Ludmila Entiauspe

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO

DISCIPLINA DE GENÔMICA FUNCIONAL

O HPV

Vírus que apresenta tropismo específico por célulasepiteliais e da mucosa

Explora o maquinário celular do hospedeiro em seu favor

Indução de tumores

Classificados por genótipos (10% do gene L1)

120 genótipos descritos

40 infecções anogenitais em homens e mulheres

15 CA

Alto risco ou baixo risco (transformação neoplásica)

O HPV

43 genomas completos seqüenciados

Infecções benignas

Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL)

Raramente há associações pré-malignas ou malignas

HPV-6, 11, -42, -43 e -44

Papilomatose laríngea juvenil

Papilomatose respiratória recorrente

97% dos casos de verrugas genitais

Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL)

Carcinoma invasor de colo de útero

HPV-16, -18, -26, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56,-58

Outros cânceres anogenitais

Cabeça e pescoço

Carcinoma epidermóide boca e orofaringe

HPV-58

HPV-18

HPV-18

HPV-58

HPV-33

Distribuição do HPV e genótipos no Brasil

76%GO

64%SP

28%RS

40%

MG

PA63%

BA78%

Assintomáticas

Citologia alterada

NIC II e NIC III

NIC III e CA

Aspectos sóciocomportamentais

Demográficos

Co-fatores virais

Hormônios endógenos

Fatores genéticos

Fatores ligados à resposta imune

A co-infecção HPV/HIV ocorre em mulheres emtodo o mundo.

Estudos mostram um aumento na prevalência deinfecção genital por HPV, lesão intra-epitelial oucâncer cervical em mulheres infectadas pelo HIV

CDC incluiu o CA cervical entre as condiçõesdefinidoras da AIDS

Mulheres HIV positivas tem aumento de 100 vezesna incidência de carcinoma da vulva e ânus

Risco para CA cervical aumentado em 14 vezes

Maior prevalência de infecção e lesões

Mais graves

Progressão rápida

Difíceis de tratar

Alta taxa de recorrência

Ciclo biológico do HPV

Condiloma acuminado

Proliferação induzida pelo HPV

Epitélio escamoso estratificado

Região genital

Perianal

Boca

Laringe

Raramente progride em câncer

Lesão intra-epitelial cervical

A infecção ativa pelo HPV pode provocar mudanças nascélulas infectadas da cérvice uterina

Neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC)

Lesões precursoras do câncer cervical

Maioria das lesões leve e moderada é propensa à regressão

Persistência dos genótipos associada a lesões de alto grau

Lesão intra-epitelial cervical

Câncer cervical (CA cervical)

Segunda malignidade mais comum em mulheres nomundo

Estimativas mundiais relataram 500.000 casos novos porano de câncer de colo de útero

90% em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento

1.500 mulheres desenvolverão a doença

Porto AlegreIncidência de 200/100.000 mulheres

Estimativas para o Brasil em 2010:

Estado do Rio Grande do Sul

Incidência de 18.430 casos

Risco estimado de 18 casos a cada 100.000 mulheres

99,7% dos carcinomas apresentam DNA-HPV alto grau

HPV-16, -18, -45, -31, -33, -52, -58 e -35

90% dos casos de CA cervical no mundo

HPV-16: metade dos casos

Métodos de diagnóstico

Tríade clínica

Reação em cadeia da polimerase (PCR)Captura Híbrida (HC)

Colposcopia HistopatologiaCitologia oncológica

Clínico:

Identificação Molecular:

5.5 milhões de pessoas são infectadas por HPV/ano

75% da população já foi infectado por HPV genital

Prevalência entre 28-46%

Centro de prevenção e controle de doenças (CDC):

Idade inferior à 25 anos

90% dessas infecções

Eliminadas espontaneamente pelo sistema imune dentrode 24 meses

Prevalência da infecção clínica e subclínica é baixa

0,7-2,9%

Maior entre jovens sexualmente ativos, entre 25 e 35 anosde idade

Vacinas contra o HPV

Profiláticas

Previnem a infecção por HPV e doenças associadas

VLP (virus like particles)

Terapêuticas

Induzem a regressão das lesões ou remissão do CAcervical avançado

Antígenos virais (E6 e E7)

Vacinas contra o HPV

Brasil, agosto de 2006:

Aprovação da vacina quadrivalente recombinante

HPV-6, -11, -16 e -18

Meninas e mulheres de 9 a 26 anos de idade

Proteção contra verrugas genitais e as lesões precursorasdo câncer

Características Gerais do HPV

Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV)

Família: Papillomaviridae

Gênero: Papillomavirus

Não envelopado

DNA fita dupla circular

55 nm de diâmetro

8 kb

Biologia Molecular do HPV

Regiões que codificam a proteína viral

Filamento positivo

Transcreve o mRNA para 10 ORFs

Precoce (E)

Tardia (L)

Genoma do HPV

Genoma do HPV-16 e arranjo das proteínas precoces (E) e tardias (L)

HPV-16

Polimorfismo do p53

Códon 72

Arginina (CGC; Arg72)

Prolina(CCC; Pro72)

Arg/Arg p53 Arg/Pro p53 Pro/Pro p53

Polimorfismo do p53

Storey (1998)

