Manual de Boas Práticas de Fabricação: documento que descreve as operações realizadas

pelo estabelecimento, incluindo, no mínimo, os requisitos sanitários dos edifícios, a

manutenção e higienização das instalações, dos equipamentos e dos utensílios, o controle da

água de abastecimento, o controle integrado de vetores e pragas urbanas, controle da higiene e

saúde dos manipuladores e o controle e garantia de qualidade do produto final.

3. REFERÊNCIAS

3.1. BRASIL. Decreto-Lei nº 986, de 21 de outubro de 1969. Institui Normas Básicas sobre

Alimentos.

3.2. BRASIL. Lei n° 6437, de 20 de agosto de 1977, e suas alterações. Configuram infrações

a legislação sanitária federal, estabelece as sanções respectivas e dá outras providências.

3.3. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Portaria nº 326, de 30

de julho de 1997.

Regulamento Técnico sobre as Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de

Fabricação para Indústrias de Alimentos.

3.4. BRASIL. Ministério da Saúde - Secretário Nacional de Organização e Desenvolvimento

de Serviços de Saúde. Programa de Controle de Infecção Hospitalar. LAVAR AS MÃOS:

INFORMAÇÕES PARA PROFISSIONAIS DE SAÚDE. 39 páginas na Impressão Original,

il. - Série A: Normas e Manuais Técnicos - 11, 1989.

71

3.5. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Portaria nº 1.428, de 26

de novembro de 1993. Regulamentos Técnicos sobre Inspeção Sanitária, Boas Práticas de

Produção/Prestação de Serviços e Padrão de Identidade e Qualidade na Área de Alimentos.

3.6. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-

RDC nº 18, de 29 de fevereiro de 2000. Dispõe sobre Normas Gerais para funcionamento de

Empresas Especializadas na prestação de serviços de controle de vetores e pragas urbanas.

3.7. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº

22, de 15 de março de 2000. Dispõe sobre o Manual de Procedimentos Básicos de Registro e

Dispensa da Obrigatoriedade de Registro de Produtos Importados Pertinentes à Área de

Alimentos.

3.8. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº

23, de 15 de março de 2000. Dispõe sobre o Manual de Procedimentos Básicos para Registro

e Dispensa da Obrigatoriedade de Registro de Produtos Pertinentes à Área de Alimentos.

3.9. CODEX ALIMENTARIUS. CAC/RCP 1-1969, Ver. 3 (1997). Recommended

Internacional Code of Practice General Principles of Food Hygiene.

3.10. ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA. Code of Federal Regulations, Vol. 2, Título 9,

Capítulo III, Parte 416.Sanitation.

4. REQUISITOS PARA ELABORAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS

PADRONIZADOS

4.1. Requisitos Gerais

4.1.1. Os estabelecimentos produtores/industrializadores de alimentos devem desenvolver,

implementar e manter para cada item relacionado abaixo, Procedimentos Operacionais

Padronizados - POPs.

a) Higienização das instalações, equipamentos, móveis e utensílios.

b) Controle da potabilidade da água.

c) Higiene e saúde dos manipuladores.

d) Manejo dos resíduos.

e) Manutenção preventiva e calibração de equipamentos.

f) Controle integrado de vetores e pragas urbanas.

g) Seleção das matérias-primas, ingredientes e embalagens.

h) Programa de recolhimento de alimentos.

4.1.2. Os POPs devem ser aprovados, datados e assinados pelo responsável técnico,

responsável pela operação, responsável legal e ou proprietário do estabelecimento, firmando o

72

compromisso de implementação, monitoramento, avaliação, registro e manutenção dos

mesmos.

4.1.3. A frequência das operações e nome, cargo e ou função dos responsáveis por sua

execução devem estar especificados em cada POP.

4.1.4. Os funcionários devem estar devidamente capacitados para execução dos POPs.

4.1.5. Quando aplicável, os POPs devem relacionar os materiais necessários para a realização

das operações assim como os Equipamentos de Proteção Individual.

4.1.6. Os POPs devem estar acessíveis aos responsáveis pela execução das operações e às

autoridades sanitárias.

4.1.7. Os POPs podem ser apresentados como anexo do Manual de Boas Práticas de

Fabricação do estabelecimento.

4.2. Requisitos específicos

4.2.1. Os POPs referentes às operações de higienização de instalações, equipamentos, móveis

e utensílios devem conter informações sobre: natureza da superfície a ser higienizado, método

de higienização, princípio ativo selecionado e sua concentração, tempo de contato dos agentes

químicos e ou físicos utilizados na operação de higienização, temperatura e outras

informações que se fizerem necessárias. Quando aplicável o desmonte dos equipamentos, os

POPs devem contemplar esta operação.

4.2.2. Os Procedimentos Operacionais Padronizados devem abordar as operações relativas ao

controle da potabilidade da água, incluindo as etapas em que a mesma é crítica para o

processo produtivo, especificando os locais de coleta das amostras, a frequência de sua

execução, as determinações analíticas, a metodologia aplicada e os responsáveis.

Quando a higienização do reservatório for realizada pelo próprio estabelecimento, os

procedimentos devem contemplar os tópicos especificados no item 4.2.1. Nos casos em que as

determinações analíticas e ou a higienização do reservatório forem realizadas por empresas

terceirizadas, o estabelecimento deve apresentar, para o primeiro caso, o laudo de análise e,

para o segundo, o certificado de execução do serviço contendo todas as informações

constantes no item 4.2.1.

