UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE ......E-mail: [email protected] Co-orientador...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICALE SAÚDE

PÚBLICA

FRANCESCA GUARACYABA GARCIA CHAPADENSE

GENOTIPAGEM DO GENE KDR E ANÁLISE DE RESISTÊNCIA DE

LARVAS E ADULTOS DE Aedes aegypti A INSETICIDAS, EM GOIÂNIA–

GO.

Goiânia

2014

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS

TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL

DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade

Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca

Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos

autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões

assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de

divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ x ] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Francesca Guaracyaba Garcia Chapadense

E-mail: [email protected]

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [x]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor Bolsista

Agência de fomento: CAPES Sigla:

País: Brasil UF:GÔ CNPJ:

Título: Genotipagem do gene kdr e análise de resistência de larvas e adultos de Aedes

aegypti a inseticidas, em Goiânia- GO.

Palavras-chave: Aedes aegypti, resistência, inseticida, kdr.

Título em outra língua: Kdr gene genotyping and analysis of resistance of larvae and

adults of Aedes aegypti to insecticides in Goiânia GO

Palavras-chave em outra língua: Aedes aegypti, resistance, insecticide, kdr.

Área de concentração: Parasitologia

Data defesa: (10/04/2014)

Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública

Orientador (a): Éverton Kort Kamp Fernandes

E-mail: [email protected]

Co-orientador

(a):*

Pedro Victor Lemos Cravo

E-mail: [email protected] *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se

imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese

ou dissertação.

Francesca Guaracyaba Garcia Chapadense Data: 28 /07 /2014

Assinatura do (a) autor (a)

FRANCESCA GUARACYABA GARCIA CHAPADENSE

GENOTIPAGEM DO GENE KDR E ANÁLISE DE RESISTÊNCIA DE

LARVAS E ADULTOS DE Aedes aegypti A INSETICIDAS, EM GOIÂNIA–

GO.

Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina Tropical e Saúde Pública da

Universidade Federal de Goiás para

obtenção do Título de Mestre em

Medicina Tropical e Saúde Pública.

Área de concentração: Parasitologia.

Orientador: Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

Co-orientador: Prof. Dr. Pedro Vitor Lemos Cravo

Goiânia

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

Chapadense, Francesca Guaracyaba Garcia.

C462g Genotipagem do gene kdr e análise da resistência de larvas

e adultos de Aedes aegypti a inseticidas, em Goiânia – GO

[manuscrito] / Francesca Guaracyaba Garcia Chapadense,

2014.

Xv, 105 f. :il., figs, tabs.

Orientador: Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes; Co-

Orientadora: Prof. Dr. Pedro Victor Lemos Cravo.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás,

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014.

Bibliografia.

Inclui lista de figuras, tabelas, abreviaturas e siglas.

Apêndices.

1. Aedes aegypti – Larvicida – Resistência – Goiânia (GO)

2. Aedes aegypti – Resistência a inseticidas 3. Aedes aegypti –

Controle – Goiânia (GO) I. Título.

CDU: 595.771:615.285.7(817.3)

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluna: Francesca Guaracyaba Garcia Chapadense

Orientador: Professor Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

Co-orientador: Professor Dr. Pedro Vitor Lemos Cravo

Membros:

1. ÉVERTON KORT KAMP FERNANDES

2. ADELAIR HELENA DOS SANTOS

3. DANIELA MELO E SILVA

Data: 10/04/2014

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço a Deus por me dar forças quando precisei e nunca me

abandonar.

Ao meu orientador, Professor Éverton Kort Kamp Fernandes pela confiança, calma e

educação admirável.

Ao meu co-orientador Professor Dr. Pedro Vitor Lemos Cravo, por aceitar trabalhar

comigo neste projeto, por compartilhar toda sua sabedoria, pelo apoio, dedicação e

amizade.

Agradeço à Professora Adelair Helena dos Santos, antes de tudo pela atenção e pela

oportunidade de estágio na universidade e por abrir a primeira porta. Se não fosse

essa oportunidade talvez hoje não pudesse estar aqui concluindo meu trabalho. Muito

obrigada!

A CAPES – fonte financiadora do projeto pela ajuda.

À pós-graduação, Universidade Federal de Goiás – UFG e aos professores por nos

ensinarem e nos moldarem.

Grata a TODOS do LAFICAVE- Laboratório de Fisiologia e Controle de insetos

vetores – Fiocruz- RJ, ao Dr. Ademir Martins Júnior pela oportunidade, ao Dr. José

Bento Pereira Lima pelo ensino e paciência e aos técnicos Luciana Dias, Diogo

Bellinato, Cynara Rodovalho e ao Gilberto pela ajuda, e em especial a Luana Carrara

e Raquel Santos por toda ajuda, paciência e amizade.

Agradeço ao Izaías Ferreira Soares e aos agentes de combate à dengue e toda equipe

do Centro de Zoonoses de Goiânia pela ajuda e assistência. Em especial ao

Wellington Tristão por toda dedicação, profissionalismo e paciência.

Ao pessoal do Laboratório de Xenodiagnóstico do IPTSP/UFG, professora Drª.

Heloísa Garcia, professor Dr. Ionizete Garcia e a técnica Carmeci Natalina Elias e,

em especial ao Judson Regozino e ao Edson de Castro por toda ajuda que me deram

e pelo coração humilde que carregam.

Aos colegas Hânstter Hállison, Juliana Boaventura, Juscelino Rodrigues e Lucas

Barreto por toda colaboração, ensino, paciência, amizade e felicidade.

Agradeço aminha mãe e ao meu amado irmão pelo companheirismo e por nunca

deixarem de acreditar em mim.

Agradeço aos meus tios Neuza Lima, Cláudio Lima, Madalena Garcia pelo

acolhimento e amor.

E ao Raphael Amorim e Vitória de Aquino pelo acolhimento, compreensão, carinho

e amor.

SUMÁRIO

SUMÁRIO...................................................................................................... VIII

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS .............................................................. XI

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS.................................................

XV

RESUMO........................................................................................................ XVIII

ABSTRACT................................................................................................... XIX

1.INTRODUÇÃO.......................................................................................... 01

1.1 Aedes aegypti e o vírus da dengue..................................................... 01

1.2 Dengue em Goiás...................................................................................... 02

1.3 Métodos de controle de A. aegypti ........................................................... 04

1.3.1 Controle químico (inseticidas)............................................................... 04

1.3.2 Organofosforados (OPs) ....................................................................... 06

1.3.3 Piretroides (PYs) .................................................................................. 06

1.3.4 Alternativas de controle ........................................................................ 08

1.4 Mecanismo de ação dos inseticidas.......................................................... 09

1.5 Resistência dos vetores a inseticidas......................................................... 10

1.5.1 Resistência por redução na taxa de penetração do inseticida................. 11

1.5.2Resistência metabólica............................................................................ 12

1.5.3 Resistência por alterações no sítio-alvo................................................. 12

1.5.4 Canal de sódio voltagem-dependente..................................................... 13

1.5.5 O efeito knockdown e o fenótipo kdr...................................................... 14

1.5.6 A mutação kdr........................................................................................ 15

2. JUSTIFICATIVA........................................................................................ 17

3. OBJETIVOS................................................................................................ 19

4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 20

4.1 Área de estudo .......................................................................................... 20

4.1.2 Coleta de ovos para produção da colônia............................................... 22

4.1.3 Instalações das armadilhas e coletas de ovos......................................... 23

4.2 Manutenção das colônias de Aedes aegypti............................................... 24

4.2.1Origem dos mosquitos da colônia de Rockfeller.................................... 25

4.3 Bioensaio Dose-Resposta com temefós sobre larvas de A. aegypti.......... 25

.

4.3.1 Produção das larvas para os bioensaios ................................................. 25

4.3.2 Preparação do bioensaio........................................................................ 26

4.4 Bioensaios com papeis impregnados com deltametrina............................ 27

4.4.1 Preparo da solução e impregnação dos papéis....................................... 28

4.4.2 Mosquitos usados nos bioensaios........................................................... 28

4.4.3 Realização dos bioensaios com papéis impregnados............................ 28

4.5 Análise dos resultados ............................................................................. 30

4.6 Amostras para extração de DNA.............................................................. 31

4.6.1 Extração de DNA................................................................................... 32

4.7 Genotipagem por PCR alelo-específica no sítio Phe1534Cys do gene de

canal de sódio de Aedes aegypti (AaNav)........................................................

33

4.7.1 Genotipagem molecular por PCR no sítio Val1016Ile do gene de

canal de sódio de Aedes aegypti (AaNav)........................................................

34

4.7.2 Cálculo para frequências genotípicas e alélicas.................................... 35

5. RESULTADOS........................................................................................... 36

5.1 Dados Bioecológicos................................................................................ 36

5.2 Avaliação da suscetibilidade da população de A. aegypti a temefós e a

deltametrina........................................................................................

37

5.2.1Temefós .................................................................................................. 38

5.2.1.1Finsocial............................................................................................... 38

5.2.1.2 Sudoeste.............................................................................................. 38

5.2.1.3 Jardim América................................................................................... 38

5.2.2 Deltametrina........................................................................................... 39

5.2.2.1 Finsocial.............................................................................................. 40

5.2.2.2 Sudoeste.............................................................................................. 40

5.2.2.3 Jardim América................................................................................. 40

5.3 Análise de polimorfismos genéticos nos sítios 1016 e 1534 do gene

kdr......................................................................................................

41

5.3.1 Frequências genotípicas e alélicas no códon 1534................................. 41

5.3.2. Frequências genotípicas e alélicas no códon 1016............................... 42

5.3.3 Agrupamento genotípico nos sítios 1016 e 1534 do AaNav................... 45

6. DISCUSSÃO ......................................................................................... 52

6.1 Dados Bioecológicos................................................................................. 52

6.2 Bioensaios com Temefós.......................................................................... 53

6.3 Bioensaios com deltametrina.................................................................... 55

6.4 Investigação de alterações no gene que codifica o canal de sódio

regulado por voltagem em Aedes aegypti (AaNav)...................................

56

6.5Substituições Phe1534Cys e Val1016Ile............................................. 57

7. CONCLUSÕES......................................................................................... 59

8. REFERÊNCIAS...................................................................................... 60

ANEXOS..................................................................................................... 75

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Figura 1 Aedes aegypti..................................................................... 2

Figura 2 Estrutura do inseticida dicloro-difenil-tricloroetano e

número de compostos....................................................

5

Figura 3 Estruturas químicas de (a) Cipermetrina (C22H19C2NO3) e

(b) Deltametrina (C22H19Br2NO3).......................................

7

Figura 4 O Canal de sódio voltagem dependente – esquema

representando os quatro domínios homólogos (I-IV), e seis

segmentos hidrofóbicos (S1-S6).......................................

14

Figura 5 Mapa da cidade de Goiânia, GO, mostrando os bairros

onde as armadilhas de oviposição foram instaladas e as

coletas foram realizadas....................................................

21

Figura 6 Exemplos de ovitrampas instaladas nas residências............. 22

Figura 7

Esquema de um Bioensaio Dose-Resposta com temefós,

com nove concentrações diferentes e o controle. Kit da

OMS para realização do teste com papeis

impregnados................................................................

27

Figura 08

Kit utilizado para realização do bioensaio com

deltametrina.................................................................

30

Figura 09

Machos de Aedes aegypti usados na extração de

DNA..........................................................................

32

Figura 10 Extração de DNA........................................................ 33

Figura 11

Avaliação da resistência de larvas de populações de A.

aegyti provenientes de Goiânia-GO a temefós................

39

Figura 12

Razões de Resistência (RR) de mosquitos adultos de

populações de A. aegyti provenientes de Goiânia-GO à

deltametrina.................................................................

40

Figura 13

Distribuição da frequência alélica do polimorfismo

Val1016Ile nos três bairros analisados...........................

50

Figura 14 Distribuição da frequência alélica do polimorfismo

Phe1534Cys nos três bairros analisados.....................

51

TABELA 1. Dados comparativos de dengue em Goiás....................... 3

TABELA 2. Mutações descritas em A. aegypti associadas à redução da

sensibilidade a piretroides............................................

16

TABELA 3. Relação dos bairros pesquisados, altitude, população

estimada em 2010, e casos de dengue registrados até a 30ª

semana do presente ano...............................................

20

TABELA 4. Valores de RR para avaliações de resistência a

inseticidas..................................................................

31

TABELA 5. Sequencias de primers................................................... 35

Tabela 6 Dados bioecológicos de populações de A. aegypti

provenientes da cidade de Goiânia................................

37

TABELA 7. Concentrações Letais (CL50 e CL95) de temefós para para

populações de A. aegypti provenientes de Goiânia-GO.....

39

TABELA 8. Concentrações Letais (CL50 e CL95) de deltametrina para

populações de A. aegypti provenientes de Goiânia-GO......

40

TABELA 9. Frequência genotípica e alélica do códon 1534 do gene

kdr de populações de Aedes aegypti provenientes de

Goiânia, GO................................................................

43

TABELA 10. Frequência genotípica e alélica do códon 1016 do gene

kdr de populações de Aedes aegypti provenientes de

Goiânia, GO................................................................

44

TABELA 11. Alelos encontrados em ambos os sítios.......................... 45

TABELA 12. Frequências genotípicas e alélicas dos dois sítios no gene

kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro Vila

Finsocial – Goiânia- GO...............................................

47


kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro

Sudoeste – Goiânia- GO................................................

48


kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro

Jardim América – Goiânia- GO.....................................

49

Anexo 1. Aprovação do Comitê de Ética..................................... 75

Anexo 2. Resultados dos Bioensaios Dose-Resposta........................ 76

Tabela 1 Bioensaio Dose – Resposta realizada com larvas da

população Finsocial proveniente da cidade de Goiânia-

GO.........................................................................

76

Tabela 2. Bioensaio Dose – Resposta realizado com larvas da

população do setor Sudoeste proveniente da cidade de

Goiânia-GO.............................................................

77

Tabela 3. Bioensaio Dose – Resposta realizado com larvas da

população Jardim América proveniente da cidade de

Goiânia-GO..............................................................

78

Anexo 3: Genotipagem do gene kdr nos sítio 1016 e 1534

(Phe1534Cys e Val1016Ile).........................................

78

Tabela 1. Genotipagem do gene kdr (Phe1534Cys) em Aedes

aegypti provenientes da população Vila Finsocial da

cidade de Goiânia – GO, coletados em

2013.................................................................................

78


aegypti provenientes da população Sudoeste da cidade de

Goiânia – GO, coletados em 2013.................................

80


aegypti provenientes da população Jardim América da

cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013..................

82

Tabela 4. Genotipagem do gene kdr (Val1016Ile) em Aedes aegypti

provenientes da população Jardim América da cidade de


84




85



Goiânia – GO, coletados em 2013....................................

87

Anexo 4. Géis resultantes do PCR referente a pesquisa do

polimorfismo Val1016Ile...........................................

