UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ANÁLISE … · Crz1p - Fator de transcrição que ativa genes...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO GÊNICA NAS CEPAS SELVAGEM W303 E pkc1∆ DE Saccharomyces cerevisiae DURANTE O

PROCESSO DE DESREPRESSÃO METABÓLICA AUTOR: ANTÔNIO HELVÉCIO TÓTOLA

ORIENTADOR: PROF.DR. ROGELIO LOPES BRANDÃO Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências .

Ouro Preto, Outubro de 2007.

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biologia celular e Molecular do Núcleo de

Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto (NUPEB), sob

a orientação do professor Dr. Rogelio Lopes Brandão e com o auxílio financeiro da

Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Universidade Federal de

Ouro Preto.

II

“Cantar e cantar e cantar, A beleza de ser um eterno aprendiz”.

Dedico este trabalho Ao meu pai, grande pescador! “In memorian”.

A minha mãe, que sempre me incentivou e me serviu de exemplo! A Cristiane, minha companheira, amiga e mulher que sempre esteve ao meu lado mesmo quando era difícil. Seu amor e paciência me trouxeram até aqui. Te amo, sempre!

A minha filha Maria Clara, luz da minha vida!

III

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador professor Dr. Rogelio Lopes Brandão, pela confiança e pelo

exemplo.

Ao meu amigo professor Dr. Ieso de Miranda Castro, pelo apoio e suporte em

todos os momentos.

Ao amigo professor Dr.Luciano Gomes Fietto pela amizade e disponibilidade

para discutir as idéias, os resultados e as divagações.

A amiga professora Dra. Juliana Rangel Fietto, pela ajuda e pela amizade.

A Zezé, grande microbiologista do LBCM, sempre pronta a ajudar e sempre

trazendo alegria ao laboratório.

Ao Eduardo e demais colegas do LIP, pela ajuda e pelo papo sempre alegre

(principalmente quando o Cruzeiro ganhava ou o Galo perdia).

Aos amigos e colegas do LBCM, que sempre se mostraram dispostos a ajudar e

colaborar, mesmos nos momentos mais difíceis.

À Cida, sempre alegre e disposta a ajudar no que for necessário.

Aos professores, funcionários e alunos dos laboratórios do NUPEB, pela

convivência e amizade.

Aos alunos de graduação, pelo aprendizado e convivência. Ao

curso de pós-graduação pela oportunidade.

A minha família pelo apoio e incentivo. IV

RESUMO

A levedura Saccharomyces cerevisiae possue uma via MAP quinase de

transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi

descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na

resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do

metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no

controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono.Para isto, fizemos

uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a

resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1

∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma

diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e

oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por

RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303

quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆

quando comparada com a cepa selvagem. Análises “In silico” apontaram três fatores de

transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da

expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β-

galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram

que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1 ∆ para o gene

HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a

cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída

na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303.

V

Nossos resultados confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão

gênica durante o processo de desrepressão metabólica.

VI

ÍNDICE

RESUMO... ........................................................................................................ V ABSTRACT... ..................................................................................................VII LISTA DE ABREVIAÇÕES............................................................................... X LISTA DE TABELAS... ................................................................................. XIV LISTA DE FIGURAS... ................................................................................... XV

1. Introdução... ........................................................................................................ 2 1.1. O modelo experimental: a levedura Saccharomyces cerevisiae... ........................... 2 1.2. O genoma da levedura Saccharomyces cerevisiae... .............................................. 4 1.3. O metabolismo de fontes de carbono na levedura Saccharomyces

cerevisiae... .......................................................................................................... 6 1.4. A transdução de sinais na levedura Saccharomyces cerevisiae... .......................... 10 1.4.1. As vias MAPK (Proteínas quinases ativadas por mitógenos) na levedura

Saccharomyces cerevisiae... ............................................................................... 11 1.4.2. A transdução de sinais na conjugação em leveduras: resposta aos

ferormônios... .................................................................................................... 12 1.4.3. A transdução de sinais envolvidos na resposta ao estresse osmótico..................... 14 1.4.4. A via HOG (High Osmolarity Glycerol) em resposta ao estresse

hipertônico... ...................................................................................................... 15 1.4.5. A via de integridade celular em resposta ao estresse hipotônico... ........................ 17

2. Objetivos... ........................................................................................................ 22 2.1. Objetivo geral... ................................................................................................. 23 2.2. Objetivos específicos... ...................................................................................... 23

3. Materiais e Métodos... ........................................................................................ 25 3.1. Microorganismos utilizados nos experimentos... ................................................. 25 3.1.1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae... ................................................................. 25 3.1.2. Procedência das cepas de Saccharomyces cerevisiae... ........................................ 25 3.1.3. Cepa de bactéria... .............................................................................................. 25 3.2. Plasmídeos LacZ repórter... ................................................................................ 25 3.3. Meios de cultura e condições de crescimento... ................................................... 26 3.3.1. Meios de cultura... ............................................................................................. 26 3.3.1.1. Meio LB (Luria - Bertaine)................................................................................. 26 3.3.1.2. Meio YP... ......................................................................................................... 26 3.3.1.3. Meio mínimo SD... ............................................................................................ 26 3.3.2. Condições de crescimento... ............................................................................... 27 3.4. Transformação de bactérias e leveduras... ........................................................... 27 3.4.1. Preparação de células de bactérias competentes................................................... 27 3.4.2. Transformação de bactérias... ............................................................................. 27 3.4.3. Mini preparação de DNA plasmidial de bactéria... .............................................. 28 3.4.4. Preparo de células de levedura competentes... ..................................................... 28 3.4.5. Transformação de leveduras... ............................................................................ 29 3.5. Determinação da atividade enzimática da Invertase e da β -Galactosidase.. 30

VIII

3.5.1. Inóculo e crescimento das células.............................................................................. 30 3.5.2. Preparo de extratos celulares para a determinação da atividade enzimática

da Invertase e β - Galactosidase... ............................................................................. 30 3.5.3. Dosagem da Invertase... ............................................................................................. 30 3.5.4. Dosagem da β-Galactosidase..................................................................................... 31 3.6. Dosagem de proteína... .............................................................................................. 31 3.7. Extração do RNA Total... .......................................................................................... 31 3.7.1. Inóculo e crescimento das células.............................................................................. 31 3.7.2. Extração do RNA... .................................................................................................... 31 3.7.3. Eletroforese em gel de agarose... ............................................................................... 32 3.7.3.1. Preparação das amostras de RNA para corrida no gel... ........................................... 32 3.7.3.2. Montagem do gel para corrida de RNA... ................................................................. 32 3.8. Ensaios de microarranjos de DNA... ......................................................................... 33 3.8.1. Micro arranjos de DNA... .......................................................................................... 33 3.8.2. Marcação do cDNA para Micro arranjos... ............................................................... 34 3.8.3. Degradação do mRNA (Hidrólise alcalina)... ........................................................... 35 3.8.4. Purificação da sonda de cDNA... ............................................................................... 35 3.8.5. Reação de marcação com CyDye... ........................................................................... 36 3.8.6. Quantificação da sonda marcada... ............................................................................ 36 3.8.7. Hibridização manual... ............................................................................................... 37 3.8.8. Lavagens... ................................................................................................................. 37 3.8.9. Leitura das lâminas... ................................................................................................. 38 3.8.10. Análise estatística... .................................................................................................... 38 3.9. Reação em cadeia da polimerase em tempo real... .................................................... 39 3.9.1. Introdução... ............................................................................................................... 39 3.9.2. Obtenção dos cDNAs... ............................................................................................. 39 3.9.3. Desenho dos Iniciadores... ......................................................................................... 39 3.9.4. Reação da polimerase em cadeia... ............................................................................ 40 3.9.5. Análise dos resultados... ............................................................................................ 40

4. Resultados e discussão... ............................................................................................ 42 4.1. Análise dos experimentos de microarranjos de cDNA... .......................................... 42 4.2. Reação em cadeia da polimerase em tempo real - (RT-PCR)... ................................ 53 4.3. Análise “in silico” dos genes diferencialmente expressos... ..................................... 58 4.4. Análise da atividade de ß-galactosidase das construções CYC1-ß-Gal,

HXT1-ß-Gal e SUC2- ß-Gal...................................................................................... 64

5. Conclusões... .............................................................................................................. 70

6. Perspectivas... ............................................................................................................. 73

7. Referências Bibliográficas……………………………………………….. 75

IX

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ARG82 - Gene que codifica para uma Inositol polifosfato multiquinase (IPMK), fosforila Ins

(1,4,5)P3 formando Ins(1,3,4,5,6)P5;

BEM2 - Gene que codifica para uma proteína Rho GTPase envolvida no controle da

organização do citoesqueleto e da morfogênese celular

Cdc24 - Gene que codifica para um fator de troca de guanina para Cdc42p

CLN1 - Gene que codifica para uma ciclina envolvida na regulação do ciclo celular; ativa a

quinase Cdc28p e promove a transição da fase G1 para S.

CLN2 - Gene que codifica para uma ciclina envolvida na regulação do ciclo celular; ativa a

quinase Cdc28p e promove a transição da fase G1 para S

COX14 - Gene que codifica para uma proteína da membrana mitocondrial, necessária à

montagem da citocromo oxidase.

Crz1p - Fator de transcrição que ativa genes envolvidos na resposta ao estresse.

CSD2 - Gene que codifica para uma quitina sintase que catalisa a transferência de N-

acetilglicosamina para a quitina.

CYB2 - Gene que codifica para o Citocromo b2; reprimido por glicose e condições

anaeróbicas.

CYC1 - Gene que codifica para o Citocromo c, isoforma 1; transportador de elétrons do

espaço intermembranas da mitocôndria.

DLD1 - Gene que codifica para a D-lactato desidrogenase, oxida D-lactato a piruvato;

reprimida por glicose.

FKS1 - Gene que codifica para uma subunidade catalítica do complexo 1,3-beta-D-

glucano sintase; envolvida na sintese e manutenção da parede celular.

FKS2 - Gene que codifica para uma subunidade catalítica do complexo 1,3-beta-D-

glucano sintase; envolvida na formação da camada interna da parede celular.

FUM1 - Gene que codifica para a Fumarase; converte acido fumárico a acido L-málico no

ciclo dos ácidos tricarboxílicos.

Gcr1p - Fator de transcrição envolvido na regulação da glicólise

GLC3 - Gene que codifica para uma enzima ramificadora do glicogênio

Gpa1p - Proteína G de membrana envolvida na conjugação de leveduras

X

GPT2 - Gene que codifica para a Glicerol-3-fosfato/dihidroxiacetona fosfato

aciltransferase envolvida na acilação de glicerol-3-fosfato e dihidroxiacetona fosfato

durante a síntese de lipídeos.

GRE1 - Gene que codifica para uma Hidrofilina de função desconhecida, induzida por

estresse; regulada pela via HOG.

GUT1 - Gene que codifica para a Glicerol quinase, converte glicerol a glicerol-3-fosfato

GUT2 - Gene que codifica para am Glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial;

reprimida por glicose e cAMP

Hog1p - Proteína quinase ativada por mitógenos envolvida na síntese de glicerol

Hxk2p - Proteína Hexoquinase P2, que catalisa a fosforilação de glicose no citosol.

ICL2 - Gene que codifica para uma 2-metilisocitrato liase da matriz mitocondrial, catalisa a

conversão de 2-metilisocitrato a succinato e piruvato.

JEN1 - Gene que codifica para um transportador de lactato, necessário à captação de

lactato e piruvato; reprimido por glicose.

MDH2 - Gene que codifica para a Malato desidrogenase citoplasmática; catalisa a

interconversão de malato e oxalacetato; interage com Pck1p e Fbp1p

Mid2p - Proteína da membrana plasmática que atua como sensor da via de integridade

celular; interage com Rom2p e com a proteína Zeo1p

Mig1p - Proteína repressora estimulada por glicose

MNN1 - Gene que codifica para uma Alfa-1,3-manosiltransferase do complexo de Golgi

responsável pela formação de ligações alfa1,3-manose em oligossacarídeos N e O

ligados.

Msb2p -Membro da família das mucinas, participa na via de crescimento filamentoso

dependente de Cdc42p e da via de MAP quinases.

Msn5p - Exportina envolvida na translocação do fator Mig1 p

Pak1p - Serina-Treonina quinase do complexo SNF1;parcialmente redundante a Elm1p e

Tos3p;

PCL1 - Gene que codifica para uma Ciclina envolvida na entrada do ciclo mitótico e na

regulação da morfogênese

PCL2 - Gene que codifica para uma Ciclina envolvida na entrada do ciclo mitótico e na

regulação da morfogênese

XI

PDC1 - Gene que codifica para a Piruvato descarboxilase, enzima envolvida na

fermentação alcoólica; descarboxila piruvato a acetaldeído

PFK2 - Gene que codifica para a Fosfofrutoquinase 2, envolvida na glicólise e

indispensável para o crescimento em anaerobiose; ativada por frutose 2,6-bisfosfato e

AMP.

PLC1 - Gene que codifica para a Fosfolipase C, hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

(PIP2) para gerar inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e 1,2-diailglicerol (DAG)

PYC1 - Gene que codifica para a Piruvato carboxilase, enzima citoplasmática que

converte piruvato a oxalacetato

Ras - CDC42 - Proteína ativadora da enzima adenilato ciclase

Reg1p-Glc7p - Subunidades regulatórias envolvidas na regulação negativa de genes

reprimidos por glicose.

Rga1p - Proteína ativadora de GTPase

RHR2 - Gene que codifica para uma isoforma constitutivamente expressa da

DLglicerol-3-fosfatase; envolvida na biossíntese do glicerol; induzida em condições

anaeróbicas e por estresse osmótico.

Rlm1p - Regulador gênico envolvido na síntese da parede celular

ROM1 - Gene que codifica para uma proteína que atua como fator de troca GDP/GTP

ROM2 - Gene que codifica para uma proteína que atua como fator de troca GDP/GTP

para Rho1p e Rho2p

RSF2 - Gene que codifica para uma proteína do tipo dedo de zinco, envolvida no

controle transcricional de genes mitocondriais e nucleares necessários ao crescimento em

glicerol.

SAC7 - Gene que codifica para uma proteína ativadora da GTPase para Rho1p, envolvida

com o citoesqueleto de actina.

SDH1 - Gene que codifica para uma Flavoproteína do complexo da succinato

desidrogenase, participa na transferência de elétrons para a ubiquinona

Sho1p - Sensor osmótico transmembrana, participa na ativação de Cdc42p, do

crescimento filamentoso dependente da via de MAP quinases e da via HOG.

Slg1p -Sensor da via de resposta ao estresse ativada por PKC1-MPK1;envolvida na

manutenção da integridade da parede celular e na organização do citoesqueleto.

XII

SLN1 - Gene que codifica para um sensor osmótico que regula a cascata das MAP

quinases

Slt2p - Serina-treonina Map quinase envolvida na regulação da manutenção da parede

celular e na progressão do ciclo celular. Regulada pela via de PKC1.

Snf1p - Proteína quinase envolvida na via principal de repressão por glicose

Snf4p - Subunidade ativada da proteína Snf1;ativa genes reprimidos por glicose e reprime

genes induzidos por glicose.

Sok2p - Proteina nuclear que desempenha um papel regulatório na via de PKA

dependente de AMP cíclico; regula negativamente o crescimento de pseudo-hifas

Ssk2p - Gene que codifica para uma MAPKKK envolvida na síntese de glicerol; interage

com Ssk1p, induzindo a ativação de Ssk2p.

Ssk22p - Gene que codifica para uma MAPKKK envolvida na síntese de glicerol;

homologo a Ssk2p.

Ssn6p-Tup 1p - Co-repressores transcricionais do complexo que recruta SWI/SNF e

SAGA

Ste12p - Fator de transcrição ativado pela via das MAP quinases, ativa genes envolvidos na

conjugação e no crescimento de pseudohifas.

Ste11p Proteína quinase quinase quinase envolvida na conjugação de leveduras

STE2 - Gene que codifica para o receptor do fator α de acasalamento

Ste20p - Proteína quinase envolvida na conjugação de leveduras

STE3 - Gene que codifica para o receptor do fator a de acasalamento

SUC2 -Gene que codifica para a invertase

Swi4p-Swi6p - Componentes do complexo SBF de ligação ao DNA; ativador

transcricional que regula a transcrição de genes necessários à síntese e reparo do DNA.

TKL2 - Gene que codifica para uma transcetolase, similar a Tkl1p; catalisa a conversão de

xilulose-5-fosfato e ribose-5-fosfato a sedoheptulose-7-fosfato e gliceraldeído-3-

fosfato na via das pentoses fosfato.

TOR2 - Gene que codifica para uma proteína quinase do complexo TORC1, que regula o

crescimento em resposta a nutrientes; envolvida na meiose.

YDR 019c - Gene que codifica para uma subunidade do complexo da glicina

descarboxilase mitocondrial

XIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Classificação taxonômica da levedura Saccharomyces cerevisiae

Tabela 02 Marcos histórico da utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae

Tabela 03 Processos e produtos obtidos com o emprego da levedura Saccharomyces cerevisiae

Tabela 04 Receptores e transportadores funcionais de glicose na levedura Saccharomyces cerevisiae

Tabela 05 Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos experimentos Tabela 06 Plasmídeos LacZ repórter

Tabela 07 Iniciadores utilizados nos experimentos de RT-PCR para validação dos experimentos de microarranjos de DNA

Tabela 08 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Sok2p

Tabela 09 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Crz1p

Tabela 10 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Gcr1p XIV

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Principais laboratórios envolvidos no projeto genoma da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Figura 02 Proteínas da membrana plasmática de células eucarióticas envolvidas na

detecção de nutrientes

Figura 03 Vias de MAPK presentes em Saccharomyces cerevisiae

Figura 04 Via de resposta aos hormônios de acasalamento

Figura 05 Mecanismos de adaptação aos choques hipertônico e hipotônico em Saccharomyces cerevisiae

Figura 06 Via HOG (High Osmolarity Glycerol) in Saccharomyces cerevisiae

Figura 07 Distribuição esquemática dos domínios na proteína Pkc1p

Figura 08 Representação esquemática dos principais componentes da via de Pkc1p de Saccharomyces cerevisiae

Figura 09 Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os cDNAs da cepa W303.

Figura 10 Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os cDNAs da cepa Pkc1Δ.

Figura 11 Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303

Figura 12 Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa Pkc1Δ

Figura 13 Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas

obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303 Figura 14 Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas

obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa Pkc1Δ Figura 15 Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da

cepa selvagem W303

Figura 16 Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da cepa pkc1 ∆.

XV

Figura 17 Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono nas cepas W303 e Pkc1Δ.

