Oficina de culinária simbiótica por danilo carvalho slide_01
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA.
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
LABORATÓRIO DE AMBIENTES RECIFAIS E
BIOTECNOLOGIA COM MICROALGAS
PATRICIA GIULIANNA PETRAGLIA SASSI
CIANOBACTÉRIAS MARINHAS DA PARAÍBA E RIO GRANDE
DO NORTE: CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES
BIOTECNOLÓGICAS
JOÃO PESSOA
2013
PATRICIA GIULIANNA PETRAGLIA SASSI
CIANOBACTÉRIAS MARINHAS DA PARAIBA E RIO GRANDE
DO NORTE: CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES
BIOTECNOLÓGICAS
Monografia apresentada
em cumprimento das
exigências para a obtenção
do título de Bacharelado
em Ciências Biológicas da
Universidade Federal da
Paraíba.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Sassi
Co-Orientador: Profa. Cristiane Francisca da Costa
JOÃO PESSOA
2013
PATRICIA GIULIANNA PETRAGLIA SASSI
CIANOBACTERIAS MARINHAS DA PARAIBA E RIO GRANDE DO NORTE:
ISOLAMENTO, CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES
BIOTECNOLÓGICAS
Aprovada em:________________________
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Dr. Roberto Sassi
(Orientador: Departamento de Sistemática e Ecologia/CCCEN/UFPB – Campus I)
_________________________________________
Dra. Beatriz Suzana Ovruski de Ceballos
Departamento de Biologia, Centro de Ciencias Biológicas e da Saúde, UEPB.
_________________________________________
Msc. Katharina Kardinele Barros Sassi
Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologia de Alimentos: UFPB
_________________________________________
MsC. Clediana Dantas Calixto
Programa de Pós Graduação em Química; UFPB
JOÃO PESSOA
2013
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por tudo que Ele providenciou em minha vida
durante todo o caminho na graduação, principalmente por nunca ter me deixado desistir
e por nunca me abandonar sempre me mostrando uma solução;
Agradeço à minha mãe, Rosa Cristina Petraglia Sassi, por quem tenho imenso
orgulho e amor. Obrigada pela educação ensinada, por me tornar uma pessoa cada vez
melhor, por me ensinar a sempre ter dignidade e amor ao próximo, por nunca ter
medido esforços na minha criação e na minha vida profissional, pelos conselhos, por ser
essa GUERREIRA que mesmo “chorona e mole” é uma mulher de extremo pulso forte.
Obrigada por ser uma mãe exemplar, pela força, coragem e, pelo IMENSO e
INCONDICIONAL amor oferecido aos seus filhos.
Ao meu pai, Roberto Sassi que além de PAI, foi meu professor e orientador.
Obrigada pelos ensinamentos da vida como pai e como professor, pelo incentivo, pelos
carões e que também, assim como minha mãe, ensinou-me a ser uma pessoa digna, e ter
respeito e amor ao próximo. Agradeço também pela extrema preocupação com minha
vida profissional. Obrigada por ser um pai exemplar, pela força, coragem e, pelo
IMENSO e INCONDICIONAL amor oferecido aos seus filhos.
Aos meus irmãos André e Renato, que além dos meus pais, eles são as pessoas
que eu mais amo nesse mundo (não sei viver sem eles). Obrigada meus irmãos por
serem seres humanos exemplares e com uma inteligência inigualável, os quais eu quero
me espelhar para o resto da minha vida. Muito obrigada por sempre estarem dispostos a
me ajudar no que eu precisar, pelo incentivo, preocupação, pelo AMOR e CARINHO
imenso que vocês me ofereceram (quando morávamos juntos) e me oferecem, e por fim
obrigada por eu ser a “Nega” mais amada e “paparicada” desse mundo. A vocês ofereço
o meu amor eterno;
Às minhas queridas e amadas cunhadas, Elisa e Katharina por cuidarem de uns
dos meus bens mais preciosos da minha vida, por oferecerem suas casas como refúgio
de estresse (principalmente nesse período da monografia) por serem além de cunhadas,
amigas-irmãs, que sempre me dão amor, carinho, conselhos e cuidado. Obrigada por
tudo, amo vocês;
À Lena, que durante todo este percurso agiu como uma MÃE, sempre me dando
amor, carinho e cuidado;
Aos meus familiares que moram em São Paulo e mesmo longe mostraram
preocupação e deram/dão muito amor e carinho quando os visito;
Aos meus amigos (irmãos), Cyntya, Derek, Rachel, Elói e Vinícius que ganhei
durante a graduação, por terem me proporcionado momentos alegres, de aprendizagem,
por terem aguentado meus aperreios durante as aulas e minhas “loucuras” que os
tiravam do sério, pelas noites e madrugadas de estudo, por dividirem momentos de
estresse e por fim, obrigada por serem meus amigos. Amo vocês;
À turma de Ciências Biológicas 2008.2, por terem dividido momentos de
felicidade (como a viagem à Cabaceiras) e estresse absoluto com provas, trabalhos e
seminários;
A todos os professores do curso de ciências biológicas, por terem contribuído
imensamente na minha formação acadêmica;
Aos companheiros do laboratório LARBIM (Aline, Jordana, Giuseppe, Evandro,
Viviane, Gabriel, Thamara, Clediana, Renata (Loba do mar)), por dividirem o estresse
do nosso orientador e por tornarem o ambiente de trabalho harmonioso.
À amigas (irmãs), Aline e Jordana que ganhei do LARBIM, pelos momentos
alegres (de compras e almoços deliciosos, principalmente), por me aguentarem
diariamente com meus ataques de histeria, pelos momentos tristes e de estresse
(desculpa Jordana!), e por todo auxílio que ofereceram para que esta monografia se
concretizasse;
À minhas amigas e irmãs de infância, Andréa, Jéssica, Camila e Jéssica Lisboa,
pelos momentos de imensa alegria que vocês me proporcionaram e me proporcionam,
pelos conselhos, confidência, pela compreensão de alguns períodos afastada de vocês
devido à minha vida acadêmica, pelo amor e carinho que vocês têm por mim. Levarei
vocês comigo sempre em meu coração;
Aos meus amigos do período escolar, Jéssica Lisboa, Camila Montenegro,
Kelson, Cecília, Rossana, Lívia e Agnes.
Aos meus amigos, Maria Gabriela, Pedro e Tito, pela amizade, momentos de
“biririris”, pelos sermões sempre na hora certa (dados por Gabi) e pelo apoio que vocês
ofereceram para o andamento desse trabalho. Obrigada por tudo, amo vocês.
Ao meu orientador Prof. Dr. Roberto Sassi por ter aberto as portas do seu
laboratório, pelo incentivo à pesquisa, por todo conhecimento científico oferecido
durante a graduação e por ter proporcionado, assim, uma melhor qualificação na minha
vida acadêmica. Obrigada também pelas aulas filosóficas, com pensamentos holísticos e
integradores sobre o mundo, que abrem nossa percepção mental e ambiental, e que nos
auxilia a compreender a humanidade;
À Prof. Dra. Cristiane Costa por ter sido minha orientadora durante um período
da graduação e pelos ensinamentos sobre os recifes de corais.
À Doutoranda Katharina Kardinele, por ter aceitado ser membro da banca
avaliadora, por todo conhecimento oferecido no laboratório e na minha formação
acadêmica.
Ao Prof. Dr. Roberto Antoniosi Filho do Laboratório de Métodos de Extração e
Separação da Universidade Federal de Goiás, pelas análises cromatográficas das
amostras de cianobactérias estudadas.
Ao CNPq pela concessão de bolsa ITI-A, através do projeto “Pesquisa,
Desenvolvimento e Inovação na produção de biodiesel de óleos derivados de
microalgas”, financiado pelo MCTI/FINEP.
RESUMO
Neste trabalho foram estudadas espécies de cianobactérias marinhas isoladas (e
mantidas em cultivo) de ambientes costeiros da Paraíba e Rio Grande do Norte (zonas
recifais, estuários e regiões infra-litorais rasas). Também foram obtidas amostras de
cianobactérias que vivem em associação simbiótica com invertebrados marinhos
(cnidários e esponjas). O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar espécies de
cianobactérias marinhas e estuarinas dos Estados da Paraíba e Rio Grande do Norte e
avaliar sua potencialidade para usos biotecnológicos. O material coletado foi levado em
condições herméticas ao Laboratório de Ambientes Recifais e Biotecnologia com
Microalgas (LARBIM). As amostras de água foram inoculadas em meio Conway,
constituído em água do mar filtrada e autoclavada. Todas as amostras inoculadas foram
mantidas numa câmara de cultura climatizada, a 25ºC ± 1ºC dotada de iluminação
mantida por lâmpadas fluorescentes tipo luz-do-dia, com fotoperíodo de 12 horas. As
cianobactérias que crescerem nos inóculos foram isoladas com microcapilares em
microcoscópio, transferidas para novo meio, sendo este procedimento repetido tantas
vezes quantas necessárias até se obter cultivos monoespececíficos. Cada cepa cultivada
foi codificada e incluída no banco de microalgas da Coleção de Microalgas da UFPB
(CMUFPB). Todas as cepas cultivadas foram identificadas ao menor nível taxonômico,
usando critérios diacríticos, seguindo procedimentos de taxonomia botânica. Os cultivos
foram interrompidos no início da fase exponencial. A biomassa obtida foi concentrada,
liofilizada e o rendimento de cada cultivo foi determinado em balança analítica. Foram
determinados, na biomassa obtida, os teores de ésteres metílicos de ácidos graxos, por
cromatografia gasosa. No total foram identificadas 17 espécies de cianobactérias nas
amostras isoladas, incluídas em 10 clones. Como conclusão deste trabalho nós temos
que diversas cepas de uma mesma espécie foram isoladas de diferentes habitats (água
do mar, zonas estuarinas, tecidos de invertebrados benticos), refletindo a variabilidade
de habitat que uma mesma espécie pode ocupar, sugerindo a existência de diferenças
químicas nos bioprodutos por elas metabolizados, em função das pressões do. As
cianobactérias estudadas quanto à sua capacidade de produção de FAME são pobres
nesses produtos, a exceção da cepa M3C (Synechocystis aquatilis), isolada nos recifes
costeiros do Cabo Branco, que apresentou cerca da metade dos teores de óleo
produzidos pela soja, em torno que 15% do ácido graxo EPA, um ômega 3 de grande
importância à indústria de alimentos e de alto valor de mercado.
Palavras chaves: Cianobacterias. Cultivo monoespecífico. Ômega 3. Cromatografia
gasosa.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Vista geral do banco de cultura de microalgas da UFPB mostrando a
manutenção das cepas...................................................................................
36
Figura 2 – Experimento de produção de biomassa em andamento, em balões de 6L com
aeração...........................................................................
36
Figura 3(A-F) – Cepas da cianobacteiras Synechocystis aquatilis cultivadas no
LARBIM/UFPB (M3C, isolada do Cabo Branco; M20C, isolada da praia do Jacaré,
estuário do rio Paraiba; M60C, isolada do Cabo Branco e M91C, isolada do estuário do
rio Mamanguape..........................................................................
40
Figura 4 – Romeria gracilis (cepa M6C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos
recifes costeiros do Cabo Branco...........................................................................
41
Figura 5 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos
recifes costeiros do Cabo Branco.............................................................
42
Figura 6 – Cepas da cianobacteiras Planktolyngbya limnetica cultivadas no
LARBIM/UFPB (M12C e M48C isoladas do Cabo Branco e M104C da praia de Jacaré,
estuário do rio Paraíba)...........................................................................................
44
Figura 7 – Cepas da cianobacteiras Synechococcus nidulans cultivadas no
LARBIM/UFPB (M38C, isolada de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco; M41C,
isolada de Protopalythoa variabilis dos recifes do Cabo Branco, M94C isolada da água
do mar da Praia de Pirangí, RN, M95C isolada da água do mar da Praia de Jacarapé e
M99C e M100C isoladas de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco.....................
46
Figura 8 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos
recifes costeiros do Cabo Branco.............................................................................
47
Figura 9 – Croococcus sp (cepa M62C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de
amostra de água do mar coletada Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba)...................
48
Figura 10 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido
para a espécie Synechococcus aquatilis (M3C).......................................................
50
Figura 11 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido
para a espécie Romeria gracilis (M6C).................................................................
51
Figura 12 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido
para a espécie Synechococcus nidulans (M41C)...................................................
51
Figura 13 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido
para a espécie Synechococcus aquatilis (M60C)....................................................
52
Figura 14 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido
para a espécie Synechococcus nidulans (M95C)....................................................
53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição do meio Conway (Walne, 1970) conforme utilizado nesta
pesquisa............................................................................................ 34
Tabela 2 – Relação das cepas de cianobactérias marinhas isoladas de diferentes
habitats dos estados da Paraíba e Rio Grande do Norte, mantidas em meio
Conway na Coleção de Microalgas da UFPB (CMUFP) no Laboratório de
Ambientes Recifais e Biotecnologia com Microalgas
(LARBIM/UFPB)..........................................................................................
39
Tabela 3 – Constante de crescimento (divisões celulares/dia), duração da fase
exponencial de cultivo (dias), rendimento em biomassa (mg/g) e totais de ésteres
metílicos de ácidos graxos (mg/g) das cianobactérias marinhas cultivados nesta
pesquisa em meio Conway.......................................................
49
Tabela 4 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos
obtidos para a espécie Synechococcus aquatilis (M3C)..................................
50
Tabela 5 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos
obtidos para a espécie Romeria gracilis (M6C)...............................................
51
Tabela 6 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos
obtidos para a espécie Synechococcus nidulans (M41C).................................
52
Tabela 7 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos
obtidos para a espécie Synechococcus aquatilis (M60C).................................
52
Tabela 8 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos
obtidos para a espécie Synechococcus nidulans (M95C)....................................
53
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12
2 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 17
2.1 Objetivos específicos ................................................................................................ 17
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................................... 18
3.1 Cultivo de cianobactérias e microalgas em geral ..................................................... 18
3.2 O potencial biotecnológico das cianobactérias ........................................................ 21
3.3 Cianobactérias tóxicas .............................................................................................. 27
3.4 Diazotrofia ................................................................................................................ 29
3.5 Taxonomia das cianobactérias ................................................................................. 30
4 METODOLOGIA ............................................................................................................ 34
4.1 Preparação dos meios de cultura ............................................................................. 34
4.2 Coleta, isolamento e manutenção dos cultivos ....................................................... 35
4.3 Crescimento das espécies em condições laboratoriais ............................................ 35
4.4 Análise do perfil dos ácidos graxos........................................................................... 37
4.5 Taxonomia das cianobactérias ................................................................................. 38
5 RESULTADOS ................................................................................................................ 39
5.1 Espécies isoladas e mantidas em culturas monoespecíficas .................................... 39
5.1.1 Synechocystis aquatilis Sauvageau 1892 (Ordem: Synechococcales; Família:
Merismopediaceae) (Fig. 3 A-F)...................................................................................... 40
5.1.2 Romeria gracilis (KOCZW.) KOCZW. ex GEITL. Rabenh.’s Krypt.-Fl. 14: 916, 1932.
(Ordem: Oscillatoriales; Familia; Pseudanabaenaceae ) (Fig. 4 A-B ) ............................ 41
5.1.3 Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Czech Phycol. 4: 14, 2004.