89

SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

A - Adenina

AaNav- Canal de Sódio voltagem-dependente de Aedes aegypti

AChE- Acetilcolinesterase

Bti- Bacillus thringiensis israelensis

C-Citosina

CDC- Centers for Disease Control and Prevention

CEUA- Comissão de Ética no uso de Animais

CL- Concentração Letal

Cys- Cisteína

DDT- Dicloro difeniltricloroetano

DEN (1, 2, 3 e 4)- DENGUE

DNA- Ácido Desoxirribonucléico

DR- Dose Resposta

EDTA- Ácido etilenodiaminotetracético

Et al. E outros

FHD- Febre Hemorrágica da Dengue

G-Guanina

GABA- Ácido γ-aminobutírico

GSTs- Glutationa S-transferase

GO- Goiás

IDO- Índice de Densidade de ovos

Ile- Isoleucina

IPO- Índice de Positividade das Ovitrampas

IPTSP- Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

LAFICAVE- Laboratório de Fisiologia e Controle de Vetores

ml- mililitros

MoReNAa- Rede Nacional de monitoramento de Resistência de Aedes aegypti

NAv- Canal de Sódio Voltagem-dependente

OMS- Organização Mundial de Saúde

OPAS- Organização Pan-Americana de Saúde

Ops- Organofosforados

PCR-RT- Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

pH - Potencial Hidrogeniônico

Phe- Fenilalanina

Ppm- Parte por milhão

PYs- Piretroides

RNA- Ácido ribonucléico

RNAse - Ribonuclease

ROCK- Rockfeller

RR- Razão de Resistência

S (I a VI) – Segmentos

SCD- Síndrome de Choque da Dengue

SMS- Secretária Municipal de Saúde

SES-GO- Secretaria Estadual de Saúde de Goiás

SUCEN- Superintendência de Controle de Endemias

SE- Semana Epidemiológica

SUVISA- Superintendência de Vigilância em Saúde

Tm- Temperatura de melting

T- Timina

µl- microlitros

Val- Valina

Kdr- Knockdown Resistance

RESUMO

Organofosforados e piretroides são amplamente utilizados no Brasil no controle de

Aedes aegypti. O uso excessivo desses inseticidas resultou na evolução de

populações de mosquitos resistentes aos compostos. O estudo teve como objetivo

avaliar a resistência de populações de A. aegypti de três bairros de Goiânia-GO

(Finsocial, Sudoeste e Jardim América), ao temefós e à deltametrina e identificar

mutações no gene do canal de sódio kdr associadas à resistência a piretroides. As

coletas foram realizadas utilizando armadilhas do tipo Ovitrampas. Os bioensaios

Dose-Resposta para temefós e deltametrina foram realizados de acordo com a OMS.

Determinou-se a Concentração Letal (CL50 e CL95) para as três populações aos dois

compostos e suas respectivas Razões de Resistência (RR), por comparação à cepa

suscetível Rockefeller. O DNA de 30 indivíduos de cada população foi extraído e

através do uso do PCR alelo-específica, por curva de dissociação, para pesquisa do

polimorfismo sítio Phe1534Cys, e do PCR em Tempo Real e gel de poliacrilamida,

para detecção do polimorfismo Val1016Ile do gene kdr. Além das substituições

identificadas individualmente nos sítios, as mesmas foram detectadas ocorrendo em

simultaneidade. As populações Finsocial, Sudoeste e Jardim América, mostraram,

RR95 de 5,1; 4,9 e 5,3 para o temefós e RR95 de 112,6, 64,7 e 75,9 para deltametrina,

respectivamente. O polimorfismo Phe1534Cys foi encontrado em todas as

populações apresentando uma freqüência alélica de: 1,0, 1,0 e 0,98, para Vila

Finsocial, Sudoeste e Jardim América. O polimorfismo Val1016Ile foi detectado e

apresentou frequência alélica de 0,47, 0,72 e 0,53, respectivamente em Vila

Finsocial, Sudoeste e Jardim América. Todas as populações avaliadas apresentaram

polimorfismos simultâneos ocorrendo na proporção de 0,25, 0,577 e 0,393, para Vila

Finsocial, Sudoeste e Jardim América. Conclui-se que mesmo após oito anos de

desuso do temefós na região, as larvas de A. aegypti apresentam ainda resistência ao

composto, impossibilitando seu retorno. A deltametrina representa uma medida de

controle ineficaz para o controle do vetor em Goiânia-GO e as mutações envolvidas

no mecanismo de resistência a piretroides estão presentes em alto nível em todas as

populações avaliadas, pondo em risco a eficácia da principal ferramenta de controle

do vetor do vírus da dengue.

Palavras-chave: Aedes aegypti, inseticidas, resistência, kdr.

ABSTRACT

Organophosphorus and Pyrethroids are widely used in Brazil in the control of Aedes

aegypti. Excessive use of these insecticides has resulted in the evolution of

insecticide-resistant mosquito populations. The present study aimed to evaluate

resistance to temephos and deltamethrin of A. aegypti populations from three districts

in Goiânia-GO, Brazil (Finsocial, Sudoeste and Jardim America), to and to identify

mutations in the kdr resistance-associated sodium channel gene pyrethroid. The

collections were made using Ovitraps. The Dose-Response Bioassays were

performed according to the WHO. Determined the lethal concentration (LC50 and

LC95) for the three populations of the two compounds and their resistance ratios

(RR) compared with the susceptible Rockefeller strain. DNA from 30 individuals of

each population, and was extracted by using the allele-specific PCR, by dissociation

curve to search Phe1534Cys polymorphism site, and Real-Time PCR and

polyacrylamide gel for detection of gene polymorphism Val1016Ile kdr. In addition

to the substitutions at sites identified individually, they were detected occurring

concurrently. The Finsocial, Sudoeste and Jardim América, populations showed,

RR95 of 5.1; 4.9 and 5.3 for temephos RR95 and 112.6, 64.7 and 75.9 for

deltamethrin, respectively. The Phe1534Cys polymorphism was found in all

populations having an allelic frequency: 1.0, 1.0 and 0.98 for Vila Finsocial,

Sudoeste and Jardim América. The Val1016Ile polymorphism was detected and

showed allele frequency of 0.47, 0.72 and 0.53 respectively in Vila Finsocial,

Sudoeste and Jardim América. All populations showed concurrent evaluated

polymorphisms occurring in the ratio of 0.25, 0.577 and 0.393 for Vila Finsocial,

Southwest and Jardim America. We conclude that even after eight years of disuse of

temephos in the region, the larvae of A. aegypti also show resistance to the

compound, preventing his return. The deltamethrin is a measure of ineffective

management for vector control in Goiânia-GO and mutations involved in the

mechanism of resistance to pyrethroids are present at high level in all tested

populations, jeopardizing the effectiveness of the main tool for vector control dengue

virus.

Keywords: Aedes aegypti, inseticides, resistance, kdr

1. Introdução

1.1 Aedes aegypti e o vírus da dengue.

Aedes aegypti é o principal vetor de importância epidemiológica na

transmissão da dengue e da febre amarela nas Américas (WHO 2009) (Figura 1).

Entre as arboviroses transmitidas pelo A. aegypti a dengue é a que tem chamado mais

atenção. É uma doença infecciosa causada por um vírus de genoma RNA, do gênero

Flavivirus, família Flaviviridae, do qual são conhecidos quatro sorotipos (DENV-1,

DENV-2, DENV-3 e DENV-4) (Holmes & Twiddy 2003; WHO 2009). Os quatro

sorotipos são transmitidos pela picada da fêmea do mosquito infectado do gênero

Aedes (Stegomya). A infecção pelo vírus pode causar desde infecções assintomáticas

até formas sintomáticas graves que podem resultar em óbitos, mesmo em primo

infecção (WHO 2009). A dengue se tornou a arbovirose de maior importância hoje

no mundo, com cerca de 2,5 bilhões de pessoas vivendo em países nos quais a

doença ocorre de forma endêmica (WHO 2009).

A. aegypti originou-se no continente africano (Christophers 1960) e está

associado aos ecossistemas antrópicos. Geralmente, o mosquito é encontrado em

regiões tropicais e subtropicais, entre os paralelos geográficos 45º de latitude norte e

40º de latitude sul (Consoli & Lourenço-de-Oliveira 1994; Forattini 2002). A.

aegypti é um mosquito urbano que se adapta com facilidade aos ambientes humanos,

principalmente por encontrar condições favoráveis para desenvolver-se, como por

exemplo: abundância de criadouros, escassez de predadores e repasto sanguíneo

fácil. Apenas as fêmeas são hematófagas, apresentando atividade diurna, podendo

picar por várias vezes até completar a alimentação sanguínea e faz praticamente

nenhum som audível antes de picar. Para postura, as fêmeas escolhem principalmente

recipientes artificiais como: vasos de planta com água, pratos de vasos, latas,

garrafas, pneus, caixas d'água e outros reservatórios de água. Seus criadouros

naturais são ocos de árvores, cascas de côco, bromélias ornamentais, água acumulada

em folhas secas caídas no chão, entre outros. Os ovos por sua vez apresentam uma

incrível resistência à dessecação suportando até mais de um ano sem contato com a

água (Consoli & Oliveira 1994; Silva et al. 2009; Taveira 2001).

Figura 1: Ilustração do mosquito vetor da dengue: Aedes aegypti.

Fonte: http://drauziovarella.com.br/letras/a/aedes-aegypti/attachment/original-title-

aa_fc2_23a-jpg/.

Em Goiás, o mosquito foi detectado em 1987, no sul do estado e em Goiânia

foi descrito pela primeira vez em 1990 (Silva et al. 1991). Desde então, a dispersão

do mosquito tem sido intensa devido aos fatores climáticos favoráveis para sua

adaptação e desenvolvimento na região. De acordo com a OMS (2008) os quatro

sorotipos do vírus da dengue já circulam na região Centro-Oeste sendo o sorotipo

DEN-3 o tipo viral predominante.

1.2. Dengue em Goiânia e em Goiás (aumentar)

O estado de Goiás é constituído por 246 municípios e as notificações de casos

de dengue ocorridas no estado são realizadas através do Boletim Semanal de

Dengue– Secretária Estadual de Saúde de Goiás (SES-GO). De acordo com os dados

do ultimo boletim de casos de dengue (2013), comparado aos últimos dois anos,

Goiás sofreu um aumento em notificações de dengue de 401%, e Goiânia apareceu

como o município com maiores índices de casos (58.887) (SES-GO) (Tabela 1).

Tabela 1: Dados comparativos de dengue. Goiás, 2011, 2012 e 2013 da semana 01 a

52 (30/12/2012 a 28/12/2013).

Ano Total

Casos

notificados

Comparativo

Casos

Total de

óbitos

Comparativo

óbitos

2011

44009

51

2012

31952

Redução de

27,40% em relação

a

2011.

52

Aumento de

1,96%

em relação a 2011.

2013

160090

Aumento de

401,03%

em relação a 2012

65

Aumento de

25,00% em relação

a 2012

Adaptado de Planilha Semanal/GVEDT/SUVISA/SES-GO

De acordo com Silva et al (2002), o primeiro surto da dengue em Goiânia

ocorreu em 1994, quatro anos após descrição do vetor na região. Os surtos se

repetiram nos anos subseqüentes em 1996 foram realizados os primeiros testes para

análise de susceptibilidade de A. aegypti ao Cytion, o inseticida usado na época no

controle ao vetor. O método utilizado foi à exposição Cytion, na formulação de

ultrabaixo volume (UBV) a 95% aplicado na dosagem de 127 ml por minuto, de

adultos de A. aegypti mantidos em gaiolas expostas ao composto químico nos bairros

(Silva et al. 1994; Silva et al. 1997; Fernandes & Silva 1999; Carvalho & Silva 2000

a,b). Atualmente as atividades de controle do vetor da dengue são realizadas de

forma descentralizada pelo Sistema Único de Saúde (SUS).

2. Métodos de Controle de Aedes aegypt.

Por não existir vacina e medicamentos disponíveis, a principal medida para

evitar a transmissão da doença é através do controle do vetor. As tentativas de

controle de vetores iniciaram no fim do século XIX, quando se descobriu que

doenças de grande importância médica eram transmitidas por mosquitos. A principal

ferramenta utilizada na época para controle dos vetores foi aplicação de óleo ou de

verde Paris nos criadouros (Casida1998). O combate a A. aegypti foi

institucionalizado no Brasil a partir daí, quando diversas epidemias de febre amarela

urbana que ocorreram nessa época levaram milhares de pessoas à morte (Funasa

2001).

1.2.1 Controle químico (inseticidas)

Os inseticidas possuem ações fisiológicas sobre organismos vivos e para

serem introduzidos no mercado precisam obedecer critérios técnicos e legais sobre

seu efeito deletério no ambiente, no organismo humano e em outros animais (Braga

& Valle 2007).

O objetivo do controle de vetores utilizando inseticidas é diminuir a

transmissão de doenças, diminuindo com isso os surtos, epidemias, alta mortalidade

e morbidade e prevenir a reintrodução de doenças (Braga & Valle 2007).

Os inseticidas químicos podem ser classificados de diversas maneiras, como,

de acordo com o grupo químico ao qual pertencem, sendo conhecidos os

hidrocarbonetos clorados ou organoclorados, carbamatos, piretroides e

organofosforados. Uma segunda forma de classificação é de acordo com o modo de

ação: os compostos que acometem o aparelho digestivo como os arsênios que são da

primeira geração de inseticidas; a segunda geração são os inseticidas de contato,

como os organoclorados, carbamatos, piretroides e organofosforados; a terceira

geração é representada por compostos reguladores de crescimento, como os

hormônios juvenis e seus análogos (WHO 2005).

Até meados de 1800, o controle dos insetos dependia unicamente de lavagem

dos locais infestados e coleta dos insetos. Entre as poucas armas químicas existentes

na época incluíam-se alguns inorgânicos como enxofre, arsênico, arseniato e ácido

bórico, que serviam como venenos gerais. O controle químico com inseticidas

inorgânicos ou orgânicos era o tipo de manejo mais comumente utilizado, e no

século XX esse método de controle sofreu um dos maiores avanços a descoberta de

um inseticida que permanecia no ambiente combatendo os insetos por vários meses.

Esse inseticida recebeu o nome de dicloro-difenil-tricloroetano (DDT) (Rozendaal

1997) (Figura 2). Odicloro-difenil-tricloroetano foi introduzido pela primeira vez em

1946 para o controle de várias espécies de artrópodes (Hemingway 2000).

Muitas doenças como a malária e febre amarela sofreram uma drástica

diminuição, com o uso do DDT. Seu modo de ação e dos piretroides baseia-se na

destruição do equilíbrio de íons sódio e potássio dos axônios, provavelmente

mantendo o canal de sódio aberto, impedindo, assim, a transmissão normal de

impulsos nervosos em insetos e mamíferos (Ware 2000).

Anos depois, alguns trabalhos relacionados ao DDT relatando a presença do

inseticida no leite materno e sua associação com a ocorrência de câncer em humanos

(Bouwman 1990; Wolff et al. 1993) fez com que a OMS recomendasse aos

especialistas a revisão completa da literatura chegando à conclusão que o uso do

DDT seria justificado apenas em situações de extrema necessidade.

Esses compostos só foram úteis até à década de 1940, quando surgiram os

primeiros inseticidas botânicos chamados de “primeira geração”, que chamaram

atenção por sua complexidade estrutural, potência e seletividade (Casida 1980).

Os inseticidas de primeira geração foram representados na época pela

Nicotina, que atualmente já foi completamente substituída, o Rotenona, Rianodina,

Veratridina e Azadiractina e por fim os piretroides que até hoje tem sido os mais

importantes inseticidas. A descoberta dos primeiros inseticidas orgânicos sintéticos

marcou a década de 1930, e tornou-se o objetivo principal de vários pesquisadores

(Casida 1980; Casida 1998).

Figura 2: Estrutura do inseticida dicloro-difenil-

tricloroetano e número de compostos análogos (Tomlin, 1994).

1.2.3 Organofosforados (OPs)

O organofosforado (OP) temefós foi introduzido no mercado em 1965 (Melo

et al. 2008), sendo o único larvicida do grupo com uso generalizado no controle de

larvas de mosquito, por mais de 40 anos. Foi aprovado pela OMS para o uso em água

de consumo humano, por sua pouca persistência no ambiente e baixa toxidade aguda

(WHO 2007). Seu uso no Brasil teve início a partir de 1967 e foi intensificado após o

surto de dengue de 1986 (Macoris et al. 2007). Desde a implantação do Plano de

Erradicação de A. aegypti (PEAa) no Brasil em 1997/1998, seu uso nos programas de

saúde pública foi estimado em 5 mil toneladas por ano, segundo a FUNASA (2001).

