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Universidade Federal de Goiás

Faculdade de Farmácia

WEULLER FILHO DE MORAES

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO EXTRATO ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA CASCA DO CAULE DE Pterodon

emarginatus VOG. (SUCUPIRA)

Goiânia

2007

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ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO

EXTRATO ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA CASCA DO CAULE DE Pterodon

emarginatus VOG. (SUCUPIRA)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal de Goiás, como requisito parcial para a

obtenção do Título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos e

Medicamentos

Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula

Co-Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa

Goiânia 2007

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(GPT/BC/UFG)

Moraes, Weuller Filho. M827e Estudo fitoquímico e avaliação das atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico, frações e substância isolada da casca do caule de Pterodon emarginatus VOG. (Sucupira) / Weuller Filho de Moraes. � 2007. 102 f. : il., figs., tabs., qds. Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula, Co-Orien- tador: Prof. Dr. Elson Alves Costa.

Dissertação (Mestrado) � Universidade Federal de Goiás. Faculdade de Farmácia, 2007.

Bibliografia: f. 86-93. Inclui listas de figuras e quadros, tabelas, abreviaturas e siglas. Inclui apêndices.

1. Plantas medicinais 2. Pterodon emarginatus 3. Fito-

química - Sucupira 4. Lupeol 5. Betulina I. Paula, José

Realino de II. Costa, Elson Alves III. Universidade Federal

de Goiás. Faculdade de Farmácia IV. Titulo. CDU: 615.322:582.999


ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES

ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO EXTRATO

ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA

CASCA DO CAULE DE Pterodon emarginatus VOG.

(SUCUPIRA)

Dissertação defendida no Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção

do título de Mestre, aprovada em 27 de agosto de 2007 pela Banca Examinadora

constituída pelos seguintes professores:

___________________________________________________

Prof. Dr. José Realino de Paula � UFG

Presidente da Banca

___________________________________________________

Profª. Dra. Laila Salmen Espíndola - UnB

___________________________________________________ Profª. Dra. Maria Tereza Freitas Bara - UFG

Aos meus pais, José e Adélia por todo

amor, carinho, amizade, confiança, apoio,

paciência e incentivo

.

AGRADECIMENTOS

• A Deus, pela vida, sabedoria e força que recebi ao longo de mais uma etapa.

• Ao meu orientador, Prof. Dr. José Realino de Paula, e ao meu co-orientador,

Prof. Dr. Elson Alves Costa, por todo o ensinamento, pela confiança, pela

paciência, disposição e amizade que tiveram comigo durante esse período.

• Ao aluno de iniciação científica Marcus Vinícius Silva Mariano, por ter me

ajudado sempre que precisei principalmente na parte experimental, pela sua

amizade, pelas dicas, meu muito obrigado.

• A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas e da Faculdade de Farmácia-UFG, que colaboraram de forma

direta ou indiretamente para o êxito desse trabalho.

• A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia-UFG e de outros Programas de

Pós-Graduação, pela amizade, pelas sugestões e apoio durante todo esse

período.

• Aos alunos de Iniciação Científica e aos técnicos do Laboratório de

Farmacognosia da Faculdade de Farmácia-UFG e do Laboratório de

Farmacologia de Produtos Naturais por todo o suporte necessário para

desenvolver a parte experimental.

• A Profª. Dra. Inês Sabioni Resck do Departamento de Química da

Universidade de Brasília (UnB), pelos espectros de Ressonância Magnética

Nuclear de 1H e de 13C das substâncias isoladas.

• Ao Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição, Profª. MSc. Leonice

Tresvenzol e a Profª. Dra. Maria Teresa Freitas Bara por todas as sugestões,

dicas, amizade e companheirismo que foram muito úteis para o

aperfeiçoamento e concretização desse trabalho.

• Aos animais de laboratório utilizados para a realização do procedimento

experimental necessário para complementar esse trabalho, que sem eles não

seria possível.

• Ao CNPq pela bolsa concedida, à CAPES, FUNAPE/UFG por todo o fomento

e incentivo repassado para a realização desse trabalho.

• A todos os meus amigos, colegas e principalmente à minha Família que

contribuíram direta ou indiretamente para a concretização desse trabalho.

• Em especial, quero agradecer muito a Profª. MSc. Danielle Diniz que me

despertou para esse mundo científico tão fascinante, me apoiou e sempre

que precisei me ajudou com suas dicas que foram imprescindíveis para a

qualidade e a realização desse trabalho. Gostaria de agradecer também a

Profª. Dra. Eliana Martins Lima pelo apoio incondicional que foi dado, pela

confiança e por acreditar nos meus objetivos.

�A vitória sempre foi de quem nunca duvidou dela�.

Raul Follerean

RESUMO

Pterodon emarginatus Vogel, conhecida popularmente como Sucupira Branca, é uma espécie arbórea nativa dos Cerrados Brasileiros, sendo encontrada em Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul. Possui interesse como planta medicinal e fonte de madeira. Vários estudos com o óleo e extratos dos seus frutos demonstraram atividades cercaricida, antimicrobiana e antiinflamatória. Na região Centro-Oeste, a população utiliza o chá das cascas do caule contra inflamações e infecções ginecológicas. Entretanto a maioria dos estudos foram realizados com extratos dos frutos. O objetivo deste trabalho foi realizar o estudo fitoquímico com o intuito de isolar compostos, e avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico, das frações e dos compostos isolados da casca de Pterodon emarginatus Vogel, procurando comprovar cientificamente, o uso medicinal desta planta. O material Botânico foi coletado no município de Bela Vista-GO (847 m de Altitude, 17º 02� 1,1� S / 48º 49� 0,3� W), e uma exscicata foi depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás sob o número UFG � 27155. As cascas foram dessecadas em estufa com circulação forçada de ar a 40°C, em seguida moídas em moinho de facas. O extrato etanólico de sucupira (EES) foi obtido por maceração a frio em etanol, por 72h, do material botânico pulverizado, e concentrado sob pressão reduzida em rotavapor obtendo um rendimento de 30,14% (p/p). O EES foi fracionado por partição com Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila. Através de Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia em Coluna das frações, conseguiu-se isolar duas substâncias: O Lupeol da fração hexânica e a Betulina da fração diclorometano. Ambas as substâncias são triterpenos pertencentes à classe dos Lupanos. As doses utilizadas nos testes farmacológicos foram definidas através do teste geral de atividade cujas doses escolhidas foram (100, 300 e 1000 mg/kg). O modelo de atividade analgésica escolhido foi o da contorção abdominal induzida por ácido acético (1,2% v/v i.p.) onde camundongos tratados previamente com extrato etanólico de sucupira (1000 mg/kg, v.o e s.c.) reduziram o número de contorções acumuladas, após 30 minutos da aplicação do ácido, do valor controle 76,3 ± 7,82 para 48,5 ± 3,5 e 26,6 ± 4,4 respectivamente. A migração celular na peritonite induzida por carragenina (1%, 0,25 mL) foi um dos modelos utlizados para avaliar a atividade antiinflamatória. O número de leucócitos migrados para cavidade intraperitoneal em camundongos previamente tratado com EES (s.c.) nas doses de 100, 300 e 1000 mg/kg foi reduzido de 11,8 ± 1,2 x 106

(controle), para 7,08 ± 1,5 x 106, 6,32 ± 0,61 x 106 e 5,02 ± 0,37 x 106, respectivamente. A redução do número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético pode ser devido a uma ação analgésica e ou antiinflamatória. A atividade antiinflamatória foi também demonstrada na redução da migração leucocitária. Tais resultados podem justificar o uso popular da planta como antiinflamatório.

ABSTRACT

Pterodon emarginatus Vogel, known popularly as sucupira branca, is a native specie widely distributed over Brazilian Savannah, being found in Minas Gerais, São Paulo, Goiás and Mato Grosso do Sul states. It possess interest as medicinal plant and wood source. Some studies with the extract and oil from its fruits had demonstrated cercaricida, antimicrobiana and anti-inflammatory activities. In the center-west Brazil, the population uses the tea of the stem bark for inflammations and gynecological infections. However the majority of the studies had been carried throught with extracts from the fruits. The objective of this work was the phytochemical study with intention to isolate compounds to evaluate the analgesic and anti-inflammatory activities of the crude ethanolic extract, fractions and isolate compounds of the stem bark of Pterodon emarginatus Vogel, being looked for to prove cientificaly, the medicinal use of this plant. The botanical material was collected in Bela Vista, (847 m, 17° 02� 1.1�S / 48° 49� 0.3� W), Goiás, Brazil (September 2003). A voucher specimen (UFG � 27155) was deposited at the Herbarium of the Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiás, Brazil. The ethanolic extract (EES) was obtained from the powdered botanical material by maceration in cold ethanol (95% P.A.) with occasional agitation, for 72 h, followed by filtration, before being concentrated and dried under reduced pressure in a rotary evaporator (yield = 30.14%). The EES was submitted by partitions with hexane, dicloromethane and ethyl acetate. The hexane, dichloromethane and ethyl acetate fractions had been gotten. Through thin layer chromatography and column chromatography of the fractions was isolated two compounds from the fractions: The lupeol from the hexane fraction and the betuline from the dichloromethane fraction. Both compounds are lupanes triterpenes. The doses used in the pharmacological tests, had been defined through the general test of pharmacological activity whose chosen doses were: 100, 300 and 1000 mg/Kg. The chosen model to evaluate the analgesic activity was acetic acid-induced abdominal writhing. Groups of mice were previously trated with the EES (1000 mg/Kg, p.o. and s.c). They had reduced the number of abdominal writhing, after 30 minutes of the application the acetic acid (1.2%, v/v i.p.); in relation to the control value 76.3 ± 7.82 for 48.5 ± 3.5 and 26.6 ± 4.4 respectively. The cellular migration in the carrageenan-induced peritonitis was chosen model to evaluate the anti-inflammatory activity. The number of leukocytes migrated for intraperitoneal socket in mice previously treated with EES (s.c.) in the doses 0.1, 0.3 and 1.0 g/kg was reduced in relation to control value 11.8 ± 1.2 x 106 for 7.08 ± 1.5 x 106, 6.32 ± 0.61 x 106 and 5.02 ± 0.37 x 106 respectively. The reduction of the number of acetic acid-induced abdominal writhing suggests analgesic or anti-inflammatory action. The anti-inflammatory activity also was demonstrated in the reduction of the leukocytes migration. Such results can justify the popular use of this plant as anti-inflammatory.

LISTA DE FIGURAS E QUADROS

Figura 1: Árvore de Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira) no município de Bela Vista � GO. J. R. Paula, setembro de 2006...............................................................23 Figura 2: Esquema resumido dos principais eicosanóides........................................27 Figura 3: Fluxograma do Fracionamento do EES por partição Líquido/Líquido...........................................................................................................37 Figura 4: Fracionamento da Fração Hexânica por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.....................................................................................................38

Figura 5: Fracionamento da Fração Diclorometano por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel...............................................................................................39

Quadro 1: Esquema do isolamento do lupeol da fração hexânica da casca do caule

de P.emarginatus......................................................................................................47

Quadro 2: Esquema do isolamento da betulina da fração diclorometano da casca do

caule de P.emarginatus. ...........................................................................................47

Figura 6: Substâncias isoladas do extrato etanólico da casca do caule de Sucupira.....................................................................................................................48 Figura 7: Espectro de Infravermelho do Lupeol (LP-10)............................................49 Quadro 3: Dados de RMN 1H de LP-10 e a comparação com os dados da literatura.....................................................................................................................50 Figura 8: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LP-10................................51 Quadro 4: Dados de RMN 13C de LP-10 e a comparação com os dados da literatura..................................................................................................................... 52 Figura 9: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) de LP-10................................53 Figura 10: Espectro de Infravermelho da Betulina (BT � 4).......................................56

Quadro 5: Dados de RMN 1H de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura......................................................................................................................57 Figura 11: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de BT- 4...............................58 Quadro 6: Dados de RMN de 13C de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura ....................................................................................................................59 Figura 12: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) de BT- 4................................60

Figura 13: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via p.o. e s.c. com veículo (grupo controle; V), com o extrato etanólico das cascas da P. emarginatus (EES; 1000 mg/Kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/Kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12 animais por grupo experimental...............................................................................................................63 Figura 14: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via s.c. com veículo (V), com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt), 50 mg/kg) ou com indometacina (Indo 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12 animais por grupo experimental...............................................................................................64 Figura 15: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via s.c. com veículo (V), com o Lupeol (Lupeol; 70 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 10 animais por grupo experimental.................................................................................65 Figura 16: Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em camundongos antes e após tratamento com o veículo, com EES (100, 300 ou1000 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg). Nas ordenadas estão representados os tempos dos camundongos ao estímulo térmico nociceptivo expressos em porcentagem relativa ao tempo zero. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± EPM de 6 animais por grupo experimental.................................................................................66 Figura 17: Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V; n = 9), com o EES (1000 mg/kg, n = 8), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM............................................................................................................68 Figura 18: Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15 � 30 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V; n = 7), com o EES (1000 mg/kg, n = 7), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM............................................................................................................69 Figura 19: Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 8 e 6 respectivamente) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM........................................................................71

Figura 20: Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 10), com Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg, n = 8) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM............................................................................................................................72 Figura 21: Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 7 e 7 respectivamente) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM..............................................................................................................73 .