Figura 18 Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono selecionados através dos ensaios de microarranjos de DNA para validação por RT-PCR

Figura 19 Resultado da análise por RT-PCR da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono nas cepas W303 e Pkc1Δ

Figura 20 Curvas de dissociação das reações de RT-PCR

Figura 21 Atividade de ß-galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das cepas W303 e pkc1 Δ transformadas com a construção CYC1-ß- Galactosidase

Figura 22 Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das cepas W303 e pkc1 Δ transformadas com a construção HXT1 - ß- Galactosidase

Figura 23 Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das cepas W303 e pkc1 Δ transformadas com a construção SUC2 - ß- Galactosidase

Figura 24 Atividade de invertase (em nmoles de Glicose/min/mg de proteína) das cepas W303 e pkc1 Δ transformadas com a construção SUC2 - ß- Galactosidase

XVI

1

INTRODUÇÃO

2

1-Introdução

1.1-O modelo experimental: a levedura Saccharomyces cerevisiae

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um fungo unicelular, pertencente ao filo

Ascomycota (Tabela 01) com formato redondo ou oval, medindo aproximadamente de 5

a 10 µm de diâmetro, sendo um dos modelos de organismo eucariótico mais estudados

em biologia celular e molecular.

Os estudos empregando S. cerevisiae como modelo experimental receberam um

forte impulso no final da década de 70 com o desenvolvimento da técnica de

transformação de fungos (Hinnen e cols., 1978). Algumas das propriedades que tornam

as leveduras tão interessantes como modelo experimental incluem a fácil obtenção, o

rápido crescimento na forma de células dispersas, um sistema genético bem definido, a

facilidade de transformação, replicação e isolamento de mutantes, seu genoma

completamente seqüenciado (Dujon, 1996) (Goffeau e cols., 1996), ser relativamente

estável tanto no estado haplóide quanto diplóide, além de não ser patogênico, dentre

outras.

Classificação Taxonômica Reino Fungi Filo Ascomycota Subfilo Saccharomycotina Classe Saccharomycetes Ordem Saccharomycetales Kudrjanzev, 1960 Família Saccharomycetaceae G. Winter, 1881 Gênero Saccharomyces Meyen Espécie Saccharomyces cerevisiae Hansen, 1883. Taxonomic Serial Nº 194157

Tabela 01: Classificação taxonômica da levedura Saccharomyces cerevisiae

Fonte: Integrated taxonomic information system (http://www.iti S. usda.gov)

Outro fator que deve ser levado em consideração é o fato de que uma vasta gama

de processos biológicos e funções celulares são altamente conservados e compartilhados

entre os fungos e organismos eucarióticos superiores, permitindo a utilização daqueles

como modelo no estudo comparativo desses processos. A possibilidade de

3

complementação com genes heterólogos (Atrian e cols., 1990; Smith e cols., 1990;

Wyckoff & Hsieh, 1988; Hensing e cols., 1995) e a facilidade de manipulação genética

dos fungos fazem dos mesmos um excelente sistema para o entendimento das funções

biológicas de produtos gênicos de outros organismos eucarióticos.

Além dos fatores descritos acima, deve-se levar em consideração a utilização de

Saccharomyces cerevisiae em uma vasta gama de processos industriais e

biotecnológicos (Ro e cols., 2006; Ostergaard e cols., 2000; Weber & Barth, 1988;

Maraz, 2002), além de constituir-se num dos mais antigos organismos domesticados

pelo ser humano, tendo sido empregada desde os primórdios da civilização (Tabela 02).

Tabela 02: Marcos histórico da utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Nos dias atuais, S. cerevisiae é utilizada na indústria alimentícia (Moreno-

Arribas & Polo, 2005; Chae e cols., 2001; Doores, 1983; Rose, 1981), na obtenção de

etanol (Bayrock & Michael, 2001; Taylor e cols., 2000; Taylor e cols., 1995), na

indústria farmacêutica para a produção de uma vasta gama de produtos (Maraz, 2002;

Masimirembwa e cols., 1999; Rombaut & Jore, 1997; Gill & Zaworski, 1991), em

pesquisas ambientais (Schofield e cols., 2007; Radhika e cols., 2007; Radhika e cols.,

2005)e no estudo bioquímico e biológico conforme descrito acima.

Cronologia Marcos históricos 6000-2000 AC Fermentação (Suméria, Babilônia) 1680 Levedura sob o microscópio (Van Leeuwenhoek) 1835 Fermentação alcoólica associada com a levedura 1837 Nome (S. cerevisiae) criado para as leveduras observadas no malte 1839 Açúcar com fonte de crescimento para leveduras 1857 Fermentação correlacionada com metabolismo (Pasteur) 1877 Introdução do termo Enzima (na levedura) por Kuhne 1880 Isolamento de cepas puras de levedura (Hansen) 1883 Produção de álcool e CO2 em extrato livre de células (Buchner) 1915 Produção de Glicerol 1949 Primeiro mapa genético (Lindegren); Sistema de conjugação e

acasalamento. 1930-1960 Taxonomia de leveduras por Kluyver 1960 Primeira estrutura de tRNA de levedura 1978 Primeira transformação em leveduras (Finck e cols..) 1990-1994 Primeiro produto farmacêutico a partir de levedura (vacina da hepatite B) 1990-1996 Seqüenciamento completo do genoma de S. cerevisiae

4

Na Tabela 03, podemos observar alguns dos processos e produtos obtidos com a

utilização de S. cerevisiae.

. Área Processos e produtos Indústria Química e de alimentos Enzimas

Fermento Acidulantes Redutores químicos

Indústria de fermentação Etanol Glicerol Vinho, cerveja, aguardentes. Panificação

Biomedicina Pesquisas em: Câncer, AIDS. Metabolismo de drogas Testes de genotoxicidade Desordens genéticas humanas

Meio ambiente Bioremediação Processos de reciclagem Bioadsorção de metais

Indústria Farmacêutica Probióticos Vacinas Hormônios Fatores de coagulação Fatores de crescimento Outros

Pesquisas biológicas Biologia celular Biologia molecular Genética Bioquímica Outros

Tabela 03: Processos e produtos obtidos com o emprego da levedura Saccharomyces

cerevisiae

1.2-O genoma da levedura Saccharomyces cerevisiae

A levedura S. cerevisiae contem um conjunto haplóide de 16 cromossomos com

tamanho variando entre 200 e 2200 KB. A seqüência completa do DNA cromossomal,

constituída de 12.052 KB foi descrita em 1996 (Dujon,1996;Goffeau e cols.,1996).

Contrastando com o genoma de organismos multicelulares, o genoma da levedura é

altamente compactado, onde os genes representam aproximadamente 72% da seqüência

total. O tamanho médio dos genes é de 1.45Kb ou 483 códons. Aproximadamente 3,8%

5

das janelas abertas de leitura contêm íntrons. Das 6.183 janelas abertas de leitura

descritas, compostas por mais que 100 aminoácidos, cerca de 5.800 correspondem a

possíveis genes que codificam para proteínas. Destas, cerca de 30% já foram

caracterizadas experimentalmente e 35% correspondem a genes que codificam para

proteínas que são relacionadas estruturalmente com produtos gênicos já caracterizados

em outros fungos ou organismos.

O RNA ribossômico é composto por aproximadamente 120 cópias arranjadas em

seqüência no cromossomo XII e os tRNAs são codificados por 262 genes, dos quais 80

possuem íntrons. O DNA de S. cerevisiae contém ainda uma série de elementos móveis

ou retro-transposons, que variam em quantidade e posição de acordo com as diferentes

cepas de levedura. O DNA mitocondrial tem aproximadamente 85Kb e contem os genes

que codificam para as subunidades I, II e III da citocromo C oxidase, apocitocromo b,

subunidades 6, 8 e 9 da ATPase e uma proteína associada ao ribossomo. Codifica ainda

para as unidades pequena e grande do RNA ribossomal, 24 RNAs transportadores e o

RNA 9 S. É caracterizado por um baixo conteúdo de GC (17%), possuindo uma grande

porção de regiões intergênicas representando 62% do mtDNA (Langkjaer e cols., 2003).

A Figura 01 representa um diagrama esquemático com os laboratórios

envolvidos no projeto de seqüenciamento do genoma da S. cerevisiae, publicado em

1996, com os 16 cromossomos em ordem decrescente de tamanho. As unidades

repetitivas estão representadas por boxes brancos nos cromossomos XII, IV e VIII

respectivamente.

6

Figura 1: Principais laboratórios envolvidos no projeto genoma da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Fonte – Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on basic features and novel aspects; 2005.

1.3-O metabolismo de fontes de carbono na levedura Saccharomyces cerevisiae.

As leveduras são organismos bem adaptados às mais variadas mudanças nas

condições ambientais, tendo desenvolvido uma série de mecanismos para responder às

mesmas. Uma vez que a disponibilidade de nutrientes no meio nunca é constante, as

leveduras devem se adaptar a estas variações e responder a elas modulando seu

metabolismo e seu crescimento (Holsbeeks e cols., 2004a) (Newcomb e cols., 2003).

Embora seja capaz de utilizar uma grande variedade de fontes de carbono a

levedura S. cerevisiae utiliza a glicose como sua fonte preferencial de carbono e energia

7

(Gancedo, 1998a; Mashego e cols., 2005). O metabolismo de glicose nas leveduras é

realizado principalmente através da fermentação alcoólica, mesmo sob condições de

aerobiose (Holm e cols., 2001). Embora a fermentação produza uma menor quantidade

de ATP por mol de açúcar, ela se processa a uma velocidade bem maior, trazendo uma

grande vantagem competitiva à levedura, principalmente porque o etanol produzido

durante a fermentação inibe o crescimento de outros microrganismos capazes de

competir com a levedura pelas fontes de carbono disponíveis. O etanol produzido pode

ainda ser utilizado através do metabolismo aeróbico, resultando na utilização completa

de todo o carbono presente no meio.

A capacidade que a levedura tem de detectar a flutuação dos níveis de glicose no

meio externo pode ser explicada pela presença de receptores de glicose na sua superfície

celular (Tabela 04).

Nome do gene ORF Descrição HXT1 YHR094C Transportador de hexose de baixa afinidade HXT2 YMR011W Transportador de hexose com baixa afinidade por

glicose HXT3 YDR345C Transportador de hexose de baixa afinidade HXT4 YHR092C Transportador de hexose de afinidade baixa a moderada HXT5 YHR096C Proteína da família Hxt com atividade transportadora

intrínseca HXT6 YDR343C Transportador de hexose de alta afinidade HXT7 YDR342C Transportador de hexose de alta afinidade HXT14 YNL318C Proteína da família de transportadores de açúcar capaz

de suportar o crescimento em galactose GPR1 YDL035C Receptor para glicose e sacarose acoplado à proteína G SNF3 YDL194W Sensor de glicose em baixas concentrações, semelhante

aos transportadore S. RGT2 YDL138W Sensor de glicose em altas concentrações, semelhante

aos transportadore S.

Tabela 04: Receptores e transportadores funcionais de glicose na levedura Saccharomyces cerevisiae. Fonte – SGD (Saccharomyces genome Database) http://www.yeastgenome.org

Além dos diversos transportadores de glicose, as células de S. cerevisiae

possuem dois tipos de sensores que detectam a presença de glicose, sendo um de baixa

(Rgt2p) e outro de alta afinidade (Snf3p) (Johnston & Kim, 2005) (Ozcan e cols., 1998).

Estes sensores são membros da família de transportadores de glicose com similaridade

parcial com os outros membros, possuindo longas caudas C - terminais citoplasmáticas.

Rgt2p e Snf3p não são capazes de atuar diretamente como transportadores de glicose;

8

entretanto, agem como sensores extracelulares de glicose envolvidos no controle da

expressão dos genes dos transportadores, através do fator de transcrição Rgt1. Rgt2 é

necessário para a máxima indução da expressão do transportador HXT1 em altas

concentrações de glicose, enquanto Snf3p é requerido para a indução da expressão dos

genes que codificam para Hxt2p, Hxt3p e Hxt4p em baixas concentrações de glicose

(Kaniak e cols., 2004) (Ozcan & Johnston, 1999). RGT2 é expresso constitutivamente,

ao passo que SNF3 é reprimido por altas concentrações de glicose. As caudas

citoplasmáticas de Rgt2p e Snf3p parecem ser responsáveis pela habilidade que estas

moléculas têm de traduzir a presença de glicose no meio externo para o interior a célula.

A fusão da cauda de Snf3p com os transportadores Hxt1p e Hxt2p foi capaz de

converter estes transportadores em sensores funcionais de glicose, capazes de gerar o

sinal necessário à indução da expressão dos genes dos transportadores funcionais de

glicose (Ozcan e cols., 1998;Tropia e cols., 2006)

Nas leveduras, uma das vias metabólicas mais estudadas e conhecidas,

envolvidas na regulação da utilização de glicose é a via principal de repressão por

glicose. A presença de glicose no meio desencadeia uma série de processos regulatórios

direcionados à utilização mais eficiente da mesma. A glicólise é ativada levando à

conversão da glicose em etanol e CO2, enquanto a gliconeogênese é inibida. Ocorre um

aumento acentuado na taxa de crescimento celular, precedido do aumento na

concentração de RNA ribossomal e da síntese de proteínas. Os genes envolvidos no

metabolismo de outras fontes de carbono e na resposta ao estresse são rapidamente

reprimidos e os carboidratos de reserva são utilizados (Gancedo, 1998b).

Os componentes centrais da via principal de repressão por glicose são o

complexo repressor Mig1p, o complexo da proteína quinase Snf1p e a proteína fosfatase

I – Reg1-Glc7 (Gelade e cols., 2003; Schuller, 2003). Mig1p é uma proteína com

domínios do tipo dedos de zinco Cys2–His2, que na presença de altas concentrações de

glicose recruta as proteínas co-repressoras Ssn6p e Tup1p, levando à repressão de

diversas famílias de genes e de seus respectivos indutores transcricionais (Treitel &

Carlson, 1995). A atividade de Mig1p como repressor é regulada por sua localização

celular, o que ocorre através da fosforilação ou defosforilação do mesmo. Em altas

concentrações de glicose, Mig1p é desfosforilado pela proteína fosfatase I e concentra-

se no núcleo da célula, onde se liga aos promotores dos genes reprimidos por glicose.

Quando a concentração de glicose decresce, Mig1p é fosforilado pela quinase Snf1p,

promovendo a interação de Mig1p com a exportina Msn5p, o que faz com que seja

9

transportado rapidamente para o citoplasma, aliviando a repressão gênica(Elbing e cols.,

2004; Kim e cols., 2006)

Snf1p é uma proteína serina/treonina quinase que apresenta dois domínios, um

regulatório na região carboxi-terminal e outro catalítico na região amino-terminal e

encontra-se associada a uma subunidade ativadora (Snf4p) e a três proteínas de

estruturação do complexo de alta massa molecular (subunidades Sip1p, Sip2p e

Gal83p). A subunidade Snf4p é necessária para a atividade de Snf1p, ao passo que

Sip1p, Sip2p e Gal83p ajudam a manter a associação entre as duas e determinam a

localização celular do complexo (Papamichos-Chronakis e cols., 2004).

A ativação de Snf1p parece estar relacionada a uma mudança conformacional da

mesma. Na presença de glicose, o domínio regulatório carboxi-terminal promove a

auto-inibição do complexo quinase, associando-se ao domínio catalítico. Na ausência de

glicose, ocorre a fosforilação de Snf1p, através das quinases Pak1p, Tos3p e Elm1p

(Nath e cols., 2003), ocasionando uma mudança conformacional que permite a interação

de Snf4p com o domínio regulatório de Snf1p, dissociando o mesmo do domínio

catalítico e promovendo a ativação do complexo, que fosforila Mig1p, promovendo sua

translocação do núcleo para o citoplasma. Quando a glicose é novamente disponível, o

complexo da proteína fosfatase I Glc7-Reg1p defosforila Snf1p no resíduo treonina 210,

fazendo com que a mesma retorne a sua conformação auto-inibitória. Ao lado disso, foi

proposta a participação da Hxk2p no processo de repressão por glicose, através da

interação com Mig1p, formando um complexo repressor localizado no núcleo celular da

levedura S. cerevisiae. Este complexo se ligaria aos promotores de diversos genes

reprimidos por glicose, reprimindo a transcrição dos mesmos (Ahuatzi e cols., 2004) .

Na ausência de glicose, outros carboidratos também podem ser utilizados por S.

cerevisiae como fonte de carbono e energia. Dentre eles podemos citar a frutose, a

manose, a galactose, a maltose, a sacarose entre outros. Frutose e manose são utilizadas

de modo semelhante à glicose, sendo que a galactose não é uma fonte usual de energia

para S. cerevisiae. Os genes envolvidos no metabolismo de galactose encontram-se

normalmente reprimidos. Na ausência de glicose e presença de galactose estes genes

são ativados cerca de 1.000 vezes, sendo um dos poucos genes neste organismo que

respondem da maneira tudo ou nada. A maltose e a sacarose são convertidas em seus

respectivos monossacarídeos através da ação da maltase e da invertase. As leveduras

podem ainda utilizar o glicerol após sua captação e conversão em glicerol-3-fosfato

através da enzima glicerol quinase.

10

1.4-A transdução de sinais na levedura Saccharomyces cerevisiae.

Na natureza, as leveduras lidam constantemente com flutuações nos níveis de

nutrientes disponíveis. A capacidade de detectar estas flutuações e de se adaptar a elas

é um fator preponderante para garantir a sobrevivência destes organismos. Durante a

evolução, as leveduras desenvolveram vários mecanismos que permitiram sua

adaptação a estas flutuações. Estes mecanismos envolvem tanto controle positivo como

negativo na regulação do metabolismo celular. Estes controles podem ser realizados

tanto a nível transcricional através da repressão ou indução de genes, quanto a nível pós

-transcricional, controlando a estabilidade e a tradução dos mRNAs, e pós-tradução,

através do controle da atividade enzimática por ativação ou inibição alostérica ou da

estabilidade das proteínas. A maioria desses processos é afetada direta ou indiretamente

pelos mecanismos de detecção e sinalização celular, através de vias de transdução de

sinais presentes nas leveduras.

A membrana plasmática das leveduras não se constitui somente numa barreira

celular onde moléculas que controlam o metabolismo e a proliferação celular são

detectadas, mas também numa barreira através da qual os nutrientes que garantem o

suprimento de energia e o crescimento celular são transportados (Holsbeeks e cols.,

2004b). Nela estão presentes diversos receptores adaptados a responder às condições

ambientais e a transformar os estímulos externos em respostas celulares específicas

através da ativação ou repressão transcricional, possibilitando às leveduras adaptar seu

metabolismo (Figura 02). A presença de um determinado tipo de molécula é detectada

pelo receptor apropriado, promovendo a ativação do mesmo e desencadeando uma série

de eventos celulares, geralmente através de uma cascata de reações enzimáticas.

Diversas vias de transdução de sinais foram identificadas em leveduras; dentre elas,

podemos citar aquelas envolvidas com a detecção da presença de hormônios e fatores de

crescimento; com as oscilações na temperatura e pH; com a presença de nutrientes e

com a variação da osmolaridade dentre outras.

11

Figura 2 – Proteínas da membrana plasmática de células eucarióticas envolvidas na

detecção de nutrientes. Os receptores apresentam-se divididos em três grandes grupos: o

grupo de receptores não transportadores, envolvidos na detecção de sinais, mas não

acoplados ao transporte (Non-transporting transceptor), os receptores transportadores

não acoplados a proteínas G (transporting transceptors) e os transportadores

propriamente ditos acoplados a proteínas G (G-protein coupled receptors).

Fonte: (Holsbeeks e cols., 2004c)

1.4.1 - As vias MAPK (Proteínas quinases ativadas por mitógenos) na levedura

Saccharomyces cerevisiae.