A resistência ao OP temefós foi confirmada alguns anos depois do início da

sua utilização (Macoris et al. 1999; Braga et al. 2004; Carvalho et al. 2004). O

monitoramento da resistência de populações de A. aegypti ao temefós tem sido

amplamente estudado e registrado em várias localidades do Brasil, como no Distrito

Federal (Carvalho et al. 2001, 2004), Espírito Santo e Rio de Janeiro (Lima et al.

2003), Alagoas, Goiás, Rio Grande do Norte, Sergipe, Rio Grande do Sul e Pará

(Montella 2007), Campinas (Campos & Andrade 2001) e São Paulo (Macoris et al.

2003).

Em consequência disto, o Ministério da Saúde do Brasil substituiu o temefós

por uma medida alternativa usando o biolarvicida Bacillus thuringiensis israelensis

(Bti) nas regiões onde havia sido detectada a resistência de A. aegypti (Lima 2003).

O Bti é uma bactéria Gram-positiva esporulante, produtora de cristais protéicos com

atividade inseticida, segundo Angelo (2010) o microorganismo mais utilizado no

controle biológico.

1.2.4 Piretroides (PYs)

Com a proibição do uso frequente do DDT e a disseminação de populações

resistentes ao composto, outros grupos de inseticidas começaram a serem

desenvolvidos, entre eles, os piretroides (Hemingway & Rason 2000).

Os PYs são os derivados sintéticos das piretrinas, ésteres tóxicos retirados das

flores de Chrysanthemum cinerariaefolium (Santos et al. 2007). E destacam-se pelo

desenvolvimento comercial, sendo os inseticidas mais usados no mundo. Os

inseticidas mais vendidos são cipermetrina e deltametrina (Figura 3), classe dois e

três, que juntos somam aproximadamente 25% do mercado mundial dos inseticidas.

A extração dos ésteres foi realizada pela primeira vez em 1800 pela tribo Caucasian

para combater piolhos e subseqüentemente, depois passaram ser comercializados na

Armênia e no Japão em 1828, e em 1940 com produção na África (Ruanda, Quênia,

Tanzânia, e Zaire) e na Austrália. Segundo Casida (1980), mais de 200 agricultores

estavam envolvidos com a produção das flores na época, com isso a produção das

flores secas chegou ao dobro do necessário: cerca de 150 a 200 toneladas por ano.

As flores contêm um único grupo de seis poliacetilenos diferentes, as

piretrinas, que são responsáveis por toda atividade inseticida. Coletivamente

chamados de piretroides, os PYs substituíram muitos inseticidas sintéticos como

DDT e carbamatos, conhecidos por seus efeitos negativos sobre o meio ambiente e

efeitos tóxicos sobre homens e animais. Os PYs são classificados como “segunda

geração”, e encontram-se nessa classificação os inseticidas com ação nervosa:

organofosforados, meilcarbamatos, hidrocabonetos clorados e PYs. Os dois

primeiros agem inibindo acetilcolinesterase e consequentemente prejudicando a

transmissão sináptica (Casida 1980). Os PYs podem ser divididos em dois tipos:

Tipo I onde falta um grupo ciano (ex: Permetrina) e Tipo II que possui com um alfa-

ciano (ex: Deltametrina) (Vais et al. 2000; Davies et al. 2007).

Figura 3. Estruturas químicas de (a) Cipermetrina (C22H19C2NO3) e (b)

Deltametrina (C22H19Br2NO3). Adotado de Picolli (2010).

Apesar dos PYs serem um pouco mais caros que os outros grupos de

inseticidas por unidade de peso, são bastante usados na agricultura e no controle de

vetores de importância médica e veterinária por apresentarem grandes vantagens

como a rápida degradação por luz ultravioleta e sua baixa toxidade aos mamíferos

(Elliott 1995; Sucen 2010). Geralmente, a exposição dos seres humanos aos PYs

ocorre principalmente via ingestão de resíduos presentes nos alimentos e inalação

após o uso do mesmo no interior de domicílios (Santos et al. 2007).

Os PYs, numa ação semelhante ao DDT, agem no sistema nervoso central e

periférico do inseto, tendo como alvo o canal de sódio dependente de voltagem

(Nav), localizado na membrana dos neurônios (Davies et al. 2007).

A partir de 1999 os PYs passaram a ser utilizados na rotina de controle de A.

aegypti no Brasil no interior das casas, e impregnados em mosquiteiros e telas para

janelas (Hemingway 2004). No entanto, a resistência aos PYs logo foi detectada e, a

disseminação das populações resistentes de A. aegypti foi relatada em vários estados

brasileiros como, por exemplo, no Rio de Janeiro (da-Cunha et al. 2005) e no Paraná

(Luna et al. 2004), Roraima, Amapá, Pará, Ceará, Alagoas, Mato Grosso, Mato

Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais e Rio Grande do Sul (Martins et al. 2009).

1.2.5 Alternativas de controle

Visando à redução ou substituição do uso de inseticidas foram desenvolvidas

muitas formas alternativas de controle, que atuam sobre as larvas e causam a morte

das mesmas nos criadouros (Guirado et al. 2009).

Uma alternativa que vem sendo bastante usada é o Bti, uma bactéria que

produz proteínas como δ- endotoxinas, que são tóxicas não só para larvas de A.

aegypti como também para larvas de outros insetos (Gunasekaran et al. 2004). O Bti

tem se destacado entre os outros métodos por não poluir o meio ambiente, preservar

a maioria da fauna associada e não ser tóxico ao homem e aos animais. Sua

permanência no ambiente é inativada pela exposição direta a radiação ultravioleta

(Becker et al. 1992; Polanczyk et al. 2003).

Muitas pesquisas com extrato de plantas têm sido realizadas com o objetivo

de utilizá-los na eliminação do mosquito na fase larval. Pesquisadores da Fiocruz

desenvolveram um produto à base da Piper solmsianum, uma planta da família da

pimenta, encontrada na Mata Atlântica e que provou sua eficiência em testes de

laboratório (Fiocruz 2008). Cientistas da Universidade do Sul de Santa Catarina

(USSC) desenvolveram suas pesquisas envolvendo as plantas andiroba e cinamomo.

A equipe da Universidade Federal do Paraná (UFP) usa extrato etanólico de

sementes trituradas de Melia azedarach como objeto de pesquisa. Pesquisadores do

Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC) indicam um chá

misturando plantas medicinais como agrião-bravo, alfavaca, alho capim-santo,

cidreira, hortelã, limão ou mastruz (Paraná 2004; Talamoni 2007; Nogueira 2008).

Muitos outros estudos estão sendo desenvolvidos no Brasil e no mundo, visando o

controle do mosquito pela interrupção do ciclo biológico na fase larval, utilizando

extrato de plantas.

Outra alternativa muito utilizada é a cafeína ou a borra de café, avaliadas por

pesquisadores da Universidade Estadual Paulista (UNESP) de São José do Rio Preto

(SP), onde foi mostrada alta eficiência desde 2000, na eliminação das larvas de Aedes

aegypti (Laranja et. al. 2003; Laranja et al. 2006; Guirato & Bicudo 2009). A cafeína

destacou-se em muitas pesquisas apresentando eficiência para o controle, por não

apresentar resistência e diminuir o número de oviposição da fêmea e eclosão das

larvas em testes feitos em laboratório. É importante ressaltar que qualquer que seja o

produto que se utilize, a resistência pode se estabelecer com o tempo (Laranja et al.

2006).

Atualmente, as atividades educativas, fiscalizações nas casas e o

comprometimento da população com a eliminação de criadouros, têm sido

importante métodos de controle, pois a aplicação e nebulização dos inseticidas têm

sido feita apenas em epidemias devido seus efeitos deletérios ao homem e ao

ambiente, e o surgimento de indivíduos resistentes, já mencionados (Macoris et al.

1995; Queiroz et al. 1999; Gubler 2002; Taiul 2001; Lima et al. 2006).

Mecanismos de ação de inseticidas

Mecanismo de ação refere-se ao processo bioquímico pelo qual uma molécula

de inseticida interage com o seu alvo, causando alterações em processos fisiológicos

normais do inseto, que se expressam na forma de toxicidade e inabilidade de

sobrevivência (Eto 1990). Os inseticidas podem ser classificados quanto à finalidade,

como: adulticida, larvicida e ovicida, e as vias de contato podem ser oral, inalatória

ou contato direto.

Os grupos de inseticidas mais utilizados no controle de A. aegypti agem em

diferentes alvos do sistema nervoso central, levando a disfunções na transmissão dos

impulsos nervosos, paralisia e morte (Martins et al. 2009). Os Ops e carbamatos

agem inibindo a ação da Acetilcolinesterase (AchE), que por sua vez, possui um

papel fundamental no sistema nervoso, degradando o neurotransmissor Acetilcolina

após os impulsos nervosos. Com essa inibição da AchE, os impulsos não cessam e

levam o inseto a paralisia e morte (Corbett 1992).

Os PYs e dicloro-difenil-tricloroetano afetam o sistema nervoso central do

inseto. Apresentam afinidade com as subunidades do canal de sódio voltagem-

dependente das membranas dos neurônios, aparentemente, mantendo-o abertos e

assim produzindo descargas repetitivas causando paralisia e, eventualmente, a morte

(Ware 2000).

Resistência dos vetores a inseticidas

A resistência é definida pelo Comitê de Peritos em Inseticidas da OMS como

“a habilidade de uma população de insetos tolerarem uma dose de inseticida que, em

condições normais, causaria sua morte”. Apesar da descoberta, desenvolvimento e

utilização de vários métodos alternativos para o controle de A. aegypti, tais como

vigilância, redução de criadouros, controle biológico, armadilhas, repelentes e

educação nas escolas, os inseticidas químicos continuam sendo um importante

instrumento dos programas integrados de controle. Nesse sentido, o monitoramento e

o manejo da resistência de A. aegypti se traduzem como uma ferramenta importante

para o controle vetorial (Rose 2001). O uso continuado de inseticidas, tanto na

agricultura e pecuária quanto na área da Saúde Pública, gerou o aparecimento de

populações resistentes e ocasionou problemas para o controle de vetores. A

resistência a inseticidas é um processo dinâmico e dependente de uma série de

fatores externos como a concentração, frequência e tempo que os inseticidas são

aplicados, dependendo também de características propícias apresentadas pelo vetor,

tais como o ciclo de vida curto e prole abundante (Hemingway 2000). A resistência

tem sido detectada para todas as classes e grupos de inseticidas causando a re-

emergência de muitas doenças transmitidas por vetores (Brogdon & McAllister

1998). Segundo a WHO (1992). Essa resistência tem aumentado em países da Ásia,

Caribe e Américas Central e do Sul. Muitos mecanismos de resistência são ainda

pouco conhecidos e podem ocorrer de diferentes formas em um mesmo organismo

(Guirado & Bicudo 2009).

A resistência é baseada na variabilidade genética de populações naturais de

mosquitos. Desse modo, alguns artrópodes podem apresentar uma proporção de

indivíduos que possuam alelos que confiram resistência a um determinado produto

químico. As cepas resistentes surgem como resultado do uso contínuo de inseticidas

que eliminam indivíduos com alelos susceptíveis. Todavia, alguns insetos que

apresentam alelos resistentes são aptos a resistir e sobrevivem às doses aplicadas, não

sendo eliminados. Assim, nas próximas gerações, a proporção de indivíduos que

apresentem alelos resistentes aumentará na população. O inseticida não é responsável

pela mudança genética, mas seu uso contínuo seleciona indivíduos resistentes. Por

outras palavras, a evolução de resistência a inseticidas é simplesmente uma

conseqüência da seleção natural, sendo o inseticida o agente de seleção (Ferrari

1996; Saavedra-Rodriguez et al. 1997; Guedes & Fragoso 2000).

A primeira informação sobre o surgimento e desenvolvimento da resistência

de A. aegypti aos Ops foi reportada em 1950 em uma população originária do Caribe

(Lima et al. 2006). No Brasil essa resistência aos larvicidas temefós e ao adulticida

malathion foi documentada por Macoris et al. (1995) e depois por Beserra et al.

(2007) e Montella et al. (2007).

A resistência de insetos aos inseticidas pode originar-se a partir de três

diferentes mecanismos, que podem atuar independentemente ou simultaneamente e

conferir resistência a vários inseticidas: a) redução da penetração do inseticida,

devido a alterações na cutícula do inseto, b) resistência metabólica devido a super-

expressão de enzimas desintoxicantes como Esterases, Glutationa S-transferases

(GSTs) e monoxigenases, e c) modificação do sítio alvo do inseticida, que ocorre

devido a alterações na seqüência de DNA que codifica a molécula alvo do inseticida

de tal forma que esta não mais interage com o inseticida no sistema nervoso central

do inseto (Hemingway et al. 2004; Ferrari 1996). Além desses mecanismos, estudos

revelam outro tipo de resistência chamada resistência comportamental, através da

qual os insetos evitam o contato com locais que contenham a substância tóxica

(Lockwood et al. 1985).

1.4.1 Resistência por redução na taxa de penetração do inseticida

Comparado a outros mecanismos, a redução na taxa de penetração do

inseticida é considerado de importância secundária por conferir pouca resistência ao

inseto. Este mecanismo é bastante estudado em Musca domestica (Insecta: Diptera),

e pode, em combinação com outros mecanismos, aumentar a resistência. Acredita-se

que a composição protéica do integumento está relacionada à redução da taxa de

penetração (Oppenoorth 1985).

1.4.2 Resistência Metabólica

A resistência metabólica aumenta a capacidade de metabolização do

inseticida e leva à formação de produtos menos tóxicos. As alterações no

metabolismo podem ocorrer de diversas formas como, por exemplo, tornando as

enzimas já existentes mais eficazes na degradação dos inseticidas ou nos mecanismos

reguladores que aumentam a produção de enzimas já disponíveis em insetos

suscetíveis (Brogdon et al. 1998; Ferrari et al. 1996). As enzimas que geralmente

estão envolvidas no metabolismo de compostos químicos estranhos podem ser

divididas em enzimas de Fase I, que são as Monooxigenases e Esterases, e as

enzimas de Fase II que é o caso das glutationas- S-transferases.

1.4.3 Resistência por alteração no sítio alvo

A resistência no sítio alvo refere-se às alterações no sítio que o inseticida se

liga que impossibilitam, de alguma forma, que a ligação do inseticida ocorra ou que a

afinidade de ligação seja diminuída. Neste tipo de resistência inclui-se: 1) a

insensibilidade da Acetilcolinesterase (AchE), sítio alvo dos organofosforados e

carbamatos, 2) a mutação no receptor neurotransmissor γ-aminobutírico (GABA),

sítio alvo de inseticidas ciclodienos, e 3) polimorfismos no gene do canal de sódio

(NAᵥ) sítio alvo do dicloro-difenil-tricloroetano e piretroides, como o adulticida

deltametrina (Hemingway et al. 2004).

AchE desempenha um papel importante no sistema nervoso, catalisando e

hidrolisando a acetilcolina e encerrando os impulsos nervosos. Os Ops agem inibindo

a atividade da AchE por ligação covalente de fosforilação ou carbamilação (Corbett

1974), e com isso, os impulsos nervosos não são encerrados e o inseto sofre

convulsões e paralisia, seguida de morte.

1.4.4 Canal de sódio voltagem-dependente

Os canais de sódio voltagem-dependente (NAv) são proteínas

transmembrânicas responsáveis por gerar o potencial de ação inicial em células

excitadas (Catterall 2000). O processo em operação correta do NAᵥ é essencial para a

propagação dos impulsos nervosos do inseto (Martins & Valle 2012). Os canais de

sódio compreendem quatro domínios homólogos (I, II, III e IV) sendo cada domínio

composto por seis segmentos (S-1 a S-6) (Figura 4). Em atividade normal, os

potenciais de ação são gerados através da membrana e a informação elétrica é

distribuída por todo sistema nervoso. O potencial de ação se inicia com a

despolarização da membrana, que do lado interno alcança um estado positivo

promovendo a ativação. Quando ativada, a membrana se torna despolarizada e o NAᵥ

se abre liberando um fluxo de sódio. Após um milissegundo a membrana circundante

atinge o equilíbrio de sódio e o canal é desativado. Neste estado, o poro ainda se

encontra aberto, mas o fluxo de íons para dentro da célula é interrompido.