(Ordem: Oscillatoriales Familia: Phormidiaceae) (Figs. 5A-C) ........................................ 42
5.1.4 Planktolyngbya limnetica (Lemmermann) Komárková-Legnerová & Cronberg,
Algolog. Stud. 67:21, 22, 1992. (Ordem: Oscillatoriales Familia: Pseudanabaenaceae )
(Fig. 6-F) .......................................................................................................................... 43
5.1.5 Synechococcus nidulans (E. G. Pringsheim) Komárek, in P. C. Bourrelly, Les Algues
d’Eau Douce, III: 690.1970. (Ordem: Synechococcales; Familia: Synechococcaceae )
(Fig.7 A-F) ........................................................................................................................ 45
5.1.6 Spirulina labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont, 1892 (Ordem: Oscillatoriales,
Familia: Pseudoanabaenacea; Subfamilia: Spirulinoideae) (Fig. 8) ................................ 46
5.1.7 Croococcus sp (Ordem: Chroococcales, Familia: Chroococcaceae) (Fig. 9) .......... 48
5.2 Dados dos cultivos .................................................................................................... 48
5.3 Análise cromatográfica dos ácidos graxos das espécies selecionadas ..................... 49
6 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 54
7 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 59
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 61
1 INTRODUÇÃO
Cianobactérias, também conhecidas como cianofíceas ou algas azuis, são
organismos procariontes, aeróbios e fotossintetizantes, que possuem uma ampla
distribuição geográfica ocorrendo em diversas condições ambientais. O grupo abriga
cerca de 150 gêneros, dos quais 40 são potencialmente tóxicos. Surgiram no planeta
Terra há cerca de 3,5 bilhões de anos e foram indispensáveis para a conversão da
atmosfera primitiva à atual (SAHA et al., 2007).
As células vegetativas das cianobactérias caracterizam-se por possuírem
grânulos fosfatos, grânulos de glicogênio, grânulos de cianoficina e os carboxissomos
(STAINER; COHEN-BAZIRE, 1977). Além destas, algumas cianobactérias apresentam
células modificadas denominadas heterocistos que são permeáveis a todos os gases (N2,
O2, CO2, CO, H2, Ar, CH4) e às moléculas de água, contribuindo na regulação da célula
na coluna d’água (WALSBY, 1972). Nos heterocistos ocorre fixação do nitrogênio
atmosférico em condições anaeróbicas, o qual é transferido para as células vegetativas
(TONIETTO, 2009).
Alguns gêneros também podem apresentar outras células modificadas
denominadas acinetos que constituem uma estrutura capaz de promover resistência à
célula (STAINER; COHEN-BAZIRE, 1977). Os acinetos ocorrem em cianobactérias
filamentosas e se apresentam como células diferenciadas e aumentadas, são formadas
em condições desfavoráveis, como em situações de baixa intensidade luminosa,
mudanças do pH e da temperatura, e em baixas concentrações de nutrientes. Eles
guardam, em seu interior, grânulos com substâncias de reserva e atuam como esporos de
resistência. Uma vez liberados ao meio em situaões de estresse entram em divisão
quando as condições são novamente favoráveis, originando um novo filamento.
As cianobactérias também apresentam células que contêm clorofila-a e outros
pigmentos acessórios característicos, como ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina,
contidos em tilacóides e responsáveis pela coloração verde-azulada característica do
grupo (LORENZI, 2008)
Filogeneticamente, as cianobactérias estão incluídas no grupo das bactérias
gram-negativas, com distribuição cosmopolita. Podem ser encontradas nos ambientes:
marinho, estuarino e de água doce, vivendo livremente no plâncton ou associadas a
algum tipo de substrato como rochas, sedimento arenosos e lodosos, ou como epífitas,
epizóicas e até mesmo como endossimbiontes.
13
Muitas cianobactérias são psamófilas, vivendo entre os grãos de sedimento. O
hábito psâmico indica a relação desse grupo com as condições de umidade, ao
ressecamento, à natureza do substrato, à temperatura e à reação do movimento da água,
mostrando as exigências ecológicas multiformes das cianobactérias. Seu crescimento
torna-se intenso, a ponto de alterar a coloração da areia (GARCIA-BAPTISTA;
BAPTISTA, 1992). Elas podem viver livres, agregadas aos grãos de sedimento ou em
tubos de mucilagem secretados em suas atividades metabólicas (ROUND, 1983).
Muitas espécies também colonizam pântanos salinos, solos úmidos, raízes de
leguminosas e ambientes extremos como fontes termais, hidrotermais e lagos
hipersalinos, até regiões árticas e antárticas, e diversas espécies vivem endoliticamente
em esteiras microbianas (DAMÁZIO et al., 2005; SINHA; HADER, 2008).
A razão deste sucesso adaptativo tem raízes históricas e é largamente dependente
da versatilidade morfológica e funcional desses organismos. As cianobactérias são os
mais primitivos procariontes fotoautotróficos que supostamente apareceram no planeta
durante o período Précambriano, considerado também a “Era dos estromatólitos”
(SRIVASTAVA, 1997), e “Idade das cianobactérias” (HOEK et al., 1998), devido à
biota estar dominada por estes organismos (SILVA et al., 2004), e por persistiram como
os únicos seres fotossintetizantes oxigênicos por um período de 2 a 3 bilhões de anos.
Os estromatólitos são estruturas organo-sedimentares litificadas cuja formação ocorre
devido ao trapeamento dos sedimentos com minerais precipitados a partir de
comunidades microbianas bentônicas. As construções estromatolíticas apresentam três
estágios de desenvolvimento: esteiras microbianas, estromatólitos estratiformes e
estromatólitos individuais (SILVA; SILVA, 2002), onde são verificadas espécies de
cianobactérias cocóides e filamentosas (HORODYSKY et al., 1977; SILVA et al.,
2004).
Alterações nas condições do ambiente, particularmente no pH, dióxido de
carbono, matéria orgânica, alcalinidade, nitratos e fosfatos são fatores importantes na
determinação da distribuição das cianobactérias (PODDA et al., 2000). A alta
diversidade de hábitats e a consequente divergência ecológica podem explicar a ampla
diversificação de morfótipos e especiação dos tipos cianobacterianos. Esta
diversificação é baseada, muito provavelmente, em uma adaptabilidade rápida e a
estabilização genética de novos ecótipos e morfótipos em novos ambientes
(REJMANKOVA et al., 2004).
14
Sua ampla variação morfológica mostra cianobactérias unicelulares, coloniais e
filamentosas. Os filamentos são formados a partir dos tricomas (uma cadeia de células
que podem ou não estar envoltas por uma bainha de polissacarídeos). Já os grupos
coloniais estão imersos em uma bainha que confere à célula um contorno irregular ou
esférico (CHORUS; BARTRAM, 1999).
A maioria das cianobactérias se reproduz por divisão celular ou pela formação
de esporos, mas no caso das filamentosas, além dessas formas já citadas, a reprodução
pode ocorrer por formação de hormogônios que são pequenas partes de tricomas que se
destacam para formar novos filamentos (CHORUS; BARTRAM, 1999).
Segundo Hoffmann (1996), a consideração de diversos fatores relacionados à
ecofisiologia e capacidades de dispersão, como por exemplo, temperatura, distribuição
de habitats, dispersão e especiação podem resultar em explicações possíveis para os
diferentes padrões de distribuição geográfica das cianobactérias e colonização dos
distintos habitats.
No plâncton de água doce e marinho, algumas espécies podem formar densas
florações em determinadas situações, que se estendem por várias dezenas ou até mesmo
centenas de metros, formando manchas na superfície do mar visíveis à distância.
Associadas ao ambiente bêntico marinho, algumas espécies crescem profusamente em
certos habitats (DE PHILLIPPIS et al., 2005) formando tufos e mucilagens que podem
se aderir a corais, algas e invertebrados marinhos (CHARPY et al., 2012), podendo se
desenvolver, em alguns casos, como culturas praticamente monoespecíficas.
Contribuições das cianobactérias na formação de tapetes microbianos e seu
papel nas cadeias alimentares da zona intertidal foram investigados em vários estudos
(JAVOR; CASTENHOLZ, 1984; FARMER, 1992; WHITTON; POTTS, 2000; AL-
THUKAIR; ABED; MOHAMED, 2007). Muitas espécies são predadas por peixes,
moluscos e diversos herbívoros do macro e do mesozooplâncton e como método de
defesa aos predadores muitas delas produzem potentes toxinas (CHARPY et al., 2012).
Alguns gêneros e espécies de cianobactérias halotolerantes possuem
mecanismos específicos que ajustam intracelularmente o seu status osmótico (APSE;
BLUMWALD, 2002) devido à produção de moléculas osmoprotetoras como glicina,
betaina, trealose e glicerol (LALOKNAM et al. 2006). Pela sua habilidade
fotossintetizante as cianobactérias ocupam um papel de destaque no ciclo global do
carbono, e desde que muitas espécies também são diazotróficas (CAPONE et al., 2005)
15
também desempenham importante papel no ciclo do nitrogênio, particularmente em
áreas oceânicas.
Cianobactérias marinhas produzem metabólitos secundários com potentes
atividades anti-cancer, anti-tumorais e antimicrobianas, além de apresentarem
propriedades biotóxicas (GERWICK et al., 2008). Inúmeras espécies também são fontes
potenciais de diversos produtos naturais biologicamente ativos de interesse químico,
como bio-fertilizantes e combustível renovável (LEM; GLCK, 1985), além de outros
compostos de interesses para a indústria farmacêutica e de alimentos. Recentemente
também tem aumentado o interesse no uso das cianobactérias para propósitos de
bioremediação e controle de poluição, inclusive em processos que envolvem a
degradação de óleos combustíveis e biocombustíveis.
No grupo ocorrem inúmeras espécies que são reconhecidamente tóxicas a
animais aquáticos e ao homem sendo que tais organismos podem provocar desde
alergias leves até a morte por ações neurotóxicas, hepatóxicas ou citotóxicas. De acordo
com Carmichael (2001), as cianotoxinas formam um grupo diverso de substâncias
químicas e o alvo de seu efeito em vertebrados é utilizado para separá-las em
hepatotoxinas (microcistinas e nodularinas), neurotoxinas alcalóides ou
organofosforados (anatoxina-a, anatoxina-a(s) e saxitoxinas), citotoxinas
(cilindrospermopsinas), dermatotoxinas (lyngbyatoxinas) e toxinas irritantes
(lipopolissacarídeos). Alguns autores acreditam que a função ecológica das cianotoxinas
se deve à proteção contra a herbivoria ou por alguma outra condição que proporciona o
stress.
No Brasil, as cianobactérias têm sido particularmente estudadas em ambientes
dulcícolas, especialmente nos aspectos taxonômico, com base na morfologia,
usualmente empregando-se a avaliação taxonômica botânica. Mas apesar da sua grande
importância do ponto de vista ecológico da engenharia sanitária, ainda é pequeno o
conhecimento da diversidade das cianobactérias de ambientes aquáticos brasileiros
(SANT’ANNA et al., 2007), bem como há carência de informações ecológicas sobre
muitas espécies.
Os estudos da biodiversidade das cianobactérias marinhas bentônicas, realizados
por Halperin (1967, 1970, 1974) no litoral da Argentina contribuíram muito para o
conhecimento da diversidade do grupo no Atlântico sul, mas nos ecossistemas costeiros
ao longo da costa brasileira o grupo tem sido bastante menosprezado e a escassez de
informações a respeito é imensa, fazendo-se necessário um estudo amplo e detalhado da
16
biodiversidade das cianobactérias do litoral brasileiro. A despeito de o Brasil possuir
mais de 8000 km de costa e ambientes recifais que se estendem por mais de 2000 km ao
longo da costa brasileira, nenhum trabalho enfocando o grupo foi conduzido até o
momento em recifes.
Em ambientes costeiros, o grupo tem sido estudado particularmente em estuários
e manguezais (BRANCO, 1994; NEVES, 1991; 1992; BRANCO et al., 1996;
BRANCO et al. 1997; BRANCO et al., 2003; JOLY, 1957; OLIVEIRA, 1984;
CARMO,1987; SANT´ANNA, 1988; MOURA, 1991; FROIS-ABREU, 1939;
DAMÁZIO, 1979/1980a; 1979/1980b; DAMÁZIO; SANTOS, 1985, 1990; CUTRIM,
1998) sendo a referencia pioneira o trabalho de Möebius (1889), que reportou a
ocorrência de Microcoleus chtonoplastes. Em manguezais de Joinville, Santa Catarina.
Outros estudos incluem os trabalhos desenvolvidos por Baeta-Neves (1992): Baeta-
Neves; Tribuzi (1992), Sant´Anna; Simnonetti (1992), Nogueira; Ferreira-Correia
(2001); Branco et al. (2003).
Os estudos disponíveis sobre o tema também incluem os trabalhos realizados nos
estados do Maranhão (NOGUEIRA; FERREIRA-CORREIA 2001), Pernambuco
(MOURA 1991; MOURA et al. 2000), Rio de Janeiro (BAETA-NEVES; TRIBUZI,
1992) e São Paulo (BRANCO et al. 1994, 1996, 1997; SANT´ANNA, 1988). Melo
Magalhães et al. (2009) citam 31 espécies de cianobactérias encontradas em associação
com outras espécies fitoplanctônicas na Lagoa de Mundaú, Alagoas. Na Paraíba, apenas
5 espécies são referidas para o ambiente marinho (SASSI, 1991).
Neste trabalho nós isolamos diversas espécies de cianobactérias marinhas dos
estados da Paraíba e Rio Grande do Norte identificando-as taxonomicamente e
realizamos ensaios laboratoriais de cultivo avaliando as respostas dessas espécies às
condições de cultivo e discutimos o seu potencial para a produção de alguns bio-
produtos que possam ter interesse econômico.
17
2 OBJETIVO GERAL
Isolar e identificar taxonomicamente espécies de cianobactérias marinhas dos
estados da Paraíba e Rio Grande do Norte e avaliar sua potencialidade para usos
biotecnológicos, a partir de cepas isoladas de habitats marinhos e estuarinos, incluindo
espécimes associadas a invertebrados bênticos recifais.
2.1 Objetivos específicos
a) Obter culturas monoespecíficas de cianobactérias marinhas e estuarinas do Estado da
Paraíba e Rio Grande do Norte isoladas de amostras do plâncton e de tecidos
extraídos de cnidários e esponjas.
b) identificar ao menor nível taxonômico possível as cepas isoladas em cultivos
monoespecíficos, a partir de critérios morfológicos;
c) caracterizar as respostas de crescimento das cianobactéria mantidas em culturas
monoespecíficas em condições laboratoriais de cultivo;
d) comparar as diferentes espécies de cianobactérias mantidas em culturas
monoespecíficas quanto à produção de biomassa e velocidade de crescimento;
e) avaliar o potencial de utilização biotecnológica das espécies levando em conta a sua
capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos.