As vias de proteínas quinases ativadas por mitógenos são vias de transdução de

sinais altamente conservadas nos organismos eucarióticos superiores, podendo ser

ativadas tanto por sinais externos como internos. Estas vias controlam uma série de

processos em leveduras como o crescimento celular, a morfogênese, a proliferação

celular, a resposta aos estresses, dentre outras. Geralmente, estas vias apresentam como

ponto comum, três proteínas quinases: uma MAP quinase (MAPK), uma MAP quinase

quinase (MAPKK) e uma MAP quinase quinase quinase (MAPKKK), atuando em

cascata. A ativação dessas vias se dá por sucessivos passos de fosforilação, culminando

12

com a regulação e modulação de fatores transcricionais. A regulação dessas vias

também se faz através da ação de diversas proteínas fosfatases que atuam normalmente

ao nível da MAPKK ou MAPK quinases. A ativação dessas vias normalmente ocorre

com a participação de uma proteína quinase inicial, associada geralmente a pequenas

proteínas G.

Em leveduras, são conhecidas seis vias de MAPK diferentes: a via de

conjugação em resposta aos ferormônios, a via de desenvolvimento de pseudo-hifas, a

via HOG (High Osmolarity Glycerol), a via de integridade celular, a via de montagem

da parede de esporos e a via de crescimento vegetativo(Chen & Thorner, 2007). Na

Figura 03, temos as cinco vias mais conhecidas, mostrando o compartilhamento de

algumas proteínas, o que contribui para a grande complexidade dos processos

envolvendo a ativação das vias de MAPK quinases.

Figura 3: Vias de MAPK presentes em Saccharomyces cerevisiae.

Fonte: Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on basic

features and novel aspects; 2005.

1.4.2-A transdução de sinais na conjugação em leveduras: resposta aos

ferormônios

Células de leveduras haplóides com fatores de acasalamento opostos (a ou α)

podem se cruzar gerando células diplóides. As células MATα produzem o fator α e

possuem receptores para o fator a, codificado pelo gene STE2. As células haplóides

13

MATa produzem o fator a e possuem receptores para o fator α, codificado pelo gene

STE3. Após a ligação do fator de acasalamento ao seu respectivo receptor, ocorre a

ativação de Gpa1p, uma proteína G heterotrimérica. Em seguida, o sinal é transmitido

para uma proteína ligante de GTP da família das proteínas relacionadas a Ras (Cdc42p),

a qual está associada a uma proteína ativadora de GTPase (Rga1p) e ao fator

estimulador de troca GTP/GDP (Cdc24p). Ocorre então a ativação de Ste20p, uma

proteína do complexo das MAP quinases, com ativação subseqüente desta via. Os genes

específicos de acasalamento são por fim ativados pelo fator de transcrição Ste12p, que é

capaz de se ligar aos elementos de resposta a ferormônios (PRE) (Breitkreutz & Tyers,

2002)(Figura 04).

Figura 4: Via de resposta aos hormônios de acasalamento

Fonte: Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on basic

features and novel aspects; 2005

14

1.4.3-A transdução de sinais envolvidos na resposta ao estresse osmótico.

A maioria dos organismos unicelulares encontrados na natureza como as

leveduras, freqüentemente estão expostos a grandes variações nas condições ambientais.

A capacidade de responder a estas mudanças eficientemente é de vital importância para

garantir a sobrevivência dos mesmos. Mudanças no ambiente podem ser de natureza

física ou química, como temperatura, pressão, radiação, concentração de solutos e água,

presença de determinados íons, agentes tóxicos, pH e disponibilidade de nutrientes.

Freqüentemente, as leveduras lidam com flutuações em mais de um dos fatores acima

descritos.

Na natureza, as células de leveduras estão expostas a variações dramáticas e

muito rápidas na osmolaridade, ou seja, na concentração de água disponível. Uma

levedura crescendo em um fruto seco pode estar exposta a altas concentrações de

açúcar, ao passo que imediatamente após uma chuva a mesma pode estar sujeita a altas

concentrações de água disponível. Durante o metabolismo fermentativo, ocorre um

aumento acentuado na concentração de álcool produzido como subproduto do

metabolismo, o que também diminui consideravelmente a água disponível (Tamas e

cols., 2000). O estresse osmótico é causado pela mudança nas concentrações de solutos

no meio onde a levedura está presente, alterando a disponibilidade de água. Em

membranas semipermeáveis, a água sempre flui na direção do compartimento com

maior concentração osmótica. Uma vez que a maioria das membranas biológicas é mais

permeável à água do que à maioria dos solutos, as células dos organismos na maioria

das vezes são afetadas pelas mudanças na osmolaridade. Um aumento da concentração

osmótica no meio (estresse hiperosmótico) fará com que a água tenha uma tendência a

fluir do interior da célula para o meio externo, enquanto uma diminuição da

concentração de solutos no meio (estresse hiposmótico) irá causar um aumento na

entrada de água para a célula (Figura 05).

15

Figura 5 – Mecanismos de adaptação aos choques hipertônico e hipotônico em


Uma série de vias de sinalização permitem às leveduras detectar as variações

osmóticas no meio ambiente. As mais conhecidas são a via HOG (High Osmolarity

Glycerol) em resposta ao estresse hipertônico e a via de integridade celular ou via das

MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase ou proteínas quinases ativadas por

mitógenos) em resposta ao estresse hipotônico.

1.4.4 - A via HOG (High Osmolarity Glycerol) em resposta ao estresse hipertônico. O glicerol é um álcool produzido durante o processo fermentativo em leveduras,

podendo ser utilizado como fonte de carbono e energia, sendo ainda importante na

biossíntese de fosfolipídios. Além disso, o glicerol é utilizado pela levedura como

regulador osmótico, através da regulação de sua concentração no interior da célula. Na

presença de estresse hipertônico, as leveduras acumulam o glicerol, contrabalançando as

altas concentrações de soluto no meio externo. O acúmulo do glicerol se dá pelo

aumento de sua captação, pelo aumento na produção do mesmo ou pelo controle da

abertura e fechamento dos canais de glicerol. A entrada do glicerol nas células de

leveduras pode acontecer por mecanismos diferentes: difusão passiva, difusão facilitada

e transporte ativo.

Segundos ou minutos

Entrada de água – Aumento da pressão interna. Inchamento da célula.

Saída de glicerol

Acúmulo de glicerol

Saída de água Célula murcha

Adaptação – Captação passiva de água, capacidade de proliferação, reassume forma regular

Adaptação – Saída passiva de água, diminuição pressão interna

Aumento da Osmolaridade

Choque hipertônico

Horas

Choque hipotônico

Diminuição da Osmolaridade

16

Normalmente, a difusão passiva de glicerol através da membrana celular de

leveduras é baixa. Em condições de estresse hiperosmótico a difusão passiva encontra-

se bastante diminuída. Isto parece ser devido ao fato de que as alterações na membrana

celular durante o estresse dificultam ainda mais a difusão.

A difusão facilitada de glicerol em leveduras é mediada pelo canal Fps1p. O

transporte de glicerol pelo mesmo pode se dar tanto num sentido quanto em outro. O

canal Fps1p desempenha um papel fundamental no controle dos níveis intracelulares de

glicerol em leveduras. O mecanismo de transporte ativo ainda não está bem estabelecido

em leveduras.

Em S. cerevisiae, foram identificadas três vias de sinalização capazes de ativar a

via HOG, através da fosforilação e ativação de Hog1p (Figura 06) (Van e cols., 2000)

(Saito & Tatebayashi, 2004) (Westfall e cols., 2004). Através de Sho1p, uma proteína

com quatro domínios transmembranares ou através de Msb2p, uma proteína semelhante

à mucina. Estas duas vias de sinalização estão conectadas à proteína Rho trifosfatase, a

Cdc42p, à proteína Pak1p, à proteína Ste20p e à proteína MAPKK quinase, Ste11p. A

outra via de sinalização que ocorre através de SLN1 normalmente é ativada em

condições de estresse hiperosmótico moderado, levando à ativação de duas MAPKKKs

redundantes, a Ssk2p e Ssk22p (O'Rourke e cols., 2002; O'Rourke & Herskowitz,

2004).

As vias de ativação via Sho1p e Msb2p ativam a via HOG através da ação de

Ste11p e a via de sinalização em resposta ao estresse moderado é ativada a partir de

Sln1p.

A ativação dessa vias leva a fosforilação de Hog1p, o ponto central da ativação da

resposta ao estresse hiperosmótico. A fosforilação de Hog1p resulta na sua translocação

do citoplasma para o núcleo, onde ela interage com uma grande variedade de proteínas

nucleares, incluindo fatores de transcrição e histona deacetilases, promovendo a

transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse. Quando a célula

restabelece o equilíbrio osmótico, Hog1p é defosforilada e exportada para o citoplasma,

cessando a resposta.

17

Figura 6 – Via HOG (High Osmolarity Glycerol) in Saccharomyces cerevisiae Fonte:http:stke.sciencemag.org/cgi .

1.4.5 - A via de integridade celular em resposta ao estresse hipotônico.

A via de integridade celular ou via PKC MAP quinases é uma via de transdução

de sinais envolvida em uma série de eventos celulares, como resposta a variações de

temperatura, resposta a ferormônios, ciclo celular e baixa osmolaridade. O principal

papel desta via parece ser o de manter a integridade celular, através do controle da

síntese da parede celular durante o crescimento, o desenvolvimento ou após eventos que

levam a expansão da célula ou perturbações da parede celular (Hohmann, 2002).

Mutantes nesta via de sinalização apresentam defeitos na formação da parede celular,

necessitando a adição de estabilizadores osmóticos (NaCl ou Sorbitol) para seu

crescimento e proliferação.

18

A proteína Pkc1p, codificada pelo gene PKC1 (Levin e cols., 1990) é a única

proteína quinase C em leveduras homóloga das proteínas quinases C de mamíferos. Ela

contém uma série de domínios funcionais similares aos encontrados nas proteínas

homólogas de mamíferos como duas regiões do tipo C1, que são seqüências do tipo

dedo de zinco com sítios de ligação para diacilglicerol, um domínio tipo C2 envolvido

na ligação de fosfolipídios dependente de cálcio, o domínio quinase, um sítio para

ligação do pseudosubstrato, a região V5 na porção C-terminal e dois domínios HR1 na

região N-terminal que ligam pequenas proteínas G (Figura 07). Apesar de possuir os

sítios para ligação de diacilglicerol e o domínio C2 dependente de cálcio, dados

experimentais obtidos até então demonstram que a Pkc1p de leveduras não é ativada por

esses sinais (Schmitz & Heinisch, 2003).

Figura 07 - Distribuição esquemática dos domínios na proteína Pkc1p.

Fonte: Denis,V. e cols.; 2005

Como descrito acima, a via da Pkc1p é ativada por perturbações ao nível da

parede celular. A capacidade de detectar essas perturbações e ativar essa via parece

estar associada à presença se sensores na superfície da célula, capazes de detectar e

transmitir os sinais para o interior da célula. Dois sensores foram identificados como

sendo possíveis componentes da via da Pkc1p. O primeiro deles é a proteína Slg1p (ou

Hcs77p ou ainda Wsc1p), que foi descoberta através de estudos que demonstraram sua

participação na ativação da fosforilação de Slt2p durante o estresse térmico (Gray e

cols., 1997). O outro é a proteína Mid2p, codificada pelo gene MID2, que participa no

controle da viabilidade celular durante o acasalamento e na manutenção da homeostase

do cálcio (Ono e cols., 1994). Sua seqüência de aminoácidos deduzida apresenta

similaridades com Slg1p. Ambas as proteínas apresentam um domínio rico em serina e

treonina, indicativo de que sejam proteínas glicosiladas localizadas na superfície

celular. Não se sabe como ocorre a transmissão do sinal entre esses possíveis sensores e

a via da Pkc1p.

O ponto central da via de Pkc1p é a cascata de quinases constituída por uma

MAPquinase quinase quinase (Bck1p), duas MAPquinase quinase redundantes (Mkk1p

e Mkk2p) e uma MAPquinase (Slt2p) (Figura 08). Esta cascata é ativada através da

19

fosforilação de resíduos de serina e treonina presentes em Bck1p pela ação da Pkc1p, o

que provoca uma seqüência de fosforilações nos componentes seguintes Mkk1p/Mkk2p

e Slt2p. A ativação de Pkc1p se dá através da ação de Rho1p, uma proteína da família

das proteínas ligantes de GTP. Rho1p é ativada através da ação do fator de troca

GDP/GTP (GEF), codificado pelos genes ROM1 e ROM2, sendo que Rom2 p parece ter

um papel preponderante neste processo. Por outro lado, as proteínas ativadoras de

GTPase, codificadas pelos genes BEM2 e SAC7, parecem ser as responsáveis pela

regulação negativa, inibindo a atividade de Rho1p (Schmidt e cols., 2002). O gene

TOR2 codifica para a proteína Tor2p que é responsável pela ativação de Rom2p

(Helliwell e cols., 1998b). Essa proteína possui uma grande homologia com as

fosfatidilinositol quinases de mamíferos, o que pode sugerir uma ligação entre o

metabolismo de lipídeos, importante na integridade da parede celular, e a via de Pkc1p.

Rho1p também participa diretamente na ativação do complexo da glucano sintase

(Mazur & Baginsky, 1996).

Como dissemos anteriormente, a via da Pkc1p está envolvida na manutenção da

integridade da parede celular e isso se dá através do controle da expressão de genes

envolvidos na síntese da mesma. Experimentos realizados por Igual(Igual e cols., 1996)

demonstraram que os genes FKS1 e FKS2, que codificam para as subunidades do

complexo β-1,3-glucano sintase, o gene MNN1 que codifica para uma α-1,3-

manosiltransferase e o gene CSD2 que codifica para uma quitina sintase, são

dependentes da ativação de Slt2p para sua expressão. Um dos fatores transcricionais

ativados por Slt2p é Rlm1p, um membro da família de proteínas MAD-Box. Estudos de

duplo híbrido demonstraram a interação de Slt2p com Rlm1p (Watanabe e cols., 1997)

e que Rlm1p ativa a transcrição de genes somente após a sua fosforilação (Watanabe e

cols., 1995). Outro alvo da fosforilação por Slt2p é o fator de transcrição SBF, um

heterodímero composto por Swi4p e Swi6p, envolvido na regulação do ciclo celular e

do crescimento polarizado em leveduras, principalmente durante a fase de transição de

G1 para a fase S, ativando a transcrição de genes como CLN1, CLN2, PCL1 e PCL2

(Madden e cols., 1997).

20

Figura 8 – Representação esquemática dos principais componentes da via de Pkc1p de Saccharomyces cerevisiae

Fonte: (Heinisch e cols., 1999b).

Estudos realizados por Levin (Levin e cols., 1994) com mutantes na via de PKC

MAP quinase demonstraram que mutações no gene PKC originaram um fenótipo mais

severo de osmosensibilidade quando comparados com mutações nos genes de outros

componentes desta via como BCK1 (MAPquinase quinase quinase), MKK1/MKK2

(MAPquinase quinase) e SLT2 (MAPquinase), o que sugere que Pkc1p possa estar

envolvida em outras vias de sinalização nas leveduras, além da via de MAPK quinases.

Outras vias envolvidas com Pkc1p já descritas (Heinisch e cols., 1999a); (Gustin

e cols., 1998) incluem a via de calcineurina (Mazur e cols., 1995), a via envolvida na

detecção de nutrientes, a via HOG, a via de fosfatidil inositol (Yoshida e cols., 1994;

Schmidt e cols., 1997), a via TOR (Barbet e cols., 1996), a via de controle do ciclo

celular dependente de Cdc-28 (Marini e cols., 1996), a organização do citoesqueleto

(Chai e cols., 2002) (Helliwell e cols., 1998a) e a via de conjugação celular (Zarzov e

cols., 1996). Valentini demonstrou, através da análise de supressores multicópia do

fator de iniciação eIF5A, a participação de Pkc1p nos mecanismos de controle da

estabilidade de RNAs mensageiros (Valentini e cols., 2002) .

21

Estudos realizados em nosso laboratório (Brandao e cols., 2002)) demonstraram

que uma cepa mutante pkc1∆ apresenta uma primeira fase de crescimento mais lenta e

um consumo de etanol menor do que as cepas selvagem e um mutante bck1∆. Foi

demonstrado ainda que o mutante pkc1∆ apresentava uma diminuição na expressão de

transportadores de glicose quando comparada com as cepas selvagem e bck1∆. Os

experimentos demonstraram ainda que o mutante pkc1∆ não crescia na presença de

glicerol como única fonte de carbono e que a desrepressão do gene SUC2 que codifica

para invertase estava bastante diminuída em comparação com a cepa selvagem. A

atividade enzimática de invertase também foi analisada e os resultados demonstraram

que a cepa pkc1∆ apresentava uma atividade invertásica bastante diminuída quando

comparada com as cepas selvagem, bck1∆ e mpk1∆. Posteriormente, Salgado

demonstrou que Pkc1p estava envolvida na desrepressão de outras enzimas como a

álcool desidrogenase e que o mecanismo envolvido nesse processo parece ser o controle

da localização subcelular do repressor Mig1p pela Pkc1p (Salgado e cols., 2002). Por

sua vez, Gomes (Gomes e cols., 2005) demonstrou que a cepa pkc1∆ não cresce em

glicerol por não ser capaz de desreprimir o gene GUT1 que codifica para a glicerol

quinase, a enzima que catalisa o primeiro passo do metabolismo do glicerol e que o

transporte de glicerol também estava afetado na cepa pkc1∆.

Os dados até então disponíveis, sugerem a participação da proteína Pkc1 p nos

processos de repressão e desrepressão por glicose; entretanto, como as vias de

transdução de sinais em leveduras apresentam uma grande complexidade, com

elementos comuns a várias vias, torna-se difícil avaliar quais são os componentes que

participam efetivamente nos processos de repressão e desrepressão por glicose que estão

associados à atividade de Pkc1p.

Os avanços relacionados à análise da expressão global de genes, através da

utilização de microarranjos de DNA, possibilitaram a utilização desta técnica na

elucidação do padrão de expressão gênica de diversos organismos submetidos a

condições pré-determinadas.

Decidimos então empregar a técnica de microarranjos de DNA, uma vez que a

mesma nos permite avaliar a expressão global dos genes de Saccharomyces cerevisiae

em condições de repressão e desrepressão, comparando as células selvagens com os

mutantes da cepa pkc1∆.

22

OBJETIVOS

23

2-Objetivos

2.1 - Objetivo geral

Tendo em vista os resultados anteriores obtidos em nosso laboratório, que

apontam para a participação da Pkc1p em processos metabólicos não relacionados

diretamente à via das Map quinases durante a desrepressão metabólica, decidimos

analisar comparativamente a expressão global de genes nas cepas selvagem W303 e

mutante pkc1∆ em condição de repressão e desrepressão metabólica.

2.2 - Objetivos específicos

2.2.1 - Analisar, através de ensaios de microarranjos de DNA, a expressão de todos os

genes da levedura Saccharomyces cerevisiae das cepas selvagem e mutante pkc1∆

durante o processo de desrepressão metabólica e selecionar os genes que apresentam

diferenças significativas de expressão entre as duas cepas.

