UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

FACULDADE DE FARMÁCIA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

Douglas Massote Pestana

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA ESTRUTURA DA COMUNIDADE

BACTERIANA INTESTINAL, PELO USO DA TÉCNICA DE PCR-DGGE, EM

INDIVÍDUOS EUTRÓFICOS E COM EXCESSO DE PESO

Juiz de Fora

2016

Douglas Massote Pestana

Avaliação comparativa da estrutura da comunidade bacteriana intestinal, pelo

uso da técnica de PCR-DGGE, em indivíduos eutróficos e com excesso de

peso

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao corpo docente do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Juiz de Fora, como requisito

parcial para a obtenção do título de

Bacharel em Farmácia.

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Galuppo Diniz

Juiz de Fora

2016

DOUGLAS MASSOTE PESTANA

Avaliação comparativa da estrutura da comunidade bacteriana intestinal, pelo

uso da técnica de PCR-DGGE, em indivíduos eutróficos e com excesso de

peso

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao corpo docente do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Juiz de Fora, como requisito

parcial para obtenção do título de Bacharel

em Farmácia.

Aprovado em: __/__/__

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________

Prof. Dr. Cláudio Galuppo Diniz (Orientador)

Instituto de Ciências Biológicas (UFJF)

_________________________________________

Profa. Dra. Alessandra Barbosa Ferreira-Machado

Instituto de Ciências Biológicas (UFJF)

_________________________________________

MSc. Thaís Oliveira de Paula

Instituto de Ciências Biológicas (UFJF)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade de concluir a faculdade e

iniciar a vida profissional. Foram cinco anos de muita luta e garra, mas ao olhar

para trás, vejo que todo o esforço valeu a pena.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Cláudio Galuppo Diniz e à Profa. Dra.

Vânia Lúcia da Silva, por me concederem a oportunidade de trabalhar no

laboratório de microbiologia e por todos os ensinamentos que me transmitiram.

Agradeço à mestra Thaís Oliveira de Paula pela oportunidade de poder

trabalhar em seu projeto grandioso, que me fez despertar um interesse maior pela

ciência.

Agradeço a Alessandra, Juliana, Michele, Francis e Dionéia por todos os

conhecimentos que me passaram e pelo auxílio prestado durante os experimentos.

Agradeço a todos os colegas de laboratório que me ajudaram durante os

últimos três anos e me proporcionaram dias mais alegres. Foi uma experiência

incrível fazer parte da história de cada um.

Agradeço aos meus pais Paulo e Marli, à minha irmã Ana Paula e à minha

namorada Ohanna por todo o apoio que me deram durante esse período, além de

sempre me incentivarem a chegar até o final sem desistir de lutar.

RESUMO

A obesidade é um crescente problema de saúde pública no mundo inteiro.

Grande parte das despesas econômicas no sistema de saúde do mundo está

relacionada com as comorbidades decorrentes da obesidade, como diabetes,

hipertensão e câncer. Sua etiologia é multifatorial, envolvendo fatores genéticos,

endócrinos e ambientais. Estudos recentes classificam a obesidade como um

estado de inflamação crônica de baixo grau, enquanto outros estudos mostram que

a microbiota intestinal humana exibe um papel importante na manutenção da

homeostase energética. Uma das técnicas mais utilizadas para monitorar o

comportamento da microbiota intestinal é a Reação em Cadeia da Polimerase

seguida de Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (PCR-DGGE), uma

vez que esta fornece um fingerprinting da comunidade microbiana avaliada. O

presente estudo teve como objetivo avaliar comparativamente a estrutura da

comunidade bacteriana em indivíduos eutróficos e com excesso de peso, pelo

método de PCR-DGGE com primers para o domínio Bacteria. Foi utilizado um

grupo amostral de 72 indivíduos, classificados em obesos, com sobrepeso e

eutróficos, de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC) e as medidas

antropométricas. Por meio da similaridade dos perfis de bandeamento fornecidos

pelo DGGE, foi possível agrupar os indivíduos em três clusters diferentes. Tal fato

sugere que a comunidade bacteriana de indivíduos obesos se diferencia dos

indivíduos eutróficos, enquanto que os indivíduos com sobrepeso apresentam-se

em estágio de transição. Os resultados corroboram as evidências encontradas na

literatura e espera-se que auxiliem no desenvolvimento de estudos futuros, com a

finalidade de modular a microbiota intestinal e compreender melhor a patogenia da

obesidade.

Palavras-chave: Obesidade, Microbiota intestinal, Reação em Cadeia da

Polimerase-Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (PCR-DGGE).

ABSTRACT

Obestiy is a growing public health problem worldwide. Most of the economic

burden in the global health system is related to co-morbidities resulting from

obesity, such as diabetes, hypertension and cancer. Its etiology is multifactorial,

involving genetic, endocrine and environmental factors. In recent studies, obesity is

classified as a state of chronic low-grade inflammation, while other approaches

complements that the human intestinal microbiota exhibits an important role in

maintaining energy homeostasis. One of the most widely used techniques to

monitor the behavior of intestinal microbiota is the Polymerase Chain Reaction

followed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE), since it is

capable to evaluate microbial communities through fingerprinting. This study aimed

at comparing the structure of the bacterial community in normal weight and

overweight individuals, by PCR-DGGE with universal primers for Bacteria. We

sampled a group of 72 individuals and classified them as normal weight, overweight

and obese, according to the Body Mass Index (BMI) and anthropometric

measurements. Through the similarity of banding profiles provided by DGGE, it was

possible to group individuals in three different clusters. This fact suggests that the

bacterial community of obese is different from normal weight individuals, while

overweight individuals are in the transition stage. These results support the

evidence found in the literature and are expected to assist in the development of

future studies, in order to modulate the gut microbiota and best understanding the

pathogenesis of obesity.

Keywords: Obesity, Intestinal microbiota, Polymerase Chain Reaction-Denaturant

Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE).

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. DGGE fingerprint dos produtos de amplificação do DNA bacteriano

correspondente à região V6 do gene codificador para o rRNA 16S.......................33

Figura 2. Diagrama de Venn com a distribuição das bandas correspondentes à

região V6 do rRNA 16S bacteriano.........................................................................34

Figura 3. Agrupamento dos indivíduos participantes desse estudo (eutróficos, com

sobrepeso e obesos) de acordo com o perfil de bandeamento..............................35

Figura 4. Matriz de similaridade resultante da análise de agrupamento UPGMA com

coeficiente de Jaccard, do fingerprint dos produtos de amplificação do DNA

bacteriano, separados em DGGE...........................................................................36

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação de peso de acordo com IMC e risco de comorbidades......15

Tabela 2. Sexo e idade dos participantes deste estudo...........................................30

Tabela 3. Características antropométricas dos participantes do estudo..................31

Tabela 4. Estatística descritiva dos resultados obtidos para o domínio Bacteria e

valores de p entre os grupos estudados..................................................................32

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA....................................................... 12

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................. 14

2.1 Aspectos gerais da obesidade............................................................... 14

2.2 Obesidade e o sistema imunológico...................................................... 16

2.3 Tecido adiposo e sua função endócrina................................................ 17

2.4 Microbiota intestinal humana................................................................. 18

2.5 Alterações na microbiota intestinal........................................................ 20

2.6 Abordagens de técnicas independentes de cultivo................................ 21

3 OBJETIVOS.......................................................................................... 24

3.1 Objetivo geral......................................................................................... 24

3.2 Objetivos específicos............................................................................. 24

4 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 25

4.1 Seleção dos participantes do estudo..................................................... 25

4.2 Caracterização dos indivíduos............................................................... 25

4.3 Coleta de amostras fecais e preparação para análises microbiológicas......................................................................................