18
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Cultivo de cianobactérias e microalgas em geral
Tradicionalmente as cianobactérias têm sido cultivadas usando as mesmas
técnicas e métodos empregados para os cultivos das microalgas em geral. Isso porque,
as cianobactérias são microorganismos fotoautotróficos que ainda hoje são incluídas no
vasto grupo das microalgas pelo simples fato de que tradicionalmente suas bases
taxonômicas e nomenclaturais seguiram os procedimentos adotados pelo código de
nomenclatura botânica, como é feito para as algas em geral.
O uso do termo microalgas não tem nenhuma conotação taxonômica visto que
inclui distintos grupos de prototistas e é de natureza polifilética. Nele também estão
incluídas clorofíceas, bacilariofíceas, dinofíceas, euglenofíceas, eustigmatofíceas,
xantofíceas, glaucofíceas, entre outros.
Os cultivos intensivos de microalgas representam hoje um dos mais modernos
processos da biotecnologia e a partir desses cultivos é possível obter-se alimento e
alguns produtos de interesse nutricional, farmacológico e industrial a custos muito
inferiores do que aqueles empregados pela agricultura tradicional e numa velocidade de
produção muito mais rápida (http://www.spirulinasource.com/earthfoodintro.html).
Historicamente, o primeiro cultivo unialgal foi obtido por Beijerinck em 1890
com Chlorella vulgaris (clorofícea) e os primeiros estudos fisiológicos empregando
essas culturas foram realizados por Warburg por volta de 1900. Mas foi somente por
volta de 1950 que os cultivos em massa desses organismos começaram a receber mais
atenção. O livro clássico de Burlew (1953) procurou sumarizar o conhecimento a
respeito na época e a partir de então o interesse nos cultivos de microalgas tem crescido
continuadamente.
Desde que várias espécies podem conter mais de 50% de proteína (BECKER,
1995) o aproveitamento mais promissor das microalgas é a produção de alimento. Mas
elas também têm importância ambiental muito grande, porque podem ser utilizadas no
controle da qualidade da água, particularmente na remoção de compostos tóxicos,
incluindo amônia (NH3) e nitrito (NO2) em efluentes de carcinicultura (VÍLCHEZ et al.,
1997; CHUNTAPA; POWTONGSOOK; MENASVETA, 2003) e na remoção de
compostos nutricionais em estações de tratamento de água. Nesses casos a biomassa
19
algácea aumenta consideravelmente levando à depleção de oxigênio, sendo necessária
sua remoção frequente (VÍLCHEZ;VEGA, 1994; KAYA et al., 1995).
Muitos estudos básicos com microalgas mantidas em culturas já foram
desenvolvidos. Esses estudos têm enfocado diversos aspectos como efeitos das
condições fóticas sobre os cultivos (QURAISHI; SPENCER, 1971; GRIFFTHS, 1973;
FAWLEY, 1984; SAVIDGE, 1986); temperatura (MORRIS; CLOVER, 1974;
GOLDMAN, 1977a; GOLDMAN; MANN, 1980; RAIMBAULT, 1984; 1986),
salinidade (SHIMURA; SHIBUYA; ICHIMURA, 1979; SCHOBERT, 1980; BLINN,
1984; BRAND, 1984), absorção de compostos nitrogenados (CRESSWELL; SYRETT,
1979; RAIMBAULT, 1984), guanina (SHAH; SYRETT, 1982), aminoácidos (FLYNN;
SYRETT, 1985, 1986a,b), amônia (GOLDMAN; GLIBERT, 1982), excreção
(RAIMBAULT, 1986), aqüicultura (WALNE, 1970; GUILLARD, 1975; SIMNON,
1978; OKAUCHI; HIRANO, 1986; SCOTT; BAYNES, 1978; BEM-AMOTZ et al.,
1987; WALSH et al., 1987), composição química, neste caso objetivando-se a
alimentação de animais em cativeiro (WHYTE, 1987; BROWN, 1991; BROWN et al.,
1997, 1998; LOPES-MUÑOZ et al., 1992; O’CONNOR, NELL; DIEMAR 1992;
SOUTHGATE et al., 1998; CAERS, COUTTEAU, 1999), constituição química das
microalgas em diferentes condições de cultivos (ANTIA et al., 1977; GOLDMAN,
1980; FABREGAS et al., 1984, 1985, 1987; OJEDA; AFONSO, 1986; WIKFORS,
1986; NELSON et al., 1992; SUKENIK; YAMAGUCHI; LIVNE., 1993; LOURENÇO
et al., 1997; FIDALGO et al., 1998; SAUODIS-HELIS et al., 1999; VALENZUELA-
ESPINOZA; MÍLAN; NÚNEZ, 2002) e outros estudos ecológicos diversos envolvendo
relações interespecíficas como competição (GOLDMAN; DENNET; RILEY, 1982;
RIJSTENBIL, 1988) e alelopatia (SHARP, UNDERHILL e HUGHERS, 1979).
A literatura que trata dos estudos sobre cultivos de microalgas é muito vasta,
demonstrando que o tema vem de longo tempo recebendo a atenção de pesquisadores no
mundo todo. Outras abordagens que foram conduzidas com esses organismos incluem
estudos sobre fotossíntese, bioensaios de toxicidade, bioensaios de enriquecimento
visando determinar compostos nutricionais limitantes, tolerância de espécies à
dessecação e escuridão de células vegetativas e esporos de resistência, excreção e
absorção de compostos, entre outros assuntos (NAKANISHI; MONSI, 1965;
RAIMBAULT, 1984; 1986; LOMBARDI, 1990; BERLAND et al., 1973;
HARGRAVES e FRENCH, 1975; QUARMBY et al., 1982; POULET e MARTIN-
JÉZÉQULl, 1983; MYKLESTAD et al., 1972).
20
No Brasil, a maior parte das pesquisas sobre este tema tem-se restringido a
estudos laboratoriais em condições controladas, principalmente sobre aspectos
metodológicos (VIEIRA, 1975, 1977), ecológicos e eco-fisiológicos (VIEIRA;
TUNDISI, 1978), meios alternativos (CASTRO, 1979; GONZALEZ-RODRIGUEZ;
MAESTRINI, 1983, OLIVEIRA; KOENING, 1984, TRIANI et al., 1984, 1986;
OLIVEIRA, 1988; MELO et al., 1993) e análises bioquímicas (TALAMONI et al.,
1988; KOENING; MAIA,; CAMPOS-TAKAKI, 1990, LOURENÇO et al., 1997),
principalmente. Estudos envolvendo cultivos em massa visando obtenção de biomassa e
possibilidades de usos tecnológicos foram iniciadas mais tarde, particularmente a partir
dos trabalhos de Derner (2006).
O cultivo de microalgas pode ser considerado um sistema biológico muito
eficiente no armazenamento de energia solar, através da produção de compostos
orgânicos via processo fotossintético, sendo que a maioria das espécies apresenta
crescimento mais rápido que as plantas terrestres, possibilitando maior rendimento de
biomassa (VONSHAK, 1990). Além disso, culturas puras desses organismos também
são essenciais para o estudo de vários aspectos de sua biologia e fisiologia.
No caso particular das cianobactérias, que é o objeto desse trabalho, os cultivos
são muito susceptíveis às variações físicas e químicas, da luz, salinidade, temperatura e
nutrientes (BOOMIATHAN, 2005; SEMYALO, 2009). Sendo o seu crescimento
influenciado por diversos fatores torna-se necessário avaliar as condições ótimas para o
seu cultivo em massa visando aplicações tecnológicas.
Os requerimentos para o sucesso dos cultivos das cianobactérias variam de
espécie para espécie e normalmente pode ser necessário fazer algumas modificações no
meio e nas condições de cultivo (RIPPKA et al., 1979; ALLEN; ARNON, 1955). As
espécies marinhas, por exemplo, tem um requerimento adicional dos íons Na+, Cl
-, Mg
+
e Ca+ para o seu crescimento ótimo (RIPPKA et al., 1979). Diversos meios líquidos
foram modificados para o cultivo de espécies marinhas e de água doce, como por
exemplo: ASN-III, MN, e BG11 (RIPPKA et al., 1979), ASP-2 e SAG1 (PROVASOLI
et al., 1957; RIPPKA, 1988). Para algumas espécies o meio Conway (WALNE, 1970),
também utilizado para o cultivo de diatomáceas, tem demonstrado resultados muito
eficientes.
No processo de isolamento e manutenção do cultivo monoespecífico de
cianobactérias facilmente ocorre contaminação do material por outros organismos
microscópicos, sejam fotossintéticos ou não. Para isso muitos trabalhos foram
21
desenvolvidos com o intuito de descobrir novas alternativas para a obtenção de cepas
monoespecíficas. Mas a obtenção de culturas axênicas não é fácil de ser atingida, pois
usualmente todos os cultivos de organismos fotoautotróficos são fácilmente
contaminados por bactérias heterotróficas. A utilização da azida sódica e fluoreto de
sódio na inibição da cadeia transportadora de elétrons e da glicólise pode ser um bom
procedimento de modo que apenas organismos fotossintetizantes sobrevivam tendo este
método sido aplicado no cultivo das espécies Aphanothece halophytica e Chroococus
minutus, ambas cianobactérias marinhas (MELO; BAETA NEVES; BAPTISTA, 2011).
Outros procedimentos descritos na literatura incluem o uso de antibióticos seletivos que
inibem o crescimento de bactérias, mas que são ineficazes às cianobactérias produtoras
de mucilagem, pois tal composto abriga e protege esses organismos dos antibióticos
(CHO et al., 2002).
3.2 O potencial biotecnológico das cianobactérias
O interesse pelas cianobactérias tem crescido profusamente nas últimas décadas,
a notar pelo volume de publicações sobre o grupo e pela quantidade de informações
divulgadas pela internet, quer seja em termos de documentação científica e educacional,
divulgações de eventos científicos, usos econômicos, perigos à saúde publica e
ambiental, e aplicações industriais.
No Google, são listadas 70 páginas (Janeiro de 2013) que cobrem uma grande
diversidade de assuntos sobre cianobactérias, colocando à disposição dos usuários da
rede mundial de computadores o que existe de mais atual a respeito. Inúmeras outras
páginas relacionadas são também referidas, evidenciando que este assunto penetra em
outras áreas de interesse, a exemplo da importância paleontológica dos estromatólitos e
trombólitos, cujo interesse no assunto tem crescido profusamente, inclusive no Brasil, e
até mesmo sobre ciências espaciais e planetárias visando à colonização do espaço. O
youtube fornece diversos filmes que mostram em detalhes magníficas imagens de
espécies, de florações de espécies, da formação da atmosfera, tratamento de águas e
esgotos, cultivo, produção de biocombustíveis, e outros usos.
Os artigos científicos publicados sobre o grupo tem aumentado a cada década.
Uma busca sobre as principais pesquisas monitoradas pelos scirus.com mostra que de
1920 a 1980 (60 anos) foram divulgados 1849 artigos em Html, 315 em pdf, 1 em ppt e
22
1 documento word, enquanto que somente nas últimas duas décadas (1990 a 2010)
foram divulgados 94746 artigos em html, 46345 em pdf, 1018 em ppt, 35 em OS e 1
TeX. E somente nos últimos meses de 2012 até o mês de fevereiro de 2013 já foram
monitorados pelo scirus.com 2.524 artigos em html e 1.095 artigos em pdf. Só o
interesse aplicado desse microorganismos relacionam assuntos dos mais variados
possíveis, que incluem desde a produção de hidrogênio (DUTTA et al., 2005),
engenharia ambiental, fotobiologia, bioenergética molecular, bioinformática, pesquisas
pós genômicas, engenharia genética, dentre tantas outras frentes de ponta.
Indubitavelmente, o assunto está em alta, e deverá crescer ainda mais. Por trás
desse interesse estão as múltiplas possibilidades do uso biotecnológico das
cianobactérias. Em função das inúmeras aplicações dos produtos derivados desses
organismos. Só a indústria de alimentos e a produção de fármacos e medicamentos
mostram um potencial de crescimento inesgotável. Alimentos, cosméticos e corantes
extraídos das cianobactérias deverão contribuir com grande parcela das necessidades
nas sociedades futuras. E as pesquisas sobre produção de energia a partir de
cianobactérias apontam para possibilidades ainda mais relevantes.
Nesta conjuntura de expansão da biologia das cianobactérias torna-se essencial a
busca e estudos de novas espécies (isolar e purificar) e estabelecer um conjunto que
pode ser uma porta para a exploração biotecnológica (SHAH et al, 2000). As
cianobactérias marinhas, por exemplo, são reconhecidamente consideradas como
prolificas produtoras de metabolitos secundários bioativos (GERWICK et. al., 2001;
TAN, 2007; CARMICHAEL, 2001; CODD, 1997) e muitos desses compostos têm
elevada importância biotecnológica visto que podem ser importantes fontes de agentes
farmacêuticos como vitaminas (TAN; GOH, 2009) e substancias antimitóticas e
antimicrobianas. Os compostos Apratoxina A (LUESCH et al., 2001), largazole
(TAORI et al.,2008) e hantupeptina A (TRIPATHI et al.,2009), por exemplo, tem sido
estudadas como drogas anticancerígenas; combustíveis e compostos químicos finos
além de muitos outros produtos (DEVRIES et al., 1993; MIURA et al., 1993; MUNDT
et al., 2001), são outros exemplos.
A importância das cianobactérias para a biotecnologia destaca-se entre os
modernos processos microbiológicos com inúmeros trabalhos e frentes de pesquisa
desenvolvidos nas ultimas décadas (NAGARAJAN; MARUTHANAYAGAM;
SUNDARARAMAN, 2012; http://www.algenolbiofuels.com/). Esses organismos
fotoautotróficos oxigênicos produzem mais de 600 metabólitos secundários, muitos com
23
inibição sobre várias proteínas, constituindo uma fonte de produtos com potencial
farmacológico ainda desconhecido (SAMPAIO; CARNEIRO; PINTO, 2011). Além da
produção de toxinas por inúmeras espécies, também foram isolados de cianobactérias
um grande número de substâncias ativas com potencial biológico antibacteriano,
antiviral, fungicida, de inibição de enzimas, com atividade imunossupressora, efeitos
citotóxicos e algicida (MUNDT et al., 2001).
Algumas das espécies podem fixar nitrogênio e assim desempenharem um
importante papel no balanço global de nitrogênio nos oceanos (CARPENTER;
ROMANS, 1991) e pelo mesmo motivo diversas espécies são relevantes para a
agricultura VAISHAMPAYAN et al., 2001) e muitas tem sido uma grande promessa
para propósitos de biorremediação (PATTERSON,1996).