Milissegundos depois ocorrem a inativação e bloqueio da passagem de íons através

da membrana. Todo esse processo ocorre em consonância com outros canais de

bombeamento como os canais de potássio que restauram o potencial elétrico da

célula (Vais et al. 2000; Catterall et al. 2005; Randall et al. 2008).

Os PYs agem modificando a cinética de propagação do canal de sódio,

prolongando ou impedindo o fechamento normal do mesmo após a transmissão dos

impulsos nervosos. Ocorrem repetitivas descargas motoras, hiperexcitabilidade e

perda da postura locomotora (efeito knockdown) causando paralisia e morte do inseto

(Hemingway et al. 2004). Segundo O´Reilly et al. (2006) o DDT e piretroides

interagem com uma longa e estreita cavidade delimitada entre IIS4-S5 e os IIS5 e

IIIS6, acessível aos inseticidas lipofílicos e esses compostos apresentam maior

afinidade pelo NAv aberto.

Figura 4. Topologia transmembranosa do Canal de sódio voltagem

dependente. A subunidade α formadora do poro consiste numa cadeia polipepitídica

simples formada por quatro domínios internos homólogos (I-IV), cada um possuindo

seis hélices transmembranosas (S1-S6). Os domínios se arranjam para formas um

poro central, aquoso revestido pelas hélices S5 e S6 e seus “linkers” (P-loops). As

hélices S1-S4 são responsáveis pela parte sensível à voltagem do canal e se arranjam

de modo a formar quatro domínios independentes (VSD) (Adaptado de Davies et al.

2007).

1.4.5 O efeito Knockdown e o fenótipo kdr

Os PYs possuem um rápido efeito nos insetos, conhecido como ‘knockdown,

caracterizado por paralisia seguida de morte. O uso abusivo deste grupo de

inseticidas levou ao surgimento de populações de A. aegypti resistentes a esse efeito.

Os insetos expostos ao composto passaram a apresentar paralisia momentânea

seguida de uma completa recuperação motora. Esse fenótipo recebeu o nome de

knockdown resistance (kdr) (Martinez- Torres et al. 1998). A mutação kdr ocorre

devido a mudança no sítio alvo dos piretroides, no caso o NAᵥ, que diminui a

afinidade entre o inseticida e o seu local de ligação, causado por simples ou múltiplo

substituições no gene do NAᵥ, se expressa em homozigose recessiva.

Uma pressão exercida pelo uso contínuo do DDT no passado ajudou no

rápido surgimento e expansão do fenótipo kdr em várias espécies de artrópodes,

quando os piretroides foram introduzidos, caracterizando uma resistência cruzada

entre inseticidas (Hemingway & Ranson 2000). A resistência kdr diminui de 10 a 20

vezes a sensibilidade ao inseticida. Algumas espécies exibem até 100 vezes mais

resistência a piretroides, sendo esse fenótipo conhecido como super-kdr. Kdr e

super-kdr atuam como alelos recessivos, portanto, podem aparecer em níveis baixos

na população em indivíduos heterozigotos (AaAa) (Davies et al. 2007).

Vários estudos relataram a afinidade dos PYs ao NAᵥ e o fenótipo kdr em

várias espécies. Documentada pela primeira vez em Musca domestica por Busvine

(1951), Tsukamoto et al. (1965) realizaram experimentos que evidenciaram a

existência do fenótipo kdr em outras espécies de moscas que apresentaram

resistência ao inseticida DDT e conferia resistência cruzada a piretroides (Soderlund

2008). O mesmo fenômeno foi também documentado em outros insetos (Liu et al.

2000; Soderlund & Knipple 2003), incluindo Anopheles spp e A. aegypti (Severson

et al. 1997).

14.6 A mutação kdr

A primeira mutação identificada como responsável pelo fenótipo kdr foi a

substituição de uma Leucina por uma Fenilalanina (Leu1014Phe) no NAᵥ no

segmento IIS6 de Musca domestica (Busvine 1951). Em Anopheles gambiae foi

encontrada mutação no mesmo sítio (1014) ocorrendo uma substituição de Leucina

por Serina (Leu1014Ser) registrado em algumas regiões africanas descrito por Pinto

et al. (2006). A interação entre o inseticida e o NAᵥ pode ocorrer em qualquer um dos

domínios, e de acordo com O’Relly et al. (2006), essa ligação ocorre com mais

freqüência no domínio II. O fenótipo super-kdr foi descrito primeiro em M.

domestica por Williuamson et al. (1996) e em seguida em Haematobia irritans por

Guerrero (1997). No caso deste fenótipo, mais de uma mutação foi encontrada em

uma mesma espécie que apresentava resistência a PYs.No caso das últimas espécies

citadas, as mutações encontradas foram as substituições Leu1014Phe e Met918Thr

nos segmento IIS4-S5.

Até o momento não foram descritas mutações no sítio 1014 em A. aegypti,

mas em outros insetos como Ver. Gambiae e Culex 32u. Outras mutações, no

entanto, já foram descritas em A. aegypti entre as regiões IIS5-IIS6 (Gly923Val,

Leu982Trp, Ile1011Met, Ile1011Val, Val1016Ile, e Val1016Gly). Duas outras

mutações em posições diferentes têm sido encontradas com bastante freqüência em

populações de A. aegypti resistentes a PYs no Sudeste da Ásia e na América Latina:

no sítio 1016 a substituição de uma Valina por uma Isoleucina (Val1016Ile) (Tabela

2) (Brengues et al. 2003; Saavedra-Rodriguez et al. 2007; Rajatileka et al. 2008;

Martins et al. 200a,b) e no sítio 1534, a substituição de Fenilalanina por uma

Cisteína (Phe1534Cys) (Harris et al. 2010; Yanola et al. 2010)(Tabela 2).

Baseado em estudos sobre a detecção das substituições no gene que codifica o

canal de sódio, desenvolvidos por vários autores ao longo dos anos, a tabela 2

representa as mutações descritas em A. aegypti associadas à resistência a piretroides.

Tabela 2: Mutações descritas em A. aegypti associadas à redução da sensibilidade a

piretroides.

Posições na

cadeia

polipeptídica

Substituições Referência

923 Glicina→Valina (G923V)

Brengues et al. 2003

952 Valina→Isoleucina (V952I)


961 Histidina→Lisina (H961K)


982 Leucina→Triptofano (L982W)


1011 Isoleucina→Metionina

(I1011M)

Brengues et al.

2003/Lima et al. 2011

1011 Isoleucina→Valina (I1011V)


1011 Valina→Metionina (V1011M) Saavedra-Rodriguez

et al. 2007

1016 Valina→Glicina (V1016G)


1016 Valina→Isoleucina (V1016I) Saavedra-Rodriguez

et al.2007

1534 Fenilalanina→Cisteina

(F1534C)

Yanola et al.

2010,2011/Harris et

al.2010

1794 Ac. Aspártico→Tirosina

(D1794Y

Cheng et al. 2009

2. JUSTIFICATIVA

O controle de A. aegypti no Brasil tem sido intenso, fazendo uso de métodos de

eliminação mecânica dos criadouros e os movimentos educativos junto à sociedade,

integrados ao controle do vetor. Apesar dos diversos métodos de controle disponíveis, o

uso dos inseticidas químicos continua sendo a principal arma nessa luta (Becnell et al.

1996), uma vez que não existe vacina ou mesmo drogas antivirais específicas (Gubler

1989).

Os inseticidas destacam-se como as únicas ferramentas utilizadas em situações de

emergência, como surtos e epidemias da doença, principalmente pelo método de UBV.

O uso contínuo desses inseticidas tanto na agricultura e pecuária como na área da Saúde

Pública, que data de mais de 50 anos para organofosforados e aproximadamente 20 anos

para piretroides, provocou o surgimento de populações resistentes devido à pressão

seletiva (Lima et al. 2003). Esta resistência aos compostos químicos dificulta o controle

de A. aegypti favorecendo com isso a transmissão de arboviroses, dentre elas a dengue,

que tem se destacado no cenário regional e nacional em notificações de casos (Macoris

et al. 1999; Campos & Andrade 2001; Carvalho et al. 2004).

A oportunidade de estudar o impacto de um grupo de inseticida sobre

populações de A. aegypti de uma determinada região pode ajudar a entender o

desenvolvimento da resistência dentro das populações do local e também contribuir na

escolha de novos produtos que sejam efetivos no controle do vetor (Macoris et al.

2007). Os bioensaios com larvas e adultos para detecção da suscetibilidade ou

resistência de indivíduos em uma população de insetos permitem a seleção de produtos

eficazes para as campanhas de controle de vetores (OMS 1976).

O frequente monitoramento da resistência através dos ensaios moleculares se

torna essencial para os programas de controle de vetores, pois a detecção de mutações

associadas à resistência, ou seja, de genes de resistência presentes em populações

naturais, auxilia, por exemplo, na observação da distribuição dos polimorfismos dentro

da população e os níveis do mesmo que levam à inutilização do inseticida. Desse modo,

é possível otimizar o uso de inseticidas de forma adequada/racional, permitindo definir

um esquema de rotatividade entre inseticidas, bem como o momento exato de realizar a

introdução de novos agentes de controle, sem que ocorram falhas nestas ações. Assim, a

vigilância de mutações determinantes de resistência, fornece subsídios para escolha de

estratégias de manejo e um controle mais efetivo do vetor (Carvalho et al. 2004;

Macoris 2011), no sentido de otimizar a eficácia dos programas de controle e proteção

à saúde humana e ao meio ambiente.

No estado de Goiás, os inseticidas são usados como uma das principais medidas

de controle da dengue. No entanto, não existem dados sobre a tolerância do A. aegypti a

esses compostos, nem sobre a variabilidade genética de populações de mosquitos em

genes determinantes de resistência. O conhecimento dessas propriedades é uma

ferramenta fundamental em termos de saúde da população humana, pois fornece dados

baseados em evidências que permitem orientar as políticas públicas de controle da

dengue.

Nesse sentido, a hipótese colocada neste estudo foi de que, à semelhança do que

ocorre em outras áreas geográficas, as populações de mosquitos A. aegypti de Goiânia

são resistentes ao larvicida temefós e ao adulticida deltametrina, o inseticida

oficialmente utilizado no seu controle, e que essas populações são portadoras de

polimorfismos genéticos que auxiliam na resistência.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os parâmetros fenotípicos e genotípicos envolvidos na resistência

de populações de A. aegypti de três bairros de Goiânia, Goiás, ao

organofosforado temefós e ao piretroide deltametrina. * os parâmetros

genotípicos não está ligado ao temefós.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar a frequência e densidade vetorial nos três bairros avaliados em

Goiânia: Vila Finsocial, Sudoeste e Jardim América

Determinar a susceptibilidade de larvas de A. aegypti ao larvicida

temefós

Determinar a susceptibilidade de adultos de A. aegypti à deltametrina

Verificar a presença e frequência de mutações no gene do canal de sódio

em A. aegypti em dois sítios (Val1016Ile, Phe1534Cys) nas três

populações de campo

4. MÉTODOS

4.1. Área de estudo

Foram analisadas populações de Aedes aegypti provenientes de três bairros da

cidade de Goiânia, estado de Goiás, Centro-Oeste brasileiro. Goiânia possui cerca de

1.302.001 de habitantes e uma área total Km2 de 732,8 (IBGE 2010). Os bairros foram

divididos em quadrantes para definição de pontos de amostragem e as armadilhas foram

instaladas em 20 quadras de cada bairro. Os bairros escolhidos foram: Vila Finsocial,

Jardim América e Sudoeste, representando as regiões Noroeste, Sudoeste e Sul da

capital (Figura 5), os mesmo foram escolhidos com ajuda da Secretaria Municipal de

Saúde – Goiás (SMS-GO) por representarem bairros com alto índice de casos de dengue

na cidade. Os dados de cada bairro, como altitude, número total de moradores e casos de

dengue registrados até a trigésima semana epidemiológica do ano de 2013, estão

representados na tabela 3.

Tabela 3. Relação dos bairros pesquisados, altitude, população estimada em 2010, e

casos de dengue registrados até a 30ª semana de 2013.

Bairros Altitude População

Estimada/2010

Casos de Dengue

até a 30ª SE* de

2013

Vila Finsocial

776 m 18876 734

St. Sudoeste

824 m 15135 666

Jardim América

851 m 43383 1552

*SE – Semana Epidemiológica

Figura 5. Mapa da cidade de Goiânia, GO, mostrando os bairros Vila Finsocial,

Sudoeste e Jardim América onde as armadilhas de oviposição foram instaladas entre

Março e Abril de 2013.

4.1.2. Coleta de ovos para produção da colônia

Amostras de três populações de A. aegypti foram capturadas no peridomicílio de

residências de três bairros na cidade de Goiânia-GO com o uso de armadilhas de

oviposição, conhecida como Ovitrampas (Figura 6). As ovitrampas foram padronizadas

de acordo com as normas do ‘Centers for Disease Control and Prevention’(CDC),

desenvolvidas originalmente por Fay & Eliason (1966), um método sensível e

econômico que permite determinar a dispersão geográfica, densidade, freqüência,

ocupação, dominância e sazonalidade. Apesar da ovitrampa, não permite quantificar o

número de fêmeas que utilizaram essas armadilhas para oviposição (Juliano et al. 2002;

Glasser e Gomes 2000; Passos et al. 2003). A ovitrampa possibilita o cálculo de dois

tipos de índice (Nunes et al. 2011):

Índice de Positividade de Ovitrampa: Percentagem de armadilha positiva.

Nº de armadilhas positivas

IPO: x 100

Nº de armadilhas examinadas

- Índice de Densidade de Ovos: Número médio de ovos por armadilha positiva

Número de ovos

IDO:

Nº de armadilhas positivas

Figura 6. Ovitrampas instaladas no peridomicílios das residências.

4.1.3 Instalações das armadilhas e coletas dos ovos (Informar aqui neste

tópico os critérios para seleção dos bairros junto a secretária municipal de saúde).

As coletas foram realizadas com ajuda dos técnicos da SES-GO, no período de

três semanas, entre abril e maio de 2013. Para obter uma amostra populacional do

mosquito que fosse representativa, utilizou-se para captura dos ovos, 20 armadilhas de

oviposição em cada bairro, uma em cada peridomicílio. As ovitrampas consistem em

vasos pretos, com capacidade para 500 ml, e um compensado de madeira (3 × 15 cm)

do tipo eucatex/duratex, chamada popularmente de palheta, que apresenta uma das

superfícies rugosa e outra lisa. A palheta é fixada ao vaso com um clip, ficando a

superfície rugosa voltada para cima, exposta, para a postura dos ovos Fay & Eliason

(1966). De acordo com as normas da Rede Nacional de Monitoramento de Resistência

de A. aegypti a inseticidas (MoReNAa) as palhetas devem ser lavadas dois dias antes do

seu uso; o procedimento de lavagem consiste em colocá-las na água por 48 hs com troca

de água regular.

Um terço da palheta permaneceu imerso em água, para garantir de umidade

adequada para a oviposição. Dentro do vaso misturou-se 100 ml de infusão de

gramínea/feno (Panicuns maximus), que serve como atrativo para as fêmeas de A.

aegypti (Reiter et al. 1991; Santos et al. 2003) e mais 300 ml de água da rede pública. A

preparação da infusão seguiu as normas da MoReNAa, e para cada 1L de água era

adicionado 8,3g de feno. A fermentação da infusão ocorreu, em média, em sete dias e

estava então pronta para uso. A infusão foi usada a 30% nas armadilhas e utilizada por

um período não superior a quatro semanas após sua preparação, pois seu efeito de

atração é reduzido após esse tempo.