26

4.4 Extração de DNA a partir dos espécimes fecais.................................... 26

4.5 Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE).................. 27

4.5.1 Amplificação de rRNA 16S de representantes do domínio Bacteria..... 27

4.5.2 Condições da corrida eletroforética....................................................... 28

4.6 Análise estatística.................................................................................. 29

5 RESULTADOS...................................................................................... 30

5.1 Características epidemiológicas e clínicas dos participantes................ 30

5.2 Avaliação da estrutura da comunidade bacteriana................................ 32

6 DISCUSSÃO.......................................................................................... 38

7 CONCLUSÕES...................................................................................... 40

REFERÊNCIAS.................................................................................................... 41

ANEXO A - Parecer do comitê de ética em pesquisa – UFJF.............. 47

ANEXO B - Termo de consentimento livre e esclarecido ................. 49

ANEXO C - Ficha para dados antropométricos................................. 51

12

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A obesidade é um sério problema de saúde pública na atualidade.

Estimativas sugerem que cerca de 50% da população mundial está acima do peso,

o que a configura como uma pandemia. O maior problema relacionado à obesidade

se refere às comorbidades, sendo hipertensão arterial, diabetes mellitus tipo 2 e

dislipidemias as principais doenças crônicas não transmissíveis relacionadas ao

excesso de peso.

A etiopatologia da obesidade ainda não é totalmente esclarecida. Fatores

extrínsecos como alimentação rica em calorias vazias, ausência de exercícios

físicos e estresse elevado contribuem para que haja o desequilíbrio energético, o

qual culmina no ganho excessivo de peso. Muitas linhas de pesquisa procuram

elucidar os fatores intrínsecos relacionados às causas da obesidade. Ensaios

imunológicos demonstram que a obesidade comporta-se como uma inflamação

crônica de baixo grau, relacionada com a liberação contínua de determinadas

citocinas que induzem o acúmulo de gordura. Outra vertente de pesquisadores

correlaciona a comunidade microbiana intestinal, denominada microbiota intestinal,

com a elevada absorção de ácidos graxos e o balanço energético positivo.

Diversos estudos relatam que a microbiota intestinal apresenta um importante

papel na homeostase energética do indivíduo.

Os grandes avanços da Biologia Molecular permitiram o desenvolvimento de

técnicas apuradas, as quais já são utilizadas em certos laboratórios de rotina. A

técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), inicialmente desenvolvida na

década de 80, representou um marco na história da pesquisa contemporânea. Com

o avançar do tempo, o aperfeiçoamento dessa técnica possibilitou o surgimento de

novas variantes, as quais são capazes de fornecer resultados com superior

qualidade e quantidade de informações.

A técnica de PCR-DGGE (Reação em Cadeia da Polimerase-Eletroforese

em Gel com Gradiente Desnaturante) é usada com o intuito de avaliar grandes

grupos genômicos. Em estudos de avaliação da diversidade microbiana em

determinado ambiente, esse método se destaca devido a sua capacidade de

organizar perfis genéticos semelhantes em agrupamentos, sendo bastante

consolidado na literatura.

13

O presente trabalho é uma fração de um projeto maior, realizado no

Laboratório de Fisiologia e Genética Molecular Bacteriana da Universidade Federal

de Juiz de Fora, o qual buscou avaliar a correlação entre a diversidade bacteriana

intestinal e a obesidade.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspectos gerais da obesidade

A obesidade é descrita como uma doença crônica, com alta prevalência e

incidência no mundo inteiro, sendo considerada uma pandemia nos dias atuais. É

caracterizada pelo excessivo acúmulo de gordura no tecido adiposo, em

decorrência do rompimento da homeostase energética, que resulta em prejuízos

importantes na qualidade de vida do indivíduo. Preferencialmente, a energia em

excesso é armazenada na forma de gordura, a qual é metabolizada na ausência de

carboidratos para manter o funcionamento do organismo de maneira estável

(BORGES, 2011).

A etiologia da obesidade é multifatorial, envolvendo interações complexas

entre fatores genéticos, endócrinos e diversas condições ambientais desfavoráveis

à saúde, como hábitos alimentares inadequados e o sedentarismo. (MARTINEZ et

al., 2008) A obesidade é classificada como doença de caráter plurimetabólico por

coexistir com agravos como a hipertensão, dislipidemia e diabetes. Além disso,

está associada a fatores culturais e ambientais, apresentando impacto significativo

na saúde, no bem-estar psicossocial, na longevidade e na qualidade de vida.

(ESKINAZI et al., 2011)

O excesso de peso é um fator de risco conhecido para o desenvolvimento

de enfermidades crônicas não transmissíveis, como câncer, diabetes mellitus e

doenças cardiovasculares. Tais condições são responsáveis por grande parte das

despesas econômicas no sistema de saúde do mundo. De acordo com Bahia et al.

(2012), os custos de uma doença podem ser mensurados pelo impacto gerado no

sistema de saúde com os tratamentos (custos diretos) e por meio da queda na

qualidade de vida e no absenteísmo (custos indiretos). Estima-se que cerca de 2 a

6% dos gastos com saúde no mundo sejam decorrentes das comorbidades

envolvidas na obesidade. (BAHIA et al., 2012; TRAYHURN, 2013).

Atualmente, cerca de 80 milhões de brasileiros em idade adulta estão acima

do peso e um quinto se encontra obesa. 72% dos óbitos no país se referem às

doenças crônicas relacionadas à obesidade. A população com idade entre 35 a 64

anos é a que apresenta maior prevalência de obesidade no Brasil, e desse escopo,

o excesso de peso é maior observado nas mulheres. No mundo, atualmente 614

15

milhões de pessoas estão obesas e as estimativas sugerem que um quinto da

população global apresentará quadro de obesidade até o ano de 2025. (BRASIL,

2015; EZZATI, 2016)

A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica a obesidade de acordo

com o Índice de Massa Corporal (IMC), cujo cálculo se dá pelo valor do peso

corporal, em quilogramas, dividido pelo quadrado da altura, em metros quadrados,

conforme demonstrado na Tabela 1 (WHO, 2000).

Tabela 1. Classificação de peso de acordo com IMC e risco de comorbidades.

Classificação IMC (Kg/m2) Risco de comorbidades

Baixo peso < 18,5 Baixo

Peso normal 18,5 a 24,9 Médio

Pré-obeso 25,0 a 29,9 Aumentado

Obesidade grau I 30,0 a 34,9 Moderado

Obesidade grau II 35,0 a 39,0 Grave

Obesidade grau III ou mórbida ≥ 40,0 Muito grave

Fonte: Adaptado de WHO, 2000.