De acordo com Nagaragan; Maruthanayagam; Sundararaman (2012) alguns
gêneros de cianobactérias marinhas como Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix,
Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema, Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix e
Synechocystis produzem diversas classes de metabólitos peptídeos acíclicos,
decadepsipeptídeos lineares, lipopeptídeos lineares, lipopeptídeos alcinóicos lineares,
depsipeptídeos cíclicos, undecapeptídeos cíclicos, hexapeptídeos cíclicos, peptídeos
cíclicos lipofílicos, paraciclofanos, alcalóides sesterterpenos, “swinholides”, ácidos
graxos aminados, ácidos graxos brominados, glicolipídeos, éteres polifenólicos,
macrolactonas, macrólidos glicosódicos e iminotetrasacarídeos (ANDRIANASOLO et
al., 2005; BUI et al., 2007; CLARK et al., 2008; GUNASEKERA et al., 2010; KHAN;
LU ; HECHT, 2009; LININGTON et al., 2007, 2009; MO et al., 2009; MULLER et al.,
2006; SALVADOR et al., 2011).
A utilização das cianobactérias na produção de energia também tem sido cada
vez mais investigada, podendo-se admitir que a energia do futuro que poderá atender
grande parte das atividades humana deverá ser dependente do cultivo e processamento
das cianobactérias. Neste contexto, a empresa americana algaenol já registrou patente
para a produção de etanol biogênico, produzido por cianobactérias
(http://www.algenolbiofuels.com/). Tem-se descoberto que algumas espécies excretam
diretamente para o meio de cultura etanol puro, que evapora da água e é colhido usando
fotobioreatores com condensação. A produção total de etanol das cianobactérias
ultrapassa os 8000 kg/há, sendo até 4 vezes maior do que o que é obtido com a cana de
açúcar, numa mesma área.
24
Esses achados também deverão estimular pesquisas sobre o potencial de
produção de biodiesel a partir de cianobactérias e outras microalgas, sendo este um
campo de investigação bastante promissor. A quantidade de óleo que algumas espécies
de microalgas podem conter chega até 75-80% da biomassa seca, dependendo da
espécie e do estado fisiológico em que ela se encontra. Chisti (2007) aponta que a
espécie Botryococcus braunii, por exemplo, pode conter de 25 a 75% de lipídeos,
Chlorella sp de 28 a 32%, Phaeodactylum tricornutum, de 20 a 30%, Schizochytrium sp
de 50 a 77% e Neochloris oleoabundans de 35 a 54%.
A importância nutricional das cianobactérias é outro fato que as qualifica como
um dos mais promissores grupos de microorganismos que deverão ocupar papel de
destaque em nossa sociedade num futuro próximo. Neste contexto, a inserção de
microrganismos ou enzimas na produção de alimentos e de novos produtos é de grande
interesse nutricional e econômico (MULITERNO et al., 2005).
Alternativas alimentares que possam diminuir o déficit nutricional das pessoas
através de novos processos e matérias-primas tem sido alvo de inúmeras pesquisas
recentes e a utilização das cianobactérias para a produção de alimentos representa
atualmente um mercado em franco crescimento, com inúmeras indústrias que cultivam,
beneficiam, embalam e vendem biomassa de algumas espécies (especialmente
Spirulina), para fins nutracêuticos e outros.
A cianobactéria Arthrospira platensis (Spirulina platensis) apresenta um papel
de destaque, devido ao seu alto teor protéico 55-70 % em peso seco (PHANG et al.,
2000), sendo produzida e comercializada em varias partes do mundo. O produto seco é
um valioso suplemento alimentar (CIFELLI, 1983; BELAY et al., 1993), visto que
apresenta baixas concentrações de ácidos nucléicos e aminoácidos, similares ao
recomendado pela FAO (CIFERI; TIBONI, 1985; RICHMOND, 1988). Ela é rica em
proteínas (60–70% em peso), vitaminas (especialmente B12 e B-caroteno), e sais
minerais; contém muitos aminoácidos essenciais e ácidos graxos, sendo, ainda, uma das
fontes de ácido γ-linolenic (GLA) e pigmentos antioxidantes como os carotenóides
(BELAY; KATO; OTA, 1996; BELAY, 2002). Também é grande a possibilidade de
obter-se outros produtos como ficocianinas, ficoeritrina, clorofilas, vitaminas
(especialmente vitamina B12 pró-vitamina A = β-caroteno) e ácidos graxos poli-
insaturados, incluindo os ácidos graxos omega-3 (AARONSON et al., 1980;
SASSANO, 1999) e minerais como o Ferro (BELAY, 2002; HABIB et al., 2008).
25
Pertencente à ordem Oscillatoriales, Arthrospira (Spirulina) é uma cianobactéria
microscópica, fotossintética, unicelular, filamentosa, composta por tricomas de 5-6 μm
de largura e 20-200 μm de comprimento, em forma de um espiral, que tem seu habitat
preferencial em águas alcalinas (HOFF; SNELL, 1999), e que surgiu em nosso planeta
há cerca de 3,0 bilhões de anos (YANG; LEE; KIM, 1997).
Ela tem sido muito usada na alimentação humana e também é conhecida por
produzir vários compostos bioativos. Em particular, S. platensis tem sido usada para
melhorar a imunidade das pessoas e ela também tem sido muito usada na medicina
tradicional chinesa. Estudos pré-clínicos e estudos clínicos sugerem que a Spirulina tem
um efeito terapêutico certo (FOX, 1996), atuando na redução do colesterol do sangue,
proteção contra alguns tipos de câncer, equilíbrio do sistema imunológico, aumento dos
lactobacilos intestinais, redução de nefrotoxicidade por metais pesados e drogas,
proteção à radiação ultravioleta, redução de hiperlidemia (excesso de substâncias como
o colesterol, triacilgliceróis e lipoproteínas no plasma sanguíneo) e obesidade (BELAY
et al., 1993), conforme demonstrado em estudos in vitro em ratos e em humanos (DEVI;
VENKATARAMAN, 1983; KATO et al., 1984; TORRES-DURAN et al., 1999;
MANI; IYER; SUBRAMANIAN, 1998). Tem-se verificado também que em estrato
aquoso S. platensis inibia parcialmente a replicação do vírus HIV1 em células T, em
células mononucleares periféricas e em células de Langerhans, em humanos infectados
com HIV1 (AYEHUNIE et al., 1998) e que ela podia inibir reações anafiláticas em ratos
(YANG et. al., 1997).
Seus efeitos na desnutrição têm sido reportados especialmente em crianças
(SESHADRI, 1993; SIMPORE et al. 2006). Tem-se constatado também que Spirulina
atua também como imunomoduladores em seres humanos e animais, indicando que
Spirulina e seus extratos poderiam impedir ou inibir câncer (QURESHI; ALI, 1996;
HAYAKAWA et al., 1997; KIM et al., 1998; MIRANDA et al., 1998; MISHIMA et al.,
1998; QURESHI; GARLICH; KIDD, 1996; SAEKI et al., 2000a ; SAEKI et al.,
2000b). Também foi relatado que Spirulina apresenta atividade antimicrobiana
(DEMULE; DECAIRE; DECANO, 1996; OZDEMIR et al, 2004), visto que ela
estimula a secreção de Interleucina (IL)-1β, IL-4, e interferon (IFN)-γ em 2.0, 3.3, e até
13.6 vezes os níveis basais, respectivamente, indicando que ela pode fornecer uma forte
proteção contra patógenos e parasitas intracelulares e pode ser eficaz no combate a
parasitas extracelulares (MAO; VAN DE WATER; GERSHWIN, 2003). Neste
contexto, verificou-se que Spirulina tem efeito anti-viral (HAYASHI; HAYASHI;
26
MORITA, 1993), especialmente Herpes simplex (HSV-1) e HIV-1.68. (AYEHUNIE et
al. 1998; HERNANDEZ-CORONA et al. , 2002) e contra diferentes espécies de
bactérias patogênicas humanas (MALA et al., 2009).
Além disso, ela é reconhecidamente um microorganismo toxicologicamente
seguro, não se registrando inclusive efeito colateral devido à overdose de Spirulina, mas
somente um aumento benigno de carotenoides na pele, em alguns casos extremos
(“suntan pill” effect), que pode inclusive auxiliar na prevenção do câncer de pele
(HABIB et al, 2008).
Com todas essas aplicações não é a toa que Spirulina tem sido denominada de
“Super Alimento Natural” (MOORHEAD; CAPELLI; CYSEWSKI, 2006), “uma fonte
maravilhosa de alimento do futuro (HABIB et al., 2008) e “Powerful New Food That
Can Help Rebuild Our Health and Restore Our Environment.” (HENRIKSON, 2009).
Spirulina produzida pela Earthrise tem um status GRAS (Generally Recognized as
Safe). Ela é hoje produzida em diversos países por empresas que utilizam sistemas cada
vez mais complexos de produção e que a comercializam de diversas formas,
disponibilizando-a para lojas de alimentos e muitos outros pontos de venda no mundo
todo(http://www.fda.gov/Food/FoodIngredientsPackaging/GenerallyRecognizedasSafe
GRAS/GRASListings/ucm153944.htm).
Atualmente, microfazendas de cultivo de Spirulina estão se espalhando ao redor
do mundo. E muitas pessoas estão aprendendo a produzir Spirulina em pequena escala
para sua autossuficiência ou para obter algum ganho extra. Em países subdesenvolvidos,
vilas de Spirulina estão crescendo para melhorar a saúde de crianças subnutridas e para
aumentar um ganho extra na economia local
(http://www.spirulinasource.com/microfarms.html).
Spirulina é produzida em pelo menos 22 países incluindo o Brasil e a produção
anual estimada chega a 3000 toneladas por ano (BELAY, 2002; SHIMMAMATSU,
2004), mas esses dados podem estar subestimados. A produção chinesa, por exemplo,
não está dentro das estatísticas oficiais da FAO, e na China já existia em 1997 mais de
80 fábricas produzindo Spirulina (Li; Qi, 1997). A produção chinesa em 2003
ultrapassou 19000 toneladas e passou de 41000 toneladas em 2004 (FAO, 2006).
Apesar disso, a distância entre o desenvolvimento tecnológico dos cultivos dessa
espécie, cada vez mais sofisticados, e sua produção artesanal é muito grande. Também,
são escassos os dados sobre o grau de aceitação da espécie como alimento popular, o
que poderia melhorar a qualidade nutricional de comunidades carentes, no mundo todo.
27
Embora a maior aplicação desses microrganismos na indústria de alimentos
esteja associada às Spirulinas, espera-se que outros gêneros e outras espécies dentro da
biodiversidade total desses organismos também sejam promissores para esse fim, à
medida que avancem as pesquisas biotecnológicas sobre as cianobacterias.
3.3 Cianobactérias tóxicas
Uma importância ambiental particular das microalgas são as florações que
ocorrem em circunstâncias excepcionais. Muitas dessas florações podem ser de espécies
tóxicas, e nesses casos os impactos ambientais decorrentes trazem tanto consequências
sociais como econômicas negativas muito significativas, inclusive com danos à saúde
pública.
No Brasil, muitos episódios de florações nocivas recentes têm sido registrados
(http://www.cttmar.univali.br/algas/publicacoes/V_FANSA.pdf). O caso mais
dramático ocorreu em 1960 em Caruaru-Pernambuco, onde 52 pessoas morreram
intoxicadas com cianotoxinas e 116 pacientes apresentaram distúrbios visuais, náusea,
vômitos e fraqueza muscular após uma seção de hemodiálise (AZEVEDO et al, 2002).
No Brasil, a ocorrência de blooms cianobacterianos são frequentes em
ecossistemas de água doce como demonstra os trabalhos de Ferrão-filho et al. (2002);
Sotero-Santos et al. (2006); Becker; Cardoso; Marques, (2004); Bittencourt-Oliveira et
al.(2010) dentre tantos outros. Mas a formação de blooms da cianobactéria
Tichodesmium tem sido registrada e observada com frequência no ambiente marinho,
em diversas regiões ao longo da costa brasileira (SILVA; MATTHIENSEN; YUNES,
2008).
O fenômeno foi registrado pela primeira vez na Baia de Tamandaré, Estado de
Pernambuco (SATO et al., 1963), sendo que os autores atribuiram uma doença
conhecida na região do litoral de Pernambuco como “febre de Tamandaré” às florações
dessas cianobactérias, alegando que a causa da doença seria o “spray” marinho
contendo tricomas de Trichodesmium, inalados pelos habitantes da região, ou
simplesmente a ingestão de água contendo as colônias, que apareceram quase que
anualmente, geralmente entre os meses de fevereiro e março. O fenômeno provoca entre
os habitantes locais um tipo de febre popularmente conhecida pelo nome “tingui”.
Chellappa e Passavante (2004) descrevem uma floração da espécie de
cianobacteria Trichodesmium ertythraeum em águas costeiras do Estado do Rio Grande
28
do Norte. Em 1995 florações de Trichodesmium também foram relatadas na região de
Ubatuba – São Paulo (GIANESELLA-GALVÃO et al., 1995) e posteriormente o
fenômeno também foi relatado para o litoral norte de Santa Catarina (RORIG et al.,
1998a). Em 1994, uma floração de Trichodesmium atingiu a praia do Cassino (SILVA
et al., 2008), impactando o ambiente costeiro por mais de sete dias. Relatos de florações
de Trichodesmium erythraeum também são conhecidos para o litoral do Paraná,
ocorridos entre os anos de 1998 e 1999 (SIQUEIRA et al., 2006) e na plataforma
continental na região de SANTOS – São Paulo, em 2006 (CARVALHO et al., 2008),
bem como na região da Baía de Camamu – Bahia (PROENÇA et al., 2009). A
ocorrência de florações de Trichodesmium no litoral da Paraíba é fato bastante comum,
conforme relato de pescadores artesanais e observações pessoais pesquisados (SASSI,
comunicação pessoal).
No meio marinho os blooms de cianobactérias ocorrem em algumas áreas
restritas dos oceanos tropicais e subtropicais, e quase sempre estão formados por
representantes dos gêneros Trichodesmium, uma oscillatoriaceae fixadora de N2
(CARPENTER; PRICE, 1976; 1977; CAPONE et al., 1997); Nodularia, e
Aphanizomenon (SELLNER, 1997) e Lyngbya majuscula (DENNISON et al., 1999),
uma oscillatoriacea filamentosa.
A principal preocupação com as florações de cianobactérias é a capacidade
dessas células de produzir toxinas que são metabólitos secundários e podem ser letais
para muitos organismos, incluindo o homem e também causam efeitos que podem
influenciar no equilíbrio dos ecossistemas.
As cianotoxinas são classificadas de acordo com sua ação tóxica nos animais
pela composição química. De modo geral essas substâncias são agrupadas como:
neurotóxicas, hepatóxicas, dermatotóxicas, e aquelas caracterizadas como inibidores
potentes de síntese proteica (YUNES et al., 2003). As neurotoxinas ainda podem ser
classificadas em subgrupos que são eles: anatoxina-a, anatoxina-a(s), saxitoxina, L-
BMMA (Beta-n metilamino-L-alanina).