2.2.2 – Validar os resultados obtidos nos ensaios de microarranjos de DNA para alguns

dos genes selecionados, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-

PCR).

2.2.3 – Analisar o padrão da transcrição de alguns genes das cepas selvagem W303 e

pkc1∆ durante o processo de desrepressão metabólica empregando plasmídeos

contendo os promotores destes genes associados ao gene da β-galactosidase.

24

MATERIAIS E MÉTODOS

25

3-Materiais e Métodos

3.1 - Microorganismos utilizados nos experimentos

3.1.1 - Cepas de Saccharomyces cerevisiae

As cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho estão descritas na tabela

abaixo:

Nome Genótipo

aW303 Mat a ade2-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 can1-100 GAL mal SUC2

bYSH850 Mat a pkc1∆::HIS3 (W303-1A)

∗ Letras a-b, procedência das cepas de S. cerevisiae ítem 3.1.2

Tabela 05: Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos experimentos

3.1.2 - Procedência das cepas de Saccharomyces cerevisiae :

a- Johan Thevelein, Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie, Katholieke

Universiteit Leuveun, Belgium.

b- Stefan Hohmann, CMB/Microbiology, Göteborg Univerty, Sweden.

3.1.3-Cepa de bactéria

A cepa de Escherichia coli utilizada para a amplificação do DNA plasmidial foi

a TOP10F’: F’, mcr A, ∆ (mrr-hadRMS – mcrBC) Ø 80∆lacZ ∆M15, ∆lacx74, deoR,

rec∆1, araD139,∆(ara,leu), 7697, galIU, galK, λ-,rs1p,end ∆1,nupG.

3.2-Plasmídeos LacZ repórter

Os plasmídeos contendo os promotores dos genes associados ao gene da β-

galactosidase estão descritos na tabela abaixo:

Nome Construção Gene do promotor associado

pBM2636 HXT1::lacZ em YEP 357R (URA3) YFL011W

pBM1942 pLG669-Z from L.Guarente (URA3)

= CYC-LacZ ( with no lexO sites)

YJR048W

pBM2773 SUC2::lacZ em YEP 356 (URA3) YIL162W

Tabela 06: Plasmídeos LacZ repórter

26

Todos os plasmídeos foram fornecidos pelo Dr. Mark Johnston, Washington University

School of Medicine, St. Louis, Missouri.

3.3-Meios de cultura e condições de crescimento

3.3.1-Meios de cultura

3.3.1.1-Meio LB (Luria – Bertaine)

O meio LB é composto por triptona 1% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v) e cloreto

de sódio 0,5% (p/v), pH 7,5 ajustado com NaOH. Ao meio sólido acrescenta-se ágar

1,5% (p/v).

3.3.1.2-Meio YP

O meio YP é composto por extrato de levedura 1% (pv), bacto-peptona 2%

(p/v). O meio sólido é acrescido de ágar 1,5% (p/v). Em todos os experimentos o meio

YP foi adicionado de 1M de Sorbitol. As fontes de carbono utilizadas foram as seguintes:

glicose 2% ou 4% ou rafinose 2%. As fontes de carbono foram autoclavadas

separadamente e acrescentadas ao meio no fluxo laminar.

3.3.1.3-Meio mínimo SD

O meio SD é composto por 6.7 g/l de base nitrogenada de levedura sem

aminoácidos, suplementado com os aminoácidos arginina 20 mg/l, ácido glutâmico 100

mg/l, ácido aspártico 100 mg/l, fenilanina 50 mg/l, histidina 100 mg/l, isoleucina 30 mg/l,

lisina 30 mg/l, leucina 250 mg/l, metionina 20 mg/l, serina 375 mg/l, triptofano 100 mg/l,

tirosina 30 mg/l, treonina 200 mg/l, valina 150 mg/l e as bases adenina 50 mg/l e uracil

50 mg/l. Em todos os experimentos o meio SD foi adicionado de 1M de Sorbitol O meio

sólido foi acrescido de ágar 1,5% (p/v). O pH do meio SD foi acertado com KOH para o

valor 6,5. As fontes de carbono usadas foram: glicose 2% (p/v) ou rafinose 2% (p/v).

27

3.3.2-Condições de crescimento

As células de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas a 30°C sob agitação a

200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25) em meio YP suplementado

com a fonte de carbono adequada. Para as cepas transformadas portadoras de

plasmídeos, foi utilizado o meio seletivo SD-URA. As células de E. coli foram

crescidas a 37°C sob agitação de 200 rpm (incubador rotatório New Brunswick Model

G25) em meio LB.

3.4-Transformação de bactérias e leveduras

3.4.1-Preparação de células de bactérias competentes

A bactéria Escherichia coli Top 10 F’, estocada à - 70°C com 25% glicerol, foi

crescida em meio LB suplementado com 15 µg/ml de tetraciclina e 20 µg/ml de

estreptomicina a 37°C durante 16 horas. Uma colônia dessa cultura foi inoculada em 3

ml de meio LB e incubada sob agitação de 200 rpm (Incubador Rotatório New

Brunswick Model G25) nas mesmas condições descritas acima. Após este período,

utilizou-se uma alíquota de 1 ml dessa cultura para inocular 100 ml de meio LB,

mantidos a 37 °C sob agitação de 200 rpm (Incubador Rotatório New Brunswick Model

G25) até atingir a DO600nm próxima de 0.8 nm (Du-68 Spectrophtometer-Beckman).

Após o crescimento, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 1.000g, por 10

minutos, a 4°C. O sedimento celular foi suspenso em 40 ml de CaCl2 0.1 M e mantido

em gelo por 1 hora. Após centrifugação, as células foram suspensas em 1 ml de CaCl2

1M. As células competentes foram aliquotadas e usadas imediatamente ou estocadas a -

70°C em presença de glicerol em uma concentração final de 25%.

3.4.2 - Transformação de bactérias

Cerca de 10 ng de mistura de ligação ou 2 µl de plasmídeo foram adicionados a

um tubo Eppendorf de 1,8 ml contendo 100 µl de bactéria TOP 10F’competentes (item

3.9). Este material foi mantido em gelo por 30 minutos. Após este período, as células

28

foram submetidas a um choque térmico a 42°C por 2 minutos. Em seguida, as células

foram mantidas em 1 ml de meio LB, a 37°C, por 50 minutos. Após centrifugação a

6.000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofure 13) por 1 minuto, o sobrenadante foi descartado.

As células foram suspensas em 100 µl de LB, plaqueadas com auxílio de pérolas de

vidro em meio líquido LB-ampicilina (100 µg/ml) e crescidas a 37°C sob agitação 200

rpm (incubador rotatório New Brunswick Model G25), por 16 horas.

3.4.3 - Mini preparação de DNA plasmidial de bactéria

As colônias obtidas no procedimento anterior foram inoculadas em 5 ml de meio

LB-ampicilina100 µg/ml a 37° C por 12 horas. Após o crescimento, a suspensão de

células foi transferida para tubos de microcentrífuga de 1,8 ml e centrifugadas a 3500

rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o

sedimento celular ressuspendido em 100 µl da solução I (dextrose 0,5M, EDTA 7,5

mM, Tris-HCl pH 8, 25mM e Ribonuclease A 0,15mg/ml) . Em seguida, foram

adicionados 200µl de solução de lise (SDS 1% e NaOH 0,2 M). As células foram

homogeneizadas por inversão e incubadas a 4º C por 20 minutos. Após este período, o

material foi centrifugado a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 20 minutos.

O sobrenadante foi transferido para outro tubo de microcentrífuga de 1,8 ml, adicionado

de 300 µl de Isopropanol e centrifugado a 13000 rpm por 20 minutos O sobrenadante

foi descartado e o DNA plasmidial foi lavado com 800 µl de etanol 70%. Após uma

nova centrifugação nas mesmas condições, o sobrenadante foi eliminado e o DNA seco

a vácuo (speedvac Savant AS 290). O DNA plamidial foi ressuspendido em 25 µl de

água milli-Q (Sistema Milli-Q Millipore).

3.4.4-Preparo de células de levedura competentes

A cepa de Sacharomyces cerevisiae a ser transformada foi crescida a 30°C, 200

rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25), durante 24 horas, em 5 ml de

YPD com sorbitol 1M. Este pré-inóculo foi utilizado para inocular 100 ml do mesmo

meio e foi incubado nas mesmas condições de temperatura e agitação descritas acima,

até que a cultura atingisse um valor de densidade ótica de 0,6. Após o crescimento, as

células foram coletadas por centrifugação a 1.000g por 4 minutos. O sobrenadante da

29

cultura foi descartado e as células foram lavadas com 20 ml de TE (10mM de Tris-HCl

pH 8,0, 1mM EDTA) e suspensas em 5 ml de TE acrescidos de 250 µL de uma solução

de acetato de lítio 2,5 M. A suspensão de células foi incubada a 30°C sob agitação de

200 rpm durante no mínimo 1 hora. As células de levedura, tornadas competentes pelo

tratamento descrito acima, foram aliquotadas em frações de 300µl e usadas

imediatamente.

3.4.5-Transformação de leveduras

A transformação de leveduras foi realizada de acordo com a técnica descrita por

Ito e colaboradores (Ito e cols.., 1983) com pequenas modificações. Em um tubo de

microcentrífuga contendo 300 µl de leveduras competentes, adicionaram-se 5 µg do

DNA plasmidial de interesse e 10 µl de DNA de esperma de salmão (10mg/ml),

previamente desnaturado a 95°C (Thermomixer 5436). Após incubação por 30 minutos

a 30°C, foram adicionados 700µL de PEG 4000 (50%), procedeu-se à homogeneização

do conteúdo delicadamente e incubou-se novamente por 1 hora nas mesmas condições

anteriores. Em seguida, as células foram submetidas a choque térmico a 42°C, por 10

minutos, e logo após, foram centrifugadas por 10 minutos a 4.000 rpm (Heraeus

Sepatech, Biofure 13). Após essa nova centrifugação nas mesmas condições anteriores,

o sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas no sobrenadante residual

e plaqueadas com pérolas de vidro em meio sólido seletivo (SD-URA). As placas foram

incubadas a 30°C, por 48 a 72 horas. As colônias crescidas nos meios seletivos foram

inoculadas em meio líquido YPD com Sorbitol 1M para posterior confirmação dos

marcadores genéticos com o objetivo de confirmar se a transformação foi efetiva

Como controle negativo do experimento, utilizamos 300 µl de leveduras

competentes e 10 µl de DNA de esperma de salmão (10 mg/ml) previamente

desnaturado a 95°C.

30

3.5-Determinação da atividade enzimática da Invertase e da β - Galactosidase

3.5.1 - Inóculo e crescimento das células

As células de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas em 20 ml do meio SD-

URA acrescido de glicose 4% ou rafinose 2%, durante 24 horas, a 30°C, sob agitação a

200 rpm em incubador rotatório New Brunswick Model G25.

3.5.2-Preparo de extratos celulares para a determinação da atividade enzimática

da invertase e β - Galactosidase.

As células de leveduras foram coletadas em diferentes intervalos de tempo e

centrifugadas a 1000 g, a 4°C, por 5 minutos. Em seguida as células foram lavadas uma

vez com tampão de extração (Na2PO4 460mM, NaH2PO4 40mM, KCl 10mM e MgSO4

1mM, pH 7,0) e ressuspensas em 500µl do mesmo tampão. Após este procedimento,

adicionou-se, em cada tubo, 0,5 g de pérolas de vidro (0,5 mm de diâmetro) e as células

foram lisadas por agitação em vortex (três vezes, 60segundos) com repouso em gelo nos

intervalos de agitação. Em seguida, os extratos foram centrifugados (3000g por 5 min) e

o sobrenadante foi coletado e congelado a – 70º C para posterior dosagem no aparelho

bioquímico COBAS-FARA (Roche).

3.5.3-Dosagem da invertase

A dosagem da enzima invertase foi realizada no aparelho de dosagem

bioquímica COBAS-FARA (Roche), tendo sido utilizado como substrato para a reação

uma solução de sacarose 0,3 M em acetato de potássio 100 mM pH 5,1. Após 5 minutos

de incubação, a 30°C, a reação foi interrompida pela adição de NaOH 1 M. Em seguida

um volume igual de HCl 1M foi adicionado para neutralizar o pH da reação. A glicose

liberada foi determinada pela reação clássica de glicose – oxidase / peroxidase, tendo a

ortodianisidina como reativo de cor. A leitura da absorbância foi feita a 560 nm. A

atividade da enzima invertase foi expressa em nmoles de glicose /min /mg proteína.

31

3.5.4 - Dosagem da β-Galactosidase

Os ensaios para determinação da atividade de β-galactosidase foram realizados

com extratos de células de leveduras pré-incubados por 5 minutos a 30º C. Depois disso,

0,44 mM de ONPG foi acrescentado e uma outra incubação de 25 minutos foi realizada.

A reação foi interrompida pela adição de Na2CO3. Procedeu-se então a leitura da

absorbância a 420nm e os resultados foram expressos em nmoles ONP min /mg

proteína. Todas as reações foram realizadas pelo aparelho bioquímico COBAS-FARA

(Roche).

3.6 - Dosagem de proteínas

A dosagem de proteínas foi realizada segundo o método de Lowry (LOWRY e

cols., 1951).

3.7-Extração do RNA Total

3.7.1 - Inóculo e crescimento das células

As leveduras foram inoculadas em 10 ml de meio YPD 4% e incubadas a 30°C,

sob agitação a 200 rpm em incubador rotatório (New Brunswick Model G25) até

atingirem e a densidade ótica entre 0,8 e 1,0 a 600 nm (DU-68 Spectrophotometer-

Beckman). Em seguida, as células foram coletadas por centrifugação (3000 g por 5

min), lavadas em 1M de sorbitol e ressuspensas em meio YPD 4% e em meio

YPRafinose 2%.As células foram então incubadas sob agitação a 200rpm a uma

temperatura de 30º C por 2 horas, para que ocorresse a desrepressão das células

crescidas em rafinose.

3.7.2-Extração do RNA

As células foram coletadas por centrifugação (3000 g por 10 min, 4º C)

descartando-se o sobrenadante e em seguida foram lavadas com 2 ml de sorbitol 1M,

4ºC. Após nova centrifugação (3000 g por 10 min, 4º C), o sobrenadante foi descartado

e o conteúdo restante foi ressuspenso em 2 ml de fenol / água 3,75:1 e 2 ml de TES

(10mM Tris:Cl; 10mM EDTA; 0,5% SDS; pH 7,5) seguido de agitação vigorosa em

32

Vortex. Os tubos foram incubados em banho Maria a 70º C por 1 hora, sendo agitados

vigorosamente em Vortex a intervalos de 5 minutos. Os tubos foram centrifugados

(3000g por 10 min a 4º C) e a fase superior coletada em tubos de microcentrífuga.

Foram adicionados 800 µl de fenol / água 3,75: 1, e após nova agitação os tubos foram

centrifugados (3000g por 10 min a 4º C). O sobrenadante foi coletado e foram

adicionados 600 µl de clorofórmio. Procedeu-se à nova agitação em vortex e em

seguida, os tubos foram centrifugados (3000g por 10 min a 4º C). O sobrenadante foi

coletado e foram adicionados acetato de sódio (50µl, 3M pH 5,3) e etanol gelado

100%(1 ml). Em seguida os tubos foram incubados a –70º C por 10 minutos. As

amostras foram centrifugadas (15000 rpm por 10 min, 4º C). O sobrenadante foi

descartado e o sedimento lavado com 500 µl de etanol 70%. As amostras foram

centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. O RNA foi ressuspenso em 50 µl H2O

DEPC (200ml H2O milli Q estéril, 200µl DEPC) e armazenado a -70ºC até a utilização.

3.7.3 - Eletroforese em gel de agarose

3.7.3.1 - Preparação das amostras de RNA para corrida no gel

As amostras foram desnaturadas a 68º C por 5 minutos em aparelho termoblott.

Uma alíquota de 5µl de cada amostra foi misturada com 15µl de tampão de amostra (1x

volume NBC 20x, 3x volume formaldeído 37%, 2x volume corante, 10x volume

formamida) e 1µl de brometo de etídio 10mg/ml. As amostras foram então mantidas em

gelo por 5 minutos antes da aplicação.

3.7.3.2 - Montagem do gel para corrida de RNA Todo o material utilizado (cuba de eletroforese, pente e suporte para o gel) foi

previamente tratado com NaOH 0,1M por duas horas e depois enxaguado por várias

vezes com água milli Q. Para a eletroforese foi preparado um gel de agarose 1% em

NBC 1x e formaldeído 1%. Antes da aplicação, os géis foram percorridos por 30

minutos a 100V em tampão NBC 1X. Depois disto as amostras foram aplicadas e a

eletroforese realizada nas mesmas condições. Em seguida os géis foram visualizados no

transiluminador a 365 nm e fotografados (Sony-KAISER-RSI).

33

3.8 – Ensaios de microarranjos de DNA 3.8.1 – Microarranjos de DNA

Os avanços obtidos nos últimos anos, relativos ao seqüenciamento do genoma de

várias espécies, inclusive do genoma humano realizado pelo consórcio internacional

para seqüenciamento do genoma humano, trouxeram uma vasta gama de informações a

respeito da constituição do genoma destas espécies, mas independente dos esforços

realizados, muitas questões permanecem não elucidadas. Com relação ao ser humano,

não se sabe ainda quantos genes são realmente funcionais, sendo que as estimativas

realizadas através de análises computacionais variam entre 30.000 e 120.000 (Das e

cols., 2001).

Independentemente do número exato de genes funcionais necessários à

sobrevivência de um dado organismo, o desafio consiste em determinar quais genes são

necessários em determinada condição fisiológica ou estágio do desenvolvimento, ou

ainda quais genes são expressos em diferentes tecidos ou em determinadas situações

patológicas. Estas são questões abordadas por uma nova área do conhecimento,

denominada genômica funcional (Asnagli & Murphy, 2001).

Um aspecto crucial da genômica funcional é a descrição da expressão global dos

genes de um determinado organismo, abordando basicamente duas questões:

a) Quando, no organismo em questão, os genes são expressos ou reprimidos?

b)Como a expressão desses genes varia em função de mudanças fisiológicas ou

metabólicas ou ainda patológicas?

Durante muito tempo, essas questões foram abordadas com o emprego de

técnicas com baixa capacidade de resolução, como “Northern blot”, “RNAse

protection”, “Western blot”, permitindo avaliar um pequeno conjunto de genes de cada

vez. A disponibilidade de dados através dos projetos de análise de genomas e o

desenvolvimento da técnica de microarranjos de DNA, possibilitou a análise da

expressão de centenas ou milhares de genes em um único ensaio.

A técnica de microarranjos de DNA consiste na hibridização de múltiplas sondas

fluorescentes com um DNA alvo de determinada célula ou tecido. As células de

interesse são submetidas à extração do mRNA. O mRNA é transcrito em cDNA e

marcado com uma sonda fluorescente. Em seguida, o cDNA marcado é hibridizado com

34

sondas de DNA conhecidas (representando um genoma ou um conjunto de genes

específicos) afixadas a uma matriz sólida (um lamina de vidro recoberta com uma

matriz especifica para adesão das sondas). A hibridização ocorre através do pareamento

complementar de bases entre as sondas e os cDNAs, proporcionalmente à concentração

de moléculas de cDNA presentes. Em seguida, as laminas são submetidas à leitura de

fluorescência em comprimentos de onda específicos para cada corante e os dados são

coletados na forma de intensidade de fluorescência para cada ponto (cada sonda alvo),

sendo posteriormente analisados.