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 � Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle; V), pela via p.o. e s.c. com o extrato etanólico das cascas de P. emarginatus (EES; 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) (II), pela via s.c. com o Lupeol (70 mg/kg) (III) ou com indometacina (Indo;10mg/kg)....................................................................................95 Tabela 2 � Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em camundongos antes e após tratamento por via s.c. com o veículo (V) (I), com EES 100 (II), 300 (III) ou 1000 (IV) mg/kg, ou morfina (V) (10 mg/kg)........................................................................................................................97 Tabela 3 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) (I) e segunda fase (15 � 30 min) (II) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo, com o EES (1000 mg/kg), com morfina (10 mg/kg) ou com indometacina (10 mg/kg)..........................................................................................100 Tabela 4 � Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com o Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg) (II) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg)......................................................................................................................101 Tabela 5 � Migração de leucócitos totais (x 106) no modelo de peritonite induzida por carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg)......................................................................................................................102

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT 5-hidroxitriptamina

5-HPTE 5-hidroperoxiácido

5-LOX 5-Lipoxigenase

AA Ácido araquidônico

AcOEt Acetato de Etila

AINE(S) Antiinflamatório(s) não-esteroidal(is)

ANOVA Análise de variância

BT-4 Betulina

CC Cromatografia em Coluna

CCD Cromatografia em Camada Delgada

COX Cicloxigenase

COX-1 Cicloxigenase-1



d Dubleto

dd Duplo Dubleto

dl Dubleto Largo

DEXA Dexametasona

EES Extrato etanólico da casca do caule de Pterodon emarginatus

EPM Erro padrão da média

FAcOEt Fração acetato de etila

FD Fração diclorometano

FH Fração hexânica

g Grama(s)

Hz Hertz

i.p. Via intraperitoneal

ILs Interleucinas

IL-1 Interleucina 1

IL-2 Interleucina 2

INDO Indometacina

J Constante de acoplamento, em Hertz

Kg Kilograma(s)

LP-10 Lupeol

LT Leucotrieno

LTA4 Leucotrieno A4

LTB4 Leucotrieno B4

LTC4 Leucotrieno C4

LTD4 Leucotrieno D4

LTE4 Leucotrieno E4

m Multipleto

m/v Massa/volume

mg Miligrama(s)

min Minuto(s)

mL Mililitro(s)

mm Milímetro(s)

MHz Megahertz

MOR Morfina

Nº Número

NO Óxido nítrico (nitric oxide)

P.A. Padrão analítico

p.o. Via oral

PBS Solução salina tamponada (Phosphate Buffered Saline)

PG Prostaglandina

PGD2 Prostaglandina D2

PGE2 Prostaglandina E2

PGF2α Prostaglandina F2α

PGG2 Prostaglandina G2

PGI2 Prostaglandina I2

ppm Partes por milhão

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Próton

RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

s Singleto

s.c. Via subcutânea

SNC Sistema nervoso central

TNF-α Fator de necrose tumoral α

UFG Universidade Federal de Goiás

v/v Volume/volume

δ Deslocamento químico (em ppm) µg Micrograma(s) µL Microlitro(s)

SUMÁRIO

RESUMO.....................................................................................................................7

ABSTRACT .................................................................................................................8

LISTA DE FIGURAS E QUADROS .............................................................................9

LISTA DE TABELAS .................................................................................................12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.....................................................................13

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................19

1.1. Os produtos naturais e o estudo fitoquímico .....................................................19

1.2. Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira).............................................................21

1.3. Dor��...............��..........................................24

1.4.Inflamação.................��.��.......26 2. OBJETIVOS..................................................................................................... ......31 2.1. Objetivo Geral......................................................................................................31 2.2. Objetivos Específicos..........................................................................................31 3. MATERIAIS ...........................................................................................................33

3.1. Material Botânico.........��.........33 3.2. Extrato, frações e medicamentos .......................................................................33

3.3. Reagentes utilizados ..........................................................................................33

3.4. ANIMAIS.............................................................................................................34

4. MÉTODOS ............................................................................................................36

4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS..............................................................................36

4.1.1. Preparo do extrato etanólico de Pterodon emarginatus ..................................36

4.1.2. Preparo das Frações e Isolamento de alguns constituintes químicos. ............36

4.1.2.1. Fracionamento da Fração Hexânica (FH).....................................................38 4.1.2.2. Fracionamento da Fração Diclorometano (FD).............................................39 4.1.2.3. Elucidação estrutural das substâncias isoladas............................................40

4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS ......................................................................40

4.2.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas .....................................................40

4.2.2. Avaliação da Atividade Antinociceptiva��.�............41

4.2.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................................41

4.2.2.2. Teste do �tail flick��.�.............�41 4.2.2.3. Dor induzida pela Formalina .....................��............42 4.2.3. Avaliação da Atividade Antiinflamatória............ ��43 4.2.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton..................................................43

4.2.3.2. Peritonite induzida por carragenina...................................................................43

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................44

6. RESULTADOS ......................................................................................................46

6.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS........................................................................46

6.1.1.Extração ...........................................................................................................46

6.1.2. Fracionamento, Isolamento e caracterização dos constituintes químicos.......46 6.1.2.1. Determinação estrutural dos compostos isolados.........................................48 6.1.2.2. Substância LP-10..........................................................................................48 6.1.2.2.1 Dados Espectroscópicos da Substância isolada Lupeol (LP-10)................54 6.1.2.3. Substância BT-4............................................................................................55 6.1.2.3.1 Dados Espectroscópicos da Substância isolada Betulina (BT-4)...............61 7 RESULTADOS FARMACOLÓGICOS....................................................................62

7.1.Teste geral de Atividades Farmacológicas...........................................................62

7.2. Atividade Antinociceptiva.....................................................................................62 7.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético..........................................62

7.2.2. Teste do �tail flick� ..................................................................................................66

7.2.3. Dor induzida pela Formalina ............................................................................67 7.3. Atividade Antiinflamatória��....................................................70 7.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton.....................................................70

7.3.2. Peritonite induzida por carragenina ......................................................................70

8. DISCUSSÃO .........................................................................................................75

9. CONCLUSÕES .....................................................................................................84

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................86

APÊNDICE ............................................................................................................95

Introdução

19

1. INTRODUÇÃO

1.1. Os Produtos naturais e o estudo fitoquímico

Os vegetais fazem parte da vida do homem desde a antiguidade, sendo

usados como fonte de alimentos, habitação, meio restaurador da saúde, na

produção de meios de transporte, dentre outras. Até o século XIX, os recursos

terapêuticos eram constituídos predominantemente por plantas e extratos vegetais

(Simões et al., 2004).

O papel das plantas na medicina é de fundamental importância para toda a

população. Elas fornecem algumas substâncias extremamente úteis, entre essas

substâncias podemos citar, por exemplo os alcalóides da papoula produtora do ópio,

a digoxina da Dedaleira (Digitalis sp) dentre outras. Das plantas também são

retirados compostos que podem apresentar pouca ou nenhuma atividade e ao serem

modificados tornam-se mais eficazes ou menos tóxicos, podendo ainda servir como

protótipos ou modelos para medicamentos sintéticos que tenham atividades

fisiológicas semelhantes às originais (Robbers et al., 1997).

Entretanto, inúmeras plantas que são usadas em preparações fitoterápicas

carecem de um maior controle de qualidade, uma vez que a literatura científica

indica que várias destas podem apresentar composição química variável ou

substâncias tóxicas (Noldin et al., 2003).

A identificação de metabólitos vegetais de interesse terapêutico continua

sendo uma área de grande importância para a saúde humana. Várias moléculas já

foram isoladas e identificadas e algumas dessas apresentaram diferentes atividades

biológicas (Simões et al., 2004).

Atualmente, o principal interesse das pesquisas com produtos naturais, não é

produzir medicamentos melhores do que os que já existem no mercado e sim

fornecer novas alternativas, ampliando a quantidade de substâncias químicas

disponibilizadas. Através do estudo fitoquímico em que é feito o isolamento,

20

purificação e identificação estrutural das substâncias químicas, a quantidade de

informações disponíveis na literatura aumenta, podendo ser utilizadas nesse caso,

para fornecer novos modelos de fármacos para a química farmacêutica, ou após

estudos biológicos, como fonte alternativa em relação às substâncias já existentes

no mercado (Simões et al., 2004).

O Brasil possui a maior diversidade genética vegetal do mundo. Um total

estimado entre 350.000 a 550.00 espécies existem no país, das quais 55.000 são

catalogadas, e apenas 8% dessas espécies vegetais foram estudadas em busca de

compostos bioativos (Simões et al., 2004). Atualmente cerca de 25% dos

medicamentos prescritos no mundo são obtidas direta ou indiretamente de plantas.

Além disso, cerca de 49% dos fármacos desenvolvidas entre 1981 a 2002 foram

obtidas a partir de produtos naturais, ou análogos semi-sintéticos ou ainda

compostos sintéticos baseados em produtos naturais (Koehn e Carter, 2005).

Um estudo fitoquímico abrange várias etapas. A etapa inicial consiste na

definição do material vegetal a ser estudado, qual órgão desse vegetal será utilizado

e a coleta do material. É uma etapa que se deve tomar muito cuidado, evitando

coletar partes do vegetal afetadas com doenças, materiais estranhos e parasitas,

além de anotar a época do ano e o horário de coleta desse material tendo em vista

que a produção de alguns metabólitos podem aumentar ou diminuir dependendo da

época do ano (Simões et al., 2004).

Na etapa de preparo do material vegetal, deve-se atentar as condições ideais

para preservar os metabólitos existentes. Na extração do material vegetal, o

solvente a ser utilizado, também deverá ser escolhido baseado no que irá ser

extraído. Existem várias reações químicas que caracterizam determinados grupos de

metabólitos, essas reações são importantes, pois direcionam o estudo que está

sendo realizado. A etapa de fracionamento, isolamento e purificação de substâncias

é uma etapa fundamental, tendo em vista a diversidade de substâncias químicas

que podem ser encontrados em uma planta. A utilização de diferentes métodos em

conjunto, possibilita uma otimização dessa etapa e da etapa de elucidação estrutural

da substância isolada, assim como da avaliação da existência ou não de atividade

biológica (Simões et al., 2004).

21

Estudos fitoquímicos feitos com diferentes espécies do gênero Pterodon

levaram ao isolamento de vários metabólitos secundários onde alguns deles

demonstraram atividade biológica. Na casca do caule foram identificados alcalóides

(Sabino et al., 1999; Coelho, et al., 2005), na madeira do caule, isoflavonas (Sabino

et al., 1999; Coelho et al., 2005) e triterpenos (Coelho et al., 2005), no óleo dos

frutos, isoflavonas (Coelho et al., 2005) e diterpenos (Sabino et al., 1999; Coelho et

al., 2005). Além disso, vários furanos diterpenos foram encontrados no óleo dos

frutos das espécies P. apparicoi e P. polygalaeflorus (Fascio et al., 1976), assim

como em P. pubescens (Dos Santos, 1972; Fascio et al., 1976), P. polygalaeflorus

(Duarte et al., 1992; Campos et al., 1994; Demuner e Barbosa, 1996; Arriaga et al.,

2000; Belinelo et al., 2002), e P. emarginatus (Mahajan et al. 1972).

Outros tipos de metabólitos secundários também foram isolados. No óleo dos

frutos de P. polygalaeflorus, isolou-se flavonóides (Arriaga et al., 2000; Silva et al.,

2004), já no alburno e no cerne, isoflavonas, os triterpenos lupeol, betulina e o ácido

4-metoxibenzóico (Marques et al., 1998). Isoflavonas foram isoladas da madeira do

caule de P. apparicioi (Galina e Gottlieb, 1974; Almeida e Gottlieb, 1975) e P.

pubescens (Braz Filho et al., 1971).

1.2. Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira)

A Pterodon emarginatus Vogel, conhecida popularmente como Sucupira,

Sucupira-Branca, Sucupira do Cerrado, Sucupira-Lisa, Faveira, Fava de Sucupira,

Fava de Santo Inácio e Bilro (Figura 1), pertence à Família Leguminosae-

Papilionoideae. Esta família compreende cerca de 650 gêneros e 18.000 espécies.

O gênero Pterodon inclui 5 espécies nativas do Brasil: Pterodon abruptus Benth,

Pterodon apparicioi Pedersoli, Pterodon emarginatus Vog, Pterodon pubescens

Benth e Pterodon polygalaeflorus Benth (Carvalho et al., 1999). No Brasil, essa

espécie encontra-se distribuída nos estados da Região Centro-Oeste, além de Minas

Gerais, São Paulo, Maranhão, Piauí e Tocantins. É uma árvore de grande porte,

podendo chegar até 15 metros de altura, a casca é de cor cinza-clara, levemente

áspera, soltando placas. As folhas são alternas, compostas pinadas, imparipinadas e

22

pecioladas. Inflorescência em panícula terminal e nas axilas das folhas superiores,

com cerca de 80 a 200 flores (Almeida et al., 1998).

As flores com aproximadamente 1 cm de comprimento, pediceladas, cálice

petalóide, róseo, com 3 dentes diminutos e 2 maiores, oblongos, ciliados,

semelhante a um vexilo, corola papilionácea, rósea ou lilás, ovário súpero,

unilocular, longo-estipitado, com um só óvulo parietal inserido no meio do lóculo.

Frutos são legumes deiscente com cerca de 5 cm de comprimento, castanho-escuro,

oval a orbicular, plano-compresso, semente única, central, dotada de invólucro

aliforme de endocarpo. Existe uma controvérsia sobre a possível existência de uma

ou duas espécies de sucupira-branca, quando unidas, o nome dado para a espécie

é P. emarginatus. Mas estudos recentes de taxonomia molecular usando RAPD dá

base para manter a divisão tradicional em duas espécies: P. polygalaeflorus Benth

que possui flores de coloração roxa e folhas glabras e P. pubescens Vogel que

possui flores de coloração rosa (Almeida et al., 1998).