Cada bairro foi dividido em quadrantes e as armadilhas foram distribuídas por

quadra. Cada armadilha foi colocada separadamente, uma em cada residência na parte

externa do domicílio. As palhetas foram substituídas semanalmente, durante três

semanas, totalizando 180 palhetas recolhidas. As palhetas recolhidas foram

acondicionadas em sacos plásticos individuais e levadas para a SMS-GO para separação

das palhetas positivas, ou seja, com presença de ovos. Em seguida, as palhetas positivas

foram transportadas para o Laboratório de Entomologia do Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública-UFG (ITSP), onde foi realizada a identificação e contagem

dos ovos, com o auxílio de lupa, para verificação do Índice de Positividade das Palhetas

(IPO) que traduz a distribuição espacial da infestação em uma localidade investigada.

4.2 Manutenção das colônias de Aedes aegypti

As palhetas com ovos, retiradas do recipiente de oviposição foram colocadas em

um recipiente contendo 2,5L de água desclorada, em temperatura ambiente, para

eclosão das larvas. Após eclosão, as larvas L1 foram transferidas para uma bacia telada

contendo 1L de água desclorada e 1g de ração para gato (Friskies; Purina, Camaquã/RS)

triturada em gral e pistilo e coada em tela fina. A ração era adicionada em quantidade e

periodicidade de acordo com que era julgado necessário, até as larvas alcançarem o

estágio de pupa, quando eram então, transferidas com auxílio de uma pipeta 41ubseqü

de plástico para copos descartáveis de plástico com capacidade para 50 ml, contendo

água limpa. Os recipientes foram colocados dentro de uma gaiola entomológica para

emergência dos adultos. Após a emergência, os adultos foram transferidos para outra

gaiola com o auxílio de um aspirador entomológico de sucção bucal para identificação

das espécies e diferenciação do sexo.

Os adultos foram separados em nove gaiolas e identificadas de acordo com os

bairros. Os adultos foram alimentados com solução de glicose a 10% envolvida em

algodão hidrofílico dentro de frascos Erlenmeyers de 50 mL. As fêmeas foram também

alimentadas com sangue de camundongos BALB/c uma vez por semana, já que a

hematofagia é essencial para garantir a oviposição. A alimentação das fêmeas de A.

aegypti foi realizada conforme metodologia estabelecida por Lima et al. (2009), que

estabelece a relação máxima de 40 fêmeas por camundongo, o método de anestesia dos

camundongos, e o tempo de exposição dos camundongos nas gaiolas. A metodologia

descrita por Lima et al. (2009) está de acordo com os princípios éticos na

experimentação animal, e o presente estudo foi executado com aprovação da Comissão

de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Goiás- UFG,

protocolado sob o Nº 031/13 (Anexo 1). Para oviposição das fêmeas e obtenção dos

ovos para estocagem, utilizou-se um copo escuro em cada gaiola entomológica, para

melhor atração das fêmeas. O interior do copo foi revestido com papel-filtro e

continham aproximadamente 40 ml de água. Os copos foram colocados nas gaiolas três

dias após a hematofagia das fêmeas (Silva et al. 1998; Paixão 2007). Cada copo foi

etiquetado com as seguintes informações: data de colocação na gaiola, população de

origem e número de geração.

Após oviposição, os papeis filtro foram secos por evaporação natural em

ambiente, e em seguida os mesmos foram colocados em sacos de papel identificados e

datados. As cartelas de ovos foram estocadas em média 45 dias e então destinadas aos

ensaios conduzidos no Instituto de Biologia do Exército – Laboratório de Fisiologia e

Controle de Artrópodes Vetores (LAFICAVE), Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil.

4.2.1 Origem dos mosquitos da colônia de Rockfeller

Todos os procedimentos realizados no laboratório LAFICAVE foram feitos com

a cepa Rockefeller (ROCK) de A. aegypti suscetível a inseticida, que não teve contato

anterior com compostos químicos e por isso não apresenta resistência a nenhum deles.

A colônia e os ovos de ROCK são mantidos pelo LAFICAVE há anos e foram doados

pelo mesmo para criação de larvas e adultos utilizados nos bioensaios do presente

estudo.

4.3. Bioensaio Dose-Resposta com temefós sobre larvas de Aedes aegypti

4.3.1 Ensaios biológicos com temefós

O temefós é um inseticida organofosforado utilizado no controle de larvas de

insetos, e recomendado pela OMS para uso em água potável; fórmula é C16H20O6P2S3.

Este inseticida foi usado nos bioensaios para avaliação da suscetibilidade das larvas. O

temefós é comercializado em pó, e é mantido entre 4º a 10ºC no LAFICAVE. A

solução é preparada mensalmente de uma concentração de 3000mg/L diluído em etanol

PA (“para análise”). E armazenada na mesma temperatura. Todos os bioensaios

seguiram o modelo recomendado pela WHO (1981).

4.3.2 Produção das larvas para os bioensaios

Para o teste de susceptibilidade das larvas de A. aegypti ao organofosforado

temefós, utilizou-se larvas em estádio L3. Tanto larvas da cepa ROCK quanto larvas

oriundas de ovos coletados na cidade de Goiânia foram testadas no presente estudo.

Para sincronização da idade das larvas usadas no ensaio, os ovos foram colocados em

um copo plástico contendo 50 ml de água da criação em temperatura ambiente para

eclosão das larvas L1. A água da criação é aquela já utilizada para desenvolvimento de

larvas e manutenção da criação de A. aegypti. Após uma hora, as larvas L1 foram

transferido para uma bacia retangular (33 x 24 x 8 cm), identificada, contendo 1L de

água desclorada e 1g de ração triturada. As larvas L3 foram retiradas após 3 ou 4 dias,

para realização dos bioensaios.

4.3.2 Preparação do bioensaio

Foi realizado o bioensaio Dose Resposta (DR), um ensaio quantitativo que tem

como objetivo observar a mortalidade e a sobrevivência de larvas expostas a diferentes

concentrações de inseticida. Para cada concentração testada utilizou-se quatro réplicas,

constituída cada uma por grupo de 20 larvas L3 em 20 mL de água desclorada. Após a

transferência das larvas para copos com capacidade para 50 mL, estes foram deixados

em repouso por 30 minutos para certificar que todas as larvas permaneciam vivas.

Um pré-teste foi realizado com o objetivo de obter uma dose que promovesse

mortalidade de 10% das larvas tratadas (CL10); Quatro doses que promovessem

mortalidade em torno de 50% (CL50), e uma que causasse mortalidade próxima a 99%

(CL99). Foram tratadas larvas provenientes das três populações da cidade de Goiânia,

com nove concentrações diferentes (0,0045; 0,009; 0,0135; 0,0180; 0,0225; 0,0270;

0,0315; 0,0360; 0,0405 ppm). A solução estoque utilizadas nos bioensaios foi de 9

mg/L. para definição da dose que seria usada nos ensaios. As concentrações usadas no

bioensaio DR foram às mesmas utilizadas no pré-teste. Foram utilizados para este

bioensaio copos descartáveis com capacidade máxima de 200 mL, identificados de

acordo com as concentrações testadas. Em cada copo foram adicionados 80 mL de água

filtrada. Em seguida 500 µL dessa água foram retirados de cada copo para adição do

etanol. A solução de temefós foi adicionada aos copos de acordo com cada

concentração, que variou entre 100 µL e 500 µL. Com ajuda de um biovortex a solução

de cada copo foi agitada por aproximadamente 1 min. Após 15 a 30 minutos foram

adicionados 20 mL de água contendo as larvas. Ao fim do ensaio todos os copos

continham um volume de 100 mL. Os copos do grupo controle continham apenas 100

mL de água e 500µL de etanol (Figura 7).

A leitura dos resultados dos ensaios foi feita 24h após a exposição das larvas.

Larvas moribundas, incapazes de atingir a superfície da água e que apresentavam

tremores e/ou rigidez, foram consideradas mortas (WHO 1981). Todos os testes foram

realizados em paralelo com a colônia ROCK, utilizada como parâmetro para o controle

de qualidade. Larvas provenientes de cada uma das três populações estudadas, assim

como a cepa sensível, ROCK, passaram por quatro ensaios em dias diferentes. As larvas

sobreviventes foram retidas em uma peneira e maceradas antes de serem descartadas.

Temefós

µl

Etanol µl Água

ml

0 50 80

100 400 80

150 350 80

200 300 80

250 250 80

350 150 80

400 100 80

450 50 80

500 0 80

Figura 7. Esquema de um Bioensaio Dose-Resposta com temefós, com nove

concentrações diferentes e o controle. Para cada concentração testada e também para o

controle, 4 réplicas foram utilizadas. Cada réplica, representada na figura por cada copo

de plástico, continha 20 larvas e, portanto, 80 larvas no total foram expostas a cada

concentração.

4.4 Bioensaios com papeis impregnados com deltametrina

O objetivo deste ensaio biológico foi medir os níveis de resistência dos adultos,

de população de campo, a diferentes concentrações de deltametrina, inseticidas da

classe dos piretroides. As populações de campo foram testadas em paralelo com a cepa

padrão ROCK, fornecida pelo LAFICAVE.

Controle

Expostos

4.4.1. Preparo da solução e impregnação dos papeis

A deltametrina (Sigma) utilizada no teste foi armazenada no LAFICAVE em

temperatura abaixo de 0ºC. Soluções do inseticida foram preparadas diluindo a

deltametrina em óleo de silicone Dow Cornig 556 seguindo as recomendações da WHO,

(1998). As concentrações utilizadas no ensaio foram calculadas de acordo com a área do

papel 1MM Whatman (WHO, 1998) que foi anteriormente impregnado (12 x 14 cm).

As concentrações da solução foram: 2,5 mg/m2, 5 mg/m

2, 15 mg/m

2, 30 mg/m

2, 40

mg/m2, 50 mg/m

2, 75 mg/m

2, 100 mg/m

2 e 125 mg/m

2.

Os papéis filtro foram identificados de acordo com as concentrações usadas e

impregnados 48 h antes do uso. Para cada concentração utilizou-se três réplicas e um

papel reserva. Todos os papéis foram impregnados 48 h antes do uso, para garantir a

impregnação e a secagem. Os papéis controle foram impregnados com 3,36 mL de

silicone.

Para distribuição homogênea da solução com inseticida ou do silicone nos

papeis, a adição foi feita sobre um suporte específico fabricado no próprio LAFICAVE

e com auxílio de uma pipeta multicanal (12 canais) graduada em 5µL.

4.4.2 Mosquitos usados no bioensaio

Apenas mosquitos fêmeas, 3 a 5 dias após emergidos, não alimentadas com

sangue, foram utilizados nos ensaios com papéis impregnados com deltametrina. Tanto

os mosquitos da cepa ROCK, quanto àqueles provenientes da geração F1das populações

de campo foram avaliadas neste ensaio.

4.4.3 Realização dos bioensaios com papeis impregnados com deltametrina

Os ensaios com papeis impregnados seguiram as normas estipuladas pela OMS

(WHO, 1981). As fêmeas foram expostas ao inseticida deltametrina em tubos

cilíndricos de plástico contendo em seu interior papeis impregnados com o mesmo. O

bioensaio com adultos foi conduzido com nove diferentes concentrações de

deltametrina, já mencionadas.

Fêmeas e machos foram separados com auxílio de um sugador entomológico e

as fêmeas foram acomodadas em gaiolas separadas dos machos. Para cada concentração

utilizou-se três réplicas, cada uma com 20 fêmeas, ou seja, 60 fêmeas foram utilizadas

para cada concentração testada. Em cada ensaio nove concentrações de deltametrina

foram testadas e um controle com duas réplicas, assim, um total de 540 fêmeas foram

utilizadas em cada ensaio e 40 fêmeas foram utilizadas nos tubos controle.

O kit da OMS foi montado antes do ensaio. Os tubos, com indicação azul, são

tubos sem papel impregnado com inseticida, chamados de tubos de descanso, e os tubos

com marcações vermelhas são aqueles contendo papel impregnado com inseticida. Para

cada concentração de inseticida, seis tubos foram separados, três com marcações

vermelhas e três com marcações azuis. Os tubos foram etiquetados de acordo com a

concentração testada e a origem dos mosquitos, inclusive os tubos controles.

As fêmeas foram colocadas em grupos de 20 nos tubos de descanso Figura 11

(A). Em seguida foram transferidas quase que simultaneamente para os respectivos

tubos contendo inseticida (B); assim, as fêmeas de todos os grupos de tratamento

ficaram expostas pelo mesmo período de tempo (1h). Após uma hora, as fêmeas foram

transferidas novamente para os tubos de descanso (C) e foi realizada a primeira

avaliação, com quantificação de indivíduos mortos ou vivos. Em seguida, os tubos de

descanso foram desconectados do tubo impregnado e algodões contendo água açucarada

a 10% foram deixados na parte superior dos tubos para alimentação das fêmeas

sobreviventes (D) (Figura 8). A última avaliação foi realizada 24 horas após o início do

teste para observação da mortalidade e knowdown resistance (kdr) (Brogdon &

Mcallister 1998ª; da-Cunha et al. 2005).

Figura 08: A) Transferência das fêmeas para o tubo descanso (sem papel

impregnado) com auxílio de aspirador entomológico; B) Transferência das fêmeas do

tubo descanso para o tubo com papel impregnado; C) mosquitos expostos no tubo com

papel impregnado por um período de 1h para a primeira avaliação de mortalidade; D)

Após a primeira avaliação os mosquitos foram novamente transferidos para o tubo

descanso, e água açucarada (glicose 10%) foi oferecida em algodão hidrófilo

umedecido. As fêmeas permanecem neste tubo por 24h para realização da segunda

avaliação de mortalidade (Adaptada de WHO 1981).

4.5 Análises dos resultados

O resultado dos bioensaios DR com temefós e deltametrina foram organizados

em planilhas de Excel e em seguida submetidos a análises onde as doses efetivas (CL50,

CL90 e CL99) foram calculadas com o auxílio do software Polo-PC análise Probit

(Raymond 1985).

A razão de resistência (RR) como indicador quantitativo foi avaliada de acordo

com Mazzari & Georghiou (1995) e Campos & Andrade (2003) (Tabela4).

Tabela 4: Valores de RR para avaliações de resistência a inseticidas.

Classificação Razão de

Resistência

Tolerante RR<3

Baixa

resistência

RR > 3 e <

5

Resistência

moderada

RR > 5 E <

10

Média

resistência

RR > 10 <

20

Altamente

resistente

RR > 20

A RR foi calculada para as concentrações letais que eliminavam 50 e 95% (CL50

e CL95) da população testada com a cepa de referência Rock.

Fórmula: CL50 população de campo

CL50 Rock

4.6 Amostras para extração de DNA

Para análises moleculares, foram utilizados 30 machos de A. aegypti, escolhidos

por conveniência, provenientes dos ovos coletados de cada uma das três regiões de

Goiânia (Vila Finsocial, Sudoeste e Jardim América) investigadas no presente estudo,

totalizando 90 machos da geração F0. Os mosquitos foram mantidos em grupos de 10

em microtubos de 1,5 mL contendo álcool 80%, por um mês a -20 °C, para posterior

extração de DNA (Figura 09).

Figura 09: Machos de Aedes aegypti mantidos em álcool 80% e congelados a -

20 °C, para extração de DNA.

4.6.1 Extração de DNA

Antes do início da extração, os machos foram lavados com água Milli-Q e secos

em papel toalha. A extração de DNA seguiu o protocolo descrito por Martins, et al.