3.8.2 - Marcação do cDNA para Microarranjos Para a realização do experimento de marcação do cDNA obtido a partir dos

RNAs extraídos foi usado o CyScribe Post-Labelling kit. Os seguintes reagentes foram

descongelados em gelo: tampão CyScript, DTT, mix de nucleotídeos, AA-dUTP, H2O,

RNA total e iniciadores. Em seguida foi feita a reação de anelamento do RNA total

com os iniciadores de oligo-dT para a marcação direta. Foi preparado o Mix1 (um para

controle e o outro para o experimental), sendo utilizada uma quantidade de RNA total

equivalente a 20µg de amostra e como iniciador foi utilizado o oligo-dT.

Reagentes do Mix1 Amostra 1 Amostra 2

RNA total X µl (20µg) X µl (20µg)

Oligo-dT ancorado 4 µl(0,5µg/µl) 4 µl

Água (do kit) Y µl Y µl

TOTAL 11 µl 11 µl

As amostras foram misturadas e incubadas a 70º C por 5 minutos no

termociclador. Deixou-se esfriar por 10 minutos a temperatura ambiente e preparou-se o

Mix2.

35

Reagentes do Mix2 x 1

5x tampão CyScript 4 µl

DTT 0,1M 2 µl

Mix de nucleotídeos 1 µl

AA-dUTP 1 µl

Transcriptase reversa CyScript 1 µl

TOTAL 9 µl

Foram transferidos 9µl dos tubos de reação do Mix2 para os quatro tubos

contendo os 11 µl do Mix1. Os tubos de reação foram misturados bem com a pipeta e

quando necessário, submetidos a uma rápida centrifugação para homogeneização da

mistura. A reação foi incubada 10 minutos a temperatura ambiente e, em seguida a 42ºC

por 1,5 h. Nesta fase, os tubos de reação foram colocados em gelo para purificação

posterior.

3.8.3 - Degradação do mRNA (Hidrólise alcalina)

Foram adicionados aos tubos de reação 2µl de 2,5M NaOH. Misturou-se bem e

em seguida centrifugou-se durante 30 segundos. Os tubos foram incubados no

termociclador a 37º C por 15 minutos. Aos tubos foram adicionados 10µl de 2M

HEPES “free acid”. Novamente, misturou-se bem e centrifugou-se por 30 segundos.

Neste momento, pôde-se congelar a -20º C ou prosseguir o experimento fazendo a

purificação da sonda de cDNA.

3.8.4 - Purificação da sonda de cDNA

Foram adicionados 120µl de tampão de ligação a cada reação e todo o volume

foi transferido para um poço da placa de purificação de 96 cavidades (Millipore

Multiscreen filter plate). Centrifugou-se a 1000xg por 1 minuto a 25ºC e descartou-se o

filtrado. Cada poço do filtro foi lavado 4x usando 200µl de Etanol 80%, sendo que a

última lavagem foi realizada centifugando-se a 3500rpm por 5 minutos. O filtrado foi

descartado e a placa de coleta foi trocada por uma nova. As amostras foram eluídas 2x

com 45µl de 10mM Tris pH 8,0 e a cada eluição foram centrifugadas a 3000rpm por 5

minutos. Juntou-se os 85µl de sonda marcada em um tubo âmbar. As amostras foram

36

secas no speed-vac por aproximadamente 40 a 60 minutos, até secar (não em excesso).

Neste ponto pôde-se parar a marcação e as amostras puderam ser congeladas secas por

vários dias.

3.8.5 - Reação de marcação com CyDye

O cDNA amino allyl purificado foi seco e ressuspendido em 15µl em água

DEPC. Também foram ressuspendidas uma alíquota de Cy3 (corante verde) e outra de

Cy5 (corante vermelho) do kit em 15µl de 0,1M Bicarbonato de Sódio pH 9,0.

Adicionou-se imediatamente uma alíquota de CyDye (corante Cy) a uma alíquota de

cDNA. A reação foi misturada por agitação e incubada a temperatura ambiente, no

escuro, por uma hora. Foram adicionados 15µl de Hidroxilamina 4M a cada reação.

Novamente, a mistura foi homogeneizada e incubada à temperatura ambiente, no

escuro, por 15 minutos. Em seguida, realizou-se a purificação como descrito

anteriormente, sem secar e sem incidência direta de luz. O volume eluído foi medido e a

marcação foi dosada em espectrofotômetro. A etapa de marcação dos cDNAs com os

corantes fluorescentes foi realizada sem a incidência de luz direta.

3.8.6 - Quantificação da sonda marcada

Foram utilizadas cubetas de quartzo de 50µl reservadas para cada Corante. As

cubetas foram lavadas cerca de 5 vezes com água milli-Q, tendo sido adicionados cerca

de 70µl de Tris-HCl pH 8,0 para zerar o espectrofotômetro. Apos a retirada da solução

de Tris da cubeta, colocou-se todo o volume de sonda marcada (não diluída) na cubeta.

A leitura foi feita nos seguintes comprimentos de onda: 550 nm para Cy3, 650 nm para

Cy5 e 260 nm para quantificação de cDNA. Foi medido o volume final de cada uma das

reações. O total de corante incorporado foi determinado de acordo com a seguinte

fórmula:

(OD x fator de diluição x volume) / (E x 10-6) = total pmol de Cy

Volume = volume de sonda purificada

OD = densidade ótica, unidade de medida: nanômetros.

E 550 coeficiente de extinção molar Cy3 = 150000M

E 650 coeficiente de extinção molar Cy5 = 250000M

37

A fórmula também pode ser dada resumidamente como:

Para Cy3 → (ABS / 0,15) x vol = pmol

Para Cy5 → (ABS / 0,25) x vol = pmol

ABS = absorbância

Esta etapa, tal como a anterior, foi feita sem a incidência de luz direta.

3.8.7 - Hibridização manual

As amostras foram secas totalmente no aparelho Speed-vac (Savant), à 30º C por

aproximadamente 40 a 60 minutos. Cada uma foi ressuspensa com 6,75 µl água DEPC.

As sondas foram misturadas Cy3 e Cy5 (total 13,5 µl) e então foram acrescentados 13,5

µl de tampão de hibridização e 27 µl de formamida. Incubou-se a 92º C por 2 minutos e

colocou-se no gelo. Os 54µl da amostra foram aplicados em uma das extremidades da

lâmina contendo os microarranjos (oligos de DNA) (EuroGentec), sem encostar a

ponteira na lâmina, fazendo um arraste de solução. Com cuidado para não fazer bolhas,

colocou-se por cima uma lamínula muito limpa com o auxílio de uma pinça. A lamínula

foi colocada dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml (preso em suporte de ferro) com

um filme de água, na horizontal. O suporte foi colocado no banho a 42º C por 16 h.

3.8.8 - Lavagens

As duas primeiras soluções foram aquecidas em banho a 55º C. Foram feitas 5

lavagens, como descrito a seguir, sob leve agitação e protegendo as lâminas da luz:

1. 1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º C

2. 0,1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º C

3. 0,1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º C

4. 0,1x SSC → 1min temperature ambiente

5. 4 vezes em água milli-Q

Após mergulhar em água, as lâminas foram secas imediatamente com nitrogênio gasoso

e as imagens e fluorescência foram captadas em seguida.

38

3.8.9 – Leitura das laminas.

Ao final da hibridização, a fluorescência nas lâminas foi captada com o auxilio do

aparelho scanner utilizando os parâmetros de intensidade de fluorescência relacionados

abaixo. Estes parâmetros são padronizados de acordo com a intensidade de

fluorescência emitida por cada corante, sendo menores para Cy5 uma vez que a emissão

de fluorescência deste corante é maior que a emissão de Cy3.

PMT Cy3 – 900

PMT Cy5 – 650

3.8.10 – Análise estatística

Os experimentos de hibridização foram realizados no mínimo 3 vezes e os

resultados foram analisados utilizando-se dos métodos estatísticos descritos por Yang,

Y.H. e colaboradores. (Yang e cols., 2002). Foram considerados como genes

diferencialmente expressos apenas aqueles que apresentaram sinal de fluorescência

igual ou maior que oito vezes o valor do sinal de fundo (background) e que

apresentaram intensidade de fluorescência maior que 1x log 2 em relação ao gene

controle. Uma segunda analise foi realizada utilizando o pacote estatístico R, usando o

critério de Fold Variation de acordo com Gentleman e colaboradores(Gentleman R &

Ihaka R, 1997). Foram selecionados os genes que apresentaram valores superiores a

dois desvios da média.

39

3.9 – Reação em cadeia da polimerase em tempo real.

3.9.1 – Introdução

Os experimentos de microarranjos de DNA são capazes de fornecer um conjunto

muito grande de dados referentes à expressão gênica global de determinado organismo.

Estes dados, apesar de fornecerem informações qualitativas muito importantes, não são

precisos do ponto de vista quantitativo, uma vez que as condições empregadas nos

experimentos não são as ideais para cada gene analisado. Para validar os dados obtidos

nos experimentos de microarranjos, devemos empregar um método capaz de fornecer

dados quantitativos mais precisos. Dentre os vários métodos disponíveis, um dos mais

empregados é a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), o qual

permite, através da reação de amplificação dos cDNAs obtidos a partir dos RNAs

mensageiros, quantificar exatamente o número de cópias de cada RNA mensageiro

presente nas amostras, através da utilização de corantes ou sondas fluorescentes. Os

métodos que empregam os corantes fluorescentes se baseiam na propriedade que estes

corantes apresentam de se ligarem à dupla fita de DNA tão logo ela tenha sido

sintetizada, permitindo a quantificação dos mesmos. A metodologia que emprega as

sondas fluorescentes utiliza sondas associadas a um reagente fluorescente e a uma

substância inibidora de fluorescência. Quando a sonda hibridiza com a seqüência alvo e

ocorre a amplificação, ocorre a remoção da substância inibidora de fluorescência e a

emissão de fluorescência proporcional ao número de cópias das seqüências alvo.

3.9.2 – Obtenção dos cDNAs

A partir de 5µg de RNAs extraídos das cepas selvagem W303 e pkc1∆ extraídos

nas mesmas condições descritas para os experimentos de microarranjos de DNA, foram

sintetizados os cDNAs através do mesmo protocolo descrito em material e métodos.

Estes cDNAs foram armazenados a -80º C até a sua utilização.

3.9.3 – Desenho dos iniciadores

Os iniciadores para os experimentos de PCR em tempo real foram desenhados

com o auxílio do programa Primer Express da Applied Biosystems. Foram escolhidos

os pares de iniciadores com a TM mais próxima e com menor conteúdo de GC,

40

principalmente nas extremidades. A tabela 07 apresenta a seqüência dos iniciadores

utilizados.

3.9.4 – Reação da polimerase em cadeia

Para a reação de polimerase em cadeia em tempo real, foram utilizados os

reagentes e procedimentos abaixo descritos:

Adicionamos a um tubo de PCR:

5 µl cDNA 5 µl iniciadores (direto e reverso) (150 µg/ml or 20 pMol cada) 4 µl 5 mM 4dNTP 10 µl 10× tampão de amplificação 70.5 µl H2O.

A mistura foi aquecida por 2 min a 94° C e rapidamente centrifugada.

Foram adicionados 0.5 µl (2.5 U) de Taq DNA polimerase, a solução foi gentilmente

misturada, e rapidamente centrifugada.

Os tubos de reação foram colocados no aparelho e os ciclos da reação estão descritos abaixo:

Numero de Ciclos Tempo por ciclo Temperatura 39 ciclos: 2 min 55° C

2 min 72° C 1 min 94° C

1 ciclo: 2 min 55° C 7 min 72° C

Para cada conjunto de cDNAs utilizado foi feita uma reação com o gene normalizador

(Actina).Para cada produto de amplificação foi feita uma curva de dissociação para

checar a especificidade de cada reação.

3.9.5 – Análise dos resultados

Para a análise dos resultados, foi utilizado o método de quantificação relativa,

utilizando o gene da actina como gene normalizador, conforme descrito por Livak and

Schmittgen ((Livak & Schmittgen, 2001) .

41

RESULTADOS E DISCUSSÃO

42

4 - Resultados e discussão 4.1. - Análise dos experimentos de microarranjos de cDNA.

Para os experimentos de análise da expressão global de genes na cepa pkc1∆,

foram utilizadas lâminas comerciais fornecidas pela Eurogentec, contendo todas as 5803

ORFs conhecidas de Saccharomyces cerevisiae, cepa 288c em duplicata, perfazendo um

total de 11.606 dados por lâmina. A hibridação e a análise de dados foram realizadas

segundo o protocolo seguido pelo CAGE (Cooperação para a análise dos genes e

genomas do departamento de Bioquímica, Instituto de Química da Universidade de São

Paulo) e o pacote estatístico R. Cada experimento foi realizado no mínimo três vezes e

os resultados foram analisados conforme descrito em material e métodos. Foram

hibridizadas sete lâminas, sendo quatro com cDNAs provenientes de mRNAs da cepa

pkc1∆ e três com cDNAs provenientes de mRNAs da cepa W303, incubadas na

presença de glicose ou rafinose como fonte de carbono.

Os dados obtidos foram filtrados e selecionados e de um total de 81.242 pontos

experimentais iniciais, um primeiro tratamento foi realizado visando eliminar os dados

que não apresentavam confiabilidade, excluindo aqueles cujo valor de intensidade de

fluorescência apresentaram discrepâncias estatísticas entre as duplicatas, pontos com

interferência na fluorescência (sujeira ou falha na impressão) e dados cujos valores de

fluorescência foram iguais ao “background” da lâmina. Utilizando o pacote estatístico

R, foi feita uma análise do background das lâminas e os resultados estão apresentados

nas figuras 9 e 10. Em seguida, foi feita uma normalização das intensidades de

fluorescência para correção dos desvios da média dos valores de fluorescência para cada

um dos corantes. O resultados das normalizações para todas as lâminas são apresentados

nas figuras 11 e 12.

43

Figura 9– Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os

cDNAs da cepa W303. Background verde representa o corante Cy3 e background

vermelho o corante Cy5.

Figura 10 – Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os

cDNAs da cepa pkc1∆. Background verde representa o corante Cy3 e background

vermelho o corante Cy5.

44

Antes da normalização Após a normalização

Figura 11 – Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após

hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303. Estão representadas as três

lâminas hibridizadas com os cDNAs da cepa W303. Em verde está representada a

fluorescência do corante Cy3 e em vermelho a fluorescência do corante Cy5.

Lâmina 01

Lâmina 02

Lâmina 03

45


Figura 12 – Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após

hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa pkc1∆. Estão representadas as

quatro lâminas hibridizadas com os cDNAs da cepa pkc1∆. Em verde está representada

a fluorescência do corante Cy3 e em vermelho a fluorescência do corante Cy5.

Lâmina 03

Lâmina 04

Lâmina 01

Lâmina 02

46

Após a normalização da intensidade de fluorescência, foi realizada a

normalização dos dados globais por “Lowess fitting” para cada uma das lâminas obtidas

com os cDNAs da cepa W303 e da cepa pkc1∆.Estes resultados são apresentados nas

figuras 13 e 14, que apresenta um Box plot antes e após a normalização dos dados.


Figura 13 – Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303, onde M = log2

(Cy5 / Cy3).


Figura14 – Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa pkc1∆, onde M = log2

(Cy5 / Cy3).

47

Nas Figuras 15 e 16, podemos observar os resultados normalizados da

hibridização das lâminas com o cDNA produzido a partir dos mRNAs extraídos das

cepas W303 e pkc1∆ crescidas em YPGlicose 4% e YPRafinose 2%.

Figura 15 - Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da cepa selvagem W303.

WR – Células crescidas em glicose 4% e transferidas para rafinose 2% por 2 horas

WG - Células crescidas em glicose 4% e reincubadas em glicose 4% por 2 horas.

Onde

M = log2(Cy5 / Cy3)

S = 1/2*(log2 (Cy5) + log2 (Cy3))

B A

C

48

Figura 16 - Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da cepa Pkc1∆.

PR – Células crescidas em glicose 4% e transferidas para rafinose 2% por 2 horas

PG - Células crescidas em glicose 4% e reincubadas em glicose 4% por 2 horas

Onde

M = log2(Cy5 / Cy3)

S = 1/2*(log2 (Cy5) + log2 (Cy3))

As figuras 15 A e 16 A apresentam em um gráfico de M x S, o resultado da

fluorescência emitida a partir da hibridização dos cDNAs obtidos a partir das cepas

incubadas em rafinose sobre a fluorescência emitida a partir da hibridização dos cDNAs

obtidos das cepas incubadas em glicose. O valor de M indica a razão de log2 de rafinose

sobre glicose, onde cada ponto corresponde a um gene. Os valores de M maiores que

zero indicam os genes que foram mais expressos na presença de rafinose e os genes

abaixo do eixo M (menores que zero) indicam os genes que foram mais expressos em

A B

C

49

glicose. Os valores de S indicam a intensidade de fluorescência quando comparados

com o background da lâmina. Foram considerados apenas os genes que apresentaram

intensidade de fluorescência (S) maior que oito vezes o valor do background. As figuras

15B e 16B indicam a intensidade de marcação pelos corantes Cy3 versus Cy5. As

figuras 15C e 16C representam os resultados de fluorescência obtidos em A após a

normalização por lowess fitting dos resultados de hibridização das lâminas.

A primeira observação que podemos fazer é que embora tenhamos empregado a

mesma quantidade de mRNA inicial e a mesma quantidade de cDNA marcado nas

hibridizações. houve uma marcação muito mais acentuada na cepa W303 do que na

cepa pkc1∆.

Podemos ainda observar uma marcação muito mais numerosa de genes quando

as cepas W303 e pkc1∆ foram incubadas em rafinose, em comparação com as mesmas

cepas incubadas em glicose. Isto pode ser explicado pela inibição da expressão de um

grande número de genes nas leveduras quando as mesmas estão em presença de glicose,

através da via principal de repressão por glicose, discutida anteriormente.

Utilizando o banco de dados de ontologia gênica do SGD, classificamos os

genes de acordo com a ontologia gênica e separamos os mesmos em grupos diversos.

Selecionamos então os genes envolvidos no metabolismo de carbono para uma análise

mais específica dos dados.

Os resultados obtidos estão apresentados na figura 17, onde estão representados

todos os 178 genes envolvidos com o metabolismo de carbono na levedura S.

cerevisiae, de acordo com a ontologia gênica do SGD. Cada coluna representa as

médias ( Log2 fold variation)dos experimentos de microarranjos de DNA para as cepas

W303 e pkc1∆ .Cada bloco representa a média dos resultados para um gene isolado,

comparando as condições de desrepressão versus repressão (rafinose/glicose). O grau de

saturação de cor indica a magnitude da expressão (rafinose/glicose) de acordo com a

escala apresentada.