No Brasil, extrato alcoólico das sementes de Pterodon emarginatus Vogel são

utilizadas popularmente como antiinflamatório e analgésico (Silva et al., 2004). O

extrato do fruto de P. emarginatus Vogel, exerceu atividade antiinflamatória que foi

mostrada através dos seguintes testes: peritonite induzida por carragenina e edema

de pata induzida por dextrana, histamina, carragenina e nistatina (Carvalho et al.,

1999).

Pterodon polygalaeflorus Benth é usada na medicina popular contra

bronquites, amigdalites e como tônico (Pimenta et al., 2006). O extrato alcoólico da

semente dessa espécie é usado como anti-reumático, antiinflamatório e em

preparações analgésicas (Belinelo et al., 2002). As sementes são também usadas

na forma de infusão alcoólica para o tratamento de infecções; as cascas, que

produzem um óleo volátil e aromático semelhante ao encontrado nos alvéolos das

sementes, são bastante eficientes no tratamento do reumatismo; as túberas

radiculares denominadas de �batata de sucupira� são usadas no tratamento de

diabetes. O óleo dos frutos foi capaz de inibir a penetração na pele humana da

cercária da esquistossomose (Demuner et al., 1996; Lorenzi e Matos, 2002).

23

Figura 1: Árvore de Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira) no município de Bela Vista

- GO. J. R. Paula, setembro de 2006.

24

1.3. Dor

A palavra dor em latim, poena, significa penalidade e reflete portanto, os efeitos

deletérios que pode infligir o corpo. É uma reação do corpo a estímulos nocivos e,

portanto constitui um sistema de alerta precoce e protetor. A natureza da dor é

extremamente subjetiva, sendo formada tanto por componentes sensitivos, quanto

por componentes psicológicos. Como milhões de pessoas sofrem algum tipo de dor,

a cada ano, resultando num gasto de bilhões de dólares para vários tipos de

tratamentos, a dor e suas causas subjacentes é um problema sério de saúde pública

(Craig e Stitzel, 2005).

A dor pode ser classificada como neurogênica, nociceptiva, neuropática ou

psicogênica, quando associada à lesão do tecido neuronal na periferia ou em nível

central, estimulação excessiva dos nociceptores, disfunção/dano de um ou mais

nervo, e a fatores psicológicos, respectivamente (Millan, 1999).

Em termos de duração, a dor pode ser classificada em: dor aguda e dor

crônica. A dor aguda, cuja duração não se estende além do estímulo doloroso

desencadeador, tem três origens geralmente detectadas: superficial, causada por

feridas, agentes químicos irritantes e queimaduras; a de origem somática profunda,

como por exemplo, um infarto, ou a injeção de substâncias irritantes no organismo e,

por último a dor de origem visceral que está relacionada à inflamação. Por outro

lado, a dor crônica se estende além do estímulo doloroso desencadeador que na

maioria das vezes é de origem desconhecida, esse tipo de dor está relacionado a

doenças como câncer e artrite (Craig e Stitzel, 2005).

A nocicepção é a tradução, condução e o processamento central dos sinais

recebidos geralmente por estimulação dos nociceptores. É um processo que quando

ocorre, resulta na percepção consciente da dor. Os estímulos gerados são captados

pelos nociceptores, conduzidos por fibras aferentes, interneurônios e medula

espinhal, chegando ao hipotálamo, córtex cerebral e sistema límbico, onde a dor é

reconhecida, em termos de localização, natureza e intensidade (Rosa e Massone,

2005).

25

Os nociceptores são terminações periféricas de neurônios sensitivos primários

cujos corpos celulares estão localizados nos gânglios da raiz dorsal ou nos gânglios

trigêmeos. Eles são responsáveis pela percepção do estímulo nocivo e estão

amplamente distribuídos no nosso organismo. São distribuídos em três classes

principais: mecanorreceptores, termorreceptores e receptores polimodais (ativados

por estímulos mecânicos, químicos ou térmicos de alta intensidade). Quando

estimulados devidamente, os nociceptores são ativados, gerando potenciais de ação

que se propagam através das fibras nervosas aferentes. A sensibilização dos

nociceptores causa uma redução do seu limiar de ativação e, em alguns casos,

atividade espontânea.

As fibras nervosas são classificadas, de acordo com seu diâmetro, estrutura e

velocidade de condução. A do tipo Aα, possui maior diâmetro, maior velocidade de

condução e fortemente mielinizadas; do tipo Aβ, também com grande diâmetro,

velocidade de condução rápida e também mielinizadas; as fibras do tipo Aδ, com

diâmetro intermediário, velocidade de condução moderada e fracamente

mielinizadas; e as do tipo C com menor diâmetro, velocidade de condução lenta e

não mielinizadas. O potencial de ação é conduzido por estas fibras nervosas até

atingir os tratos espinotalâmicos, espinorreticular e espinomesencefálico,

transmitindo para estas regiões a informação nociceptiva. Após o processamento

central da dor, estes estímulos são retransmitidos para fibras descendentes de

origem cortical ou medular (Grubb, 1998; Carr e Goudas, 1999; Millan, 1999;

Almeida et al., 2004; Djouhri e Lawson, 2004).

A maioria dos estados de dor crônica está associada com aberrações da via

fisiológica normal, dando surgimento ao que chamamos de hiperalgesia que faz com

que ocorra um aumento da resposta geralmente de um estímulo doloroso. A alodinia

é um outro exemplo desse tipo de alteração sensorial (Craig e Stitzel, 2005).

Alguns tipos de receptores opióides µ (mu), κ (kappa) ou δ (delta), encontram-

se distribuídos por todo o cérebro e medula espinhal. Esses receptores são

membros da grande família de receptores acoplados a proteína G, e são

responsáveis por modular a resposta analgésica através de mecanismos centrais.

Subtipos de receptores também são encontrados no sistema nervoso central. O

próprio organismo produz peptídios opióides chamado de endomorfinas, esses

26

peptídios são responsáveis na modulação das funções críticas do organismo, como

exemplo a homeostasia (Craig e Stitzel, 2005).

A ação analgésica dos opióides ocorre como conseqüência de sua interação

com receptores específicos µ, δ, e κ, localizados em diversos pontos do sistema

aferente e eferente, que participam da transmissão da sensibilidade dolorosa e

modulam a informação nociceptiva (Resende et al., 2006).

Para os análogos quaternários dos alcalóides da morfina, como a N-

metilmorfina, propõe-se que estes agentes, por apresentarem uma mínima

capacidade de transpor a barreira hematoencefálica, exercem o efeito analgésico

através da atuação em receptores opióides presentes nas terminações nervosas

periféricas (Ferreira e Nakamura, 1979 a,b,c; Ferreira et al., 1981; Smith et al., 1982;

Stein, 1993; Antonijevic et al., 1995). Diferentemente dos agonistas opióides que

exercem efeitos analgésicos através de ação no sistema nervoso central, como

ocorre com a morfina (Herz e Teschemacher, 1971; Millan, 1986).

Em um processo de hiperalgesia inflamatória, alguns dos mediadores

inflamatórios liberados (prostaglandinas e as prostaciclinas), embora não sejam

algógenas, aumentam diretamente a atividade dos nociceptores; por reduzirem o

limiar de excitabilidade das terminações nociceptivas, por potenciarem a ação

nociceptiva da bradicinina e da histamina e por estimularem a liberação de

substância P em neurônios sensitivos (Birell et al., 1991; Dray, 1995; Carr e Goudas,

1999).

1.4. Inflamação

A inflamação caracteriza-se por uma seqüência de diversos processos,

começando pelo desencadeamento do evento provocado por uma substância

estranha ou uma lesão física, recrutamento e quimiotaxia de células inflamatórias e

ativação dessas células liberando mediadores da inflamação capazes de lesar ou

destruir a substância invasora.

Os sinais clássicos da inflamação são: rubor, edema, calor, dor e perda da

função (Craig e Stitzel, 2005). O processo inflamatório pode ser desencadeado por

inúmeros estímulos, tais como agentes infecciosos, interação antígeno-anticorpo,

27

traumas químicos, mecânicos ou térmicos, isquemia, dentre outros. Esses estímulos

vão induzir a liberação de mediadores químicos presentes no plasma e nas células

do tecido lesado (Scognamillo-Szabó et al., 2005).

Assim como a dor, a inflamação pode ser classificada em aguda e crônica. A

inflamação aguda corresponde a uma resposta imediata a uma determinada lesão,

com alterações no calibre vascular aumentando o fluxo sanguíneo, modificações

estruturais na parede vascular, extravasamento de leucócitos e proteínas do plasma

para o interstício e consequentemente o surgimento de edema, e por último, a

migração e agregação de leucócitos para o local de lesão responsáveis por

combater os agentes ofensivos. A exposição prolongada a agentes tóxicos, à

infecção persistente e os desvios do sistema autoimune, são fatores que levam à

inflamação crônica e que podem durar semanas, meses ou anos (Di Vaio e Freitas,

2001).

Numerosos mediadores inflamatórios são ativados durante um processo

inflamatório. Dentre esses, podemos destacar os eicosanóides que são derivados do

ácido araquidônico (AA) presente nos fosfolipídios da membrana. A clivagem do

ácido araquidônico pela enzima fosfolipase A2, ativa uma das duas vias enzimáticas

existentes, a da cicloxigenase (COX) também conhecida como prostaglandina

sintetase ou prostaglandina endoperóxido sintetase levando a produção de

prostaglandinas e tromboxanos ou da lipoxigenase levando a produção de

leucotrienos (Figura 2).

Figura 2: Esquema resumido dos principais eicosanóides.

Fosfolipídios da Membrana

Fosfolipase A2

Ácido Araquidônico

Cicloxigenase

Tromboxano Prostaglandinas

Lipoxigenase

Leucotrienos

28

Existem duas isoformas da enzima COX, a COX-1 que é uma isoforma

constitutiva, ou seja, presente nas células em condições fisiológicas, principalmente

nos vasos sanguíneos, plaquetas, estômago e rins, responsável pela produção basal

de prostaglandinas, prostaciclinas, etc; e a COX-2 que é induzível pelas citocinas

(IL-1, IL-2 e TNF-α) interleucina-1, interleucina-2 e fator de necrose tumoral α e

outros estímulos inflamatórios. As prostaglandinas exercem uma série de funções

fisiológicas no organismo como, proteção da mucosa gástrica, metabolismo ósseo,

hipotensão, ovulação. Essas prostaglandinas (PGF2α, PGI2, PGE2, PGD2) agem no

organismo causando vasodilatação, bronconstrição e vasoconstrição. Pela via da

lipoxigenase, os leucotrienos produzidos LTA4, LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4, 5-HPTE

(5- hidroperoxiácido) também exercem várias funções como quimiotaxia e ativação

de leucócitos cujo responsável por isso é o LTB4 (Craig e Stitzel, 2005).

A expressão de uma terceira via enzimática da COX, denominada (COX-3) foi

demonstrada em estudos in vitro com linhagens de macrófagos. Nesse caso essa

via não levaria a produção de prostaglandinas, mas sim de um membro da família

das ciclopentanonas (PGJ2) que também exerceria atividade antiinflamatória. A

COX-3, possivelmente uma variação da COX-1, (oriunda de um mesmo gene dessa

isoforma), encontra-se distribuída principalmente no córtex cerebral, medula

espinhal e coração. Supõe-se que a inibição da COX-3 representaria o mecanismo

de ação pelos quais os antiinflamatórios não esteroidais (AINES), exerceriam sua

atividade analgésica e antipirética (Carvalho et al., 2004).

Em 1893, começou a ser produzido pela Bayer (Indústria Farmacêutica), o

ácido acetilsalicílico patenteado como a Aspirina®. A partir desse período, os

agentes antiinflamatórios não esteroidais passaram a ser os medicamentos mais

largamente prescritos e usados em todo o mundo (Fiorucci et al., 2001). John Vane

em 1971, propôs que o mecanismo de ação desses agentes é de suprimir o

processo inflamatório através da inibição da cicloxigenase (COX), impedindo assim

a síntese de prostaglandinas (Carvalho et al., 2004). O uso do AINES deve ser

limitado, pelo fato de apresentar efeitos colaterais, particularmente no trato

gastrintestinal (TGI) e nos rins (Fosslien, 1998).

29

Outra classe de substâncias muito usadas no tratamento de um processo

inflamatório são os corticosteróides, cujo mecanismo de ação consiste na inibição da

via da cicloxigenase e a via da lipoxigenase (Meireles-Teixeira et al., 2003).

Entretanto, esses agentes devem ser utilizados com cautela por também

apresentarem efeitos adversos, por exemplo, alteração no metabolismo ósseo e

toxicidade ocular (Rizzo e Solé, 2006).

Células fagocíticas (neutrófilos e macrófagos), geram potentes oxidantes

como o peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO), ácido hipocloroso (HOCl),

dentre outros, que são bons agentes bactericidas, mas que induzem lesão tecidual.

Algumas das funções fisiológicas do NO, inclui vasodilatação e citotoxicidade em

macrófagos (Schuman e Madison, 1994).

Outro mediador inflamatório que merece destaque são as citocinas das quais

as mais importantes são o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina 1 (IL-

1). São produzidos primeiramente por células da linhagem dos monócitos-

macrófagos, atuando em conjunto, esses mediadores estimulam respostas

inflamatórias, como dor, febre e recrutamento de linfócitos induzindo também a

produção de outros mediadores da inflamação e na inflamação crônica, contribuindo

com a lesão tecidual (Craig e Stitzel, 2005).