4.2.3. As etapas, a frequência e os princípios ativos usados para a lavagem e antissepsia das

mãos dos manipuladores devem estar documentados em procedimentos operacionais, assim

como as medidas adotadas nos casos em que os manipuladores apresentem lesão nas mãos,

sintomas de enfermidade ou suspeita de problema de saúde que possa comprometer a

segurança do alimento. Deve-se especificar os exames aos quais os manipuladores de

alimentos são submetidos, bem como a periodicidade de sua execução. O programa de

73

capacitação dos manipuladores em higiene deve ser descrito, sendo determinada a carga

horária, o conteúdo programático e a frequência de sua realização, mantendo-se em arquivo os

registros da participação nominal dos funcionários.

4.2.4. Os Procedimentos Operacionais Padronizados devem estabelecer a frequência e o

responsável pelo manejo dos resíduos. Da mesma forma, os procedimentos de higienização

dos coletores de resíduos e da área de armazenamento devem ser discriminados atendendo, no

mínimo, aos tópicos especificados no item 4.2.1.

4.2.5. Os estabelecimentos devem dispor dos Procedimentos Operacionais Padronizados que

especifiquem a periodicidade e responsáveis pela manutenção dos equipamentos envolvidos

no processo produtivo do alimento.

Esses POPs devem também contemplar a operação de higienização adotada após a

manutenção dos equipamentos.

Devem ser apresentados os POPs relativos à calibração dos instrumentos e equipamentos de

medição ou comprovante da execução do serviço quando a calibração for realizada por

empresas terceirizadas.

4.2.6. Os POPs referentes ao controle integrado de vetores e pragas urbanas devem

contemplar as medidas preventivas e corretivas destinadas a impedir a atração, o abrigo, o

acesso e ou a proliferação de vetores e pragas urbanas. No caso da adoção de controle

químico, o estabelecimento deve apresentar comprovante de execução de serviço fornecido

pela empresa especializada contratada, contendo as informações estabelecidas em legislação

sanitária específica.

4.2.7. O estabelecimento deve dispor de procedimentos operacionais especificando os

critérios utilizados para a seleção e recebimento da matéria-prima, embalagens e ingredientes,

e, quando aplicável, o tempo de quarentena necessário. Esses procedimentos devem prever o

destino dado às matérias-primas, embalagens e ingredientes reprovados no controle efetuado.

4.2.8. O programa de recolhimento de produtos deve ser documentado na forma de

procedimentos operacionais, estabelecendo-se as situações de adoção do programa, os

procedimentos a serem seguidos para o rápido e efetivo recolhimento do produto, a forma de

segregação dos produtos recolhidos e seu destino final, além dos responsáveis pela atividade.

5. MONITORAMENTO, AVALIAÇÃO E REGISTRO DOS PROCEDIMENTOS

OPERACIONAIS PADRONIZADOS

5.1. A implementação dos POPs deve ser monitorada periodicamente de forma a garantir a

finalidade pretendida, sendo adotadas medidas corretivas em casos de desvios destes

74

procedimentos. As ações corretivas devem contemplar o destino do produto, a restauração das

condições sanitárias e a reavaliação dos Procedimentos Operacionais Padronizados.

5.2. Deve-se prever registros periódicos suficientes para documentar a execução e o

monitoramento dos Procedimentos Operacionais Padronizados, bem como a adoção de

medidas corretivas. Esses registros consistem de anotação em planilhas e ou documentos e

devem ser datados, assinados pelo responsável pela execução da operação e mantidos por um

período superior ao tempo de vida de prateleira do produto.

5.3. Deve-se avaliar, regularmente, a efetividade dos POPs implementados pelo

estabelecimento e, de acordo com os resultados, deve-se fazer os ajustes necessários.

5.4. Os Procedimentos Operacionais Padronizados devem ser revistos em caso de modificação

que implique em alterações nas operações documentadas.

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ANEXO III

MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NO EXPERIMENTO

DRBC (Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol)

Digestão Péptica de tecido animal: 5.00g

Dextrose: 10.00 g

Fosfato Monopotássico: 1.00g

Sulfato de Magnésio: 0.50 g

Rosa Bengala: 0.02 g

Dicloran: 0.002 g

Agar: 15.00g

Preparo: Utilizar 15,75g de meio e adicionar água destilada para completar 1000ml.

Autoclavar.

AFPA (Ágar Aspergillus flavus e parasiticus)

Peptona bacteriológica: 10g

Extrato de levedura: 20g

Citrato férrico amoniacal: 0,5g

Cloranfenicol: 100mg

Ágar: 15g

Água destilada: 1 litro

Dicloran: 2mg (0,2% em etanol, 1ml)

Preparo: Dissolver todos os ingredientes e autoclavar a 121ºC por 15 min. 58

BDA (Batata Dextrose Agar)

Discos de batata sem pele: 200g

Dextrose: 20g Ágar: 17g

Água destilada: 1000 ml

Preparo: Ferva os discos de batata em 500 ml de água destilada por 30 minutos. Filtrar o

caldo. Fundir o ágar em 500 ml de água destilada. Adicionar a dextrose ao caldo e misture

tudo no recipiente contendo o ágar fundido. Ajustar o volume com água para 1000 ml.

Distribuir o meio em tubos ou frascos de erlenmeyer e esterilizar em autoclave.