Genótipo Arg/Arg

Risco 7 vezes

Genótipo Pro/Pro

Não apenas a infecção por HPV

Mudança estrutural na p53

Seleção de mulheres com alto risco para CA

Forma epissomalForma integrada

Instabilidade celular Anomalias neoplásicas

Mutações

Ação sobre p53 e pRb

E6E7

Propriedades Dano ao DNA

S (síntese)Replicação do DNA

G2

M

R (checkpoint stop)Checagem do estado do

DNA

G1 (gap)

Ativação do p53 Mecanismos independentes

de p53

S (síntese)Replicação do DNA

Propriedades

G2

M

G1 (gap)

Dano ao DNA

R (checkpoint stop)Checagem do estado do

DNAInibidores de ciclina/CDK

p27

p16p21

Ponto R (fase G1)Recuperação do

DNA

Ativação do p53 Mecanismos independentes

de p53

Inibidores de ciclina/CDK

p27

p16p21

Ponto R (fase G1)Recuperação do

DNA

DNA recuperado

DNA não-recuperado

Propriedades Dano ao DNA

S (síntese)Replicação do DNA

G2

M

R (checkpoint stop)Checagem do estado do

DNA

G1 (gap)

Ativação do p53 Mecanismos independentes

de p53

DNA recuperado

DNA não-recuperado

Apoptose

Propriedades Dano ao DNA

S (síntese)Replicação do DNA

G2

M

R (checkpoint stop)Checagem do estado do

DNA

G1 (gap)

Inibidores de ciclina/CDK

p27

p16p21

Ponto R (fase G1)Recuperação do

DNA

Dano ao DNA

Ativação do p53 Mecanismos independentes

de p53

DNA recuperado

DNA não-recuperado

Apoptose

Ciclina/CDKativado

Sinaliza célulaa continuar

Propriedades

S (síntese)Replicação do DNA

G2

M

R (checkpoint stop)Checagem do estado do

DNA

G1 (gap)

Inibidores de ciclina/CDK

p27

p16p21

Ponto R (fase G1)Recuperação do

DNA

Expressão gênica e câncer cervical

p53 Apoptose na fase S do ciclo celular

E6

Tumorigênese

Regulação da transcrição

Ativação da telomerase

Retardo na diferenciação dos queratinócitos

Expressão gênica e câncer cervical

G0

G2

S

G1

Rb

E2F

Rb

E7

E2F

DP1

DP1

Transcrição

Gharizadeh et al. (2001)

Sistema rápido, confiável e robusto

Adequado para a triagem clínica de rotina com um

grande número de amostras

Facilmente adaptado para a automação de laboratório

Também permite a detecção de

um amplo espectro de HPV,

incluindo putativos novos

genótipos e mutações

PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic human papillomaviruses

Testes de DNA-HPV Baixa especificidade

Prevalência de HPV

Mulheres com CA

Região L1

PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic human papillomaviruses

PreTectTM HPV-Proofer

PCR Real-time multiplex

Vantagem de detectar mRNA E6/E7

HPV oncogênicos

HPV-16, -18, -31, -33 e -45

Monitorar persistência da infecção

Identificar infecções HPV com potencial transformador

Câncer cervical: genótipos oncogênicos de HPV e polimorfismo da p53 do códon 72

Prevalência da infecção pelo HPV

Investigar dos genótipos presentes

Determinar a prevalência de polimorfismo da p53 nocódon 72

Polimorfismo da p53 Genótipos oncogênicos do HPV

Maior risco para CA

Risco agravado quando associado aos fatores sociodemográficos ?

Tem relação???

Dois momentos:

Estudo transversal, composto por 1100 mulheres, no qualse buscará

Investigar a prevalência de HPV,

Genótipos mais freqüentes

Presença do polimorfismo na p53 do códon 72

Associação entre polimorfismo da p53 e genótiposoncogênicos

Estudo de coorte

Acompanhará pelos próximos dois anos, a cada seismeses,

100 pacientes HIV positivas, positivas para HPV semalterações citopatológicas

Investigar se a persistência da infecção por HPV,

associada à mutação da p53 apresenta maior risco ao

desenvolvimento de câncer cervical.

Serviço de Ginecologia – Faculdade de Medicina / UFPel

FAMED / SAE

Aplicação questionário padronizado

Coleta de amostra secreção cervical

Mulheres que buscarem atendimento nos serviços

de Ginecologia(N = 1100)

Acondicionamento das amostras

Laboratório Genômica Funcional

Serviço de Ginecologia – Faculdade de Medicina / UFPel

Análise laboratorial

Extração do DNA genômico

Nested-PCR (nPCR)

Primers MY 09/11

Primers GP5+/6+

Seqüenciamento dos genótipos do HPV

PCR da p53

Análise dos fragmentos de restrição (RFLP) da p53

Enzima Tha I - HELENA

Região L1 do HPV

Éxon 4

Primers utilizados na amplificação do HPV e região amplificada (L1)

Alta a prevalência por HPV em mulheres na cidade dePelotas

Desconhecida no âmbito molecular

Prevalência dos genótipos

Tais determinações poderão contribuir como medidas deprevenção e controle da infecção.

DNA HPV30% HIV negativas

90% HIV positivas

Comportamento de risco compartilhado para ambas asinfecções

Susceptibilidade ao HPV devido ao comprometimento dosistema imune.

Alelos Arg/Arg Lesão intra-epitelial escamosa (SIL)

Maior risco para o desenvolvimento de CA cervical

Espera-se que com os resultados apresentados

Úteis no futuro

Diagnóstico complementar ao citopatológico e colposcopia

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 7Figura 6

Figura 8

Figura 9