(2007), com solução TNES (50 mM Tris, pH 7,5; 400 mM NaCl; 20 mM EDTA; 0,5%

SDS). No entanto, foram feitas algumas adaptações ao método, citadas logo abaixo. Os

espécimes foram macerados por 10 segundos, com auxílio de um bioprocessador

manual, em microtubos de 1,5 mL contendo 25 µL de solução de TNES. Após

maceração, 475 µL de solução TNES foram acrescentados aos microtubos. Esta etapa

foi realizada em banho de gelo. Em seguida, adicionou-se 3 µL de proteinase K

(20mg/mL), e o tubo foi agitado em vortex. As amostras foram incubadas em banho

49ubse a 55ºC por 3h e depois colocadas sobre gelo. Em seguida, 200 µL de NaCl 5M

foram adicionados em cada amostra e as mesmas foram agitadas em vortex por 20

segundos e centrifugadas por 6 min a 13.800 rpm. O sobrenadante de cada amostra foi

transferido cuidadosamente para novo microtubo, e adicionado à 600 µL de

isopropanol 100%. As amostras foram novamente centrifugadas por 6 min a 13.800 rpm

e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 600 µL de etanol 70% e as amostras foram

centrifugadas por 6 min a 13.800 rpm. O sobrenadante foi descartado e as amostras

foram secas em estufa a 55°C, por 10 min. 30 µL de TE (10 mM de Tris, 1 mM de

EDTA, pH 8) foram adicionados às amostras, e estas foram deixadas sob refrigeração

para ressuspender no dia seguinte. Não houve o passo envolvendo a adição de RNAse

como sugerido por Martins et al. (2007). Alguns passos da extração estão representados

na Figura 10.

Figura 10: Extração de DNA. A) Microtubos identificados e machos separados e secos

em papel; B) mosquitos transferidos para o microtubo para maceração; C) maceração

dos mosquitos com auxílio de bioprocessador manual e pistilo individual; D) incubação

por 3h em banho-maria a 55ºC.

4.7 Genotipagem por PCR alelo-específica no sítio Phe1534Cys do gene de

canal de sódio de Aedes aegypti (AaNav) .

Foi utilizada a técnica PCR alelo-específica (AS-PCR) pelo método de curva de

dissociação, para os sítio 1534 AaNav, para avaliação da freqüência de mutação no gene

codificador do canal de sódio.

Os ensaios moleculares foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular

do Instituto Oswaldo Cruz – RJ (LBM- IOC) Fiocruz, RJ. Para pesquisa do sítio 1534,

utilizou-se um primer comum para ambos os alelos (Ver), um primer específico para o

alelo selvagem (Phe) e outro para o alelo mutante (Cys). Foi adicionado um GC no final

da cauda da exterminada 5’ de tamanhos diferentes destes iniciadores para que os

produtos pudessem ser distinguidos pela sua temperatura, numa análise de curva de

Melting (Germer et al. 1996, Wang et al. 2005, Saavedra-Rodriguez et al. 2007),

OLHAR SE É 2007 OU 2008 avaliando a dissociação da dupla fita de DNA com o

aumento da temperatura (Nascimento et al. 2013), no qual cada genótipo possui uma

temperatura específica: no caso do genótipo Phe a Tm deve ser entre 75 a 80ºC, o

genótipo Cys deve ser entre 81,5ºC a 83,5C, para o sítio 1534. As sequências dos

primers estão representadas na tabela 5 (Linss et al. 2014).

A genotipagem para o sítio 1534 foi realizada utilizando DNA genômico de 30

machos, escolhidos por conveniência, da geração F0 de cada uma das três populações

de campo, totalizando 90 amostras. Seguindo o protocolo de Saavedra-Rodriguez, et. al.

(2009), utilizando o Go Taq Kit (Promega®

), com o sistema de fluorescência de SYBR

Green. O mix foi preparado com volumes referentes a 100 reações, contendo 500µL de

SYBR, 0,24 µL de cada um dos primers usados (Ver, Phe e Cyskdr

), e 328,0 µL de H2O.

Em microplacas de 96 poços, foi adicionado a cada poço 1 µL da amostra de DNA e

mais 9 µL do mix preparado, totalizando um volume final de 10 µL.

A desnaturação, anelamento e extensão foram respectivamente em 94º/30’’,

62ºC/1’, e 72ºC/ 45’’, em 31 ciclos. Os resultados foram analisados 2,5 hs depois

através da análise do produto amplificado por curva de dissociação para detecção de

polimorfismos na sequencia-alvo.

4.7.1 Genotipagem molecular por PCR no sítio Val1016Ile do gene de canal

de sódio de Aedes aegypti (AaNav)

Para o sítio 1016 foi utilizado o método de PCR convencional (Step One Plus)

usando os mesmos DNA genômicos dos 30 machos de cada população de campo de A.

aegypti utilizados para pesquisa do sítio 1534. As reações de PCR foram realizadas

usando o kit GoTaq (Promega®

) contendo os primers específicos e primer comum para

ambos. O mix foi preparado com 0.5 µl de DNA genômico em 12.0 µl de reação e 0.24

µl do primers comum, 0.12 µl de cada um dos primers específicos (For, Val e Ilekdr

). As

condições de desnaturação, anelamento e extensão foram, respectivamente, 94 º C /

30’’, 62 º C / 1 ‘e 72? C / 45’’, em 30 de ciclos (Martins et al. 2009).

A verificação da amplificação do gene kdr foi realizada em gel de poliacrilamida

a 30% usando como corante o Brometo de Etídio e como marcador de peso molecular

Ultra Low Ranger (Anexo III).

Tabela 5. Sequencias dos primers.

Primers Sequencia (5’ – 3’) Referência

1016Val+

(for) ACAAATTGTTTCCCACCCGCACCGG Saavedra-Rodriguez

et al. 2007; Martins

et al. 2009.

1016Ilekdr

(for) ACAAATTGTTTCCACCCGCACTGA

1016 comum (ver) GGATGAACCGAAATTGGACAAAAGC

1534 Phe+ (for) TCTACTTTGTGTTCTTCATCATATT Yanola et al. 2011

1534 Cyskdr

(for) TCTACTTTGTGTTCTTCATCATGTG

1534 comum (ver) TCTGCTCGTTGAAGTTGTCGAT

4.7.2 Cálculo para frequências genotípicas e alélicas

Frequência genotípica [ƒ (x)] refere-se a proporções dos diferentes genótipos

(AA, Aa ou aa) em uma determinada população.

Ƒ(x) = número d indivíduos com genótipo x

número total de indivíduos

Frequência alélica [ƒ (y)] é a proporção de ocorrência de diferentes alelos (A ou

a) de um determinado gene observado em uma determinada população.

Ƒ (A) = 2 × nº de indivíduos com genótipo AA + nº de indivíduos com genótipo Aa

2 x nº total de indivíduos

ƒ(a) = 2 × nº de indivíduos com genótipo aa + nº de indivíduos com genótipo Aa

2 x nº total de indivíduo

5. RESULTADOS

Dados bioecológicos: dados referentes às coletas realizadas nos bairros estudados,

quantidade de armadilhas instaladas e recolhidas, armadilhas que apresentaram Índice

de Positividade (IPO), Índice de Densidade de Ovos (IDO), presença de vetores nas

regiões estudadas, a relação dessa porcentagem com o índice de casos notificados nestes

bairros de acordo com os dados fornecidos pela Secretaria Estadual de Saúde (SES-

GO).

5.1 Dados Bioecológicos

Em cada um dos três bairros analisados (Vila Finsocial, Sudoeste e Jardim

América) da cidade de Goiânia- GO, 20 armadilhas foram instaladas, por um período de

três semanas, com coletas semanais nos períodos de 19/04 a 10/05.

Deste total, 121 palhetas (67%), apresentaram positividade, ou seja, presença de

ovos férteis. Foram contados 7400 ovos, utilizando a lupa. Os ovos julgados inférteis

não foram contabilizados. As palhetas positivas foram colocadas em bacias com água

para eclosão das larvas. A porcentagem de eclosão variou entre 64% a 75,5%, sendo

satisfatória para obtenção da colônia e geração F1 de todas as populações de campo de

A. aegypti (Tabela 6).

O total de ovos contados de cada palheta positiva permite calcular a densidade

de fêmeas grávidas no local através do Índice de Positividade das Palhetas (IPO). Os

bairros Vila Finsocial e Sudoeste apresentaram um IPO de 78,3% e 70%,

respectivamente, enquanto que Jardim América apresentou taxa de positividade de 53%

(tabela 6). Todas as populações apresentaram uma razão sexual esperada de 1:1.

Tabela 6. Dados bioecológicos de populações de A. aegypti provenientes da cidade de

Goiânia utilizadas para obtenção da colônia de mosquitos.

Bairros Região Total de

ovitrampas

instaladas

IPO* Tempo de

armazenamento

Total

de

ovos

%

eclosão

Vila

Finsocial

Noroeste

60

47

(78,3%)

3 a 5 dias

2.703

64,8%

Sudoeste

Sudoeste

60

42

(70%)

3 a 5 dias

2.436

75,5%

Jardim

América

Sul

60

32

(53,3%)

3 a 5 dias

2.261

64%

*IPO- Índice de Positividade das Palhetas

Avaliação de suscetibilidade de larvas e adultos de A. aegypti a inseticidas: trata dos

resultados referentes à resistência das populações de mosquitos de campo expostas ao

temefós e a deltametrina, comparado aos resultados apresentados pela cepa sensível

(Rockefeller). Apresenta Concentração Letal que eliminou 50 e 95% (CL50 e CL95)

tanto da população de campo quanto da cepa Rock. Em seguida apresentam-se os dados

referentes à Razão de Resistência (RR50 e RR95) relativa a mosquitos adultos,

resultantes dos bioensaios realizados.

5.2 Avaliação da suscetibilidade da população de A. aegypti a temefós e

deltametrina

As Concentrações Letais (CL50 e CL95) que eliminaram 50 e 95% de indivíduos

da população de campo foram comparadas com os valores encontrados com a cepa de

referência Rock para avaliação da RR50 e RR95 (Tabela 7 e 8) e são apresentadas em

detalhe nos Anexos 2), tanto para os ensaios realizados com larvas quanto para os

ensaios realizados com adultos de A. aegypti.

Foram efetuados testes para determinar a Razão de Resistência (RR) dos grupos

de larvas ao temefós e adultos à deltametrina. Segundo Campos & Andrade (2003) uma

população pode ser considerada tolerante se a RR < 3; de baixa resistência se a RR > 3 e

< 5; de moderada resistência se a RR > 5 e < 10; de média resistência se a RR > 10 e <

20; e altamente resistentes a RR > 20. De acordo com os resultados obtidos neste

estudo, todas as três populações avaliadas (Vila Finsocial, Sudoeste e Jardim América)

apresentaram RR= >5 e <10 (resistência moderada) ao larvicida temefós, mesmo após o

abandono do uso do larvicida na região há oito anos, indicando a presença de muitos

indivíduos resistentes nas populações.

A avaliação dos níveis de tolerância dos mosquitos adultos ao inseticida

deltametrina permitiu identificar elevados níveis de resistência em todas as populações

avaliadas, com RRs variando entre 64,7 e 112,6 (Figura 15). A descrição pormenorizada

dos resultados acima mencionados para o temefós e deltametrina é descrita nas seções

subsequentes.

5.2.1 Temefós

5.2.1.1Vila Finsocial

Em relação aos ensaios realizados com larvicida temefós, a população do bairro

Finsocial apresentou CL50 e CL95 de 0,02095 e 0,04612 ppm, respectivamente,

correspondendo a valores de RR50 e RR95 de 5.1 e 5.3 (Figura 11). Assim, em ambos os

casos o valor de RR foi maior que 3, valor esse indicativo de resistência moderada.

5.2.1.2 Bairro Sudoeste

A população do bairro Sudoeste apresentou valores de CL50 de 0, 02111 e CL95

de 0,04536 ppm, respectivamente, com RR > 3, RR50 e RR95 de 5.1 e 5.3 a temefós,

como mostrados na figura 11.

5.2.1.3 Jardim América

Os resultados apresentados pela população do Jardim América apresentaram

CL50s de 0,02100 e CL95 0,04852 ppm, respectivamente, e a RR > 3, RR50 e RR95 de 5.1

e 5.3 representados na tabela 7 e figura 11.

Tabela 7. Populações de A. aegypti provenientes de Goiânia-GO e suas respectivas

Concentrações Letais (CL50 e CL95) para temefós.

Populações de A. aegypti CL50 CL95

Rockefeller 0,00407 0,00909

Vila Finsocial 0,02095 0,04612

Sudoeste 0,02111 0,04536

Jardim América 0,02100 0,04852

*CL- Concentração Letal

*RR – Razão de Resistência (CL50 População /CL50 Rock).

Figura 11: Razões de Resistência (RR) de larvas de populações de A. aegyti

provenientes de Goiânia-GO a temefós.

5.2.2 Deltametrina

5.2.2.1 Vila Finsocial

Na tabela 7 estão representados os valores de CL50 e CL95 referentes aos adultos

expostos a deltametrina, que foram de 30,01314 e 238,93066 ppm e correspondentes a

RR50 e RR95 32,5 de 112,6 para a Vila Finsocial (Figura 12). Em comparação com os

resultados apresentados das outras populações testadas, o bairro Vila Finsocial

apresentou a população com maior valor em relação a RR à deltametrina.

5.2.2.2 Bairro Sudoeste

Na tabela estão representados os valores referentes a CL50 e CL95 utilizadas no

ensaios com deltametrina com adultos que foram 33,5611 e 238,93066, correspondentes

a RR50 de 36,4 e RR95 de 64,7, que em comparação com as outras populações

apresentou a menor valor em relação a RRs a deltametrina.

5.2.2.3 Jardim América

Em relação aos ensaios realizados com deltametrina as CL50 e CL95 apresentadas

foram de 35, 57806 e 161,10924 com RR50 de 38,5 e RR95 de 75,9 (tabela 8 e figura12).

Tabela 8. Populações de A. aegypti provenientes de Goiânia-GO e suas respectivas

Concentrações Letais (CL50 e CL95) para deltametrina.

Populações de A. aegypti CL50 CL95

Rockefeller 0,92230 2,12119

Vila Finsocial 30,01314 238,93066

Sudoeste 33,5611 137,20129

Jardim América 35,57806 161,10924

*CL- Concentração Letal

*RR – Razão de Resistência (CL50 População/CL50 Rock).

Figura 12: Razões de Resistência (RR) de mosquitos adultos de populações de

A. aegyti provenientes de Goiânia-GO à deltametrina.

Análise de polimorfismos presentes nos sítios 1016 e 1534 do gene kdr: Apresenta os

dados decorrentes do DNA extraído dos 30 indivíduos de cada população e

amplificação do gene kdr para detecção de polimorfismos envolvidos na resistência a

piretroides. Os dados mostram também a freqüência genotípica e alélica dentro de cada

população.

5.3 Análises de polimorfismos genéticos nos sítios 1016 e 1534 do gene kdr

O DNA extraído de 30 mosquitos machos de cada população, totalizando 90

amostras de DNA, pelo método de TNES (adaptado de Martins et al. 2007) foi utilizado

posteriormente na amplificação por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para

genotipagem de cada indivíduo.

Através do uso do PCR em tempo real alelo-específica por método de curva de

dissociação foi realizado a genotipagem do DNA de cada indivíduo das três populações

de A. aegypti para a detecção do polimorfismo Phe1534Cys, ou seja, a substituição de

uma Fenilalanina por uma Cisteína no sítio 1534 e detecção do polimorfismo

Val1016Ile, que ocorre devido a substituição de uma Valina por uma Isoleucina no sítio

1016, através do uso do PCR e revelação em gel de agarose (Anexo 4). Para o sítio

1534, cada indivíduo foi classificado como selvagem homozigoto (genótipo Phe/Phe),

homozigoto mutante (kdr) (genótipo Cys/Cys) ou heterozigoto (genótipo Phe/Cys)

(Anexo 3). Para o sítio 1016 foram classificados como indivíduos tipo selvagens

homozigotos aqueles que apresentaram genótipos (Val/Val), homozigotos mutantes

(kdr) (Ile/Ile) e heterozigotos (Val/Ile) (Anexo 3). Para cada reação, um controle

negativo (sem DNA adicionado) foi utilizado nas reações para descartar a possibilidade

de contaminação dos reagentes ou dos materiais utilizados.