50

Figura 17– Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono nas cepas

W303 e pkc1∆. As colunas representam a expressão dos genes nas cepas W303 e pkc1∆

. Cada bloco representa o Log2 (Fold variation) para cada gene, comparando a expressão

em condição de desrepressão versus a condição de repressão (rafinose/glicose). A

saturação de cor representa a magnitude da razão da expressão de rafinose sobre glicose

de acordo com a escala indicada na figura.

51

Apesar de alguns genes se apresentarem mais expressos na cepa pkc1∆ , como

por exemplo o gene YDR019c, podemos observar um maior número de genes cuja

expressão é maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆.

A partir da análise da expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de

carbono, selecionamos um grupo de genes cuja expressão estava aumentada na cepa

W303 em relação à cepa pkc1∆ em condição de desrepressão metabólica. Na figura 18

estão representados os genes selecionados e os resultados da expressão dos mesmos

obtidos a partir dos experimentos de microarranjos de DNA.

52

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

ARG82 COX14 CYB2 DLD1 FUM1 GLC3 GPT2 GRE1 GTT1 GUT1 GUT2 HXT2 HXT3 HXT5 ICL2 JEN1 MDH2 PDC1 PFK2 PLC1 PYC1 RHR2 RSF2 SDH1 SUC2 TKL2

Fo

ld v

ari

ati

on

WR/WG

PR/PG

Figura 18 – Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono selecionados através dos ensaios de microarranjos de DNA para

validação por RT-PCR. Os valores estão expressos em Log2 (Fold variation).

53

Podemos observar nesta figura que o gene SUC2 apresentou uma expressão

maior na cepa pkc1∆ em relação à expressão na cepa selvagem W303. Também não

estão apresentados os valores para os genes HXT1, HXT4 e HXT6 que codificam para

transportadores de glicose. Estes genes não estão representados porque seus dados

foram excluídos durante os procedimentos de análise dos microarranjos de DNA. Para

os genes HXT1 e HXT4 o número de dados não foi suficiente, uma vez que em duas

lâminas da cepa W303 a leitura dos mesmos ficou comprometida. O gene HXT6

apresentou valores muito discrepantes entre as réplicas, não podendo ser analisado.

Apesar disto, estes genes foram incluídos nos experimentos de RT-PCR, uma

vez que dados anteriores obtidos em nosso laboratório indicavam que SUC2, HXT1 e

HXT4 apresentavam uma expressão diminuída na cepa pkc1∆ quando comparada com a

cepa W303. Incluímos o gene HXT6 porque assim teríamos a possibilidade de avaliar o

comportamento de todos os genes para transportadores funcionais de glicose em


4.2. - Reação em cadeia da polimerase em tempo real – (RT-PCR).

Baseados nos resultados obtidos a partir dos experimentos de microarranjos de

DNA, selecionamos 28 genes envolvidos no metabolismo de carbono para validação

através de RT-PCR. Como descrito em material e métodos, utilizamos o gene da actina

como controle interno da análise da expressão dos genes selecionados.

Através do banco de dados disponível no SGD, obtivemos as seqüências das

regiões codificadoras de cada um dos genes e utilizamos estas seqüências para o

desenho dos iniciadores a serem utilizados nos experimentos de RT-PCR. Os

iniciadores foram desenhados com o auxílio do programa Primer Express da Applied

Biosystems. Foram escolhidos os pares de iniciadores com a TM mais próxima e com

menor conteúdo de GC, principalmente nas extremidades. Realizamos então os

experimentos de RT-PCR, a partir dos mRNAs extraídos das cepas W303 e pkc1∆,

comparando a expressão dos mesmos em condição de desrepressão e repressão

metabólica ( rafinose/glicose). Os resultados foram normalizados utilizando o gene da

actina, como descrito em material e métodos. Os resultados estão apresentados na figura

19, e são expressos em quantificação relativa. As figuras estão ordenadas pela

magnitude da expressão, ou seja, primeiro são apresentados os resultados dos genes que

apresentaram uma expressão relativa menor.

54

Gene Iniciador direto Iniciador reverso

Actina GCCGAAAGAATGCAAAAGGA TCTGGAGGAGCAATGATCTTGA

ARG82 CCGGAGCGATGGGAATTACTAA ACCAGTTGTTTTTTTGTCCTTTGG

COX14 GACGTTGGTTGGTGGTACGTT TTGTTCGTACTTCTTACCGTTCATG

DLD1 CCCTGAAGAACACGAAACCTGTAG AAATCGACGGGTGCTTCACCTA

CYB2 GGTGTTCAACGTACCGAAGATG CCACCATGATTGGATAGAACCA

FUM1 TTAGTCACCGCTTTGAACCCTAA TTCAGGAACAACCCATTCATCA

GLC3 GCTGTGGGATTCCCGTCTTT AAAATGCCAGGTTTGCTAATAAGAA

GPT2 TCGACCCGGCTTTGGTAAT CATTCTGGATCGGGACTTTCC

GRE1 TGCTCAAAGTAACCGCTACCAA CGTTTCCTGACCCAGACAGATC

GUT1 CCACGTTGAAGTTCCCCAAA TTGGACGACGTTCACCAGTAAT

GUT2 GCCTCGCTTGTGTACCATGA ACAGCCGTGATGGCTAAAGTG

HXT1 GCTTCCTGGGTTCCAGTATCC TGGTTGGTCATCATGCATTAGG

HXT2 GGCCCCAATTGCCTACGT CAATAGCCATAGCACGATTTTTGA

HXT3 CGAAGCAAGAGCATCTCTTTCC ACCCCATGATGCTGAACCA

HXT4 TGCTGCTTCCATGACAGCTT CTTCTTACCATTTGGCCACAATC

HXT5 CTGGTACCGCCGGTTACAA GCCTTCATGGGAAATGTAACTTG

HXT6 GCTGCATCCATGACTGCTTGT TCTTGACCATTTGGCCATAATCT

ICL2 GCCGGATTTTGGCGATT AATTGCTGCGCCTTGAATATTC

JEN1 CCTTACTGCACATCCACGAGTTT CCATGTCATTTTGCGCAGTT

MDH2 ACCGGAGCGTTACCCACAT GGCGGTAACACCGTTGATG

PDC1 CCAACTTTCGGTGCTAAGGACTAT CAAGTTTTGTGGAGCATCGAAGA

PFK2 GAAAACTTCAACGCTGATGACAA CCAGTGAATGACCTTTGGCATT

PLC1 GCAAACTAATGATATTGGACAGCAA TGGAATCATTTTCGCCTTTGTT

PYC1 TTACTAAATCCAAAGCAGACATGCA TTTCCATTTTCATGGCGCTTAA

RHR2 TGCCTTTGACCACAAAACCTTT GAATAACGTGTTCGGCATCGAA

RSF2 CAATAAACGCCAATCCAGCAAT CATAGCAAACTTCCTCCAAAGCTT

SDH1 TGATGAAGAAACTGGCGAAGAC CAGAAACACAAGCGGCTTCAC

SUC2 CTATGCCTTGCAAACTTTCTTCAA TTGAAGCCCAGGCAATACCT

TKL2 ATGGCACAGTTCTCCGACATT TCCACCTGGTCAACGGAAAG

Tabela 07 – Iniciadores utilizados nos experimentos de RT-PCR para validação dos

experimentos de microarranjos de DNA.

55

A

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

COX14 DLD1 FUM1 HXT1 HXT2 HXT3 HXT4 MDH2 PDC1 PFK2 PLC1 PYC1 RHR2 SDH1

Qu

an

tifi

ca

çã

o R

ela

tiv

a

WR/WG

PR/PG

B

0

10

20

30

40

50

ARG82 CYB GLC3 GPT2 RSF2 SUC2

Qu

an

tifi

ca

çã

o R

ela

tiv

a

WR/WG

PR/PG

C

0

20

40

60

80

100

GUT1 GUT2 HXT5 HXT6 ICL2

Qu

an

tifi

caç

ão

Re

lati

va

WR/WG

PR/PG

D

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

GRE1 JEN1 TKL2

Qu

anti

fica

çã

o R

ela

tiva

WR/WG

PR/PG

Figura 19 – Resultado da análise por RT-PCR da expressão de genes envolvidos no

metabolismo de carbono nas cepas W303 e pkc1∆. Os valores estão expressos em

quantificação relativa, usando o gene da actina como gene normalizador e representam a

media de três experimentos.

56

Analisando os resultados da figura 19, podemos observar, para nossa surpresa ,

que alguns genes apresentaram uma expressão maior na cepa pkc1∆ do que na cepa

W303 em condição de desrepressão metabólica. São eles o gene HXT4, que não havia

sido analisado nos experimentos de microarranjos de DNA e os genes MDH2 uma

enzima com atividade málica, RHR2 uma enzima com atividade de glicerol 1 fosfatase e

SDH1 uma enzima com atividade de succinato desidrogenase. Aparentemente estes

resultados contradizem aqueles encontrados nos experimentos de microarranjos.

Entretanto, é conveniente salientar que a validação dos experimentos de microarranjos

de DNA através do RT-PCR visa exatamente eliminar os desvios que podem acontecer

nos experimentos de microarranjos. Devemos lembrar que a hibridização dos cDNAs

nos experimentos de microarranjos não é otimizada para um determinado gene, uma vez

que a temperatura de hibridização não leva em consideração um único gene. Assim,

podemos estar trabalhando numa faixa de temperatura de hibridização que é boa para a

maior parte dos genes mas está longe da ideal para outros em particular. Nos

experimentos de RT-PCR, os iniciadores são desenhados e selecionados para uma faixa

de temperatura ótima para todos os genes, com desvios muito pequenos da temperatura

ideal. Nestas condições, podemos analisar com um grau de certeza maior a expressão

dos genes selecionados.

Voltando à analise dos resultados do RT-PCR, podemos observar que sete genes

apresentam uma expressão maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆

em condição de desrepressão metabólica. São eles ARG82 que codifica para uma

inositol muliquinase envolvida no metabolismo de inositois polifosfatos, HXT5 que

codifica para um transportador de glicose de afinidade moderada, ICL2 que codifica

para uma proteína envolvida no metabolismo de ácido propiônico, JEN1 que codifica

para um transportador de lactato, PLC1 que codifica para uma fosfolipase que hidroliza

Fosfatidilinositol -4,5-bifosfato gerando inositol 1,4,5 trifosfato e diacilglicerol, RSF2

que codifica para uma proteína do tipo dedo de zinco e está relacionada ao controle de

genes envolvidos no metabolismo respiratório e no crescimento em glicerol e TKL2 que

codifica para uma proteína envolvida no metabolismo de pentoses fosfato. Todos os

demais genes não apresentam uma expressão diferente quando comparadas as duas

cepas analisadas.

Para excluirmos a possibilidade da existência de artefatos nos experimentos de

RT-PCR como a formação de dímeros de iniciadores durante a reação, realizamos as

57

curvas de dissociação para todos os experimentos realizados. Na figura 20,

apresentamos os resultados para os genes da actina e os sete genes que apresentaram

uma expressão maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆.

Figuras 20 – Curvas de dissociação das reações de RT-PCR. Estão representadas as

curvas de dissociação para as reações realizadas com os cDNAs obtidos das cepas

W303 e pkc1∆. Os genes estão identificados em cada uma das reações.

Os resultados apresentados mostram que não houve a formação de dímeros de

iniciadores ou outros artefatos durante as reações de RT-PCR, demonstrando que os

iniciadores escolhidos satisfizeram os requisitos desejados.

ACTINA ARG82

HXT5 ICL2

PLC1 JEN1

RSF2 TKL2

58

4.3. – Análise “in silico” dos genes diferencialmente expressos.

Com base nestes resultados foi realizada uma analise “in silico “ tentando

encontrar algum fator que pudesse conectar os genes que apresentaram uma menor

expressão na cepa pkc1∆. Para isto, foi realizada uma busca por fatores de transcrição

relacionados com o controle da expressão dos genes acima relacionados, através de

pesquisa no site Yeastract (Teixeira e cols., 2006). Quatro dos sete genes (HXT5, ICL2,

JEN1 e RSF2) apresentaram um sitio de ligação para o fator de transcrição Sok2p, um

repressor transcricional dependente de glicose cuja atividade supressora depende da

fosforilação no resíduo T 598 por PKA (Shenhar & Kassir, 2001).Três genes (HXT5,

ICL2 e TKL2) possuem sítios de ligação para o fator de transcrição Crz1p, um ativador

transcricional dependente de calcineurina envolvido na ativação de FKS2, um

componente do complexo glucano sintase regulado por Pkc1p (Lu e cols., 2005a;

Stathopoulos & Cyert, 1997) (Boustany & Cyert, 2002) e no controle da expressao de

diversos genes em S.cerevisiae (Matheos e cols., 1997).

Buscamos então por possíveis sítios de fosforilação em Sok2p e Crz1p por

Pkc1p utilizando as ferramentas disponíveis no site NETPHOSK (Blom e cols., 2004)e

encontramos dezoito sítios de fosforilação por Pkc1p com “score” acima de 0,70 com o

maior “score” (0,91) na posição 132, indicando uma grande possibilidade de que Sok2p

possa ser fosforilado por Pkc1p. O resíduo T598 não aparece como possível sítio de

fosforilação por Pkc1p, indicando que caso Pkc1p atue sobre Sok2p isto aconteça em

outros resíduos. (Tabela 08)

59

Metodo: NetPhosK com filtro ESS – Corte - 0,70

Nome: Sok2p

Pos: AA: Kinase: Score: Positivo: Negativo:

Pos AA Kinase Score Positivo Negativo

14 S PKC 0.79 2 0

132 T PKC 0.906 2 0

133 T PKC 0.905 2 0

186 S PKC 0.818 2 0

220 T PKC 0.738 2 0

291 S PKC 0.772 2 0

377 T PKC 0.728 2 0

384 T PKC 0.834 2 0

385 T PKC 0.718 2 0

395 T PKC 0.724 2 0

515 S PKC 0.796 2 0

532 S PKC 0.705 2 0

533 T PKC 0.809 2 0

647 T PKC 0.726 2 0

695 S PKC 0.711 2 0

731 T PKC 0.7762 2 0

738 T PKC 0.708 2 0

780 T PKC 0.794 2 0

Tabela 08 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Sok2p utilizando as ferramentas disponíveis no site of NetphosK. A predição dos sítios de fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS (Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão representados.

Estes dados, juntamente com os resultados por nos obtidos, parecem apresentar

uma controvérsia, uma vez que Sok2p funciona como um repressor transcricional

dependente de glicose e que os genes controlados por Sok2p estão menos expressos em

Pkc1p durante o processo de desrepressão metabólica. Uma hipótese para explicar isto,

seria a de que Pkc1p possa regular negativamente a atividade de Sok2p através da

fosforilação em outros resíduos. Na ausência de Pkc1p, Sok2p poderia estar exercendo

seu efeito repressor sobre os demais genes por ele regulados, caracterizando o fenótipo

reprimido da cepa pkc1∆. Para confirmar esta hipótese, teríamos que analisar se Pkc1p

efetivamente fosforila Sok2p.É importante dizer que os níveis de expressão do gene

Sok2p não estão afetados na cepa de pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem

W303, durante o processo de desrepressão metabólica. Outra possibilidade, uma vez

que recentemente nosso laboratório adquiriu a coleção com todos os mutantes contendo

a deleção de todos os genes da cepa Saccharomyces cerevisiae da EuroScarf, seria

analisar se a dupla deleção de PKC1 e SOK2 reverteria o fenótipo de pkc1∆ para os

genes regulados por Sok2p.

60

A busca por sítios de fosforilação em Crz1p resultou em treze possíveis sítios de

fosforilação por Pkc1p com “score” acima de 0,70, com o maior “score” (0,92) na

posição 546, indicando a possibilidade de que Pkc1p fosforile Crz1p (tabela 09).


Nome: Crz1p


Pos AA Kinase Score Positivo Negativo

69 S PKC 0.84 2 0

143 T PKC 0.86 2 0

183 T PKC 0.89 2 0

318 S PKC 0.70 2 0

405 S PKC 0.85 2 0

418 T PKC 0.84 2 0

422 S PKC 0.83 2 0

490 T PKC 0.88 2 0

491 S PKC 0.72 2 0

544 T PKC 0.87 2 0

546 S PKC 0.91 2 0

620 T PKC 0.88 2 0

657 S PKC 0.74 2 0

Tabela 09 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Crz1p utilizando as ferramentas disponíveis no site NetphosK. A predição dos sítios de fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS (Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão representados.

Crz1p é um fator de transcrição envolvido na ativação da transcrição de FKS2

dependente de calcineurina em resposta ao Cálcio. Zhao e colaboradores (Zhao e cols.,

1998)demonstraram que a via de calcineurina e a via de integridade celular funcionam

em paralelo durante o crescimento em condições de altas temperaturas moderadas e que

a indução de FKS2 durante o crescimento celular em meio pobre em fontes de carbono

era dependente de SNF1 e MIG1. Resultados anteriores em nosso laboratório

demonstraram que PKC1 está envolvido na regulação da localização celular de Mig1p.

Zakrzewska e colaboradores (Zakrzewska e cols., 2005)demonstraram que Crz1p está envolvido

na resposta celular a quitosano, um composto formado por cadeias lineares de resíduos de β-1,4

glicoseaminas que age perturbando a membrana celular, mostrando que células

deletadas do gene CRZ1 são mais sensíveis ao quitosano. Garcia e colaboradores

mostraram que o uso de agentes que causam perturbações na parede celular como

vermelho congo e zimolase induziu um aumento da expressão de diversos genes

relacionados à via de integridade da parede celular e que Crz1p estava relacionado à

61

regulação da expressão de alguns desses genes.(Garcia e cols., 2004). Lagorce e

colaboradores (Lagorce e cols., 2003), usando mutantes da via de síntese da parede

celular, demonstraram que a via de integridade celular e a via de Ca++/Calcineurina

atuavam em conjunto regulando a expressão de FKS2 através da ação de Crz1p.

Analisando estes dados em conjunto, podemos estabelecer uma conexão entre

Pkc1p e Crz1p, atuando conjuntamente na manutenção da integridade celular. A

ausência da Pkc1p e conseqüentemente mudanças estruturais ao nível da parede celular,

uma vez que Pkc1p está diretamente envolvida no metabolismo da parede celular

através da ativação da via das MAP quinases e do complexo glucano sintase, pode se

refletir na composição da membrana celular numa tentativa de se manter a integridade

celular. Uma vez que um dos alvos da via de integridade celular é o gene FKS2, que

também é controlado por CRZ1, é possível pensar na hipótese de que outros genes

compartilhem um mecanismo de controle exercido por Pkc1p e Crz1p. Estudos mais

detalhados, com a construção de duplos mutantes pkc1∆:crz1∆ podem permitir uma

visão mais detalhada das possíveis interações de Pkc1p com Crz1p.