Apesar de ser um bom indicador, o IMC isolado não é totalmente

correlacionado com a gordura corporal. Dentre as suas limitações estão o fato de

ser incapaz de diferenciar massa gordurosa de massa magra, podendo ser pouco

estimado em indivíduos mais velhos e superestimado em indivíduos musculosos.

Além disso, este indicador não reflete a distribuição da gordura corporal, uma

variável importante na avaliação da obesidade devido ao fator de risco gerado pela

presença da gordura visceral. Dessa maneira, indivíduos com mesmo valor de IMC

podem apresentar proporções diferentes de gordura visceral, não se enquadrando,

portanto, no mesmo grau de risco. Para reduzir as limitações do indicador isolado,

a OMS sugere que o IMC seja utilizado de forma combinada com outras formas de

avaliação, como a medida da circunferência abdominal e a bioimpedância

(GODOY-MATOS et al., 2009; WHO, 2000).

16

2.2 Obesidade e o sistema imunológico

O estado de obesidade é caracterizado como uma “inflamação sistêmica de

baixo grau”, induzida por diversos mediadores inflamatórios, os quais foram

demonstrados pela primeira vez por Hotamisligil e seus colaboradores em 1993. O

tecido adiposo é considerado atualmente como um órgão endócrino, capaz de

mediar efeitos biológicos no metabolismo e inflamação, contribuir para a

manutenção da homeostase energética e, provavelmente, está relacionado com a

patogenia de disfunções metabólicas e inflamatórias relacionadas à obesidade

(HOTAMISLIGIL et al., 1993; WOZNIAK et al., 2009).

As causas e o mecanismo envolvido no estado inflamatório induzido na

obesidade ainda não são totalmente compreendidos. Grande parte dos estudos

estão centrados nas adipocinas, as quais são citocinas produzidas pelo tecido

adiposo com função imunológica, tais como a interleucina 6 (IL-6), o fator de

necrose tumoral α (TNF-α) e os fatores B, C3 e D (adipsina) do sistema

complemento. Algumas dessas moléculas possuem ação autócrina ou parácrina,

no entanto, podem também contribuir de forma significativa para a inflamação

sistêmica (BERG e SCHERER, 2005).

O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória, produzida pelos tecidos muscular,

adiposo e linfoide. É capaz de reduzir a resposta à insulina por meio da diminuição

da expressão dos transportadores de glicose GLUT-4 na superfície celular,

fosforilação do substrato 1 nos receptores de insulina (IRS-1) e fosforilação

específica do receptor de insulina. Também é proposto que essa citocina possui

ação regulatória da massa de tecido adiposo, diminuindo a diferenciação de pré-

adipócitos pela indução da apoptose (in vitro) e da lipólise (in vitro e in vivo). O

TNF-α é comumente associado à insulino-resistência, sendo detectado em valores

elevados na obesidade, e reduzidos à medida que ocorre a perda de peso

(HOOPER et al., 2012).

O tecido adiposo (especialmente a gordura visceral), é a principal fonte de

IL-6 circulante nos estados não-inflamatórios. Há evidências de que a secreção de

IL-6 também ocorre na região do hipotálamo, o que denota um papel na regulação

do apetite e no gasto energético. Da mesma maneira que o TNF-α, a IL-6 está

relacionada com o metabolismo de lipídeos e da glicose, sendo também um

marcador para a resistência à insulina. Dentre suas principais funções, estão

17

envolvidas a inibição da lipoproteína lipase, a indução da lipólise e o aumento da

captação de glicose. Os níveis séricos de IL-6 estão aumentados na obesidade,

mas com a perda de peso, se encontram reduzidos (HERDER et al., 2013).

As moléculas do sistema complemento produzidas no tecido adiposo são o

fator B, fator C3 e fator D. Para que ocorra a síntese do fator C3a proveniente de

C3, é necessária a presença dos fatores B e D. O C3a é clivado posteriormente em

ASP (proteína estimulante de acilação). Tal proteína está diretamente relacionada

à síntese e armazenamento de triglicerídeos (TG). Experimentos em ratos

demonstraram que a sua deficiência está associada à diminuição da gordura

corporal e ao aumento da sensibilidade à insulina (HAVEL, 2004; XU et al., 2003).

2.3 Tecido adiposo e sua função endócrina

A leptina é um peptídeo fundamental na regulação do balanço energético.

Produzida quase que exclusivamente pelo tecido adiposo, é regulada por

alterações induzidas pela insulina no adipócito e seus níveis são estritamente

correlacionados com a massa desse tecido. Apresenta papel importante na

fertilidade, relacionada à liberação de gonadotrofinas e GnRH (hormônio liberador

de gonadotrofina), além de possuir ação moduladora da imunidade e da resposta

inflamatória (HOTAMISLIGIL, 2006; MANCO et al., 2007).

No hipotálamo, a leptina é capaz de controlar a liberação de neuropeptídios

anorexígenos. Como consequência, a resposta desencadeada pode determinar a

redução da energia adquirida, ou por uma via oposta, o aumento do gasto

energético. Perifericamente, essa molécula apresenta uma função importante na

redução da síntese e secreção de insulina (GREGOR e HOTAMISLIGIL, 2011).

É observado na obesidade que os níveis séricos elevados de leptina não

promovem a resposta esperada. É sugerido que a resistência à ação desse

hormônio esteja relacionada com a limitação do seu transporte a nível de barreira

hemato-encefálica. Tal fato poderá resultar na interrupção do eixo adipo-insular,

conduzindo ao hiperinsulinismo e ao diabetes mellitus tipo 2 associado à obesidade

(MITCHELL, et al., 2005).

A leptina não é considerada um fator de saciedade, no entanto, está ligada à

adaptação sob condições de baixa disponibilidade energética. Em humanos, a

18

mutação do gene da leptina ou de seu receptor está associado à obesidade

hiperfágica e à infertilidade (SMITH et al., 2007; ZHANG et al., 2009).

2.4 Microbiota intestinal humana

O intestino de uma pessoa adulta é colonizado principalmente por bactérias,

com um total de aproximadamente 100 trilhões delas e várias centenas de

espécies diferentes (RAJILIC-STOJANOVIC, 2013). A microbiota intestinal está

envolvida em diversos fatores biológicos intestinais, tais como a defesa contra

patógenos, imunidade, desenvolvimento dos microvilos intestinais e a degradação

de polissacarídeos complexos não-digeríveis. (HAN e LIN, 2014). Apesar de cada

indivíduo possuir uma microbiota diferente, o conjunto de genes expressos pelos

microrganismos intestinais (microbioma) é funcionalmente o mesmo para a grande

maioria dos indivíduos. As bactérias mais comuns que compõem a microbiota

intestinal são membros de dois filos: Bacteroidetes (Gram-negativos) e Firmicutes

(Gram-positivos), que juntos compõem mais de 90% do total das bactérias,

seguidos por Actinobacteria (Gram-positivos) e Proteobacteria (Gram-negativos)

(ESTEVE et al., 2011; MUSSO et al., 2010; SHEN et al., 2013).