As aminas vasoativas (histamina e serotonina) também exercem papel

fundamental na inflamação, elas são capazes de causar dilatação de vênulas pós-

capilares e, conseqüentemente, aumentar o fluxo sangüíneo e a permeabilidade

vascular (Barnes et al., 1988).

30

Objetivos

31

2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral:

Realizar o estudo químico �biomonitorado� do extrato etananólico da casca do

caule de Pterodon emarginatus sobre modelos experimentais de inflamação e dor.

2.2. Objetivos Específicos:

• Realizar o estudo fitoquímico do extrato etanólico bruto da casca do caule de

P. emarginatus Vogel visando o isolamento e identificação de substâncias

responsáveis pela atividade farmacológica do extrato.

• Avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico bruto,

frações e substâncias isoladas da casca do caule de Pterodon emarginatus

Vogel.

32

Materiais

33

3. MATERIAIS

3.1. Material Botânico

A casca do caule de Pterodon emarginatus Vogel foi coletada no município de

Bela Vista - Goiás, Brasil, (847 m de Altitude, 17º02�1,1� S / 48º49�0,3� W) em

setembro de 2003. O material botânico foi identificado pelo Professor Dr. José

Realino de Paula. Uma excicata foi depositada no Herbário da Universidade Federal

de Goiás (UFG) sob número UFG-27155. A casca do caule foi dessecada a 40ºC em

uma estufa com circulação forçada de ar por 48 horas, em seguida foram trituradas

em moinho de facas.

3.2. Extrato, Frações e Medicamentos.

Nos modelos farmacológicos utilizados para avaliar a atividade analgésica e

antiinflamatória do extrato e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila,

foram preparadas soluções, imediatamente antes da realização dos experimentos.

As suspensões do extrato nas doses pré-estabelecidas foram feitas utilizando água

destilada. Para as frações e para o lupeol, foram utilizados para preparar as

soluções nas doses estabelecidas, água destilada e tween-80 3%. Foram usados

como controle positivo os medicamentos indometacina (Prodome � Brasil), morfina

(Cristália � Brasil), dexametasona (Hipolabor � Brasil) e heparina (Prodome � Brasil).

Todos os medicamentos foram solubilizados em água destilada, exceto a

indometacina, que foi solubilizada em solução aquosa de NaHCO3 5% (p/v).

3.3. Reagentes utilizados

• Acetato de Etila (Synth � Brasil)

• Acetona (Synth � Brasil)

• Ácido acético glacial (Synth � Brasil)

34

• Bicarbonato de sódio (Synth � Brasil)

• Carragenina (Sigma � USA)

• Diclorometano (Synth � Brasil)

• Etanol 95% P.A (p/v) (Synth � Brasil)

• Formaldeído (Synth � Brasil)

• Metanol (Synth � Brasil)

• Hexano (Synth � Brasil)

• Óleo de cróton (Sigma � USA)

• Sílica Gel 60 (Merck � USA)

• Solução de Türk (Sigma � USA)

• Tween 80 (Synth � Brasil)

3.4. Animais

Os animais utilizados nos modelos farmacológicos escolhidos foram

camundongos albinos (Mus musculus) tipo Swiss, machos, pesando entre 25 e 40 g

obtidos no Biotério Central da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os tratamentos

dos animais com o veículo (grupo controle), extrato, frações ou diferentes

substâncias foram realizados em concentrações adequadas para a administração de

um volume constante de 10 mL/kg, volume esse padronizado no Laboratório de

Farmacologia de Produtos Naturais/UFG, onde foram feitos os experimentos. As

administrações foram feitas a 45 ou 60 minutos, dependendo do modelo escolhido,

pela via (s.c.) ou (p.o.) antes de iniciar os testes de atividade farmacológica.

Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (24°C ±

1,5ºC) e iluminação (ciclo claro / escuro de 12 h), com água e ração ad libitum,

permanecendo no laboratório por um período de adaptação de pelo menos 24 horas

antes dos experimentos que geralmente começavam no período matutino.

35

Métodos

36

4. MÉTODOS 4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS 4.1.1. Preparo do extrato etanólico de Pterodon emarginatus.

A casca do caule de P. emarginatus, após ter sido dessecada em estufa com

circulação forçada de ar, foi triturada em moinho de facas. O pó obtido foi macerado

em álcool etílico 95% P.A. (p/v) na proporção 1:5 (m/v), sob agitação por 5 horas,

seguida por filtração. A extração foi repetida por mais duas vezes para garantir o

esgotamento das substâncias extraíveis pelo álcool etílico e, em seguida, os filtrados

foram agrupados. O filtrado foi evaporado em rotaevaporador a 40ºC sob pressão

reduzida a fim de concentrá-lo, obtendo assim o extrato etanólico bruto da casca do

caule de Pterodon emarginatus, que denominamos de extrato etanólico de sucupira

(EES).

4.1.2. Preparo das Frações e Isolamento de alguns constituintes químicos.

O EES obtido foi fracionado utilizando para isso, partições líquido/líquido com

solventes de polaridades crescentes (hexano, diclorometano e acetato de etila).

Pesou-se 50,0 g do extrato etanólico bruto e adicionou-se 200 mL de metanol/água

na proporção 7:3. Feito isso, a amostra foi transferida para um funil de separação.

Adicionou-se 100 mL de hexano, agitando-o em seguida. O funil permaneceu em

repouso até ocorrer a separação entre as fases, onde a fase hexânica foi

armazenada em um recipiente limpo e seco. Realizou-se mais duas extrações

subseqüentes com 100 mL de hexano. Repetiu-se o mesmo procedimento para

diclorometano e acetato de etila. No final, após a evaporação do metanol da fração

metanol/água, a fração aquosa resultante foi armazenada em freezer (-10ºC) para

ser liofilizada posteriormente (Figura 3).

37

Hexano (3x100 mL)

Diclorometano (3x100mL)

Acetato de Etila (3X100mL)

Figura 3 - Fluxograma do fracionamento do EES por partição líquido/líquido.

Extrato Etanólico Bruto da casca do caule de Pterodon emarginatus ( 50 g )+

200 mL de Metanol:Água ( 7:3 )

Fração Hexânica

Fração Acetato de Etila

Fração Diclorometano

Fração Aquosa

38

4.1.2.1. Fracionamento da Fração Hexânica (FH)

Da (FH) após ter evaporado todo o solvente, foram pesados 2,5g, em

seguida, essa foi submetida à cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel,

empacotada com uma mistura de hexano/acetato de etila (95:5) e eluída com essa

mistura de solventes em polaridade crescente até 50% AcOEt (Figura 4). Foram

coletadas 62 frações de 20 mL cada, reunidas em 15 novas frações de acordo com

os índices de retenção (Rf) observados nas placas de CCD, cuja fase móvel

utilizada foi hexano: acetato de etila (90:10 e 85:15), após serem reveladas com Iodo

(I2).

Fração Hexânica (2,5 g)

Hex/AcOEt(95:5)

FH (1-2 0)

FH(21- 2 5)

Hex/AcOEt(93:7)

Hex/ AcOEt(90:10)

FH(26-30 )

Hex/AcOEt(85:15)

FH(36- 4 0)

Hex/AcOEt(80:20)

FH(41-45 )

FH(46-50 )

Hex/AcOEt(75:25)

Hex/AcOEt(70:30)

FH(51-55)

FH(56-62 )

Hex/AcOEt(60:40)

Hex/AcOEt(50:50)

FH(31-35 )

Figura 4 - Fracionamento da Fração Hexânica por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.

39

4.1.2.2. Fracionamento da Fração Diclorometano (FD)

Da (FD) após ter evaporado todo o solvente, foram pesados 2,86g, sendo

submetida em seguida à cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel,

empacotada com uma mistura de hexano/acetato de etila (80:20) e eluída com essa

mistura de solventes em polaridade crescente até 50% AcOEt (Figura 5). Foram

coletadas 62 frações de 20 mL cada, reunidas em 16 novas frações de acordo com

os índices de retenção (Rf) observados nas placas de CCD, cuja fase móvel

utilizada foi hexano: acetato de etila (90:10 e 85:15), após serem reveladas com

Iodo (I2).

Fração Diclorometano (2,86g)

FD1-20

FD21-30

FD31-35 FD

46-50FD

36-40FD

41-45FD

51-62Hex/AcOEt80:20

Hex/AcOEt75:25

Hex/AcOEt70:30

Hex/AcOEt65:35

Hex/AcOEt60:40

Hex/AcOEt55:45

Hex/AcOEt50:50

Figura 5 - Fracionamento da Fração Diclorometano por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.

40

4.1.2.3. Elucidação estrutural das substâncias isoladas

Uma vez purificada por cromatografia em coluna (CC) e cromatografia em

camada delgada (CCD), as substâncias isoladas, foram caracterizadas por

Espectrometria de Infravermelho (EI) e Ressonância Magnética Nuclear de

hidrogênio (RMN 1H) e de carbono (RMN 13C).

As pastilhas de KBr a serem utilizadas no (EI), foram preparadas com KBr

(Vetec), previamente dessecada em estufa a 120°C. Em seguida foram colocados

100 mg de KBr no pastilhador, seguido de compressão em prensa hidráulica Perkin

Elmer ® modelo 4037 com pressão de 10a toneladas por 2 minutos, para a obtenção

de pastilhas finas e transparentes. As análises foram realizadas em um aparelho de

Infravermelho BX/RX Perkin Elmer ® (modelo 60508). O equipamento foi mantido

em sala com temperatura e umidade controladas. A faixa espectral utilizada

compreendia números de onda entre 4000 e 450cm-1 , sendo utilizada resolução de

4cm-1.

As análises de RMN foram realizadas à temperatura ambiente em um

espectrômetro Mercury plus da VARIAN (7,05 T), utizando uma sonda de 5mm e

pulsos de 45º para o hidrogênio e carbono. Os deslocamentos químicos no RMN de 1H (300 MHz) foram referenciados aos padrões internos TMS (tetrametilsilano; 0,0

ppm) para o solvente CDCl3. Nos espectros de RMN de 13C (75,46 MHz), foram

referenciados ao CDCl3 (77,0 ppm).

4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS 4.2.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas

Grupos de animais foram tratados pela via oral através de gavagem, pela via

subcutânea e intraperitoneal através de injeção, com extrato etanólico de sucupira

nas doses (100 a 2000 mg/kg). O grupo controle recebeu veículo (água) em volume

proporcional às doses do extrato utilizadas. Os animais após o tratamento, foram

41

observados em deambulação livre, sobre uma superfície plana durante 3 minutos,

nos tempos 5, 10, 20, 30 e 60 minutos, 4, 8, 24 e 48 horas, e após 4 e 7 dias do

tratamento. Os efeitos observados nos animais foram anotados em uma ficha

padrão de triagem farmacológica, adaptada daquela descrita por Malone (1977).

4.2.2. Avaliação da Atividade Antinociceptiva 4.2.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético

De acordo com a metodologia descrita por Koster (1959), foram utilizados

grupos experimentais de camundongos que foram tratados com veículo (n = 10;

s.c.), EES (n = 10; 1000 mg/kg s.c. e p.o.), FH (n = 12; 100 mg/kg s.c.), FD (n = 12;

114 mg/kg s.c.), FAcOEt (n = 12; 50 mg/kg s.c.), Lupeol (n= 10; 70 mg/kg s.c.) ou

indometacina (n = 8, 12 ou 10; 10 mg/kg s.c.). Todos os grupos receberam ácido

acético 1,2% (v/v i.p.) 45 minutos após os tratamentos. O número de contorções

abdominais, que é a contração da parede abdominal seguida pela extensão de ao

menos uma das patas posteriores (Tornos et al., 1999), foram contadas

acumulativamente em 30 minutos de avaliação. Os resultados foram expressos

como as médias ± erro padrão da média (EPM) dos números de contorções

abdominais acumuladas em 30 minutos de avaliação experimental.

4.2.2.2. Teste do �tail flick�

Para este teste foi empregada a metodologia descrita por Janssen et al

(1963), adaptada por Grotto e Sulman, (1967). Este ensaio permite o estudo de

substâncias com atividade opióide central, mediante a avaliação do tempo, em

segundos, que o animal leva para retirar a cauda do local de incidência de um

estímulo térmico doloroso. Este estímulo nociceptivo foi produzido por imersão do

terço distal da cauda dos camundongos em banho-maria a 55,5 ± 0,5 ºC.

42

Grupos experimentais de 6 animais foram previamente selecionados quanto à

sua reatividade ao estímulo nociceptivo, não sendo utilizados animais cujo tempo de

resposta foi superior a 7 segundos. A reatividade foi medida a cada 30 minutos,

iniciando-se uma hora antes e prolongando-se por 2 horas depois da administração

s.c. do veículo ou do EES (100, 300 ou 1000 mg/kg). A morfina (10 mg/kg),

administrada via s.c., foi utilizada como controle positivo do ensaio. O tempo máximo

que se deixaram as caudas dos animais em contato com a água do banho-maria foi

de 20 segundos para se evitar lesões.

4.2.2.3. Dor induzida pela Formalina

Esse método permite distinguir a dor de origem neurogênica que ocorre entre

(0 � 5 minutos) através da estimulação direta dos nociceptores, e a dor de origem

inflamatória, que ocorre entre (15 � 30 minutos) onde ocorre a liberação de

mediadores inflamatórios (Hunskaar et al., 1985, 1986 e 1987).