As neurotoxinas apresentam ação rápida em vertebrados através de diferentes
mecanismos fisiológicos causando a morte por parada respiratória. A anatoxina-a possui
o menor número de ocorrência no Brasil. As saxitoxinas fazem parte de um grupo de
neurotoxinas comumente observadas em dinoflagelados marinhos, responsáveis pelo
fênomeno das marés vermelhas.
29
Diferente das neurotoxinas, as hepatoxinas apresenta um mecanismo de ação
mais lenta, podendo causar a morte em horas, dias ou meses (CARMICHAEL, 1994).
As hepatoxinas são conhecidas como microcistinas, estas possuem maior occorência no
mundo e no Brasil. As microcistinas apresentam maior número de registros,
principalmente em reservatórios utilizados para o abastecimento público.
O aumento dos registros sobre a produção de cianotoxinas por diversas espécies
de cianobactéria sugere ocorrência cosmopolita desses compostos. Entretanto, muitos
trabalhos referem-se a ambientes salobros ou de água doce, com poucos exemplos de
cianobactérias tóxicas em habitats marinhos e terrestres. Com a exceção de estudos
sobre cianobactérias costeiras e planctônicas de regiões tropicais e temperadas-quentes
(HAWSER et al., 1991; 1992), relativamente poucas pesquisas tem sido desenvolvidas
sobre a produção de toxinas por cianobactérias marinhas. Apesar de se reconhecer que
linhagens marinhas também produzem compostos tóxicos ainda existem poucos casos
de intoxicação resultante de cianobactérias marinhas quando comparadas com
ambientes de água doce ou salobra (PEARL, 1996).
3.4 Diazotrofia
As comunidades microbiológicas são componentes essenciais dos ecossistemas,
onde desempenham papéis fundamentais no metabolismo da matéria orgânica e na
transformação bioquímica detodos os elementos, incluindo a fixação biológica do
nitrogênio. Para a realização da fixação do nitrogênio alguns grupos de cianobactérias
sofrem modificações morfológicas e fisiológicas, a exemplo do desenvolvimento dos
heterocistos e o aparecimento da atividade do complexo enzimático da nitrogenase.
Atualmente, o elemento mais importante para aumentar a produção agrícola
tropical é o nitrogênio, que forma 80% da atmosfera na forma gasosa de N2, mas que as
plantas não conseguem utilizar. Somente certas bactérias e cianobactérias, chamadas
diazotróficas ou fixadoras de N2, são capazes de transformar o N2 da atmosfera em NH3,
NH4+ ou aminoácidos, que as plantas podem usar em sua nutrição.
(http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio01/1hp_15.pdf). No meio terrestre fixação
de nitrogênio é um processo natural que ocorre devido à interação entre plantas e
bactérias, razão pela qual na agricultura sustentável a técnica é utilizada como
alternativa para aumentar a produtividade e minimizar a emissão dos Gases de Efeito
Estufa (GEE), contribuindo para atenuar os efeitos das mudanças climáticas.
30
No meio aquático, os microrganismos responsáveis pela fixação biológica do
nitrogênio são as cianobactérias, sejam filamentosas ou unicelulares. A fixação do
nitrogênio é um processo induzido e regulado pelos níveis de amônia e é uma fonte de
entrada de formas assimiláveis de nitrogênio na biosfera, por meio da redução do N2
atmosférico a amônia (NH3), sendo que globalmente, esse é o mais importante processo
depois da fixação do CO2 pela fotossíntese (GENUÁRIO, 2010). As cianobactérias são
os únicos seres-vivos capazes de realizar esses dois processos, que são importantes para
a manutenção da vida na Terra.
As principais ordens das cianobactérias responsáveis pela realização da fixação
biológica do nitrogênio incluem Stigonematales e Nostocales que consiste na sua
morfologia células verdadeiramente diferenciadas, chamadas heterocistos e as ordens
Oscillatoriales e Chroococales, que apresentam células não diferenciadas denominadas,
diazócitos (BERMAN-FRANK et al, 2001). No meio marinho Trichodesmium é o único
gênero de cianobactéria não heterocistada conhecido até hoje que realiza a fixação
biológica de nitrogênio. Algumas espécies isoladas de uma variedade de habitats como
epífitas, planctónicas (CARPENTER; ROMANS, 1991) e edáficas (ZUBERER;
SILVER, 1978) também são fixadoras de nitrogênio e cianobactérias diazotrófricas
foram reportadas para habitats similares em varias partes do mundo. Todas essas
cianobactérias fixadoras de nitrogênio tem um papel significativo na produção de novo
nitrogênio bem como na produção primária no ambiente marinho (HERBERT, 1999) o
que torna esse grupo de microorganismos ecológicamente relevante particularmente em
áreas oligotróficas dos diversos oceanos e mares do mundo.
3.5 Taxonomia das cianobactérias
A taxonomia das cianobactérias atualmente adota dois seguimentos sistemáticos,
o tradicional da botânica e o bacteriológico, respectivamente, pelos Sistemas de
classificação sugeridos por Anagnostidis e Komarék (ANAGNOSTIDIS; KOMÁREK,
1985). A cultura pura da espécie descrita é referência no código de bacteriologia ao
passo que espécimes conservados em herbários, fotografias e/ou desenhos são usados
no código botânico (OREN, 2004; OREN; TINDALL, 2005).
Na taxonomia botânica cada espécie é descrita seguindo normas do Código
Internacional de Nomenclatura Botânica, incluindo a descrição do material em latim e
sua inclusão em coleções de herbários (GEITLER, 1932). Além disso, informações
31
genéticas somadas às características morfológicas, citológicas, ecológicas e bioquímicas
das cianobactérias são usadas na classificação botânica (KOMÁREK;
ANAGNOSTIDIS, 2005). Como as cianobactérias apresentam um aparato
fotossintético semelhante aos das plantas estes microrganismos foram inicialmente
classificadas junto às algas, e assim receberam a denominação de algas-azuis ou
cianofíceas (STAINER et al., 1971).
A taxonomia bacteriana baseia-se na organização da estrutura celular a partir de
microscopia eletrônica, juntamente com análises bioquímicas da composição da parede
celular e estrutura dos ribossomos que revelam a natureza procariótica das células e
justificam o posicionamento do grupo junto às bactérias Gram-negativas (BONEN;
DOOLITTLE, 1978; RIPPKA, 1988; STANIER et al., 1971; STANIER; COHEN-
BAZIRE, 1977) e a inserção das cianobactérias no Código Internacional de
Nomenclatura Bacteriana.
Tanto a abordagem botânica como a molecular é empregada no estudo das
cianobactérias e como referências se utilizam os sistemas de classificação proposto por
Anagnostidis e Komárek (1985; 1990), Komárek e Anagnostidis (1989; 1999; 2005) e o
Manual de Bergey de Bacteriologia Sistemática (BOONE; CASTENHOLZ; GARRITY,
2001), respectivamente conforme as normas botânicas e microbiológicas.
Apesar das diferenças e restrições de cada sistema, os dois códigos estão
convergindo cada vez mais (HOFFMANN; KOMÁREK; KAŠTOVCKÝ, 2005; OREN;
TINDALL, 2005) de modo que nomes botânicos são usados na classificação
bacteriológica e a divisão das cianobactérias em subseções reflete as ordens usadas na
classificação botânica (GENUÁRIO, 2011).
O emprego tradicional de caracteres morfológicos e ecológicos (GEITLER,
1932; DESIKACHARY, 1959; LANE et al., 1985) tem sido aplicado a diferentes
biótopos o que tem contribuído para o conhecimento da variabilidade morfológica das
espécies e permitido, por consequência, obter-se informações da sua distribuição
geográfica. Komarék (2006) ressalta que os estudos florísticos são pouco populares na
pesquisa moderna ficológica, pois as relações filogenéticas entre as cianobactérias ainda
é escassamente entendida, apesar de que estudos comparativos de populações
provenientes de diferentes hábitats (ou de hábitats similares e diferentes regiões) são
importantes para o entendimento do diverso mundo cianobacteriano.
Por outro lado, Stainier et al. (1978) e Rippka et al. (1979) argumentaram que a
sistemática das cianobactérias não deve basear-se somente nos métodos tradicionais da
32
Botânica pois conforme ressaltam Zerhr; Mello; Hiorns (1997); Henson; Watson;
Barnum (2002); Fiore et al. (2007), é extremamente árduo definir as relações
taxonômicas e filogenéticas das cianobactérias por causa das poucas distinções de
características consistentes que suportam um esquema taxonômico seja este pelo
sistema nomenclatural botânico ou o bacteriano.
Branco et al., 2003 admitem que abordagens moleculares podem também
esclarecer mais sobre a biogeografia das cianobactérias, cujos membros desempenham
papel ecológico fundamental nos diversos ecossistemas onde ocorrem, enquanto Garcia-
Pichel et al, (1998) e Palinska et al, (1996) consideram que a reorganização da
sistemática cianobacteriana baseada somente na morfologia pode não ser o método mais
adequado.
Como se vê, o uso de dois sistemas de classificação torna a sistemática das
cianobactérias bastante confusa e esse dilema ainda será tema recorrente nas discussões
entre botânicos e microbiologistas (GENUÁRIO, 2011).
O sistema da taxonomia botânica nas cianobactérias tem sido baseado nas
descrições fenotípicas, morfologia da célula e forma da bainha, reprodução, formação
de colônia, pigmentação, fisiologia e bioquímica. Esses procedimentos têm sido usados
em estudos de levantamento da biodiversidade do grupo iniciados no século XIX e
continuados até hoje.
Adicionalmente, os estudos ultraestruturais e ecológicos usualmente adotados na
taxonomia botânica convencional, não necessitam de grandes exigências visto que
podem ser efetuados com espécimes coletados de amostras naturais. O emprego das
ferramentas da biologia molecular parece ser um complemento dos procedimentos
tradicionais, sendo recomendável a manutenção das populações em bancos de cultura
com condições adequadas para o crescimento das cianobactérias. Este é um aspecto
crítico, visto que muitas cianobactérias não se estabelecem em condições artificiais e,
portanto, não são cultiváveis (FERREIRA, 2008). Um problema adicional das culturas
disponíveis em bancos é a imprecisão nas identificações taxonômicas, levando a um
potencial equívoco na análise dos dados obtidos. Estima-se que mais de 50% das
linhagens de cianobactérias existentes em coleções de cultura estejam identificadas
incorretamente ou foram colocadas erroneamente em alguns grupos taxonômicos
(ANAGANOSTIDIS; KOMÁREK,1990).
Sendo esses alguns dos vários problemas existentes nos estudos da taxonomia
das cianobactérias presume-se que a utilização de diferentes procedimentos de análise
33
que combinem caracteres fenotípicos com o genótipo poderá melhorar o conhecimento
das espécies (SWILMOTTE; HERDMAN, 2001; MARQUARDT; PALINSKA, 2007;
ZEHR et al., 2003; RAJANIEMI et al., 2005). Com relação ao último aspecto, biólogos
têm empregado variedade de técnicas moleculares para responder questões de filogenia,
evolução e diversidade de populações cianobacterianas, particularmente na última
década, (BOYER; FLETCHTER; JOHANSEN, 2001; TOMITANI, 2004) sendo que a
maioria desses estudos baseiam-se na seqüência do rRNA 16S (GIOVANNI et al.,
1988; TURNER et al., 1999; WILMOTTE; HERDMAN, 2001; GUGGER;
HOFFMANN, 2004).
Segundo WEISBURG et al., (1991), a comparação de seqüências de rRNA é
uma poderosa ferramenta para deduzir as relações filogenéticas e evolutivas entre
Bacteria, Archaea e Eukarya e Casamatta, Vis e Shesth (2003) relatam que muitas
vezes a variação morfológica pode não corresponder a diferenças genéticas em
cianobactérias, e que métodos moleculares são essenciais na detecção do curso
biogeográfico de espécies potencialmente críticas.
Segundo Genuário (2011), o advento da sistemática molecular permite comparar
seqüências de DNA de cianobactérias com outros procariotos e eucariotos inferindo
uma filogenia. Análises baseadas em uma ordem de extensão de seqüências gênicas
revelam claramente que as cianobactérias constituem um dos onze maiores clados do
domínio Bacteria. Esta filogenia explica a disposição de muitas similaridades em
estruturas celulares e fisiológicas que cianobactérias compartilham com outros
procariotos (GRAHAM; WILCOX, 2000).
34
4 METODOLOGIA
4.1 Preparação dos meios de cultura
Como meio básico para o cultivo das cianobactérias marinhas estudadas neste
trabalho foi utilizado o meio Conway (WALNE, 1970), preparado com água do mar
filtrada em filtro de fibra de vidro Whatman GF/C de 47mm de diâmetro, autoclavada e
deixada em repouso por 24 horas em temperatura constante, para a re-oxigenação. Após
este tempo, foram adicionados à água filtrada, todos os macronutrientes,
micronutrientes e vitaminas presentes na formulação do referido meio de cultura (Tab.
1).
Tabela 1- Composição do meio Conway (Walne, 1970) conforme utilizado nesta pesquisa.
Solução principal Quantidades FeCl3.6H2O 2,60g MnCl2.4H2O 0,72g H3BO3 67,20g EDTA 90g NaH2PO4.2H2O 40g NaNO3 200g Solução de metais traços 2ml Água destilada 2000mL Adicionar 1ml para cada litro de água do mar Solução de metais Quantidades ZnCl2 2,1g CoCl2.6H2O 2,0g (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,9g CuSO4.5H2O 2,0g Água destilada 100ml Adicionar a Solução Principal Solução de vitaminas Quantidades B12 10mg B1 200mg Água destilada 200ml Adicionar 0,1ml para cada litro de água do mar Solução de silicato Quantidades Na2SiO3.5H2O 4,0g Água destilada 100ml Adicionar 2ml para cada litro de água do mar em caso de cultivo de
diatómaceas e de sílicoflagelados
35
4.2 Coleta, isolamento e manutenção dos cultivos
As coletas foram realizadas em meses aleatórios ao longo dos anos de 2010 a
2012, principalmente na zona de entremarés dos recifes costeiros do Cabo Branco, João
Pessoa, PB, na praia de Pirangi, RN, nos estuários dos rios Mamanguape e Paraíba e na
laguna costeira de Jacarapé. Também foram coletados diversos exemplares dos
invertebrados bênticos recifais: Protopalythoa variabilis (zoantídeo) e Cynachrella sp
(esponja), para o estudo das populações de cianobactérias simbioticamente a eles
associadas. O material coletado foi transportado ao Laboratório de Ambientes Recifais e
Biotecnologia com Microalgas (LARBIM/LEA/UFPB) em condições herméticas onde
foi processado.
As amostras de água foram inoculadas em meio Conway em tubos de ensaio. Os
exemplares de esponjas foram lavados em água do mar filtrada usando jatos de água
projetados com um Water Pik® e também espremidas em placa de Petri.