Voltando aos genes cuja expressão está diminuída na cepa pkc1∆ , é interessante

notar que dois deles codificam para transportadores presentes na membrana celular (

HXT5 e JEN1). Resultados anteriores obtidos em nosso laboratório mostram que outros

transportadores de glicose também estão menos expressos na cepa pkc1∆ quando

comparada com a cepa selvagem W303. Uma menor expressão destes transportadores

poderia explicar o crescimento mais lento de pkc1∆, uma vez que a captação de

nutrientes, essencial para o crescimento celular, é diretamente dependente da expressão

dos mesmos. Como discutido anteriormente, perturbações ao nível da parede celular

podem implicar em alterações ao nível da membrana celular, o que pode afetar a

organização e a funcionalidade das proteínas associadas à mesma.

Dois outros genes (ARG82 e PLC1) estão envolvidos no metabolismo de

inositois e na sinalização celular dependente de fosfolipídios. Embora em mamíferos

exista uma correlação direta entre PKC e PLC1 através da ação de Diacilglicerol e

Ca++, produtos finais da ação de Plc1p que atuam ativando a Pkc1p (O'Brian & Ward,

1989; Bell e cols., 1986), esta conexão não foi observada em leveduras. A menor

expressão de ARG82 e PLC1 pode estar relacionada com o metabolismo dos lipídeos

da membrana celular, uma vez que a cepa pkc1∆ apresenta problemas relacionados à

manutenção da integridade da parede celular. Outro fator a ser levado em conta é o fato

que produtos do metabolismo de fosfolipídeos como IP3, IP4, IP5 e IP6 e outros, estão

62

relacionados com vias de controle da expressão gênica e nos mecanismos envolvidos no

transporte de mRNAs a partir do núcleo (Odom e cols., 2000; York e cols., 1999; cazar-

Roman e cols., 2006; Resnick e cols., 2005; Auesukaree e cols., 2005; Chi e cols.,

2004). Uma menor expressão de ARG82 e PLC1 poderia afetar o metabolismo destes

fosfolipídeos, afetando a expressão de diversos genes ou mesmo afetando de uma

maneira geral o transporte de mRNAs a partir do núcleo.

O gene RSF2 é um gene cuja expressão é fundamental para o metabolismo

aeróbico e para o metabolismo do glicerol. Lu e colaboradores (Lu e cols.,

2005b)demonstraram que RSF2 controla uma série de genes envolvidos com a

utilização de glicerol como fonte de carbono e genes mitocondriais envolvidos na

respiração celular.Uma expressão diminuída de RSF2 pode explicar a ausência da

segunda fase de crescimento e a incapacidade que a cepa pkc1∆ tem de crescer em

glicerol como única fonte de carbono, conforme descrito anteriormente em nosso

laboratório.

63

Uma busca por fatores de transcrição associados aos genes cuja expressão estava

aumentada em pkc1∆ através do programa Yeastract, nos permitiu identificar o fator de

transcrição Gcr1p, que possue sítios de ligação em três dos quatro genes pesquisados

(HXT4, RHR2 e SDH1).

Gcr1p é um fator transcricional ativador de genes envolvidos na glicólise,

atuando como regulador positivo da enolase e de genes da família das gliceraldeido -3 -

fosfato desidrogenases.

Uma busca por sítios de fosforilação por Pkc1p em Gcr1p resultou em nove

possíveis sítios de fosforilação com score superior a 0,70, indicando a possibilidade de

que Gcr1p seja fosforilado por Pkc1p ( Tabela 10).

Tabela 10 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Gcr1p1p utilizando as ferramentas disponíveis no site NetphosK. A predição dos sítios de fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS (Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão representados.

Zeng e colaboradores (Zeng e cols., 1997) demonstraram que Gcr1p é altamente

fosforilado em resíduos de serina e que esta fosforilação é dependente do fator Gcr2p.

Entretanto, não foram identificadas qual ou quais seriam as quinases responsáveis pela

fosforilação de Gcr1p e muito menos se a fosforilação do mesmo aumentava ou

diminuía sua atividade como ativador transcricional.

Para analisar se Pkc1p efetivamente fosforila Gcr1p, serão necessários ensaios

de fosforilação “in vitro” e “in vivo” para confirmação. Também seria interessante

analisar o fenótipo do duplo mutante pkc1∆:gcr1∆ e a expressão dos genes regulados

por Gcr1p durante o processo de desrepressão metabólica..


Nome: Gcr1p


20 S PKC 0.85 2 0

48 T PKC 0.8 2 0

132 S PKC 0.81 2 0

225 S PKC 0.78 2 0

479 S PKC 0.81 2 0

605 T PKC 0.77 2 0

607 T PKC 0.77 2 0

612 S PKC 0.8 2 0

687 T PKC 0.75 2 0

64

4.4. - Análise da atividade de ß-galactosidase das construções CYC1-ß-Gal, HXT1-

ß-Gal e SUC2- ß-Gal.

Resultados obtidos em nosso laboratório por Brandão e cols.. (2002)

demonstraram que uma cepa de S. cerevisiae com deleção do gene PKC1 apresentava

uma série de problemas na desrepressão metabólica. As células de pkc1∆ não eram

capazes de crescer em glicerol como única fonte de carbono, apresentavam uma

atividade invertásica bastante diminuída mesmo em condições de desrepressão e baixa

expressão do gene SUC2 que codifica para a invertase; além disso, tinham um

crescimento menor na segunda fase de crescimento e apresentava problemas de

expressão dos genes que codificam para os transportadores de glicose Hxt1, Hxt2 e

Hxt4.

Através da transformação das cepas pkc1∆ e W303 com os plasmídeos contendo

o gene da ß-galactosidase sob controle dos promotores dos genes HXT1, SUC2 e CYC1

foram obtidos diversos transformantes selecionados em meio SD-Uracila. Os

transformantes foram transferidos para meio líquido e testados de acordo com a

metodologia descrita.

Na Figura 21, apresentamos os resultados da incubação de células de pkc1∆ e

W303 transformadas com a construção CYC1-ß-galactosidase. O gene CYC1 codifica a

proteína citocromo C, isoforma 1, uma proteína envolvida no transporte de elétrons

durante o processo de respiração celular. Como podemos observar ambas as células

apresentaram atividade de ß-galactosidase quando transferidas para o meio contendo

rafinose como fonte de carbono. A cepa pkc1∆ apresentou uma atividade de ß-

galactosidase superior se comparada à cepa selvagem W303. Os dados representam a

média de três experimentos independentes, realizados com células de leveduras

transformadas isoladas de colônias diferentes.

65

CYC1-LacZ

0

2500

5000

7500

10000

12500

0 10 20 30

Tempo ( horas)

Ativ

idad

e β

-Gal

acto

sida

se n

mol

es

ON

P/m

in/m

g pr

otei

na

W303

pkc1

*

**

*

Figura 21 – Atividade de ß-galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das

cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção CYC1–ß-Galactosidase.(*)

p<0,05.

Estes resultados indicam que a indução da transcrição do gene da ß-

galactosidase associado ao promotor do gene CYC1 foi superior na cepa pkc1∆ quando

comparamos com a cepa selvagem W303. Isto indica que, apesar de não apresentar uma

segunda fase metabólica respiratória, este problema não se encontra associado à

ativação da transcrição do gene CYC1, devendo haver outros mecanismos envolvidos na

deficiência respiratória da cepa pkc1∆.

Na Figura 22 apresentamos os resultados referentes às células do mutante pkc1∆

e da cepa selvagem correspondente W303 transformadas com a construção HXT1-ß-

galactosidase transferidas de um meio SD-Uracila e rafinose2% para um meio SD-

Uracila e glicose 4% para desrepressão do gene HXT1. O gene HXT1 codifica para um

transportador de glicose de baixa afinidade.Como podemos observar, tanto as células

pkc1∆ quanto as células W303 apresentaram atividade da ß-galactosidase, compatível

com a indução do promotor do gene HXT1. Entretanto, os níveis de indução foram

significativamente menores na cepa pkc1∆ do que na cepa W303, indicando que a cepa

pkc1∆ apresenta problemas de desrepressão do gene HXT1.

66

HXT1

0

3000

6000

9000

12000

15000

0 10 20 30

Tempo ( Horas)

Ati

vida

de

-Gal

acto

sida

se n

mol

es

ON

P/m

in/m

g pr

otei

na

W303

pkc1

*

*

*

*

Figura 22 – Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das

cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção HXT1 – ß-Galactosidase. .(*)

p<0,05.

Estes dados corroboram aqueles apresentados por Brandão (2002), que

demonstraram que a cepa pkc1∆ apresentava problemas relacionados à expressão de

alguns transportadores de glicose, inclusive HXT1. O defeito apresentado pela cepa

pkc1∆ na expressão de transportadores de baixa e alta afinidade por glicose, pode ser

um dos fatores cruciais no que diz respeito ao crescimento mais lento que esta cepa

apresenta quando comparada à cepa selvagem, uma vez que a disponibilidade

intracelular de glicose pode estar afetada. Para confirmar esta hipótese, seria necessário

realizar experimentos de captação de glicose, comparando-se as cepas pkc1∆ e W303.

Os dados obtidos para este experimento não podem ser comparados com os

dados obtidos com os experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR, uma vez que

para este ensaio, as células foram crescidas em condição de desrepressão metabólica

(rafinose) e depois foram reincubadas em condições de repressão metabólica (glicose),

uma vez que a transcrição do gene HXT1 é ativada por altas concentrações de glicose. O

fato de não encontrarmos diferença na expressão do gene HXT1 nos experimentos de

microarranjos de DNA e RT-PCR, pode ser explicado pelo fato de termos incubado as

células em glicose e depois termos reincubado as mesmas em rafinose. O tempo em que

as células foram mantidas em condição de desrepressão metabólica (2 horas) pode não

ter sido suficiente para que os níveis de mRNA do gene HXT1 fossem alterados

significativamente nas duas cepas estudadas.

67

Na Figura 23, podemos ver o perfil de indução da transcrição da ß-galactosidase

associada ao promotor do gene SUC2 que codifica para a enzima invertase, após a

transferência das células de meio SD-Ura mais glicose 4% para um meio SD-Ura mais

rafinose 2%. Como podemos observar, ocorre a indução da transcrição do gene da ß-

galactosidase associado ao promotor do gene SUC2 tanto na cepa W303 quanto na cepa

Pkc ∆, não havendo diferença significativa entre as duas cepas.

SUC2-LacZ

0

250

500

750

1000

1250

1500

0 5 10 15 20 25

Tempo ( Horas)

Ati

vida

de

-Gal

acto

sida

se n

mol

es

ON

P/m

in/m

g pr

otei

na

W303

pkc1

*

Figura 23 – Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das

cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-Galactosidase. .(*)

p<0,05.

Dados apresentados por Brandão (2002) indicavam que a atividade de invertase

estava bastante diminuída na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem

W303. Decidimos então analisar a atividade de invertase nas cepas transformadas com a

construção SUC2–ß-galactosidase. Os resultados são apresentados na Figura 24.

68

Invertase - SUC2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25Tempo (Horas)

nmol

Gli

cose

x m

in-1

x m

g pr

otei

na-1

W303

pkc1

*

*

**

Figura 24 – Atividade de invertase (em nmoles de glicose/min/mg de proteína) das

cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-Galactosidase. .(*)

p<0,05.

Como podemos observar, a atividade de invertase da cepa selvagem W303 é

muito maior que aquela apresentada pela cepa pkc1∆ em todo o intervalo de tempo

analisado. Os tempos correspondem ao tempo de transferência das células de um meio

YPglicose 4% para um meio YPrafinose 2%. Os dados encontrados corroboram aqueles

descritos por Brandão, exceto pelos resultados da atividade de ß-galactosidase das

construções de SUC2 – ß-galactosidase. Estes resultados, associados aos encontrados

nos experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR, indicam que a indução da

transcrição do gene SUC2 não apresenta problemas na cepa pkc1∆ quando comparada

com a cepa selvagem. Estes resultados sugerem que os baixos níveis de atividade

invertásica encontrados na cepa pkc1∆ não são devidos a problemas relacionados com a

transcrição do gene SUC2. Nossos dados apontam que a baixa atividade de invertase na

cepa pkc1∆ parece estar relacionada a problemas pós-transcricionais, podendo estar

relacionada com a estabilidade da proteína invertase por exemplo. Estudos mais

específicos devem ser realizados para avaliar esta hipótese.

69

CONCLUSÕES

70

5 - Conclusões

5.1 - Com base nos resultados das análises do padrão de expressão global dos

genes através de microarranjos de DNA e RT-PCR, podemos confirmar a participação

de Pkc1p nos mecanismos envolvidos na regulação da expressão de diversos genes

durante o processo de desrepressão metabólica.

5.1.1 - A cepa pkc1∆ de S. cerevisiae apresenta níveis diminuídos de expressão

dos genes ARG82, HXT5, ICL2, JEN1, PLC1, RSF2 e TKL2 quando comparada com a

cepa selvagem W303 durante o processo de desrepressão metabólica.

5.1.2 – Os genes HXT4, MDH2, RHR2 e SDH1 apresentam um nível de

expressão aumentado na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303

durante o processo de desrepressão metabólica.

5.1.3 – Os genes HXT1 e SUC2 não apresentaram expressão alterada nos

experimentos de RT-PCR realizados quando comparadas as duas cepas analisadas.

5.2 – A análise “in silico” dos sete genes cuja expressão está diminuída na cepa

pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303 encontraram dois fatores

transcricionais, Sok2p e Crz1p, possivelmente envolvidos na regulação desses genes.

5.2.1 – O fator Sok2p, um repressor transcricional dependente de glicose, possue

sítios de ligação em quatro genes HXT5, ICL2, JEN1 e RSF2.

5.2.2 – O fator Crz1p, um ativador transcricional dependente de calcineurina,

possue sítios de ligação em três genes HXT5,ICL2 eTKL2

5.2.3 – A análise “in silico” dos quatro genes cuja expressão está aumentada na

cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303 encontrou um fator de

transcrição, Gcr1p, envolvido na regulação de três dos quatro genes analisados (HXT4,

RHR2 e SDH1).

.

71

5.2.4 – Os fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e Gcr1p possuem prováveis sítios

de fosforilação por Pkc1p com scores superiores a 0,70. Sok2p apresenta dezoito sítios

de fosforilação por Pkc1p, Crz1p apresenta treze sítios de fosforilação e Gcr1p possue

nove sítios de fosforilação por Pkc1p.

5.3 – Os ensaios com as construções com os plasmídeos contendo o gene da ß-

galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram

que:

5.3.1 - a indução da transcrição do gene da ß-galactosidase associado ao

promotor do gene CYC 1 foi superior na cepa pkc1∆ quando comparamos com a cepa

selvagem W303.

5.3.2 - tanto as células pkc1∆ quanto as células W303 apresentaram atividade da

ß-galactosidase, compatível com a indução do promotor do gene HXT1. Entretanto, os

níveis de indução foram significativamente menores na cepa pkc1∆ do que na cepa

W303, indicando que a cepa pkc1∆ apresenta diminuição da resposta de desrepressão

do gene HXT1.

5.3.3 - ocorre a indução da transcrição do gene da ß-galactosidase associado ao

promotor do gene SUC2 tanto na cepa W303 quanto na cepa pkc1∆, não havendo

diferença significativa entre as duas cepas. Entretanto, a atividade de invertase é

significativamente menor na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem

W303.

72

PERSPECTIVAS

73

6 - Perspectivas

6.1 – Analisar através de ensaios de fosforilação “in vitro” e “in vivo” se Pkc1p

fosforila os fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e Gcr1p.

6.2 – Analisar a localização celular dos fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e

Gcr1p nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ durante o processo de desrepressão

metabólica.

6.3 – Analisar a expressão de outros genes controlados por Sok2p, Crz1p e

Gcr1p durante o processo de desrepressão metabólica nas cepas selvagem W303 e

pkc1∆.

6.4 – Analisar o fenótipo de cepas obtidas através da construção de duplos

mutantes pkc1∆:sok2∆; pkc1∆:crz1∆; pkc1∆:gcr1∆ durante o processo de desrepressão

metabólica e a expressão dos genes analisados nos ensaios de RT-PCR que

apresentaram uma expressão alterada nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ relacionados a

estes fatores.

6.5 – Analisar os mecanismos pós-transcricionais envolvidos nos processos de

síntese e estabilidade de proteínas, com o objetivo de explicar porque os níveis de

atividade de invertase estão diminuídos na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa

selvagem W303.

74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

75

7 - Referências Bibliográficas

AHUATZI D., HERRERO P., DE LA C.T. & MORENO F. (2004) The glucose-regulated nuclear localization of hexokinase 2 in Saccharomyces cerevisiae is Mig1-dependent. J.Biol.Chem. 279, 14440-14446.

ASNAGLI H. & MURPHY K.M. (2001) The functional genomics experience (are you experienced?). Nat.Immunol. 2, 826-828.

ATRIAN S., GONZALEZ-DUARTE R. & FOTHERGILL-GILMORE L.A. (1990) Synthesis of Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase in yeast. Gene 93, 205-212.

AUESUKAREE C., TOCHIO H., SHIRAKAWA M., KANEKO Y. & HARASHIMA S. (2005) Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 280, 25127-25133.

BARBET N.C., SCHNEIDER U., HELLIWELL S.B., STANSFIELD I., TUITE M.F. & HALL M.N. (1996) TOR controls translation initiation and early G1 progression in yeast. Mol.Biol.Cell 7, 25-42.

BAYROCK D.P. & MICHAEL I.W. (2001) Application of multistage continuous fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology. J.Ind.Microbiol.Biotechnol. 27, 87-93.

BELL R.M., HANNUN Y.A. & LOOMIS C.R. (1986) Mechanism of regulation of protein kinase C by lipid second messengers. Symp.Fundam.Cancer Res. 39, 145-156.

BLOM N., SICHERITZ-PONTEN T., GUPTA R., GAMMELTOFT S. & BRUNAK S. (2004) Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence. Proteomics. 4, 1633-1649.

BOUSTANY L.M. & CYERT M.S. (2002) Calcineurin-dependent regulation of Crz1p nuclear export requires Msn5p and a conserved calcineurin docking site. Genes

Dev. 16, 608-619.

BRANDAO R.L., ETCHEBEHERE L., QUEIROZ C.C., TROPIA M.J., ERNANDES J.R., GONCALVES T., LOUREIRO-DIAS M.C., WINDERICKX J., THEVELEIN J.M., LEIPER F.C., CARLING D. & CASTRO I.M. (2002) Evidence for involvement of Saccharomyces cerevisiae protein kinase C in glucose induction of HXT genes and derepression of SUC2. FEMS Yeast Res. 2, 93-102.

BREITKREUTZ A. & TYERS M. (2002) MAPK signaling specificity: it takes two to tango. Trends Cell Biol. 12, 254-257.

76

CAZAR-ROMAN A.R., TRAN E.J., GUO S. & WENTE S.R. (2006) Inositol hexakisphosphate and Gle1 activate the DEAD-box protein Dbp5 for nuclear mRNA export. Nat.Cell Biol. 8, 711-716.

CHAE H.J., JOO H. & IN M.J. (2001) Utilization of brewer's yeast cells for the production of food-grade yeast extract. Part 1: Effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics. Bioresour.Technol. 76, 253-258.

CHAI B., HSU J.M., DU J. & LAURENT B.C. (2002) Yeast RSC function is required for organization of the cellular cytoskeleton via an alternative PKC1 pathway. Genetics 161, 575-584.