Foram utilizados grupos experimentais de até 10 camundongos tratados pela

via s.c. com veículo, EES (1000 mg/kg), morfina (10 mg/Kg) ou indometacina (10

mg/kg). 60 minutos após os tratamentos via s.c., foram injetados na região

intraplantar da pata posterior direita dos animais 20 µL de formalina 3% v/v

(formaldeído 1,2% v/v). Feito isso, os animais foram observados individualmente

durante 30 min em caixas de acrílico com fundo especular para auxiliar a

visualização. Após a aplicação da formalina, foi medida a reatividade do animal

considerada como o tempo, em segundos, que o animal permanece lambendo a

pata injetada. O efeito antinociceptivo foi avaliado nas duas fases da dor: no período

de 0 - 5 minutos (dor neurogênica) e de 15 a 30 minutos (dor de origem

inflamatória). Os resultados foram expressos como as médias ± EPM dos tempos de

reatividade nas duas fases, comparando ao grupo controle experimental.

43

4.2.3. Avaliação da Atividade Antiinflamatória

4.2.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton

Grupos de camundongos foram tratados pela via s.c. com o veículo (n = 10),

EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) n = 6, 8 e 6 respectivamente, Lupeol (35, 70 e 140

mg/kg) n = 8 ou dexametasona (2 mg/kg) n = 6. Após 60 minutos dos tratamentos,

em cada animal foi administrado topicamente 20 µL de solução recém preparada de

óleo de cróton 2,5% v/v em acetona, na superfície interna da orelha direita e o

mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos camundongos. Após 4 horas, os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Segmentos idênticos (discos

de 6 mm de diâmetro) de ambas as orelhas foram tomados e pesados em balança

analítica. A formação e intensidade do edema foi avaliado através das diferenças de

peso de tais segmentos (Zanini et al, 1992). Os resultados foram comparados com o

grupo controle experimental.

4.2.3.2. Peritonite induzida por carragenina

Este ensaio avalia a evolução da migração leucocitária para a cavidade

peritoneal, segundo protocolo originalmente descrito por Ferrándiz e Alcaraz (1991).

Grupos experimentais de até 9 camundongos foram tratados previamente pela via

s.c. com veículo (grupo controle), com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) ou com

dexametasona (2 mg/kg). Decorridos 60 minutos após os tratamentos, foram

injetados nos animais, pela via intraperitoneal, 0,25 mL de carragenina (1% m/v em

solução salina). Após 4 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento

cervical e injetou-se na cavidade peritoneal 2 mL de PBS heparinizado (10 UI/mL de

heparina). Após 60 compressões leves no abdômen, o fluído peritoneal foi coletado,

a amostra diluída (1:20 em Solução de Tϋrk) e a contagem do número de leucócitos

totais migrados realizada na câmera de Newbauer. Os resultados foram expressos

como médias ± EPM dos números de leucócitos totais por mL.

44

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão das médias (EPM).

As diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas pela

análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Considerou-se como

valores significantes aqueles cujo p < 0,001, p < 0,01 e p < 0,05. Para a análise dos

dados foi utilizado o software GraphPad Prism 3.0.

45

Resultados

46

6. RESULTADOS

6.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS 6.1.1. Extração

Pesou-se 900 gramas da casca do caule seca de Pterodon emarginatus Vog,

dessecada e pulverizada, extraiu-se por maceração em etanol 95% P.A (p/v) com

agitação ocasional, obtendo 271,32g de extrato etanólico bruto de sucupira (EES)

com um rendimento de 30,14% (p/v).

6.1.2. Fracionamento, Isolamento e Caracterização dos Constituintes Químicos

Após a ressuspensão de 50,0 gramas do extrato etanólico da casca do caule

de P. emarginatus em metanol:água (7:3) e o fracionamento com hexano (FH),

diclorometano (FD) e acetato de etila (FAcOEt), foram obtidos 2,5g de Fração

Hexânica (5,0%), 2,86g de Fração Diclorometano (5,72%) e 1,25g de Fração Acetato

de Etila (2,5%).

Parte dessas frações FH, FD e FAcOEt foram submetidas ao fracionamento

por cromatografia em coluna de adsorção em sílica na proporção 1:40 (um mg de

fração para cada quarenta mg de sílica gel), com gradiente Hexano/Acetato de Etila.

Após as frações serem coletadas em alíquotas de 20 mL, elas foram analisadas

através de CCD, usando como fase móvel Hexano/Acetato de Etila na proporção

(90:10 e 85:15), e depois de terem sido reveladas com Iodo (I2), foram reunidas,

baseado no fator de retenção (Rf) de cada mancha obtida, em quinze, dezesseis e

dez frações respectivamente. Novamente fez-se cromatografia em camada delgada

das frações reunidas anteriormente e após a revelação das placas de cromatografia,

observou-se a formação de apenas uma mancha na Fração Hexânica FH-1.10

(Quadro 1), uma mesma mancha na Fração Diclorometano FD-1.4 e FD-1.5 na

Fração Diclorometano (Quadro 2), e nenhuma mancha única na Fração Acetato de

Etila. Foi feita análise espectroscópica através do Infravermelho utilizando pastilhas

de KBr e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C utilizando como solvente

clorofórmio deuterado, nas três frações onde apareceram as manchas únicas e, após

47

a interpretação dos espectros, identificou-se na fração hexânica, o Lupeol (LP-10)

cujo rendimento foi de 28,8% e nas duas frações diclorometano, a Betulina (BT- 4) que teve o rendimento total de 2,79% (Figura 6).

Frações Reunidas

Nomenclatura Massa(g) Substância Isolada

2-5 6-8 9-12 13-15 16-17 18 19-23 24-25 26 27-32 33-34 35-38 39-44 45-50 51-62

FH-1.1 FH-1.2 FH-1.3 FH-1.4 FH-1.5 FH-1.6 FH-1.7 FH-1.8 FH-1.9 FH-1.10 FH-1.11 FH-1.12 FH-1.13 FH-1.14 FH-1.15

0,06 0,04 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,04 0,72 0,18 0,18 0,06 0,04 0,22

LP-10

Quadro � 1: Esquema do isolamento do lupeol da fração hexânica da casca do caule de

P.emarginatus.

Frações Reunidas

Nomenclatura Massa (g) Substância Isolada

1 2 3 4-10 11 12-20 21-40 41 42-45 46-49 50 51-55 56 57-58 59-61

62

FD-1.1 FD-1.2 FD-1.3 FD-1.4 FD-1.5 FD-1.6 FD-1.7 FD-1.8 FD-1.9 FD-1.10 FD-1.11 FD-1.12 FD-1.13 FD-1.14 FD-1.15 FD-1.16

0,04 0,01 0,02 0,07 0,01 0,07 0,04 0,04 0,05 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,09

BT- 4 BT- 4

Quadro � 2: Esquema do isolamento da betulina da fração diclorometano da casca do

caule de P.emarginatus.

48

6.1.2.1. Determinação estrutural dos compostos isolados

Figura 6 - Substâncias isoladas do extrato etanólico da casca do caule de Sucupira.

6.1.2.2. Substância LP-10

A substância LP-10 (720 mg) foi isolada da fração hexânica FH-1.10, através

de coluna cromatográfica de adsorção em sílica, obtendo após a evaporação do

solvente, um sólido branco solúvel em diclorometano.

No espectro de Infravermelho observou-se a presença de uma banda larga

em 3.414 cm-1 atribuído à deformação axial de O-H, uma banda em 2.944 cm-1

atribuído à deformação axial de CH de alifático e uma banda em 1.637 cm-1 atribuído

a deformação axial de grupos metileno (Figura 7).

CH2OH

HO

Betulina

1

3 5 7

9

11 13

15

17

18

1920 21

22

2324

25 26

27

28

29

30

HO

Lupeol

1

3 5 7

9

11 13

15

17

18

1920 21

22

2324

25 26

27

28

29

30

49

Fi

gura

7 �

Esp

ectro

de

Infra

verm

elho

do

Lupe

ol (L

P-10

).

Ban

da c

arac

terís

tica

de O

H

Def

orm

ação

axi

al

de C

H a

lifát

ico

Def

orm

ação

axi

al

de g

rupo

s m

etile

no

50

No espectro de RMN 1H (Figura 8), observam-se os sinais de hidrogênios

vinílicos em δ 4,57(m) e δ 4,68 (dl; J=2,4Hz) referentes aos hidrogênios H-29 da

ligação dupla terminal. O duplo dubleto em δ 3,18 (J=5,1 e 10,5Hz) relativo ao

hidrogênio carbinólico H-3α, estes acoplamentos indicaram a presença da hidroxila

em C-3 com β-configuração, e os sinais em δ 0,76 a δ 1,68 são referentes às

metilas. Os dados de RMN 1H de LP-10 (Quadro 3) foram comparados com os

dados da literatura para o Lupeol (Silva, 2004).

Hidrogênio LP-10 a

δ 1H, multi. (nº H, J) Lupeol b

δ 1H, multi. (nº H, J). (Silva, 2004)

H-3 H-19 H-21 H-23 H-24 H-25 H-26 H-27 H-28 H-29

H-30

3,18, dd (1H, 5,1 e 10,5) 2,38, m (1H) 1,36, m (1H), 1,92, m (1H) 0,97,s (3H) 0,76, s (3H) 0,83, s (3H) 1,03, s (3H) 0,94, s (3H) 0,79, s (3H) 4,68, dl (1H, 2,4); 4,57, m (1H) 1,68, m (3H)

3,18, dd (1H, 5,4 e 10,8) 2,37, m (1H) 1,35, m (1H), 1,91 m (1H) 0,97,s (3H) 0,76, s (3H) 0,83, s (3H) 1,03, s (3H) 0,94, s (3H) 0,79, s (3H) 4,69, d (1H, 2,4); 4,50, m (1H) 1,68, s (3H)

a- RMN 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parênteses estão em Hertz.

Quadro 3 - Dados de RMN 1H de LP-10 e a comparação com os dados da literatura

(Silva, 2004).

51

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

23.7

51.

000.

500.

500.

50

CD

Cl3

TMS

4.694.68

4.574.57 4.55

3.213.20

3.183.16

2.422.41

2.392.37

2.352.331.951.91

1.701.681.68

1.65 1.591.51

1.381.36 1.26

1.25 1.201.03

0.970.94 0.91

0.760.700.690.66

Figu

ra 8

� E

spec

tro d

e R

MN

1 H (3

00 M

Hz,

CD

Cl 3)

de

LP-1

0.

HO

Lupe

ol

1

35

7

9

1113

15

17181920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

Hid

rogê

nio

viní

lico

(H-2

9)

Hid

rogê

nio

carb

inól

ico

(H-3

)

52

No espectro de RMN 13C (Figura 9) observa-se os sinais em δ 109,3 (C-29) e

δ 150,9 (C-20), referentes à dupla terminal. O sinal em δ 78,9 corresponde ao próton

carbinólico C-3. Os dados de RMN 13C de LP-10 foram comparados com os dados

da literatura para o Lupeol (Mahato e Kundu, 1994), conforme Quadro 4.

Nº Carbono Lupeol δ 13Cb

(Mahato e Kundu, 1994)

LP-10 δ 13Ca

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

38,7 27,4 78,9 38,8 55,3 18,3 34,2 40,8 50,4 37,1 20,9 25,1 38,0 42,8 27,4 35,5 43,0 48,2 47,9

150,9 29,8 40,0 28,0 15,4 16,1 15,9 14,5 18,0

109,3 19,3

38,652 27,388 78,946 38,805 55,228 18,268 34,218 40,766 50,366 37,110 20,871 25,060 37,980 42,773 27,388 35,531 42,949 48,229 47,932

150,918 29,784 39,957 27,953 15,346 16,086 15,933 14,506 17,963

109,311 19,268

a- RMN 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN 13C (CDCl3, 14,5MHz)

Quadro 4 - Dados de RMN 13C de LP-10 e a comparação com os dados da literatura

(Mahato e Kundu, 1994).

53

230

220

210

200

190

180

170

160

150

140

130

120

110

100

9080

7060

5040

3020

100

-10

-20

-30

150.91

109.30

78.9477.42

77.0076.57

55.22

50.3648.23

42.9542.7740.76

37.9835.53

34.22 29.7827.95

27.34

20.8718.2717.96

16.0914.51

Figu

ra 9

� E

spec

tro R

MN

13C

(75

MH

z, C

DC

l 3) d

e LP

-10.

HO

Lupe

ol

1

35

7

9

1113

15

17181920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

C-2

0

C-2

9

54

Após análise dos dados espectrais e da comparação com os dados de

literatura do Infravermelho, da Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de

Carbono 13, conclui-se que a substância LP-10 trata-se de um triterpeno da série

dos lupanos, o Lupeol (lup-20(29)-en-3β-ol).

6.1.2.2.1. Dados Espectroscópicos da Substância Isolada Lupeol (LP-10):

Lupeol: (lup-20(29)-en-3β-ol)

Fórmula Molecular: C30H50O

IV √ máx cm -1 (KBr), (Figura 7): 3414, 2944, 1637, 1458, 1380, 1043.

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ1H, mult. (H, J em Hz, nº H), (Figura 8).