O zoantídeo Protopalythoa variabilis teve seus tecidos macerados em placa de
Petri com água do mar filtrada, usando estilete e bisturi. Os materiais oriundos desses
invertebrados foram inoculados também em meio Conway, em tubos de ensaio. Todas
as amostras inoculadas foram mantidas em câmara de cultura climatizada, a 25º C ± 1º
C dotada de iluminação mantida por lâmpadas fluorescentes tipo luz-do-dia, com
fotoperíodo de 12 horas.
As cianobactérias que cresceram nos inóculos foram isoladas em microcoscópio
utilizando micropipetas capilares (confeccionada em bico de Bunsen) transferidas para
novo meio, sendo este procedimento repetido tantas vezes quantas necessárias até se
obter cultivos monoespecíficos. Cada cepa cultivada foi codificada e incluída no banco
de microalgas da Coleção de Microalgas da UFPB (CMUFPB) (Fig. 1).
4.3 Crescimento das espécies em condições laboratoriais
O crescimento das espécies selecionadas para estudo foi efetuado em meio
Conway na câmara de cultura climatizada em balões de 6 litros contendo 4 litros de
meio de cultura, sendo que a agitação dos cultivos foi realizada por injeção contínua de
ar (2,0 mL.min-1
) por minicompressor de membrana Resun AOC2. (Fig. 2)
O desenvolvimento dos cultivos foi efetuado por meio de contagens celulares em
câmaras de Fuchs Rozenthal e em câmaras de Sedgewick-Rafter (para as espécies
36
filamentosas), em microscópio binocular Leica, ou através de medidas da fluorescência
in vivo usando um fluorômetro Turner Design 10005 R e/ou medidas da densidade ótica
num espectrofotômetro Micronal B382. Durante as contagens em microscópio também
se efetuou observações do estado fisiológico das células, avaliando-se aspectos da sua
morfologia e tamanho. Todas as espécies estudadas foram fotografadas em vários
aumentos e medidas, utilizando-se um sistema “image-vision” acoplado ao microscópio
Leica.
Figura 1 – Vista geral do banco de cultura de
microalgas da UFPB evidenciando a maneira
como as cepas são mantidas.
As curvas de crescimento de cada espécie cultivada foram traçadas utilizando os
parâmetros de crescimento supra referidos, a partir das quais foi possível determinar-se
o tempo de cultivo, a duração da fase exponencial, a velocidade de crescimento (µ), e o
rendimento final em biomassa. Todas as curvas obtidas foram ajustadas com o
programa estatístico CurveExpert versão 1.3 pela aproximação à curva logística,
conforme Pindich e Rubenfeld (1981) e segundo Derner (2006).
A velocidade de crescimento (k), a qual representa o número de divisões
celulares da população em estudo por unidade de tempo (dia), foi determinada através
da seguinte fórmula (STEIN,1973):
Figura 2 – Fotografia mostrando um
experimento de produção de biomassa em
andamento, em balões de 6L com aeração.
37
k = 3,322 x Log N2
T2 - T1 N1
onde:
k = velocidade de crescimento.
3,322 = fator de conversão do logaritmo base 2 a base 10.
(T2 - T1) = intervalo de tempo em dias.
N1 = densidade celular inicial.
N2 = densidade celular final.
Log = logaritmo em base 10.
No final da fase exponencial do crescimento os experimentos foram
interrompidos e o material foi centrifugado em centrifuga refrigerada a 18oC, os
concentrados foram congelados (-40°C), e posteriormente liofilizados em um
liofilizador da marca Terroni. A biomassa seca foi pesada e guardada em recipiente
hermético para as análises dos ésteres metílicos de ácidos graxos.
4.4 Análise do perfil dos ácidos graxos
As analises da composição dos ésteres metílicos de ácidos graxos (Fatty Acids
Methil Ester – FAME) e os cálculos do teor de ésteres foram efetuados no Laboratório
de Métodos de Extração e Separação (LAMES), da Universidade Federal de Goiás, pela
equipe do Prof. Dr. Nelson Antoniosi Filho através de cromatografia gasosa, usando um
Cromatógrafo a Gas Agilent 7890, equipado com detector FID e injetor split/splitless.
Segundo os procedimentos adotados no LAMES e conforme publicado no artigo
de Menezes et al., (2013), a coluna capilar utilizada foi a DB-WAX (30 m x 0.25 mm x
0.25 um); o forno operou sob temperatura inicial de 70˚C, sendo aquecido a 10˚C.min-1
ate 240˚C, e mantido nesta temperatura por 13 minutos, sendo novamente aquecido a
5˚C.min-1 ate 250˚C; o injetor foi mantido a temperatura de 310˚C com volume de
injecão de 2 µL, no modo split, com razão de split de 10:1; a temperatura do detector foi
mantida a 310˚C; o Hidrogênio 5.0 foi utilizado como gás de arraste a velocidade linear
de 42 cm.s-1
, e o nitrogênio usado como gás make-up auxiliar a 20 mL.min-1
Os FAME foram identificados pela comparação direta com amostras de
composição conhecida, tais como o óleo de soja, amendoim e crambre, por injeção de
padrões de referencia de FAME (NuCheck Prep®) e por análises via Cromatografia
38
Gasosa de Alta Resolução acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS), usando um
Cromatógrafo a Gás modelo Shimadzu 17A acoplado a Espectrômetro de Massas QP-
5050 Shimadzu, com interface a 280oC. O gás de arraste utilizado nos ensaios foi o
hélio a velocidade linear de 42 cm.s-1
. As condições operacionais para forno, injetor e
coluna capilar foram às mesmas utilizadas para HRGC-FID (MENEZES et al., 2013).
4.5 Taxonomia das cianobactérias
A identificação das espécies foi feita através de literatura especializada
utilizando critérios diacríticos (HINDAK, 1990). Foram realizadas observações
morfológicas dos principais caracteres usados na taxonomia do grupo, utilizando um
microscópio Leica com vários aumentos. A identificação morfológica seguiu os
manuais tradicionais de ficologia (GEITLER; 1932; KOMARÉK; ANAGNOSTIDIS
1999, 2005).
As espécies foram identificadas utilizando artigos de referencia, seguindo-se os
procedimentos usuais de taxonomia das cianobactérias (BRANCO et al., 1996; 1997) e
adotando-se como sistema de classificação Komárek; Anagnostidis (1989, 1999, 2005).
Fotografias de cada uma das cepas cultivadas foram realizadas em vários
aumentos, inclusive em objetivas de contraste de fase.
39
5 RESULTADOS
5.1 Espécies isoladas e mantidas em culturas monoespecíficas
Foram identificadas 7 espécies de cianobactérias. Cada cepa identificada foi
codificada e inserida no banco de culturas de microalgas da UFPB (CMUFPB).
Informações referentes à sua procedência e data de isolamento são apresentados na
tabela 2.
Tabela 2 Relação das cepas de cianobactérias marinhas isoladas de diferentes habitats dos
estados da Paraíba e Rio Grande do Norte, mantidas em meio Conway na Coleção de
Microalgas da UFPB (CMUFP) no Laboratório de Ambientes Recifais e Biotecnologia com
Microalgas (LARBIM/UFPB).
Código da cepa Taxon Procedência Data de
isolamento
CMUFPB M3C Synechocystis aquatilis Cabo Branco (água do mar) 12/02/2011
CMUFPB M6C Romeria gracilis Cabo Branco (água do mar) 12/02/2011
CMUFPB M11C Planktotrix isothrix Cabo Branco (água do mar) 14/03/2010
CMUFPB M12C Planktolyngbya limnetica Cabo Branco (água do mar) 14/03/2010
CMUFPB M20C Synechocystis aquatilis. Maceió de Intermares (água salobra) 09/07/2010
CMUFPB M38C Synechococcus nidulans Cynachrella sp. (Cabo Branco) 17/02/2012
CMUFPB M41C Synechococcus nidulans Protopalythoa variabilis (Cabo Branco) 17/02/2011
CMUFPB M48C Planktolyngbya limnetica Cabo Branco (água do mar) 06/07/2011
CMUFPB M60C Synechocystis aquatilis Cabo Branco (água do mar) 09/08/2011
CMUFPB M62C Chroococcus sp Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba) 17/08/2011
CMUFPB M85C Spirulina labirintiformis Cabo Branco (água do mar) 02/12/2011
CMUFPB M91C Synechocystis aquatilis Estuário Mamanguape 09/01/2012
CMUFPB M94C Synechocystis aquatilis Praia de Pirangí, RN (água do mar) 26/01/2012
CMUFPB M95C Synechococcus nidulans Praia de Jacarapé (água do mar) 17/01/2012
CMUFPB M99C Synechococcus nidulans Cynachrella sp. (Cabo Branco) 14/02/2012
CMUFPB M100C Synechococcus nidulans Cynachrella sp. (Cabo Branco) 03/02/2012
CMUFPB M104C Planktolyngbya limnetica Praia do Jacaré (estuário do rio Paraíba) 28/12/2011
Os dados da tabela 2, mostram isolados vários clones de uma mesma espécie, de
distintas procedências, a exemplo de Synechococcus aquatilis cujas cepas foram
isoladas de amostras de água do Cabo Branco, do Maceió de Intermares, do estuário do
rio Mamanguape e da Praia de Pirangi no rio Grande do Norte, e Synechococcus
nidulans isolada de amostras de água coletada na Praia de Jacarapé e dos invertebrados
40
bënticos recifais Cynachrella sp e Protopalythoa variabilis coletados nos recifes do
Cabo Branco. Detalhes taxonômicos das cepas identificada são apresentados a seguir.
5.1.1 Synechocystis aquatilis Sauvageau 1892 (Ordem: Synechococcales;
Família: Merismopediaceae) (Fig. 3 A-F)
Descrição: A espécie Synechocystis aquatilis é esférica e usualmente é encontrada em
células solitárias ou aos pares, com diâmetros variando de 2-4 µm. Apresenta coloração
esverdeada-pálida com granulações mais densas em um dos polos.
Figura 3(A-F) – Diferentes cepas da cianobacteiras Synechocystis aquatilis cultivadas no
LARBIM/UFPB (M3C do Cabo Branco; M20C da praia do Jacaré, estuário do rio Paraiba;
M60C do Cabo Branco e M91C do estuário do rio Mamanguape.
A (Cepa M3C, aumento 400x) B (Cepa M3C, aumento 1000x)
D (Cepa M60C, aumento 400x)
F (Cepa M91C, aumento 1000x) E (Cepa M60C, aumento 1000x)
C (Cepa M20C, aumento 1000x)
41
Comentários: Os exemplares cultivados tem grande semelhança com os espécimens
estudados por Ferragut et al., (2005) em amostras coletadas no Lago IAG, São Paulo,
com os quais concorda muito bem em forma e tamanho. São ligeiramente menores do
que os exemplares estudados por Tucci et al. (2002) em amostras oriundas do Lago das
Garças, São Paulo. Outra referencia para o Brasil é o trabalho de Sant’anna et al., 2007,
que cita esta espécie para reservatórios do alto Tietê, São Paulo, bem como para o alto
rio Paraná.
5.1.2 Romeria gracilis (KOCZW.) KOCZW. ex GEITL. Rabenh.’s Krypt.-Fl. 14:
916, 1932. (Ordem: Oscillatoriales; Familia; Pseudanabaenaceae ) (Fig. 4 A-B )
Descrição: Esta espécie apresenta tricomas solitários, irregularmente ondulados e até
enrolados com quantidades de células que variam de 2 a 16 células. As células possuem
formas cilíndricas, levemente dilatadas no centro larguras em torno de 1,5 µm.
Apresentam coloração azul esverdeada pálida homogênea.
Figura 4 – Romeria gracilis (cepa M6C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra de
água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.
Comentários: Os exemplares cultivados são muito semelhantes em forma e tamanho
dos exemplares estudados por Brito et al, 2012. Romeria gracilis é uma espécie
planctônica cosmopolita, encontrada em lagoas e lagos (Komarek, 2001). Este autor
considera as espécies Raciborskia gracilis KOCZW. Kosmos 53: 104, 1929; Amalia
gracilis (KOCZW.) DE TONI Noter. Nomencl. Algol. 1: 5, 1934 e Synechococcus
gracilis (KOCZW.) KOM. Arch. Protistenk. 112: 363, 1970 como sinônimos de R.
gracilis. Previamente esta espécie foi referida para o Lago das Garças, São Paulo (Tucci
B (Cepa M6C, aumento 1000x)
A (Cepa M6C, aumento 400x)
42
et al., 2006). Esta parece ser a primeira referencia para o nordeste e a segunda para o
Brasil.
5.1.3 Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Czech Phycol. 4: 14,
2004. (Ordem: Oscillatoriales Familia: Phormidiaceae) (Figs. 5A-C)
Descrição: P. isothrix apresenta tricomas solitários retos ou levemente sinuosos, com
extremidade sub-hemisférica e parede celular reta e sem constricção. Usualmente possui
granulação adensada no sentido transversal da parede. Largura dos tricomas: 4.0-10.0
μm. As células são usualmente de 0.3 a 1.0 vezes mais compridas do que largas, com
comprimento variando de 2.0 a 5.0 μm. Pigmentos marrom-esverdeados, numerosos
aerótopos.
Figura 5 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra
de água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.
Comentários: A espécie estudada apresenta muita semelhança em forma e dimensões
com P. isothrix estudada por Martins; Branco; Werner (2012) em lagoas costeiras
A (Cepa M11C, aumento 630x) B (Cepa M11C, aumento 1000x)
C (Cepa M11C, aumento 1000x,
Fotograia em contraste de fase)
43
associadas à Lagoa dos Patos no Rio Grande do Sul. As características da espécie
mostram semelhanças com a descrição fornecida por Komárek; Komárková (2004). De
acordo com Martins; Branco; Werner (2012) esta espécie é bentônica
preferencialmente, mas também forma blooms e está presente em corpos de água
estagnadas eutróficos e hipereutróficos e em lagos tropicais e temperados (DAVIS et al.
2003, STEFANIAK; KOKOCINSKI; MESSYASZ, 2005; PÉREZ et al. 2009). Santos:
Sant’anna (2010) referem-se à Oscillatoria agardhii var. isothrix Skuja, Symb. Bot.
Upsal. 9(3): 49. 1948. Figura 31 como sinônimo. Esses dois autores fazem referencia
dessa espécie para lagoas do pantanal da Nhecolândia, Mato Grosso do Sul. De acordo
com Komárek; Anagnostidis (2005) P. isothrix ocorre em água doce, com hábito
primariamente bentônico, epipélico, secundariamente planctônico, solitário,
frequentemente formando florações, distribuída mundialmente em águas estagnadas e
lagos eutróficos a hipereutróficos.