CHEN R.E. & THORNER J. (2007) Function and regulation in MAPK signaling pathways: lessons learned from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim.Biophys.Acta 1773, 1311-1340.

CHI Z.M., LI J.F., WANG X.H. & YAO S.M. (2004) Inositol and phosphatidylinositol mediated mediated glucose derepression, gene expression and invertase secretion in yeasts. Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 36, 443-449.

DAS M., BURGE C.B., PARK E., COLINAS J. & PELLETIER J. (2001) Assessment of the total number of human transcription units. Genomics 77, 71-78.

DOORES S. (1983) The microbiology of apples and apple products. Crit Rev.Food

Sci.Nutr. 19, 133-149.

DUJON B. (1996) The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet. 12, 263-270.

ELBING K., STAHLBERG A., HOHMANN S. & GUSTAFSSON L. (2004) Transcriptional responses to glucose at different glycolytic rates in Saccharomyces cerevisiae. Eur.J.Biochem. 271, 4855-4864.

GANCEDO J.M. (1998b) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 62, 334-361.

GANCEDO J.M. (1998a) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 62, 334-361.

GARCIA R., BERMEJO C., GRAU C., PEREZ R., RODRIGUEZ-PENA J.M., FRANCOIS J., NOMBELA C. & ARROYO J. (2004) The global transcriptional response to transient cell wall damage in Saccharomyces cerevisiae and its regulation by the cell integrity signaling pathway. J.Biol.Chem. 279, 15183-15195.

GELADE R., VAN d., V, VAN D.P. & THEVELEIN J.M. (2003) Multi-level response of the yeast genome to glucose. Genome Biol. 4, 233

GENTLEMAN R & IHAKA R (1997) The R language. In Proceedings of the 28th

Symposium on the Interface, L.Billard and N.Fisher Eds.The Interface

Foundation of North America

77

GILL G.S. & ZAWORSKI P.G. (1991) Use of yeasts in production and discovery of pharmaceuticals. Ann.N.Y.Acad.Sci. 646, 172-180.

GOFFEAU A., BARRELL B.G., BUSSEY H., DAVIS R.W., DUJON B., FELDMANN H., GALIBERT F., HOHEISEL J.D., JACQ C., JOHNSTON M., LOUIS E.J., MEWES H.W., MURAKAMI Y., PHILIPPSEN P., TETTELIN H. & OLIVER S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science 274, 546, 563-546, 567.

GOMES K.N., FREITAS S.M., PAIS T.M., FIETTO J.L., TOTOLA A.H., ARANTES R.M., MARTINS A., LUCAS C., SCHULLER D., CASAL M., CASTRO I.M., FIETTO L.G. & BRANDAO R.L. (2005) Deficiency of Pkc1 activity affects glycerol metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 5, 767-776.

GRAY J.V., OGAS J.P., KAMADA Y., STONE M., LEVIN D.E. & HERSKOWITZ I. (1997) A role for the Pkc1 MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae in bud emergence and identification of a putative upstream regulator. EMBO J. 16, 4924-4937.

GUSTIN M.C., ALBERTYN J., ALEXANDER M. & DAVENPORT K. (1998) MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 62, 1264-1300.

HEINISCH J.J., LORBERG A., SCHMITZ H.P. & JACOBY J.J. (1999b) The protein kinase C-mediated MAP kinase pathway involved in the maintenance of cellular integrity in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Microbiol. 32, 671-680.

HEINISCH J.J., LORBERG A., SCHMITZ H.P. & JACOBY J.J. (1999a) The protein kinase C-mediated MAP kinase pathway involved in the maintenance of cellular integrity in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Microbiol. 32, 671-680.

HELLIWELL S.B., HOWALD I., BARBET N. & HALL M.N. (1998a) TOR2 is part of two related signaling pathways coordinating cell growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 148, 99-112.

HELLIWELL S.B., SCHMIDT A., OHYA Y. & HALL M.N. (1998b) The Rho1 effector Pkc1, but not Bni1, mediates signalling from Tor2 to the actin cytoskeleton. Curr.Biol. 8, 1211-1214.

HENSING M.C., ROUWENHORST R.J., HEIJNEN J.J., VAN DIJKEN J.P. & PRONK J.T. (1995) Physiological and technological aspects of large-scale heterologous-protein production with yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek 67, 261-279.

HINNEN A., HICKS J.B. & FINK G.R. (1978) Transformation of yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 75, 1929-1933.

HOHMANN S. (2002) Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 66, 300-372.

HOLM H.E., NISSEN P., SOMMER P., NIELSEN J.C. & ARNEBORG N. (2001) The effect of oxygen on the survival of non-Saccharomyces yeasts during mixed

78

culture fermentations of grape juice with Saccharomyces cerevisiae. J.Appl.Microbiol. 91, 541-547.

HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004c) The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends

Biochem.Sci. 29, 556-564.

HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004b) The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends


HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004a) The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends


IGUAL J.C., JOHNSON A.L. & JOHNSTON L.H. (1996) Coordinated regulation of gene expression by the cell cycle transcription factor Swi4 and the protein kinase C MAP kinase pathway for yeast cell integrity. EMBO J. 15, 5001-5013.

JOHNSTON M. & KIM J.H. (2005) Glucose as a hormone: receptor-mediated glucose sensing in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem.Soc.Trans. 33, 247-252.

KANIAK A., XUE Z., MACOOL D., KIM J.H. & JOHNSTON M. (2004) Regulatory network connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot.Cell 3, 221-231.

KIM J.H., BRACHET V., MORIYA H. & JOHNSTON M. (2006) Integration of transcriptional and posttranslational regulation in a glucose signal transduction pathway in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot.Cell 5, 167-173.

LAGORCE A., HAUSER N.C., LABOURDETTE D., RODRIGUEZ C., MARTIN-YKEN H., ARROYO J., HOHEISEL J.D. & FRANCOIS J. (2003) Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 278, 20345-20357.

LANGKJAER R.B., CASAREGOLA S., USSERY D.W., GAILLARDIN C. & PISKUR J. (2003) Sequence analysis of three mitochondrial DNA molecules reveals interesting differences among Saccharomyces yeasts. Nucleic Acids Res. 31, 3081-3091.

LEVIN D.E., BOWERS B., CHEN C.Y., KAMADA Y. & WATANABE M. (1994) Dissecting the protein kinase C/MAP kinase signalling pathway of Saccharomyces cerevisiae. Cell Mol.Biol.Res. 40, 229-239.

LEVIN D.E., FIELDS F.O., KUNISAWA R., BISHOP J.M. & THORNER J. (1990) A candidate protein kinase C gene, PKC1, is required for the S. cerevisiae cell cycle. Cell 62, 213-224.

LIVAK K.J. & SCHMITTGEN T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408.

79

LOWRY O.H., ROSEBROUGH N.J., FARR A.L. & RANDALL R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem. 193, 265-275.

LU L., ROBERTS G.G., OSZUST C. & HUDSON A.P. (2005a) The YJR127C/ZMS1 gene product is involved in glycerol-based respiratory growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 48, 235-246.

LU L., ROBERTS G.G., OSZUST C. & HUDSON A.P. (2005b) The YJR127C/ZMS1 gene product is involved in glycerol-based respiratory growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 48, 235-246.

MADDEN K., SHEU Y.J., BAETZ K., ANDREWS B. & SNYDER M. (1997) SBF cell cycle regulator as a target of the yeast PKC-MAP kinase pathway. Science 275, 1781-1784.

MARAZ A. (2002) From yeast genetics to biotechnology. Acta

Microbiol.Immunol.Hung. 49, 483-491.

MARINI N.J., MELDRUM E., BUEHRER B., HUBBERSTEY A.V., STONE D.E., TRAYNOR-KAPLAN A. & REED S.I. (1996) A pathway in the yeast cell division cycle linking protein kinase C (Pkc1) to activation of Cdc28 at START. EMBO J. 15, 3040-3052.

MASHEGO M.R., JANSEN M.L., VINKE J.L., VAN GULIK W.M. & HEIJNEN J.J. (2005) Changes in the metabolome of Saccharomyces cerevisiae associated with evolution in aerobic glucose-limited chemostats. FEMS Yeast Res. 5, 419-430.

MASIMIREMBWA C.M., OTTER C., BERG M., JONSSON M., LEIDVIK B., JONSSON E., JOHANSSON T., BACKMAN A., EDLUND A. & ANDERSSON T.B. (1999) Heterologous expression and kinetic characterization of human cytochromes P-450: validation of a pharmaceutical tool for drug metabolism research. Drug Metab Dispos. 27, 1117-1122.

MATHEOS D.P., KINGSBURY T.J., AHSAN U.S. & CUNNINGHAM K.W. (1997) Tcn1p/Crz1p, a calcineurin-dependent transcription factor that differentially regulates gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11, 3445-3458.

MAZUR P. & BAGINSKY W. (1996) In vitro activity of 1,3-beta-D-glucan synthase requires the GTP-binding protein Rho1. J.Biol.Chem. 271, 14604-14609.

MAZUR P., MORIN N., BAGINSKY W., EL-SHERBEINI M., CLEMAS J.A., NIELSEN J.B. & FOOR F. (1995) Differential expression and function of two homologous subunits of yeast 1,3-beta-D-glucan synthase. Mol.Cell Biol. 15, 5671-5681.

MORENO-ARRIBAS M.V. & POLO M.C. (2005) Winemaking biochemistry and microbiology: current knowledge and future trends. Crit Rev.Food Sci.Nutr. 45, 265-286.

NATH N., MCCARTNEY R.R. & SCHMIDT M.C. (2003) Yeast Pak1 kinase associates with and activates Snf1. Mol.Cell Biol. 23, 3909-3917.

80

NEWCOMB L.L., DIDERICH J.A., SLATTERY M.G. & HEIDEMAN W. (2003) Glucose regulation of Saccharomyces cerevisiae cell cycle genes. Eukaryot.Cell 2, 143-149.

O'BRIAN C.A. & WARD N.E. (1989) Biology of the protein kinase C family. Cancer

Metastasis Rev. 8, 199-214.

O'ROURKE S.M. & HERSKOWITZ I. (2004) Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis. Mol.Biol.Cell 15, 532-542.

O'ROURKE S.M., HERSKOWITZ I. & O'SHEA E.K. (2002) Yeast go the whole HOG for the hyperosmotic response. Trends Genet. 18, 405-412.

ODOM A.R., STAHLBERG A., WENTE S.R. & YORK J.D. (2000) A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science 287, 2026-2029.

ONO T., SUZUKI T., ANRAKU Y. & IIDA H. (1994) The MID2 gene encodes a putative integral membrane protein with a Ca(2+)-binding domain and shows mating pheromone-stimulated expression in Saccharomyces cerevisiae. Gene 151, 203-208.

OSTERGAARD S., OLSSON L. & NIELSEN J. (2000) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 64, 34-50.

OZCAN S., DOVER J. & JOHNSTON M. (1998) Glucose sensing and signaling by two glucose receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 17, 2566-2573.

OZCAN S. & JOHNSTON M. (1999) Function and regulation of yeast hexose transporters. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 63, 554-569.

PAPAMICHOS-CHRONAKIS M., GLIGORIS T. & TZAMARIAS D. (2004) The Snf1 kinase controls glucose repression in yeast by modulating interactions between the Mig1 repressor and the Cyc8-Tup1 co-repressor. EMBO Rep. 5, 368-372.

RADHIKA V., MILKEVITCH M., AUDIGE V., PROIKAS-CEZANNE T. & DHANASEKARAN N. (2005) Engineered Saccharomyces cerevisiae strain BioS-1, for the detection of water-borne toxic metal contaminants. Biotechnol.Bioeng. 90, 29-35.

RADHIKA V., PROIKAS-CEZANNE T., JAYARAMAN M., ONESIME D., HA J.H. & DHANASEKARAN D.N. (2007) Chemical sensing of DNT by engineered olfactory yeast strain. Nat.Chem.Biol. 3, 325-330.

RESNICK A.C., SNOWMAN A.M., KANG B.N., HURT K.J., SNYDER S.H. & SAIARDI A. (2005) Inositol polyphosphate multikinase is a nuclear PI3-kinase with transcriptional regulatory activity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102, 12783-12788.

81

RO D.K., PARADISE E.M., OUELLET M., FISHER K.J., NEWMAN K.L., NDUNGU J.M., HO K.A., EACHUS R.A., HAM T.S., KIRBY J., CHANG M.C., WITHERS S.T., SHIBA Y., SARPONG R. & KEASLING J.D. (2006) Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature 440, 940-943.

ROMBAUT B. & JORE J.P. (1997) Immunogenic, non-infectious polio subviral particles synthesized in Saccharomyces cerevisiae. J.Gen.Virol. 78 ( Pt 8), 1829-1832.

ROSE A.H. (1981) The microbiological production of food and drink. Sci.Am. 245, 126-34, 136, 138.

SAITO H. & TATEBAYASHI K. (2004) Regulation of the osmoregulatory HOG MAPK cascade in yeast. J.Biochem.(Tokyo) 136, 267-272.

SALGADO A.P., SCHULLER D., CASAL M., LEAO C., LEIPER F.C., CARLING D., FIETTO L.G., TROPIA M.J., CASTRO I.M. & BRANDAO R.L. (2002) Relationship between protein kinase C and derepression of different enzymes. FEBS Lett. 532, 324-332.

SCHMIDT A., BICKLE M., BECK T. & HALL M.N. (1997) The yeast phosphatidylinositol kinase homolog TOR2 activates RHO1 and RHO2 via the exchange factor ROM2. Cell 88, 531-542.

SCHMIDT A., SCHMELZLE T. & HALL M.N. (2002) The RHO1-GAPs SAC7, BEM2 and BAG7 control distinct RHO1 functions in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Microbiol. 45, 1433-1441.

SCHMITZ H.P. & HEINISCH J.J. (2003) Evolution, biochemistry and genetics of protein kinase C in fungi. Curr.Genet. 43, 245-254.

SCHOFIELD D.A., WESTWATER C., BARTH J.L. & DINOVO A.A. (2007) Development of a yeast biosensor-biocatalyst for the detection and biodegradation of the organophosphate paraoxon. Appl.Microbiol.Biotechnol.

SCHULLER H.J. (2003) Transcriptional control of nonfermentative metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 43, 139-160.

SHENHAR G. & KASSIR Y. (2001) A positive regulator of mitosis, Sok2, functions as a negative regulator of meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Cell Biol. 21, 1603-1612.

SMITH H.A., GORMAN J.W., KOLTIN Y. & GORMAN J.A. (1990) Functional expression of the Candida albicans beta-tubulin gene in Saccharomyces cerevisiae. Gene 90, 115-123.

STATHOPOULOS A.M. & CYERT M.S. (1997) Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev. 11, 3432-3444.

82

TAMAS M.J., REP M., THEVELEIN J.M. & HOHMANN S. (2000) Stimulation of the yeast high osmolarity glycerol (HOG) pathway: evidence for a signal generated by a change in turgor rather than by water stress. FEBS Lett. 472, 159-165.

TAYLOR F., KURANTZ M.J., GOLDBERG N. & CRAIG J.C., Jr. (1995) Continuous fermentation and stripping of ethanol. Biotechnol.Prog. 11, 693-698.

TAYLOR F., KURANTZ M.J., GOLDBERG N., MCALOON A.J. & CRAIG J.C., Jr. (2000) Dry-grind process for fuel ethanol by continuous fermentation and stripping. Biotechnol.Prog. 16, 541-547.

TEIXEIRA M.C., MONTEIRO P., JAIN P., TENREIRO S., FERNANDES A.R., MIRA N.P., ALENQUER M., FREITAS A.T., OLIVEIRA A.L. & SA-CORREIA I. (2006) The YEASTRACT database: a tool for the analysis of transcription regulatory associations in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic

Acids Res. 34, D446-D451

TREITEL M.A. & CARLSON M. (1995) Repression by SSN6-TUP1 is directed by MIG1, a repressor/activator protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92, 3132-3136.

TRÓPIA MJ, CARDOSO AS, TISI R, FIETTO LG, FIETTO JL, MARTEGANI E, CASTRO IM, BRANDÃO RL. (2006) Calcium signaling and sugar-induced activation of plasma membrane H(+)-ATPase in Saccharomyces cerevisiae cells. Biochem Biophys Res Commun. 19;343(4):1234-43.

VALENTINI S.R., CASOLARI J.M., OLIVEIRA C.C., SILVER P.A. & MCBRIDE A.E. (2002) Genetic interactions of yeast eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) reveal connections to poly(A)-binding protein and protein kinase C signaling. Genetics 160, 393-405.

VAN W.O., REISER V., SIDERIUS M., KELDERS M.C., AMMERER G., RUIS H. & MAGER W.H. (2000) Response of Saccharomyces cerevisiae to severe osmotic stress: evidence for a novel activation mechanism of the HOG MAP kinase pathway. Mol.Microbiol. 37, 382-397.

WATANABE Y., IRIE K. & MATSUMOTO K. (1995) Yeast RLM1 encodes a serum response factor-like protein that may function downstream of the Mpk1 (Slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol.Cell Biol. 15, 5740-5749.

WATANABE Y., TAKAESU G., HAGIWARA M., IRIE K. & MATSUMOTO K. (1997) Characterization of a serum response factor-like protein in Saccharomyces cerevisiae, Rlm1, which has transcriptional activity regulated by the Mpk1 (Slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol.Cell Biol. 17, 2615-2623.

WEBER H. & BARTH G. (1988) Nonconventional yeasts: their genetics and biotechnological applications. Crit Rev.Biotechnol. 7, 281-337.

WESTFALL P.J., BALLON D.R. & THORNER J. (2004) When the stress of your environment makes you go HOG wild. Science 306, 1511-1512.

83

WYCKOFF E. & HSIEH T.S. (1988) Functional expression of a Drosophila gene in yeast: genetic complementation of DNA topoisomerase II. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85, 6272-6276.

YANG Y.H., DUDOIT S., LUU P., LIN D.M., PENG V., NGAI J. & SPEED T.P. (2002) Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, e15

YORK J.D., ODOM A.R., MURPHY R., IVES E.B. & WENTE S.R. (1999) A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science 285, 96-100.

YOSHIDA S., OHYA Y., NAKANO A. & ANRAKU Y. (1994) Genetic interactions among genes involved in the STT4-PKC1 pathway of Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 242, 631-640.

ZAKRZEWSKA A., BOORSMA A., BRUL S., HELLINGWERF K.J. & KLIS F.M. (2005) Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound chitosan. Eukaryot.Cell 4, 703-715.

ZARZOV P., MAZZONI C. & MANN C. (1996) The SLT2(MPK1) MAP kinase is activated during periods of polarized cell growth in yeast. EMBO J. 15, 83-91.

ZENG X., DEMINOFF S.J. & SANTANGELO G.M. (1997) Specialized Rap1p/Gcr1p transcriptional activation through Gcr1p DNA contacts requires Gcr2p, as does hyperphosphorylation of Gcr1p. Genetics 147, 493-505.

ZHAO C., JUNG U.S., GARRETT-ENGELE P., ROE T., CYERT M.S. & LEVIN D.E. (1998) Temperature-induced expression of yeast FKS2 is under the dual control of protein kinase C and calcineurin. Mol.Cell Biol. 18, 1013-1022.

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