4,68, dl (H-29; 2,4; 1H); 4,57, m (H-29; 1H); 3,18, dd (H-3; 5,1 e 10,5; 1H); 2,38, m

(H-19; 1H), 1,92, m (H-21; 1H); 1,68, m (H-30; 3H); 1,36, m (H-21; 1H); 1,03, s (H-26;

3H); 0,97, s (H-23; 3H); 0,94, s (H-27; 3H); 0,83, s (H-25; 3H); 0,79, s (H-28; 3H);

0,76, s, (H-24; 3H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ13C (C), (Figura 9).

38,6 (C-1); 27,3 (C-2); 78,9 (C-3); 38,8 (C-4); 55,2 (C-5); 18,2 (C-6); 34,2 (C-7); 40,7

(C-8); 50,3 (C-9); 37,1 (C-10); 20,8 (C-11); 25,0 (C-12); 37,9 (C-13); 42,7 (C-14); 27,3

(C-15); 35,5 (C-16); 42,9 (C-17); 48,2 (C-18); 47,9 (C-19); 150,9 (C-20); 29,7 (C-21);

39,9 (C-22); 27,9 (C-23); 15,3 (C-24); 16,0 (C-25); 15,9 (C-26); 14,5 (C-27); 17,9 (C-

28); 109,3 (C-29); 19,2 (C-30).

55

6.1.2.3. Substância BT- 4

A substância BT- 4 (80 miligramas), foi isolada da fração diclorometano (FD-

1.4, FD-1.5) através de coluna cromatográfica de adsorção em sílica, obtendo após a

evaporação do solvente, um sólido branco solúvel em diclorometano.

No espectro de Infravermelho observou-se a presença de uma banda forte em

3.435 cm-1, indicando a presença de grupo hidroxila. A banda na região de 2942 a

2869 cm-1 apresentou deformação axial de ligação C-H, em 1459 cm-1 uma banda

de deformação angular de grupo metileno, em 1376 cm-1 uma banda de deformação

angular de grupo metila (Figura 10).

56

Fi

gura

10

� Es

pect

ro d

e In

frave

rmel

ho d

a Be

tulin

a (B

T �

4).

Ban

da c

arac

terís

tica

de O

H

Def

orm

ação

axi

al

de C

HD

efor

maç

ão a

ngul

ar

do g

rupo

met

ilenoD

efor

maç

ão a

ngul

ar d

o gr

upo

met

ila

57

O espectro de RMN 1H (Figura 11) de BT-4 apresentou em δ 4,58 e δ 4,68,

sinais de hidrogênios vinílicos referentes aos hidrogênios H-29 da ligação dupla

terminal. O sinal na região de δ 3,17 é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, cujos

acoplamentos indicaram a presença de β-configuração, e os dos metilas ocorrem

entre δ 0,96 a δ 1,68. Os dois dubletos de dubletos em δ 3,78 e δ 3,33 em relação

aos de LP - 10 evidenciam a presença de um metileno carbinólico em BT-4 no lugar

do metila-28 de LP-10. Os dados de RMN 1H de BT-4 foram comparados com os

dados da literatura para a betulina (Silva, 2004) (Quadro 5).

Hidrogênio BT-4 a

δ 1H, multi. (nº H, J) Betulina b

δ 1H, multi. (nº H, J) (Silva, 2004)

H-3 H-19 H-21 H-23 H-24 H-25 H-26 H-27 H-28

H-29

H-30

3,17, dd (1H; 5,1 e 10,8) 2,37, m (1H) 1,95, m (2H) 0,96,s (3H) 0,75, s (3H) 0,82, s (3H) 1,02, s (3H) 0,97, s (3H) 3,78, dd (1H; 3,9 e 10,2); 3,33, dd (1H; 3,0 e 10,8) . 4,68, m (1H); 4,58, m (1H) 1,68, m (3H)

3,18 2,38 1,40;1,95 0,96 0,76 0,82 1,02 0,98 3,77; 3,31 4,68; 4,58 1,68

a-RMN 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntese estão em Hertz.

Quadro 5 - Dados de RMN 1H de BT - 4 e a comparação com os dados da literatura

(Silva, 2004).

58

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

28.1

91.

551.

000.

570.

530.

50

CD

Cl3

TMS

4.694.684.584.58

3.823.813.78

3.353.21

3.183.16

2.412.38

2.34

1.971.951.90

1.891.89

1.851.68

1.611.57 1.43

1.391.38

1.251.22 1.14

1.020.98 0.97 0.90

0.820.76

0.68

Figu

ra 1

1 �

Espe

ctro

de

RM

N 1 H

(300

MH

z, C

DC

l 3) d

e B

T �

4.

CH

2OH

HO

Bet

ulin

a

1

35

7

9

1113

15

17181920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

Hid

rogê

nio

viní

lico

H-2

9M

etile

no c

arbi

nólic

oH

-28

59

No espectro de RMN 13C (Figura 12) observam-se os sinais em δ 109,6

referente ao metileno C-29 da dupla terminal, em δ 150,4 referente ao C-20, em δ

78,9 ao metino carbinólico C-3, em δ 60,4 ao metileno carbinólico C-28 e na região

entre δ 14,7 a 27,9 as metilas. Os dados de RMN 13C foram comparados com os

dados da literatura para a betulina, segundo (Mahato e Kundu, 1994) (Quadro 6).

Nº Carbono BT- 4 a δ 13C Betulina b δ 13C (Mahato e Kundu, 1994)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

38,828 26,999 78,954 38,828 55,228 18,261 34,172 40,865 50,336 37,248 20,779 25,144 37,248 42,674 26,999 29,120 47,749 48,703 47,749 150,45 29,685 33,936 27,953 15,346 16,086 16,086 14,727 60,493 109,66 19,138

38,8 27,2 78,9 38,9 55,3 18,3 34,3 40,9 50,4 37,2 20,9 25,3 37,3 42,7 27,0 29,2 47,8 48,8 47,8

150,6 29,8 34,0 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 60,2

109,6 19,1

a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 100,6MHz)

Quadro 6 - Dados de RMN 13C de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura

(Mahato e Kundu, 1994).

60

Fi

gura

12

� Es

pect

ro d

e R

MN

13C

(75

MH

z, C

DC

l3) d

e B

T- 4

.

CH

2OH

HO

Bet

ulin

a

1

35

7

9

1113

15

17181920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

61

Após análise dos dados espectrais e comparação com os dados de literatura

do Infravermelho, da Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono

13, conclui-se que a substância BT- 4 trata-se de um triterpeno da série dos lupanos,

a Betulina (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).

6.1.2.3.1. � Dados Espectroscópicos da Substância Isolada Betulina (BT- 4):

Betulina: (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).

Fórmula Molecular: C30H50O2

IV √ máx cm -1 (KBr), (Figura 10): 3435, 2942, 2869, 1637, 1459, 1376, 1027.

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ1 H, mult. (H, J em Hz, nº H), (Figura 11)

4,68 m (H-29; 1H); 4,58 m (H-29; 1H); 3,78 dd (H-28; 10,2 e 3,9; 1H); 3,33 d (H-28;

10,8 e 3,0; 1H); 3,17 dd (H-3; 10,8 e 5,1; 1H); 2,37 m (H-19; 1H); 1,95 m (H-21; 2H);

1,68 m (H-30; 3H); 1,02 s (H-26; 3H); 0,97 s (H-27; 3H); 0,96 s (H-23; 3H); 0,82 s (H-

25; 3H); 0,75 s (H-24; 3H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ13C (C), (Figura 12) 38,8 (C-1); 26,9 (C-2); 78,9 (C-3); 38,8 (C-4); 55,2 (C-5); 18,2 (C-6); 34,1 (C-7); 40,8 (C-8);

50,3 (C-9); 37,2 (C-10); 20,7 (C-11); 25,1 (C-12); 37,2 (C-13); 42,6 (C-14); 26,9 (C-15); 29,1

(C-16); 47,7 (C-17); 48,7 (C-18); 47,7 (C-19); 150,4 (C-20); 29,6 (C-21); 33,9 (C-22); 27,9

(C-23); 15,3 (C-24); 16,0 (C-25); 16,0 (C-26); 14,7 (C-27); 60,4 (C-28); 109,6 (C-29); 19,1

(C-30).

62

7. RESULTADOS DOS ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

7.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas

Durante todo o período de observação, baseado nos dados contidos na ficha

padrão de triagem farmacológica, adaptada daquela descrita por Malone (1977),

nenhuma alteração comportamental que caracterizasse algum efeito do extrato nos

animais foi demonstrado. Ocorreu óbito em dois animais somente na dose de 100

mg/kg pela via intraperitoneal, até 4 horas após a administração do EES. As doses

do extrato etanólico de sucupira escolhidas para a realização dos demais testes

farmacológicos foram (100, 300 e 1000 mg/kg). A administração do extrato durante a

realização do teste de contorção abdominal induzida por ácido acético foi feita

utilizando duas vias, a via oral e via subcutânea, tendo em vista que essas não

provocaram morte nos animais durante o teste geral de atividade. No entanto, a via

subcutânea apresentou melhores resultados do que a via oral, e por isso foi à

escolhida para ser utilizada nos demais testes farmacológicos.

7.2. Atividade Antinociceptiva 7.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético

Comparado com o grupo controle, o EES foi capaz de reduzir o número de

contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. O grupo controle que foi

previamente tratado com veículo (água destilada), 45 minutos antes da injeção de

ácido acético (1,2 % i.p.) apresentou 76,3 ± 7,8 contorções em 30 min. Já o grupo

que foi tratado previamente com EES (1000 mg/kg s.c. ou p.o.) o número de

contorções abdominais diminuiu (26,6 ± 4,4), (48,5 ± 3,5), respectivamente. A

indometacina (10 mg/kg s.c.) também diminuiu o número de contorções (44,1 ± 7,1)

(Figura 13). Grupo de animais que foram tratados previamente pela via s.c. com as

frações FH (100 mg/kg), FD (114 mg/kg) ou FAcOEt (50 mg/kg), o número de

contorções reduziu significativamente naqueles tratados com as Frações FH (27,9 ±

4,5), FD (29,0 ± 6,0) em relação ao grupo controle (62,3 ± 9,0), enquanto que a

63

FAcOEt não reduziu o número de contorções de forma significativa (51,6 ± 7,1). O

controle positivo Indometacina, diminuiu o número de contorções (41,3 ± 6,1) (Figura 14). O pré-tratamento com Lupeol (70 mg/kg) reduziu as contorções em (40,1 ± 4,7)

em relação ao grupo controle (74,2 ± 7,3) e no grupo tratado com indometacina o

número de contorções foi de (40,0 ± 5,6) (Figura 15).

Figura 13 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em

salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela

via s.c. com veículo (V; grupo controle; n = 10), pela via s.c. e p.o. com o extrato

etanólico da casca do caule de P. emarginatus (EES; 1000 mg/kg, n = 10) ou com

indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 8) s.c.. As colunas e barras verticais representam

as médias ± EPM de cada grupo experimental.

** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey

*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de Tukey

0

3 0

6 0

9 0

**

***

**

V In d o 1 0 0 0 m g /k g E E S

s .c . p .o .

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s

64

0

15

30

45

60

75

* *

V FH100

FD114

FAcOEt50

Indo

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s



via s.c. com veículo (V), com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano

(FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) ou com indometacina (INDO;

10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12

animais por grupo experimental.

* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.

65

01 02 03 04 05 06 07 08 09 0

V L u p eo l In d o7 0

* *

Núm

ero

de C

onto

rçõe

s



via s.c. com veículo (V), com o Lupeol (Lupeol; 70 mg/kg) ou com indometacina

(Indo; 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 10

animais por grupo experimental.


66

7.2.2. Teste do �tail flick�

O tratamento prévio com o EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) não alteraram o

tempo para reação ao estímulo térmico, 2 horas após a administração. O tratamento

com morfina (10 mg/kg) usada como controle positivo, ampliou o tempo de latência

ao estímulo térmico, 30 minutos após a sua administração e continuou causando

antinocicepção até o tempo de 90 minutos (Figura 16).

-60 -30 0 30 60 90 120

0100200300400500600700

Veículo 10 mL/kgEES 100 mg/kgEES 300 mg/KgEES 1000 mg/KgMorfina 10 mg/Kg

Tempo do tratamento (min)

Tem

po p

ara

reaç

ão(%

do

tem

po z

ero)

**

*

Figura 16 - Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail flick em

camundongos antes e após tratamento com o veículo, com EES (100, 300 ou1000

mg/kg) ou morfina (10 mg/kg). Nas ordenadas estão representados os tempos dos

camundongos ao estímulo térmico nociceptivo expressos em porcentagem relativa

ao tempo zero. Os símbolos representam as médias ± EPM dos tempos para reação,

expressos em porcentagem relativa ao tempo zero imediatamente após a

administração em 6 animais por grupo experimental.


67

7.2.3. Dor induzida pela Formalina

A aplicação intraplantar de formalina 3% na pata posterior direita de

camundongos produziu intensa nocicepção em duas fases distintas: a primeira de 0

a 5 minutos (dor neurogênica) (Figura 17) e a segunda de 15 a 30 minutos (dor

inflamatória) (Figura 18). Nos animais previamente tratados (60 min) pela via s.c.

com veículo, a reatividade na primeira fase de nocicepção foi de 65,7 ± 6,3 s (n = 9)

e na segunda fase foi de 134,1 ± 19,8 s (n = 7). O pré-tratamento com EES (1000

mg/kg, s.c.) foi capaz de reduzir só a segunda fase de nocicepção, na primeira fase o

valor obtido foi de (44,3 ± 6,1 s, n = 8) e na segunda fase, a redução foi de (76,1 ±

13,7 s, n = 7). O grupo tratado com morfina (10 mg/kg s.c.) teve ambas as fases

reduzidas, sendo que a primeira fase foi reduzida em (22,7 ± 11,6 s, n = 7) e a

segunda fase em (30,0 ± 15,8 s, n = 7). No grupo tratado com indometacina (10

mg/kg, s.c.) a primeira fase não foi reduzida (65,8 ± 6,5 s, n = 6), porém a segunda

fase foi reduzida (44,3 ± 10,1 s, n = 6).