5.1.4 Planktolyngbya limnetica (Lemmermann) Komárková-Legnerová &
Cronberg, Algolog. Stud. 67:21, 22, 1992. (Ordem: Oscillatoriales Familia:
Pseudanabaenaceae ) (Fig. 6-F)
Descrição: Os exemplares cultivados apresentam filamentos solitários retos ou
ligeiramente tortos, que flutuam na água e que possuem larguras variando de 1 a 2 µm.
Normalmente são pálidos, de coloração verde-azulada homogênea, mas com uma
granulação mais forte sobre cada lado da parede no sentido longitudinal. As células
apicais são cilíndricas com ápice arredondado. Os tricomas são cilíndricos e são de
largura uniforme de aproximadamente 0,8 a 1,7 µm. As células são aproximadamente 3
a 5 vezes mais longas do que largas.
44
Figura 6 – Diferentes cepas da cianobacteiras Planktolyngbya limnetica cultivadas no
LARBIM/UFPB (M12C e M48C isolada do Cabo Branco e M104C da praia de Jacaré, estuário
do rio Paraíba).
Comentários:
Os nossos exemplares assemelham-se bastante com as espécimes estudados por
Martins et al. (2012) em amostras coletadas na região da Lagoa dos Patos, Rio Grande
do Sul. A espécie P. limnetica havia sido referida previamente para o Brasil por
Sant’anna et al. (2007) em amostras coletadas em reservatórios do alto Tiete, São Paulo.
Esses autores referem-se à Lyngbya limnetica Lemmermann, Bot.Centralbl. (76):154.
1898 como basiônimo de Planktolyngbia limnetica.
E (Cepa M48C, aumento 1000x) F (Cepa M104C, aumento 1000x)
C (Cepa M12C, aumento 1000x,
fotografia em contraste de fase)
D (Cepa M12C, aumento 1000x,
fragmento de treicoma em contraste
de fase)
A (Cepa M12C, aumento 630x) B (Cepa M12C, aumento 1000x)
45
Este táxon apresenta semelhanças a Pseudoanabaena sp1 estudada por Cordeiro-
Araujo et al. (2010) no estado de São Paulo. Cordeiro-Araújo et al. (2010) comentam
que com a mudança de gênero proposto por Anagnostidis & Komárek (1985), Lyngbya
limnetica Lemmermann 1898 foi considerada sinônimo de L. subtilis W. West 1892, o
que significa utilizar o epíteto específico “subtilis” para o novo gênero Planktolyngbya,
devido à prioridade de publicação, resultando então em Planktolyngbya subtilis. No
entanto, como Lyngbya subtilis é sinônimo de Lyngbya distincta (Norstedt) Schmidle
1897 a qual pertence ao gênero Heteroleibleinia (GEITLER, 1905) então o epíteto
“subtilis” não seria mais adequado e sim, o epíteto “limnetica” Komárková-Legnerová;
Cronberg 1992. Portanto, P. limnetica é o nome válido para esta espécie, segundo estes
autores. Esta é a primeira referencia dessa espécie para o Estado da Paraíba.
5.1.5 Synechococcus nidulans (E. G. Pringsheim) Komárek, in P. C. Bourrelly, Les
Algues d’Eau Douce, III: 690.1970. (Ordem: Synechococcales; Familia:
Synechococcaceae ) (Fig.7 A-F)
Descrição: Synechococcus nidulans apresenta células isoladas, podendo formar curtos
filamentos de 2 células, raramente mais, que podem ser retos, curvos ou sigmoides. As
células tem formato subcilindrico até levemente ovalado e não possuem mucilagem e
usualmente variam de 1,5 a 6.0 μm de comprimento e de 0,5 a 2,0 μm de largura.
Apresenta coloração homogenea verde-azulada pálida, sem aerótopos.
Comentários: Os exemplares cultivados assemelham-se em forma e dimensões ao
material estudado por Ferragut et al. (2005) em amostras oriundas do Lago do IAG, São
Paulo. Segundo Sant’anna et al. (2007) a espécie Lauterbornia nidulans Pringsheim,
Arch. Mikrobiol. 63. 1968 é o basiônimo de Synechococcus nidulans. A espécie é
referida previamente para o Estado de São Paulo em reservatórios do alto Tietê
(SANT´ANNA et al., 2007), para a lagoa das Garças (GENTIL, 2000; TUCCI, 2002;
CROSSETTI, 2002) e para o Lago do IAG (LOPES, 1999; FERRAGUT et al., 2005).
Esta é a primeira citação da espécie para o Estado da Paraíba.
46
Figura 7 – Diferentes cepas da cianobacteiras Synechococcus nidulans cultivadas no
LARBIM/UFPB (M38C, isolada de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco; M41C, isolada
de Protopalythoa variabilis dos recifes do Cabo Branco, M94C isolada da água do mar da Praia
de Pirangí, RN, M95C isolada da água do mar da Praia de Jacarapé e M99C e M100C isolada
de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco.
5.1.6 Spirulina labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont, 1892 (Ordem: Oscillatoriales,
Familia: Pseudoanabaenacea; Subfamilia: Spirulinoideae) (Fig. 8)
Descrição: Esta espécie apresenta tricomas isolados com conteúdo celular de coloração
tipicamente verde-azulada pálida e com espiras justapostas de 2 a 2,5 µm de diâmetro.
B (Cepa M41C, aumento 1000x) B (Cepa M41C, aumento 1000x)
C (Cepa M94C, aumento 1000x) D (Cepa M95C, aumento 630x)
F (Cepa M100C, aumento 1000x) E (Cepa M95C, aumento 1000x)
47
O eixo longitudinal dos tricomas tem aproximadamente µm de diâmetro e é mais ou
menos retilíneo e as células são até duas vezes mais longas do que largas.
Figura 8 – Spirulina labyrinthiformis (cepa M85C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de
amostra de água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.
Comentários: A espécie foi previamente referida para a Praia Mansa, Município de Ilha
Bela, São Paulo, Praia das Anchovas e Praia do Saco do Eustáquio, bem como em
Itanhaém (SANT’ANNA et al., 1985), Ubatuba (SANT’ANNA, 1997).
Spirulina labyrinthiformis tem sido encontrada vivendo sobre a mucilagem de
outras cianobactérias filamentosas como Blennothrix glutinosa e B. lyngbyacea bem
como em meio a massa de Oscillatoria nigro-viridis, mas pode ocorrer isoladamente
não formando talo ou massa de tricomas como descrito por Komarék; Anagnostidis
(2005) como foi observados nos nossos cultivos em laboratório. Também tem sido
encontrada vivendo como epífita da macroalga Bostrychia radicans.
O holótipo do gênero Spirulina é Spirulina major (Kützing ex Gomont. Spirulina
labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont 1892 é nome correntemente aceito mas nenhum
sinônimo é incluído no AlgaeBase
(http://www.algaebase.org/search/species/detail/?species_id=143130). A localidade tipo
da espécie é “Thermis Patavinis” (Àbano Terme, próximo à Padova, Itália) (SILVA;
BASSON; MOE,1996:).
F (Cepa M85C, aumento 1000x)
48
5.1.7 Croococcus sp (Ordem: Chroococcales, Familia: Chroococcaceae) (Fig. 9)
Descrição
Os exemplares cultivados apresentam células arredondadas, isoladas em grupos
de 2 a 4 células, com diâmetros variando de 2 a 4 µm. Aparentemente as células se
agrupam numa massa mucilaginosa pouco densa, hialina. As células são esféricas, têm
paredes espessas, de coloração verde-azulada e com granulações densas em seu interior,
visíveis em grande aumento.
Figura 9 – Croococcus sp (cepa M62C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra de
água do mar Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba).
Comentários:
As características observadas para os exemplares cultivados não permitiram
enquadrá-la em nenhuma espécie conhecida do gênero, segundo a literatura consultada.
Pelas suas dimensões diminutas é possível que seja uma espécie ainda não descrita,
visto que em muitos casos a identificação é baseada principalmente no tamanho da
célula, associado ainda ao fato de que a taxonomia de populações tropicais ainda não é
perfeitamente clara conforme ressaltam Sant´Anna et al, (2004).
5.2 Dados dos cultivos
A tabela 3 apresenta os resultados finais dos cultivos em condição de
laboratório. Os valores apresentados de velocidade específica de crescimento (k) são a
média dos respectivos valores obtidos em cada experimento. Houve grande diferença
Cepa M62C, aumento 1000x,
fotografia em contraste de fase
49
nos resultados para as diferentes espécies estudadas, com valor máximo de 1,07
divisões/dia para a cepa M94C (Synechococcus nidulans), e mínimo de 0,26
divisões/dia para a cepa M3C (Synechocystis aquatilis).
Tabela 3 – Constante de crescimento (divisões celulares/dia), duração da fase exponencial de
cultivo (dias), rendimento em biomassa (mg/g) e totais de ésteres metílicos de ácidos graxos
(mg/g) das cianobactérias marinhas cultivados nesta pesquisa em meio Conway.
Espécie Cepa k
(média)
Desvio
Padrão
Duração
da fase
Log
(dias)
Biomassa
total
Total de
ésteres de
ácidos graxos
Synechocystis aquatilis M3C 0,26 ±0,16 6 25,35 101,1
Romeria gracilis M6C 0,36 ±0,17 11 25,82 72
Planktotrix isothrix M11C 0,48 ±0,15 8 15,13
Planktolyngbya limnetica M12C 0,31 ±0,21 9 7,85
Synechocystis aquatilis M20C 0,33 ±0,28 7 5,65
Synechococcus nidulans M38C 0,87 ±0,6 8
Synechococcus nidulans M41C 0,77 ±0,3 4 2,64 45,4
Planktolyngbya limnetica M48C 0,45 ±0,3 4 7,86
Synechocystis aquatilis M60C 0,65 ±0,45 8 16,46 4,8
Croococcus sp M62C 0,45 ±0,32 8 9,64
Synechocystis aquatilis M91C 0,39 ±0,009 7
Synechococcus nidulans M94C 1,07 ±0,31 5
Synechococcus nidulans M95C 0,66 ±0,46 5 5,21 4,0
Synechococcus nidulans M100C 0,68 ±0,27 5
O rendimento final em biomassa foi maior nas cepas M3C, M6C, M60C e
M11C, em ordem decrescente. A cepa M6C foi a que apresentou uma fase exponencial
mais longa, chegando há 11 dias, enquanto as cepas M41C e M48C foram as que
tiveram as menores durações da fase log (4 dias). Dentre as espécies selecionadas para
análises dos ésteres metílicos de ácidos graxos, os maiores valores foram encontrados
nas cepas M3C (101,1 mg/g) e M6C (72 mg/g).
5.3 Análise cromatográfica dos ácidos graxos das espécies selecionadas
Os cromatogramas relativos aos ésteres metílicos de ácidos graxos (Fig. 10-
14) evidenciaram maiores picos e maior diversidade de ácidos graxos (Tabelas 4 a 8)
nas cepas M3C (Synechocystis aquatilis) e M6C (Romeria gracilis). As cepas M60C e
M95C foram extremamente pobres em ácidos graxos. Na cepa M3C foram detectados
18 tipos de ácidos graxos, com maior representatividade quantitativa dos ácidos
palmítico (C16:0), com 35,8 mg/g e palmitoleico (C16:1c9), com 22,8 mg/g,
representando a soma desse dois tipos mais que 50% dos ácidos graxos totais dessa
50
espécie. Esses ácidos graxos são respectivamente saturados e monoinsaturados e,
portanto, uteis para propósitos de produção de biodiesel. Entretranto, constatou-se,
também, que esta espécie produz expressiva quantidade do ácido graxo
Eicosapentanóico (C20:5 c5,8,11,14,17), com 14,4 mg/g (quase 15% do total de ácidos
graxos produzido por esta espécie), que é um ômega 3 de extrema importância
econômica e alto valor de mercado, frente suas possibilidades de utilização na indústria
de alimentos.
Figura 10 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a
espécie Synechococcus aquatilis (M3C).
Tabela 4 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie
Synechococcus aquatilis (M3C).
Tempo de eluição
(min) Símbolo Éster Metílico do Ácido
Notação
Taquigráfica Teor (%)
5,18 Cy Caprílico C8:0 0,4 7,65 C Cáprico C10:0 0,2 10,12 La Láurico C12:0 1,8 12,43 M Mirístico C14:0 8 13,51 Pt Pentadecílico C15:0 0,4 14,57 P Palmítico C16:0 35,8 14,85 Po Palmitoléico C16:1 c9 22,8 15,07 11-Hexadecenóico C16:1 c11 0,3 15,55 Mg Margárico C17:0 0,3 15,8 9-Heptadecenóico C17:1 c9 0,4 16,55 S Esteárico C18:0 0,9 16,7 7-Octadeceóico C18:1 c7 0,1 16,8 O Oléico C18:1 c9 6,7 16,86 V Vacênico C18;1 c11 0,2 17,34 L Linoleico C18:2 c9,12 3,9 17,72 γ Ln Gama linolênico C18:3 c6,9,12 0,2 21,17 AA Araquidônico C20:4 c5,8,11,14 2,9 22,6 EPA Eicosapentanóico C20:5 c5,8,11,14,17 14,4
51
Figura 11 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a
espécie Romeria gracilis (M6C).
Tabela 5 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie
Romeria gracilis (M6C).
Tempo de
eluição (min) Símbolo Éster Metílico do Ácido
Notação
Taquigráfica Teor (%)
5,16 Cy Caprílico C8:0 0,1 10,1 La Láurico C12:0 0,2 12,4 M Mirístico C14:0 0,2 13,49 Pt Pentadecílico C15:0 0,3 14,55 P Palmítico C16:0 47,3 14,75 Po Palmitoléico C16:1 c9 0,1 14,82 11-Hexadecenóico C16:1 c11 15 15,53 Mg Margárico C17:0 1,6 15,77 9-Heptadecenóico C17:1 c9 3,9 16,3 Diinsaturado 0,2 16,52 S Esteárico C18:0 0,6 16,77 O Oléico C18:1 c9 14,6 16,84 V Vacênico C18;1 c11 0,5 17,3 L Linoléico C18:2 c9,12 9,9 18,11 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 5,3
Figura 12 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a
espécie Synechococcus nidulans (M41C).
52
Tabela 6 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie
Synechococcus nidulans (M41C).
Tempo de
Retenção (min) Símbolo
Éster Metílico do Ácido
Graxo Notação Taquigráfica
Teor
(%) 5,7 L Láurico C12:0 1,1 7,8 M Mirístico C14:0 25,9 8,3 Mo Miristoléico C14:1 c9 1,9 8,9 Pt Pentadecílico C15:0 1,0 9,8 P Palmítico C16:0 19,5 10,0 Po Palmitoléico C16:1 c9 26,5 10,5 7,10-Hexadecadienóico C16:2 c7,10 3,5 11,0 7,10,13-Hexadecatrienóico C16:3 c7,10,13 4,1 11,8 S Esteárico C18:0 1,7 11,9 O Oléico C18:1 c9 1,1 12,0 V Vacênico C18:1 c11 3,1 12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 1,0 12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 0,5 14,9 Poliinsaturado 9,1
Figura 13 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a
espécie Synechococcus aquatilis (M60C)
Tabela 7 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie
Synechococcus aquatilis (M60C)
Tempo de
Retenção (min) Símbolo Éster Metílico do Ácido Graxo Notação Taquigráfica Teor (%)
9,8 P Palmítico C16:0 25,6 10,5 7,10-Hexadecadienóico C16:2 c7,10 13,4 11,0 7,10,13-Hexadecatrienóico C16:3 c7,10,13 13,2 11,9 O Oléico C18:1 c9 7,4 12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 26,1 12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 14,3
53
Figura 14 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a
espécie Synechococcus nidulans (M95C)
Tabela 8 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie
Synechococcus nidulans (M95C).