A formação da microbiota se inicia ao nascimento e o padrão de colonização

será diferente de acordo com o modo de nascimento, uma vez que o bebê será

exposto primeiro à microbiota vaginal (como Lactobacillus e Prevotella) da mãe, se

for realizado um parto normal, ou à microbiota da pele (como Staphylococcus,

Corynebacterium, Propionibacterium), se for um parto por cesárea. O modo como o

recém-nascido é alimentado também influencia a composição da microbiota; com a

amamentação, observa-se grande quantidade de Bifidobacterium e pequena

quantidade de Clostridium e Bacteroides, enquanto que na ausência de

amamentação observa-se número elevado de Clostridium e Bacteroides. Durante a

infância, a microbiota será moldada de acordo com eventos como infecções,

exposição a antibióticos e, principalmente, alterações na dieta. Na primeira

infância, a microbiota do indivíduo é caracterizada por instabilidade e pouca

diversidade. Com o avançar da idade, ela se estabiliza e apresenta grande

diversidade (ALBENBERG e WU, 2014).

Boa parte da atividade metabólica microbiana é de grande relevância para o

hospedeiro. Seus efeitos benéficos envolvem o auxílio da digestão, síntese de

19

vitaminas, inibição de crescimento de patógenos e estímulo do sistema

imunológico. No entanto, também podem ser prejudiciais, como na síntese de

toxinas e compostos carcinogênicos, além da contribuição no desenvolvimento de

diarreia, constipação e infecções intestinais (RAJILIC-STOJANOVIC, 2013).

Vários estudos sugerem que a microbiota intestinal exibe um papel

importante no desenvolvimento de massa gorda e na homeostase energética

alterada. É importante para a compreensão do papel da microbiota intestinal na

manutenção da saúde do hospedeiro, o conceito de disbiose, o qual denota a

ruptura do equilíbrio entre as bactérias intestinais que promovem a saúde e

aquelas que não proporcionam benefícios ou que são prejudiciais para o

hospedeiro (SHEN et al., 2013).

As evidências a favor de um elo causal entre a microbiota e a obesidade

provêm a partir de modelos experimentais realizados em camundongos germ-free,

os quais demonstraram que os mesmos são resistentes à obesidade induzida por

dieta hipercalórica, principalmente devido à ausência de bactérias fermentadoras

capazes de processar polissacarídeos complexos, além da reduzida produção de

ácidos graxos de cadeia curta. A colonização de camundongos germ-free com

bactérias fermentadoras, juntamente com organismos que promovem processos

fermentativos, resultou em aumento de peso e obesidade. Tal estudo revelou que a

microbiota intestinal é um fator ambiental modulável, capaz de controlar o acúmulo

de gordura. Um dos mecanismos propostos sugere que a microbiota intestinal

otimiza o processo de extração da energia adquirida na dieta. Dessa maneira, a

habilidade de modular vias sinalizadoras do hospedeiro poderia influenciar no

balanço energético e no metabolismo (NICHOLSON, 2012).

Em condições patológicas, tais como obesidade e diabetes mellitus tipo 2, a

microbiota intestinal pode controlar o metabolismo do hospedeiro e contribuir para

o desenvolvimento de uma inflamação de baixo grau. É proposto que o

lipopolissacarídeo (LPS), derivado da microbiota intestinal, apresenta-se como uma

molécula crucial envolvida no desenvolvimento inicial da inflamação e das doenças

metabólicas. O LPS é uma poderosa molécula pró-inflamatória proveniente da

membrana externa de bactérias Gram-negativas e é continuamente liberada no

intestino do hospedeiro após a morte das mesmas (CANI et al., 2008; MUCCIOLI et

al.; 2010). O conceito de endotoxemia metabólica (níveis aumentados de LPS no

plasma) foi definido inicialmente em uma série de experimentos em camundongos.

20

A relação entre dieta hipercalórica, consumo de gorduras, obesidade, diabetes

mellitus e LPS foi posteriormente confirmada em diversos estudos realizados em

indivíduos humanos (AMAR et al., 2008; GHANIM et al., 2009).

2.5 Alterações na microbiota intestinal

Atualmente, a patologia da obesidade é reconhecida por estar associada a

alterações na diversidade e na composição da microbiota. Os primeiros estudos

que demonstraram os efeitos dessas mudanças foram realizados em camundongos

geneticamente obesos (genótipo ob/ob), os quais revelaram um aumento na

quantidade de Firmicutes e um decréscimo na proporção de Bacteroidetes, dois

filos dominantes da microbiota intestinal (LEY et al., 2005; TURNBAUGH et al.,

2006). Desde esses experimentos pioneiros, vários estudos caracterizaram a

microbiota intestinal em modelos animais obesos, com a maioria dos resultados

revelando um aumento na proporção de Firmicutes e decréscimo em Bacteroidetes

associado com a obesidade (HILDEBRANDT et al., 2009; MURPHY et al., 2010).

Em estudos que envolveram humanos, o aumento da razão

Firmicutes/Bacteroidetes em pacientes obesos ainda permanece em debate e

merece ser aprofundado. Um estudo foi capaz de indicar como a composição da

microbiota intestinal durante a infância é capaz de predizer a tendência para o

ganho de peso. Os autores identificaram níveis elevados de Staphylococcus aureus

e uma redução na quantidade de bifidobactérias nas amostras fecais de crianças

que estavam com sobrepeso (GEURTS et al., 2011; KALLIOMAKI et al, 2008;

TURNBAUGH et al., 2009)

É bem consolidado na literatura que alterações na composição e na

funcionalidade da microbiota intestinal geram um impacto na homeostase do

indivíduo. No entanto, diversas questões ainda necessitam de respostas e devem

ser debatidas. Ainda não há evidências claras se as alterações da microbiota

intestinal estão associadas com a dieta ou com a própria patologia da obesidade.

Além disso, muito se discute se as alterações da microbiota intestinal são a causa

ou a consequência da patogênese da obesidade (BACKHED, 2009)

Uma das principais funções do intestino é permitir a relação simbiótica entre

a microbiota intestinal e o hospedeiro, enquanto previne a invasão no tecido

hospedeiro. No entanto, disfunções na barreira intestinal podem representar uma

21

porta de entrada para microrganismos ou para moléculas derivadas de bactérias

oriundas do lúmen intestinal, como LPS, peptideoglicanos e flagelina. É sugerido

que alterações na permeabilidade da barreira intestinal poderiam ser responsáveis

pela endotoxemia metabólica presente em obesos (EVERARD et al., 2011). O

mecanismo envolvido nessas alterações está intimamente ligado à permeabilidade

paracelular, a qual é regulada por complexos multi-proteicos capazes de promover

a ligação entre as células epiteliais. Estudos envolvendo camundongos obesos

demonstraram que o aumento na permeabilidade intestinal pode estar associado

com a alteração na expressão, localização e distribuição de duas proteínas

específicas, ocludina e zonula occludens 1 (ZO-1), no intestino delgado. Além

disso, é relatado que alterações na microbiota intestinal pelo uso de antibióticos

aumentou a expressão de mRNA da ZO-1, reduzindo a permeabilidade intestinal e,

consequentemente, a endotoxemia metabólica em camundongos com obesidade

induzida por dieta hipercalórica (CANI et al., 2009; DE LA SERRE et al., 2010;

EVERARD et al., 2011).