68

1ª Fase (0 � 5 minutos)

0

20

40

60

80

**

V EES 1000 Morf Indo

Tem

po d

e re

ação

(s)

Figura 17 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata

posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) do teste da

formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V;

n = 9), com o EES (1000 mg/kg, n = 8), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com

indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as

médias ± EPM.

** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.

69

2ª Fase (15 � 30 minutos)

0

40

80

120

160

200

*** **

V EES 1000 Morf Indo

*

Tem

po d

e re

ação

(s)

Figura 18 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata

posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15 � 30 min) do teste da

formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V;

n = 7), com o EES (1000 mg/kg, n = 7), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com

indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as

médias ± EPM.

***Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de Tukey.

**Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.

*Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.

70

7.3. Atividade Antiinflamatória

7.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton

O EES e o Lupeol reduziram o edema de orelha induzido pelo óleo de cróton.

No grupo controle, previamente tratado (60 min antes) com o veículo (s.c.), a

administração de óleo de cróton (2,5% v/v em solução de acetona) na orelha direita e

o mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos camundongos, gerou um

edema de 18,7 ± 1,1 mg (n = 9) em 4 horas. Nos animais que foram previamente

tratados com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg; s.c.) reduziu o edema em (13,1 ± 1,0

mg, n = 6), (10,7 ± 1,4 mg, n = 8) e (8,0 ± 1,9 mg, n = 6), respectivamente. O pré-

tratamento com dexametasona (2 mg/kg s.c.) reduziu o edema em (3,6 ± 0,7mg, n =

6) (Figura 19). Animais tratados previamente com Lupeol (35, 70 ou 140 mg/kg; s.c.)

cujos os resultados foram expressos como porcentagem relativa ao grupo controle, o

edema foi reduzido (110,25 ± 7,9, n = 8), (101,37 ± 6,0 mg, n = 8) e (70,93 ± 7,9 mg,

n = 8), respectivamente em relação ao grupo controle (173,29 ± 11,4). O pré-

tratamento com dexametasona (2 mg/kg; s.c.) reduziu o edema em (46,67 ± 3,9, n =

6) (Figura 20).

7.3.2. Peritonite induzida por carragenina

O EES reduziu significativamente o número de leucócitos migrados para o

peritônio no modelo de peritonite induzida por carragenina (Figura 21). O grupo

controle tratado com o veículo (s.c.), 4 horas após a administração de carragenina

1% (m/v i.p.) induziu a migração de 11,8 ± 1,0 x 106 leucócitos / mL (n = 9) para a

cavidade peritoneal. O pré-tratamento com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg s.c.)

reduziu a migração celular em (7,1 ± 1,1 , n = 6), (6,3 ± 5,7, n = 7) e (5,0 ± 3,5, n = 7)

x 106 leucócitos / mL. O pré-tratamento com dexametasona (2 mg/kg, n = 6, s.c.)

reduziu a migração celular em (4,3 ± 7,6 x 106 leucócitos / mL).

71

Figura 19 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em

acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com

extrato etanólico da casca do caule de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000

mg/kg, n = 6, 8 e 6, respectivamente) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6).

As barras verticais representam a média ± EPM.


*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de

Tukey.

0

5

10

15

20

*

***

V Dexa 100 300 1000E ES

*** ***

∆ P

eso

entr

e as

ore

lhas

(mg)

72

0255075

100125150175200

V 35 70 140 Dexa

Lupeol

* **

*∆ d

e Pe

so e

ntre

as

orel

has(

%)

Figura 20 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em

acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 10), com

Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg, n = 8) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n

= 6). As barras verticais representam a média ± EPM dos pesos das orelhas,

expressos em percentagem relativa ao controle. Os resultados foram expressos

como média ± EPM em porcentagem relativa ao grupo controle.


Os grupos tratados com as diferentes doses de Lupeol são significativamente

diferentes entre si (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.

73

0

5

10

15

*

V Dexa 100 300 1000

EES

Leuc

ócito

mig

rado

s/m

L

(X 1

06 )

***** ***

Figura 21 - Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por

carragenina (1% m/v), para a cavidade intraperitoneal de camundongos previamente

tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico da casca do caule

de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 7 e 7, respectivamente) ou

dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As barras verticais representam a média ±

EPM.




Tukey.

74

Discussão

75

8. DISCUSSÃO

Atualmente várias doenças permanecem com sua origem desconhecida,

sendo que algumas dessas doenças apresentam caráter inflamatório e doloroso que

persistem ao longo dos tempos. AINES, glicocorticóides, opióides e seus derivados

são exemplos de medicamentos bastante utilizados na terapêutica para aliviar os

sintomas que essas doenças causam (Gupta e Dubois, 2001).

Algumas evidências demonstram que um grande número de medicamentos

utilizados na terapêutica é derivado direta ou indiretamente de produtos naturais,

especialmente de plantas, sendo uma fonte inesgotável de possibilidades para a

descoberta de novos fármacos (Koehn e Carter, 2005). O uso de plantas medicinais

pela população não é suficiente para validá-las eticamente como medicamentos

eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas medicinais para serem usadas

oficialmente como medicamentos, devem ser fundamentadas em evidências

experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles que a

utilizam é suplantado pelos benefícios que possam obter (Simões et al., 2004).

No estudo fitoquímico realizado com a casca do caule de P. emarginatus, das

frações hexânica e diclorometano foram extraídos dois triterpenos da classe dos

lupanos, o lupeol e a betulina respectivamente. Alguns dos triterpernos dessa classe

exercem atividade antiinflamatória através da inibição da produção de óxido nítrico e

da prostaglandina E2 (Reyes et al., 2006). Tendo em vista o rendimento obtido da

substância Lupeol, foram feitos testes farmacológicos para avaliar a atividade

antiinflamatória e analgésica desse composto.

Em estudos feitos anteriormente com o lupeol, ele apresentou atividade

antiinflamatória e analgésica (Geetha e Varalakshmi, 2001; Agarwal e Rangari,

2003). Foi capaz de inibir a proliferação de células através da indução da apoptose,

exercendo dessa maneira ação antitumoral (Aratanechemuge et al., 2004). O lupeol

também apresentou atividade antimalárica, hepatoprotetora e antifúngica (Sunitha et

al., 2001; Fotie et al., 2006; Lall et al., 2006; Preetha et al., 2006). Nos estudos feito

com a betulina, foi mostrado que ela exerce atividade antitumoral, antiviral,

76

antimalárica, antifúngica e antiinflamatória, nesse caso, através da inibição da

enzima fosfolipase A2, (Sun et al., 1998; Pavlova et al., 2003; Lall et al., 2006; Sami

et al., 2006).

O diterpeno 14,15 diidroxigeranilgeraniol isolado do óleo essencial do fruto de

Pterodon pubescens Benth, além de exercer atividade antiinflamatória, é um dos

responsáveis pela ação profilática do óleo de P. pubescens sobre Schistossoma

mansoni em camundongos (Pimenta et al., 2006). Já o furano diterpeno 6α,7β-

diidroxivouacapan-17 β-oic, isolado do óleo do fruto de P. polygalaeflorus Benth

demonstrou ter atividade antiinflamatória no teste de edema de pata induzido por

carragenina (Carvalho et al., 1999).

No teste geral de atividades farmacológicas, os tratamentos com EES não

demonstraram nenhuma alteração comportamental, ocorrendo óbito somente pela

via intraperitoneal. Na via de administração e nas doses definidas através do teste

geral de atividades, o EES demonstrou ter efeito antiinflamatório e antinociceptivo

analisados através de alguns modelos de inflamação e de nocicepção em

camundongos. O lupeol, uma das substâncias isoladas do EES, também demonstrou

exercer efeito antiinflamatório e antinociceptivo nos modelos farmacológicos de

inflamação e de nocicepção utilizados para avaliar tais atividades.

Para verificar se o EES, as frações e o composto isolado Lupeol exercem

atividade analgésica e/ou antiinflamatória, utilizamos como modelo farmacológico, o

modelo da contorção abdominal induzida pelo ácido acético de acordo com a

metodologia empregada por Koster (1959). Onde o número de contrações da parede

abdominal, seguidas de torção do tronco e extensão de um dos membros posteriores

após a injeção intraperitoneal de ácidos fracos ou outros agentes inflamatórios, são

contadas durante 30 minutos (Tornos et al., 1999).

Esse modelo é considerado adequado para avaliar compostos que tem

atividade antinociceptiva. O próprio ácido acético causa dor, e ao mesmo tempo ele

estimula a liberação de mediadores endógenos envolvidos na modulação da

nocicepção, por exemplo, a PGE2, uma das prostaglandinas associadas a processos

77

fisiológicos de dor e inflamação (Shu et al., 2006). O modelo das contorções

abdominais em camundongos mostra-se sensível aos fármacos com atividades

analgésicas semelhantes à aspirina ®, aos antagonistas de receptores colinérgicos e

aos analgésicos opióides de ação central e periférica (Matos et al., 2004). Apesar

desse modelo ser sensível, a resposta antinociceptiva é pouco específica tendo em

vista que vários compostos essencialmente não analgésicos como os anti-

histamínicos, estimulantes do sistema nervoso central, antagonistas

serotoninérgicos, neurolépticos, dentre outros, também são capazes de inibir as

contorções (Rates e Barros, 1994). Faz-se necessário a realização de ensaios

complementares para a interpretação dos resultados desse teste.

Os resultados do presente estudo demonstram que, no modelo de contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético, o EES pelas vias s.c. e p.o. na maior dose

(1000 mg/kg), as Frações Hexânica (100 mg/kg) e Diclorometano (114 mg/kg), e o

composto isolado Lupeol na dose (70 mg/kg) ambos pela via s.c., apresentaram

atividade antinociceptiva, pois foram capazes de diminuir o número de contorções

abdominais acumuladas durante 30 minutos após a injeção intraperitoneal de ácido

acético 1,2% (v/v). Como era de se esperar, a indometacina, um antiinflamatório não

esteroidal, inibidor da COX-1 e da COX-2 (Craig e Stitzel, 2005), usada como

controle positivo no teste, também foi capaz de diminuir o número de contorções

abdominais.

A analgesia moderada produzida pelo ácido acetilsalicílico e pela

indometacina é explicada pela inibição da atividade da COX e redução da síntese de

PG (Vane, 1971). Entretanto, nos testes padrões em animais nos quais se induz uma

reação inflamatória, tem sido difícil a separação entre a influência da atividade

antiinflamatória desses compostos e entre um efeito analgésico singular (Hunskaar

et al., 1986).

A fim de diferenciar entre uma ação opióide central ou periférica, foi realizado

o teste do �tail flick�. Esse modelo de imersão de cauda mede o tempo de reação do

animal a um estímulo térmico, é sensível a compostos opióides tipo morfina (Janssen

et al., 1963), cujo efeito analgésico é devido à ação no sistema nervoso central

(Millan, 1986).

78

O EES administrado nos animais pela via subcutânea, nas doses (100, 300 ou

1000 mg/kg) não foi capaz de alterar o tempo de latência ao estímulo térmico

doloroso durante os 120 minutos de realização do teste, enquanto a morfina, que foi

o controle positivo do teste, aumentou o tempo de latência de modo significativo, até

90 minutos após o tratamento. Sugere-se então que o EES não atua através de

mecanismos de antinocicepção dependente de atividade analgésica central, o que

nos leva a crer que as substâncias presentes no EES exercem atividade

antinociceptiva através de mecanismos periféricos atuando como agonistas opióides

periféricos ou por induzirem a liberação de peptídeos opióides endógenos

perifericamente.

Tradicionalmente, os agonistas opióides exercem efeitos analgésicos através

de ação no sistema nervoso central, como ocorre com o fentanil ou a morfina (Herz e

Teschemacher, 1971; Milan, 1986). A utilização de análogos quaternários de

agonistas ou antagonistas opióides, por exemplo, os alcalóides N-metilmorfina e N-

metilnalorfina que possuem a mínima capacidade de atravessarem a barreira

hematoencefálica, parecem exercer o efeito analgésico através da atuação em

receptores opióides presentes nas terminações nociceptivas periféricas (Ferreira e

Nakamura, 1979 a,b,c; Ferreira et al., 1981; Smith et al., 1982).

A utilização de modelos de inflamação ocorre na quase totalidade dos estudos

que caracterizam a atividade antinociceptiva opióide periférica (Stein, 1993). Durante

o processo inflamatório o número de receptores opióides está aumentado (supra-

regulação) nos terminais aferentes periféricos (Hassan et al., 1993; Schäfer et al.,

1995). Esses receptores são ativados por peptídeos opióides endógenos produzidos

por células do sistema imunológico que migram para o tecido inflamado (Stein et al.,

1989; Przewlocki et al., 1992).

Os agentes opióides produzem analgesia através da ativação de receptores

opióides conhecidos como µ, δ ou κ. Os receptores opióides µ são responsáveis por

uma analgesia predominantemente supraespinhal e espinhal, e juntamente com

receptores δ e κ influenciam periféricamente os terminais nociceptivos das fibras

aferentes primárias C e A-δ. Desta forma há uma menor participação dos receptores

79

δ e κ no controle da dor a nível espinhal (Stein et al., 1989; Dickenson, 1991; Levine

et al., 1993; Kanjhan, 1995; Grubb, 1998; Law e Loh, 1999).