Tempo de
Retenção (min) Símbolo
Éster Metílico do Ácido
Graxo Notação Taquigráfica
Teor
(%)
9,8 P Palmítico C16:0 39,1
10,0 Po Palmitoléico C16:1 c9 11,6
11,7 S Esteárico C18:0 6,3
11,9 O Oléico C18:1 c9 24,0
12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 10,1
12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 8,9
54
6 DISCUSSÃO
Culturas unialgais de cianobactérias são essenciais para se estudar vários
aspectos da sua biologia, mas até o momento deste trabalho nenhum estudo prévio tinha
sido realizado no estado da Paraíba. Os resultados aqui apresentados obtidos em escalas
laboratoriais (cultura batch), trazem importantes resultados sobre as respostas de
crescimento das espécies isoladas e de produção de biomassa, bem como sobre a
diversidade e quantidade de ésteres metílicos de ácidos graxos que elas produzem o que
é necessário para futuros propósito de desenvolvimento de cultivos em maiores escalas.
A grande diversidade de hábitats dos quais as espécies estudadas foram isoladas
reflete a ampla variabilidade de adaptação ecológica das cianobactérias, corroborando
informações pretéritas de outros autores acerca da enorme capacidade de dispersão e
colonização de diferentes ambientes do grupo (DAMÁZIO et al., 2005; SINHA;
HADER, 2008), refletindo o caráter cosmopolita dessas. Algumas espécies podem
ocorrer em distintos habitats, como foi evidenciado com Synechococcus nidulans,
isolada tanto de amostras de água do mar como de estuários e de tecidos de
invertebrados marinhos como no zoantídeo Protopalyhota variabilis, na esponja
Cynachrella sp, em água do mar e em água salobra de ambientes estuarinos.
A presença de cianobactérias associadas a invertebrados certamente não se
constitui um exemplo de mutualismo perfeito, mas de oportunismo, visto que a
associação é mais importante para os hóspedes do que para os hospedeiros (COSTA;
SASSI; AMARAL, 2005), os autores citados ressaltam que cianobactérias, diversas
outras microalgas e outros tipos de prototistas tiram proveito das condições oferecidas
pelos hospedeiros que os abrigam. No caso específico dos corais e zoantídeos toda essa
microbiota se acha associada à camada de mucopolissacarídeos produzidos por esses
organismos. Essa camada pode abrigar uma comunidade microbiana diversificada,
incluindo zooxantelas, bacterias, fungos, algas e diversos protistas (ROHWER et al.
2002).
Pesquisas recentes demonstraram que existem evidencias acerca da existência de
cianobactérias endossimbiontes em Montastraea cavernosa do Caribe, capazes de fixar
nitrogênio atmosférico (LESSER et al., 2004). Evidências a partir de microscopia
eletrônica demonstraram que formas similares a cianobactérias também ocorrem no
interior de duas espécies tabulares de Acroporídeos (Acropora hyacinthus e Acropora
cytherea) dos recifes de Heron e Wistari, parte sul da Grande Barreira de Recifes da
55
Austrália (KVENNEFORS; ROFF, 2009). Nestes casos, as células dessas
cianobactérias apresentam diâmetros de 1 a 4 µm e ocorrem adjacentes às zooxantelas
encerradas numa membrana do hospedeiro e frequentemente apresentam altas
densidades nos tecidos da gastroderme. As implicações da presença de altas densidades
desses microrganismos nos corais são consideráveis especialmente no tocante à
absorção pelas zooxantelas do nitrogênio fixado pelas cianobactéria (LESSER et al.,
2007).
Cianobacterias endossimbiontes também foram isoladas de dois taxa diferentes
de Soritideos coletados no Mar Vermelho e na Grande Barreira (LEE, 2006), e é comum
encontrarmos a cianobactéria Richelia intracelulares vivendo no interior de diatomáceas
do gênero Rhizosolenia. Esses dados sugerem que o fato pode ser mais comum do que
se imagina e que esses microorganismos podem ocorrer endossimbioticamente numa
grande diversidade de organismos marinhos de diferentes grupos taxonômicos.
O pequeno número de espécies isoladas e cultivadas neste trabalho frente à
enorme diversidade de espécies das cianobactérias que deve existir no meio marinho
muito provavelmente reflete a seletividade do meio de cultura utilizado, associado ao
simples fato de que muitas espécies de cianobactérias não são cultivadas. Presume-se,
entretanto, que com o avanço da pesquisa usando outros tipos de meios como o BG11
(RIPPKA et al; 1979) ou Zarrouk (ZARROUK, 1966) constituídos em água do mar será
possível aumentar a diversidade das cianobactérias marinhas no banco de microalgas do
LARBIM.
Todas as cepas cultivadas nesta pesquisa são referidas para diversos
ecossistemas lacustres de diferentes regiões do globo, indicando, este fato, a enorme
capacidade adaptativa das cianobactérias visto que foram cultivadas em meio salino
oriundas de diferentes tipos de habitat, incluindo água do mar, água estuarina e até
mesmo como episimbiontes de invertebrados marinhos. Esses achados refletem a
variabilidade de habitat que uma mesma espécie pode ocupar e também indica que é
possível ocorrer mudanças na síntese de bioprodutos por essas espécies, como resultado
das pressões do ambiente onde elas vivem. Tal aspecto poderá abrir novas fontes
investigativas dos pontos de vista da taxonomia e biotecnologia, desde que tais produtos
poderão ser detectado por técnicas cromatográficas.
A água do mar utilizada em todos os cultivos deste trabalho tem pH em torno de
8,1 e salinidade por volta de 34, sugerindo que todas as espécies cultivadas tem
preferencia por meio salino e alcalino, o que parece óbvio visto que a água do mar é
56
naturalmente tamponada. No entanto, Buck; Smith, (1995); Burja et al., (2002); Bano e
Siddiqui, (2003), demonstraram que muitas espécies de cianobactérias são hábeis em
crescer em meio ácido (pH 6.5), refletindo capacidade adaptativa à variações do pH.
Buck e Smith (1995) consideram que as cianobactérias possuem diferentes mecanismos
para manutenção da homeostasia com o pH, dependendo de seus habitats naturais.
Provavelmente esta capacidade de homeostasia às condições do pH indica porque
muitas das espécies estudadas usualmente também tem sido referidas para diferentes
tipos de ambientes lacustres de distintas regiões geográficas.
Também é sabido que mudanças na salinidade afetam o crescimento das
cianobactérias. Mas muitas espécies de água doce têm sido registradas em altas
salinidades (CARR; WYMAN, 1986). E similarmente, muitas formas marinhas podem
sobreviver muito bem em salinidades menores (BANO; SIDDIQUE, 2003), muito
embora nesses casos, o seu ótimo de crescimento expresse requisitos específicos para a
adição de sais (RIPPKA et al.,1979), refletindo características halotolerante e halofilica.
Ripkka et al (1979) citam por exemplo, P. lonchoides, L. contorta e S. major que
parecem ser halofílicas e duas espécies S. aquatilis e K. accurata que demonstraram
seus comportamentos halotolerantes, uma vez que elas cresceram bem a baixas
salinidades mas podem suportar salinidades maiores.
Ressalta-se, no entanto, que nem todas as cianobactérias são halotolerantes
(YOPP et al., 1978; BLUMEWALD; TEL-OR, 1982) apesar do fato de que muitas
espécies possam se adaptar a variações de salinidade. Conforme demonstrado por
Thajuddin e Subramanian (1992), algumas linhagens podem crescer muito bem em
salinidades que variam de 0 a 99, e Moisander et al., (2002) evidenciaram que uma
espécie de Nodularia mostrava crescimento em salinidades variando de 0 a 20. Esses
achados e a reflexões aqui apresentadas sugerem que não são todas as cianobactérias
que podem ser classificadas distintamente como formas marinhas ou de água doce, fato
este de extrema importância para propósitos tecnológicos, em cultivos em escala
industrial.
As espécies testadas mostraram diferentes respostas de crescimento na mesma
condição de cultivo, conforme ficou evidente nos valores dos ks e no rendimento
máximo da biomassa de cada espécie. Mas nem sempre as espécies que apresentaram as
maiores taxas de divisão celular mostraram os maiores valores de biomassa, como
também nem sempre se observou que as maiores taxas de divisão celular ocorriam nas
espécies que apresentavam uma menor duração da fase exponencial, demonstrando,
57
esses achados, que cada espécie responde diferentemente a uma mesma condição
experimental.
Os dados das análises cromatográficas efetuadas nessa pesquisa evidenciaram
uma grande variação na capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos
entre as espécies estudadas, presumindo-se que o mesmo deve acontecer com muitos
outros metabólitos secundários sintetizados pelas cianobactérias que são de importância
farmacêutica ou nutricional. Entretanto, conforme ressaltam Burja et al., (2002) as
condições de crescimento dos cultivos influenciam a produção de metabolitos
secundários, razão esta que demandará muita investigação ainda em casos de interesses
específicos.
Com relação ao teor de ésteres, experimentalmente observa-se que a soja - que
possui cerca de 20% de seu peso em óleo - por transesterificação direta fornece cerca de
200 mg de ésteres por grama de biomassa seca. As cianobactérias testadas até o
momento apresentaram teores de ésteres inferiores ao da soja, muito embora a cepa
M3C apresentou 101,6 mg/g, ou pouco mais que 50% do que é produzido pela soja.
Entretanto, a presença de mais que 10% do ácido eicosapentanóico merece destaque
pelo alto valor de mercado desse produto. Há que se ressaltar que manipulações
experimentais que alterem as rotas metabólicas relacionadas com a síntese de ácidos
graxos e outros produtos de interesse são perfeitamente possíveis de serem efetuadas
como, por exemplo, o cultivo em condições de estresses fóticos, térmicos e nutricionais,
permitindo incrementar com certa facilidade a produção desses compostos.
Finalmente, ressaltamos que de todas cianobactérias cultivadas cuja biomassa foi
enviada para as análises cromatográficas no Laboratório de Métodos de Extração e
Separação da Universidade Federal de Goiás, até o momento recebemos os resultados
de apenas 5 cepas, de modo que, considerando a grande variabilidade entres cepas nas
quantidades de ácidos graxos obtido, pode-se presumir que valores mais elevados do
que o que foi observado para a cepa M3C poderão ser encontrados.
No Brasil, este é um campo de investigação pioneiro, bastante promissor, e que
necessita de atenção urgente. Considerando-se a existência de regiões com condições
climáticas potencialmente adequadas, com temperaturas amenas e sol em abundância,
sua prática parece ser uma possibilidade sócio-econômica muito promissora,
particularmente na região Nordeste. Assim, a pesquisa de espécies de cianobactérias ou
outras microalgas que tenham potencialidades biotecnológicas é um aspecto importante
a considerar, pois pode levar à redução dos custos no processo produtivo.
58
No caso do biodiesel, por exemplo, os resíduos gerados no processo produtivo
usando microalgas podem se constituir numa importante fonte de material proteico e de
outras substancias nutricionais que poderão ser utilizados como suplemento alimentar
de baixo custo para alimentação humana ou ração animal. Citam-se como exemplos, a
produção de etanol, metano, alimento para gado, fertilizante orgânico (devido à sua alta
relação N:P), ou, como ressaltam Wang et al., (2008), a biomassa remanescente pode
ser queimada para a co-geração de energia.
Este é o primeiro trabalho efetuado com cultivo de cianobactérias direcionado à
potencialidade de aplicação tecnológica desses organismos na Paraíba. Acreditamos que
os dados aqui apresentados apesar de modestos, poderão abrir novas frentes de
investigação não somente sobre a importância ecológica e taxonômica das
cianobactérias em áreas marinhas costeiras, mas também intensificar cultivos
direcionados para múltiplas aplicações tecnológicas, incluindo pesquisas sobre química
fina e compostos bioativos de importância econômica, em particular os antioxidantes
como a astaxantina, e corantes naturais como a ficoeretrina, ficocianina e clorofila.
59
7 CONCLUSÕES
a) As espécies de cianobactérias cultivadas e estudadas nesta pesquisa ocorrem
comumente em ambientes lacustres, mas o seu isolamento de habitats marinhos e
estuarinos reflete a grande capacidade adaptativa do grupo.
b) Todas as cepas identificadas segundo os critérios diacríticos utilizados em ficologia,
resultaram em 6 espécies e 5 gêneros, com predominância para as formas cocóides.
c) A pequena quantidade de espécies que foram isoladas com sucesso se deve à
seletividade do meio, indicando que outros tipos de meios poderão ampliar as cepas
de cianobactérias marinhas da Coleção de Microalgas da UFPB.
d) Diversas cepas de uma mesma espécie foram isoladas de diferentes habitats (água do
mar, zonas estuarinas e até mesmo em tecidos de invertebrados benticos), refletindo
a variabilidade de habitat que uma mesma espécie pode ocupar, sugerindo a
existência de diferenças químicas nos bioprodutos por elas metabolizados, em função
das pressões do meio.
e) As espécies testadas mostraram diferentes respostas de crescimento na mesma
condição de cultivo, conforme ficou evidente nos valores dos ks e no rendimento
máximo da biomassa de cada espécie. Mas nem sempre as espécies que apresentaram
as maiores taxas de divisão celular mostraram os maiores valores de biomassa, como
também nem sempre se observou que as maiores taxas de divisão celular ocorriam
nas espécies que apresentavam uma menor duração da fase exponencial,
demonstrando, esses achados, que cada espécie responde diferentemente a uma
mesma condição experimental.
f) Os dados das análises cromatográficas efetuadas nessa pesquisa evidenciaram uma
grande variação na capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos
entre as espécies estudadas, presumindo-se que o mesmo deve acontecer com muitos
outros metabólitos secundários sintetizados pelas cianobactérias que são de
importância farmacêutica ou nutricional.
60
g) As cianobactérias estudadas quanto à sua capacidade de produção de ésteres
metílicos de ácidos graxos são pobres nesses produtos, a exceção da cepa M3C
(Synechocystis aquatilis), isolada da água do mar coletada nos recifes costeiros do
Cabo Branco, que apresentou cerca da metade dos teores de óleo produzidos pela
soja, em torno que 15% do ácido graxo eicosapentanoico, um ômega 3 de grande
importância à indústria de alimentos e de alto valor de mercado.
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