5.3.1 Frequências genotípicas e alélicas no códon 1534

A freqüência genotípica e alélica para o códon 1534 foi calculada para cada

população analisada (tabela 9). O alelo mutante que confere resistência Cys1534Cys foi

encontrado em grande frequência nas três populações de campo testadas. Nas

populações Vila Finsocial e Sudoeste uma freqüência genotípica e alélica de 1,0,

(100%) foi observada. Nas amostras da população do Jardim América, a frequência do

genótipo em homozigose foi de 0,96 (96%) e com freqüência alélica de 0,98 (98%),

sendo a única população que apresentaram indivíduos heterozigotos (Phe/Cys), ainda

que em baixa frequência 0,4 (4%). Nenhuma das populações analisadas apresentou

indivíduos homozigotos selvagens (Phe/Phe).

5.3.2 Frequências genotípicas e alélicas no códon 1016

As frequências genotípica e alélica para o códon 1016 foram calculadas para

cada população analisada e estão representadas na tabela 10. As populações

apresentaram certa heterogeneidade em relação à frequência do alelo mutante (Ile), que

em homozigose (Ile1016Ile) confere resistência. A população da Vila Finsocial mostrou

freqüência genotípica do alelo mutante de 0,23 (23%) e frequência alélica de 0,47

(47%) entre os 30 indivíduos avaliados. Nas amostras da população do setor Sudoeste a

freqüência genotípica do alelo mutante foi de 0,60 (60%) e a freqüência alélica de 0,72

(72%), apresentando a maior porcentagem de indivíduos mutantes das três populações

avaliadas, visto que nas amostras da população do Jardim América a freqüência

genotípica do alelo mutante foi de 0,43 (43%) e freqüência alélica de 0,53 (53%). No

sítio 1016, todas as três populações apresentaram indivíduos heterozigotos e

homozigotos selvagens (Val/Ile e Val/Val) de 0,30 e 0,47 para Vila Finsocial, 0,16 e

0,23 para Sudoeste e 0,37 e 0,20 para Jardim América, respectivamente.

Tabela 9. Frequência genotípica e alélica do códon 1534 do gene kdr de populações provenientes de Goiânia – GO.

__________________Frequência Genotípica_________________Frequência Alélica__

Populações Nº de

amostras

Phe/Phe Phe/Cys Cys/Cys Phe

(S)

Cys

(M)

Vila

Finsocial

28 0 0 1,0 0,00 1,0

Sudoeste 26 0 0 1,0 0,00 1,0

Jardim

América

27 0 0,04 0,96 0,02 0,98

Phe = Fenilalanina; Cys = Cisteína; S: selvagem; M: mutante

Tabela 10. Frequência genotípica e alélica do códon 1016 do gene kdr de populações provenientes de Goiânia – GO.

_____________________Frequência Genotípica____________Frequência Alélica_

Populações Nº de

amostras

Val/Val Val/Ile Ile/Ile Val

(S)

Ile

(M)

Vila

Finsocial

30 0,30

0,47

0,23

0,53

0,47

Sudoeste 30 0,16

0,23

0,60

0,28 0,72

Jardim

América

30 0,37 0,20

0,43

0,47 0,53

*Val=Valina; Ile=Isoleucina; S: selvagem; M: mutante

5.3.3 Agrupamento genotípico nos sítios 1016 e 1534 do AaNav

Os genótipos de mosquitos individuais para ambos os sítios foram calculados

primeiro de forma independente: 1016 Val/Val, Val/Ilekdr

e Ilekdr

/Ilekdr

e 1534 Phe+/

Phe+, Phe

+/Cys

kdr e Cys

kdr / Cys

kdr ¸e foram posteriormente agrupados. Os alelos

encontrados em ambos os sítios foram avaliados e comparados para observação da

ocorrência simultânea dos polimorfismos analisadas no gene kdr de A. aegypti (tabela

11). As freqüências estão representadas separadamente nas tabelas 12,13 e 14.

Tabela 11. Alelos encontrados em ambos os sítios.

Alelos Sigla

Val1016 + + Phe1534

+ S

Val1016+

+ Cys1534kdr

R1

Ile1016kdr

+ Cys1534kdr

R2

Ile1016kdr

+ Phe1534 +

RX

*(kdr

) – alelos mutantes, (+)- alelos selvagens.

Com base na composição destes genótipos, conclui-se que três alelos estavam

presentes nas 90 amostras avaliadas: 1016 Val+ + 1534Phe

+ (S), 1016 Val

+ + 1534

Cyskdr

(R1) e '1016 Ilekdr

+ 1534 Cyskdr

(R2) .

A partir de agora estes alelos serão representados no texto como S, R1 E R2. A

tabela 12 apresenta os dados referentes a população de A. aegypti avaliada no setor Vila

Finsocial. Das 28 amostras, 0,536 dos mosquitos testados apresentaram alelos R1 e

0,464 de indivíduos apresentaram alelos R2, este ultimo representando a presença de

homozigose recessiva nos dois sítios. Nenhum individuo desta população apresentou

alelos selvagens (Val1016+/Phe1534

+) em simultaneidade.

A tabela 13 apresenta os dados referentes à população de A. aegypti avaliada no

setor Sudoeste. Das 28 amostras, 0, 288 dos mosquitos testados apresentaram alelos R1.

Em ralação à polimorfismos presentes nos dois sítios o valor apresentado foi de 0,712.

A população do bairro Sudoeste também não apresentou nenhum individuo com alelos

selvagens (Val1016+/Phe1534

+) em simultaneidade.

Na população de A. aegypti avaliada no setor Jardim América (tabela 14) foram

avaliados o mesmo número de indivíduos, de onde se identificaram 0,482 indivíduos

portadores do alelo R1. Em relação à homozigose recessiva presentes nos dois sítios

avaliados (R2) 0,500 apresentaram polimorfismos simultâneos. Apenas a população de

A. aegypti coletada no setor Jardim América apresentou indivíduos S, mesmo assim, em

pequena na porcentagem de 0, 018, sendo a menos representativa.

Em nenhum caso foi encontrada o polimorfismo 1016kdr

individualmente,

impedindo a existência de um Ilekdr

+ Phe+. A distribuição dos três alelos não diferiu

muito em relação às populações da Vila Finsocial e setor Sudoeste. A população do

bairro Jardim América apresentou diferença significativa em relação a presença dos

alelos R1 e R2 e também pelo fato de ser a única população a apresentar indivíduos com

alelos selvagens. O alelo mais freqüente, em 2 das 3 populações avaliadas, foi o alelo

R2, duplo polimorfismo. .

Tabela 12. Frequências genotípicas e alélicas dos sítios ligados do gene kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro Vila

Finsocial – Goiânia- GO.

Frequências genotípicas dos sítios ligados – 1016 +1534

Val/Val

(S)

Val/Ile Ile/Ile

(M)

Total

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

SS

SR1 R1R1 SRX SR2 R1R2 RXRX RXR2 R2R2

N 0 0 9 0 0 12 0 0 7 28

Freq. 0,000

0,000 0,321 0,000 0,000 0,429 0,000 0,000 0,250

Frequência alélica

S R1 R2

0,0 0,536 0,464

*S:selvagem; M:mutante

Tabela 13. Frequências genotípicas e alélicas dos sítios ligados do gene kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro Sudoeste –

Goiânia- GO.


Val/Val

(S)

Val/Ile Ile/Ile

(M)

Total

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

SS


N 0 0 4 0 0 7 0 0 15 28

Freq. 0,000

0,000 0,154 0,000 0,000 0,269 0,000 0,000 0,577


S R1 R2

0,00 0,288 0,712

*S: selvagem; M: mutante

Tabela 14. Frequências genotípicas e alélicas dos sítios ligados do gene kdr da população de A. aegypti proveniente do bairro Jardim América –

Goiânia- GO.


Val/Val

(S)

Val/Ile Ile/Ile

(M)

Total

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

Phe/Phe

(S)

Phe/Cys Cys/Cys

(M)

SS


N 0 1 10 0 0 6 0 0 11 28

Freq. 0,000

0,036 0,357 0,000 0,000 0,214 0,000 0,000 0,393


S R1 R2

0,18 0,482 0,500

*S: selvagem; M: mutante

No intuito de facilitar a visualização geográfica da distribuição dos alelos no

gene kdr nos códons 1016 e 1534 nos bairros estudados, foram elaborados mapas

mostrando a frequência com que esses alelos estão presentes nas três populações

analisadas em Goiânia-GO (Figuras 13 e 14).

Figura 13: Distribuição da freqüência alélica do polimorfismo Val1016Ile nos três

bairros analisados. Frequência do alelo selvagem (Val1016) representado pela cinza

claro e a freqüência do alelo mutante (Ile1016) representado pela cinza escuro.

Figura 14: Distribuição da freqüência alélica do polimorfismo Phe1534Cys nos três

bairros analisados. Frequência do alelo selvagem (Phe1534) representado pela cinza

claro e a freqüência do alelo mutante (Cys1534) representado pela cor cinza escuro.

6. DISCUSSÃO

6.1 Dados Bioecológicos

A ocorrência de surtos e epidemias de dengue tem se manifestado em grandes

centros urbanos de várias regiões do mundo (Teixeira, 1999) onde a densidade vetorial

está inteiramente ligada a essas ocorrências (Braga & Valle, 2007). Tal se deve ao fato

de que, nos centros urbanos o A. aegypti encontra todos os fatores fundamentais para

sua ocorrência: o humano, o vírus e condições ambientais favoráveis, formando a

estrutura ideal que permite o estabelecimento da cadeia de transmissão da dengue

(Costa & Natal 1998). Desse modo, a vigilância epidemiológica, envolvendo métodos

de avaliação da densidade vetorial, tem sido grande aliada dos serviços de saúde como a

Organização Mundial de Saúde (OMS) e a Organização Pan-Americana de Saúde

(OPAS), no controle desses vetores nos grandes centros urbanos.

O Índice de Positividade (IPO) ou Índice de Densidade de Ovos (IDO) constitui

o mais simples método para revelar o nível que permite apontar o índice de infestação

(Gomes 1998), atividade de postura e a atividade hematofágica das fêmeas do mosquito,

sendo que este último indicador está inteiramente correlacionado coma eficiência de

transmissão do vírus da dengue. As porcentagens elevadas encontradas no trabalho

corroboram com as pesquisas de Gluber (1998), Lagrotta et al. (2008) e Taiul (2001)

que fortalecem a ideia de que as mudanças demográficas dos últimos anos, o

crescimento populacional e a urbanização não planejada auxiliam na produção de novos

criadouros e condições propícias para a proliferação de A. aegypti.

Segundo o censo de 2010, Goiânia possui 1.302.001 habitantes e uma área total

de 732,8 km2

(IBGE) possuindo um cenário demográfico marcado por intenso progresso

de urbanização (Martins 2012). De acordo com informações do Plano Diretor de

Goiânia (2006), a capital cresceu em ritmo acelerado e desordenado, apresentando uma

série de problemas socioambientais, sendo grande parte deles relacionados ao processo

de urbanização. Essa alta densidade populacional foi observada nos bairros pesquisados

(Vila Finsocial: 18876 habitantes, Sudoeste: 15135 habitantes e Jardim América: 43383

habitantes).

O bairro Vila Finsocial apresentou o IPO mais alto, porém, o número

populacional e número de casos de dengue notificados nesta região foram menores em

comparação com os outros bairros, diferindo do trabalho desenvolvido por Barata et al.

(2001), onde foi encontrado o maior número de fêmeas em localidades com alta

concentração populacional. Acredita-se que essa discordância seja devido aos registros

de casos, pois os moradores do bairro Vila Finsocial geralmente realizam as consultas

em unidades de saúde do bairro próximo, no caso, Urias Magalhães.

A porcentagem de coletas que apresentaram resultados positivos para a presença

de ovos de A. aegypti foi expressiva, o que já era esperado devido ao aumento no

número de criadouros favorecido pela ocorrência de chuvas no estado durante os meses

de coleta. A taxa de eclosão das larvas em laboratório foi satisfatória para a obtenção da

colônia, oscilando em 64 e 75,5%. O curto período de armazenamento, que não excedeu

cinco dias após a coleta, pode ser um fator influente nessa taxa, pois segundo Juliano et

al. (2002) o tempo de armazenamento, entre outras condições como a umidade,

temperatura e transporte que afetam a integridade dos ovos e a porcentagem de eclosão

das larvas de A. aegypti.

6.2. Bioensaios com temefós

Populações resistentes a inseticidas podem surgir como resultados de fatores

genéticos e biológicos que são característicos dessas populações, como a freqüência e o

caráter dominante dos genes de resistência, isolamento, proliferação, duração do ciclo

de vida e endogamia. A evolução de populações resistentes também depende da pressão

seletiva sofrida por elas aos compostos utilizados (Brogdon & McAllister 1998),

eliminando indivíduos sensíveis e selecionando os resistentes capazes de transmitir à

sua prole a mesma capacidade (Donalísio & Glasser 2002).

De acordo com Mazzari & Georghiou (1995) e Campos e Andrade (2003)

quanto à classificação das RRs as três populações de A. aegypti avaliadas no presente

estudo, apresentam resistência moderada a temefós (10 > RR > 5). No passado, esse

resultado não seria levado em consideração pelos programas de controle, por se

considerar que não existia um risco significativo de prejuízo aos mesmos. No entanto, a

partir de 2006, em uma reunião do Grupo Técnico Assessor para a Rede Nacional de

Monitoramento de A. aegypti/Plano Nacional Contra a Dengue (MoReNAa/PNCD)

definiu-se que quando os bioensaios resultarem em mortalidade inferior a 70% e RR95

>3, é sugerida a substituição do temefós por algum outro tipo de larvicida e deve

proceder-se a modificações no aspecto operacional do controle do vetor (Reunião

Técnica 2006).

A resistência ao larvicida temefós reportada no presente estudo, corrobora

resultados prévios, apresentados nos estudos de Macoris et al. (1995) e de Montella et

al. (2007), onde havia sido documentado que populações de mosquitos provenientes da

cidade de Goiânia, apresentavam, resistência moderada ao temefós. A resistência ao

temefós foi também já amplamente documentada em amostras de A. aegypti

provenientes de outras regiões do Brasil, tal como na Paraíba (Beserra et al. 2007),

Espírito Santo e Rio de Janeiro (Lima et al. 2003; Braga et al. 2004), Ceará (Lima et al.

2006), Paraná (Duque et al. 2004; Duque 2008) e São Paulo (Campos & Andrade 2001;

Macoris et al. 1999, 2003). Coletivamente, todos os resultados acima descritos

constituem um forte argumento a favor do completo abandono (ainda que temporário)

do temefós como agente larvicida para o controle de A. aegypti no território Brasileiro.

A detecção de mudanças na suscetibilidade ajuda no planejamento e manejo da

resistência do vetor na região em estudo, pois segundo Lima et al. (2006) espera-se que

ocorra uma recuperação na susceptibilidade da espécie alvo a essa classe de inseticida

após um período sem a utilização, o que poderá levar à re-introdução do composto. O

temefós é usado como principal larvicida no país desde 1967 e em Goiânia, o uso do

larvicida durou 18 anos até sua substituição. O impacto causado pelo uso do temefós em

longo prazo resultou na evolução de resistência, presente ainda hoje em todas as

populações do mosquito estudadas, mesmo após oito anos de desuso do mesmo após

sua substituição pelo diflubenzuron em 2004. Tal observação pode sugerir que a

resistência não apresenta um custo ecológico significativo para os mosquitos afetados.