Foi proposto em estudos recentes que o sistema endocanabinóide estaria

envolvido na regulação da barreira intestinal durante a obesidade. Esse sistema é

composto por lipídios endógenos bioativos que exercem a maioria das suas

funções pela ativação de dois receptores acoplados à proteína G, denominados

receptores canabinóides 1 (CB1) e 2 (CB2). Ambos são expressos através do trato

gastrointestinal em vários níveis, de acordo com o segmento. Antagonistas de CB1

diminuem a permeabilidade intestinal e a endotoxemia metabólica em

camundongos obesos através do aumento da distribuição e localização das

proteínas de junção ZO-1 e ocludina (ALHOUAYEK e MUCCIOLI, 2012). Em

estudos com animais, demonstrou-se que a microbiota intestinal também pode

regular o CB1, pois sua alteração com uso de prebióticos resultou em redução da

permeabilidade intestinal (EVERARD e CANI, 2013; HAN e LIN, 2014).

2.6 Abordagens de técnicas independentes de cultivo

A descoberta da sub-unidade do RNA ribossomal, o rRNA 16S, foi um marco

decisivo na evolução das metodologias de análise das comunidades bacterianas.

Essa molécula contém regiões de sequências de bases de nucleotídeos altamente

conservadas no domínio bacteriano, intercaladas por regiões variáveis e altamente

22

variáveis. A partir desse conceito, métodos moleculares para avaliação da

microbiota fecal foram desenvolvidos, nos quais os microrganismos constituintes de

uma amostra fecal são identificados a partir de seu material genético, independente

de serem cultiváveis ou não (TANNOCK, 2005).

Podem ser empregados diversos métodos para a análise filogenética da

microbiota intestinal. O padrão-ouro para análises de filogenia da microbiota

intestinal humana é baseado na construção de bibliotecas genômicas. Para tal, é

necessária a amplificação do gene rRNA 16S, seguindo-se da clonagem desse

produto de amplificação e posterior sequenciamento junto à análise dos clones

resultantes (ZOETENDAL et al., 2011).

O FISH (Hibridização Fluorescente In Situ) é um método no qual são

utilizadas sondas de oligonucleotídeos marcadas com um componente fluorescente

que hibridizam com o material genético presente na amostra. Dessa maneira,

microrganismos marcados na amostra podem ser identificados e quantificados

(FAVIER et al., 2002; ZOETENDAL et al., 2011).

Uma técnica que também tem sido utilizada para a quantificação de

diferentes grupos filogenéticos é a qPCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase

quantitativa). Tal método utiliza iniciadores e sondas grupo-específicos, o que

garante uma alta sensibilidade, capaz de identificar a presença de microrganismos

em quantidades inferiores às necessárias em outras metodologias convencionais

(ZOETENDAL et al., 2011).

Com a finalidade de elucidar a dinâmica da microbiota intestinal, foram

introduzidas algumas variações das técnicas moleculares. Uma delas é a

eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE), uma técnica capaz de

determinar, descrever e monitorar a diversidade da comunidade microbiana de

ambientes complexos, tais como solo, água e o intestino humano. Essa técnica tem

sido empregada para análises da estrutura e da evolução de comunidades

bacterianas, a fim de determinar sua dinâmica em resposta a variações ambientais

(ERCOLINI, 2004).

A técnica de DGGE é um método de fingerprinting recente, no qual

fragmentos de DNA amplificados por PCR (amplicons) são separados de acordo

com suas sequências de pares de bases. Tem sido amplamente empregada em

estudos de microbiologia ambiental, microbiologia de alimentos e na análise de

comunidades microbianas que habitam o corpo humano. Anteriormente, estudos de

23

comunidade eram realizados primariamente por técnicas clássicas como cultura, ou

clonagem por PCR. A clonagem e o sequenciamento de amostras é um processo

altamente trabalhoso e caro de ser realizado, especialmente devido à grande

diversidade envolvida nesse tipo de estudo. Dessa maneira, técnicas de

fingerprinting genético como o DGGE, demonstram-se ideais para esta finalidade.

(BRAGA DA CRUZ, 2010; CARVALHO, 2012).

Quando aplicado para a análise de comunidades microbianas, o DGGE

assume o princípio de que moléculas de DNA dupla-fita de mesmo tamanho, mas

com diferentes sequências em pares de bases, podem ser parcialmente separadas

enquanto migram em um gel de poliacrilamida, contendo gradiente desnaturante

em concentração crescente e linear. Dessa forma, cada banda do DGGE

corresponde, teoricamente, a uma unidade taxonômica operacional (OTU), em que

o padrão de bandeamento total é capaz de refletir a riqueza e a diversidade das

espécies de uma comunidade. Quando combinada ao sequenciamento de clones

de rRNA 16S, a técnica de DGGE permite a determinação da taxonomia dos

membros de uma comunidade microbiana (FAVIER et al, 2003; CARVALHO,

2012).

24

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar comparativamente a diversidade bacteriana no ecossistema intestinal

de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos, os quais são

participantes do projeto “Diversidade bacteriana intestinal e parâmetros

nutricionais de indivíduos obesos, com sobrepeso e eutróficos” (DE PAULA,

2016).

3.2 Objetivos específicos

Obter o DNA representativo do metagenoma intestinal a partir de espécimes

fecais dos indivíduos participantes;

Avaliar a estrutura da comunidade bacteriana intestinal dos indivíduos pela

técnica de PCR seguida de eletroforese em gel com gradiente desnaturante

(PCR-DGGE) e agrupá-los de acordo com o perfil obtido;

Correlacionar os perfis eletroforéticos com as condições de indivíduos

eutróficos, com sobrepeso e obesos.

25

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Seleção dos participantes do estudo

O presente estudo é parte de um projeto maior, denominado “Diversidade

bacteriana intestinal e parâmetros nutricionais de indivíduos obesos, com

sobrepeso e eutróficos”, o qual foi realizado nos anos de 2015 e 2016 no

Laboratório de Fisiologia e Genética Molecular Bacteriana da Universidade Federal

de Juiz de Fora. Tal projeto foi um estudo de caráter transversal, descritivo e

observacional, realizado com indivíduos de idade entre 18 e 60 anos e IMC a partir

de 18,5 kg/m², que foram selecionados na comunidade e no ambulatório do serviço

de nutrição do Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora.

Foram adotados os seguintes critérios de exclusão: histórico de doenças

intestinais, uso de antibióticos no último mês e diagnóstico confirmado de diabetes.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres

Humanos da Universidade Federal de Juiz de Fora (Anexo A). Todos os voluntários

foram informados a respeito dos objetivos do estudo e assinaram o termo de

consentimento livre esclarecido (Anexo B).

4.2 Caracterização dos indivíduos

Para a avaliação antropométrica, foram utilizados peso atual (Kg), altura

(cm), medidas de índice de massa corporal (IMC), circunferências da cintura (CC),

abdominal (CA) e quadril (CQ) (Anexo C). O peso dos participantes foi aferido em

balança digital com o indivíduo em posição central, ereto, descalço, com os pés

juntos, e usando o mínimo de vestimentas possível. A altura foi verificada

utilizando-se um estadiômetro vertical fixo à balança, também descalço e ereto,

com calcanhares unidos, com a cabeça livre de adereços e olhando para o

horizonte. O IMC foi calculado a partir da relação peso (kg)/altura (m2) e avaliado

de acordo com o proposto pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2000).