Outro teste realizado foi o teste da formalina em camundongos, esse teste foi

feito com o objetivo de melhor caracterizar a atividade antinociceptiva do EES. É um

modelo químico de nocicepção que fornece uma resposta mais específica

comparativamente ao modelo do ácido acético (Shibata et al., 1989; Tjǿlsen et al.,

1992). Esse ensaio consiste na injeção intraplantar de formalina 3% (v/v) na pata

posterior direita. A nocicepção causada pela formalina é caracterizada por vigorosas

lambidas, mordidas e batidas na pata injetada com o agente irritante. A aplicação

desse agente na pata posterior torna a resposta nociceptiva mais específica, tendo

em vista que o animal, durante o �grooming�, utiliza mais freqüentemente as patas

anteriores (Tjǿlsen et al., 1992).

Em roedores, o teste da formalina caracteriza-se por apresentar duas fases

distintas de nocicepção (Hunskaar et al., 1985; Dickenson e Sullivan, 1987; Cowan et

al., 1989). A primeira fase ocorre nos 5 primeiros minutos após a aplicação de

formalina (dor neurogênica) possivelmente ocasionada pela estimulação química

direta dos nociceptores (Dubuisson e Dennis, 1977; Hunskaar et al., 1985). Já a

segunda fase que ocorre entre 15 e 30 minutos (dor inflamatória) após a aplicação

da formalina e está relacionada com a liberação de vários mediadores pró-

inflamatórios como histamina, serotonina, prostaglandinas, dentre outros (Hunskaar

e Hole, 1987).

O pré-tratamento pela via subcutânea com EES na dose de 1000 mg/kg, que

produziu o efeito no modelo de contorções abdominais, foi capaz de inibir a segunda

fase do teste da formalina, à semelhança do efeito obtido com a indometacina

utilizada como padrão. A morfina, um agonista opióide de ação central e periférica,

inibiu ambas as fases da formalina.

A segunda fase da formalina pode ser inibida também por agentes

antiinflamatórios. Assim, a investigação dessa atividade também foi realizada através

de um modelo que mede a atividade antiedematogênica e um outro que quantifica a

inibição da migração de leucócitos para o foco inflamatório.

80

A atividade antiedemetogênica do EES e do Lupeol foi avaliada utilizando

para isso o teste de edema de orelha induzida por óleo de cróton. O óleo de cróton é

um agente irritante que provoca a migração de leucócitos causando edemas

intervasculares (Swingle et al., 1981). Esse teste apresenta sensibilidade aos

antiinflamatórios esteroidais e aos não esteroidais (Schiantarelli et al, 1982). Neste

ensaio, a formação de edema é induzida através da aplicação tópica do óleo de

cróton em solução com acetona, na orelha direita do camundongo.

A formação do edema em tecidos injuriados resulta no sinergismo entre vários

mediadores inflamatórios, além do aumento da permeabilidade vascular mediados

pelo aumento do fluxo sanguíneo. O desenvolvimento do edema é dividido em duas

fases: fase precoce observada em torno de uma hora, onde ocorre a liberação de

bradicinina, histamina e serotonina; e a fase tardia onde ocorre a liberação de

prostaglandinas (Miceli et al, 2005).

Portanto, deve-se considerar, ao interpretar os resultados deste ensaio,

fatores que influenciam a formação do edema, tais como a perfusão vascular do

tecido, pressão sanguínea sistêmica e nível de glicocorticóides, pois a intensidade do

edema é o parâmetro observado nesse teste quanto à ação antiinflamatória

analisada (Rates e Barros, 1994; Souccar e Lapa, 1997).

Em animais previamente tratados pela via subcutânea com EES (100, 300 ou

1000 mg/kg) e lupeol (35, 70 ou 140 mg/kg) e com a dexametasona que foi o

controle positivo do teste de edema de orelha induzida por óleo de cróton, foram

capazes de reduzir a formação do edema de maneira significativa. O lupeol foi

escolhido para ser avaliado quanto à atividade antiinflamatória visto que ele foi capaz

de inibir o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.

Entretanto, de acordo com os resultados obtidos, não foi possível distinguir em qual

das 3 fases de um processo inflamatório (aguda, tardia ou crônica) que o EES e o

lupeol atuaram.

Assim, não se sabe ao certo de que maneira ocorreu a ação

antiedematogência provocada pelo EES e pelo lupeol, o qual pode ter várias

explicações, como por exemplo, uma ação inespecífica gerando vasoconstrição,

81

mecanismos de inibição da migração celular, ou se foi por uma ação direta sobre a

cascata do AA, seja inibindo a COX e acil-hidrolases, dentre outras possibilidades

que existem (Faiçal e Uehara, 1998).

Relata-se que o lupeol exerce supressão de PGE2 e que a sua atividade

antiinflamatória é exercida possivelmente por prevenir a produção de mediadores

pró-inflamatórios (Agarwal e Rangari, 2003). O efeito antiinflamatório tópico do lupeol

detectado no teste de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, pode ser devido

ao efeito de proliferação de queratinócitos, especialmente pela hemisuccinilação

(Agarwal e Rangari, 2003).

Outro modelo utilizado foi o teste da peritonite induzida por carragenina, que

teve como objetivo avaliar a participação de mecanismos antiinflamatórios na

atividade antinociceptiva do EES. A carragenina, administrada intraperitonealmente

provoca uma reação inflamatória aguda, onde vários mediadores pró-inflamatórios

são liberados, principalmente a histamina, a serotonina, as cininas, as

prostaglandinas e os tromboxanos (Di Rosa et al., 1971; Damas et al., 1990). Esse

teste consiste na contagem do número de leucócitos migrados para a cavidade

intraperitoneal sob a ação de agentes quimiotáticos principalmente interleucinas e

leucotrienos, sendo sensível a ação de agentes antiinflamatórios esteroidais (Vinegar

et al., 1973; Higgs et al., 1980; Mikami e Miyasaka, 1983; Brooks e Day, 1991).

Nos animais previamente tratados com EES nas doses definidas

anteriormente, o número de leucócitos migrados para cavidade intraperitoneal

diminuiu significativamente, comparados com os animais tratados com veículo

(água). O que reforça a ação antiinflamatória desse extrato, vista anteriormente no

modelo que avaliou a atividade antiedematogênica. A dexametasona (glicocorticóide)

usada como controle positivo nesse teste, exerceu ação antiinflamatória de forma

eficiente, o que pode ser comprovado pela redução do número de leucócitos

migrados nos animais tratados com esse controle.

82

Esse resultado, somado ao resultado positivo no teste de edema de orelha

induzido por óleo de cróton sugere que o EES possui uma ação antiinflamatória,

assim como o Lupeol, de acordo com o modelo antiedematogênico. A ação

antiinflamatória vista através da redução da migração de leucócitos para o sítio

inflamatório, mostra a possível interferência do EES nos mecanismos quimiotáticos.

83

Conclusões

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9. CONCLUSÕES

• Lupeol e Betulina foram os componentes isolados das frações hexânica e

diclorometano, respectivamente.

• Baseado nos testes realizados, EES possui atividade antiinflamatória e

antinociceptiva.

• EES não exerce ação antinociceptiva através de mecanismo centrais, devido

ao teste de flexão de cauda não ter demonstrado resultado significativo.

• As Frações Hexânica e Diclorometano também demonstraram ter atividade

antinociceptiva e antiinflamatória nos testes realizados.

• O lupeol exerceu atividade antiinflamatória, e, portanto, parece ser um dos

compostos responsáveis por tal atividade, tanto do EES quanto da fração

hexânica.

• Esse estudo respalda o uso popular da casca de Pterodon emarginatus Vog

como antiinflamatório.

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Referências

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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94

Apêndice

95

APÊNDICE A � Tabelas de Dados Tabela 1 � Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina,

i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via

p.o. com veículo, pela via p.o. e s.c. com o extrato etanólico das cascas de P.

emarginatus (EES; 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com as frações hexânica (FH, 100

mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) (II), pela via s.c. com o Lupeol (70 mg/kg) (III) ou com indometacina (10 mg/kg).

I (EES)

Tratamento

Veículo

EES

Indometacina

Dose - Via

10mL/kg - s.c.

1000 mg/Kg - p.o.

1000 mg/Kg - s.c.

10 mg/Kg - s.c.

Número de contorções (Média ± EPM)

76,3 ± 7,8

48,5 ± 3,5 ** 26,6 ± 4,4 ***

44,1 ± 7,1 **

II (Frações) Tratamento

Veículo

FH FD FAcOEt

Indometacina

Dose - Via

10mL/kg - s.c.

100 mg/kg - s.c. 114 mg/kg - s.c. 50 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.


62,3 ± 9,0

27,9 ± 4,5 * 29,0 ± 6,0 * 51,6 ± 7,1

41,3 ± 6,1

96

III (Lupeol) Tratamento

Veículo

Lupeol

Indometacina

Dose - Via

10mL/kg - s.c.

70 mg/kg - s.c.

10 mg/kg - s.c.


74,2 ± 7,3

40,1 ± 4,7 * 40,0 ± 5,6 *




Tukey.

97

Tabela 2 � Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em

camundongos antes e após tratamento por via s.c. com o veículo (I), com EES 100

(II), 300 (III) ou 1000 (IV) mg/kg, ou morfina (V) (10 mg/kg).

I (Veículo)

Imersão das caudas (min)

-60 -30

0 30

60

90

120

Tempo (%) (Média ± EPM)

169,33 ± 36,95 99,00 ± 16,41

100 ± 0,00

142,00 ± 23,98

160,00 ± 26,50

172,16 ± 17,29

132,16 ± 16,34

II (EES 100 mg/kg)

Imersão das caudas

(min)

-60 -30 0

30

60

90

120

Tempo (%)

(Média ± EPM)

104,00 ± 15,59 94,33 ± 21,66

100 ± 0,00

225,16 ± 21,57

215,50 ± 38,03

132,50 ± 24,65

188,83 ± 24,28

98

III (EES 300 mg/kg)


-60 -30 0

30

60

90

120


121,00 ± 31,27 111,33 ± 22,88

100 ± 0,00

208,83 ± 38,62

199,83 ± 27,99

206,66 ± 20,65

295,50 ± 74,47

IV (EES 1000 mg/kg)


-60 -30

0 30

60

90

120


130,50 ± 19,92 142,00 ± 27,45

100 ± 0,00

232,83 ± 48,31

238,83 ± 42,52

194,16 ± 30,23

290,50 ± 51,01

99

V (Morfina 10 mg/kg)


-60 -30

0 30

60

90

120


73,33 ± 16,85 67,50 ± 7,85

100 ± 0,00

334,00 ± 67,54 * 464,16 ± 139,45 * 383,33 ± 106,73 *

295,33 ± 64,364


Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente

diferentes entre si (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.

100

Tabela 3 � Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata

posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) (I) e segunda

fase (15 � 30 min) (II) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via

s.c. com veículo, com o EES (1000 mg/kg), com morfina (10 mg/kg) ou com

indometacina (10 mg/kg).

I (Primeira Fase) Tratamento

Veículo

EES Morfina Indometacina

Dose - Via

10mL/kg - s.c.

1000 mg/kg - s.c. 10 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.

Tempo de Latência (Média ± EPM)

65,7 ± 6,3

44,3 ± 6,1 22,7 ± 11,6 **

65,8 ± 6,5

II (Segunda Fase) Tratamento

Veículo EES

Morfina Indometacina

Dose - Via

10mL/kg - s.c. 1000 mg/kg - s.c.

10 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.

Tempo de Latência (Média ± EPM)

134,1 ± 19,8 76,1 ± 13,7 *

30,0 ± 15,8 *** 44,3 ± 10,1 **




Tukey.

101

Tabela 4 � Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em

acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato

etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com o

Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg) (II) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg).

(I) EES

Tratamento

Veículo EES

Dexametasona

Dose - Via

10mL/kg - s.c. 100 mg/kg - s.c. 300 mg/kg - s.c.

1000 mg/kg - s.c. 2 mg/kg � s.c.

Diferença de peso entre as orelhas

(Média ± EPM)

18,7 ± 1,1 13,1 ± 1,0 * 10,7 ± 1,4 *** 8,0 ± 1,9 ***

3,6 ± 0,7 ***

II) Lupeol

Tratamento

Veículo Lupeol

Dexametasona

Dose - Via

10mL/kg - s.c. 35 mg/kg - s.c.

70 mg/kg - s.c.

140 mg/kg - s.c. 2 mg/kg - s.c.

Diferença de peso entre

as orelhas em % (Média ± EPM)

173,29 ± 11,4 110,25 ± 7,9 *

101,37 ± 6,0 * 70,93 ± 7,9 *

46,67 ± 3,9 *



Tukey.

102

Tabela 5 � Migração de leucócitos totais (x 106) no modelo de peritonite induzida por

carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos

previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P.

emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg).

Tratamento

Veículo EES

Dexametasona

Dose - Via

10mL/kg - s.c. 100 mg/kg - s.c.

300 mg/kg - s.c.

1000 mg/kg - s.c. 2 mg/kg � s.c.

Número de Leucócitos Migrados (106) (Média ± EPM)

11,8 ± 1,2 7,1 ± 1,5 * 6,3 ± 0,61 ** 5,0 ± 0,37 ***

4,3 ± 0,88 ***




Tukey.

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