Curiosamente, em um estudo efetuado no Grand Cayman (Harris et al, 2010) verificou-

se uma diminuição significativa no índice de resistência a temefós em apenas dois anos

após o desuso do composto,provavelmente pelo curto período de uso na região e a

menor freqüência de aplicação do inseticida.

Um fato interessante é que as taxas de mortalidade por temefós e as respectivas

RRs são muito próximas entre os três bairros avaliados no presente estudo. Este

nivelamento dos valores em todas as populações corrobora com a hipótese da pressão

seletiva exercida pelo larvicida, advinda das medidas de controle serem uniformemente

aplicadas e em quantidades aproximadas em todos os bairros. Outro fator que poderá

ajudar a explicar esta equivalência é a proximidade dos bairros e inexistência de

barreiras geográficas capazes de impedir o cruzamento entre estas populações. Tal

fenômeno foi documentado por Lima et al. (2006) em sua avaliação de resistência a

temefós em populações de A. aegypti coletados em bairros de Fortaleza- Ceará.

6.3 Bioensaios com deltametrina

O adulticida, denominado Cytion, foi o primeiro inseticida usado no controle de

A. aegypti na região . Os primeiros testes para avaliação da resistência de A. aegypti ao

composto foram realizados por Silva et al. (1996), Silva et. al. (1997), Fernandes &

Silva (1999) e Carvalho e Silva (2000). Logo após a comprovação da resistência do A.

aegypti ao Cytion este passou a ser substituído pela deltametrina, sendo usada até o

presente. Por 20 anos a deltametrina, tem atuado como agente de seleção na região

explicando a expressividade nos resultados da freqüência de alelos mutantes nas três

populações.

Além da baixa mortalidade dos adultos nos bioensaios realizados, o fato

preocupante são os altos níveis de RR nas populações testadas, em sua maioria, acima

de 32, um nível considerado extremamente alto, que compromete as ações do inseticida

contra A. aegypti em Goiânia, causando prejuízos aos programas de controle do vetor.

Os altos valores de RR podem ser explicados pelo longo período de aplicação do

mesmo grupo de inseticida e, além disso, pela quantidade de produtos a base de

piretroides utilizados sem vigilância e controle em aplicações domésticas nos últimos

anos, como reportado no trabalho de Chandrer et al. (1999) a respeito da resistência de

Anopheles gambiae a dois tipos de piretroides. Deste modo, a resistência tende a crescer

mesmo com o uso controlado de piretroides em campanhas de controle, pois a pressão

continuará constante devido ao uso indevido de outras alternativas químicas.

Para populações que apresentam RR desta magnitude, o efeito residual do

piretroide em campo será menor, uma vez que há queda gradual, contribuindo, com

isso, para o aumento no número de mosquitos adultos sobreviventes e com o

conseqüente aumento na ocorrência de surtos e epidemias. Diante das condições de

resistência das populações testadas, coloca-se a necessidade de substituição da

deltametrina por outro adulticida com mecanismo de ação diferente, visando maior

efetividade do programa de controle e a recuperação da susceptibilidade do mosquito ao

produto usado. Além da substituição da deltametrina, sugere-se ainda que se invista em

formas de controle alternativas que possam minimizar ou até mesmo eliminar os riscos

de desenvolvimento de resistência aos produtos químicos usados na região. Essas

medidas podem ser integradas utilizando o controle químico, biológico e mecânico e,

principalmente, a participação da população. Acredita-se também na aplicação de

estratégias de educação ambiental e educação em saúde. É ainda indispensável que haja

investimento no sistema de saneamento básico, coleta de lixo e outras formas de manejo

urbano que minimize o risco representado por criadouros de A. aegypti (Oliveira 1999).

A resistência a inseticidas da classe dos PYs e a disseminação das populações

resistentes de A. aegypti foi relatada em vários estados brasileiros como, no Rio de

Janeiro, (da-Cunha et al. 2005), no Paraná (Luna et al. 2004) em Roraima, Amapá, Pará,

Ceará, Alagoas, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais e Rio Grande

do Sul (Martins et al. 2009). Para outras espécies de vetores de doença, como Anopheles

gambiae, a resistência aos compostos permetrina, deltametrina e DDT é também

bastante frequente (Chandrer et al. 1999).

6.4. Investigação de alterações no gene que codifica o canal de sódio

regulado por voltagem em Aedes aegypti (AaNav)

Os polimorfismos pontuais não sinônimas no gene codificante da molécula alvo

levam à sua insensibilidade a alguns inseticidas (Hemingway et al. 2004). Esses

polimorfismos estão inteiramente relacionadas ao mecanismo de resistência aos PYs e

ao DDT, inseticidas que afetam o sistema nervoso central do inseto, e que apresentam

afinidade com as subunidades do canal de sódio voltagem dependente das membranas

dos neurônios do sítio alvo do inseticida (Brengues et al. 2003; Saavedra-Rodriguez et

al. 2007; Martins et al. 2009ª; Harris et al. 2010; Ynola et al. 2011). Os polimorfismos

que determinam resistência são raras e aparecem depois de uma seleção prolongada, à

medida que os indivíduos susceptíveis vão sendo eliminados e reduzem em proporção.

O grau de dominância do gene de resistência dentro da população influencia no seu

crescimento. Por exemplo, se o alelo que determina resistência for dominante, a

população se recupera mais rápido; em caso contrário (como é o caso dos

polimorfismos pesquisados no presente trabalho) o crescimento é mais demorado

(Brown 1986; Georghiou & Taylor 1977). Os primeiros polimorfismos pontuais na

molécula do canal de sódio associadas à resistência a piretroides foram descritas em

Musca domestica: Leucina→Fenilalanina na posição 1014 (L1014F) e

Metionina→Treonina na posição 918 (M918T) por Busvine, (1951). Em A. aegypti

vários polimorfismos nos exons 19, 20 e 21 no segmento S6 do domínio II já foram

identificados e descritos por em vários estudos. Brengues et al. (2003) descreveu as

substituições Glicina→Valina na posição 923 (G923V), Valina→Isoleucina na posição

952 (V952I), Histina→Lisina na posição 961 (H961L), Leucina→Triptofano na posição

982 (L982W) e Isoleucina→Valina (I1011V). Saavedra-Rodriguez et al. (2007)

identificou dois novos polimorfismos associados a resistência a PYs,

Valina→Metionina na posição 1011 (V1011M) e Valina→Isoleucina (V1016I), Cheng

et al. (2009) descreveu a substituição de Ac. aspártico→Tirosina (D1794Y).

Os dois polimorfismos encontrados na gene do canal de sódio nas populações do

presente estudo equivalem à substituição dos aminoácidos Fenilalanina por uma

Cisteína na posição 1534 (Phe1534Cys) e a substituição de uma Valina por uma

Isoleucina na posição 1016 (Val1016Ile).

6.5 Substituição Phe1534Cys e Val1016Ile

A substituição de um único par de bases muda o códon de TTC para TGC no

domínio III, subunidade 6 no gene kdr de A. aegypti resultando na troca de uma

Fenilalanina por uma Cisteína no sítio 1534. Esse polimorfismo foi documentado

também por Harris et al. (2010) através do uso do método do PCR tetraplex em

populações de Grand Cayman e foi altamente associada aos mosquitos tolerantes ao

DDT e permetrina, sugerindo que a substituição no sítio 1534 confere alta resistência a

piretroides e a DDT em populações de A. aegypti. Resultados similares foram também

descritos por Yanola et al. (2011) em populações da Tailândia conferindo resistência à

permetrina.

A substituição Val1016Ile documentada no presente trabalho já foi reportada na

região de Goiás, mais especificamente em Aparecida de Goiânia, por Martins et al.

(2009) e Linss et al. (2014) corroborando com os resultados encontrados e com a

hipótese de que o polimorfismo está relacionado com a resistência a PYs e é bastante

frequente na região. O polimorfismo Val1016Ile também já foi amplamente

documentada em amostras de A. aegypti provenientes de outras regiões do Brasil e do

mundo, tal como no Grand Cayman (Harris et al. 2010), em populações da América

Latina (Saavedra- Rodriguez 2007 e 2008) e populações brasileiras, tal como São Paulo,

Goiás, Roraima, Amapá, Pará, Ceará, Alagoas, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Rio

de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul e Nova Iguaçu

(Garcia et al. 2009; Martins et al. 2009a; Martins et al. 2009b; Batista, 2012).

Em relação ao agrupamento genotípicos dos sítios, existem pelo menos, sete

polimorfismos diferentes descritos no AaNav, mas apenas as posições 1016 e 1534 estão

claramente relacionados à resistência, onde os polimorfismos são encontrados em um

domínio do canal de sódio que interage diretamente com a molécula de piretroide (Du et

al. 2013). A ocorrência desses polimorfismos em simultâneo pode modular os níveis de

resistência a piretroides (Linss et al. 2014).

A dupla substituição Val1016Ile e

Phe1534Cys foi descrita recentemente em A. aegypti de 30 populações brasileiras (Linss

et al. 2014), corroborando com os resultados encontrados no presente trabalho onde a

ocorrência dos polimorfismos juntos foi encontrada em todas as populações avaliadas.

O controle de mosquitos adultos de A. aegypti em Goiânia é realizado pela SES-

GO desde 1993 até os dias atuais, utilizando deltametrina - PYs. Deste modo, os

piretroides têm atuado como agente de seleção na região por 20 anos, o que poderá

explicar as elevadas freqüências de alelos mutantes nas três populações, pois os

polimorfismos têm tendência a aumentar de freqüência se a pressão de seleção for

constante (Martins & Valle 2009), podendo eventualmente atingir a fixação.

Os graus de resistência encontrados para os dois inseticidas, a freqüência

expressiva de alelos mutantes dentro das três populações ajudam a explicar a ineficácia

das medidas de controle, resultando no aumento de casos de dengue em Goiânia. Os

resultados do presente estudo evidenciam a importância e a necessidade de implantar o

monitoramento de resistência de A. aegypti aos inseticidas utilizados no controle do

vetor na cidade. A percepção da mudança temporal da susceptibilidade dos vetores e a

elucidação da distribuição real dos polimorfismos podem auxiliar no manejo de

resistência e nas estratégias a serem adotadas garantindo a eficácia do programa de

controle no estado de Goiás.

Por tanto, monitorar a presença e evolução desses polimorfismos é

imprescindível para que o uso dos piretroides e o controle do vetor sejam eficientes.

7 CONCLUSÕES

* As populações de A. aegypti de Goiânia são ainda resistentes ao

organofosforado temefós, impossibilitando o retorno do larvicida como medida de

controle do vetor na região.

* A deltametrina representa uma medida de controle ineficaz para o controle do

vetor em Goiânia-GO, com um subjacente desperdício de recursos.

* A resistência a deltametrina foi compatível com a elevada frequência de

polimorfismos encontrados no gene kdr das populações avaliadas.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8804403

ANEXO 2

1 . Resultados dos Bioensaios Dose-Resposta.

Tabela 1. Bioensaio Dose – Resposta realizado com larvas da população Vila

Finsocial proveniente da cidade de Goiânia-GO

Tabela 2. Bioensaio Dose – Resposta realizado com larvas da população Sudoeste

proveniente da cidade de Goiânia-GO

Tabela 2. Bioensaio Dose – Resposta realizado com larvas da população Jardim

América proveniente da cidade de Goiânia-GO

Anexo 2 – Genotipagem dos polimorfismos (Phe1534Cys e Val1016Ile).

Tabela 1. Genotipagem do gene kdr (Phe1534Cys) em Aedes aegypti provenientes

da população Vila Finsocial da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013.

População

avaliada

Código Sexo Genótipo Fenótipo

Vila Finsocial FS1 Macho

Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante

Vila Finsocial FS21 Macho Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante


Cys/Cys Mutante

*Cys/Cys- homozigoto mutante- Phe/Phe- homozigoto selvagem- Phe/Cys –

Heterozigoto.


da população Sudoeste da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013.

População

avaliada


Sudoeste S1 Macho Cys/Cys

Mutante

Sudoeste S2 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S3 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S4 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S5 Macho Cys/Cys Mutante

Sudoeste S6 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S7 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S8 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S9 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S10 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S11 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S12 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S13 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S14 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S15 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S16 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S17 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S18 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S19 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S20 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S21 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S22 Macho

Cys/Cys Resistente

Sudoeste S23 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S24 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S25 Macho

Cys/Cys Mutante

Sudoeste S26 Macho

Cys/Cys Mutante


Heterozigoto.


da população Jardim América da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013.

População

avaliada


Jardim

América

JA1 Macho Cys/Cys

Mutante

Jardim

América

JA2 Macho Cys/Cys Mutante

Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim JA9 Macho Cys/Cys Mutante

América

Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América

JA27 Macho Phe/Cys Heterozigoto


Heterozigoto.

Tabela 4. Genotipagem do gene kdr (Val1016Ile) em Aedes aegypti provenientes da

população Vila Finsocial da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013

População

avaliada

Código Sexo Genótipo Fenótipo Gel

Vila

Finsocial

FS1 Macho Ile/Ile Mutante Gel 5-8

Vila

Finsocial


Vila

Finsocial

FS3 Macho Val/Ile Heterozigoto Gel 5-10

Vila

Finsocial

FS4 Macho Val/Val Selvagem Gel 5-11

Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial

FS21 Macho Ile/Ile Mutante Gel 6-

Vila

Finsocial

FS22 Macho Val/Ile Heterozigoto Gel 6-

Vila

Finsocial

FS23 Macho Val/Val Selvagem Gel 6-

Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial


Vila

Finsocial

F29 Macho Val/Val Selvagem Gel 7-6

Vila

Finsocial

F30 Macho Ile/Ile Mutante Gel 7-7

*Ile/Ile- homozigoto mutante- Val/Val- homozigoto selvagem- Val/Ile –

heterozigoto.


população Sudoeste da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013

População

avaliada


Sudoeste S1 Macho Ile/Ile Mutante Gel 1-1

Sudoeste S2 Macho

Ile/Ile Mutante Gel 1-2

Sudoeste S3 Macho


Sudoeste S4 Macho

Val/Val Selvagem Gel 1-4

Sudoeste S5 Macho


Sudoeste S6 Macho

Val/Ile Heterozigoto Gel 1-6

Sudoeste S7 Macho


Sudoeste S8 Macho


Sudoeste S9 Macho


Sudoeste S10 Macho


Sudoeste S11 Macho


Sudoeste S12 Macho


Sudoeste S13 Macho


Sudoeste S14 Macho


Sudoeste S15 Macho


Sudoeste S16 Macho


Sudoeste S17 Macho


Sudoeste S18 Macho


Sudoeste S19 Macho


Sudoeste S20 Macho


Sudoeste S21 Macho



Sudoeste S23 Macho


Sudoeste S24 Macho


Sudoeste S25 Macho


Sudoeste S26 Macho


Sudoeste S27 Macho Val/Ile Heterozigoto Gel 2-13

Sudoeste S28 Macho Val/Ile Heterozigoto Gel 2-15


Sudoeste S30 Macho Val/Ile Gel 3-2


heterozigoto.


população Jardim América da cidade de Goiânia – GO, coletados em 2013

População

avaliada


Jardim

América

JA1 Macho Ile/Ile Mutante Gel 3-4

Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América

JA4 Macho Val/Val Selvagem Gel 3-7

Jardim

América

JA5 Macho Val/Ile Heterozigoto Gel 3-8

Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim JA23 Macho Val/Val Selvagem Gel 4-13

América

Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América


Jardim

América



heterozigoto.

Anexo 3. Géis resultantes do PCR referente a pesquisa da mutação Val1016Ile.

Gel 1

Gel 2

Gel 3

Gel 4

Gel 5

Gel 6

Gel 7

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