Foram realizadas aferições das circunferências com fita métrica flexível e

inextensível de 150 cm de comprimento, estando no plano horizontal e no mesmo

nível em todas as partes, com o individuo em pé, ereto, braços estendidos ao longo

do corpo e sem comprimir os tecidos. A circunferência da cintura foi aferida a 2

26

dedos acima da cicatriz umbilical e com a roupa afastada, sendo analisada de

acordo com os pontos da Organização Mundial da Saúde (WHO, 2000), onde CC ≥

94 cm e ≥ 80 cm indica risco cardiovascular para homens e mulheres,

respectivamente. A circunferência abdominal foi medida na altura da cicatriz

umbilical, também com a roupa afastada e a circunferência do quadril foi aferida na

área de maior proeminência da região glútea. A relação cintura quadril (RCQ) foi

obtida por meio da divisão da circunferência da cintura pela circunferência do

quadril, sendo usado para análise com valores de corte considerados pela WHO

(1995), onde RCQ > 0,95 para homens e > 0,85 para mulheres são indicativos de

obesidade androide e risco aumentado de doenças metabólicas relacionadas com

a obesidade.

4.3 Coleta de amostras fecais e preparação para análises microbiológicas

As amostras fecais dos participantes foram coletadas em domicílio no início

da manhã, por demanda espontânea pelos participantes, em recipientes coletores

universais esterilizados e fornecidos pelos pesquisadores. Os recipientes com as

amostras fecais foram enviadas para o Laboratório de Fisiologia e Genética

Molecular Bacteriana do ICB/UFJF, onde foram aliquotadas. Para extração de DNA

metagenômico, foram pesados 200 mg de fezes, e armazenados em freezer à

temperatura de -20°C.

4.4 Extração de DNA a partir dos espécimes fecais

O DNA total foi extraído com a utilização do kit comercial QIAamp™ DNA

Stool Mini Kit e a plataforma automatizada Qiacube (Qiagen, Hilden, Alemanha), de

acordo com as instruções do fabricante e algumas alterações para aumento no

rendimento do DNA metagenômico. Inicialmente, três pérolas de vidro foram

adicionadas por amostra na etapa de lise celular e homogeneizadas em vortex

durante 2 minutos. Em seguida as amostras foram incubadas a 95°C, por 15

minutos, e subsequentemente agitadas em vortex, vigorosamente, por mais 2

minutos adicionais. Após esta etapa, 300 mL de tampão InhibiTex (fornecido no kit)

foram adicionados às suspensões fecais, seguido de homogeneização, incubação

e centrifugação. Posteriormente, o procedimento de obtenção dos extratos de DNA

27

prosseguiu na plataforma automatizada Qiacube, de acordo com o programa

específico para o QIAamp™ DNA Stool Mini Kit. O DNA representativo do

metagenoma intestinal foi eluído em volume de 200 µL e mantido em freezer a

-70ºC para estudos posteriores.

Para determinar a concentração e a pureza do DNA metagenômico, usou-se

o fluorímetro Qubit™ 2.0®, com o kit Qubit™ dsDNA HS Assay (Life Technologies,

California, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do DNA

foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris-HCl-

Borato-EDTA). O gel foi corado com brometo de etídio e analisado em

transiluminador de luz ultravioleta (GE Healthcare, Reino Unido). O DNA extraído

foi aliquotado e armazenado em freezer a -70°C.

4.5 Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)

Com o intuito de avaliar a estrutura da comunidade bacteriana intestinal de

participantes obesos, com sobrepeso e eutróficos, foi usada a técnica de

eletroforese em gel com gradiente desnaturante.

4.5.1 Amplificação de rRNA 16S de representantes do domínio Bacteria

Os fragmentos do gene codificador do rRNA 16S de grupos microbianos

específicos representantes do domínio Bacteria foram amplificados por PCR.

Utilizou-se o DNA metagenômico extraído das amostras de fezes como molde para

as reações de amplificação.

Os primers (oligonucleotídeos iniciadores) utilizados nesta reação foram

F984GC (5’-gc.- AACGCGAAGAACCTTAC-3’) (gc = sequência rica em Guanina +

Citosina) (HEUER et al., 1997) e R1378 (5’-ACGGGCGGTGTGTACA -3’)

(BLACKWOOD et al., 2005) para amplificação da região V6 do DNA

correspondente ao rRNA 16S bacteriano. A reação de PCR apresentou

aproximadamente 20 ng/μL de DNA total, 0,5 μL de cada primer (10 μM) e como

mistura da reação foi utilizado o PCR Master Mix® (Promega, USA).

A PCR foi realizada contemplando-se as seguintes condições: temperatura

inicial de desnaturação a 94ºC por 5 minutos, seguida de 20 ciclos de 94ºC por 1

28

minuto para a desnaturação, 53ºC por 1 minuto para anelamento e 72ºC por 2

minutos para a extensão. O ciclo de amplificação foi seguido por uma extensão

final a 72ºC por 10 minutos (GELSOMINO; CACCO, 2006). Foi utilizado controle

negativo sem DNA molde. As reações de PCR foram realizadas no termociclador

Techne® TC-412. Os amplicons obtidos em cada reação foram visualizados em gel

de agarose (Sigma-Aldrich, USA) 1,2% em TBE (Tris-base, ácido bórico e EDTA), e

corados com brometo de etídio (Promega, USA). Para estimar o tamanho dos

amplicons, foi empregado o padrão de peso molecular de 100bp plus DNA ladder

ready-to-use (Bioron).

4.5.2 Condições da corrida eletroforética

Foi aplicado o volume de 20 μL dos produtos de PCR em gel de

poliacrilamida (acrilamida:N,N’-metilenobisacrilamida 37,5:1) vertical a 8% (p/v) em

tampão TAE (tris-acetato-EDTA) 1X. O gradiente desnaturante apresentou variação

linear de 30% a 70% utilizando-se como agentes desnaturantes ureia 7M, e

formamida deionizada 40% v/v, a partir de duas soluções estoque de poliacrilamida

a 0% (solução acrilamida/bisacrilamida 20% v/v, TAE 50X 2% v/v, água q.s.p) e

100% (solução acrilamida/bisacrilamida 20% v/v, TAE 50X 2% v/v, ureia 7M, e

formamida desionizada 40% v/v), as quais foram dispensadas pelo formador de

gradiente (Modelo 475 Gradient Delivery System – BIO-Rad Califórnia, USA). Além

das soluções estoque para a formação do gradiente, foram utilizados 0,03% (p/v)

de persulfato de amônio (polimerizador), 0,17% (v/v) de TEMED (N,N,N’,N’-

tetrametiletilenodiamino) (catalisador) e 50μL de corante (azul de bromofenol 0,5%,

xileno cianol 0,5% e TAE 1X) para caracterização visual do gradiente.

A eletroforese foi realizada em temperatura constante de 60ºC e voltagem

de 50V, durante 16 horas. O gel foi corado por 20 minutos com solução de SYBR®

Gold (Invitrogen™), de acordo com as recomendações do fabricante. A imagem do

gel foi visualizada no transiluminador ultravioleta ImageQuant 100 (GE Healthcare,

Reino Unido) e capturada com o auxílio da câmera ED LENS SP-500 UZ

(Olympus).

29

4.6 Análise estatística

Para análise dos dados foram utilizados os softwares de estatística SPSS

20.0, XLstat 2014 e PAST 3.0. Para as variáveis contínuas foram utilizadas

medidas de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão); para as

variáveis categóricas foi utilizada a distribuição percentual. Os dados obtidos foram

avaliados quanto ao tipo de distribuição, usando-se o teste de Kolmogorov-

Smirnov. Para comparações dos dados antropométricos, foi utilizado teste t de

Student, em que valores de p menores que 5% (p<0,05) foram considerados

significativos.

Por meio dos eletroforegramas obtidos pela técnica de PCR-DGGE e com

auxilio do programa pyElph 1.4 para a delimitação das bandas, foi construída uma

matriz binária, na qual a presença de banda correspondente a cada unidade

taxonômica operacional (OTU) foi codificada como “1” e ausência como “0”. A partir

disso, realizou-se uma análise de agrupamento. A estrutura da comunidade

microbiana foi avaliada de acordo com o cálculo do coeficiente de Jaccard de

similaridade e pela técnica Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

(UPGMA) na análise de agrupamentos.

30

5 RESULTADOS

5.1 Características epidemiológicas e clínicas dos participantes

Após classificação dos indivíduos estudados nos grupos correspondentes

(eutrófico, com sobrepeso e obeso), foram avaliadas as características

demográficas. Dos 72 indivíduos amostrados, 63,9% eram do sexo feminino e

36,1% do sexo masculino, com uma média de idade de 39,6 anos, representativo

de indivíduos adultos. Os dados de gênero e idade por grupo são apresentados na

Tabela 2.

Tabela 2. Sexo e idade dos participantes deste estudo.

Eutrófico Sobrepeso Obeso

Masculino (%) 20,8 50,0 37.5

Feminino (%) 79,2 50,0 62.5

Média Idade 37,9 38,1 42,8

Os dados antropométricos e valores de p para teste de normalidade e

comparação de médias encontram-se na Tabela 3. Os valores de circunferência da

cintura, circunferência abdominal, circunferência do quadril e relação cintura quadril

foram analisados separadamente por sexo dentro dos grupos, uma vez que os

valores de referência são diferentes. Houve diferença estatística significativa em

todos os parâmetros analisados entre os três grupos em indivíduos do sexo

feminino, com um aumento nos valores proporcionalmente ao IMC. Já nos

indivíduos do sexo masculino não houve diferença estatisticamente significativa

nas medidas de circunferência da cintura e relação cintura–quadril entre nenhum

dos três grupos.

31

Tabela 3. Características antropométricas dos participantes do estudo.

Parâmetros Grupos de indivíduos Valor de p

VRa Eutrófico (eut) Sobrepeso (sob) Obeso (ob) pb pc (eut x sob) pc (eut x ob) pc (sob x ob)

IMC 22,81±1,76 29,70±14,05 36,9±6,04

Circunferência Abdominal 1,09 NT**

Mulheres 82,3±4,9 94,6±5,8 118,7±14,1 <0,001 <0,001 <0,001

Homens 93,8±9,8 94,7±4,1 111,22±16,6 0,72 0,03 0,001

Circunferência da cintura 1,13

Mulheres 74,9±4,3 86,4±4,9 113,3±15,8 <0,001 <0,001 <0,001 .≤ 80

Homens 89,6±11,5 91,0±4,9 110,7±17,4 0,78 0,06 0,004 .≤94

Circunferência Quadril 1,78 NT**

Mulheres 99,21±4,8 105,9±4,7 124,1±13,0 <0,001 <0,001 <0,001

Homens 99,6±4,01 104,9±3,9 99,7±33,5 0,23 0,99 0,59

Relação Cintura/Quadril 0,81

Mulheres 0,75±0,40 0,81±0,50 0,93±0,08 <0,001 <0,001 0,001 ≤0,85

Homens 0,89±0,98 0,86±0,05 0,99±0,15 0,42 0,22 0,14 ≤0,95

aValores de P para o teste de Kolmogorov-Smirnov.

b valores de P para teste T de student *Valores de referências segundo WHO, 2000; ** Não há valores de

referência. H = Homem; M = Mulher.

32

5.2 Avaliação da estrutura da comunidade bacteriana

Para amostrar a estrutura da comunidade bacteriana das amostras fecais

dos indivíduos, foi utilizado o perfil de bandeamento obtido pelo PCR-DGGE

(Figura 1). Considerou-se como OTU cada uma das bandas identificadas nos géis

e a estatística descritiva das mesmas pode ser observada na Tabela 4.

Tabela 4. Estatística descritiva dos resultados obtidos para o domínio Bacteria e

valores de p entre os grupos estudados.

Parâmetros

Domínio Bacteria Valor de p

Eutrófico

(eu)

Sobrepeso

(sob)

Obeso

(ob)

p (eu x sob)

p (eu x ob)

p (sob X ob)

Nº de Observações 24 24 24

Mínimo de bandas 1 3 1

Máximo de bandas 14 12 13

Média das bandas 5,96 5,41 6,87 0,53 0,36 0,07

Desvio Padrão 3,65 2,12 3,31

33

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Grupo de indivíduos eutróficos Grupo de indivíduos com sobrepeso Grupo de indivíduos obesosC C

Figura 1. DGGE fingerprint dos produtos de amplificação do DNA bacteriano correspondente à região V6 do gene codificador para o rRNA 16S a partir do

metagenoma fecal de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos. C = controle da eletroforese em gradiente de desnaturação contendo DNA de 4 espécies

bacterianas.

34

Foram identificadas 26 bandas distintas no total. Conforme demonstrado na

Figura 2, 15 dessas bandas estavam presentes nos três grupos de indivíduos

avaliados. 6 bandas pertenciam, simultaneamente, aos grupos eutrófico e com

sobrepeso, enquanto que 3 bandas foram detectadas exclusivamente no grupo

eutrófico e apenas 2 bandas únicas eram pertencentes ao grupo obeso.

Figura 2. Diagrama de Venn com a distribuição das bandas correspondentes à região V6 do rRNA

16S bacteriano, amplificadas a partir do DNA metagenômico extraído de amostras fecais de

indivíduos obesos, com sobrepeso e eutróficos.

Com a utilização de uma matriz de presença e ausência das bandas

detectadas, foi possível aplicar a técnica UPGMA, a qual agrupou os 72 indivíduos

participantes do estudo em 3 clusters: C1, C2 e C3, de acordo com o perfil de

bandeamento do DGGE (Figura 3). Um dendrograma de similaridade foi gerado

para visualizar a distribuição hierárquica dos 3 grupos (Figura 4).

35

C3: n = 20 indivíduos; 27,8%

C2: n = 8 indivíduos; 11,0%

C1: n = 44 indivíduos; 61,2%

C1

C2

C3

•Eutróficos: n=8; 18,5%•Com sobrepeso: n=16; 36,0%•Obesos: n=20; 45,5%

•Eutróficos: n=4; 50,0%•Com sobrepeso: n=3; 37,5%•Obesos: n=1; 12,5%

•Eutróficos: n=12; 60,0%•Com sobrepeso: n=5; 25,0%•Obesos: n=3; 15,0%

C1 + C2 + C3 => 72 indivíduos n = 24 Eutróficos n = 24 Com sobrepeson = 24 Obesos

Figura 3. Agrupamento dos indivíduos participantes desse estudo (eutróficos, com sobrepeso e

obesos) de acordo com o perfil de bandeamento correspondente à região V6 do rRNA 16S

bacteriano, amplificadas a partir do DNA metagenômico extraído de amostras fecais separadas por

DGGE.

36

C1

C2

C3

Figura 4. Matriz de similaridade resultante da análise de agrupamento UPGMA com coeficiente de

Jaccard, do fingerprint dos produtos de amplificação do DNA bacteriano, separados em DGGE,

correspondente à região V6 do gene codificador para o rRNA 16S a partir do metagenoma fecal de

indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos. Bootstrap de 1000 réplicas.

37

Considerando-se o total de indivíduos em cada grupo, n=24, C1 é composto

por 83,3% dos indivíduos obesos avaliados, 66,6% dos indivíduos com sobrepeso

e 33,3% dos indivíduos eutróficos; C2 possui 4,2% dos obesos, 12,5% dos

indivíduos com sobrepeso e 16,7% dos eutróficos; enquanto que C3 apresenta

12,5% dos obesos, 20,8% dos indivíduos com sobrepeso e 50% dos eutróficos.

O cluster C1 é formado pela maioria dos participantes (44 indivíduos), sendo

20 obesos (45,5%), 16 com sobrepeso (36%) e 8 eutróficos (18,5%). Já o grupo

C2, de menor representatividade, é composto por 8 indivíduos, sendo 1 obeso

(12,5%), 3 com sobrepeso (37,5%) e 4 eutróficos (50%). O grupo C3 é composto

por 20 indivíduos, dos quais 3 são obesos (15%), 5 apresentam sobrepeso (25%) e

12 são eutróficos (60%).

38

6 DISCUSSÃO

A obesidade é uma pandemia associada a diversas comorbidades que

geram grande impacto no sistema de saúde. Recentemente, a relação entre a

microbiota intestinal humana e a obesidade tem sido abordada de diversas

maneiras em uma tentativa de elucidar as possíveis causas dessa enfermidade. Já

é consolidado na literatura o quão importante é o papel da microbiota intestinal na

influência sobre o processo saúde-doença.

No presente estudo, foi utilizada a técnica de PCR-DGGE para avaliar a

diversidade bacteriana da microbiota intestinal de 72 indivíduos, classificados como

obesos, com sobrepeso e eutróficos, de acordo com o IMC e as medidas

antropométricas. Nessa metodologia, a presença de bandas detectadas nos géis

permite inferir unidades taxonômicas operacionais (OTUs). No entanto, essa

técnica possui algumas limitações, como por exemplo, o tamanho dos fragmentos

não deve exceder 500pb para que possam ser bem separados na trama no gel de

poliacrilamida nas condições experimentais. Além disso, o DGGE dificilmente é

capaz de separar regiões caracterizadas apenas por pequenas variações de

sequência de aminoácidos (YU; MORRISON, 2004). A técnica detecta, a princípio,

apenas grupos ou espécies dominantes, porém, alguns relatos da literatura

demonstraram que a população detectada no gel pode não chegar a 1% da

população total. (FROMIN et al., 2002). A seleção de determinada região variável

(V) utilizada na amplificação e o método de extração do DNA, também são capazes

de influenciar na detecção das bandas (YU; MORRISON, 2004). Ainda assim, a

técnica de DGGE pode ser aplicada com êxito a uma grande variedade de estudos

de ecossistemas microbianos devido ao fato de permitir a visualização e a

comparação de perfis de comunidades microbianas com alta reprodutibilidade

(FROMIN et al., 2002; WU et al., 2010)

A análise estatística do perfil de bandeamento fornecido pelo PCR-DGGE

permitiu que os indivíduos fossem agrupados em três clusters, de acordo com a

similaridade entre os mesmos. A presença de um cluster dominante, composto em

sua maioria por indivíduos obesos e com sobrepeso, sugere um perfil de OTUs

predominantes na microbiota intestinal desses indivíduos. Da mesma maneira, um

segundo cluster formado majoritariamente por indivíduos eutróficos associados a

indivíduos com sobrepeso, indicam um outro perfil de OTUs característicos. No

39

terceiro grupamento, de menor representatividade, foi observada uma estrutura de

comunidade bacteriana intermediária quando comparada aos outros dois clusters.

Tal fato pode sugerir que os indivíduos com sobrepeso apresentam uma microbiota

intestinal em estágio de transição.

Quanto ao número de bandas avaliadas, não foi observada diferença

estatística significativa entre os três grupos, indicando que a obesidade está

relacionada com alterações na microbiota intestinal como um todo, e não com a

ação de um determinado grupo microbiano específico, conforme já demonstrado

por Wu e seus colaboradores (2010). A técnica de PCR-DGGE não apresenta a

sensibilidade necessária para determinar a diversidade total de uma amostra, no

entanto, a detecção de grupos dominantes é uma medida relativa que pode ser

utilizada para fins de comparação da diversidade entre ecossistemas microbianos.

Nesse estudo foi possível demonstrar que a microbiota intestinal de pessoas

obesas é diferenciada de indivíduos eutróficos, o que corrobora os achados da

literatura. No entanto, para descrever a maneira como ocorre essa diferença e a

forma como a microbiota pode ser modulada, novas abordagens seriam

necessárias, como o uso de metodologias complementares e a ampliação do

universo amostral.

40

7 CONCLUSÕES

A obesidade é uma enfermidade de relevância clínica mundial e a microbiota

intestinal humana é um importante alvo de estudos, principalmente devido

ao seu papel crucial na manutenção do equilíbrio energético;

Indivíduos obesos apresentam uma microbiota intestinal característica, que

se diferencia da microbiota de indivíduos eutróficos na população estudada.

Já os indivíduos com sobrepeso, no entanto, revelam uma microbiota em

caráter de transição entre eutróficos e obesos;

A técnica de PCR-DGGE apresenta limitações, como o tamanho limite de

500pb dos amplicons, o que dificultaria a sua resolução. O método também

se limita à detecção de apenas grupos dominantes, no entanto, pode ser

utilizada para comparação entre diferentes ecossistemas com alto grau de

reprodutibilidade. Sendo assim, novas abordagens metodológicas são

necessárias para que seja possível elucidar a correlação entre as alterações

nas comunidades microbianas intestinais e os mecanismos envolvidos no

processo da obesidade.

41

REFERÊNCIAS

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ANEXO A - Parecer do comitê de ética em pesquisa - UFJF

48

49

ANEXO B - Termo de consentimento livre e esclarecido

50

51

ANEXO C – Ficha para dados antropométricos

Data

Peso atual

Altura

IMC/Classificação

CC

CA

CQ

Relação C/Q

IC